WO2004013349A2 - Verfahren zur untersuchung und beurteilung von virusenzymen im hochdurchsatz-screening hts - Google Patents

Verfahren zur untersuchung und beurteilung von virusenzymen im hochdurchsatz-screening hts Download PDF

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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • Cell culture systems are disclosed for examining the activity of the viral proteases NS2 / 3 and NS3 / 4A of the hepatitis C virus (HCV) and for identifying substances in high throughput screening (HTS) which modulate the activity of the proteases.
  • HCV hepatitis C virus
  • HTS high throughput screening
  • Viral infections e.g. caused by the human immunodeficiency virus (HIV), the hepatitis C virus (HCV), the human cytomegalovirus (HCMV) and the associated diseases such as AIDS, hepatitis, cirrhosis of the liver, retinitis and blindness, pneumonia, multiple organ failure, represent a very big problem for the health of the world population over 100
  • Virus propagation including viral proteases such as HCV NS2 / NS3, NS3, NS3 / 4A play a key role because they are essential for viral replication and have a high virus-specificity.
  • Viral proteases are an interesting target for the development of antiviral agents [Wang et al., (2000)].
  • the HCV virus is an enveloped positive-strand RNA virus that belongs to the flavivirus family.
  • the RNA genome has a size of approx. 9500 ribonucleotides and codes for a single polyprotein with approx. 3000 amino acids, which is cleaved into 10 individual proteins in vivo by cellular and viral proteases.
  • C, El, E2, P7 the structural proteins
  • NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b The structural proteins, which result from the cleavage of cellular proteases from the polyprotein, form the later envelope of the virus.
  • the non - structural proteins which catalyze the multiplication of the viral DNA, are cleaved by the two viral proteases NS2 / 3 and NS3 / 4A.
  • the metalloprotease NS2 / NS3 leads to an autocatalytic cleavage between the two proteins NS2 and NS3 (“cis” cleavage I).
  • the protease NS3 serine protease
  • cleaves from the latter Protein NS4a ab (“ice” cleavage II).
  • protease NS3 subsequently forms a complex with the small NS4a protein and catalyzes the cleavage between the remaining non-structural proteins (“trans” cleavage HI between NS4a / NS4b, NS4b / NS5a and NS5a / NS5b) [for an overview, see Bartenschlager, (1999)] ,
  • a system for measuring NS3 / 4A protease activity using the Sindbis viral replication system is described by Cho, Y.G. et al., (1997).
  • a hybrid construct consisting of the HCV protease NS3 / 4A, the NS4a / 4b cleavage site and the Sindbis Gore protein is introduced into cells. The formation of Sindbis virus particles is thus due to the cleavage of the NS4a / 4b interface and the
  • a very big disadvantage of this system is that the protease activity has to be measured indirectly via the cytopathic effect of the recombinant Sindbis viruses that arise, which requires a longer incubation period, whose quantification is difficult and which can only be measured with difficulty through the high-throughput method.
  • this complex system offers a variety of points of attack for non-specific, i.e. non-protease-dependent inhibitors, since active substances that prevent virus formation regardless of the protease function would also appear as potential active substances. This greatly increases the number of substances to be investigated, which in turn is a time-consuming and costly re-test of
  • NS4a / 4b interface fused to the Secreted Alkaline Phosphatase (SEAP) gene.
  • SEAP Secreted Alkaline Phosphatase
  • Phosphatase linearly proportional to the amount of expressed and cleaved fusion is protein and therefore the signal is not amplified and is too low for a measurement in the high-throughput method.
  • the necessary cellular export of the phosphates and the associated cellular processes involved, in addition to transcription and translation offer another point of attack for unspecific inhibitors, which necessitates time-consuming retesting. In this case, too, it is not possible to measure the NS2 / 3 protease activity.
  • One construct contains - in combination with the DHFR gene - the NS2 / 3 protease gene or fragments thereof, to which the transactivator tax (HTLV-1) is fused via the NS5a / 5b interface sequence.
  • the second construct contains a reporter gene (Cat), which is regulated via a tax-dependent promoter.
  • Cat reporter gene
  • the cleavage of the NS5a / 5b site by the NS2 or NS3 protease leads to the release of the transcription factor Tax, which can then cause expression of the reporter.
  • a major disadvantage of this system is that it is not between the activity of NS2 and
  • NS3 protease can be distinguished.
  • the modulatory function of the NS3 protease cofactor NS4a is not taken into account in this system when examining the NS3 activity, since it is not present in this system and therefore effective inhibitors of the NS3 / 4A-mediated transfission cannot be identified.
  • WO 98/00548 discloses the generation of hybrid picomaviruses, the replication of which depends on the protease activity of NS3. Since the NS3 activity is quantified indirectly via the number of viruses formed by means of a cellular plaque assay, this system cannot be carried out in the HTS method either.
  • NS3 but not NS2 / 3 or NS3 / 4A can be detected.
  • the amount of the secreted LL-1 protein is linearly proportional to the protease activity, so that sufficient amplification for implementation in the HTS process is not achieved.
  • the document WO 00/66623 discloses a cellular surrogate system consisting of a chimeric protein between NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b and a tetracycline-dependent transcription factor, which is released after NS3-dependent cleavage and causes the expression of a reporter in the cells. Proof of the NS2 / 3 protease reaction is also not possible here. It is also through
  • Hepatocytes or hepatoma cells - make it possible to take into account the influence of cellular factors and at the same time allow the different protease activities - NS2 / 3 and NS3 / 4A - to be considered separately in order to account for the different enzymatic kinetics of the protease reactions and their characterization to be able to find any active substances more easily and quickly.
  • the present application relates to cellular systems that make it possible to
  • transcriptional regulators - transcriptional regulators of the invention are nucleic acid sequences which code for proteins which regulate the expression of a reporter gene, that is to say increase or decrease the expression of a reporter gene, only then their natural ones Function if they are binding and regulatory regarding their DNA
  • proteases are functional and are located in the correct cell compartment, i.e. in the eukaryotes the nucleus.
  • the enzymatic mode of action of proteases offers the possibility of modulating both the functionality and the localization of target proteins.
  • the function and activity of the viral proteases depends on their cellular location, since further, for example tissue-specific, co-factors modulate the reaction.
  • the following systems take into account the specific peculiarities of the various proteases and enable the native process that takes place during viral replication to be reproduced as closely as possible.
  • Functional transcription regulators of the invention are regulatory proteins or nucleic acids which are located in the cell nucleus and modulate the expression of this reporter gene by binding to a reporter gene.
  • An expression construct is cloned, which codes for a fusion protein which is composed of at least three regulatory components - the modules I-TI.
  • Module I of the invention effects the delocalization of the transcription regulator, it is the transcription factor - inhibitory module.
  • Module LT of the invention is a protease-specific trans-cleaving interface or a cis-cleaving functional protease.
  • Module HI of the invention is a transcriptional regulator that modulates expression of the reporter gene.
  • modulate refers to bringing about a change in the activity, the physicochemical properties or the functional biological, enzymatic, immunological, regulatory effect of a protein. Modulation can be brought about by acting on the protein or by acting on the nuclear acids encoding the protein. Modulation can increase or decrease the functional activity of a protein and change its physicochemical properties, such as the binding strength to other proteins, nucleic acids and other substances.
  • Sensitivity to detection is that the correct selection of the modules suitable for Module I means that the module can only be delocalized into the cell nucleus after specific activation - the cleavage of Module II.
  • Modules suitable according to the invention for module I are, for example, membrane localization signals such as, for example, surface proteins, proteins with receptor properties, transmembrane domains, and modified, for example farnisylated, proteins.
  • any type of transcription factor-inhibitory module can be used which inhibits the function of the transcription regulator until it is split off from the transcription regulator.
  • those proteins or protein fragments are suitable which, although they do not influence the translocation into the cell nucleus, prevent the transcription regulator from binding to the target sequence.
  • an expression plasmid of the protease to be examined is required.
  • These constructs are introduced together into cells and become the various proteins are formed in the cell by a non-cytopathic expression system, the transcription factor-inhibitory module (I) is separated from the transcription regulator as a result of the protease activity, which then gets into the cell nucleus and the expression of the
  • Modulate reporter gene which in turn can be measured and quantified.
  • the fusion protein In the presence of an inhibitory substance, on the other hand, the fusion protein is not cleaved and the transcription regulator cannot get into the cell nucleus.
  • the chimeric expression construct described above is also used here, in which case the trans-cleavage interface (module II) is replaced by a complete protease that membrane-locates an autocatalytic one Enzyme function, for example NS2 / 3.
