WO2004011489A2 - Adenovirus modifies pour changer leur tropisme, de preference pour le ciblage des lymphocytes b ou des cellules ovariennes - Google Patents

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    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Adenoviruses modified to change their tropism, preferably for targeting B cells or ovarian cells
  • the present invention relates to recombinant adenoviruses whose tropism has been modified to allow them to infect B lymphocytes or ovary cells.
  • the recombinant adenoviruses according to the present invention exhibit a reduced tropism compared to that of the native adenovirus. It also relates to methods for the preparation of such adenoviruses, as well as their uses, in particular for the transfer of DNA sequences into B lymphocytes or ovary cells in vitro, ex vivo or in vivo, for an experimental purpose, industrial, vaccine or therapeutic.
  • the invention more specifically describes the modification of the radenovirus fiber gene with the aim of targeting B lymphocytes or ovarian cells, in particular tumor cells, as well as other modifications and / or constructs enabling the viruses to be given a specific character for these cells.
  • the invention is notably characterized either by the introduction into the fiber of the sequence of a peptide recognizing a receptor expressed on the surface of B lymphocytes, or by the replacement of the fiber button of an adenovirus Mastadenovirus by a button fiber from a phylogenically distant adenovirus, preferably from an adenovirus of the Atadenovirus family, more particularly from bovine adenovirus serotype 4 (BAV4).
  • BAV4 bovine adenovirus serotype 4
  • Adenoviruses are widely used as gene vectors. These viruses have in fact many qualities such as easy production at high titer, their genome does not integrate into the genome of the host cell, large inserts can be introduced therein and they can infect quiescent cells and dividing cells. . These advantages make these viruses interesting candidates in the context of gene transfer for gene therapy or for experimental studies (gene transfer in animals, production of recombinant cells, analysis of gene expression, etc.).
  • adenoviruses There are multiple serotypes of adenoviruses, infecting humans or animals.
  • the adenoviruses currently used are mainly from subgroup C and of serotype 2 and 5. Mention may also be made of canine, simian or bovine adenoviruses, as well as human adenoviruses of serotypes 7 or 12, for example.
  • adenoviral vectors The most serious limitations for the use of adenoviral vectors are their immunogenicity, the suboptimal distribution of adenoviral particles in vivo, the lack of vector specificity for diseased tissue, and low infectivity for a number of target cells.
  • a limitation of adenoviral vectors lies in the fact that they do not infect hematological cells very much.
  • a gene therapy protocol against a pathology involving B lymphocytes for example tumor pathologies such as leukemias and lymphomas, it is necessary to allow their infection to be effective. This also applies in the case of an in-vivo or ex-vivo gene therapy protocol, immunotherapy or a suicide gene strategy.
  • an in-vivo or ex-vivo gene therapy protocol immunotherapy or a suicide gene strategy.
  • such a gene vector can be used in experimental approaches, for example to efficiently transfect lymphocytes
  • Vectors having the capacity to preferentially infect the target cells would make it possible to significantly reduce the doses of therapeutic vectors, which would reduce their toxicity and increase their efficiency.
  • the second strategy used to modify the tropism of adenoviruses is to graft on the fiber, in a genetic way, a peptide allowing the recognition of a cellular receptor.
  • the addition of this peptide sequence should not hinder trimerization in order to obtain a correct assembly of the virus.
  • Many studies have been carried out in this direction, with in particular the use of a poly-lysine sequence (K 7 ) or of an RGD sequence at the C-terminal end of the fiber (Wickham et al, 1997). These modifications allow correct assembly of the virus and infection of the cells via the interaction of poly-lysine / heparan sulfates or RGD / integrins of the ⁇ v ⁇ 3-5 type.
  • the third approach is based on the use of a trimerization domain, which can be heterologous or come from the fiber of an adenovirus that does not recognize the hCAR receptor.
  • a trimerization domain which can be heterologous or come from the fiber of an adenovirus that does not recognize the hCAR receptor.
  • the heterologous domains let us mention the fibritin of bacteriophage T4 (Krasnykh et ah, 2001), a trimerization domain of the envelope glycoprotein of MoMuLV (vanBeusechem et ah, 2000), a peptide of 36 amino acids derived from the NRP domain ( Neck Region Peptide) of the surfactant protein D of the lungs (Magnusson et al., 2001).
  • the present invention describes the possibility of modifying the natural tropism of an adenovirus to allow good infection of cells little or not infected with the natural adenovirus, preferably B lymphocytes or ovary cells, without increasing the natural spectrum of host cells of this virus, preferably with a decrease in the natural spectrum of host cells of this virus.
  • the natural spectrum of the native adenovirus is already very important because the natural adenovirus receptor is present on the surface of a large number of cell types.
  • the present application now describes the construction and production of adenoviral vectors capable of infecting B lymphocytes, via a well-defined peptide recognizing a specific B receptor.
  • the present application also describes recombinant adenoviral vectors exhibiting a modified and restricted tropism for B lymphocytes.
  • B lymphocytes not being natural targets for adenoviruses, the The present invention shows that it is possible to develop a tool for targeting these cells.
  • a first object of the invention lies more particularly in a recombinant adenovirus, characterized in that it comprises a modified fiber, the sequence of which comprises a targeting peptide specific for a CD21 receptor.
  • the present application further describes the construction and production of adenoviral vectors capable of specifically infecting ovarian cells.
  • the present application also describes recombinant adenoviral vectors exhibiting a modified and restricted tropism for ovarian cells.
  • the present invention shows that it is possible to develop a specific targeting tool for these cells.
  • the adenovirus according to the present invention weakly infects human epithelial cells, which are the target cells of adenoviruses of subgroup C. On the other hand, this hybrid virus more effectively infects tumor cells originating from ovarian cancer, such as the SKOV3 line.
  • a second object of the invention lies more particularly in a recombinant Mastadenovirus adenovirus, characterized in that it comprises a modified fiber, the fiber button of which has been replaced by the fiber button of an adenovirus of the Atadenovirus family, preferably bovine adenovirus 4 (BAV4) or the virus responsible in chicken for "Egg Drop Syndrome" (EDS), more particularly bovine adenovirus 4 (BAV4).
  • BAV4 bovine adenovirus 4
  • EDS Egg Drop Syndrome
  • Another aspect of the invention resides in a process for the preparation or production of a recombinant adenovirus as defined above, as well as in the tools and constructions which can be used for this purpose (vectors, chimeric genes, cells, etc.) .
  • Another aspect of the invention resides in a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one recombinant adenovirus as defined above, and in its use for the transfer of genes into B lymphocytes or ovary cells, in particular for the treatment of pathologies associated with a dysfunction of these cells or affecting these cells.
  • Another object of the invention resides in the use of a recombinant adenovirus as defined above for the preparation of a composition intended for the transfer of genes into B lymphocytes or ovary cells in vivo, ex vivo or in vitro.
  • Another aspect of the invention relates to a modified adenovirus fiber protein as defined above, any nucleic acid encoding such a protein, as well as their uses.
  • the invention therefore relates, in general, to recombinant adenoviruses having a modified tropism, more particularly having a tropism for B lymphocytes or ovary cells.
  • recombinant adenovirus designates, within the meaning of the invention, a modified viral particle comprising a viral genome contained in a capsid.
  • the adenoviral genomes are double stranded linear DNA of approximately 36kb. They include two terminal regions, the ITR (Inverted Terminal Repeat) which are the origins of replication of the viral genome and an encapsidation sequence ( ⁇ ). In addition, several regions (E1 to E4) called early encode elements necessary for the transcription and replication of the viral genome, and regions called late (L1 to L5) code the structural proteins of the virus.
  • the recombinant adenoviral genomes constructed for gene therapy are deleted from (or defective for) El a and / or Elb from the El region, the products of these genes being essential for viral production. This deletion (or this defective character) prevents possible dissemination of the vector in the organism. The sequence of interest is generally introduced in place of this region.
