WO2004015105A1

WO2004015105A1 - Ｄｎａシャフリング

Info

Publication number: WO2004015105A1
Application number: PCT/JP2003/006514
Authority: WO
Inventors: Kentaro Miyazaki
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2003-05-26
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2005-02-09
Also published as: JP2007129902A; AU2003241762A1; JP3882035B1

Abstract

ＤＮＡシャフリングにおけるＤＮＡ断片試料の調製において、従来のデオキシリボヌクレアーゼＩを使用する方法に代えて、簡便でかつ再現性の良好な手段を開発する。ＤＮＡの塩基配列中、チミンをランダムにウラシルに置換したＤＮＡを調製した後、エンドヌクレアーゼＶを作用させる。

Description

明細書

D N Aシャフリング技術分野

本発明は、 D N Aの断片化方法、 D N Aシャフリング方法、およびこれら方法に使用するための試薬キットに関する。背景技術

D N Aシャフリングは、全長 D N Aをランダムに切断し、適当な長さに切断された D N Aが相互にプライマーあるいは铸型となり、ォ一パーラップ伸長を行うことで、相同 D N A間の組換えを誘起する方法であり、変異遺伝子の作製方法として広く使用されている。従来、 D N Aをランダムに切断し、適当な長さの D N A断片を調製する方法として、例えばデォキシリポヌクレアーゼ I など、基質特異性の低いヌクレア一ゼを利用する方法があった。しかし、デォキシリポヌクレアーゼ I を用いる方法では、以下に述べるような幾多の問題があった。

すなわち、デォキシリポヌクレア一ゼ I による方法では、反応に関わるさまざまな因子（デォキシ.リポヌクレア一ゼ I の酵素量、基質 D N A の純度や濃度、反応温度、反応時間）を正確に制御し、適当な反応時間で反応を終結させ部分分解産物を取得する必要があった。また、 D N A の部分分解産物と未分解産物とをァガロースゲル電気泳動などの手法により分画しなければならなかった。さらに、デォキシリポヌクレアーゼ I の酵素量、基質 D N Aの純度や濃度、反応温度、反応時間などのわずかな条件の違いにより断片の長さが変わり、再現性に欠けるという欠点も有していた。このようにデォキシリポヌクレアーゼ I を用いた D N A の断片化は多大な労力を要する上、再現性にも乏しいという欠点を抱えていた。このため、煩雑な反応最適条件の検討を必要とせず、またァガロースゲルによる分離 · 抽出 ·精製等の煩雑な操作を必要としない、簡便な操作で再現性の高い D N Aの断片化および分画手法の開発が望まれていた。発明の開示

本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解消し、 DNAシャフリングにおける D N A断片試料の調製において、簡便で、かつ再現性の高い手法を開発することにある。

本発明者は、鋭意研究の結果、 DNAの塩基配列中、チミンをランダムにゥラシルに置換した D N Aを調製した後、エンドヌクレアーゼ Vを作用させることにより、 D N Aのランダムな切断を簡便かつ再現性よく行い得るとともに、さらに該エンドヌクレアーゼ Vによる DN A断片化試料を用いて実際に D N Aシャフリングを行った結果、極めて有効に D N Aシャフリングを行えることを確認し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の（ 1 ) 〜（6) に関する。

( 1 ) DN Aの塩基配列中、チミンをランダムににゥラシルで置換した後、エンドヌクレアーゼ Vを作用させることにより DNAを断片化することを特徴とする、 DNA断片試料の調製方法。

(2 ) 上記（ 1 ) により調製された DNA断片試料を用いて、 DNAシャフリングを行うことを特徴とする、 DNAシャフリング方法。

( 3 ) デォキシゥリジントリホスフエ一ト（ d UT P) およびエンドヌクレアーゼ Vをそれぞれ試薬として含むことを特徴とする、 D NAシャフリングにおける DN Aを断片化するために用いる試薬キット

(4) さらに、デォキシアデノシントリホスフェート（d AT P)、デォキシグアノシントリホスフェート（d GT P)、デォキシシチジンントリホスフエ一ト（d C T P)およびデォキシチミジントリホスフェート（d TT P)、並びに DNAポリメラーゼを試薬として含むことを特徴とする、請求項 3に記載の試薬キッ卜。 (5) DNAシャフリングにおける、 D N A断片化に使用するものである、請求項 3または 4に記載の試薬キット。