  • the transduction of the plasmids in mammalian cells results in the expression of the corresponding chimeric fusion protein, which, associated with the membrane, cleaves autocatalytically and thus releases the transcriptional regulator, which can translocate into the cell nucleus and cause expression of the reporter gene ,
  • the systems according to the invention listed above have numerous advantages over the developments described so far.
  • the simple and modular structure offers the possibility to adapt the systems to the specific issues depending on the protease type and to test the proteases separately in their specific environment.
  • the use of a transcriptionally regulated readout process leads to an increase in the signal strength, since a cleavage carried out leads to multiple activation (or repression) of the reporter gene and the signal amplification connected therewith enables it to be carried out in the HTS.
  • the delocalization of the transcription regulator causes a very low background activity, which in turn results in a large induction factor, which is also necessary for an implementation in the HTS method in order to enable identification of active substances given the scatter of the measured values.
  • a quantification with substance addition is possible after a very short time.
  • a viral transfection system such as, for example, recombinant baculoviruses, which are characterized by a high infection rate in hepatoma cell lines and are assigned to the security level S1 / LI, a measurement and quantification of the can be made after only a few hours, generally 6 hours after infection of the cells Protease activity in HTS format possible.
  • HTS high-throughput screening
  • NS3 / 4A of hepatitis C virus can be used in high throughput screening (HTS) on cellular systems, and are characterized in that detection systems are used which are dependent on the activity of such viral proteases, for example the viral proteases of NS2 / 3 and NS3 / 4A train a functional transcription regulator.
  • Methods of the invention are therefore all methods in which an expression construct is used as the transcription regulator, which is composed of at least three regulatory units, with a) one of the regulatory units being a membrane localization signal and causing deletion of the transcription regulator itself, b) one of the regulatory units contains a protease-specific trans-cleaving interface or a cis-cleaving functional protease, and c) one of the regulatory units modulates the expression of a reporter gene.
  • the methods of the invention are also all of the methods described above in which a fusion protein containing a receptor from the group of CD receptors, a viral protease interface of the HCV protease NS3 / 4A, and the transcription regulator GalVPlö are used, and methods in which the fusion protein is used the DNA sequence 8 or one of its homologues is generated, and also procedures in which a fusion protein containing a receptor from the group of CD receptors, the viral HCV-NS2 / 3 protease, or the transcription regulator GalVP16, is used, or methods in which is a fusion protein from DNA
  • Sequence 9 or one of its homologues is generated and the use of activity modulators of the proteases NS2 and NS3 or NS3 / 4A, which were found using the above-described method, for the production of medicaments which are used in the prophylaxis and therapy of HCV infection can. Brief description of the pictures:
  • the proteins are expressed under the control of the non-cytopathic CMV promoter.
  • the black boxes represent transmembrane domains and the specific protease cleavage sites are indicated by a thick one
  • FIG. 3 Fusion protein consisting of the human CD8 receptor
  • NS5b and the transcription regulator GalVP16 which is composed of the DNA-binding domain of the Gal4 protein and the transactivating domain of the VP16 protein.
  • Figure 3d HCV protease NS3 / 4A expression construct which has a point at amino acid position 1165 (of the HCV genome) mutation (serine to alanine), which leads to inactivation of the protease
  • Figure 3e fusion protein consisting of the human CD8 receptor (with transmembrane domain, transcription factor inhibitory module), the NS2 / 3 protease and the transcription regulator GalVP16, which is composed of the DNA-binding domain of the Gal4 protein and the transactivating domain of the VP16 protein.
  • Figure 3f fusion protein consisting of the human CD8 receptor (with transmembrane domain, transcription factor inhibitory module), the NS2 / 3 protease and the transcription regulator GalVP16.
  • the protease carries a point mutation (cysteine to alanine) at amino acid position 993 (of the HCV genome), which leads to inactivation of the protease
  • Figure 3g Reporter construct consisting of a Gal4-dependent promoter and the luciferase gene (firefly).
  • CD8-NS2 / 3-GalVP16 fusion protein was radioactively marked in an in vitro transcription / translation reaction and then separated by SDS gel electrophoresis and evaluated by autoradiography.
  • the figure shows that only the functional NS2 / 3 protease leads to a cleavage of the fusion protein (construct E), whereas the NS2 / 3 mutant (construct F) does not cleave autocatalytically (Cl, control plasmid 1, which is expected for one of the expected Coded fission products, here NS3-GalVP16
  • the quantification of the luciferase values shows that luciferase activity is only detectable when the functional NS3 / 4A protease is cotransfected (A + C + G), but not in NS3 (A + B + G) or the inactive NS3 / 4A mutant (A + D + G).
  • Luciferase activity is detectable (A + C + G), but not when infected with the NS3 protease (A + B + G).
  • the signal strength and the signal / background ratio (factor 54) are HTS capable.
  • the quantification of the luciferase values shows that luciferase activity is only detectable when infected with the functional NS2 / 3 protease (E + G), but not with the inactive NS2 / 3 mutant (F + G). ).
  • E + G functional NS2 / 3 protease
  • F + G inactive NS2 / 3 mutant
  • NEB New England Biolabs
  • T4 DNA ligase from Gibco BRL / Invitrogen was used for the ligations.
  • the expression constructs were cloned in the pcDNA3 vector from Invitrogen.
  • the Fast Bac system from Gibco BRL / Invitrogen was used to generate the baculoviruses.
  • the various expression constructs including the CMV promoter of the pcDNA3 were inserted into the vector pFastBacDual
  • the CD8 cDNA which was used here by way of example as a delocalizing transcription regulator module, since it contains a transmembrane domain, was generated from primary human lymphocytes by means of rtPCR (sequence No. 2).
  • the construct pM3-VP16 from Clontech served as a template (sequence No. 3).
  • the pFR As a reporter plasmid, the pFR
  • the GalVP16 transcription factor was amplified by means of the primers 5 -g egg atc ctg gaa ttc aag eta ctg tct tct atc gaa-3 'and 5'-cg tct aga tta cec acc gta etc gtc aat tcc-3' the BamHI and Xbal interfaces were cloned into the pcDNA3-CD8 vector (pcDNA3-CD8-GalVP16).
  • construct A target protein of the NS3 / 4A mediated trans-cleavage
  • the NS3 / 4A cleavage site between NS5a and NS5b with adjacent sequences was primed with the help of the primers 5'-g egg atc cag agg acg gtt gtc tta aca g-3 'and 5'-gc gaa ttc gta gtg gtc gtc tag gac ttg-3 'amplified (sequence No. 4) and cloned into the vector pcDNA3-CD8-GalVP 16 via the restriction sites BamHI and EcoRI.
  • construct E (S2 / 3 mediated trans-cleavage)
  • the NS2 / 3 protease with the primers 5'-gc gaa ttc gac egg gag atg gcc gca-3 'and 5'- gc gaa ttc gga ggt ega gtc agt tga gag-3 'amplified (sequence No. 5) and cloned into the vector pcDNA3-CD8-GalVP16 via the restriction site EcoRI.
  • the resulting amino acid exchange of the original HCV amino acid position 993 from a cysteine to an alanine leads to inactivation of the protease function of the NS2 / 3 protease.
  • construct D mutant NS3 / 4A protease
  • the primer 5'- c ttg aag ggt tcc gcg ggt ggc cca et -3 'and 5'- ag tgg gcc acc ege gga acc ctt caa was added to construct C g -3 'caused a point mutation by means of PCR.
  • the resulting amino acid exchange of the original HCV amino acid position 1165 from a serine to an alanine leads to inactivation of the
  • the construct G corresponds to the information provided by the manufacturer of the Stratagene company.
  • Construct A mixed with 5 ⁇ l each of construct B and C and for further Incubated for 60 min at room temperature. After adding SDS gel sample buffer to the batches, the protein samples were separated using SDS gel electrophoresis and evaluated by autoradiography (see Fig. 4/7).
  • the radiographic image shown in Figure 4/7 clearly shows that only the NS3 / 4A protease expressed by construct C causes a specific cleavage of the chimeric fusion protein A, cleaves the transcription regulator GalVP16 from the tianliption factor inhibitory module (CD8 receptor) and it is thus possible to demonstrate the protease activity by releasing the transcription regulator.
  • the NS3 protease (construct B) does not cleave.
  • transient transfection experiments were carried out in the human heptoma cells HepG2.
  • the cells were plated onto 48-well cell culture plates and transiently transfected with the constructs described in FIG. 6/7 using the Lipofectamine 2000 method (GibcoBRL / Invitrogen).