  • the recombinant adenoviruses of the invention comprise a recombinant adenoviral genome comprising two ITR terminal regions, an encapsidation sequence ( ⁇ ) and a DNA sequence of interest, the transfer or expression of which in a determined host is desired.
  • they comprise an adenoviral genome defective for the El region at least.
  • Adenovirus with tropism for B cells Adenovirus with tropism for B cells
  • An essential characteristic of the recombinant adenoviruses of the invention lies in the presence of a modified fiber, which gives these viruses a particular tropism, and in particular the capacity to infect B lymphocytes.
  • the invention now describes the construction of the gene encoding a chimeric fiber comprising a peptide specifically recognizing the CD21 receptor.
  • the CD21 receptor is a surface marker for B lymphocytes (Nemerow et al., 1989).
  • the CD21 (or CR2) glycoprotein is the EBV (Epstein Barr Virus) receptor, which is also recognized by the complement C3dg.
  • EBV Epstein Barr Virus
  • the inventors have developed adenoviruses having, in their fiber, a peptide specifically recognizing the CD21 receptor.
  • the peptide chosen was defined on the basis of the sequence of the part of the glycoprotein GP350 / 220 (EBV envelope protein) responsible for the recognition of CD21.
  • the glycoprotein GP350 / 220 of the EBV envelope was defined as being responsible for the recognition of the CD21 receptor (Nemerow et al., 1987; Tanner et ah, 1987).
  • the comparison of the peptide sequence of this protein to that of the complement C3dg revealed two regions of strong homology: EDPGFFNVE for GP350 / 220 and EDPGKQLYNVE for C3dg, the latter being responsible for the recognition of C3dg in CD21 ( Lambris et al., 1985).
  • Different peptides and different locations in the fiber were selected in order to have an optimal conformation of the sequence of interest on the surface of the fiber, and to allow a good interaction with the receptor.
  • the modified fiber according to the invention comprises a ligand peptide of a CD21 receptor comprising the sequence EDPGFFNVE (SEQ ID No 3) or a functional part thereof.
  • Other targeting peptides are the peptides of sequences GEDPGFFNVE (SEQ ID No 4), GEDPGFFNVEIP (SEQ ID No 5), GEDPGFFNVEIPEFP (SEQ ID No 6) and EDPGFFNVEIPEFPF (SEQ ID No 7), which have been used in order to have an optimal conformation for the recognition of CD21.
  • Targeting peptides include any peptide comprising between 7 and 20 amino acids, preferably between 10 and 18, even more preferably between 11 and 17, of synthetic, natural or mixed origin, capable of binding the CD21 receptor to the surface of a B cell, preferably selectively.
  • the term "so selective ” indicates that the binding to the CD21 receptor is more refined than the binding to other cellular markers, even if such non-specific binding cannot be completely excluded.
  • the term “functional part” designates any fragment of a sequence defined above, or any derivative of such a sequence, which retains the ability to interact selectively with a CD21 receptor.
  • the targeting peptide can be introduced into different positions in the adenovirus fiber, either as a replacement for existing sequences, or as a supplement.
  • the sequence encoding the targeting peptide is introduced at the 3 ′ end of the fiber gene (and the targeting peptide is therefore found at the C-terminal end of the fiber protein) or in the sequence of the HI loop (the HI loop being between the 535 th and the 547 th residue in the fiber sequence of the serotype 5 adenovirus).
  • the targeting peptide can be linked directly to the fiber protein, or via a spacer sequence.
  • a spacer sequence is used primarily when the targeting peptide is introduced at the C-terminus of the fiber.
  • the spacing sequence does not affect the functionality of the targeting peptide and allows for greater flexibility thereof.
  • SG sequence
  • a preferred spacer sequence is the (Ser-Gly) s-Ser sequence.
  • Specific constructs according to the invention are fibers modified at the C-terminal end by adding a targeting peptide via a spacer sequence.
  • the sequence of the C-terminal end of the fiber is for example the following:
  • the fiber further comprises one (or more) additional alteration reducing or blocking its interaction with the hCAR receptor, preferably in the button of the fiber.
  • additional alteration may understand for example mutations in the DG loop of the fiber button, which does not alter the trimerization but significantly reduces the interaction of the virus with its hCAR receptor (Kirby et al, 1999).
  • the adenovirus fiber button can be replaced by the domain that allows trimerization of fibritin from bacteriophage T4 (Krasnykh et al, 2001).
  • Another possible alteration consists in replacing the fiber button of serotypes 2 and 5 (HAdV2, HAdV5) by the fiber button of a non-Mastadenovirus adenovirus.
  • Such an alteration makes it possible to restrict the tropism of the recombinant adenovirus, and therefore to increase its specificity for B lymphocytes.
  • Such specificity is of course particularly advantageous for use in gene therapy because it makes it possible to reduce the doses to be administered. This is an important advantage because the adenovirus is very immunogenic and can induce a strong undesirable immune reaction.
  • adenovirus BAV4 Bovin Adeno Virus 4
  • the viruses were constructed, amplified and purified and initial tests made it possible to observe that the adenovirus thus modified infects human epithelial cells in a reduced manner (by a factor of 10-50).
  • another object of the invention resides in an adenovirus fiber protein comprising a targeting peptide specific for a CD21 receptor.
  • the fiber further comprises a modification reducing the interaction with the hCAR receptor.
  • An essential alternative characteristic of the recombinant adenoviruses of the invention resides in the presence of a modified fiber, which confers on these viruses a particular tropism, and in particular the capacity to specifically infect ovarian cells, more particularly tumor cells originating from ovarian cancer.
  • the recombinant Mastadenovirus adenoviruses are characterized by the presence of a chimeric fiber which confers on these viruses an abolition of the interaction with the hCAR receptor.
  • the invention now describes the construction of the gene encoding a chimeric fiber comprising a fiber button substituted by a fiber button of an adenovirus having a low sequence homology with those of adenoviruses of the subgroup C, more particularly with that of the fiber button of adenoviruses 2 and 5.
  • the virus used for the substitution of the fiber button also has a low or an absence of infectivity of human cells.
  • the adenovirus the fiber button of which is introduced into the recombinant virus, belongs, for example, to the families Aviadenovirus, Atadenovirus or Siadenovirus.
  • the fiber button of an Atadenovirus adenovirus is used.
  • Atadenovirus adenoviruses bovine adenovirus 4 (BAV4) or the EDS adenovirus constitutes a preferred embodiment.
  • BAV4 fiber button in adenovirus 2 makes it possible to obtain a specific tropism for ovarian cells.
  • the junction between the two fibers to form a chimeric fiber can be carried out at different positions in the fiber gene of the adenovirus 2.
  • the most easy junctions are in the stems of the fibers. These consist of a variable number of repeated structural patterns. It is the number of repeating patterns that determines the length of the fiber, so there are 21 patterns for the adenovirus 2 fiber, 20 patterns for BAV4 but only 5 for the adenovirus 3.
  • These different junctions can vary the length of the chimeric fiber. This length can influence the targeting efficiency of the adenoviral vector.
  • the junction was made in the stem of the two fibers, between the repeated patterns 7 and 8 for the fiber of adenovirus 2 and between the patterns 7 and 8 for that of BAV4.
  • the chimeric fiber has the sequence SEQ ID No 2 and can be encoded by the polynucleotide of sequence SEQ ID No 1.
  • An object of the invention resides in a nucleic acid encoding a fiber protein as defined above. It may be DNA or RNA, preferably DNA. Another object of the invention resides in a vector comprising such a nucleic acid, this vector possibly being a plasmid, virus, phage, cosmid, etc.
  • the modified fibers can be constructed by genetic engineering, according to techniques known to those skilled in the art, such as for example by artificial synthesis, cloning, ligation, enzymatic cleavage, amplification, site-directed mutagenesis, junction of oligonucleotides, etc.
  • the adenovirus according to the invention is produced from an adenovirus of serotype 2 or 5.
