WO2004014936A2 - Melange de peptides issus des proteines c et ns3 du virus de l'hepatite c et leurs applications. - Google Patents

Melange de peptides issus des proteines c et ns3 du virus de l'hepatite c et leurs applications. Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a mixture of peptides derived from proteins C and NS3 of the hepatitis C virus (HCV) as well as to its applications as a medicament (in immunogenic compositions, capable of stimulating the production of T lymphocytes CD4 + anti-HCV in vivo and therefore useful for the prevention and treatment of HCV infections) or as a reagent for the diagnosis of T cells specific to HCV, in particular for assessing the immune status of patients.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV hepatitis C virus
  • Humans are the only known host of HCV, but the virus can be transmitted experimentally to chimpanzees.
  • HCV infects hepatocytes, but also certain cells of the immune system such as lymphocytes, monocytes and dendritic cells. Transmission of the virus is essentially parenteral. However, since de novo infections are rarely detectable, the route of contamination remains unknown in more than 40% of cases.
  • hepatitis C The prevalence of hepatitis C is high in the general population, on the order of 1 to 2% in Africa, America, Europe as well as in Southeast Asia (Alter et al., Blood, 1995, 85, 1681-). It could reach 5% in certain regions of China and in the West Pacific. In the Middle East, the prevalence varies from 1 to 12%. Thus, it is estimated that 170 million people worldwide are carriers of HCV.
  • HCV is part of the genus Hepacivirus in the family of Flaviviridae. It is a 9.4 kb positive strand RNA virus. The genome has a main open reading frame that codes for a long polypeptide that can be cleaved into 8 proteins.
  • the capsid protein (Core or C, 191 amino acids) has a capacity for binding to viral RNA and constitutes the viral nucleocapsid. It also participates in direct cytopathogenic effects.
  • the E1 and E2 glycoproteins are inserted into the envelope of the virus and involved in interactions with host cells, in particular via the CD81 receptor.
  • the NS2 protein has a metalloprotease function involved in particular in the NS2 / NS3 cleavage.
  • NS3 (631 amino acids, the first amino acid of the NS3 protein corresponds to that located at position 1007 in the HCV polyprotein sequence) and NS4 participate in both serine protease and RNA helicase activity.
  • the NS5A and NS5B proteins are RNA polymerases involved in the replication of the HCV genome.
  • the numbering of the amino acids is indicated with reference to the sequence of the polyprotein of the HCV of genotype la (SWISSPROT P26664 and Choo et al, PNAS, 1991, 88, 2451-2455); it should be noted that this numbering is identical for all HCV genotypes insofar as their polyproteins have the same size.
  • HCV can be classified into 6 genotypes or clades (designated from 1-6) and up to 100 subtypes (designated by a, b, c, etc.). This classification according to Simmonds et al. (J. Gen. Virol., 1993, 74, 2391-) is based on a phylogenetic analysis of the NS5 sequences. Inter-genotypic variability also affects, but to different degrees, other viral proteins. Genotypes 1-3 have a worldwide distribution, genotypes 4 and 5 are mainly present in Africa while genotype 6 is mainly distributed in Asia. Within an infected individual, HCVs do not represent a homogeneous species but constitute numerous quasi-species. This phenomenon is the result of the appearance of mutations within the genome due to the low fidelity of replication of the viral polymerase.
  • HCV causes acute infections in humans which can resolve itself naturally but can lead in more than 80% of cases to the persistence of the virus.
  • the acute phase is relatively mild with only 20 to 30% of infected people developing symptoms or clinical signs.
  • About 60% of patients have an increase in transaminases indicative of chronic hepatitis.
  • Epidemiological studies indicate that 20% of individuals carrying the virus develop cirrhosis after twenty years followed by hepatic decompensation, even a hepatocarcinoma.
  • HCV is responsible for a total of 20% of acute hepatitis, 60% of hepatocellular carcinomas and 30%> of liver transplants.
  • Current treatments (interferon-alpha / ribavirin) cure approximately 50% of patients in the chronic phase.
  • helper T cells auxiliaries
  • helper T lymphocytes specific for proteins C, NS3, NS4 and NS5, and of the Thl type (that is to say secreting interleukins such as IL2 and IFN ⁇ ) is associated with spontaneous healing process (Diepolder et al., Lancet, 1995, 346, 1006-; Pape et al., J. Virol. Hepat.
  • T helper Th2 response (that is to say characterized by the secretion dTL4 and dTL5) is associated with a poor prognosis of the evolution of HCV infection (Tai et al, J. Biomed Sci., 2001, 8, 321).
  • the involvement of helper T cells in the evolution of HCV infection was confirmed by immunogenetic analyzes revealing a correlation between spontaneous healing and HLA class U alleles (HLA-DRB1 * 1101 / DQB1 * 03; Thurzs et al., J. Virol. Hepat, 1997, 4, 215).
  • T epitopes are capable of restimulating, in vitro, T lymphocytes from peripheral blood or from liver samples and it is therefore difficult to measure the production of interferon ⁇ by helper T cells, after stimulation with viral proteins (Core, NS3, NS4 and NS5). It would seem that the orientation of the immune response towards a Th0 / Th2 type profile, as well as a tolerance to viral antigens are at the origin of this loss of anti-viral immunity and therefore of the persistence of HCV.
  • CD4 + T lymphocytes are indeed capable of detecting the presence of a pathogenic agent and, under the effect of this recognition, of triggering an immune response. The recognition of antigens indeed leads to their activation.
  • CD4 + T lymphocytes secrete most of the cytokines necessary for the recruitment of effector cells such as cytotoxic CD 8+ lymphocytes and antibody-producing B lymphocytes. They also intervene in the activation of cells by cellular contacts and for example induce the activation by CD40 of dendritic cells presenting the antigen. Finally, they can play themselves the role of effectors in producing anti-viral lymphokines such as IFN- ⁇ and TNF- ⁇ .
  • CD4 + T lymphocytes recognize antigens only in the form of peptides presented by HLA EL molecules More precisely, the activation of CD4 + T lymphocytes is effected by the presentation of peptides by HLA II molecules that carry the presenting cells (APC). These peptides, called T epitopes, result from the proteolytic degradation of antigens by APC. They have variable lengths generally from 13 to 25 amino acids and have a sequence which makes them capable of binding to HLA IL molecules HLA II molecules are heterodimers, capable of binding a large repertoire of peptides having very different sequences.
  • HLA II molecules There are four types of HLA II molecules per individual (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ and 1 HLA-DP), the HLA-DR molecule whose ⁇ chain is encoded by the DRB1 gene being the most expressed. These isoforms have different binding properties, which implies that they can bind different peptides of the same antigen. They are very polymo ⁇ hes and one counted at least 200 different alleles for DRB1. The molecules from the DRB3, DRB4, DRB5 and DPB1 loci are less polymorphic. Because of this polymo ⁇ hism, each individual recognizes in an antigen a set of peptides whose nature depends on the HLA H molecules which characterize it.
  • HLA U molecules To the polymolism of HLA U molecules, we must add the difficulty of finding conserved sequences between the different strains of HCV.
  • One of the most used means to define the CD4 + helper type T epitopes is to measure the capacity of peptides to proliferate the mononuclear cells of individuals having been in contact with the antigen considered.
  • a number of Authors have identified HCV peptides as T epitopes in the patients studied:
  • HCV epitopes derived from the NS3 protein (NS3 1248-1261, NS3 1388-1407, NS3 1450-1469) recognized by helper T lines obtained from patients in the acute phase.
  • the peptide derived from protein C (C 21-40) binds with a strong affinity only to one of these HLA II molecules, namely DR15.
  • - Tabatabai et al. (Hum. Immunol. 1999, 60, 105) have identified several major epitopes (NS3 1384-1401, NS3 1454-1471) in a single chronically infected patient; these epitopes are capable of inducing the proliferation and production of IL-2.
  • helper T epitopes restricted by the HLA-DR11 allele in several non-viremic or chronically infected patients; these are peptides and polypeptides restricted to DR11 and not mixtures of peptides which bind to the HLA II molecules most frequent in the Caucasian population.
  • helper T epitopes restricted by the HLA-DR11 allele in several non-viremic or chronically infected patients; these are peptides and polypeptides restricted to DR11 and not mixtures of peptides which bind to the HLA II molecules most frequent in the Caucasian population.
  • - Hoffmann et al. Hepatology, 1995, 21, 632
  • the peripheral blood mononuclear cells of patients in the chronic phase recognize several peptides derived from the Core protein.
  • There are other similar studies, all based on the responses of mononuclear cells from patients infected with HCV (Woitas et al., J.
  • T epitope peptides identified in these studies which are derived from the most conserved proteins of HCV (C and NS3), are illustrated in Table I.
  • the HLA-DRB3, -DRB4 and DRB5 molecules which are HLA-DR molecules whose ⁇ chain is not encoded by the DRB1 gene are also present with significant allelic frequencies, because they are less polymorphic than the DRB1 molecules. Their allelic frequency is indeed 9.2% for DRB3 * 0101, 28.4% for DRB4 * 0101 and 7.9% for DRB5 * 0101. They therefore alone cover 45% of the allelic frequency.
  • the HLA-DP4 molecules which group together the molecules encoded by the DPB 1 * 0401 and DPB 1 * 0402 alleles are the most abundant HLA ⁇ molecules in Europe and the United States. Their allelic frequency is indeed 40% and 11% respectively, which means that they are either found in about 76% of individuals.
  • the peptides present in a peptide sequence and which bind all of these alleles therefore include the T epitopes of the majority of the population.
  • Such a set has the property of being effective in a large number of subjects, while the peptides of the prior art are active in a few individuals and are inactive in the majority of other individuals, because the latter do not recognize the proteins. of HCV by the same determinants.
  • the inventors have identified the sequences of peptides derived from HCV proteins C and NS3 restricted to predominant HLA II molecules in Caucasian populations and they have shown that the peptides derived from protein C, preferably associated with peptides derived of the NS3 protein, effectively induce an immunogenic and protective response in a large number of individuals, which involves several epitopes.
  • these peptides which recognize specific HCV T lymphocytes in infected patients are useful for the diagnosis of the immune status of these patients against the hepatitis C virus.
  • the present invention has in consequence for a mixture of peptides, characterized in that it includes at least two different peptides derived from the hepatitis C virus (HCV), at least one of which is a peptide derived from protein C, binding to at least four different HLA II molecules with an allelic frequency greater than 5% in the Caucasian population, with a binding activity ⁇ 1000 nM.
  • HCV hepatitis C virus
  • said mixture also comprises, in addition to said peptide C as defined above, one or more peptides or lipopeptides containing one or more CD8 +, CD4 + or B epitopes and more particularly epitopes derived from an HCV protein , in particular at least one peptide resulting from the NS3 protein, binding to at least four different HLA ⁇ molecules whose allelic frequency is greater than 5% in the Caucasian population, with a binding activity ⁇ 1000 nM.
  • the invention encompasses peptides from proteins C and NS3 of any genotype of HCV.
  • the term "different HLA II molecules” means both HLA DP and DQ molecules coded by different alleles as DR molecules coded by different genes or different alleles of the same gene.
  • the said HLA II molecules are chosen from the molecules HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR11, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA- DRB5 and HLA-DP4.
  • the said HLA II molecules are coded respectively by the HLA alleles DRB1 * 0101, DRB1 * 0301, DRB1 * 0401, DRB 1 * 0701, DRB1 * 1101, DRB1 * 1301, DRB1 * 1501, DRB3 * 0101, DRB4 * 0101, DRB5 * 0101, DP * 0401 and DP * 0402.
  • Such a mixture of peptides makes it possible to obtain, in a su ⁇ ering manner, a CD4 + T proliferative response (stimulation of CD4 + T lymphocytes) and this, in the great majority of the Caucasian population to be protected and whatever the genotype of the HCV concerned. ; we can therefore consider that such a mixture constitutes a first step towards a "universal" immunogenic composition, capable of being effectively used in a vaccine.
  • the peptides derived from protein C of the hepatitis C virus are selected from the group consisting of: a) the peptides corresponding to positions 19-47, 27-51, 31-57, 104 -133 and 127-167, b) peptides of at least 11 amino acids included in the peptides as defined in a), and c) peptides derived from the peptides as defined in a) or in b) by substitution with alanine residues (C - »A), of cysteine residue (s) located in position +1 or +2, relative to the amino acid residue in N terminal position and / or in position - 1, -2 or -3, relative to the amino acid residue in the C-terminal position.
  • the peptides of at least 11 amino acids as defined in b) are selected from the group consisting of:
  • the peptides included in the peptide 127-167 corresponding respectively to positions 127-149, 131-145, 131-148, 131-167, 134-148 and 148-167.
  • the peptides as defined in c) are selected from the group consisting of the peptide derived from peptide C 127-149 of sequence TAGFADLMGYIPLVGAPLGGAAR (SEQ H) NO: 5).
  • the peptides derived from the NS3 protein are selected from the group consisting of: d) the peptides corresponding respectively to positions 1007-1037, 1036-1055, 1052-1072, 1076-1093, 1127-1153, 1149-1172, 1174-1195, 1190-1212, 1206-1239, 1246-1275, 1275- 1304, 1361-1387, 1377-1403, 1404-1432, 1456-1481, 1495-1513, 1524-1553 and 1552-1583, e) peptides of at least 11 amino acids included in the preceding peptides, and f) the peptides derived from the peptides as defined in d) or in e) by substitution with alanine residues (C - A), of cysteine residue (s) located in position +1 or +2, relative to the residue of amino acid in the N terminal position and / or in the -1, -2 or -3 position, relative to the amino acid residue in the C terminal position
  • the peptides of at least 11 amino acids as defined in e) are selected from the group consisting of:
  • the peptides included in the peptide 1524-1553 corresponding respectively to positions 1524-1552, 1524-1538, 1528-1542, 1528-1552, 1529-1543, 1534-1548, 1538-1552 and 1540-1553, and
  • the peptides as defined in f) are selected from the group consisting of: - the peptide derived from peptide 1076-1093 of sequence GVAWTVYHGAGTRTIASP (SEQ ID NO: 10),
  • the said mixture includes peptides derived from the C and NS3 proteins of the HCV genotype 1, preferably of subtype la or lb.
  • said mixture includes 2 to 6 different peptides derived from proteins C and NS3, as defined above, all of the peptides binding to at least 10 HLA II molecules whose allelic frequency is greater than 5% in the Caucasian population.
  • said peptides are selected from the group consisting of peptides derived from protein C corresponding respectively to positions 27-51, 131-167, 127-149, 131-148, 148-167 and the peptides derived from the NS3 protein corresponding respectively to positions 1007-1037, 1015-1037, 1036-1055, 1174-1192, 1190-1212, 1246-1264, 1381-1403, 1381-1397, 1524-1553, 1528-1552 and 1552-1583.