( 6 ) デォキシゥリジントリホスフェート（ d UT P )、デォキシアデノシントリホスフェート（dATP)、デォキシグアノシントリホスフエ一ト（dGTP)、デォキシシチジンントリホスフエ一ト（d CTP) およびデォキシチミジントリホスフェート（d TT P)、 DNAポリメラ一ゼ並びにエンドヌクレア一ゼ Vをそれぞれ試薬として含むことを特徴とする、 DN Aシャフリング試薬キット。

以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明においては、遺伝子 DN A塩基配列中のチミンをランダムにゥラシルに置換した D N Aを調製した後、エンドヌクレアーゼ Vを作用させるが、このエンドヌクレア一ゼ Vはゥラシルを含む D N Aを基質とし、ゥラシル位置の 2 -3塩基下流のホスホジエステル結合を切断する活性を有する酵素である（Huang, J. , Lu, J. , Barany, F. , and Cao, W. 2001. Multiple Cleavage activities of endonuclease V from Thermotoga mar i t ima: recognition and strand nicking mechanism, Biochemistry, 40, 8738 - 8748、 Yao, M. and Kow, Y. W. 1997. Further characterization of Escherichia col i endonuclease V. Mechanism of recognition for deoxyinos ine, deoxyur idine, and base mismatches in DNA. J. Biol. C em. 272, 30774-30779) ₀ このため、 D N A塩基のチミンをランダムにゥラシルに置換した DNAを調製しェンドヌクレアーゼ Vを作用させることで、 D N Aのランダムな断片化が達成される。このようなエンドヌクレア一ゼ Vによる切断反応は、取り込まれたゥラシルの量に依存して進行し、基質を消費した段階で反応が終結する。このように、完全消化により断片化がおこなわれるため、デォキシリポヌクレア一ゼ I を使用した反応時におけるような部分消化ではなく、反応の進行状況のモニタ一の必要がない。また、再現性よく反応が進行する。

本発明による DNAシャフリングは、（ 1) ランダムな DNAの切断による DNA断片試料の調製工程と、（ 2 ) 得られた DNA断片試料を用いた D N Aシャフリング工程からなる。

( 1 ) DNA断片試料の調製工程

本発明においては、 D N Aシャフリングの対象となる遺伝子 D N Aを錶型とし、上流プライマーおよび下流プライマ一、並びにデォキシアデノシントリホスフェート（以下、 d AT Pという。）、デォキシグアノシントリホスフェート（以下、 d GT Pという。）、デォキシシチジンントリホスフェート（以下、 d C T Pという。）およびデォキシチミジントリホスフェート（以下、 d T T Pという。）と、さらにデォキシゥリジントリホスフェート（以下、 d UT Pという。）を含む反応溶液に D N Aポリメラ一ゼを加え P C R増幅を行う。得られる P C R産物は、上記遺伝子 D N Aの塩基配列中チミンがゥラシルにランダムに置き換えられた二本鎖の D N A分子である。

この場合において、得られる D NA分子中のゥラシルの置換量は、使用する d T T Pと d UT Pの量比に対応して変化し、この量比を変化させることにより、ゥラシルの置換量を制御できる。すなわち、ゥラシルの割合を多くすれば、ゥラシルの置換量は増大する。

次いで、ゥラシル置換 DNA分子を、エンドヌクレア一ゼ Vにより切断することにより、該 D N A分子は断片化される。得られる D N A断片試料は、分子長が異なる切断 DNA分子の集合体であり、各切断 D NA 分子の分子長は、ランダムに置換されたゥラシルの間に挟まれた領域に対応する。したがって、ゥラシルの置換量が多ければ、より短い分子長の切断 DNA分子が多くなり、反対に少なければ、より長い分子長の切断 DN A分子が多くなる。