  • the recombinant adenovirus comprising the modified fiber can be produced by various methods.
  • the gene encoding the modified fiber can be introduced into the adenoviral genome, or introduced, in integrated or extra-chromosomal form, into the genome of the virus-producing cell.
  • another subject of the invention relates to a process for the production of a recombinant adenovirus as defined above, comprising (i) the construction of a gene encoding the modified fiber, in particular encoding the fiber whose sequence comprises a targeting peptide specific for a CD21 receptor or encoding the fiber, the sequence of which comprises the button of the fiber of another adenovirus according to the present invention, (ii) the introduction of this gene into an adenoviral genome, ( iii) introduction of the adenoviral genome into an packaging cell, (iv) amplification of the viruses and (v) purification of the viruses produced.
  • the packaging cell used can be any permissive cell comprising or expressing the defective adenoviral proteins of the recombinant genome.
  • any cell expressing the El region of an adenovirus is used, such as cells HEK 293, PER.C6, etc. It is also possible to use cells co-transfected with a plasmid or a helper virus providing the necessary functions.
  • the packaging cell for preparing the recombinant adenoviruses having a fiber button substitution must also express a wild fiber to complement the chimeric fiber defective for its interaction with the hCAR receptor.
  • the adenovirus 2 fiber gene was inserted into a plasmid derived from pCDNA3 (Invitrogen), the sequence of exons 2 and 3 of the TPL (Tri Partite Leader) of the adenovirus. 2 was inserted between the CMV promoter and the fiber gene ( Figure 7). The sequence in the vicinity of the translation initiation codon was modified by PCR, with specific oligonucleotides, to obtain the consensus defined by KOZAC ((Kozak 1997); consensus favoring the start of translation.
  • Another subject of the invention relates to a viral particle comprising an adenovirus fiber as defined above.
  • Another subject of the invention relates to a method for the transfer of a nucleic acid into a B lymphocyte in vitro, ex vivo or in vivo, comprising bringing an organism, tissue, biological sample or cells comprising lymphocytes into contact B with a recombinant adenovirus, said recombinant adenovirus comprising said nucleic acid and comprising a modified fiber comprising a targeting peptide specific for a CD21 receptor.
  • Another subject of the invention relates to a method for the transfer of a nucleic acid into ovarian cells in vitro or in vivo, comprising bringing an organism, tissue, biological sample or cells comprising cells into contact.
  • ovary with a recombinant Mastadenovirus adenovirus said recombinant adenovirus comprising said nucleic acid and comprising a chimeric fiber having a button substitution of the fiber according to the present invention.
  • Another subject of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a recombinant adenovirus as defined above and a pharmacologically acceptable vehicle.
  • vehicle or excipient can be any solution, suspension, gel, powder, etc., compatible with pharmaceutical use, such as in particular an isotonic, buffered, saline solution, etc.
  • the invention can be used for the transfer and expression of nucleic acids of interest in B lymphocytes or ovary cells, in experimental or therapeutic approaches.
  • the nucleic acid can be a suicide gene, that is to say any nucleic acid encoding a protein toxic to the cell, either directly or conditionally (eg, TK, cytosine deaminase, etc.), a nucleic acid encoding an anti-tumor factor, a cytokine, an antisense, an antigen, a marker, etc. (such as H2, 1112, anti bcr / abl anti-sense RNA).
  • the invention can be used in the therapeutic field, for the preventive or curative treatment of pathologies involving or affecting B lymphocytes or ovary cells, such as tumor pathologies (leukemias, lymphomas, ovarian cancer, etc.), diseases immune, inflammatory, etc.
  • the E1 region can also be inserted into the vector with the aim of obtaining an adenovirus competent for replication but with a cell dependence for it. This effect can be obtained by placing the El A region under the control of a specific promoter of ovarian cancer tumor cells for example, and / or by using mutants in one or other of the proteins encoded by the region E1B.
  • a replication-competent virus could specifically lyse tumor cells and not spread to other tissues due to the loss of recognition of the hCAR receptor.
  • Figure 1 Principle of the last stage of construction of viral genomes having a fiber gene modified by homologous recombination in E. coli (after Renaut, L et al, 2002).
  • Figure 2 Shuttle vector allowing the insertion of fibers modified by molecular cloning between the Mlul and Sali sites and the homologous recombination with the vector pRECad.
  • FIG. 3 Diagram of pRECad, its digestion by Sw ⁇ l releases the viral genome.
  • Figure 4 Tropism of adenoviral vectors.
  • the genetically modified vector has a fiber with the CD21 targeting peptide in the HI loop.
  • Figure 4 A Study of the binding of the labeled vector to FAM.
  • Figure 4B Expression of the lacZ reporter gene.
  • A549 control epithelial cells; Daudi and Raji, B lymphocyte cell lines; HSB2, T lymphocytes;
  • Ad-CD21HI adenoviral vector with a fiber modified by genetic insertion of the peptide EDPGFFNVEIPEFPF in the HI loop of the fiber.
  • the values indicate the gain (> 1) or the reduction ( ⁇ 1) of tropism of the modified vector compared to the vector having a wild fiber.
  • Figure 5 Comparison of HAdV-2 and BadV-4 fiber proteins.
  • the HAdV-2 sequence involved in an interaction with the base of the penton is indicated in bold; only part of this sequence (PVYP) has been preserved in BadV-4.
  • the stem domain repeats are numbered and appear to be well preserved in the BadV-4 fiber.
  • the P and GXG residues responsible for the elbow are in italics.
  • the arrow indicates the position in the rod used to prepare the protein of the chimeric fiber. Codons K and L (AAR CTN) can correspond to a HindUl restriction site.
  • Figure 6 Construction of an adenoviral genome with a chimeric fiber gene.
  • the plasmid ⁇ 5Shut / HadV2 / BadV4 containing the chimeric fiber gene between nucleotides 31041 and 32788 was prepared.
  • PRECad has been linearized with Pac ⁇ and p5Shut / ⁇ adV2 / BadV4 with Notl and Kpnl.
  • the fragments were co-introduced into an electrocompetent E. coli ToplOF 'strain.
  • the positions of the deletion in the E3 region, of the fiber gene and of the restriction sites are indicated with reference to the HAdV5 sequences.
  • FIG. 7 Diagram of construction of the vector ⁇ C3-TPL23-fb allowing the synthesis of the fiber in the packaging cells.
  • the fiber gene is under the control of the CMV early promoter. Exons 2 and 3 of the TPL of adenovirus 2 were inserted between the promoter and the fiber gene.
  • the neomycin resistance gene is under the control of the S V40 promoter, this gene allows the selection of cells which have integrated this vector.
  • Figure 8 Diagram of pRECad2 / BAV4, its digestion by Sw ⁇ l releases the viral genome.
  • FIG. 9 In vitro synthesis of fiber proteins. Fiber proteins were synthesized in vitro and isolated by SDS-PAGE. The modification in the neighboring sequence of the initiation codon (Lines 3 and 5) and the presence of the TPL exons are indicated. A complete fiber cDNA was used as a line control 6. The arrows indicate the fiber protein synthesized in the absence of TPL and without the ATG modification.
  • Figure 10 Analysis of trimerization of fiber proteins.
  • Figure 10A the fiber proteins were synthesized in vitro and analyzed on a 12.5% non-denaturing gel on PAGE. The arrows indicate the monomeric (62 kDa) and trimeric (186 kDa) forms of HAdV-2 fiber proteins.
  • Figure 10B In vivo analysis. COS cells were transfected with pC3fbAd2 and pC3fbAd2 / BadV4. The proteins of the transformed cells were prepared 24 h after transfection and separated by SDS-PAGE after (D) or before (N) denaturation. Fiber proteins were revealed by immunodetection with a monoclonal antibody.
  • FIG 11 Immunodetection analysis of viral particles produced in HEK-293 cells.