  • peptide C 104-133 binds with good affinity to the molecules DR1, DR7, DR1 1 and DRB5 encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide C 127-149 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR7, DR1 1, DR15 and DRB5 coded by the alleles as defined above
  • - the peptide NS3 1007-1037 binds with a good affinity DRl, DR3, DR4, DR7, DRl 1, DR13, DR15, DRB4, DRB5 and DP402 molecules encoded by the alleles as defined above
  • the peptide NS3 1036-1055 binds with good affinity to the molecules DR1, DR4, DRU, DRB4 and DRB5, encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1052-1080 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR4, DR7, DRU, DR15, DRB4 and DRB5, encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1076-1093 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR7, DRU, DR15, and DRB5, encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1127-1153 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR7, DRU, DRl 3, and DRB5, coded by the alleles as defined above
  • - the peptide NS3 1149-1172 binds with a good affinity for molecules DR1, DR7, DR1 5, DRB4, and DRB5, encoded by the alleles as defined above
  • the peptide NS3 1174-1195 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR4, DR7, DRU, DR15, DRB4, and DRB5, encoded by the alleles as defined above
  • the peptide NS3 1190-1212 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR4, DR7, DRU, DRl 5 and DRB5, encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1206-1239 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR4, DR7, DR1 1 and DRB5, encoded by the alleles as defined above, - the peptide NS3 1246-1275 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR4, DR7, DRU, DR13 and DR15, encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1275-1304 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR4, DR7, DR1 1, DR15, DRB3 and DP401 encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1361-1387 binds with good affinity to the molecules DR1, DR7, DR1 5 and DRB5 encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1377-1403 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR7, DRU, DR13, DRB4 and DRB5 encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1404-1432 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR4, DR7, DRl 5 and DRB5 encoded by the alleles as defined above
  • - the peptide NS3 1456-1481 binds with a good affinity to DR1, DR3, DR4, DR7, DR1 1, DR13, DR15, DRB3, DRB4 and DRB5 molecules encoded by the alleles as defined above
  • the peptide NS3 1495-1513 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR7, DR1 1, DR1 5, DRB3, DRB4 and DRB5 encoded by the alleles as defined above,
  • the peptide NS3 1524-1553 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR4, DR7, DRU, DR15, DRB3, DRB4, DRB5 and DP402 coded by the alleles as defined above,
  • the NS3 peptide 1552-1583 binds with a good affinity to the molecules DR1, DR7, DR1 1, DR15, DRB5, DP401 and DP402 encoded by the alleles as defined above.
  • the peptides included in said mixture are in the form either of individualized peptides or of a fusion protein comprising a sequence of the peptides of said mixture, excluding the sequence corresponding to the fusion of C peptides 31-45, C 141-155 and NS3 1207-1221.
  • Said individualized peptides are prepared according to conventional methods of parallel synthesis on solid phase and said fusion protein is prepared according to conventional recombinant DNA techniques, in an appropriate expression system.
  • Said fusion protein comprises the sequences of said peptides directly linked to each other by a peptide bond or else separated by exogenous sequences, that is to say sequences other than those present at this position in the sequence of proteins C and NS3 HCV, in particular the sequences of other CD4 +, CD8 + or B T epitopes, for example HCV.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule, characterized in that it codes for a fusion protein as defined above.
  • the subject of the invention is also any recombinant vector, in particular plasmid or virus, comprising at least one nucleic acid molecule as defined above, placed under the control of the elements necessary for the transcription of said molecule, in particular under the control a promoter and a transcription terminator.
  • the invention also relates to host cells, in particular bacteria, yeasts or mammalian cells, transformed with the aid of a vector as defined above, so as to stably integrate into their genome or to maintain stably. , at least one nucleic acid molecule as defined above.
  • the present invention also relates to an anti-HCV immunogenic composition, characterized in that it comprises at least:
  • an appropriate vector as defined above in particular a virus, in combination with at least one pharmaceutically acceptable vehicle and optionally at least one adjuvant.
  • the adjuvants used are adjuvants conventionally used in vaccine compositions, such as aluminum hydroxide and squalene.
  • viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses and AAVs, in which has been inserted beforehand, can be used.
  • the sequence of interest it is also possible to associate said sequence (isolated or inserted into a plasmid vector) with a substance capable of ensuring protection of said sequences in the organism or allowing it to cross the membrane of host cells, for example a preparation of liposomes, lipids or cationic polymers, or inject it directly into the host cell, in the form of naked DNA.
  • naked DNA for immunization constitutes an effective vaccination approach: it consists in injecting into the host organism to be vaccinated, naked DNA coding for a protein antigen; this DNA allows a prolonged synthesis of the antigen by the host cells as well as a durable presentation of this antigen to the immune system.
  • said peptides are in the form of modified peptides or else associated with liposomes or lipids, in particular in the form of lipopeptides.
  • the lipid part of the lipopeptide is in particular obtained by addition of a lipid motif on an ⁇ -amino function of said peptides or on a reactive function of the side chain of an amino acid of the peptide part; it can include one or more chains derived from C 4-20 fatty acids, optionally branched or unsaturated (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, 2-amino hexadecanoic acid, pimelautide, trimetauxide) or a derivative of a steroid.
  • the process for the preparation of such lipopeptides is described in particular in International Applications WO 99/40113 or WO 99/51630.
  • the preferred lipid part is in particular represented by an N-acetyl-lysine N ⁇ group (palmitoyI), also called Ac-K (Pam).
  • the modified peptide is in particular obtained by modification of at least one peptide bond -CO-NH- of the peptide chain of said peptides by the introduction of a bond of retro or retro-inverso type (-NH-CO-) or of a bond different from the peptide bond (methylene amino, carba, ketomethylene, methylene-oxy ...) or else by substitution of at least one amino acid of the peptide chain of said peptides by a non-proteinogenic amino acid, it is to say an amino acid not forming part of a natural protein, in particular an amino acid whose carbon carrying the side chain, namely the group -CHR- is replaced by a motif which does not form part of the constitution of a natural amino acid.
  • said mixture of peptides is associated: - with one or more peptides or lipopeptides containing one or more CD8 + epitopes (recognized specifically by cytotoxic T lymphocytes and presented by HLA I molecules) and more particularly CD8 + epitopes derived from an HCV protein such as peptides C 2-10, 28-36, 35-44, 41-49, 42-50, 85-98, 88-97, 127-140, 131 -140, 132-140, 167-176, 178-187, 181-190; peptides E1 220-227, 233-242, 234-242, 363-371; E2 peptides 401-411, 460-469, 489-496, 569-578, 621-628, 725-733; peptides NS2 826-838, 838-845; peptides NS3 1073-1081, 1169-1177, 1287-1296, 1395-1403,
  • CD4 + epitopes such as the tetanus toxin peptide TT (positions 830-846), the hemagglutinin peptide from Influenza HA (positions 307-319), PADRE (Pan DR Epitope, Alexandre J. et al., Immunity, 1994, 1, 9, 751-761) and the LSA3 peptide of Plasmodium falciparum and / or
  • B epitopes derived from an HCV protein recognized specifically by antibodies directed against the latter, such as peptide C 5-27 (Khanna et al, Acta Virologica, 1998, 42, 141-145), the peptide NS4 1698-1719 (Khanna et al., Cited above) and the peptide NS5 2295-2315 (Khudyakov et al., Virology, 1995, 206, 666-672).
  • Peptides C and NS3 according to the invention, included in the mixtures, as defined above were advantageously selected using an HLA H / peptide binding test comprising: - the purification of HLA II molecules from interest, that is to say those concerning more than 5% of a given population and in particular the molecules HLA DR1, DR3, DR4, DR7, DRl 1, DRB, DR15, DRB3, DRB4, DRB5 and DP4, - the incubation of the HLA II molecules thus purified, with different concentrations of overlapping fragments and covering the sequence of protein C or of protein NS3 and with an RI reagent or tracer consisting of a peptide fragment associated with a non-radioactive marker, such as biotin and the sequence of which is different from said peptides; the RI reagent or tracer is chosen so that it has an affinity for one of the HLA ⁇ molecules of interest, such that it can be used at a concentration ⁇ 200 nM,
  • This approach also has the advantage of allowing the selection of peptides significantly more specific with respect to HCV than approaches seeking to select peptides on the basis of their capacity to stimulate CD4 + T lymphocytes (proliferation tests).
  • the incubation conditions are specific to each HLA II molecule (incubation time, pH, RI reagent, HLA II concentration or RI reagent).
  • the RI reagent is selected from the group consisting of the following sequences:
  • PKYVKQNTLKLAT (HA 306-318, SEQ IDNO: 75), specific for alleles DRBl * 0101, DRBl * 0401, DRBl * 1101 and DRB5 * 0101,
  • EAEQLRAYLDGTGVE (A3 152-166, SEQ ED NO: 79), allele specific
  • DRB1 * 1501 DRB1 * 1501,.
  • AKTIAYDEEARGLE MT 2-16, SEQ ED NO: 77
  • AAYAAAKAAALAA YKL, SEQ ED NO: 76
  • DRB allele 1 * 0701 DRB1 * 1501
  • AKTIAYDEEARGLE MT 2-16, SEQ ED NO: 77
  • AAYAAAKAAALAA YKL, SEQ ED NO: 76
  • DRB allele 1 * 0701 DRB allele 1 * 0701
  • TERVRLVTRHIYNREE Bl 21-36, SEQ ED NO: 78
  • AGDLLAEBTDKATI E2 / E168, SEQ ID NO: 81
  • allele specific amino acids E2 / E168, SEQ ID NO: 81
  • EKKYFAATQFEPLAARL (Oxy 271-287, SEQ ED NO: 82) specific for the DP * 0401 and DP * 0402 alleles.
  • Other RI reagents can be used, in particular those described in South ood et al. (J. Immunol., 1998, 160, 3363-3373).
  • the present invention also relates to a vaccine intended for the prevention and treatment of HCV infections, characterized in that it includes an immunogenic composition as defined above.
  • the present invention also relates to peptides derived from protein C or from the NS3 protein of an HCV, in particular of genotype la or lb, characterized in that they are selected from the group consisting of: peptides derived from protein C, as defined above, excluding peptide C 31-45, C 21-40, C 20-44, C 23-42, C 111-130, C 109-128, C 128-152 , C 131-150, C 133-152, C 138-162, C 141-155, C 142-161, C 141-160 and C 145-164, and the peptides derived from the NS3 protein chosen from: - the peptides corresponding respectively to positions 1007-1037, 1036-1055, 1052-1072, 1076-1093, 1127-1153, 1149-1172, 1174-1195, 1190-1212
  • the present invention also relates to a diagnostic reagent, characterized in that it comprises at least one of the C or NS3 peptides, as defined above, said peptides being optionally labeled or complexed, in the form of complexes multimeric.
  • the present invention also relates to a method for evaluating the immune status of an individual, characterized in that it comprises a step of detecting the presence of CD4 + T cells specific for C and / or NS3 peptides, such as defined above; said detection is advantageously carried out by one of the following tests: proliferation test, ELISPOT test [see for example International Application WO 99/51630 or Gahéry-Ségard et al. J. Virol., 2000, 74, 1964-)] or flow cytometry in the presence of multimeric complexes formed from said peptides E6 and / or E7.
  • a suspension of cells (PBMC, PBMC depleted in CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with the peptides selected according to the invention or cloned T lymphocytes) is cultured for 3 to 5 days in the presence of the selected peptides and, if necessary, suitable presenting cells such as dendritic cells, autologous or heterologous PBMCs, lymphoblastoid cells such as those obtained after infection with the EBV virus or genetically modified cells. Cell proliferation is measured by the incorporation of tritiated thymidine into the cell DNA.
  • the peptides selected in accordance with the invention make it possible to reveal in the initial suspension the presence of cells specific for these peptides.
  • the ELISPOT test makes it possible to reveal the presence of T cells specific for a peptide selected in accordance with the invention and secreting EFN- ⁇ . More specifically, the T cells are revealed by measuring the secretion of IFN- ⁇ after incubation of the PMBCs of the patients with the peptides selected according to the invention, in accordance with the method described in Gahéry-Ségard et al., J. Virol, 2000, 74, 1964.
  • a biological sample preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is brought into contact with labeled tetrameric complexes produced from complexes between C and / or NS3 peptides as defined above and HLA class molecules They are soluble and the labeled cells are analyzed, in particular by flow cytometry.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the biological sample prior to bringing the biological sample into contact with said complex, it is enriched in CD4 + T cells, by bringing it into contact with anti-CD4 antibodies to enrich said sample.
  • the tetramers are prepared, as specified, for example in EJ Novak et al. (J. Clin. Investig, 1999, 104, R63-R67) or in ML Kuroda et al. (J. Virol, 2000, 74, 18, 8751-8756). Briefly, the tetramers are produced by incubating, for 72 hours at 37 ° C. and in a 10 mM citrate phosphate buffer, 0.15 M NaCl at a pH of between 4.5 and 7, soluble and biotinylated HLA II molecules with a 10 excess of peptides C and / or NS3, identified and selected in accordance with the invention. The tetramerized form is obtained by adding to the preparation of streptavidin marked with a fluorochrome in an amount four times less (mole in mode) than of HLA IL molecules. The whole is incubated overnight at room temperature.
  • a suspension of cells (PBMC, PBMC depleted in CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with the peptides C and or NS3 selected in accordance with the present invention or T lymphocytes is brought into contact clones) with one or more tetramers (10 to 20 mg / mi) for 1 to 3 hours. After washing, the suspension is analyzed by flow cytometry: the labeling of the cells by the tetramers is visualized by the fact that these constructions are fluorescent.
  • Flow cytometry makes it possible to separate the cells marked by the tetramers from the unmarked cells and thus to carry out cell sorting.
  • a further subject of the present invention is thus a method for sorting T lymphocytes specific for HCV, characterized in that it comprises at least the following steps:
  • FIG. 1 illustrates the sequences of peptides from proteins C and NS3 which have been studied. To simplify the different peptides have been called
  • FIG. 3 illustrates the binding activity, vis-à-vis the predominant HLA II molecules in the Caucasian population, of a second series of peptides of proteins C and NS3, derived from the first series.
  • the values correspond to the IC 50 , expressed in nM. Values less than 1000 nM, corresponding to peptides with good affinity for HLA H molecules, are indicated in bold, nd: not determined.
  • FIG. 4 illustrates the in vivo immunogenicity of 3 peptides of the NS3 protein having a high affinity for HLA-DRl (8N 1007-1037, 15N 1174-1195 (15N) and 28N 1524-1553, measured by a proliferation test splenocytes from transgenic mice for human HLA-DR1 molecules, previously immunized with each of the peptides (FIG. 4A) or by a mixture of these peptides (FIG. 4B).
  • Peptides 3C 93-107, 6C 148-173 and 12N 1094- 1119 which have a low affinity for HLA-DR1 are used as a control. The values correspond to the proliferation index of the splenocytes.