一方、上記したようにゥラシルの置換量は、 P C R増幅において、使用する d TT Pと d UT Pの量比を変化させることにより制御可能であるから、単に、 P C R増幅において、 d T T Pと d UT Pの量比を制御するという極めて簡便な手段のみで、所定の分子長分布の DN A断片を再現性よく得ることが可能となる。また、この方法によれば、従来のような DNA切断後のァガロースによる分離、抽出、精製等の煩雑な操作は、実質上必ずしも必要としないので、エンドヌクレアーゼ Vによる切断後の DN A断片試料を、そのまま用いて DNA シャフリングを行うことができる。

上記においては、遺伝子 DN Aのゥラシル置換の手法として P C Rを使用する方法について説明したが、本発明においては、ゥラシル置換の方法はこれにとどまらない。例えば、 D NA複製の際、チミンの代わりに誤って取り込まれたゥラシルを除去修復する機能の欠損した宿主菌内で DNAを複製させることによつても得られる。このような宿主菌としては、例えば、ェシエリシァコリー C J 2 3 6あるいはェシエリシァコリ一 BW 3 1 3等が挙げられる。この場合、該宿主菌を定法に従って目的遺伝子を含むプラスミドなどで形質転換し、宿主菌内でプラスミドを増幅し、定法に従ってプラスミドを抽出 · 精製すればよい。

( 2 ) D N Aシャフリング工程

上記（ 1 ) の工程によって得られた D NA断片試料（分子長が異なる切断 DN A分子の集合体）を用い、 P C R法により D N Aシャフリングを行う。 P C Rは、上記 D NA断片試料、 dAT P、 d GT P、 d C T Pおよび d T T Pおよび DNAポリメラーゼを含む反応溶液を用いて行 Ό。

これによれば、上記 D N A断片試料中の二本鎖の各切断 DNA分子は、相互に铸型あるいはプライマ一となり、ォ一バーラップ伸長することにより、相同 D N A間の組換えが行われ、上記（ 1 ) の工程中、最初に用いた錶型遺伝子の変異遺伝子が形成される。このことは、後記実施例における、終止コドンを導入した緑色蛍光蛋白質（G F P u v) 遺伝子を用いた実験により確かめられている。

一方、本発明の試薬キットは、少なくとも、 d UT Pおよびエンドヌクレア一ゼ Vをそれぞれ試薬として含み、このキットは、 DNAシャフリングにおける、上記（ 1 ) の D N A断片試料の調製工程に使用する。この工程においては、この試薬キットのほかに、 P C Rに使用する試薬として、 dAT P、 d GT P、 d C T Pおよび d T T Pおよび DNAポリメラーゼ等も使用するが、これらは既存のものを使用してもよいし、これら試薬を、本発明の試薬キットに組み込んでもよい。

さらに、本発明の上記（ 2 ) の D N Aシャフリング工程においては、 d AT P、 d GT P、 d C T Pおよび d T T Pおよび DNAポリメラーゼ等の P C Rに通常使用する試薬を使用するが、これらを 1つの試薬セットとして、上記本発明の試薬キットと組み合わせて、 DNAシャフリング試薬キットとしてもよい。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願 2002-232236号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する < 図面の簡単な説明

図 1は、本発明の実施例における実験系の概略を示す図である。図 1 中、矢印上は、終始コドンの導入を示し、矢印下は MAシャフリングを示す。

図 2は、ゥラシル置換量が各々異なる G F P遺伝子 D N Aを、エンドヌクレアーゼ Vにより切断して得られた D N A断片試料の電気泳動写真である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により特に限定されるものではない。

下記実施例の実験系の概略を図 1 に示す。本実施例においては、 G F P u V遺伝子のコ一ド領域内に終止コドンを有する 2種の変異体を用いた。一つの変異体は 6 0番目のロイシンがオーカ一終止コドンに変わつたものであり、もう一つは 1 2 0番目のバリンがォ一カー終止コドンに変わったものである。以下これらの変異体を 6 0 *、 1 2 0 *と記す。これらの変異体は、構造遺伝子が分断されているため不活性であり、全長の G F P u Vのように緑色蛍光を発することはない。一方、これらの遺伝子が両終止コドンの間で組換わり、終止コドンを含まない配列が生成され全長の G F P u vの構造遺伝子が復活すれば蛍光を回復する。このような実験系のもと、エンドヌクレアーゼ Vを用いたこれらの 2種類の遺伝子の断片化、ならびに各断片を混合し D N Aシャフリングを行うことで、蛍光を回復する遺伝子があらわれるか否かを検定したものである。