  • Ad vectors were produced in HEK-293 cells and purified. Viral proteins were separated by SDS-PAGE and the proteins were transferred to a membrane. Fiber proteins were revealed with a monoclonal antibody against the N-terminal part of the fiber.
  • Figure 12 Study of the cellular tropism of the modified adenoviral vectors.
  • Figure 12A HeLa cells were infected with an increasing amount of viral particles, 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8 10 3 PP per cell from front to back, respectively.
  • FIG. 12B the percentage of HeLa positive cells, determined in FIG. 12A, was expressed as a function of the quantity of initial virus.
  • Figure 12C HepG2 cells were infected and analyzed under conditions similar to Fig 12 A. The results were expressed as a percentage of positive cells.
  • Figure 12E Daudi (B lymphocytes) and Jurkat (T lymphocytes) cell lines were infected with 2 ⁇ 10 PP per cell of HAdV2 and HAdV2 / BadV4 virus as indicated in FIG. 12A. The results are expressed as a percentage of positive cells.
  • Figure 13 Infection of hCAR-independent CHO cells with a hybrid Ad vector with a HAdV2 / BadV4 chimeric fiber.
  • CHO cells expressing or not expressing the hCAR receptor were infected with 1 10 3 (white) or 3 10 3 (black) PP per parental or hybrid vector cell.
  • 24 h after infection the activity of the ⁇ -galactosidase reporter was determined by FACS and is indicated as a percentage of positive cells.
  • Figure 14 Study of the cell tropism of the modified Ad vectors on the SKOV3 cell line.
  • the cells were infected with increasing amounts of viral particles, 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8 10 3 PP per cell. 24 h after infection, the activity of the ⁇ -galactosidase reporter was determined by FACS. The percentage of SKOV3 positive cells was expressed as a function of the amount of initial virus.
  • Example 1 Construction of chimeric fibers comprising a peptide targeting B cells.
  • targeting peptides chosen include the sequence GEDPGFFNVE (SEQ ID NO: 1
  • the gene encoding the adenovirus 2 fiber was cloned into pBluescript- ⁇ -SK (Stratagene) between the restriction sites NotI and S ⁇ fl.
  • a PCR was carried out on the genome of HAdV2 with the primers 5'-AggAAAAAAgCggCCgCATgAAACgCgCCAgAC-3 '(SEQ ID ⁇ o 8) in 5' and 5'-AggAAAAAAggTCgACTTATATCgATTCCTgggCAATgTAg-3 '(SEQ ID ID 3').
  • the second primer contains a ClaI site immediately before the stop codon.
  • a spacer sequence was also introduced between the sequence encoding the fiber and that encoding the EBV peptide. This sequence makes it possible to have no bulk and thus to keep an optimal conformation of the fiber and of the peptide.
  • the C-terminus of the fiber has the sequence: AQE (SG) 6 EDPGFF ⁇ VEC (SEQ ID No 12).
  • the primers 5'- AggAAAAAACgTCgACgTTAgAACgggAATTCgggAATTTCAACgTTgAAAAACC Cggg-3 '(SEQ ID No 13) and 5'-CCCCCTggggTACTCTCTTTACgCgTATCCgA ACCTCTAgTTACC-3' (SEQ ID No 14) were used.
  • This PCR fragment was cloned in place of the MluVSatt fragment. Wild fiber cloned into pBs-sK.
  • the C-terminus of the resulting fiber has the sequence: AQE (SG) 6 EDPGFFNVEIPEFP (SEQ ID No 15).
  • oligonucleotides were inserted into a site S ⁇ el located at 1615 bp from the 5 'end of the gene of the cloned fiber in pBluescript-fl-SK .
  • the oligonucleotides 5'-CTAgCggCgAAgATCCCgggTTTTTCAACgTTgAAATTC-3 '
  • Example 2 Construction and Production of Recombinant Adenovirus Comprising a Chimeric Fiber Comprising a B Cell Targeting Peptide and Functionality
  • the genes encoding the modified fibers were then cloned into a shuttle vector to allow their introduction into a viral genome previously constructed (Renaut et al, 2002), in place of the gene encoding the wild fiber. This step was carried out by homologous recombination in E. coli (Chartier et al, 1996).
  • the shuttle vector used contains 5502 bp from the right end of the PHAdV5 genome which were amplified with the primers 5'-TTgTATAAAAAgC ⁇ CggCC ⁇ CAACTACCTTGCCTACCACTC- 3 '(SEQ ID No 20) which hybridizes to 25690 bp in the genome viral and the primer 5'- TTgTATAAAAAgCgrC ⁇ [CCCTCCCgTgTgTgACTCgCAg-3 '(SEQ ID No 21) which hybridizes to 34322 bp in this same genome.
  • This fragment was amplified from pBHG11 (Graham et al, 1989) which is a plasmid containing the entire genome of HAdV5, in the part which interests us, a fragment of 3130 bp containing the E3 region between 27865 bp and 30,995 bp had been deleted.
  • This fragment was cloned between the NotI and Xh ⁇ sites in pBS-SK, and an M1 site, absent in the HAdV5 fiber, was added with the complementary primers 5'- CCCCCTggggTACTCTCTTTACgCgTATCCgAACCTCTAgTTACC-S '(SEQ ID ⁇ o 22) and 5'-ggTAACTAgAggTTCggATACgCgTAAAgAgAgTACCCCAggggg-3 '(SEQ ID ⁇ o 23).
  • an S ⁇ fl site was inserted by mutagenesis at the 3 'end of the fiber gene, upstream of the polyA addition site of the L5 region using the primers 5'- CTTACACTTTTTCATACATT ⁇ rCg4CgAATAAAgAATCgTTTgTgTTATg-3' (SEQ ID ⁇ o 24) and 5'-CATAACACAAACgATTCTTTATTC ⁇ rCg ⁇ 4CAATgTATgAAA AAgTgTAAg-3 '(SEQ JJJ ⁇ o 25).
  • HEK293 cells expressing the adenovirus 2 fiber by lipofection. These cells allow the production of recombinant viruses because they express E1 which allows transcomplementation since this gene is deleted in the genomes of the viruses previously obtained.
  • a recombinant adenovirus was thus constructed and produced.
  • the apical proteins of the capsid are fibers of HAdV2 with, at their C-terminal end, the peptide of targeting.
  • This virus was produced with a titer equivalent to that of the virus carrying wild fiber (control virus), and it infects epithelial cells with the same efficiency as the control virus.
  • a second construct was obtained with a targeting sequence of the
  • CD21 derived from GP350 / 220 of EBV and having the sequence:
  • EDPGFFNVEIPEFPF which has been inserted into the HI loop of the adenovirus 2 fiber via the insertion of an oligonucleotide into a single restriction site
  • the studies carried out with these viruses give good results with regard to the permissiveness of the cell lines expressing CD21, this both at the level of the attachment of the viruses to the cells and at the expression of the transgene (see FIG. 4).
  • the inventors observed a reduction in the binding of viral particles and in the expression of the transgene in the cell lines expressing the hCAR receptor and not expressing CD21.
  • the percentage of positive cells is equivalent for a B lymphocyte cell line (Daudi) to that observed with the control epithelial cells, which represents a gain in tropism by a factor of approximately 30.
  • Example 3 Construction and Production of Recombinant Adenovirus Comprising a Chimeric Fiber Comprising a Button of the EPS or BAV4 Fiber, and Functionality
  • EPS and BAV4 adenovirus fiber genes 1- Amplification of EPS and BAV4 adenovirus fiber genes.
  • the genes coding for the fiber of adenovirus 2 (HAdV2), those of EDS and of BAV4 were cloned in pBluescript-II-SK (Stratagene) between the restriction sites NotI and Sali .