  • FIG. 4 illustrates the in vivo immunogenicity of 3 peptides of the NS3 protein having a high affinity for HLA-DRl (8N 1007-1037, 15N 1174-1195 (15N) and 28N 1524-1553, measured by a proliferation test s
  • FIG. 5 illustrates the immunogenicity in vitro of 6 peptides of the NS3 protein exhibiting a strong affinity for minus 4 different HLA II molecules predominant in the Caucasian population (8N 1007-1021, 8N 1019-1033, 15N 1178-1193, 28N 1538-1552, 18N 1250-1264 and 8N 1024-1037), measured by an ELISPOT test, at from 3 CD4 + is T cell lines known from an HIV-negative individual (P014 / A, P014 / B and P014 / C); the T lymphocytes were previously stimulated in vitro by dendritic cells of this same individual charged by the mixture of peptides) then the number of T lymphocytes secreting IFN- ⁇ .
  • the binding activity of the peptides of the proteins C and NS3 of the HCV to the HLA H molecules was tested from 25 fragments of large sizes (between 15 and 34 amino acids), chosen according to two criteria:
  • HLA II molecules (10 HLA-DR molecules and 2 HLA-DP molecules) most abundant in the French population and whose allelic frequencies are characteristic of the Caucasian population, were selected (Table VTJJ):
  • HLA-DRl, -DR3, -DR4, -DR7, -DRU, - DRl 3 and -DRl 5 molecules whose ⁇ chain is encoded by alleles of the DRB1 locus whose frequency exceeds 5% in the French population: DRB 1 * 0101, DRB 1 * 0301, DRB1 * 0401, DRB1 * 0701, DRB1 * 1101, DRB1 * 1301 and DRBl * 1501 which alone represent 64% of the population.
  • These same alleles are the most abundant HLA-DR alleles in other Caucasian populations. Their frequency varies between 53% (in Spain) and 82% (in Denmark). For the United States and Canada, they represent respectively 58 and 55% of the DR alleles of the population.
  • HLA-DRB3, -DRB4 and -DRB5 molecules whose ⁇ chain is encoded by the most common alleles in the French population: HLA- DRB3 * 0101 (9.2%), HLA-DRB4 * 0101 ( 28.4%), and HLA-DRB5 * 0101 (7.9%). These molecules alone cover 45% of the allelic frequency.
  • HLA-DP4 molecules which group the molecules encoded by the alleles DPB 1 * 0401 and DPB 1 * 0402. These DP4 molecules are the most abundant HLA II molecules in Europe and the United States. Their allelic frequency is indeed 40 and 11% respectively which means that they are one or the other found in approximately 76% of individuals.
  • the peptides present in a protein sequence and which bind all of these molecules therefore include the CD4 T epitopes of the majority of the population, b) purification of the HLA II molecules
  • the HLA H molecules are purified by immunoaffinity from different homozygous lines of human B lymphocytes transformed by the Epstein Barr virus (EBV).
  • EBV Epstein Barr virus
  • HLA-DR and HLA-DP molecules are immunopurified using the monoclonal antibodies respectively L243 (Smith et al., PNAS, 1982, 79, 608-612) and B7 / 21 (WATSON et al., Nature, 1983, 304, 358-361), according to the protocols described in Texier et al. (J. Immunol., 2000, 164, 3177; Eur. J. Immunol., 2001, 31, 1837). 3) HLA H / peptide binding tests a) principle of the tests
  • HLA-DP and HLA-DR molecules are tests in competition with an immunoenzymatic revelation, derived from those developed for HLA-DR molecules (HLA-DR1: MARSHALL et al., J Immunol., 1994, 152, 4946-; HLA-DR1, -DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DRU and -DR13: Patent Application FR 99 0879 and TEXIER et al., Cited above).
  • the binding tests are carried out as follows: the HLA-DR or HLA-DP molecules are diluted in 96-well polypropylene plates, in 10 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, 1 mM dodecyl maltoside (DM) , 10 mM citrate, 0.003% thimerosal, at an appropriate pH and dilution for each molecule.
  • a biotinylated tracer peptide (Table VIII) is added at a given concentration, as well as several concentrations of peptides to be tested (competitor peptide).
  • the samples are neutralized with 50 ⁇ L of 450 mM Tris HC1 buffer, pH 7.5, thimerosal 0.003%, BSA 0.3% , DM 1 mM. They are then transferred to maxisorp ELISA plates (96 wells) on which the anti-DP or anti-DR antibodies have been previously adsorbed. The samples are incubated on these plates for two hours at room temperature. Washes are carried out between each step in 0.1 M Tris HC1 buffer, pH 7.5, 0.05% Tween-20.
  • the biotinylated peptide linked to the HLA II molecules is detected by the addition of 100 ⁇ L / well of the streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (45 minutes) diluted to 1/2000 in the Tris 10 mM buffer, pH 7, 0.15 M NaCl, Tween 20 0.05%, BSA 0.2%, thimerosal 0.003%, then 200 ⁇ L / well of the substrate 4-methyl-umbelliferyl phosphate (MUP) at the concentration of 100 ⁇ M, in 0.05M NaHCO 3 buffer, pH 9.8, MgCl 2 ImM.
  • MUP 4-methyl-umbelliferyl phosphate
  • the maximum binding is determined by incubating the biotinylated tracer peptide with the HLA II molecule in the absence of competing peptide.
  • the binding specificity is controlled by the addition of an excess of non-biotinylated peptide.
  • the background noise obtained does not differ significantly from that obtained by incubating the biotinylated peptide without the HLA H molecules.
  • the results are expressed in the form of the concentration of competing peptide which inhibits 50% of the maximum binding of the biotinylated tracer peptide (IC50).
  • each peptide binds with good affinity (IC 50 ⁇ 1000 nM) to at least one HLA ⁇ molecule and that several peptides bind with good affinity to several HLA ⁇ molecules.
  • peptides 26N, 8N, 28N, IC, ION, 15N, 19N, 29N, 2C, 16N, 18N, 23N, 27N, 5C, 9N, UN, 13N, 14N, 17N, 24N, 4C and 22N bind with good affinity to at least 4 different HLA molecules.
  • Second series of peptides Figures 3 and Table IX
  • Table IX Binding activities of peptides 9N and 29N vis-à-vis preponderant HLA II molecules in the Caucasian population.
  • 29N 1569-1583 950> 100,000 10,500 3,000 22> 100,000 2,800> 100,000 21,000
  • the protocol used is as follows: 25 ⁇ g of each of the peptides 8N 1007-1037, 15N 1174-1195, 28N 1524-1553, 3C 93-107, 6C 148-173 and 12N 1094-1119, separately, or else 10 ⁇ g and 25 ⁇ g of a mixture of the same peptides 8N, 15N and 28N were emulsified in montanide and injected, subcutaneously, into a group of 5 mice. 15 days later, a second injection was made under the same conditions. Ten days after this second injection, the animals were sacrificed and their spleen removed.
  • the splenocytes were cultured in HL-1 medium (BIOWHITTAKER) supplemented with 1% mouse serum, in the presence of 5 ⁇ g / ml of each of the peptides used for the injection, or in the absence of peptide. After 4 days of culture, 1 ⁇ Ci of tritiated thymidine (AMERSHAM, LIFE TECHNOLOGEE) was added for 16 h. The incorporation of tritiated thymidine was then measured using a beta counter (microbeta 1450, PERKIN ELMER). The results are expressed in proliferation index (number of CPMs in the presence of peptide / number of CPMs in the absence of peptide).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the non-adherent cells were recovered, deposited on an LS + column (MYLTENYI), then the CD4 + T lymphocytes thus purified were frozen.
  • the adherent cells were incubated for 5 days, in AEVI V medium containing lOOOU / ml of GM-CSF and lOOOU / ml of E-4, then the cells differentiated into dendritic cells were then cultured for 2 days, in the presence of l ⁇ g / ml of LPS, 1000 U / ml of EL-4 and 1000 U / ml of GM-CSF, so as to induce their maturation.
  • the mature dendritic cells (100,000 cells / well) were then incubated with a mixture of peptides (10 ⁇ g of each peptide), for 5 hours at 37 ° C.
  • the mature dendritic cells were then washed and then incubated, in the presence of CD4 + T lymphocytes (100,000 cells / well) previously thawed, in medium containing 1000 U / ml of E6 and 10 ng / ml of EL-12.
  • the culture was restimulated for the first time, using mature dendritic cells previously thawed and loaded with the mixture of peptides, in medium containing 1TL-2 (10 U / ml) and 1TL-7 (5ng / ml). 7 days later, the culture was similarly restimulated in a medium containing no IL-2.
  • the cells were tested in ELISPOT, as follows:
  • Anti-EFN ⁇ antibodies (1-D1K, MABTECH) diluted to 1 ⁇ g / ml in PBS buffer were adsorbed on nitrocellulose plates (MIXIXORE) for 1 hour at 37 ° C. The plates were then washed with PBS and then saturated with RPMI medium containing 10% FCS (100 ⁇ l / well), for 2 h at 37 ° C. The mature thawed dendritic cells (10,000 cells / well) and 10,000 lymphocytes to be tested were then added to the plates and incubated for 24 h at 37 ° C, in the presence or absence of a single peptide or a mixture of peptides.
  • PBMCs of a seronegative patient were tested according to the protocol as defined above, with the mixture of the following peptides: 8N 1007-
  • EXAMPLE 5 DETECTION OF HCV SPECIFIC T CELLS USING C AND NS3 PEPTIDES.
  • HCV hepatitis C virus
  • PHA phytohemagglutinin
  • TT tetanus toxin
  • the culture supernatants were collected at 24 or 48 hours and stored at -80 ° C until analysis.
  • cytokines possibly present in the supernatants were assayed as follows: 96-well plates (Maxisorp, NUNC) were covered with 100 ⁇ l of anti-IFN- ⁇ , IL-2, IL-4 and EL-10 antibodies (BECTON DICKXNSON, 2 ⁇ g / ml) in carbonate buffer 0, 1M, pH 8, 6 and incubated for 2 hours at 37 ° C. After three successive washes with PBS buffer containing 0.05% Twen 20, the plates were saturated with 200 ⁇ l of PBS containing 3% bovine serum albumin (BSA, SIGMA), for 2 h at room temperature.
  • BSA bovine serum albumin
  • the optical density was then measured at 540 nM and the quantitative analysis of the cytokines was carried out using the Deltasoft software (DS3-1.518F / 1994 E. BERCHTOLD & BIOMETALLICS INC). The results, expressed in pg / ml, are presented in Table X.
  • Table X Determination of cytokines produced by T lymphocytes of chronically infected patients, after stimulation with peptides C and NS3, alone or as a mixture.
  • Table X shows that 8 out of 9 patients have specific cells of at least one of the C or NS3 peptides, secreting EL-2, EFN- ⁇ , EL-4 or dTL-10. It also shows that a mixture of C and NS3 peptides can detect specific HCV T lymphocytes at least as effectively as the peptides used separately, and that it even increases the sensitivity of this detection (see patient 342).

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Abstract

Mélange de peptides incluant au moins deux peptides différents issus du virus de l'hépatite C (VHC), dont l'un au moins est un peptide issu de la protéine C, se liant à au moins quatre molécules HLA II différentes dont la fréquence est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison < 1000 nM, et ses applications en tant que médicament utile pour la prévention et le traitement des infections à VHC ou en tant que réactif de diagnostic de lymphocytes T spécifiques du VHC.

Description

MELANGE DE PEPTIDES ISSUS DES PROTEINES C ET NS3 DU VIRUS DE L'HEPATITE C ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à un mélange de peptides issus des protéines C et NS3 du virus de l'hépatite C (VHC) ainsi qu'à ses applications en tant que médicament (dans des compositions immunogènes, aptes à stimuler la production de lymphocytes T CD4+ anti-VHC in vivo et donc utiles pour la prévention et le traitement des infections à VHC) ou en tant que réactif de diagnostic de lymphocytes T spécifiques du VHC, notamment pour évaluer l'état immunitaire des patients.
Le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié en 1989 comme étant l'agent étiologique majeur des hépatites non-A non-B (Kato et al., P.N.A.S., 1990, 87, 9524-). L'homme est le seul hôte connu du VHC mais le virus peut être transmis expérimentalement aux chimpanzés. Le VHC infecte les hépatocytes, mais également certaines cellules du système immunitaire comme les lymphocytes, les monocytes et les cellules dendritiques. La transmission du virus est essentiellement parentérale. Toutefois, comme les infections de novo sont rarement décelables, la voie de contamination demeure inconnue dans plus de 40% des cas. La prévalence de l'hépatite C est élevée dans la population générale, de l'ordre de 1 à 2% en Afrique, en Amérique, en Europe ainsi qu'en Asie du sud-est (Alter et al., Blood, 1995, 85, 1681-). Elle pourrait atteindre 5% dans certaines régions de Chine et dans le pacifique-ouest. Au Moyen- Orient, la prévalence varie de 1 jusqu'à 12%. Ainsi, il est estimé que 170 millions d'individus dans le monde sont porteurs du VHC.
Le VHC fait partie du genre Hepacivirus au sein de la famille des Flaviviridae. C'est un virus à ARN brin positif de 9,4 kb. Le génome possède un cadre de lecture ouvert principal qui code pour un long polypeptide clivable en 8 protéines. La protéine de capside (Core ou C, 191 acides aminés) possède une capacité de liaison à TARN viral et constitue la nucléocapside virale. Elle participe également à des effets cytopathogènes directs. Les glycoprotéines El et E2 sont insérées dans l'enveloppe du virus et impliquées dans les interactions avec les cellules hôtes notam- ment via le récepteur CD81. La protéine NS2 possède une fonction métalloprotéase impliquée notamment dans le clivage NS2/NS3. NS3 (631 acides aminés, le premier acide aminé de la protéine NS3 correspond à celui situé en position 1007 dans la séquence de la polyprotéine du VHC) et NS4 participent à la fois à une activité serine protéase et ARN hélicase. Les protéines NS5A et NS5B sont des polymérases à ARN participant à la réplication du génome du VHC. Dans ce qui suit, la numérotation des acides aminés est indiquée en référence à la séquence de la polyprotéine du VHC de génotype la (SWISSPROT P26664 et Choo et al, P.N.A.S., 1991, 88, 2451-2455) ; il y a lieu de noter que cette numérotation est identique pour tous les génotypes du VHC dans la mesure où leurs polyprotéines présentent la même taille.
Le VHC peut être classifié en 6 génotypes ou clades (désignés de 1- 6) et jusqu'à 100 sous-types (désignés par a, b, c, etc). Cette classification selon Simmonds et al. (J. Gen. Virol., 1993, 74, 2391-) est basée sur une analyse phylo- génétique des séquences NS5. La variabilité inter-génotypique affecte également, mais à différents degrés, les autres protéines virales. Les génotypes 1-3 ont une distribution mondiale, les génotypes 4 et 5 sont présents principalement en Afrique tandis que le génotype 6 est principalement distribué en Asie. Au sein d'un individu infecté, les VHC ne représentent pas une espèce homogène mais constituent de nombreuses quasi-espèces. Ce phénomène est le résultat de l'apparition de mutations au sein du génome dues à la faible fidélité de réplication de la polymérase virale.