  • luciferin / triton buffer was then added to the cells in the same amount to measure the luciferase activity, and after transferring an aliquot of 100 ⁇ l into a 96-well cell culture plate, the light output was measured in a luminometer.
  • NS3 protease construct B
  • inactive NS3 / 4A mutant construct D
  • the low light signal using the inactive NS3 / 4A mutant shows that the release of the transcription regulator and the associated activation of the reporter gene construct G are not caused by endogenous proteases of the cell and thus the activity measured specifically for the introduced viral NS3 / 4A protease.
  • Example 5 in vivo activity detection under HTS conditions.
  • Baculoviruses like other viral transfection systems (e.g. retro viral, adenoviral systems) are characterized by their property that they very efficiently different human cell types, such as e.g. Hepatoma cells, infect reproducibly and release their DNA into the cell, but do not replicate in these cells and do not produce any cytopathic effects [Kost et al., (1999)]. They can thus be used very well as a transfer organism and lead to the expression of the desired gene shortly after infection of the target cell, provided that the gene is under the control of a suitable eukaryotic promoter. Furthermore, baculoviruses are only subject to the safety standard Sl / Ll, which is a further advantage for their use in HTS.
  • retro viral, adenoviral systems are characterized by their property that they very efficiently different human cell types, such as e.g. Hepatoma cells, infect reproducibly and release their DNA into the cell, but do not replicate in these cells and do not produce any cytopathic effects [K
  • Constructs A, B, C, E and F were cloned under the control of a CMV promoter into baculotransfer vectors from GibcoBRL / Invitrogen (pFastBacDual). After going through the manufacturer's standard procedure (FastBAC system), baculoviruses were generated and amplified. After the virus goes through
  • the virus titer (approx. Lxl 0 7 viruses / ml) was determined, the virus could be used directly with a concentration of approx. 10 viruses per seeded cell (MOI 10).

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Abstract

Offenbart werden Zellkultursysteme zur Untersuchung der Aktivität der viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A des Hepatitis C Virus (HCV) und zur Identifizierung von Substanzen im Hochdurchsatzscreening (HTS), welche die Aktivität der Proteasen modulieren. Das System ist modular aufgebaut und bietet daher die Möglichkeit, sowohl eine 'cis' als auch eine 'trans'-Spaltungsaktivität je nach Proteasetyp und Aufbau zu untersuchen.

Description

Verfahren zur Untersuchung und Beurteilung von Virusenzymen im HTS
Offenbart werden Zellkultursysteme zur Untersuchung der Aktivität der viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A des Hepatitis C Virus (HCV) und zur Identifizierung von Substanzen im Hochdurchsatzscreening (HTS), welche die Aktivität der Proteasen modulieren. Das System ist modular aufgebaut und bietet daher die Möglichkeit, sowohl eine „eis" als auch eine „trans"-Spaltungsaktivität je nach Protease- typ und Aufbau zu untersuchen.
Virale Infektionen, beispielsweise verursacht durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV), das Hepatitis C Virus (HCV), das Human Cytomegalie Virus (HCMV) und die damit verbundenen Erkrankungen wie AIDS, Hepatitis, Leberzirrhose, Retinitis und Erblindung, Pneumonie, multiples Organversagen, stellen für die Gesundheit der Weltbevölkerung ein sehr großes Problem dar. So sind z.B. über 100
Millionen Menschen weltweit mit dem Hepatitis C Virus infiziert, wobei ein hoher Prozentsatz der infizierten Personen eine chronische Leberinfektion entwickelt und an den Folgen der Erkrankung wie Leberzirrhose, hepatozelluläres Karzinom verstirbt [Zein, N. (2000)]. Die Suche nach neuen antiviralen Wirkstoffen gestaltet sich aufgrund der hohen Pathogenität und Komplexität der Erreger als sehr schwierig. In vielen Fällen ist eine schnelle Identifizierung von Wirksubstanzen nicht möglich, da eine Untersuchung der Vermehrung der Viren im „Hoch Durchsatz Screening" (High Throughput Screening, HTS) aus sicherheitstechnischen Erwägungen - Erfordernis des L2 oder L3 Standards der Laboratoriumssicherheit- oder experimentellen Gründen nicht möglich ist. So gibt es z.B. zum derzeitigen Zeitpunkt kein verlässliches Zellkultursystem, in welchem die Vermehrung des HCV Virus nachgestellt werden kann. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu umgehen, besteht darin, die einzelnen enzymatischen Vorgänge wie beispielsweise die DNS-Vermehrung, die Proteinspaltung, die Virusbildung separat zu betrachten und getrennt von einander zu untersuchen. Neben den viralen Polymerasen nehmen bei der
Virusvermehrung auch virale Proteasen wie beispielsweise HCV NS2/NS3, NS3, NS3/4A eine Schlüsselrolle ein, da sie für die virale Replikation essentiell sind und eine hohe virusabhängige Spezifität aufweisen. Virale Proteasen bilden somit einen interessanten Angriffspunkt für die Entwicklung antiviraler Wirkstoffe [Wang et al., (2000)].
Das HCV Virus ist ein umhülltes positiv-Strang RNS-Virus, das zur Familie der Flaviviren gehört. Das RNA Genom hat eine Größe von ca. 9500 Ribonukleotiden und kodiert für ein einzelnes Polyprotein mit ca. 3000 Aminosäuren, das in vivo durch zelluläre und virale Proteasen in 10 einzelne Proteine gespalten wird. Dabei unterscheidet man zwischen den Strukturproteinen (C, El, E2, P7) und den Nichtstrukturproteinen (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b). Die Strulrturproteine, welche durch Spaltung von zellulären Proteasen aus dem Polyprotein hervorgehen, bilden die spätere Hülle des Virus. Die Nicht - Strukturproteine, welche die Vermehrung der viralen DNS katalysieren, werden hingegen durch die zwei viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A gespalten. Dabei kommt es in einem ersten Schritt durch die Metalloprotease NS2/NS3 zu einer autokatalytischen Spaltung zwischen den beiden Proteinen NS2 und NS3 („cis"-Spaltung I). In einem weiteren Schritt spaltet sich die nun aminoterminal freiliegende Protease NS3 (Serinprotease) von dem Protein NS4a ab („eis"- Spaltung II ). Nachfolgend bildet die Protease NS3 mit dem kleinen NS4a Protein einen Komplex und katalysiert die Spaltung zwischen den restlichen Nicht - Strakturproteinen („trans"-Spaltung HI zwischen NS4a/NS4b, NS4b/NS5a undNS5a/NS5b) [Übersicht siehe Bartenschlager, (1999)].
Die zentrale Stellung der Proteasen NS2 und NS3 bzw. NS3/4A im Verlaufe der HCV Virusreplikation macht diese zu einem sehr interessanten Angriffspunkt auf der
Suche nach Aktivitätsmodulatoren, die therapeutisch eingesetzt werden könnten.
Allerdings ist, wie bereits erwähnt, kein zelluläres Vermehmngsmodell verfügbar, das im Hochdurchsatzverfahren einzusetzen ist, und auch biochemische in vitro
Assays brachten bisher keinen Erfolg. Obwohl bereits eine Vielzahl an Systemen zur Untersuchung der HCV Proteasen beschrieben sind, weisen diese jedoch verschiedene Limitationen auf, die einen Einsatz im Hochdurchsatzverfahren nicht ermöglichen bzw. aus wissenschaftlichen Gründen nicht für sinnvoll erachten lassen.
Ein System zur Messung der NS3/4A Proteaseaktivität unter Verwendung des viralen Sindbis Replikationssystems wird von Cho, Y.G. et al., (1997) beschrieben. Dabei wird ein Hybridkonstrukt, bestehend aus der HCV Protease NS3/4A, der NS4a/4b Spaltstelle und dem Sindbis Gore Protein in Zellen eingebracht. Die Bildung von Sindbis Viruspartikeln ist somit von der Spaltung der NS4a/4b Schnittstelle und der
Freisetzung des core-Proteins abhängig. Ein sehr großer Nachteil dieses Systems ist, dass die Proteaseaktivität indirekt über den zytopathischen Effekt der entstehenden rekombinanten Sindbis Viren gemessen werden muss, der eine längere Inkubationszeit voraussetzt, dessen Quantifizierung schwierig ist und der im Hochdurch- satzverfahren nur schwer gemessen werden kann. Des weiteren bietet dieses komplexe System eine Vielzahl von Angriffspunkten für unspezifische, d.h. nicht proteaseabhängige Inhibitoren, da auch Wirksubstanzen, die unabhängig von der Proteasefunktion die Virusbildung verhindern, als potentielle Wirksubstanzen auftreten würden. Dadurch wird die Zahl der genauer zu untersuchenden Substanzen stark erhöht, was wiederum eine zeit- und kostenaufwändige Nachtestung der
Substanzen erforderlich machte. Außerdem ist eine Messung der NS2/3 Proteaseaktivität in diesem System nicht möglich.