  • a PCR was carried out on the genome of HAdV2 with the primers 5'-
  • a PCR was carried out on the EDS genome with the primers 5'- AggAAAAAAggCggCCgCCATggCgAAgCgACTACggTTggACCCTgATCC-3 '(SEQ ID No 26) in 5' and 5'-AggAAAAAAggTCgACTACTgTgCTCCAACATATgTAAA 3 ' and on the plasmid ⁇ VM404, containing the region encoding the fiber of BAV4, with the primers 5'-AggAAAAAAgCggCCgCATgAAAAgAgCACgTTg-3 '(SEQ ID No 28) in 5' and 5'-AggAAAAAAAAggTCgACTTATATCgATTgCgTgCgATT 3CgTgG 3gAgAT 3) '(The second primer contains a ClaI site immediately before the stop codon).
  • Htwdl ⁇ site present in the gene of the fiber of adenovirus 2 was modified, by site-directed mutagenesis, using the following complementary primers: 5'- gAgCgggTTTAAgTTTTgACAACTCAgg-3 '(SEQ ID No 30) and 5'- CCTgAgTTgTCAAAACTTAAACCCg 3 '(SEQ ID No 31); this mutation does not affect the sequence of the fiber.
  • H dli sites were introduced into the genes of the fibers of adenovirus 2, EDS and BAV4, using the following pairs of complementary primers:
  • the genes of the chimeric fibers were obtained by replacing the 3 ′ end of the gene of the adenovirus 2 fiber with that of EDS and BAV4 using the restriction sites H d ⁇ l and S ⁇ fl.
  • the genes encoding the chimeric fibers were transferred into a plasmid which contains, at 5 'to the gene of interest, the element of bacteriophage T7 allowing a in vitro transcription.
  • in vitro syntheses were carried out with the in vitro transcription / translation kit from Promega and their products separated on non-denaturing polyacrylamide gel.
  • the chimeric protein synthesized in vitro migrates only at the predicted molecular weight as a monomer (61 kDa, HAdV2 / BAdV4) ( Figure 10A).
  • the BadV4 control fiber protein was also observed only as a monomer in this in vitro test ( Figure 10, line 3) although the BadV4 fiber protein in the viral capsid is probably in the form of a trimer.
  • transient expression was carried out in COS cells after transfection with pC3-TPL23-Fb-HAdV2 / BAdV4.
  • Fiber proteins were visualized by immunodetection after electrophoresis under non-denaturing conditions. Fiber proteins appeared as trimer ( Figure 10B) when synthesized in vivo, although a significant portion of the proteins synthesized are in monomeric form. These results made it possible to construct and produce recombinant adenoviruses with a chimeric fiber protein HAdV2 / BAdV4.
  • the genes encoding the chimeric fibers were then cloned into a shuttle vector to allow their introduction into a viral genome previously constructed (Renaut et a, 2002) in place of the gene encoding the wild fiber. This step was carried out by homologous recombination in E. coli (Chartier et al, 1996).
  • the shuttle vector used was described in Example 2 above.
  • adenoviruses Several recombinant adenoviruses have thus been constructed and produced.
  • the apical proteins of the capsid are of two types: the wild fiber of adenovirus 5 and one of the chimeric fiber Ad2 / EDS or Ad2 / BAV4. These viruses are then used to infect HEK293 cells.
  • the apical proteins of the viral particles thus obtained are only of chimeric type.
  • the adenovirus 2 fiber gene after amplification by PCR, using the following primers 5'- AggAAAAAAgCggCCgCCACCATggCgAAACgCgCCAgACCgTC-3 '(SEQ ID No 40) in 5' and 5 * -AggAAAAAAggTCgACCATgCAACAggTTCACg-3 No 41) in 3 ', was inserted between the Notl and Sali sites.
  • the 5 'primer was designed to modify the sequence in the vicinity of the translation initiation codon (Kozak consensus).
  • AD ⁇ c of exons 2 and 3 of the TPL of adenovirus 2 was inserted between the HmdlII and Notl sites of the vector.
  • This AD ⁇ c was obtained by PCR amplification after retrotranscription of the AR ⁇ extracted from HeLa cells 24 hours after infection with the wild strain of adenovirus 2.
  • the primers used have the sequence: 5'- AggAAAAAAgAAgCTTCTCgCggTTgAggACAAACTCTTCgC-3 '(SEQ ID ⁇ o 42) in 5 'and 5'-AggAAAAAAAAggCggCCgCTTgCgACTgTgACTggTTAgACgCC-3 (SEQ ID ⁇ o 43) in 3'.
  • the plasmid obtained was transfected by lipofection into the cell line HEK293 (Graham et al, 1977), the cell clones resistant to Geneticin were analyzed for the expression of the adenovirus fiber.
  • the clone with the highest expression (247 E ) was used for the transfection of viral genomes and the first production cycles of recombinant adenoviruses having a chimeric fiber.
  • the stage of maturation and the protein content of all the recombinant viral particles were compared by SDS-PAGE analysis of virus preparations.
  • the adenoviruses were isolated by isopycnic gradient ultracentrifugation of cesium chloride so as to purify the population of infectious virus at a density of 1.34 g mL.
  • SDS-PAGE analysis of the viruses has shown that the maturation of the viral particles is not altered by the presence of chimeric fiber proteins.
  • the various precursor proteins were cleaved into mature proteins, in particular the pVH protein.
  • the viral proteins were transferred to the membrane and the fiber proteins were revealed with a monoclonal antibody.
  • the fiber protein appears at the expected size ( Figure 11 A, line 4).
  • a set of human cell lines were tested for their sensitivity to the vector presenting a chimeric fiber by determining the level of activity of ⁇ -galactosidase (FIG. 12).
  • the vector having the HAdV2 / BAV4 fibers showed a reduced capacity to infect human cells.
  • the amount of initial virus was increased 5 to 10 times compared to a natural virus ( Figure 12A, B).
  • Figure 12E For Daudi and Jurkat non-permissive cells, the adenoviral vector presenting a chimeric fiber showed reduced infectivity compared to the vector presenting a HAdV5 fiber (FIG. 12E).
  • the infectivity of cells In order to analyze the interaction of the vector with hCAR, the infectivity of cells
  • the SKOV3 cell line was infected with increasing amounts of the two vectors and expression of the reporter gene was determined 24 h after infection.
  • the SKOV3 cell line (FIG. 14) appeared more permissive to the vector presenting the chimeric fiber than to the control vector.
  • Fiber knob modifications overcome low, heterogeneous expression of the coxsackievirus-adenovirus receptor that limits adenovirus gene transfer and oncolysis for human rhabdomyosarcoma cells. Cancer Res. 61, 2953-2960.
  • gp350 as the viral glycoprotein mediating attachment of Epstein-Barr virus (EBV) to the EBV / C3d receptor of B cells: sequence homology of gp350 and C3 complement fragment C3d. J. Virol. 61, 1416-1420.
  • Vanderkwaak TJ Wang M., Gomez-Navarro J., Rancourt C, Dmitriev L, Krasnykh V., Barnes M., Siegal GP, Alvarez R., and Curiel DT, 1999.
  • An advanced generation of adenoviral vectors selectively enhances gene transfer for ovarian cancer gene therapy approaches. Gynecol. Oncol. 74, 227-234.

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Abstract

La présente invention concerne des adénovirus recombinants dont le tropisme a été modifié pour leur permettre d'infecter des lymphocytes B ou des cellules d'ovaire. Les adénovirus recombinants selon la présente invention présente un tropisme réduit par rapport à celui de l'adénovirus natif. Elle concerne également des méthodes pour la préparation de tels adénovirus, ainsi que leurs utilisations, notamment pour le transfert de séquences d'ADN dans des lymphocytes B ou des cellules d'ovaire in vitro, ex vivo ou in vivo, dans un but expérimental, industriel, vaccinal ou thérapeutique. L'invention décrit plus spécifiquement la modification du gène de la fibre de l'adénovirus dans le but de cibler des lymphocytes B ou des cellules ovariennes, en particulier des cellules tumorales, ainsi que d'autres modifications et/ou constructions permettant de conférer aux virus un caractère spécifique pour ces cellules. L'invention est caractérisée notamment soit par l'introduction dans la fibre de la séquence d'un peptide reconnaissant un récepteur exprimé à la surface des lymphocytes B, soit par le remplacement du bouton de la fibre d'un adénovirus Mastadenovirus par un bouton de la fibre d'un adénovirus phylogéniquement éloigné, de préférence de l'adénovirus bovin de sérotype 4 (BAV4).