Le VHC occasionne chez l'homme des infections aiguës pouvant se résoudre naturellement mais peut conduire dans plus de 80% des cas à la persistance du virus. La phase aiguë est relativement bénigne avec seulement 20 à 30% des personnes infectées développant des symptômes ou des signes cliniques. Environ 60% des patients ont une augmentation des transaminases témoignant d'une hépatite chronique. Les études épidémiologiques indiquent que 20% des individus porteurs du virus développent une cirrhose après une vingtaine d'années suivie d'une décompensation hépatique, voire d'un hepatocarcinome. Dans les pays industrialisés, le VHC est responsable au total de 20% des hépatites aiguës, de 60% des carcinomes hépato- cellulaires et de 30%> des transplantations hépatiques. Les traitements actuels (interféron-alpha/ribavirine) permettent la guérison d'environ 50% des patients en phase chronique. Contrairement à l'infection par le VIH, l'infection par le VHC n'est pas systématiquement persistante. De nombreux patients infectés arrivent en effet à surmonter l'infection grâce à une réponse immunitaire efficace. Des lymphocytes T auxiliaires (T helper) pourraient être impliqués dans le contrôle précoce de la réplication virale (Thimme et al; J Exp. Med., 2001, 194, 1395). En effet, une forte activité des lymphocytes T auxiliaires, spécifiques des protéines C, NS3, NS4 et NS5, et de type Thl (c'est-à-dire sécrétant des interleukines telles que l'IL2 et l'IFNγ) est associée au processus de guérison spontanée (Diepolder et al., Lancet, 1995, 346, 1006-; Pape et al., J. Virol. Hepat. Suppl., 1999, 1, 36; Gerlach et al., Gastroenterology, 1999, 117, 933). A l'inverse, une réponse T helper Th2 (c'est-à-dire caractérisée par la sécrétion dTL4 et dTL5) est associée à un mauvais pronostic de l'évolution de l'infection à VHC (Tai et al, J. Biomed. Sci., 2001, 8, 321). L'implication des lymphocytes T auxiliaires dans l'évolution de l'infection à VHC a été confortée par des analyses immunogénétiques révélant une corrélation entre la guérison spontanée et les allèles HLA de classe U (HLA-DRB1*1101/DQB1*03 ; Thurzs et al., J. Virol. Hepat, 1997, 4, 215).
En revanche, chez les patients infectés chroniques, un nombre restreint d'épitopes T sont capables de restimuler, in vitro, les lymphocytes T issus du sang périphérique ou de prélèvements hépatiques et il est donc difficile de mesurer la production d'interféron γ par les lymphocytes T auxiliaires, après stimulation par les protéines virales (Core, NS3, NS4 et NS5). Il semblerait que l'orientation de la réponse immunitaire vers un profil du type Th0/Th2, ainsi qu'une tolérance aux antigènes viraux soient à l'origine de cette perte de l'immunité anti-virale et donc de la persistance du VHC.
Les réponses cellulaires médiées par les lymphocytes T CD4+ auxiliaires sont très souvent impliquées dans les mécanismes anti-viraux. Spécifiques des antigènes, les lymphocytes T CD4+ sont en effet capables de détecter la présence d'un agent pathogène et sous l'effet de cette reconnaissance, de déclencher une réponse immunitaire. La reconnaissance des antigènes conduit en effet à leur activation. Une fois activés, les lymphocytes T CD4+ sécrètent la plupart des cytokines nécessaires au recrutement de cellules effectrices que sont les lymphocytes CD 8+ cyto toxiques et les lymphocytes B producteurs d'anticorps. Ils interviennent également dans l'activation des cellules par des contacts cellulaires et par exemple induisent l'activation par le CD40 des cellules dendritiques présentatrices de l'antigène. Enfin, ils peuvent jouer eux-mêmes le rôle d'effecteurs en produisant des lymphokines anti-virales comme l'IFN-γ et TNF-α.
Que le rôle bénéfique des lymphocytes T CD4+ dans la résolution de l'infection par le VHC résulte d'une action directe ou indirecte, il constitue un important argument en faveur de vaccins dirigés contre le VHC et capables de stimuler une forte réponse CD4+ de type Thl. En particulier, l'utilisation de peptides capables de stimuler ces cellules constituerait une approche vaccinale très intéressante à la fois efficace et économiquement viable. Toutefois, les peptides que reconnaissent les lymphocytes T auxiliaires sont difficiles à définir en raison du polymorphisme des molécules HLA IL
En effet, les lymphocytes T CD4+ ne reconnaissent les antigènes que sous la forme de peptides présentés par les molécules HLA EL Plus précisément, l'activation des lymphocytes T CD4+ se fait sous l'effet de la présentation de peptides par les molécules HLA II que portent les cellules présentatrices (APC). Ces peptides, appelés épitopes T, résultent de la dégradation proteolytique des antigènes par l'APC. Ils ont des longueurs variables généralement de 13 à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA IL Les molécules HLA II sont des hétérodimères, capables de lier un répertoire important de peptides ayant des séquences très différentes. Il existe quatre types de molécules HLA II par individu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP), la molécule HLA-DR dont la chaîne β est codée par le gène DRB1 étant la plus exprimée. Ces isoformes possèdent des propriétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent lier des peptides différents d'un même antigène. Elles sont très polymoφhes et on a dénombré au moins 200 allèles différents pour DRB1. Les molécules issues des locus DRB3, DRB4, DRB5 et DPBl sont moins polymoφhes. Du fait de ce polymoφhisme, chaque individu reconnaît dans un antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA H qui le caractérisent.
Au polymoφhisme des molécules HLA U, il faut ajouter la difficulté de trouver des séquences conservées entre les différentes souches de VHC. Un des moyens le plus utilisé pour définir les épitopes T CD4+ de type auxiliaire est de mesurer la capacité de peptides à faire proliférer les cellules mononucléées d'individus ayant été en contact avec l'antigène considéré. Un certain nombre d'Auteurs ont identifié des peptides du VHC comme étant des épitopes T chez les patients étudiés :
- Diepolder et al., précités, ont montré l'existence d' épitopes du VHC issus de la protéine NS3 (NS3 1248-1261, NS3 1388-1407, NS3 1450-1469) reconnus par des lignées T auxiliaires obtenus à partir de patients en phase aiguë.
- Lamonaca et al. (Hepatology, 1999, 30, 10888) ont identifié cinq épitopes majeurs (Core 21-40, NS3 1253-1272, NS4 1767-1786, NS4 1907-1926, NS4 1909-1929), selon une approche similaire. Ces peptides sont à la fois immunodominants, conservés et présentés par plusieurs molécules HLA H ; sont plus particu- fièrement décrits 4 peptides immunodominants : C 21-40, NS3 1253-1272 et NS4 1767-1786, 1907-1926 et 1909-1929. Les tests de liaison à des molécules HLA H les plus fréquentes dans la population caucasienne et mondiale (DR1, DR4, DR7, DRU, DR15, DRB5, DR6, DR8 et DR9) présentés dans le tableau 3 de ce document montrent que seuls les peptides issus de NS3 et de NS4 (NS3 1253-1272, NS4 1767- 1786 et NS4 1909-1929) se lient avec une activité de liaison inférieure à 1000 nM à aux moins 4 des molécules HLA II dont la fréquence est supérieure à 5 % dans la population caucasienne (DR1, DR4, DRU, DR7, DR15 et DRB5). En revanche, le peptide issu de la protéine C (C 21-40) se lie avec une forte affinité uniquement à une de ces molécules HLA II, à savoir DR15. - Tabatabai et al. (Hum. Immunol. 1999, 60, 105) ont identifié plusieurs épitopes majeurs (NS3 1384-1401, NS3 1454-1471) chez un unique patient chroniquement infecté ; ces épitopes sont capables d'induire la prolifération et la production d'IL-2.
- Godkin et al. (Eur. J. Immunol., 2001, 31, 1438 ; voir également la Demande Internationale PCT WO 02/34770 au nom de Impérial Collège Innovations
Ltd) ont identifié plusieurs épitopes T helper restreints par l'allèle HLA-DR11, chez plusieurs patients non-virémiques ou chroniquement infectés ; il s'agit de peptides et polypeptides restreints à DR11 et non de mélanges de peptides se liant aux molécules HLA II les plus fréquentes dans la population caucasienne. - Hoffmann et al. (Hepatology, 1995, 21, 632) ont démontré que les cellules mononucléées du sang périphérique de patients en phase chronique reconnaissaient plusieurs peptides dérivés de la protéine Core. Il existe d'autres études similaires, toutes basées sur les réponses de cellules mononucléées de patients infectés par le VHC (Woitas et al., J. Immunol., 1997, 159, 1012 ; Lechmann et al. , Hepatology, 1996, 24, 790 ; Leroux-Roels et al., Hepatology, 1996, 23, 8 ; Lohr et al., Liver, 1996, 16, 174.
Les peptides épitopes T identifiés dans ces études, qui sont issus des protéines les plus conservées du VHC (C et NS3), sont illustrés au Tableau I.
Tableau I : Séquences des peptides C et NS3 identifiés comme étant des épitopes T par des tests de prolifération
Figure imgf000007_0001
• Non déterminé / et variants de ces peptides dont le peptide minimum N1251-1259. Il ressort du Tableau I que les séquences des épitopes T varient d'une étude à l'autre, traduisant le manque de précision de cette approche. Il est en effet difficile, au vu de la diversité des réponses observées, de définir des séquences épitopes T pour l'ensemble de la population caucasienne. Ces séquences ne sont adaptées qu'aux patients ayant servi à ces travaux. Ces différences de réponse s'expliquent d'une part par la représentativité des échantillons qui n'est pas évaluée. En particulier, dans les études où les patients ne sont pas typés pour leurs molécules HLA, nul ne sait si les différents allèles sont représentés selon les fréquences de la population générale. La réponse de nombreux patients à un peptide particulier peut alors résulter d'un biais de l'échantillonnage et non de la capacité effective d'un peptide à être reconnu par l'ensemble des patients. D'autre part, dans le cas de l'infection par le VHC, plusieurs études ont été effectuées sur des patients infectés de manière chronique. Du fait de la persistance du virus chez ces sujets, il est possible qu'ils présentent une tolérance aux épitopes T les plus efficaces à être présentés. Dans ce contexte, les épitopes les plus intéressants pourraient avoir disparu de la réponse immunitaire qui se maintiendrait pour des épitopes moins stimulants mais qui ne parviendrait pas à éliminer le virus. Cette hypothèse est d'ailleurs émise par Tabatabai et al., précité. Ces tests de prolifération sont donc insuffisants pour définir des séquences adaptées à la vaccination de l'ensemble de la population. Parmi les peptides ayant une activité de stimulation de lymphocytes
T identifiés, quelques uns seulement se lient aux molécules HLA II (Tableau H).
Tableau II : Liaison des peptides C et NS3 aux molécules HLA II
Figure imgf000009_0001
Dans l'article aux noms de Diepolder et al., précité, les Auteurs ont en effet étudié pour 5 peptides de la protéine NS3, la capacité à lier des molécules HLA II fréquemment rencontrées. De fait, ils ont montré que l'epitope NS3 1248-1261 ou des peptides variants (1242-1261 et 1248-1267) présentent une capacité de liaison pour 9 à 10 allèles HLA-DR à savoir : DRB 1*0101, 1501, 0401, 0404, 0405, 1101, 1302, 0802, 0901 et DRB5*0101. En revanche, les peptides 1388-1407 et 1450-1469 sont inactifs. Dans l'article de Lamonaca et al., précité, les Auteurs ont également montré, par des tests de liaison, que le peptide Core 21-40 se lie à DRB 1*1501 et que le peptide NS3 1253-1272 se lie à DRB1*0101, 0401, 1101, 701, 1501, 1302, 0802, 0901.
Il ressort de ce qui précède qu'aucun peptide du VHC se liant aux molécules HLA II les plus fréquemment rencontrées dans la population caucasienne, n'a été identifié pour la protéine C qui est la plus conservée et donc particulièrement adaptée à la vaccination contre les différents génotypes du VHC. En outre, parmi les peptides de la protéine NS3 ayant une activité de stimulation de lymphocytes T qui ont été étudiés, un seul peptide se lie aux molécules HLA II les plus fréquemment rencontrées dans la population caucasienne. Il existe un nombre important de molécules HLA II dont la répartition n'est pas homogène dans le monde. Ainsi, dans une population donnée un ensemble d'allèles regroupe à lui seul l'essentiel des allèles de la population. Par exemple en France qui est une population caractéristique de la population caucasienne (USA, Europe), seuls 7 allèles du locus DRB1 dépassent les 5 %. Il s'agit des allèles DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB1*1501 qui représentent à eux seuls 64% de la population. Ces mêmes allèles sont les plus abondants allèles HLA-DR dans les autres populations caucasiennes. Leur fréquence varie entre 53% (en Espagne) à 82% (au Danemark). Pour les Etats- Unis et le Canada, ils représentent respectivement 58 et 55%» des allèles de la population. Les molécules HLA-DRB3, -DRB4 et DRB5 qui sont des molécules HLA-DR dont la chaîne β n'est pas codée par le gène DRB1 sont présentes également avec des fréquences alléliques importantes, car elles sont moins polymoφhes que les molécules DRB1. Leur fréquence allélique est en effet de 9,2% pour DRB3*0101, 28,4% pour DRB4*0101 et 7,9% pour DRB5*0101. Elles couvrent donc à elles seules 45% de la fréquence allélique. Enfin, les molécules HLA-DP4 qui regroupent les molécules codées par les allèles DPB 1*0401 et DPB 1*0402 sont les molécules HLA π les plus abondantes en Europe et aux Etats-Unis. Leur fréquence allélique est en effet de 40 % et 11 % respectivement, ce qui signifie qu'elles sont l'une ou l'autre trouvées chez environ 76% des individus. Les peptides présents dans une séquence peptidique et qui lient l'ensemble de ces allèles inclus donc les épitopes T de la majorité de la population.
C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un ensemble de peptides aptes à être incoφorés dans une composition immunogène et à stimuler des lymphocytes T CD4+ anti-VHC, chez la majorité des individus caucasiens européens ou d'Amérique du Nord, pour induire effectivement une réponse proliférative et multiépitopique (qui fait appel à plusieurs épitopes) spécifique des composants du virus.
Un tel ensemble a pour propriété d'être efficace chez un grand nombre de sujets, alors que les peptides de l'art antérieur sont actifs chez quelques individus et sont inactifs chez la majorité des autres individus, parce que ces derniers ne reconnaissent pas les protéines du VHC par les mêmes déterminants. Pour ce faire, les Inventeurs ont identifié les séquences de peptides issus des protéines C et NS3 du VHC restreints aux molécules HLA II prépondérantes dans les populations caucasiennes et ils ont montré que les peptides issus de la protéine C, de préférence associés à des peptides issus de la protéine NS3, induisent effectivement une réponse immunogene et protectrice chez un grand nombre d'individus, qui implique plusieurs épitopes.