Des weiteren beschreiben Cho, Y.G. et al., (1998) einen Proteaseassay unter Ver- wendung eines Expressionsvektors, bestehend aus der NS3/4A Protease und der
NS4a/4b Schnittstelle fusioniert an das Secreted Alkaline Phosphatase (SEAP ) Gen. Bringt man dieses Konstrukt in eukaryontische Zellen ein, kommt es durch die NS3/4A vermittelte Spaltung der NS4a/4b Schmttstelle zur Freisetzung der alkalischen Phosphatase, die in den Überstand sezer iert wird und gemessen werden kann. Ein großer Nachteil dieses Systems liegt darin, dass die Menge an freigesetzter
Phosphatase linear proportional der Menge exprimierter und gespaltener Fusions- proteine ist und somit das Signal keine Verstärkung erfährt und zu gering für eine Messung im Hochdurchsatzverfahren ist. Außerdem bietet der notwendige zelluläre Export der Phosphate und die damit verbundenen involvierten zellulären Vorgänge neben der Transkription und Translation einen weiteren Angriffspunkt für unspezi- fische Inhibitoren, was eine aufwendige Nachtestung erforderlich macht. Auch in diesem Fall ist eine Messung der NS2/3 Proteaseaktivität nicht möglich.
Ein System, in welchem verschiedene Proteasekonstrukte und entsprechend zu spaltende Zielkonstrukte über rekombinate Baculoviren in Insektenzellen eingebracht werden und die Spaltungsprodukte immunologisch im „Westernblot" nachgewiesen werden können beschreiben Overton, H. et al., (1995). Zum einen hat dieses Verfahren den Nachteil, dass die Proteasereaktion in Insektenzellen und nicht in Säugetierzellen nachgestellt wird und somit mögliche wichtige zelluläre Faktoren nicht berücksichtigt werden, zum anderen ist die Nachweismethode nicht für ein Hoch- durchsatzscreening (HTS-Screening) geeignet.
Hirowatari, Y. et al. (1995) entwickelten eine Methode, bei der zwei Expressions- konstrukte in Säugetierzellen eingebracht werden. Das eine Konstrukt beinhaltet - in Kombination mit dem DHFR Gen - das NS2/3 Proteasegen bzw. Fragmente davon, an das über die NS5a/5b Schnittstellensequenz der Transaktivator Tax (HTLV-1) fusioniert ist. Das zweite Konstrukt enthält ein Reportergen (Cat), welches über einen Tax abhängigen Promotor reguliert wird. In vivo führt die Spaltung der NS5a/5b Schmttstelle durch die NS2 oder NS3 Protease zur Freisetzung des Transkriptionsfaktors Tax, der dann die Expression des Reporters hervorrufen kann. Ein großer Nachteil dieses Systems liegt darin, dass nicht zwischen der Aktivität der NS2 und
NS3 Protease zu unterscheiden ist . Darüber hinaus wird in diesem System bei der Untersuchung der NS3 Aktivität nicht die modulatorische Funktion des NS3 Protease-Kofaktors NS4a berücksichtigt, da er in diesem System nicht vorhanden ist und somit wirksame Inhibitoren der NS3/4A vermittelten Transspaltung nicht identi- fiziert werden können. In WO 98/00548 wird die Generierung von hybriden Picomaviren, deren Replikation abhängig von der Proteaseaktivität von NS3 ist, offenbart. Da die NS3 Aktivität indirekt über die Anzahl gebildeter Viren mittels eines zellulären Plaque-Assays quantifiziert wird, ist auch dieses System nicht im HTS-Verfahren durchführbar.
Mit einem System der Firma Agouron Pharma (WO 00/08469) wird die Aktivität der NS3 Protease über die Sekretion der sekretorischen alkalischen Phosphatase nachgewiesen. Auch hier ist nachteilig, dass beispielsweise intrazelluläre Transportvorgänge neben der Transkription und Translation einen weiteren Angriffspunkt für unspezifische Inhibitoren darstellen, was eine aufwendige Nachtestung zur Aussonderung unspezifischer Ergebnisse erforderlich macht.
Die gleichen Nachteile weist auch das System der Firma Vertex auf (US 5861267), welches die Proteaseaktivität von NS3 durch Korrelation mit der Menge von sezerniertem LL-1 quantifiziert. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass nur die Protease
NS3 nicht aber NS2/3 bzw. NS3/4A nachgewiesen werden können. Zudem ist die Menge des sezernierten LL-1 Proteins linear proportional zur Proteaseaktivität, so dass keine für die Durchführung im HTS-Verfahren ausreichende Verstärkung erzielt wird.
Die Schrift WO 00/66623 offenbart ein zelluläres Surrogatsystem bestehend aus einem chimären Protein zwischen NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b und einem tetra- zyclinabhängigen Transkriptionsfaktor, der nach einer NS3 abhängigen Spaltung freigesetzt wird und die Expression eines Reporters in den Zellen bewirkt. Auch hier ist ein Nachweis der NS2/3 Proteasereaktion nicht möglich. Außerdem ist durch
Zugabe von Tetrazyclin eine zusätzliche Substanz in dem System, welche die Ergebnisse verfälschen kann.
Die aufgeführten Beispiele zeigen die Grenzen der gegenwärtig verfügbaren Systeme und verdeutlichen den Bedarf für die Entwicklung solcher neuen Systeme, die es ermöglichen, eine große Anzahl chemischer und biologischer Substanzen auf ihre Aktivität an HCV Proteasen zu untersuchen.
Es besteht deshalb dringender Bedarf, zelluläre Systeme zu entwickeln, die die Untersuchung der Proteasen in ihrem biologischen Umfeld - beispielsweise in
Hepatozyten oder Hepatomazellen - ermöglichen, um so den Einfiuss zellulärer Faktoren zu berücksichtigen, und die es gleichzeitig erlauben, die verschiedenen Proteaseaktivitäten - NS2/3 und NS3/4A - separat zu betrachten, um aufgrund der verschiedenen enzymatischen Kinetiken der Proteasereaktionen und deren Charakte- risierung etwaige Wirksubstanzen einfacher und schneller auffinden zu können.
Weiter müssen solche neuen Systeme in ihrer Durchführung und Auswertung einfach, schnell und sicher - also unter Sl/Ll Bedingungen durchführbar - sein, um ihre Durchführung im Hochdurchsatzverfahren zu ermöglichen.
Die vorliegende Anmeldung betrifft zelluläre Systeme, die es möglich machen, die
Wirksamkeit chemischer Substanzen auf die verschiedenen HCV Proteasen separat, schnell und einfach, entsprechend den vorstehend genannten Anforderungen im Hochdurchsatzverfahren, zu untersuchen.
Ein Ansatzpunkt bei der Entwicklung der nachfolgend beschriebenen Systeme gründet auf der Überlegung, dass transkriptionelle Regulatoren - transkriptionelle Regulatoren der Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die die Expression eines Reportergens regulieren, also die Expression eines Reportergens erhöhen oder erniedrigen - nur dann ihrer natürlichen Funktion nach- kommen können, wenn sie betreffend ihre DNA bindende und regulatorische
Domäne funktional sind und im richtigen Zellkompartiment, bei Eukaryonten also dem Zellkern, lokalisiert sind. Die enzymatische Wirkweise von Proteasen bietet die Möghchkeit, sowohl die Funktionalität als auch die Lokalisation von Zielproteinen zu modulieren. Ebenso wie bei den Transkriptionsfaktoren ist auch die Funktion und Aktivität der viralen Proteasen von deren zellulärer Lokalisation abhängig, da weitere, beispielsweise gewebsspezifische co-Faktoren, die Reaktion modulieren. Die nachfolgenden Systeme berücksichtigen die spezifischen Eigenheiten der verschiedenen Proteasen und ermöglichen, den nativen Prozess, der während der viralen Replikation abläuft, so nah wie möglich nachzustellen.