Description

Adénovirus modifiés pour changer leur tropisme, de préférence pour le ciblage des lymphocytes B ou des cellules ovariennes
La présente invention concerne des adénovirus recombinants dont le tropisme a été modifié pour leur permettre d'infecter des lymphocytes B ou des cellules d'ovaire. Les adénovirus recombinants selon la présente invention présente un tropisme réduit par rapport à celui de l'adénovirus natif. Elle concerne également des méthodes pour la préparation de tels adénovirus, ainsi que leurs utilisations, notamment pour le transfert de séquences d'ADN dans des lymphocytes B ou des cellules d'ovaire in vitro, ex vivo ou in vivo, dans un but expérimental, industriel, vaccinal ou thérapeutique. L'invention décrit plus spécifiquement la modification du gène de la fibre de radénovirus dans le but de cibler des lymphocytes B ou des cellules ovariennes, en particulier les cellules tumorales, ainsi que d'autres modifications et/ou constructions permettant de conférer aux virus un caractère spécifique pour ces cellules. L'invention est notamment caractérisée, soit par l'introduction dans la fibre de la séquence d'un peptide reconnaissant un récepteur exprimé à la surface des lymphocytes B, soit par le remplacement du bouton de la fibre d'un adénovirus Mastadenovirus par un bouton de la fibre d'un adénovirus phylogéniquement éloigné, de préférence d'un adénovirus de la famille des Atadenovirus, plus particulièrement de l'adénovirus bovin de serotype 4 (BAV4).
Les adénovirus sont très utilisés comme vecteurs de gènes. Ces virus possèdent en effet de nombreuses qualités comme une production facile à titre élevé, leur génome ne s'intègre pas dans le génome de la cellule hôte, on peut y introduire de grands inserts et ils peuvent infecter des cellules quiescentes et des cellules en division. Ces avantages font de ces virus des candidats intéressants dans le cadre du transfert de gène pour la thérapie génique ou pour des études expérimentales (transfert de gènes chez l'animal, production de cellules recombinantes, analyse d'expression de gènes, etc.).
II existe de multiples sérotypes d' adénovirus, infectant les humains ou les animaux. Les adénovirus actuellement utilisés sont majoritairement du sous-groupe C et du serotype 2 et 5. On peut citer également des adénovirus canins, simiens ou bovins, ainsi que des adénovirus humains de sérotypes 7 ou 12, par exemple.
Les limitations les plus sérieuses pour l'utilisation des vecteurs adénoviraux sont leur immunogénicité, la distribution sub-optimale des particules adénovirales in vivo, le manque de spécificité des vecteurs pour les tissus malades, et une faible infectivité pour un certain nombre de cellules cibles.
Par exemple, une limitation des vecteurs adénoviraux réside cependant dans le fait qu'ils infectent peu les cellules hématologiques. Or, dans le cadre d'un protocole de thérapie génique contre une pathologie impliquant des lymphocytes B, par exemple les pathologies tumorales comme les leucémies et les lymphomes, il est nécessaire de permettre leur infection de manière efficace. Ceci aussi bien dans le cas d'un protocole de thérapie génique in-vivo ou ex-vivo, d'immunothérapie ou d'une stratégie gène suicide. En outre, dans une approche de thérapie génique, il est important d'infecter les cellules cibles le plus efficacement tout en limitant la dissémination du virus dans les autres cellules (non-cibles). De plus, un tel vecteur de gène peut être utilisé dans des approches expérimentales, par exemple pour transfecter efficacement des lymphocytes
B dans l'optique de tester l'action de divers gènes ou promoteurs.
Des vecteurs présentant la capacité d'infecter préférentiellement les cellules cibles permettraient de réduire significativement les doses de vecteurs thérapeutiques, ce qui réduirait leur toxicité et augmenterait leur efficacité.
La partie du virus qui est responsable de la reconnaissance du récepteur naturel, le hCAR (human Coxsackie- Adénovirus Receptor)(Bergelson et al, 1997), est une protéine de la capside, la fibre, et plus précisément, sa partie C-terminale appelée "le bouton" (Louis et al., 1994). Cette partie de la fibre est aussi responsable de l'amorçage de la trimérisation de la protéine (Hong and Engler 1996). Cette conformation est indispensable pour son interaction avec la base du penton et son incorporation à la capside. Pour modifier le tropisme de l'adénovirus, plusieurs stratégies ont été développées dans l'art antérieur. La première consiste en l'utilisation de composés bi- spécifiques. Ils sont formés d'une partie reconnaissant un domaine d'une protéine de la capside de l'adénovirus (la fibre, la base du penton ou l'hexon) et d'une partie qui peut interagir avec un récepteur cible. De cette manière des cellules ont été infectées via le récepteur à l'EGF (Epidermal Growth Factor) (Watkins et al., 1997) ou via le récepteur au FGF (Fibroblast Growth Factor) (Goldman et al., 1997). De nombreux autres composants membranaires ont ainsi été ciblés (Haisma et al., 1999; Kelly et al., 2000; Schneider et al., 2000; Yoon et al., 2000). Cette technique est efficace mais il est difficile de l'envisager dans un protocole de thérapie génique. En effet on se heurte à deux problèmes majeurs qui sont (i) la stabilité du composé bispécifique et (ii) l'utilisation d'un système à deux composants qui ne peuvent être produits que séparément, ce qui rend difficile la notion de reproductibilité indispensable pour les protocoles d'essais thérapeutiques.
La seconde stratégie utilisée pour modifier le tropisme des adénovirus est de greffer sur la fibre, de manière génétique, un peptide permettant la reconnaissance d'un récepteur cellulaire. L'ajout de cette séquence peptidique ne doit pas gêner la trimérisation afin d'obtenir un assemblage correct du virus. De nombreux travaux ont été effectués dans ce sens, avec notamment l'utilisation d'une séquence poly-lysine (K7) ou d'une séquence RGD à l'extrémité C-terminale de la fibre (Wickham et ai, 1997). Ces modifications permettent un assemblage correct du virus et une infection des cellules via l'interaction poly-lysine/héparanes sulfates ou RGD/intégrines de type αvβ3-5. D'autres travaux ont été effectués avec l'insertion de séquence RGD dans la boucle HI, qui est présentée à la surface du bouton. De tels virus peuvent ainsi infecter un grand nombre de types cellulaires dans lesquels il entre naturellement avec une faible efficacité (Biermann et al., 2001; Cripe et al, 2001; Grill et al., 2001; Kasono et al., 1999; Nakamura et al., 2002; Vanderkwaak et al., 1999, WO96/26281 ; WO94/10323 ; O95/05201 ; WO95/26412). Ces travaux montrent donc que l'ajout de peptides dans le bouton de la fibre ne gêne pas la conformation de celle-ci et permet de diriger l'infection vers un récepteur prédéterminé. Les modifications génétiques de la fibre décrites à ce jour permettent l'infection de types cellulaires qui ne sont pas des cibles naturelles. Cependant, le fait que les peptides utilisés (poly-lysine et RGD) reconnaissent des récepteurs qui sont fortement exprimés dans de nombreux types cellulaires ne fait qu'accroître le tropisme des adénovirus. En outre, aucun adénovirus ayant un tropisme préférentiel pour les lymphocytes B n'a été décrit dans l'art antérieur.