En outre, ces peptides qui reconnaissent des lymphocytes T spécifiques d'HCV chez les patients infectés, sont utiles pour le diagnostic de l'état immunitaire de ces patients vis-à-vis du virus de l'hépatite C. La présente invention a en conséquence pour objet un mélange de peptides, caractérisé en ce qu'il inclut au moins deux peptides différents issus du virus de l'hépatite C (VHC), dont l'un au moins est un peptide issu de la protéine C, se liant à au moins quatre molécules HLA II différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison < 1000 nM. Conformément à l'invention, ledit mélange comprend également, outre ledit peptide C tel que défini ci-dessus, un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes CD8+, CD4+ ou B et plus particulièrement des épitopes issus d'une protéine du VHC, notamment au moins un peptide issu de la protéine NS3, se liant à au moins quatre molécules HLA π différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison < 1000 nM.
L'invention englobe les peptides issus des protéines C et NS3 de n'importe quel génotype du VHC.
Conformément à l'invention, on entend par "molécules HLA II diffé- rentes" aussi bien des molécules HLA DP et DQ codées par des allèles différents que des molécules DR codées par des gènes différents ou des allèles différents d'un même gène.
Avantageusement, les dites molécules HLA II sont choisies parmi les molécules HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR11, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 et HLA-DP4.
De manière particulièrement avantageuse, les dites molécules HLA II sont codées respectivement par les allèles HLA DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB 1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301, DRB1*1501, DRB3*0101, DRB4*0101, DRB5*0101, DP*0401 et DP*0402.
Un tel mélange de peptides permet d'obtenir, de manière suφre- nante, une réponse proliférative T CD4+ (stimulation des lymphocytes T CD4+) et ce, chez la grande majorité de la population caucasienne à protéger et quel que soit le génotype du VHC concerné ; on peut donc considérer qu'un tel mélange constitue un premier pas vers une composition immunogene « universelle », apte à être effectivement utilisée dans un vaccin.
Selon une disposition avantageuse dudit mélange, les peptides issus de la protéine C du virus de l'hépatite C, sont sélectionnés dans le groupe constitué par : a) les peptides correspondant aux positions 19-47, 27-51, 31-57, 104-133 et 127-167, b) les peptides d'au moins 11 acides aminés inclus dans les peptides tels que définis en a), et c) les peptides dérivés des peptides tels que définis en a) ou en b) par substitution par des résidus alanine (C — » A), de résidu(s) cystéine situé(s) en position +1 ou +2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position— 1, -2 ou -3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale. Avantageusement, les peptides d'au moins 11 acides aminés tels que définis en b) sont sélectionnés dans le groupe constitué par :
- le peptide inclus dans le peptide 27-51 correspondant aux positions
27-41,
- le peptide inclus dans le peptide 31-57 correspondant aux positions 31-45, et
- les peptides inclus dans le peptide 127-167 correspondant respectivement aux positions 127-149, 131-145, 131-148, 131-167, 134-148 et 148-167.
Avantageusement, les peptides tels que définis en c) sont sélectionnés dans le groupe constitué par le peptide dérivé du peptide C 127-149 de séquence TAGFADLMGYIPLVGAPLGGAAR (SEQ H) NO: 5).
Selon une autre disposition avantageuse dudit mélange, les peptides issus de la protéine NS3, sont sélectionnés dans le groupe constitué par : d) les peptides correspondant respectivement aux positions 1007- 1037, 1036-1055, 1052-1072, 1076-1093, 1127-1153, 1149-1172, 1174-1195, 1190- 1212, 1206-1239, 1246-1275, 1275-1304, 1361-1387, 1377-1403, 1404-1432, 1456- 1481, 1495-1513, 1524-1553 et 1552-1583, e) les peptides d'au moins 11 acides aminés inclus dans les peptides précédents, et f) les peptides dérivés des peptides tels que définis en d) ou en e) par substitution par des résidus alanine (C — A), de résidu(s) cystéine situé(s) en position +1 ou +2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position -1, -2 ou -3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale.
Avantageusement, les peptides d'au moins 11 acides aminés tels que définis en e) sont sélectionnés dans le groupe constitué par :
- les peptides inclus dans le peptide 1007-1037 correspondant respectivement aux positions 1007-1021, 1015-1029, 1015-1037, 1019-1033 et 1020- 1034,
- les peptides inclus dans le peptide 1174-1195 correspondant respectivement aux positions 1174-1188, 1174-1192 et 1178-1192,
- les peptides inclus dans le peptide 1190-1212 correspondant respectivement aux positions 1190-1204 et 1192-1206, - les peptides inclus dans le peptide 1246-1275 correspondant respectivement aux positions 1246-1260, 1246-1264, 1250-1264 et 1261-1275,
- les peptides inclus dans le peptide 1377-1403 correspondant respectivement aux positions 1381-1395, 1381-1397, 1381-1403 et 1383-1397,
- le peptide inclus dans le peptide 1495-1513 correspondant respecti- vement aux positions 1495-1509,
- les peptides inclus dans le peptide 1524-1553 correspondant respectivement aux positions 1524-1552, 1524-1538, 1528-1542, 1528-1552, 1529- 1543, 1534-1548, 1538-1552 et 1540-1553, et
- les peptides inclus dans le peptide 1552-1583 correspondant respectivement aux positions 1559-1573 et 1563-1577.
Avantageusement, les peptides tels que définis en f) sont sélectionnés dans le groupe constitué par : - le peptide dérivé du peptide 1076-1093 de séquence GVAWTVYHGAGTRTIASP (SEQ ID NO: 10),
- le peptide dérivé du peptide 1149-1172 de séquence RGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLAP (SEQ ID NO: 13), - le peptide dérivé du peptide 1377-1403 de séquence
GKAIPLEVIKGGRHLIFCHSKKKADEL (SEQ ED NO: 20),
- le peptide dérivé du peptide 1456-1481 de séquence TAVTQTVDFSLDPTFTffiTITLPQDA (SEQ ID NO: 22), et
- le peptide dérivé du peptide 1524-1553 de séquence GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD (SEQ ED NO: 24) et les peptides inclus dans la séquence SEQ ED NO: 24 correspondant respectivement aux positions 1524-1538, 1524-1552, 1528-1552, 1538-1552 et 1540-1553.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit mélange, il inclut des peptides issus des protéines C et NS3 du VHC de génotype 1, de préférence de sous-type la ou lb.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit mélange, il inclut 2 à 6 peptides différents issus des protéines C et NS3, tels que définis ci-dessus, l'ensemble des peptides se liant à au moins 10 molécules HLA II dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits peptides sont sélectionnés dans le groupe constitué par les peptides issus de la protéine C correspondant respectivement aux positions 27-51, 131-167, 127-149, 131-148, 148-167 et les peptides issus de la protéine NS3 correspondant respectivement aux positions 1007-1037, 1015-1037, 1036-1055, 1174-1192, 1190-1212, 1246-1264, 1381-1403, 1381-1397, 1524-1553, 1528-1552 et 1552-1583.
Par exemple:
- le peptide C 19-47 se lie avec une bonne affinité aux molécules DR1, DR7, DRU, DR13, DR15, DRB5 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide C 31-57 se lie avec une bonne affinité aux molécules
DR1, DR7, DRU, DR13, DR15, DRB5, DP401 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide C 104-133 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR7, DRl 1 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide C 127-149 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR7, DRl 1, DR15 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1007-1037 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR3, DR4, DR7, DRl 1, DR13, DR15, DRB4, DRB5 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1036-1055 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DRU, DRB4 et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci- dessus,
- le peptide NS3 1052-1080 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DR7, DRU, DR15, DRB4 et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1076-1093 se lie avec une bonne affinité aux molé- cules DRl, DR7, DRU, DR15, et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci- dessus,
- le peptide NS3 1127-1153 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR7, DRU, DRl 3, et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci-dessus, - le peptide NS3 1149-1172 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR7, DRl 5, DRB4, et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1174-1195 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DR7, DRU, DR15, DRB4, et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci-dessus
- le peptide NS3 1190-1212 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DR7, DRU, DRl 5 et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1206-1239 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DR7, DRl 1 et DRB5, codées par les allèles tels que définis ci- dessus, - le peptide NS3 1246-1275 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DR7, DRU, DR13 et DR15, codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1275-1304 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DR7, DRl 1, DR15, DRB3 et DP401 codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1361-1387 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR7, DRl 5 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1377-1403 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR7, DRU, DR13, DRB4 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1404-1432 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DR7, DRl 5 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci- dessus, - le peptide NS3 1456-1481 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR3, DR4, DR7, DRl 1, DR13, DR15, DRB3, DRB4 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1495-1513 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR7, DRl 1, DRl 5, DRB3, DRB4 et DRB5 codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1524-1553 se lie avec une bonne affinité aux molécules DRl, DR4, DR7, DRU, DR15, DRB3, DRB4, DRB5 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus,
- le peptide NS3 1552-1583 se lie avec une bonne affinité aux molé- cules DRl, DR7, DRl 1, DR15, DRB5, DP401 et DP402 codées par les allèles tels que définis ci-dessus.
Conformément à l'invention, les peptides inclus dans ledit mélange sont sous forme, soit de peptides individualisés, soit d'une protéine de fusion comprenant une séquence des peptides dudit mélange, à l'exclusion de la séquence correspondant à la fusion des peptides C 31-45, C 141-155 et NS3 1207-1221.
Lesdits peptides individualisés sont préparés selon les procédés classiques de synthèse en parallèle sur phase solide et ladite protéine de fusion est préparée selon les techniques classiques d'ADN recombinant, dans un système d'expression approprié.
Ladite protéine de fusion comprend les séquences desdits peptides directement reliées entre-elles par une liaison peptidique ou bien séparées par des séquences exogènes, c'est-à-dire des séquences autres que celles présentes à cette position dans la séquence des protéines C et NS3 du VHC, notamment les séquences d'autres épitopes T CD4+, CD8+ ou B, par exemple du VHC.
La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de fusion telle que définie ci-dessus.
L'invention a également pour objet tout vecteur recombinant, notamment plasmide ou virus, comprenant au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à la transcription de ladite molécule, notamment sous le contrôle d'un promoteur et d'un terminateur de transcription.
L'invention concerne également les cellules hôtes, notamment bactéries, levures ou cellules de mammifère, transformées à l'aide d'un vecteur tel que défini ci-dessus, de manière à intégrer de façon stable dans leur génome ou à maintenir de manière stable, au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci- dessus.
La présente invention a également pour objet une composition immunogene anti-VHC, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins :
- un mélange de peptides issus d'une protéine C et d'une protéine NS3 du VHC, tels que définis ci-dessus, et/ou - une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, ou
- un vecteur approprié tel que défini ci-dessus, notamment un virus, en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement au moins un adjuvant.
Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés dans les compositions vaccinales, tels que l'hydroxyde d'alumine et le squalène.
On peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adéno- virus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalable- ment la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance capable d'assurer une protection desdites séquences dans l'organisme ou lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de lipides ou de poly- mères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte, sous forme d'ADN nu.
Par exemple, l'utilisation d'ADN nu pour l'immunisation constitue une approche vaccinale efficace : elle consiste à injecter dans l'organisme hôte à vacciner, un ADN nu codant pour un antigène protéique ; cet ADN permet une synthèse prolongée de l'antigène par les cellules de l'hôte ainsi qu'une présentation durable de cet antigène au système immunitaire.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition immunogene, lesdits peptides sont sous forme de peptides modifiés ou bien associés à des liposomes ou à des lipides, notamment sous forme de lipopeptides. La partie lipidique du lipopeptide est notamment obtenue par addition d'un motif lipidique sur une fonction α-aminée desdits peptides ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie peptidique ; elle peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide lino- lénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d'un stéroïde. Le procédé de préparation de tels lipopeptides est notamment décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe N -acétyl-lysine Nε(palmitoyI), également dénommé Ac-K(Pam). Le peptide modifié est notamment obtenu par modification d'au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique desdits peptides par introduction d'une liaison de type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou d'une liaison différente de la liaison peptidique (méthylène amino, carba, cétométhylène, méthy- lène-oxy...) ou bien par substitution d'au moins un acide aminé de la chaîne peptidique desdits peptides par un acide aminé non protéinogénique, c'est à dire un acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine naturelle, notamment un acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale, à savoir le groupe -CHR- est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'un acide aminé naturel.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition immunogene, ledit mélange de peptides est associé : - à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes CD8+ (reconnus spécifiquement par les lymphocytes T cytotoxiques et présentés par les molécules HLA I) et plus particulièrement des épitopes CD8+ issus d'une protéine du VHC tels que les peptides C 2-10, 28-36, 35-44, 41-49, 42-50, 85- 98, 88-97, 127-140, 131-140, 132-140, 167-176, 178-187, 181-190 ; les peptides El 220-227, 233-242, 234-242, 363-371 ; les peptides E2 401-411, 460-469, 489-496, 569-578, 621-628, 725-733 ; les peptides NS2 826-838, 838-845 ; les peptides NS3 1073-1081, 1169-1177, 1287-1296, 1395-1403, 1406-1415 ; les peptides NS4A 1585- 1593, 1666-1675 ; les peptides NS4B 1769-1777, 1789-1797, 1807-1816, 1851-1859 ; le peptide NS5A 2252-2260 et les peptides NS5B 2588-2596, 2727-2735 (Rehermann et al, Current Topics in Microbiology and Immunology, 2000, 242; 299),
- à d'autres peptides comprenant des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide de la toxine tétanique TT (positions 830-846), le peptide de Fhémagglutinine d'Influenza HA (positions 307-319), PADRE (Pan DR Epitope, Alexandre J. et al., Immunity, 1994, 1, 9, 751-761) et le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum et/ou
- à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes B, plus particulièrement des épitopes B issus d'une protéine du VHC reconnus spécifiquement par des anticoφs dirigés contre ces derniers, tels que le peptide C 5-27 (Khanna et al, Acta Virologica, 1998, 42, 141-145), le peptide NS4 1698-1719 (Khanna et al., précité) et le peptide NS5 2295-2315 (Khudyakov et al., Virology, 1995, 206, 666-672).
Les peptides C et NS3 selon l'invention, inclus dans les mélanges, tels que définis ci-dessus ont été avantageusement sélectionnés à l'aide d'un test de liaison HLA H/peptides comprenant : - la purification des molécules HLA II d'intérêt, c'est-à-dire celles concernant plus de 5 % d'une population donnée et notamment les molécules HLA DRl, DR3, DR4, DR7, DRl 1, DRB, DR15, DRB3, DRB4, DRB5 et DP4, - l'incubation des molécules HLA II ainsi purifiées, avec différentes concentrations de fragments chevauchants et couvrant la séquence de la protéine C ou de la protéine NS3 et avec un réactif RI ou traceur constitué d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif, tel que la biotine et dont la séquence est diffé- rente desdits peptides ; le réactif RI ou traceur est choisi de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de l'une des molécules HLA π d'intérêt, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration < 200 nM,
- le transfert des complexes obtenus sur une plaque de type ELISA, préalablement sensibilisée avec un anticoφs spécifique de toutes les molécules DR ou DP,
- la révélation des complexes molécules HLA H/réactif RI, fixés au fond de la plaque au moyen de conjugués convenables, tels que streptavidine-phos- phatase et d'un substrat fluorescent,
- la sélection des peptides comprenant des épitopes différents, c'est- à-dire les plus représentatifs des différentes zones d'interaction entre la protéine C ou la protéine NS3 et les molécules HLA II et
- le choix des peptides les plus adaptés, en fonction de la fréquence des allèles vis-à-vis desquels ils présentent une activité de liaison < 1000 nM, de préférence < 800 nM, correspondant à la concentration de ces peptides, qui inhibe 50 % de la liaison du réactif RI (IC50).