実施例 1

( 1 ) 基質 D N Aの調製

a . 断片化の基質となる G F P u V遺伝子変異体を含むプラスミドの作成；

G F P u v遺伝子以外のベクタ一部分は、 D a t e ら（Date, T. , Tanihara, K. , and Numura, N. 1990. Construction of Escherichia coli vectors for express ion and mutagenesis： synthesis of human c-Myc protein that is initiated at a non-AUG codon in exon 1. Gene. 90, 141-144) により作成された p TD— t a cをもとに、該プラスミドの有する唯一の N c o I部位を N d e I認識部位に変換したプラスミド p T D - t a c N dを作成した（p TD— t a cの CCATGG配列が CATATG と置き換わっている）。次に、 G F P u v遺伝子の該ベクタ一へのクロ一二ングは、以下のように行われた。即ち、 2 つのプライマ一 ( 5'-GGCATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT-3'、配列表の配列番号 1 及び 5'-GGTAATGGTAGCGACCGGCG-3\ 同配列番号 2 ) を用いて、クロンテック社製の G F P u vをコードするプラスミド pG F P u vより G F P遺伝子領域を定法に従い P C R法により増幅した。次に、増幅断片を制限酵素 N d e I及び E c o R Iで切断し、先に同様の制限酵素により切断しておいた p TD— t a c N dを定法に従いライゲーシヨンにより連結したこうして得られた G F P u vを発現する組み換えプラスミド p T G u v 1の塩基配列を配列表の配列番号 3に示す。また、 G F P遺伝子領域の塩基配列を同配列番号 4に示す。

b . 終止コドンの導入；

こうして得られた G F P u Vを発現する組み換えプラスミドに対し、ストラタジーン社製 Q u i k C h a n g eキットにより部位指定突然変異を行い、 6 0番目及び 1 2 0番目の位置のアミノ酸置換を行った。即ち、 2組のプライマー（ 6 0番目に対して

5' -CTACCTGTTCCATGGCCAACATAAGTCACTACTTTCTCTTATGG-3\ 同配列番号 5 及び 5' -CCATAAGAGAAAGTAGTGACTTATGTTGGCCATGGAACAGGTAG-3\ 同配列番号 6、 1 2 0番目に対して

5' -GAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTTAAAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTG-3'、同配列番号 7、及び

5， -CAATACCTTTTAACTCGATACGATTTTAAAGGGTATCACCTTCAAACTTGACTTC-3'、同配列番号 8 ) を用い、 Q u i k C h a n g eキットのマニュアルに従い実験を行った。こうして得られた不活性型の G F P u V遺伝子を組み込んだプラスミドを p T G u v 6 0 *および p T G u v 1 2 0 *と名付けた。

c . ゥラシルによる置換；

断片化の基質となるゥラシルを含む D NAは、 p T G u v 6 0 *及び p T G u v l 2 0 *より、 G F P u v遺伝子をはさむ上流（p TD _ f wd、 5'- AGCGGATAACAATTTCACACAGG- 3'、同配列番号 9 ) 及び下流プライマー（p T D— r e v、 5' -GTAAAACGACGGCCAGTGCC-3'、同配列番号 1 0 ) を用い、 d UT P存在下で各変異体の G F P遺伝子領域を T a q 2 0 0 0 D N Aポリメラーゼ（ストラタジーン社製）により？ C R増幅することにより増幅された二本鎖 D NA断片を用いた。その際、 d T T Pと d UT Pの合計濃度を 0. 2 mMとし、両ヌクレオチドの比率を種々に変えて行った（ 1 : 0、 0. 7 5 : 0. 2 5、 0. 5 : 0. 5、 0. 2 5 : 0. 7 5、 0 : 1 )。すなわち、 d T T Pと d UT Pの濃度の組み合わせは、 0. 2 mM : 0 mM、 0. 1 5 m M ： 0. 0 5 mM、 0. I mM : 0. l mM、 0. 0 5 m M ： 0. 1 5 mM、 0 m M : 0. 2 mMとした。反応溶液の組成は、 1 0 mM トリス-塩酸緩衝液（p H 8. 3 )、 5 O mM 塩化カリウム、 1. 5 mM 塩化マグネシウム、各 2 5 M プライマ一（p TD— ： f wd及び p TD— r e v；)、各 0. 2 mMの d AT P， d C T P， d G T P及び各種濃度の d T T P · d U T P混合溶液、 1 n g 鍀型プラスミド、および 0. 2 5ユニットの T a q 2 0 0 0 D N Aポリメラーゼである。増幅反応は、 9 5 °Cで 1分間保温後、 9 4°C 3 0秒、 5 5 °C 3 0秒、 7 2 3 0秒の温度サイクルを 3 0回繰り返し、最後に 7 2 °Cで 5分間保温することにより行った。