La troisième approche repose sur l'utilisation d'un domaine de trimérisation, celui-ci peut être hétérologue ou provenir de la fibre d'un adénovirus ne reconnaissant pas le récepteur hCAR. Parmi les domaines hétérologues, citons la fibritine du bactériophage T4 (Krasnykh et ah, 2001), un domaine de trimérisation de la glycoprotéine d'enveloppe du MoMuLV (vanBeusechem et ah, 2000), un peptide de 36 acides aminés dérivé du domaine NRP (Neck Région Peptide) de la protéine surfactant D des poumons (Magnusson et al., 2001). La première utilisation de l'extrémité C- terminale d'une fibre d'un adénovirus ne reconnaissant pas le hCAR a été réalisée avec celle de l'adénovirus 3 du sous-groupe B (Krasnykh et al., 1996). Ce virus hybride a les mêmes propriétés de reconnaissance des cellules que l'adénovirus 3 avec un tropisme plus large encore que celui des adénovirus du sous-groupe C.
La présente invention décrit la possibilité de modifier le tropisme naturel d'un adénovirus pour permettre une bonne infection de cellules peu ou pas infectées par l'adénovirus naturel, de préférence des lymphocytes B ou des cellules d'ovaire, sans augmenter le spectre naturel de cellules hôtes de ce virus, de préférence avec une diminution du spectre naturel des cellules hôtes de ce virus. Le spectre naturel de l'adénovirus natif est déjà très important car le récepteur naturel des adénovirus est présent à la surface d'un grand nombre de type cellulaire.
La présente demande décrit maintenant la construction et la production de vecteurs adénoviraux capables d'infecter les lymphocytes B, via un peptide bien défini reconnaissant un récepteur B spécifique. La présente demande décrit également des vecteurs adénoviraux recombinants présentant un tropisme modifié et restreint pour les lymphocytes B. Les lymphocytes B n'étant pas des cibles naturelles des adénovirus, la présente invention montre qu'il est possible de développer un outil de ciblage de ces cellules.
Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans un adénovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte une fibre modifiée dont la séquence comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21.
La présente demande décrit en outre la construction et la production de vecteurs adénoviraux capables d'infecter spécifiquement des cellules d'ovaire. La présente demande décrit également des vecteurs adénoviraux recombinants présentant un tropisme modifié et restreint pour les cellules d'ovaire. La présente invention montre qu'il est possible de développer un outil de ciblage spécifique de ces cellules. L'adénovirus selon la présente invention infecte faiblement les cellules épithéliales humaines, qui sont les cellules cibles des adénovirus du sous-groupe C. Par contre, ce virus hybride infecte plus efficacement des cellules tumorales provenant de cancer des ovaires, comme la lignée SKOV3.
Un deuxième objet de l'invention réside plus particulièrement dans un adénovirus Mastadenovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte une fibre modifiée dont le bouton de la fibre a été remplacé par le bouton de la fibre d'un adénovirus de la famille des Atadenovirus, de préférence de l'adénovirus bovin 4 (BAV4) ou du virus responsable chez le poulet de « l'Egg Drop Syndrome » (EDS), plus particulièrement de l'adénovirus bovin 4 (BAV4).
Le fait de disposer d'un virus infectant préférentiellement un type cellulaire particulier réduit de manière considérable le risque de dissémination in vivo. De plus, la dose de virus à utiliser devient moins importante, ce qui limite le risque d'avoir une forte réponse immunitaire et est bénéfique dans une approche de thérapie génique in vivo. Un autre aspect de l'invention réside dans un procédé de préparation ou de production d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant, ainsi que dans les outils et constructions utilisables à cet effet (vecteurs, gènes chimériques, cellules, etc.).
Un autre aspect de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant, et dans son utilisation pour le transfert de gènes dans des lymphocytes B ou des cellules d'ovaire, notamment pour le traitement de pathologies associées à un dysfonctionnement de ces cellules ou affectant ces cellules.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant pour la préparation d'une composition destinée au transfert de gènes dans des lymphocytes B ou des cellules d'ovaire in vivo, ex vivo ou in vitro.
Un autre aspect de l'invention concerne une protéine de la fibre d'adénovirus modifiée comme défini ci-avant, tout acide nucléique codant une telle protéine, ainsi que leurs utilisations.
L'invention se rapporte donc, de manière générale, à des adénovirus recombinants ayant un tropisme modifié, plus particulièrement ayant un tropisme pour des lymphocytes B ou des cellules d'ovaire.
Le terme adénovirus recombinant désigne, au sens de l'invention, une particule virale modifiée comprenant un génome viral contenu dans une capside.
Les génomes adénoviraux sont des ADN linéaires doubles brins d'environ 36kb. us comportent deux régions terminales, les ITR (Inverted Terminal Repeat) qui sont les origines de réplication du génome viral et une séquence d'encapsidation (Ψ). De plus, plusieurs régions (El à E4) dites précoces codent des éléments nécessaires à la transcription et la réplication du génome viral, et des régions dites tardives (Ll à L5) codent les protéines structurales du virus. Les génomes adénoviraux recombinants construits pour la thérapie génique sont délétés de (ou défectifs pour) El a et/ou Elb de la région El, les produits de ces gènes étant indispensables pour la production virale. Cette délétion (ou ce caractère défectif) prévient une éventuelle dissémination du vecteur dans l'organisme. La séquence d'intérêt est généralement introduite à la place de cette région.
Compte tenu de la forte immunogénicité de l'adénovirus et pour prévenir le risque d'émergence de formes RCA (Réplication Compétent Adénovirus), d'autres génomes viraux délétés d'autres gènes ont été décrits. Ainsi, des adénovirus recombinants défectifs pour les régions suivantes : El A ; El A et E1B ; El et E3 ; El et E4 (notamment ORF3 ou ORF6) ; El et E2 ; El et E2 et E3 ; El et E2 et E4 ; El et E3 et E4 ont été construits. Dans la même optique, des génomes recombinants dépourvus de tous les gènes viraux et ne comprenant que les ITR, la séquence d'encapsidation et la séquence d'ADN d'intérêt ont aussi été décrits. Dans une variante particulière, les adénovirus recombinants de l'invention comportent un génome adénoviral recombinant comprenant deux régions terminales ITR, une séquence d'encapsidation (ψ) et une séquence d'ADN d'intérêt, dont le transfert ou l'expression dans un hôte déteraiiné est souhaité. De préférence, ils comportent un génome adénoviral défectif pour la région El au moins.
Adénovirus présentant un tropisme pour les lymphocytes B
Une caractéristique essentielle des adénovirus recombinants de l'invention réside dans la présence d'une fibre modifiée, qui confère à ces virus un tropisme particulier, et notamment la capacité d'infecter les lymphocytes B. Dans ce contexte, l'invention décrit maintenant la construction du gène codant une fibre chimérique comportant un peptide reconnaissant spécifiquement le récepteur CD21.
Le récepteur CD21 est un marqueur de surface des lymphocytes B (Nemerow et al., 1989). La glycoprotéine CD21 (ou CR2) est le récepteur à l'EBV (Epstein Barr Virus), qui est aussi reconnue par le C3dg du complément. Afin de permettre une infection préférentielle des lymphocytes B, les inventeurs ont développé des adénovirus possédant, dans leur fibre, un peptide reconnaissant spécifiquement le récepteur CD21.
Le peptide choisi a été défini sur la base de la séquence de la partie de la glycoprotéine GP350/220 (protéine de l'enveloppe de l'EBV) responsable de la reconnaissance du CD21. En 1987, la glycoprotéine GP350/220 de l'enveloppe de l'EBV a été définie comme étant responsable de la reconnaissance du récepteur CD21 (Nemerow et al., 1987; Tanner et ah, 1987). De plus, la comparaison de la séquence peptidique de cette protéine à celle du C3dg du complément a révélé deux régions de forte homologie : EDPGFFNVE pour la GP350/220 et EDPGKQLYNVE pour le C3dg, cette dernière étant responsable de la reconnaissance du C3dg au CD21 (Lambris et al., 1985).
C'est ainsi que la région EDPGFFNVE a été définie comme étant responsable de la reconnaissance EBV/CD21. De plus, des expériences ont démontré que cette séquence peptidique était capable d'inhiber l'infection des lymphocytes B par ce virus (Nemerow et al, 1989).