Ces tests permettent, de manière non ambiguë, d'associer à chaque molécule HLA H, les séquences des fragments capables de s'y lier ou au contraire qui ne s'y lient pas.
Cette démarche permet de définir des compositions immunogènes incluant des peptides qui se lient au plus grand nombre de molécules HLA II différentes et qui peuvent être ainsi avantageusement protectrices pour la majorité des patients, même si l'on ne connaît pas leurs génotype HLA.
Cette démarche a en outre l'avantage de permettre la sélection de peptides significativement plus spécifiques vis-à-vis du VHC que les démarches cherchant à sélectionner des peptides sur la base de leur capacité à stimuler les lymphocytes T CD4+ (tests de prolifération).
Les conditions d'incubation sont propres à chaque molécule HLA II (temps d'incubation, pH, réactif RI, concentration en HLA II ou en réactif RI).
Le réactif RI est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences suivantes :
. PKYVKQNTLKLAT (HA 306-318, SEQ IDNO: 75), spécifique des allèles DRBl*0101, DRBl*0401, DRBl*1101 et DRB5*0101,
. EAEQLRAYLDGTGVE (A3 152-166, SEQ ED NO: 79), spécifique de l'allèle
DRB1*1501, . AKTIAYDEEARGLE (MT 2-16, SEQ ED NO: 77), spécifique de l'allèle DRB1*0301, . AAYAAAKAAALAA (YKL, SEQ ED NO: 76), spécifique de l'allèle DRB 1*0701, . TERVRLVTRHIYNREE (Bl 21-36, SEQ ED NO: 78), spécifique de l'allèle
DRB1*1301, . ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT (LOL 191-210, SEQ ID NO: 80), spécifique de l'allèle DRB3*0101,
. AGDLLAEBTDKATI (E2/E168, SEQ ID NO: 81), spécifique de l'allèle
DRB4*0101, et . EKKYFAATQFEPLAARL (Oxy 271-287, SEQ ED NO: 82) spécifique des allèles DP*0401 et DP*0402. D'autres réactifs RI peuvent être utilisés, notamment ceux décrits dans South ood et al. (J. Immunol., 1998, 160, 3363-3373).
La présente invention a également pour objet un vaccin destiné à la prévention et au traitement des infections à VHC, caractérisé en ce qu'il inclut une composition immunogene telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet des peptides issus de la protéine C ou de la protéine NS3 d'un VHC, notamment de génotype la ou lb, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : les peptides issus de la protéine C, tels que définis ci-dessus, à l'exclusion du peptide C 31-45, C 21-40, C 20-44, C 23-42, C 111-130, C 109-128, C 128-152, C 131-150, C 133-152, C 138- 162, C 141-155, C 142-161, C 141-160 et C 145-164, et les peptides issus de la protéine NS3 choisis parmi : - les peptides correspondant respectivement aux positions 1007- 1037, 1036-1055, 1052-1072, 1076-1093, 1127-1153, 1149-1172, 1174-1195, 1190- 1212, 1206-1239, 1275-1304, 1361-1387, 1377-1403, 1404-1432, 1456-1481, 1495- 1513, 1524-1553 et 1552-1583 et les peptides d'au moins 11 acides aminés inclus dans les peptides précédents, à l'exclusion des peptides NS3 1384-1401 et NS3 1207-1221,
- les peptides correspondant respectivement aux positions 1246-1260 et 1261-1275,
- les peptides dérivés des peptides précédents par substitution par des résidus alanine (C - A), de résidu(s) cystéine situé(s) en position +1 ou +2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position — 1, -2 ou -3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale, et
- les peptides dérivés des peptides précédents, tels que définis ci- dessus.
De tels peptides qui contiennent un épitope CD4+, apte à avoir une activité de liaison < 1000 nM, de préférence < 800 nM vis-à-vis d'au moins 4 molécules HLA II différentes telles que définies ci-dessus, sont aptes à être reconnus par des lymphocytes T CD4+ spécifiques desdits peptides présents chez des patients infectés par le VHC sont donc utiles comme réactifs de diagnostic d'une infection à VHC. La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un des peptides C ou NS3, tels que définis ci-dessus, lesdits peptides étant éventuellement marqués ou complexés, sous la forme de complexes multimériques.
La présente invention a également pour objet un procédé d'évaluation de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la présence de cellules T CD4+ spécifiques des peptides C et/ou NS3, tels que définis ci-dessus ; ladite détection est réalisée, de manière avantageuse par l'un des tests suivants : test de prolifération, test ELISPOT [voir par exemple la Demande internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al. J. Virol., 2000, 74, 1964-)] ou cytométrie de flux en présence de complexes multimériques constitués à partir desdits peptides E6 et/ou E7.
De manière plus précise : * pour ce qui concerne le test de prolifération :
Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides sélectionnés selon l'invention ou des lymphocytes T clones) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence des peptides sélectionnés et au besoin de cellules présentatrices appropriées telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hétérologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La prolifération des cellules est mesurée par incoφoration de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules. Les peptides sélectionnés conformément à l'invention, permettent de révéler dans la suspension initiale la présence de cellules spécifiques de ces peptides.
* pour ce qui concerne le test ELISPOT :
Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T spécifiques d'un peptide sélectionné conformément à l'invention et sécrétant de l'EFN-γ. De manière plus précise, les cellules T sont révélées par mesure de la sécrétion d'IFN-γ après incubation des PMBC des patients avec les peptides sélectionnés selon l'invention, conformément à la méthode décrite dans Gahéry-Ségard et al., J. Virol, 2000, 74, 1964.
* pour ce qui concerne la mise en œuvre de complexes multi- mériques et notamment de complexes tétramériques :
- on met en contact un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) avec des complexes tétramériques marqués produits à partir de complexes entre des peptides C et/ou NS3 tels que définis ci-dessus et des molécules HLA de classe II solubles et l'on - analyse les cellules marquées, notamment par cytométrie de flux.
De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec ledit complexe, on l'enrichit en cellules T CD4+, en le mettant en contact avec des anticoφs anti-CD4, pour enrichir ledit échantillon.
Les tétramères sont préparés, comme précisé, par exemple dans E.J. Novak et al. (J. Clin. Investig, 1999, 104, R63-R67) ou dans M.L Kuroda et al. (J. Virol, 2000, 74, 18, 8751-8756). Brièvement, les tétramères sont fabriqués en incubant, pendant 72 heures à 37°C et dans un tampon phosphate citrate 10 mM, NaCl 0,15 M à un pH compris entre 4,5 et 7, des molécules HLA II solubles et biotinylées avec un excès de 10 de peptides C et/ou NS3, identifiés et sélectionnés conformément à l'invention. La forme tétramérisée est obtenue en ajoutant à la préparation de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mode) que de molécules HLA IL L'ensemble est incubé une nuit à température ambiante.
Pour utiliser ces tétramères, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides C et ou NS3 sélectionnés conformément à la présente invention ou des lymphocytes T clones) avec un ou plusieurs tétramères (10 à 20 mg/mi) pendant 1 à 3 heures. Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les tétramères grâce au fait que ces constructions sont fluorescentes.
La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les tétramères des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire.
La présente invention a ainsi, en outre, pour objet une méthode de tri de lymphocytes T spécifiques du VHC, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- incubation ou mise en contact, d'une suspension de cellules à trier avec un ou plusieurs tétramères marqués formés à partir de complexes entre des peptides C et/ou NS3 tels que définis ci-dessus et des molécules HLA II solubles, et
- tri des cellules marquées par les tétramères. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'au dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre les séquences des peptides issus des protéines C et NS3 qui ont été étudiés. Pour simplifier les différents peptides ont été dénommés
!C à 6C et 8N à 29N. - la figure 2 illustre l'activité de liaison d'une première série de peptides des protéines C et NS3, vis-à vis des molécules HLA π prépondérantes dans la population caucasienne. Les valeurs correspondent aux IC50, exprimées en nM. Les valeurs inférieures à 1000 nM, correspondant aux peptides présentant une bonne affi- nité pour les molécules HLA H, sont indiquées en gras, nd : non déterminé.
- la figure 3 illustre l'activité de liaison, vis-à vis des molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne, d'une seconde série de peptide des protéines C et NS3, dérivés de la première série. Les valeurs correspondent aux IC50, exprimées en nM. Les valeurs inférieures à 1000 nM, correspondant aux peptides présentant une bonne affinité pour les molécules HLA H, sont indiquées en gras, nd : non déterminé.
- la figure 4 illustre l'immunogénicité in vivo de 3 peptides de la protéine NS3 présentant une forte affinité pour HLA-DRl (8N 1007-1037, 15N 1174- 1195 (15N) et 28N 1524-1553, mesurée par un test de prolifération des splénocytes de souris transgéniques pour les molécules HLA-DRl humaines, préalablement immunisées par chacun des peptides (figure 4A) ou par un mélange de ces peptides (figure 4B). Les peptides 3C 93-107, 6C 148-173 et 12N 1094-1119 qui possèdent une faible affinité pour HLA-DRl sont utilisés comme contrôle. Les valeurs correspondent à l'index de prolifération des splénocytes. - la figure 5 illustre l'immunogénicité in vitro de 6 peptides de la protéine NS3 présentant une forte affinité pour au moins 4 molécules HLA II différentes prépondérantes dans la population caucasienne (8N 1007-1021, 8N 1019-1033, 15N 1178-1193, 28N 1538-1552, 18N 1250-1264 et 8N 1024-1037), mesurée par un test ELISPOT, à partir de 3 lignées de lymphocytes T CD4+ issues d'un individu séro- négatif (P014/A, P014/B et P014/C) ; les lymphocytes T ont été préalablement stimulés in vitro par des cellules dendritiques de ce même individu chargées par le mélange de peptides) puis le nombre de lymphocytes T sécréteurs d'IFN-γ.a été mesuré en présence de cellules dendritiques non chargées issues du même individu et en présence de ces peptides seuls ou en mélange (mix HCV) ou bien en l'absence de peptides (- peptide). Les valeurs indiquées correspondent au nombre de lymphocytes T sécréteurs d'IFN-γ. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : DETERMINATION DES CONDITIONS DES TESTS DE LIAISON PEPTIDES/MOLECULES HLA II 1) Peptides
Tous les peptides sont synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrometrie de masse (ES-MS). a) Première série de peptides
L'activité de liaison des peptides des protéines C et NS3 du VHC aux molécules HLA H, a été testée à partir de 25 fragments de grandes tailles (entre 15 et 34 acides aminés), choisis selon deux critères :
- présence de plusieurs résidus aromatiques ou hydrophobes qui sont les principaux résidus d'ancrage pour les molécules HLA-DR et HLA-DP, et
- bonne probabilité de pouvoir être synthétisés.
Les séquences des peptides sélectionnés, issues du génotype la, sont présentées dans le Tableau m ci-dessous.
Figure imgf000027_0001
* les résidus alanine correspondant à la substitution d'un résidu cystéine de la séquence de la polyprotéine du VHC sont indiqués en gras. b) deuxième série de peptides Tous les peptides de la première série se liant à au moins 6 molécules HLA II et certains peptides se liant à au moins 5 molécules HLA Et ont été découpés en peptides de 15 acides aminés afin d'identifier plus précisément les zones d'interaction (peptides 8N, 9N, ION, 15N, 16N, 18N, 19N, 23N, 27N, 28N, 29N, 1C, 2C et 5C). Seul le peptide 26 n'a pas été étudié en raison de la difficulté à le synthéti- ser. Le peptide 6C qui est très chevauchant avec le peptide 5C et qui en combinaison avec ce dernier se lie à 6 molécules HLA II a également été étudié.
La séquence de l'ensemble de ces peptides est présentée dans le Tableau IV et la figure 1.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
2) Molécules HLA II a) Choix des allèles
12 molécules HLA II (10 molécules HLA-DR et 2 molécules HLA- DP) les plus abondantes dans la population française et dont les fréquences alléliques sont caractéristiques de la population caucasienne, ont été sélectionnées (Tableau VTJJ):
- molécules HLA-DR dont la chaîne β est codée par le gène DRl
Il s'agit des molécules HLA-DRl, -DR3, -DR4, -DR7, -DRU, - DRl 3 et -DRl 5 dont la chaîne β est codée par les allèles du locus DRBl dont la fréquence dépasse les 5 % dans la population française : DRB 1*0101, DRB 1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRBl*1501 qui représentent à eux seuls 64 % de la population. Ces mêmes allèles sont les allèles HLA-DR les plus abondants dans les autres populations caucasiennes. Leur fréquence varie entre 53 % (en Espagne) et 82 % (au Danemark). Pour les Etats-Unis et le Canada, ils représentent respectivement 58 et 55 % des allèles DR de la population.
- molécules HLA-DR dont la chaîne β n'est pas codée par le gène DRl
Il s'agit des molécules HLA-DRB3, -DRB4 et -DRB5 dont la chaîne β est codée par les allèles les plus fréquents dans la population française : HLA- DRB3*0101 (9,2 %), HLA-DRB4*0101 (28,4 %), et HLA-DRB5*0101 (7,9 %). Ces molécules couvrent à elles seules 45 % de la fréquence allélique.
- molécules HLA-DP
Il s'agit des molécules HLA-DP4 qui regroupent les molécules codées par les allèles DPB 1*0401 et DPB 1*0402. Ces molécules DP4 sont les molécules HLA II les plus abondantes en Europe et aux Etats Unis. Leur fréquence allélique est en effet de 40 et 11 % respectivement ce qui signifie qu'elles sont l'une ou l'autre trouvées chez environ 76% des individus. Les peptides présents dans une séquence proteique et qui lient l'ensemble de ces molécules incluent donc les épitopes T CD4 de la majorité de la population, b) purification des molécules HLA II
Les molécules HLA H sont purifiées par immunoaffinité à partir de différentes lignées homozygotes de lymphocytes B humains transformées par le virus Epstein Barr (EBV).
L'origine des lignées EBV et les différents allèles qui les caractérisent sont décrits dans les Tableaux V et VI ci-dessous .
Tableau V : Spécificité DR des lignées EBV
Figure imgf000030_0001
Strang et al. J. Gen Virol., 1990, 71, 423, °° Tsukui et al., Cancer Res., 1996, 56, 3967 Tableau VI : Lignées EBV exprimant DP4
Figure imgf000031_0001
° l'origine des lignées est décrite sur le site internet de la Collection européenne de Culture Cellulaire (http: Il fuseiv.co.uk/camr/.)