( 2 ) エンドヌクレア一ゼ Vによる D N Aの断片化

上記（ 1 ) c . で得られた各 P C R産物（各 1. 5 H g ) を精製後、 1 0 mM HE P E S - KOH (p H 7. 4)、 5 0 mM 塩化ナトリゥム、 0 · 5 mM 塩化マンガン、 0. 5ユニットのエンドヌクレア一ゼ V (トレビジェン社製) 中、 3 7 °Cで 2 4時間反応させた。反応液をキアゲン社製 Q I A q u i c kキットにより精製し、 3 0 j 1 の水に溶解した。 6 0 *の試料に関し、一部（ 3 1 ) をァガロースゲル電気泳動により分離し、断片のサイズを見積もった（図 2 )。なお、図中 Mレーンは、分子量マ一カーついて行った泳動図である。その結果、 d TT P = 0. 2 mM、 d UT P = 0 mM条件下で得られた D N A試料では全長 DNAのままであるが（レーン 1 )、 d T T P = 0. 1 5 mM, d UT P = 0. 0 5 mM (レーン 2 )、 d T T P = 0. l mM、 d UT P = 0. 1 mM (レーン 3 ) と d UT Pの濃度が高くなるにつれ D N A断片長が短くなり、 d T T P = 0. 0 5 mM、 d UT P = 0. 1 5 mM条件下で得られた D N A断片試料が 2 0 0〜4 0 0 b pの断片サイズを与え（図 2 , レーン 4 )、この DNA断片試料を用いて以下の DNAシャフリング実験を行った。 ( 3 ) D N Aシャフリング

上記（ 2 ) で得られたレーン 4に対応する D NA断片試料を用い、 P C R反応による D N Aシヤフリングを行った。反応溶液の組成は、 1 0 mM トリスロ塩酸緩衝液（p H 8 . 3 )、 5 0 mM 塩化カリウム、 1. 5 mM 塩化マグネシウム、各 0. 2 mMの d AT P、 d C T P， d G T P、 d T T P、各変異体の D N A断片各 0. 5 β g および 0. 2 5ュニットの T a Q 2 0 0 0 D NAポリメラ一ゼである。増幅反応は、 9 5 °Cで 1分間保温後、 9 4 °C 3 0秒、 5 5 °C 3 0秒、 7 2 °C 3 0秒の温度サイクルを 3 0回繰り返し、最後に 7 2 °Cで 5分間保温することにより行った。

実施例 2

( 1 ) DN Aシャフリング産物から全長遺伝子の増幅

上記（ 2 ) で得られた D N Aシャフリング産物から全長遺伝子を再増幅するため、 G F P遺伝子をはさむプライマ一を用いて P C Rを行った。反応溶液の組成は、 1 0 mM トリスロ塩酸緩衝液（p H 8. 3 )、 5 0 mM 塩化カリウム、 1. 5 mM 塩化マグネシウム、各 2 5 M プライマ一（ p TD— i wd及び p TD— r e v)、各 0. 2 mMの d AT P、 d C T P、 d GT P、 d TT P、上記（ 3 ) で得られた反応溶液 1 l 、および 0. 2 5ュニットの丁 & 2 0 0 0 D NAポリメラーゼである。増幅反応は、 9 5 で 1分間保温後、 9 4°C 3 0秒、 5 5 °C 3 0秒、 7 2 °C 3 0秒の温度サイクルを 2 5回繰り返し、最後に 7 2 で 5分間保温することにより行った。