Dazu werden zwei Nachweissysteme erstellt, die in Abhängigkeit der Proteaseaktivität einen funktionalen Transkriptionsregulator ausbilden. Funktionale Transkriptionsregulatoren der Erfindung sind regulatorisch wirkende Proteine oder Nukleinsäuren, die im Zellkern lokalisiert sind und über die Bindung an ein Reportergen die Expression dieses Reportergens modulieren. Es wird ein Expres- sionskonstrukt Moniert, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches sich aus mindestens drei regulatorischen Komponenten - den Modulen I— TI - zusammensetzt. Modul I der Erfindung bewirkt die Delokahsation des Transkriptionsregulators, es ist das Transkriptionsfaktor - inhibitorische Modul. Modul LT der Erfindung ist eine proteasespezifische trans-spaltende Schnittstelle oder eine cis-spaltende funktionale Protease. Modul HI der Erfindung ist ein Transkriptionsregulator, der die Expression des Reportergens moduliert .
Der Begriff modulieren, wie er in diesem Zusammenhang gebraucht wird, bezieht sich auf das Herbeiführen einer Änderung der Aktivität, der physikochemischen Eigenschaften oder der funktionellen biologischen, enzymatischen, immunologischen, regulatorischen Wirkung eines Proteins. Modulation kann herbeigeführt werden durch Einwirkung auf das Protein oder durch Einwirkung auf die das Protein kodierenden Nuklemsäuren. Modulation kann die funktioneile Aktivität eines Proteins erhöhen oder erniedrigen und seine physikochemischen Eigenschaften wie beispielsweise die Bindungsstärke gegenüber anderen Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Substanzen, verändern.
Wesentlich für das Erreichen der für das erfindungsgemäße Verfahren typischen
Nachweisempfindlichkeit ist, dass durch die richtige Auswahl der für Modul I geeigneten Bausteine eine Delokahsation des Moduls in in den Zellkern nur nach spezifischer Aktivierung - der Spaltung von Modul II - erfolgen kann. Erfin- dungsgemäß geeignete Bausteine für Modul I sind z.B. Membranlokalisationssignale wie beispielsweise Oberflächenproteine, Proteine mit Rezeptoreigenschaft, Transmembrandomänen, modifizierte, beispielsweise farnisylierte Proteine. Gleichermaßen kann jede Art von TransMptionsfaktor-inhibitorischem Modul eingesetzt werden, welches die Funktion des Transkriptionsregulators inhibiert bis es vom Transkriptionsregulator abgespalten wird. Dazu eignen sich beispielsweise solche Proteine oder Proteinfragmente, die zwar die Translokation in den Zellkern nicht beeinflussen, die Bindung des Transkriptionsregulators an die Zielsequenz aber unterbinden.
Nachweissystem für die NS3/4A vermittelte „Trans"-Spaltung (Abbildung 1/7 )
Zur Analyse der „Trans"-Spaltungsaktivität wird neben dem vorstehenden modularen Expressionskonstrukt, welches als Modul II die Transspaltungsschmttstelle bein- haltet, und dem Reportergen als drittes Konstrukt, ein Expressionsplasmid der zu untersuchenden Protease benötigt. Bringt man diese Konstrukte zusammen in Zellen ein und werden die verschiedenen Proteine durch ein nicht zytopathisches Expressionssystem in der Zelle gebildet, kommt es infolge der Proteaseaktivität zur Trennung des Transkriptionsfaktor-inhibitorischen Moduls (I) von dem Transkrip- tionsregulator, welcher dann in den Zellkern gelangen und die Expression des
Reportergens modulieren kann, welches wiederum gemessen und quantifiziert werden kann. In Gegenwart einer inhibitorischen Substanz wiederum wird das Fusionsprotein nicht gespalten und der Transkriptionsregulator kann nicht in den Zellkern gelangen.
Nachweissystem für die membranassozeierte NS2/3 „cis"-Spaltung (Abbildung 2/7)
Auch hier kommt das vorstehend beschriebene chimäre Expressionskonstrukt zum Einsatz, wobei in diesem Fall die Transspaltungsschnittstelle (Modul II) durch eine komplette Protease ersetzt wird, die membranlokahsiert eine autokatalytische Enzymfunktion beispielsweise NS2/3 aufweist. Zusammen mit einem Reporter- konstrukt kommt es nach einer Transduktion der Plasmide in Säugetierzellen zur Expression des entsprechenden Chimären Fusionsproteins, welches sich, an der Membran assoziiert, autokatalytisch spaltet und somit den Transkriptionsregulator freisetzt, der in den Zellkern translozieren und die Expression des Reportergens hervorrufen kann.
Die oben aufgeführten erfindungsgemäßen Systeme haben gegenüber den bisher beschriebenen Entwicklungen zahlreiche Vorteile. Zum einen bietet der einfache und modulare Aufbau die Möglichkeit, die Systeme den spezifischen Fragestellungen je nach Proteasetyp anzupassen und die Proteasen separat in ihrer spezifischen Umgebung zu testen. Die Verwendung eines transkriptionell-regulierten Ausleseverfahrens fuhrt zur Erhöhung der Signalstärke, da eine durchgeführte Spaltung zu mehrfacher Aktivierung (oder Repression) des Reportergens führt und die damit verbundene Signalverstärkung die Durchführung im HTS ermöglicht.
Die Delokahsation des Transkriptionsregulators bewirkt eine sehr geringe Hintergrundaktivität, was wiederum einen großen Induktionsfaktor zur Folge hat, der ebenfalls für eine Durchführung im HTS Verfahren notwendig ist, um bei gegebener Streuung der Meßwerte eine Identifizierung wirksamer Substanzen zu ermöglichen.
Außerdem ist in Abhängigkeit von dem verwendeten Transduktionssystem - Trans- fektion, stabile Zelllinien, virale Infektion - bereits nach kürzester Zeit eine Quantifizierung unter Substanzzugabe möglich. So ist unter Verwendung eines viralen Transfektionssystems wie beispielsweise rekombinanten Baculoviren, welche sich durch eine hohe Infektionsrate in Hepatomazelllinien auszeichnen und der Sicherheitsstufe Sl/Ll zuzuordnen sind, bereits nach wenigen Stunden, im allgemeinen 6 Stunden nach der Infektion der Zellen, eine Messung und Quantifizierung der Proteaseaktivität im HTS Format möglich. Zusammenfassend ist fest- zustellen, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Untersuchung der Aktivität viraler Proteasen im Hochdurchsatzscreening (HTS) an zellulären Systemen bereitgestellt werden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass Nachweissysteme verwendet werden, die in Abhängigkeit der Aktivität der viralen Proteasen einen funktionalen Transskriptionsregulator ausbilden oder die Ausbildung eines funktionalen Transskriptionsregulators ausnutzen, und zur Untersuchung der Aktivität von viralen Proteasen wie beispielsweise der viralen Proteasen NS2/3 und
NS3/4A des Hepatitis C Virus (HCV) im Hochdurchsatzscreening (HTS) an zellulären Systemen verwendet werden können, und dadurch gekennzeichnet sind, dass Nachweissysteme verwendet werden, die in Abhängigkeit der Aktivität solcher viralen Proteasen, beispielsweise der viralen Proteasen von NS2/3 und NS3/4A einen funktionalen Transskriptionsregulator ausbilden. Verfahren der Erfindung sind deshalb alle Verfahren, in denen als Transkriptionsregulator ein Expressionskonstrukt verwendet wird, welches sich aus mindestens drei regulatorischen Einheiten zusammensetzt, wobei a) eine der regulatorischen Einheiten ein Membran- lokalisationssignal ist und die Delokahsation des Transkriptionsregulators selbst bewirkt, b) eine der regulatorischen Einheiten eine proteasespezifische trans-spalten- den Schnittstelle oder eine cis-spaltende funktionale Protease enthält, und c) eine der regulatorischen Einheiten die Expression eines Reportergens moduliert. Verfahren der Erfindung sind weiter alle vorstehend geschilderten Verfahren in denen ein Fusionsprotein enthaltend einen Rezeptor aus der Gruppe der CD-Rezeptoren, eine virale Proteaseschnittstelle der HCV - Protease NS3/4A, und der Transkriptionsregulator GalVPlö, eingesetzt wird, sowie Verfahren in denen das Fusionsprotein aus der DNA Sequenz 8 oder einem ihrer Homologen generieret wird, sowie Verfaliren, in denen ein Fusionsprotein enthaltend einen Rezeptor aus der Gruppe der CD-Rezeptoren, die virale HCV - NS2/3 Protease, oder den Transkriptionsregulator GalVP16, eingesetzt wird, oder Verfahren, in denen ein Fusionsprotein aus der DNA
Sequenz 9 oder einem ihrer Homologen generieret wird sowie die Verwendung von Aktivitätsmodulatoren der Proteasen NS2 und NS3 bzw. NS3/4A die unter Anwendung der vorstehen geschilderten Verfahrens gefunden wurden, zur Herstellung von Arzneimitteln, die in der Prophylaxe und Therapie der HCV-Infektion verwendet werden können. Kurzbeschreibung der Abbildungen:
Abbildung 1
Schematische Darstellung des Systems zur Messung der NS3/4A vermittelten „Trans"-Spaltung
Abbildung 2
Schematische Darstellung des Systems zur Messung der NS2/3 vermittelten „Cis"-
Spaltung
Abbildung 3
Schematische Darstellung der verschiedenen DNA Konstrukte, die generiert wurden.