Les molécules HLA-DR et HLA-DP sont immunopurifiés au moyen des anticorps monoclonaux respectivement L243 (Smith et al., P.N.A.S., 1982, 79, 608-612) et B7/21 (WATSON et al., Nature, 1983, 304, 358-361), selon les protocoles décrits dans Texier et al.(J. Immunol., 2000, 164, 3177 ; Eur. J. Immunol., 2001, 31, 1837). 3) Tests de liaison HLA H/peptides a) principe des tests
Les tests de liaison des peptides aux molécules HLA-DP et HLA- DR sont des tests en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, dérivés de ceux mis au point pour des molécules HLA-DR (HLA-DRl: MARSHALL et al., J. Immunol., 1994, 152, 4946- ; HLA-DRl, -DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DRU et -DR13 : Demande de Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al., précités).
Les tests de liaison sont réalisés de la manière suivante: les molécules HLA-DR ou HLA-DP sont diluées dans des plaques à 96 puits en poly- propylène, dans du tampon phosphate lOmM, NaCl 150 mM, dodécyl maltoside (DM) 1 mM, citrate 10 mM, thimérosal 0,003%, à un pH et une dilution appropriés pour chaque molécule. Un peptide traceur biotinylé (Tableau VIII) est ajouté à une concentration donnée, ainsi que plusieurs concentrations de peptides à tester (peptide compétiteur). A la fin de l'incubation à 37°C (entre 24 et 72 heures selon les molécules), les échantillons sont neutralisés avec 50 μL de tampon Tris HC1 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Ils sont ensuite transférés sur des plaques ELISA maxisorp (96 puits) sur lesquels les anticorps anti-DP ou anti-DR ont été préalablement adsorbés. L'incubation des échantillons sur ces plaques est réalisée pendant deux heures à température ambiante. Des lavages sont effectués entre chaque étape en tampon Tris HC1 0,1M, pH 7,5, Tween-20 0,05%. Le peptide biotinylé lié aux molécules HLA II est détecté par l'addition de 100 μL/puits du conjugué strepta- vidine-phosphatase alcaline (45 minutes) dilué au 1/2000 dans le tampon Tris lOmM, pH 7, NaCl 0,15M, Tween 20 0,05%, BSA 0,2%, thimérosal 0,003%, puis de 200 μL/puits du substrat 4-méthyl-umbelliféryl-phosphate (MUP) à la concentration de 100 μM, en tampon NaHCO3 0,05M, pH 9,8, MgCl2 ImM. L'émission de fluorescence par le produit de la réaction enzymatique est mesurée à 450 nm après excitation à 365 nm. La liaison maximale est déterminée en incubant le peptide traceur biotinylé avec la molécule HLA II en l'absence de peptide compétiteur. La spécificité de liaison est contrôlée par l'addition d'un excès de peptide non biotinylé. Le bruit de fond obtenu ne diffère pas significativement de celui obtenu en incubant le peptide biotinylé sans les molécules HLA H. Les résultats sont exprimés sous la forme de la concentration de peptide compétiteur qui inhibe 50% de la liaison maximale du pep- tide traceur biotinylé (IC50). b) Conditions et sensibilité des tests
Pour chaque test de liaison, la concentration en molécules HLA H, la concentration du peptide traceur, le pH d'incubation et le temps d'incubation ont été optimisés comme précisé dans le Tableau Vu ci-après. TABLEAU VII : Conditions des tests de liaison aux molécules HLA II
Allèles dilution Traceurs Concentration pH Temps traceur optimal d'incubation
(nM) (h)
DRB1*0101 1/40 à 1/400 HA 306-318 1 6 24
DRB 1*0301 1/10 à 1/40 MT 2-16 200 4,5 72
DRB 1*0401 l/20à 1/100 HA 306-318 30 6 24
DRB 1*0701 1/20 à 1/100 YKL 10 5 24
DRBi iOl 1/20 à 1/100 HA 306-318 20 5 24
DRB1*1301 1/10 à 1/40 Bl 21-36 200 4,5 72
DRB1*1501 1/10 à 1/100 A3 152-166 10 4,5 72
DRB5*0101 1/10 à 1/100 HA 306-318 10 5,5 24
DRB3*0101 1/10 à 1/100 Loi 191-120 10 5,5 24
DRB4*0101 1/10 à 1/100 E2/E168 10 5 72
DBP 1*401 1/20 à 1/400 Oxy 271-287 10 24
DPB 1*402 1/20 à 1/100 Oxy 271-287 10 24 La sensibilité de chaque test est reflétée par les IC observées avec les peptides non-biotinylés qui correspondent aux traceurs et les résultats obtenus sont illustrés au Tableau VIÏÏ ci-après.
Tableau VIII : Sensibilité des tests de liaison au molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne
Allèles Fréquence Peptides Séquences IC50
(SEQ ID NO: 75 à 82) (nM)
DRB1*0101 9,3 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 31
DRB 1*0401 5,6 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 44
DRB1*1101 9,2 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 38
DRB 1*0701 14,0 YKL AAYAAAKAAALAA 34
DRBl*0301 10,9 MT 2-16 AKTIAYDEEARRGLE 100
DRB1*1301 6,0 Bl 21-36 TERVRLVTRHIYNREE 330
DRB1*1501 8,0 A3 152-166 EAEQLRRAYLDGTGVE 14
DRB5*0101 7,9 HA 306-318 PKYVKQNTLKLAT 6,5
DRB3*0101 9,2 Loi 191-120 ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT 5
DRB4*0101 28,4 E2/E168 AGDLLAIETDKATI 2
DPB 1*401 40 Oxy 271-287 EKKYFAATQFEPLAARL 10
DPB 1*402 11 Oxy 271-287 EKKYFAATQFEPLAARL 10
Les fréquences indiquées, issues de Colombani (HLA: fonctions immunitaires et applications médicales. 1993. Eds John Libbey Eurotext).qui sont les fréquences alléliques en France, sont représentatives de celles de la population caucasienne.
EXEMPLE 2 : ACTIVITES DE LIAISON DES PEPTIDES C et NS3 VIS-A-VIS DES MOLECULES HLA II PREPONDERANTES DANS LA POPULATION
CAUCASIENNE.
1) Première série de peptides (figure 2)
L'activité de liaison des peptides longs tels que définis à l'exemple 1, vis à vis des 12 molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne (HLA-DRl, -DR3, -DR4, -DR7, -DRU, -DR13, -DR15, -DRB3, -DRB4, -DRB5, -
DP401, et -DP402 ; tableau VIÏÏ ) a été mesurée dans les conditions précisées à l'exemple 1.
Les résultats illustrés par la figure 2 montrent que chaque peptide se lie avec une bonne affinité (IC50 < 1000 nM) à au moins une molécule HLA ïï et que plusieurs peptides se lient avec une bonne affinité à plusieurs molécules HLA ïï.
Parmi ces derniers, les peptides 26N, 8N, 28N, IC, ION, 15N, 19N, 29N, 2C, 16N, 18N, 23N, 27N, 5C, 9N, UN, 13N, 14N, 17N, 24N, 4C et 22N se lient avec une bonne affinité à au moins 4 molécules HLA ïï différentes. 2) Deuxième série de peptides (figures 3 et Tableau IX)
Les résultats illustrés par la figure 3 et le Tableau LX permettent de préciser les zones d'interaction des peptides avec les différentes molécules HLA ïï. Tableau IX: Activités de liaison des peptides 9N et 29N vis-à-vis des molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne.
DRÎ DR3 DR4 DR7 DR?Ï DRÏ3 DR15 DRB3 DRB4 DRB5
9N 1036-1055 5Î >100000 950 26ÔÔ 7ÔÔ >100000 5500 1000 53
9N 1036-1050 16 >100000 350 2500 1100 >100000 1550 300 2000
9N 10411055 190 62500 2900 25000 2600 >100000 525 65000 11
29N 1552-1583 170 6750 4000 750 90 27333 60 25000 333
29N 1559-1573 29 >100000 3000 18 7 >100000 305 >100000 32
29N 1563-1577 8 3900 2100 16 817 3250 13 40000 12
29N 1569-1583 950 >100000 10500 3000 22 >100000 2800 >100000 21000
EXEMPLE 3 : IMMUNOGENICITE DE PEPTIDES NS3 IN VIVO CHEZ DES SOURIS TRANSGENIQUES POUR UNE MOLECULE HLA II
La capacité des peptides ayant une bonne affinité pour les molécules HLA ïï tels que définis ci-dessus à induire une réponse immunitaire, a été évaluée par un test de prolifération in vitro, chez des souris transgéniques pour les molécules HLA-DRl (Wilkinson et al., Infect. Immunity, 1999, 67, 1501-; Rosloniec et al., J. Exp. Med., 1997, 185, 1113-), préalablement immunisés avec ces peptides.
Plus précisément, le protocole utilisé est le suivant : 25 μg de chacun des peptides 8N 1007-1037, 15N 1174-1195, 28N 1524-1553, 3C 93-107, 6C 148-173 et 12N 1094-1119, séparément, ou bien 10 μg et 25 μg d'un mélange des mêmes peptides 8N, 15N et 28N ont été émulsifiés dans du montanide et injectés, par voie sous-cutanée, à un groupe de 5 souris. 15 jours après, une deuxième injection a été effectuée dans les mêmes conditions. Dix jours après cette deuxième injection, les animaux ont été sacrifiés et leur rate prélevée. Les splénocytes ont été mis en culture dans du milieu HL-1 (BIOWHITTAKER) supplémenté par 1% de sérum de souris, en présence de 5μg/ml de chacun des peptides utilisés pour l'injection, ou en l'absence de peptide. Après 4 jours de culture, lμCi de thymidine tritiée (AMERSHAM, LIFE TECHNOLOGEE) a été rajoutée pendant 16 h. L'incorporation de la thymidine tritiée a ensuite été mesurée à l'aide d'un compteur béta (microbéta 1450, PERKIN ELMER). Les résultats sont exprimés en index de prolifération (nombre de CPM en présence de peptide/nombre de CPM en l'absence de peptide).
Les résultats montrent que les peptides 8N1007-1037, 15N 1174- 1195 et 28N 1524-1553 qui possèdent une forte capacité de liaison à la molécule HLA-DRl (IC50 de respectivement 2, 3 et 2 nM) induisent une forte réponse immunitaire chez ces souris alors que les peptides 3C93-107, 6C148-173 et 12N1094-1119 qui possèdent un faible capacité de liaison à cette molécule (IC50 de respectivement 6333, 10000 et > 10000 nM) n'induisent pas d'effet (figure 4A). Ces résultats montrent également que l'injection d'un mélange de peptides n'a pas d'effet délétère sur la réponse immunitaire et permet d'induire une forte réponse contre chacun des peptides du mélange (figure 4B).
Ces résultats confirment que les peptides sélectionnés par le test de liaison aux molécules HLA ïï sont capables d'induire une forte réponse CD4+ chez les individus immunisés. Ils indiquent donc que les peptides sélectionnés peuvent être utilisés dans des compositions immunogènes pour la vaccination contre l'hépatite C. EXEMPLE 4 : IMMUNOGENICITE DE PEPTIDES NS3 IN VITRO
La capacité des peptides ayant une bonne affinité pour les molécules HLA ïï à induire in vitro une stimulation de lymphocytes T spécifiques a été évaluée à partir de prélèvements sanguins de personnes séronégatives pour le VHC. Il s'agit d'évaluer la capacité à recruter des lymphocytes précurseurs CD4+ alors qu'ils sont chez un individu naïf à une très faible fréquence c'est-à-dire d'effectuer une immunisation in vitro au moyen de ces peptides. a) Matériels et méthodes Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été séparées sur un gradient de Ficoll. Les PBMCs ont ensuite été mises en culture dans du milieu AM V (LD?E TECHNOLOGffiS) et incubées dans des flasques, à l'étuve à 37°C en présence de 5% CO2. Après une nuit d'incubation, les cellules non adhérentes ont été récupérées, déposées sur une colonne LS+ (MYLTENYI), puis les lympho- cytes T CD4+ ainsi purifiés ont été congelés. Les cellules adhérentes ont été incubées pendant 5 jours, dans du milieu AEVI V contenant lOOOU/ml de GM-CSF et lOOOU/ml d'E -4, puis les cellules différenciées en cellules dendritiques ont ensuite été cultivées pendant 2 jours, en présence de lμg/ml de LPS, 1000 U/ml d'EL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF, de manière à induire leur maturation.
Les cellules dendritiques matures (100 000 cellules/puits) ont alors été incubées avec un mélange de peptides (10 μg de chaque peptide), pendant 5 heures à 37°C. Les cellules dendritiques matures ont ensuite été lavées puis incubées, en présence des lymphocytes T CD4+ (100 000 cellules/puits) préalablement décongelés, dans du milieu contenant 1000 U/ml d'E -6 et lOng/ml d'EL-12. Après 7 jours, la culture a été restimulée une première fois, au moyen de cellules dendritiques matures préalablement décongelées et chargées par le mélange de peptides, dans du milieu contenant de 1TL-2 (10 U/ml) et de 1TL-7 (5ng/ml). 7 jours plus tard, la culture a été restimulée, de façon similaire, dans un milieu ne contenant pas d'IL-2. Après deux stimulations supplémentaires, dans les conditions précédentes, les cellules ont été testées en ELISPOT, de la façon suivante :
Des anticorps anti-EFN γ (1-D1K, MABTECH) dilués à 1 μg/ml dans du tampon PBS ont été adsorbés sur des plaques de nitrocellulose (MÏÏXEPORE) pendant lheure à 37°C. Les plaques ont ensuite été lavées avec du PBS puis saturées avec du milieu RPMI contenant 10 % SVF (lOOμl/puits), pendant 2 h à 37 °C. Les cellules dendritiques matures préalablement décongelées (10000 cellules/puits) et 10 000 lymphocytes à tester ont ensuite été ajoutés dans les plaques et incubées 24 h à 37 °C, en présence ou en l'absence d'un seul peptide ou d'un mélange de peptides. Après un lavage avec du tampon PBS puis avec du PBS Tween 0,05%, 100 μl d'anticorps secondaire anti-EFN-γ conjugué à la biotine (7-B6-l-biotin, MABTECH), dilué à 1 μg/ml dans du PBS contenant 0,05% Tween 20 et 1% BSA, a été ajouté dans chaque puits. Après une heure d'incubation, les plaques ont été lavées à nouveau et incubées avec lOOμl/puits d'Extravidin-AKP (n° 2636, SIGMA,), diluée au 1/5000 dans du PBS contenant 0,05 % Tween 20 et 1 % BSA. La révélation de la réaction immuno- enzymatique a ensuite été réalisée à l'aide du kit n° 170-6432 (BIORAD) b) Résultats
Les PBMC d'un patient séronégatif (PO 14) ont été testées selon le protocole tel que défini ci-dessus, avec le mélange des peptides suivants : 8N 1007-
1021, 8N 1019-1033,15N 1178-1192, 28N 1538-1552, 18N 1250-1264 et 8N 1024-
1037. Après 4 restimulations, un ELISPOT a été réalisé sur différents puits. Trois lignées spécifiques ont pu être mises en évidence (figure 5). Ces trois lignées répondent en présence du mélange de peptides (mix) mais pas en l'absence du mélange. Chaque lignée répond à au moins un des peptides du mélange. La lignée P014/A répond au peptide 15N 172-186 et au peptide 18N 244-258 (figure 5A). La lignée P014/B répond au peptide 8N 13-27 (figure 5B) et la lignée P014/C aux peptides 15N 172-186 et 28N 532-546 (figure 5C).