( 2 ) ライブラリの構築とスクリーニング

得られた増幅断片を精製し、制限酵素 N d e l及び E c o R Iで切断した。同様に、 p TD— t a c N dベクタ一に関しても同様の制限酵素で消化し、両 D NA断片をライゲ一シヨン反応により連結させた。

反応液の一部をェシエリシァコリー J M 1 0 9のコンビテントセルに導入し、 1 0 O g /m l のアンピシリン及び 0. 5 mMのイソプロピル一 j3— D—チォガラクトピラノシドを含む L B寒天プレート上、 3 7 °Cで 1 6時間培養しコロニーを形成させた。形成したコロニー数を白色光下で計測し、また緑色蛍光を発するコロニー数を 3 6 5 Mの紫外線を照射し計測した。その結果、全 1 0 0クローンのうち、 1 0個が蛍光性であった。

( 3 ) D N Aシャフリングライブラリ一により得られた蛍光性クローンの塩基配列

( 2 ) で得た蛍光性コロニー 1 0個を培養し、定法によりプラスミドを精製し、定法により G F P遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、蛍光性コロニーのいずれにおいても 6 0番目、 1 2 0番目の位置に終止コドンを含まない全長の G F P u V遺伝子をコードするものであった。すなわち、 DNAシャフリングの基質として用いた終止コドンを含む遺伝子はもともと存在した終止コドン間で組換わっており、 D N Aシャフリングが行われていることが判明した。産業上の利用可能性

従来、 DNAシャフリングにおける遺伝子 D N Aの断片化工程においては、基質特異性の低いデォキシリポヌクレアーゼによる方法がよく用いられているが、この方法では、反応に関わるさまざまな因子（デォキシリポヌクレアーゼ I の酵素量、基質 DNAの純度や濃度、反応温度、反応時間）を正確に制御し、直当な反応時間で反応を集結させ部分分解産物を取得する必要があった。これに対して、本発明は、 DNAシャフリングにおける遺伝子 D N Aの断片化工程において、遺伝子 DNAの塩基配列中、チミンをゥラシルに所定の量置換させた後、エンドヌクレアーゼ Vを作用させ、置換されたゥラシル部位の 2— 3塩基下流において該 DNAを切断して、 D NA断片試料を得るものであり、基質を消費した段階で反応が終結するため、完全消化により断片化がおこなわれ、反応の最適条件の検討や反応の進行状況のモニターの必要がないものであり、得られる D N A断片試料の分子長の分布状態は、ゥラシルの置換量を制御することにより行うものであり、極めて簡便な操作でよく、しかも再現性が良好なものである。本明細書に引用されたすベての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲

1. D NAの塩基配列中、チミンをランダムにゥラシルで置換した後、エンドヌクレアーゼ Vを作用させることにより DN Aを断片化することを特徴とする、 DNA断片試料の調製方法。

2. 請求項 1 により調製された D NA断片試料を用いて、 DNAシャフリングを行うことを特徴とする、 DN Aシャフリング方法。

3. デォキシゥリジントリホスフエ一ト（d UT P ) およびエンドヌクレアーゼ Vをそれぞれ試薬として含むことを特徴とする、 DNAを断片化するための試薬キット

4. さらに、デォキシアデノシントリホスフェート（d AT P)、デォキシグアノシントリホスフエ一ト（d GT P)、デォキシシチジンントリホスフェート（d C T P)およぴデォキシチミジントリホスフェート（d T T P)、並びに DNAポリメラーゼを試薬として含むことを特徴とする請求項 3に記載の試薬キッ卜。

5. D N Aシャフリングにおける、 DN A断片化に使用するものである、請求項 3または 4に記載の試薬キット。

6 · デォキシゥリジントリホスフエ一ト（d UT P)、デォキシアデノシントリホスフェート ( d A T P )、デォキシグアノシントリホスフエ一ト（d GT P)、デォキシシチジンントリホスフェート（d C T P) およびデォキシチミジントリホスフエ一ト（d TT P)、 DNAポリメラ一ゼ並びにびエンドヌクレアーゼ Vをそれぞれ試薬として含むことを特徴とする、 DN Aシャフリング試薬キット。