Die Expression der Proteine (Konstrukte A-F) erfolgt unter der Kontrolle des nicht zytopathischen CMV Promotors. Die schwarzen Kästen stellen Transmembran- domänen dar, und die spezifischen Proteasespaltstellen sind durch einen dicken
Strich gekennzeichnet.
Abbildung 3a Fusionsprotein bestehend aus dem humanen CD8 Rezeptor
(mit Transmembrandomäne, Transbiptionsfalrtor-inhibitori- schem Modul), der NS3/4A Spaltstelle zwischen NS5a und
NS5b und dem Transkriptionsregulator GalVP16, der sich aus der DNA bindenden Domäne des Gal4 Proteins und der transaktivierenden Domäne des VP16 Proteins zusammensetzt.
Abbildung 3b HCV Protease NS3-Expressionskonstrukt
Abbildung 3c HCV Protease NS3/4A-Expressionskonstrukt
Abbildung 3d HCV Protease NS3/4A-Expressionskonstrukt, welches an der A inosäureposition 1165 (des HCV Genoms) eine Punkt- mutation aufweist (Serin zu Alanin), was zu einer Inaktivie- rung der Protease führt
Abbildung 3e Fusionsprotein bestehend aus dem humanen CD8 Rezeptor (mit Transmembrandomäne, TransMptionsfaktor-inhibitori- schem Modul), der NS2/3 Protease und dem Transkriptionsregulator GalVP16, der sich aus der DNA bindenden Domäne des Gal4 Proteins und der transaktivierenden Domäne des VP16 Proteins zusammensetzt.
Abbildung 3f Fusionsprotein bestehend aus dem humanen CD8 Rezeptor (mit Transmembrandomäne, Transkriptionsfaktor-inhibitorischem Modul), der NS2/3 Protease und dem Transkriptionsregulator GalVP16. Die Protease trägt an der Aminosäure- Position 993 (des HCV Genoms) eine Punktmutation (Cystein zu Alanin), was zu einer Inaktivierung der Protease führt
Abbildung 3g Reporterkonstrukt bestehend aus einem Gal4 abhängigen Promotor und dem Luziferasegen (firefly).
Abbildung 4
Nachweis der Funktionalität der Expressionskonstrukte mittels in vitro Translation. Das CD8-NS5a/b-GalVP16 Fusionsprotein (Konstrukt A) wurde in einer in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion radioaktiv markiert und danach mit der in vitro translatierten Protease (nicht radioaktiv) NS3 (Konstrukt B) bzw. NS3/4A (Konstrukt
C) für 60 min inkubiert. Die Proteinansätze wurden durch eine SDS-Gelelektro- phorese aufgetrennt und autoradiographisch ausgewertet. Die Abbildung zeigt, dass nur in Anwesenheit des co- Faktors NS4a (Konstrukt A+C) eine Transspaltung des Konstruktes erfolgt. Abbildung 5
Nachweis der Funktionalität der Expressionskonstrukte mittels in vitro Translation. Das CD8-NS2/3-GalVP16 Fusionsprotein wurde in einer in vitro Transkriptions- /Translationsreaktion radioaktiv markiert und danach über eine SDS-Gel- elektrophorese aufgetrennt und autoradiographisch ausgewertet. Die Abbildung zeigt, dass nur die funktioneile NS2/3 Protease zu einer Spaltung des Fusionsproteins führt (Konstrukt E), wohin gegen die NS2/3 Mutante (Konstrukt F) sich nicht autokatalytisch spaltet (Kl, Kontrollplasmid 1, welches für eines der zu erwartenden Spaltprodukte kodiert, hier NS3-GalVP16
Abbildung 6
Nachweis der Aktivität der Expressionskonstrukte und somit der Funktionalität der verscliiedenen Systeme anhand einer transienten Transfektion der verschiedenen Konstrukte in die Hepatomazelllinie HepG2 und Messung der Luziferaseaktivität.
Abbildung 6a NS3/4A vermittelte „Trans"-Spafung
Die Quantifizierung der Luziferasewerte zeigt, dass nur bei Kotransfektion der funktioneilen NS3/4A Protease eine Luziferaseaktivität nachweisbar ist (A+C+G), jedoch nicht bei NS3 (A+B+G) oder der inaktiven NS3/4A Mutante (A+D+G).
Abbildung 6b NS2/3 vermittelte „Cis"-Spalung
Die Quantifizierung der Luziferasewerte zeigt, dass nur bei
Transfektion der funktionellen NS2/3 Protease eine Luziferase- aktivität nachweisbar ist (E+G), jedoch nicht bei der inaktiven
NS2/3 Mutante (F+G).
Abbildung 7
Nachweis der Funktionalität der Systeme im Hochdurchsatzverfahren (im Format 384). Die verschiedenen Expressionskonstrukte und das Reporterkonstrukt wurden mittels eines bakteriellen Rekombinationsverfahren in das Genom von Baculoviren eingebracht uns somit rekombinante Baculoviren hergestellt (Sicherheitsstufe Ll/Sl), die nach Infektion mit Säugetierzellen die Expression der Konstrukte hervorrufen. Die Luziferasemessung (30 Sekunden, im Format 384) erfolgte 20 Stunden nach
Infektion.
Abbildung 7a NS3/4A vermittelte „Trans"-Spalung
Die Quantifizierung der Luziferasewerte zeigt, dass nur bei Infektion mit der fαnktionellen NS3/4A Protease eine
Luziferaseaktivität nachweisbar ist (A+C+G), jedoch nicht bei Infektion mit der NS3 Protease (A+B+G). Die Signalstärke und das Signal/Hintergrundverhältnis (Faktor 54) sind HTS fähig.
Abbildung 7b NS2/3 vermittelte „Cis"-Spalung
Die Quantifizierung der Luziferasewerte zeigt, dass nur bei Infektion mit der funktionellen NS2/3 Protease eine Luziferaseaktivität nachweisbar ist (E+G), jedoch nicht bei der inaktiven NS2/3 Mutante (F+G). ). Die Signalstärke und das
Signal/Hintergrundverhältniss (Faktor 40) sind HTS fähig.
Beispiele
Materialien:
Alle Restriktionsendonukleasen wurden von der Firma Gibco BRL/lhvitrogen bezogen. Die Polymerasekettenreaktionen wurden mit der Vent DNS Polymerase der
Firma New England Biolabs (NEB) durchgeführt, und für die Ligationen wurde die T4 DNS Ligase von Gibco BRL/Invitrogen verwendet.
Molekularbiologische und zellbiologische Experimente wurde nach Standard- Protokollen [Ausubel et al., (1994), Sambrook et al, (1989)] dvtfchgeführt.
Die Klonierung der Expressionskonstrukte erfolgte im pcDNA3 Vektor der Firma Invitrogen. Für die Generierung der Baculoviren wurde das Fast Bac-System der Firma Gibco BRL/Invitrogen verwendet. In den Vektor pFastBacDual wurden die verschiedenen Expressionskonstrukte inclusive des CMV Promotors des pcDNA3
Vektors kloniert und nach Durchlaufen des Standardprozedurverfahrens rekombinate Baculoviren generiert.