EXEMPLE 5 : DETECTION DE LYMPHOCYTES T SPECIFIQUES DU VHC A L'AIDE DES PEPTIDES C ET NS3. La capacité des peptides possédant une affinité élevée pour les molécules HLA de classe ïï tels que définis ci-dessus, à détecter des lymphocytes T spécifiques du virus de l'hépatite C (VHC), a été testée in vitro par le dosage des cytokines EFN-γ, EL-2, IL-4 et EL- 10 produites par les lymphocytes T issus de PBMC de patients infectés de façon chronique par le VHC. De manière plus précise, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patients infectés de façon chronique par le VHC ont été séparées sur gradient de Ficoll, à partir d'un prélèvement sanguin héparine. Les PBMC isolées ont ensuite été cultivées à 37°C, dans des plaques à 96 puits contenant du milieu RPMI 1640 (GIBCO) complet (10 % sérum humain 10 %, 100 Ul/ml pénicilline et lOμg/ml streptomycine), seul ou en présence :
- d'un mélange des peptides C 19-47 et 31-57, d'un mélange des peptides C 127-149 et 148-173 ou des peptides NS3 1007-1037, 1036-1055, 1074- 1195, 1190-1212, 1377-13403, 1524-1553, 1552-1583, chacun à la concentration de 10 μg/ml, - d'un mélange de l'ensemble de ces peptides, chacun à la concentration de 110 μg/ml, 55 μg/ml ou 11 μg/ml, ou
- de phytohémagglutinine (PHA) ou de toxine tétanique (TT), chacune à la concentration de 2,5 μg/ml .
Les surnageants de culture ont été récoltés à 24h ou 48h et stockés à -80 °C jusqu'à l'analyse.
Les cytokines éventuellement présentes dans les surnageants ont été dosées de la façon suivante : Des plaques à 96 puits (Maxisorp, NUNC) ont été recouvertes de 100 μl d'anticorps anti-IFN-γ, IL-2, IL-4 et EL-10 (BECTON DICKXNSON, 2μg/ml) dans du tampon carbonate 0,1M, pH 8, 6 et incubées 2h à 37°C. Après trois lavages successifs avec du tampon PBS contenant 0,05 % de Twen 20, les plaques ont été saturées avec 200 μl de PBS contenant 3 % de sérum albumine bovine (BSA, SIGMA), pendant 2h à température ambiante. 50 μl de surnageant de culture (en double), ainsi qu'une une gamme étalon de cytokines recombinantes humaines (rH-IFN-γ, rH-IL-2, rH-IL-4 et rH-EL-10 ; BECTON DICKJNSON) ont ensuite été ajoutés dans chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 12h à + 4°C. Après trois lavages successifs avec du tampon PBS contenant 0,05 % de Twen 20, 100 μl d'anticorps secondaires anti-IFN-γ, IL-2, IL-4 et EL- 10 (BECTON DICKDSfSON, 1 μg/ml) dans du tampon PBS contenant 1 % de BSA ont été ajoutés dans les puits puis les plaques ont été incubées lh à température ambiante. Après quatre lavages successifs avec du tampon PBS contenant 0,05 % de Twen 20, 100 μl de streptavidine-peroxydase (SIGMA) diluée au 1/10000 dans du tampon PBS contenant 0,1 % BSA ont été ajoutés dans les puits, puis les plaques ont été incubées 30 min à température ambiante. Après quatre lavages successifs avec du tampon PBS contenant 0,05 % de Twen 20, 100 μl d'orthophényldiamine (OPD, SIGMA, 400 μg/ml) dans du tampon citrate 50 mM ont été ajoutés dans les puits et les plaques ont été incubées à température ambiante, puis la réaction a été stoppée par ajout de 50 μl d'HCl 2N. La densité optique a ensuite été mesurée à 540 nM et l'analyse quantitative des cytokines a été réalisée à l'aide du logiciel Deltasoft (DS3-1.518F/1994 E. BERCHTOLD & BIOMETALLICS INC). Les résultats, exprimés en pg/ml, sont présentés au Tableau X.
Tableau X: Dosage de cytokines produites par les lymphocytes T de patients infectés chroniques, après stimulation par les peptides C et NS3, seuls ou en mélange.
Figure imgf000039_0001
* dosage à 24h au lieu de 48 h ; NT: non testé; - : non détecté Le Tableau X montre que 8 patients sur 9 présentent des cellules spécifiques d'au moins un des peptides C ou NS3, sécrétrices d'EL-2, EFN-γ, d'EL-4 ou dTL-10. Il montre également qu'un mélange de peptides C et NS3 permet de détecter des lymphocytes T spécifiques du VHC au moins aussi efficacement que les peptides utilisés séparément, et qu'il augmente même la sensibilité de cette détection (voir patient 342).
Ces résultats indiquent que les peptides ayant une bonne affinité pour les molécules HLA ïï tels que définis ci-dessus, peuvent être utilisés dans un test de diagnostic de l'état immunitaire de patients vis-à-vis de l'infection par le VHC.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Mélange de peptides, caractérisé en ce qu'il inclut au moins deux peptides différents issus du virus de l'hépatite C, dont l'un au moins est un peptide issu de la protéine C, se liant à au moins quatre molécules HLA ïï différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison < 1000 nM.
2°) Mélange de peptides selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il inclut, outre ledit peptide issu de la protéine C, au moins un peptide issu de la protéine NS3, se liant à au moins quatre molécules HLA ïï différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison < 1000 nM.
3°) Mélange de peptides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les dites molécules HLA ïï sont choisies parmi les molécules HLA-DRl, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRl 1, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3 , HLA-DRB4, HLA-DRB5 et HLA-DP4.
4°) Mélange de peptides selon la revendication 3, caractérisé en ce que les dites molécules HLA ïï sont codées respectivement par les allèles HLA DRB1*0101, DRB1*0301, DRB 0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301, DRB1*1501, DRB3*0101, DRB4*0101, DRB5*0101, DP*0401 et DP*0402. 5°) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les peptides issus de la protéine C du virus de l'hépatite C, sont sélectionnés dans le groupe constitué par : a) les peptides correspondant respectivement aux positions 19-47, 27-51, 31-57, 104-133 et 127-167, b) les peptides d'au moins 11 acides aminés inclus dans les peptides tels que définis en a), et c) les peptides dérivés des peptides tels que définis en a) ou en b) par substitution par des résidus alanine (C -> A), de résidu(s) cystéine situé(s) en position + 1 ou + 2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position -1, - 2 ou - 3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale. 6°) Mélange de peptides selon la revendication 5, caractérisé en ce que les peptides d'au moins 11 acides aminés tels que définis en b) sont sélectionnés dans le groupe constitué par :
- le peptide inclus dans le peptide 27-51 correspondant aux positions
27-41,
- le peptide inclus dans le peptide 31-57 correspondant aux positions
31-45, et
- les peptides inclus dans le peptide 127-167 correspondant respectivement aux positions 127-149, 131-145, 131-148, 131-167, 134-148 et 148-167. 7°) Mélange de peptides selon la revendication 5, caractérisé en ce les peptides tels que définis en c) sont sélectionnés dans le groupe constitué par le peptide dérivé du peptide C 127-149 de séquence SEQ ED NO: 5.
8°) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que les peptides issus de la protéine NS3, sont sélectionnés dans le groupe constitué par : d) les peptides correspondant respectivement aux positions 1007- 1037, 1036-1055, 1052-1072, 1076-1093, 1127-1153, 1149-1172, 1174-1195, 1190- 1212, 1206-1239, 1246-1275, 1275-1304, 1361-1387, 1377-1403, 1404-1432, 1456- 1481, 1495-1513, 1524-1553 et 1552-1583, e) les peptides d'au moins 11 acides aminés inclus dans les peptides précédents, et f) les peptides dérivés des peptides tels que définis en d) ou en e) par substitution par des résidus alanine (C — » A), de résidu(s) cystéine situé(s) en position + 1 ou + 2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position -1, - 2 ou - 3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale.
9°) Mélange de peptides selon la revendication 8, caractérisé en ce que les peptides d'au moins 11 acides aminés tels que définis en e) sont sélectionnés dans le groupe constitué par :
- les peptides inclus dans le peptide 1007-1037 correspondant respectivement aux positions 1007-1021, 1015-1029, 1015-1037, 1019-1033 et 1020-
1034, - les peptides inclus dans le peptide 1174-1195 correspondant respectivement aux positions 1174-1188, 1174-1192 et 1178-1192,
- les peptides inclus dans le peptide 1190-1212 correspondant respectivement aux positions 1190-1204 et 1192-1206, - les peptides inclus dans le peptide 1246-1275 correspondant respectivement aux positions 1246-1260, 1246-1264, 1250-1264 et 1261-1275,
- les peptides inclus dans le peptide 1377-1403 correspondant respectivement aux positions 1381-1395, 1381-1397, 1381-1403 et 1383-1397,
- le peptide inclus dans le peptide 1495-1513 correspondant respecti- vement aux positions 1495-1509,
- les peptides inclus dans le peptide 1524-1553 correspondant respectivement aux positions 1524-1552, 1524-1538, 1528-1542, 1528-1552, 1529- 1543, 1534-1548, 1538-1552 et 1540-1553, et
- les peptides inclus dans le peptide 1552-1583 correspondant respectivement aux positions 1559-1573 et 1563-1577.
10°) Mélange de peptides selon la revendication 8, caractérisé en ce que les peptides tels que définis en f) sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences SEQ ï) NO: 10, 13, 20, 22 et 24 et les séquences dérivées de la séquence
SEQ ï) NO: 24 correspondant respectivement aux positions 1524-1538, 1524-1552, 1528-1552, 1538-1552 et 1540-1553.
11°) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il inclut des peptides issus des protéines C et NS3 du Virus de l'hépatite C de génotype 1.
12°) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il inclut 2 à 6 peptides différents issus des protéines C et NS3, l'ensemble des peptides se liant à au moins 10 molécules HLA ïï dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne.
13°) Mélange de peptides selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il inclut des peptides sélectionnés dans le groupe constitué par les peptides issus de la protéine C correspondant respectivement aux positions 27-51, 131-167, 127-149,
131-148, 148-167 et les peptides issus de la protéine NS3 correspondant respective- ment aux positions 1007-1037, 1015-1037, 1036-1055, 1174-1192, 1190-1212, 1246- 1264, 1381-1403, 1381-1397, 1524-1553, 1528-1552 et 1552-1583.
14°) Mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il est sous forme d'une protéine de fusion comprenant une séquence des peptides dudit mélange, à l'exclusion de la séquence correspondant à la fusion des peptides C 31-45, C 141-155 et NS3 1207-1221.
15°) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de fusion selon la revendication 14.
16°) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15.
17°) Cellule, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon la revendication 16.
18°) Composition immunogene anti-VHC, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : - un mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, et/ou
- une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15, ou
- un vecteur recombinant selon la revendication 16, en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éven- tuellement au moins un adjuvant.
19°) Composition immunogene selon la revendication 18, caractérisée en ce que lesdits peptides sont sous forme de peptides modifiés ou bien associés à des liposomes ou à des lipides, notamment sous forme de lipopeptides.
20°) Composition immunogene selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisée en ce que ledit mélange de peptides est associé :
- à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et plus particulièrement des épitopes CD8+ issus d'une protéine du VHC tels que les peptides C 2-10, 28-36, 35-44, 41-49, 42-50, 85-98, 88-97, 127- 140, 131-140, 132-140, 167-176, 178-187, 181-190 ; les peptides El 220-227, 233- 242, 234-242, 363-371 ; les peptides E2 401-411, 460-469, 489-496, 569-578, 621- 628, 725-733 ; les peptides NS2 826-838, 838-845 ; les peptides NS3 1073-1081, 1169-1177, 1287-1296, 1395-1403, 1406-1415 ; les peptides NS4A 1585-1593, 1666- 1675 ; les peptides NS4B 1769-1777, 1789-1797, 1807-1816, 1851-1859 ; le peptide NS5A 2252-2260 et les peptides NS5B 2588-2596, 2727-2735.
- à d'autres peptides comprenant des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide de la toxine tétanique TT (positions 830-846), le peptide de l'hémagglutinine d'Influenza HA (positions 307-319), PADRE et le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum et/ou
- à un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes B, plus particulièrement des épitopes B issus d'une protéine du VHC reconnus spécifiquement par des anticorps dirigés contre ces derniers, tels que tels que le peptide C 5-27, le peptide NS4 1698-1719 et le peptide NS5 2295-2315.
21°) Vaccin, caractérisé en ce qu'il inclut une composition immunogene selon l'une quelconque des revendications 18 à 20.
22°) Peptides issus d'une protéine C ou NS3 du VHC caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : les peptides issus de la protéine C, tels que définis à l'une quelconque des revendications 1, 3 à 7, 11, 13 et 14, à l'exclusion du peptide C 31-45, C 21-40, C 20-44, C 23-42, C 111-130, C 109- 128, C 128-152, C 131-150, C 133-152, C 138-162, C 141-155, C 142-161, C 141- 160 et C 145-164, et les peptides issus de la protéine NS3 choisis parmi :
- les peptides correspondant respectivement aux positions 1007- 1037, 1036-1055, 1052-1072, 1076-1093, 1127-1153, 1149-1172, 1174-1195, 1190-
1212, 1206-1239, 1275-1304, 1361-1387, 1377-1403, 1404-1432, 1456-1481, 1495- 1513, 1524-1553 et 1552-1583 et les peptides d'au moins 11 acides aminés inclus dans les peptides précédents, tels que définis aux revendications 8 et 9, à l'exclusion des peptides NS3 1384-1401 et NS3 1207-1221, - les peptides correspondant respectivement aux positions 1246-1260 et 1261-1275, tels que définis à la revendication 9,
- les peptides dérivés des peptides précédents par substitution par des résidus alanine (C — > A), de résidu(s) cystéine situé(s) en position + 1 ou + 2, relativement au résidu d'acide aminé en position N terminale et/ou en position -1, - 2 ou - 3, relativement au résidu d'acide aminé en position C terminale, tels que définis aux revendications 8 et 10, et - les peptides dérivés des peptides précédents, tels que définis aux revendications 11 et 14.
23°) Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide selon la revendication 22 ou un mélange de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, éventuellement marqué ou complexé, sous la forme de complexes multimériques.
24°) Procédé d'évaluation de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la présence de cellules T CD4+ spécifiques des peptides C et/ou NS3 tels que définis aux revendications 1 à 14. 25°) Méthode de tri de lymphocytes T spécifiques du VHC, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- mise en contact, d'une suspension de cellules à trier avec un ou plusieurs tétramères marqués formés à partir de complexes entre des peptides C et/ou NS3 tels que définis aux revendications 1 à 14 et des molécule HLA ïï solubles , et - tri des cellules marquées par les tétramères.
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