Ein Fragment der viralen HCV lb cDNS, die als PCR-Template für die Amplifi- kation der viralen Proteasen und Proteaseschnittstellen diente, wurde von Professor
Roggendorf, Universität Essen, zur Verfügung gestellt (Sequenz Nr.l). Die CD8 cDNS, welche hier beispielhaft als delokalisierendes Transkriptionsregulatormodul verwendet wurde, da es eine Transmembrandomäne beinhaltet, wurde mittels rtPCR aus primären humanen Lymphozyten generiert (Sequenz Nr.2). Für die Amplifi- kation des GalVP16 Transkriptionsfaktors, welcher hier beispielhaft als Trankrip- tionsregulator verwendet wurde, diente das Konstrukt pM3-VP16 der Firma Clontech als Template (Sequenz Nr. 3). Als Reporterplasmid wurde hier beispielhaft der pFR-
Luc Vektor der Firma Stratagene verwendet, welcher ein Luziferasegen unter der
Kontrolle eines Gal-abhängigen Minimalpromotors beinhaltet. Beispiel 1 Amplifikation und Klonierung der Expressionskonstrukte
Für die Klonierung der trimären Fusionsproteine (Konstrukt A, E, F) wurde in einem ersten Schritt ein Teil des CD8 Rezeptors mit den Primern 5 '-cg aag ctt acc atg gcc tta cca gtg acc gcc-3' und 5 '-gcg gat cca aac acg tct tcg gtt cct gtg gtt-3' amplifiziert und über die in den Primern enthaltenen Schnittstellen der Restriktions- endonukleasen Hind in und BamHI in den pcDNA3 Vektor kloniert (pcDNA3- CD8). In einem weiteren Schritt wurde der GalVP16 Transkritionsfaktor mittels der Primer 5 -g egg atc ctg gaa ttc aag eta ctg tct tct atc gaa-3' und 5'-cg tct aga tta cec acc gta etc gtc aat tcc-3 ' amplifiziert und über die Schnittstellen BamHI und Xbal in den pcDNA3-CD8 Vektor kloniert (pcDNA3-CD8-GalVP16).
Für die Generierung des Konstruktes A (Zielprotein der NS3/4A vermittelten Transspaltung) wurde die NS3/4A Spaltstelle zwischen NS5a und NS5b mit angrenzenden Sequenzen mit Hilfe der Primer 5 '-g egg atc cag agg acg gtt gtc tta aca g-3' und 5'-gc gaa ttc gta gtg gtc gtc tag gac ttg-3 'amplifiziert (Sequenz Nr. 4) und über die Restruktionsschnittstellen BamHI und EcoRI in den Vektor pcDNA3-CD8- GalVP 16 kloniert.
Für die Generierung des Konstruktes E ( S2/3 vermittelten Transspaltung) wurde die NS2/3 Protease mit den Primern 5'-gc gaa ttc gac egg gag atg gcc gca-3'und 5'- gc gaa ttc gga ggt ega gtc agt tga gag-3 'amplifiziert (Sequenz Nr. 5) und über die Restriktionsschnittstelle EcoRI in den Vektor pcDNA3-CD8-GalVP16 kloniert.
Für die Generierung des Konstruktes F (mutierte NS2/3 Protease) wurde in das
Konstrukt E über die Primer 5'- a gac act gca gcg gcc ggg gac gtc atc -3 'und 5 gat gac gtc cec ggc ege tgc agt gtc -3 'mittels PCR eine Punktmutation eingeführt. Der daraus resultierende Aminosäurenaustasch der ursprünghehen HCV Aminosäurenposition 993 von einem Cystein zu einem Alanin führt zu einer Inaktivierung der Proteasefunktion der NS2/3 Protease. Für das Konstrukt B (NS3 Protease) wurde eine PCR Reaktion mit den Primern 5 '- gc aag ctt acc atg gct cec atc acg gcc tat tcc -3 ' und 5 '-gcg aat tcc tea ggt gac gac etc cag gtc ggc-3' durchgeführt und das Fragment (Sequenz Nr. 6) über die Reslxiktionsschnittstellen Hindin und EcoRI in den pcDNA3 Vektor kloniert.
Für das Konstrukt C (NS3/4A Protease) wurde eine PCR Reaktion mit den Primern 5'- gc aag ctt acc atg gct cec atc acg gcc tat tcc -3' und 5 '-gcg aat tcc tea gca etc ttc cat etc atc gaa-3' durchgeführt und das Fragment (Sequenz Nr. 7) über die Restriktionsschnittstellen Hindin und EcoRI in den pcDNA3 Vektor kloniert.
Für die Generierung des Konstruktes D (mutierte NS3/4A Protease) wurde in das Konstrukt C über die Primer 5'- c ttg aag ggt tcc gcg ggt ggc cca et -3 'und 5'- ag tgg gcc acc ege gga acc ctt caa g -3 'mittels PCR eine Punktmutation emgef hrt. Der daraus resultierende Aminosäurenaustausch der ursprünglichen HCV Aminosäuren- position 1165 von einem Serin zu einem Alanin führt zu einer Inaktivierung der
Proteasefunktion der NS 3/4a Protease.
Das Konstrukt G entspricht den Angaben des Herstellers der Firma Stratagene.
Beispiel 2 in vitro Funktionalitätsnachweis der NS3/4A vermittelten „trans"-
Spaltung
Zum Nachweis der Funktionahtät der generierten Konstrukte A, B und C wurde eine in vitro Transkriptions- Translationsreaktion unter Verwendung des T7-in vitro Transkriptions- Translationsverfahrens der Firma Promega durchgeführt (siehe Abb.
4/7). Während die Reaktion (nach Standardbedingungen des Herstellers) für das zu spaltende Konstrukt A in einem radioaktiven Ansatz (35S-Methionin Markierung) durchgeführt wurde (25 μl Ansatz), wurde die Reaktion für das Konstrukt B und C, die viralen Proteasen NS3 und NS3/4A, nicht radioaktiv durchgeführt (jeweils 25 μl). Nach einer 90 minütigen Inkubation der einzeln generierten Proben, wurden 5μl des
Konstruktes A mit jeweils 5 μl des Konstruktes B bzw. C vermischt und für weitere 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von SDS-Gel Probenpuffer zu den Ansätzen wurden die Proteinproben mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und autoradiographisch ausgewertet (siehe Abb. 4/7). Das in Abbildung 4/7 dargestellte Bild der Radiographie zeigt deutlich, dass nur die durch Konstrukt C exprimierte NS3/4A Protease eine spezifische Spaltung des chimären Fusionsproteins A bewirkt, eine Abspaltung des Transkriptionsregulators GalVP16 von dem tianslαiptionsfaktor-inhibitorischen Modul (CD8 Rezeptor) herbeiführt und somit ein Nachweis der Proteaseaktivität über das Freisetzen des Transkriptionsregulators möglich ist. Die NS3 Protease (Konstrukt B) fuhrt zu keiner Spaltung.
Beispiel 3 in vitro Funktionalitätsnachweis der NS2/3 vermittelten „cis"- Spaltung
Zum Nachweis der Funktionalität der generierten Konstrakte E und F wurde wie bereits in Beispiel 2 beschrieben, eine in vitro Transkriptions- Translationsreaktion unter Verwendung des T7-in vitro Transkriptions- Translationsverfahrens der Firma Promega durchgeführt (siehe Abb. 5/7). Die Reaktionen (nach Standardbedingungen des Herstellers) für das sich selbst spaltende Konstrukt E bzw. dessen inaktive Mutante (Konstrukt F) sowie ein Kontrollplasmid Kl, welches für das in Abb. 5/7 dargestellte und nach Spaltung zu erwartende NS3-GalVP16 Fusionsprotein kodiert, wurden in einem radioaktiven (35S-Methionin Markierung) Ansatz durchgeführt (25 μl Ansatz). Nach einer 90 minütigen Inkubation der Proben wurden 5μl der Proben nach Zugabe von SDS-Gel Probenpuffer mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und autoradiographisch ausgewertet (siehe Abb. 5/7). Das in Abbildung 5/7 darge- stellte Bild der Radiographie zeigt deutlich, dass nur das durch Konstrukt E exprimierte Fusionsprotein, welches eine funktioneile NS2/3 Protease beinhaltet, eine Spaltung des chimären Fusionsproteins nach sich zieht, wohingegen die Mutante nicht autokatalytisch aktiv ist. Darüberhinaus entspricht die Größe der Banden den zu erwartenden Größen nach einer spezifischen Spaltung (Vergleich E zu Kl). Auch hier führt somit das Einbringen einer aktiven Protease in das Fusionsprotein aus einem Transkriptionsregulator und einem inhibitorisch wirkenden Modul (I) zur Frei- setzung des Transkriptionsregulators, wodurch der Nachweis der Spaltungsaktivität ermöglicht wird.
Beispiel 4 in vivo Aktivitätsnachweis der chimären Fusionsproteine
Zum Nachweis der spezifischen Aktivität der generierten Fusionsproteine (A, E, F) und Proteasen (B, C, D) in vivo, d.h. im zytoplasmatischen Umfeld einer lebenden Zelle, wurden transiente Transfektionsexperimente in den humanen Heptomazellen HepG2 durchgeführt. Die Zellen wurden zu diesem Zweck auf 48 Well Zell- kulturplatten ausplattiert und mit den in Abbildung 6/7 beschriebenen Konstrukten mittels der Lipofectamine 2000 Methode (GibcoBRL/Invitrogen) transient transfiziert. Nach einer Inkubation von 48 Stunden wurde dann zur Messung der Luziferaseaktivität ein Luziferin/Tritonpuffer in gleicher Menge zu den Zellen gegeben und nach Transfer eines Aliquots von 100 μl in eine 96 Well Zellkultur- platte die Lichtausbeute in einem Luminometer gemessen.
Die erzielten Ergebnisse der NS3/4A vermittelten Transspaltung, die in der Abbildung 6a dargestellt sind, zeigen deutlich, dass nur die aktive NS3/4A Protease (Konstrukt C) eine Spaltung des chimären Fusionsproteins A bewirkt und somit eine hohe Luziferaseakivität hervorruft ( ca. 140 000 Lichteinheiten), wohingegen die
Expression der NS3 Protease (Konstrukt B) bzw. der inaktiven NS3/4A Mutante (Konstrukt D) nur zu einer geringen Luziferaseaktivität führen (ca. 5000 Lichteinheiten). Weiterhin zeigt das geringe Lichtsignal unter Verwendung der inaktiven NS3/4A Mutante (Konstrukt D), dass die Freisetzung des Transkriptions- regulators und die damit verbundene Aktivierung des Reportergenkonstruktes G nicht durch endogene Proteasen der Zelle hervorgerufen wird und somit die gemessene Aktivität spezifisch für die eingebrachte virale NS3/4A Protease ist.
Auch die Ergebnisse der in Abbildung 6b dargestellten NS2/3 vermittelten cis- Spaltung zeigen, dass nur unter Verwendung des Konstruktes E, der aktiven NS2/3
Protease in dem chimären Fusionsprotein, in Verbindung mit dem Reportergen- konstrukt G, eine spezifische Luziferaseaktivität messbar ist (ca. 24 000 Lichteinheiten), die gegenüber der inaktiven Mutante (Konstrukt F, ca. 2000 Lichteinheiten) eine mehr als lOfach höhere Luziferaseaktivität aufweist.
Beispiel 5 in vivo Aktivitätsnachweis unter HTS-Bedingungen.
Um eine Durchfuhrung der Proteasetestsysteme in vivo im Hochdurchsatzscreening im 384er Plattenformat zu ermöglichen, wurden in einem ersten Schritt rekombinante Baculoviren von den Konstrukten A, B, C, E, F hergestellt, da eine transiente Transfektion von Zellen unter Hochdurchsatzbedingungen nicht durchführbar ist.
Baculoviren hingegen zeichnen sich, ebenso wie andere virale Transfektionssysteme (z.B. retro virale, adenovirale Systeme) durch Ihre Eigenschaft aus, dass sie sehr effizient verschiedene humane Zelltypen, wie z.B. Hepatomazellen, reproduzierbar infizieren und Ihre DNS in die Zelle abgeben, sich jedoch in diesen Zellen nicht replizieren und keine zytopathischen Effekte hervorrufen [Kost et al., (1999)]. Sie können somit sehr gut als Transferorganismus genutzt werden und führen bereits kurz nach Infektion der Zielzelle zu der Expression des gewünschten Gens, sofern das Gen unter der Kontrolle eines geeigneten eukaryontischen Promotors steht. Des weiteren unterliegen Baculoviren nur dem Sicherheitsstandard Sl/Ll, was einen weiteren Vorteil für Ihre Verwendung um HTS darstellt.
Die Konstrukte A, B, C, E und F wurden unter der Kontrolle eines CMV Promotors in Baculotransfervektoren der Firma GibcoBRL / Invitrogen kloniert (pFastBacDual). Nach Durchlaufen der Standardprozedur des Herstellers (FastBAC- System) wurden Baculoviren generiert und amplifiziert. Nachdem das Virus durch
Zentrifugation und Sterilfiltration (0.45 μM Filter) aufgereinigt und der Virastiter (ca. lxl 07 Viren /ml) bestimmt wurde, konnte das Virus direkt mit einer Konzentration von ca. 10 Viren pro ausgesäter Zelle (MOI 10) verwendet werden.
Für die Infektion der Zellen im 384er Platten-HTS Format, wurden 2000 Zellen pro
Well in 40 μl Medium ausplattiert und direkt mit den in Abbildung 7/7 beschriebenen verschiedenen Viren (MOI 10, in 5 μl Sf9 Medium) infiziert. Als Ausgangszelle diente bei diesen Experimenten eine HepG2 Zelllinie (oder Huh7 Zelllinie, Daten nicht aufgeführt), welche eine stabile Integration des Konstruktes G trägt. Nach einer 20 stündigen Inkubation wurde nach Zugabe von 25 μl einer Luziferin/Triton Lösung ein Luziferaseassay durchgeführt und in einem Lumino- meter ausgewertet.
Die in Abbildung 7/7 dargestellten Ergebnisse für die beiden aufgeführten Systeme der NS3/4A (Abb. 7a) und NS2/3 (Abb. 7b) vermittelten Proteasespaltung des chimären Fusionsproteins zeigen sehr deutlich, dass nur in Anwesenheit einer vollständigen NS3/4A Protease (A+C+G) jedoch nicht mit der NS3 Protease alleine (A+B+G) bzw. einer aktiven NS2/3 (E+G) und nicht der inaktiven NS2/3 Protease (F+G) eine Luziferaseaktivität nachweisbar ist. Darüberhinaus bildet die geringe Hintergrandaktivität, die Stärke des Signals und das sehr gute Signal/Hinter- grundverhältnis der beiden beispielhaft aufgeführten Systeme optimale Bedingungen für eine Durchführung im Hochdurchsatzscreening unter Verwendung eines effizienten und schnellem Transfektionssystem wie z.B. dem hier verwendeten viralen Baculotransfektionssystem.
Literatur
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Claims

Patentansprtiche
1. Verfahren zur Untersuchung der Aktivität viraler Proteasen im Hochdurchsatzscreening (HTS) an zellulären Systemen, dadurch gekennzeichnet, dass Nachweissysteme verwendet werden, die in Abhängigkeit der Aktivität der viralen Proteasen einen funktionalen Transskriptionsregulator ausbilden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Untersuchung der Aktivität der viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A des Hepatitis C Virus (HCV) im Hochdurch- satzscreening (HTS) an zellulären Systemen, dadurch gekennzeichnet, dass
Nachweissysteme verwendet werden, die in Abhängigkeit der Aktivität der viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A einen funktionalen Transskriptionsregulator ausbilden.
3. Verfahren nach Ansprach 1 und 2, in dem als Transkriptionsregulator ein
Expressionskonstrukt verwendet wird, welches sich aus mindestens drei regulatorischen Einheiten zusammensetzt, wobei
a) eine der regulatorischen Einheiten ein Membranlokalisationssignal ist und die Delokahsation des Transkriptionsregulators selbst bewirkt,
b) eine der regulatorischen Einheiten eine proteasespezifische transspaltenden Schnittstelle oder eine cis-spaltende funktionale Protease enthält,
c) eine der regulatorischen Einheiten die Expression eines Reportergens moduliert
4. Verfahren nach Ansprach 1 bis 3, in dem ein Fusionsprotein enthaltend einen Rezeptor aus der Gruppe der CD-Rezeptoren, eine virale Proteaseschnittstelle der HCV - Protease NS3/4A, und der Transkriptionsregulator GalVP16, eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Ansprach 4 wobei das Fusionsprotein aus der DNA Sequenz:
Sequenz 8
oder einem ihrer Homologen generieret wird.
6. Verfahren nach Ansprach 4, wobei ein Fusionsprotein enthaltend einen
Rezeptor aus der Gruppe der CD-Rezeptoren, die virale HCV - NS2/3 Protease, und den Transkriptionsregulator GalVP16, eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Ansprach 4 wobei das Fusionsprotein aus der DNA Sequenz:
Sequenz 9
oder einem ihrer Homologen generieret wird.
8. Verwendung von Aktivitätsmodulatoren der Proteasen NS2 und NS3 bzw.
NS3/4A die unter Anwendung des Verfahrens gemäss der Ansprüche 1 bis 7 gefunden wurden, zur Herstellung von Arzneimitteln für die Prophylaxe und Therapie der HCV-Infektion.
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