Différents peptides et différents emplacements dans la fibre ont été sélectionnés afin d'avoir une conformation optimale de la séquence d'intérêt à la surface de la fibre, et de permettre une bonne interaction avec le récepteur.
Plus particulièrement, la fibre modifiée selon l'invention comporte un peptide ligand d'un récepteur CD21 comprenant la séquence EDPGFFNVE (SEQ ID No 3) ou une partie fonctionnelle de celle-ci. D'autre peptides de ciblage sont les peptides de séquences GEDPGFFNVE (SEQ ID No 4), GEDPGFFNVEIP (SEQ ID No 5), GEDPGFFNVEIPEFP (SEQ ID No 6) et EDPGFFNVEIPEFPF (SEQ ID No 7), qui ont été utilisés afin d'avoir une conformation optimale pour la reconnaissance du CD21. Les peptides de ciblage selon l'invention incluent tout peptide comprenant entre 7 et 20 acides aminés, de préférence entre 10 et 18, encore plus préférentiellement entre 11 et 17, d'origine synthétique, naturelle ou mixte, capable de lier le récepteur CD21 à la surface d'un lymphocyte B, de préférence de manière sélective. Le terme « de manière sélective » indique que la liaison au récepteur CD21 est plus affine que la liaison à d'autres marqueurs cellulaires, même si une telle liaison non-spécifique ne peut être totalement exclue. Le terme « partie fonctionnelle » désigne tout fragment d'une séquence définie ci-dessus, ou tout dérivé d'une telle séquence, conservant la faculté d'interagir de manière sélective avec un récepteur CD21.
Le peptide de ciblage peut être introduit en différentes positions dans la fibre de l'adénovirus, soit en remplacement de séquences existantes, soit en supplément. De manière préférentielle, la séquence codant le peptide de ciblage est introduite à l'extrémité 3' du gène de la fibre (et le peptide de ciblage se trouve donc à l'extrémité C-terminale de la protéine de la fibre) ou dans la séquence de la boucle HI (la boucle HI étant comprise entre le 535eme et le 547eme résidu dans la séquence de la fibre de l'adénovirus de serotype 5).
Par ailleurs, le peptide de ciblage peut être lié directement à la protéine de la fibre, ou par l'intermédiaire d'une séquence d'espacement. Une telle séquence est utilisée essentiellement lorsque le peptide de ciblage est introduit à l'extrémité C- terminale de la fibre. La séquence d'espacement n'affecte pas la fonctionnalité du peptide de ciblage et permet une meilleure flexibilité de celui-ci. A titre d'exemple, on peut citer notamment une séquence (SG)i, dans laquelle i est un entier compris entre 1 et 7, etc. Une séquence d'espacement préférée est la séquence (Ser-Gly)s-Ser.
Des constructions spécifiques selon l'invention sont des fibres modifiées à l'extrémité C-terminale par ajout d'un peptide de ciblage via une séquence d'espacement. La séquence de l'extrémité C-terminale de la fibre est par exemple la suivante :
— AQE-(SG)5-S-peptide de ciblage.
Dans un mode de réalisation particulier, la fibre comporte en outre une (ou plusieurs) altération supplémentaire réduisant ou bloquant son interaction avec le récepteur hCAR, de préférence dans le bouton de la fibre. De telles altérations peuvent comprendre par exemple des mutations dans la boucle DG du bouton de la fibre, ce qui n'altère pas la trimérisation mais réduit de manière significative l'interaction du virus avec son récepteur hCAR (Kirby et al, 1999). Alternativement, le bouton de la fibre de l'adénovirus peut être remplacé par le domaine qui permet la trimérisation de la fibritine du bactériophage T4 (Krasnykh et al, 2001). Une autre altération possible consiste à remplacer le bouton de la fibre des sérotypes 2 et 5 (HAdV2, HAdV5) par le bouton de la fibre d'un adénovirus non Mastadenovirus.
Une telle altération permet de restreindre le tropisme de l'adénovirus recombinant, et donc d'augmenter sa spécificité pour les lymphocytes B. Une telle spécificité est bien entendu particulièrement avantageuse pour une utilisation en thérapie génique car elle permet de réduire les doses à administrer. Ceci constitue un avantage important car l'adénovirus est très immunogène et peut induire une forte réaction immunitaire non désirable.
Un tel échange a été effectué en utilisant le bouton de l'adénovirus BAV4 (Bovin Adeno Virus 4). Les virus ont été construits, amplifiés et purifiés et des premiers tests ont permis d'observer que l'adénovirus ainsi modifié infecte de manière réduite les cellules épithéliales humaines (d'un facteur 10-50).
A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans une protéine de fibre d' adénovirus comprenant un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21. Dans un mode préféré, la fibre comporte en outre une modification réduisant l'interaction avec le récepteur hCAR.
Adénovirus présentant un tropisme pour les cellules d'ovaire
Une caractéristique essentielle alternative des adénovirus recombinants de l'invention réside dans la présence d'une fibre modifiée, qui confère à ces virus un tropisme particulier, et notamment la capacité d'infecter spécifiquement les cellules d'ovaire, plus particulièrement les cellules tumorales provenant de cancers des ovaires.
En particulier, les adénovirus Mastadenovirus recombinants se caractérisent par la présence d'une fibre chimérique qui confère à ces virus une abolition de l'interaction avec le récepteur hCAR. Dans ce contexte, l'invention décrit maintenant la construction du gène codant une fibre chimérique comportant un bouton de la fibre substituée par un bouton de la fibre d'un adénovirus présentant une faible homologie de séquence avec celles des adénovirus du sous-groupe C, plus particulièrement avec celle du bouton de la fibre des adénovirus 2 et 5. De préférence, le virus utilisé pour la substitution du bouton de la fibre présente en outre une faible ou une absence d'infectivité des cellules humaines. L'adénovirus, dont le bouton de la fibre est introduit dans le virus recombinant, appartient par exemple aux familles Aviadenovirus, Atadenovirus ou Siadenovirus. De préférence, le bouton de fibre d'un adénovirus Atadenovirus est utilisé. Parmi les adénovirus Atadenovirus, l'adénovirus bovin 4 (BAV4) ou l'adénovirus EDS constitue un mode de réalisation préféré. L'utilisation du bouton de la fibre de BAV4 dans l'adénovirus 2 permet d'obtenir un tropisme spécifique pour les cellules d'ovaire.
La jonction entre les deux fibres pour former une fibre chimérique peut être réalisée en différentes positions dans le gène de la fibre de l'adénovirus 2. Les jonctions les plus faciles à réaliser sont dans les tiges des fibres. Celles-ci sont constituées d'un nombre variable de motifs structuraux répétés. C'est le nombre de motifs répétés qui détermine la longueur de la fibre, ainsi il y a 21 motifs pour la fibre de l'adénovirus 2, 20 motifs pour BAV4 mais seulement 5 pour l'adénovirus 3. Ces jonctions différentes peuvent faire varier la longueur de la fibre chimérique. Cette longueur peut influencer l'efficacité du ciblage du vecteur adénoviral. Dans un mode de réalisation, la jonction a été effectuée dans la tige des deux fibres, entre les motifs répétés 7 et 8 pour la fibre de l'adénovirus 2 et entre les motifs 7 et 8 pour celle de BAV4. Dans un mode de réalisation particulier, la fibre chimérique présente la séquence SEQ ID No 2 et peut être codée par le polynucléotide de séquence SEQ ID No 1.
Un objet de l'invention réside dans un acide nucléique codant une protéine de fibre telle que définie ci-dessus. Il peut s'agir d'un ADN ou d'un ARN, de préférence d'un ADN. Un autre objet de l'invention réside dans un vecteur comprenant un tel acide nucléique, ce vecteur pouvant être un plasmide, virus, phage, cosmide, etc. Les fibres modifiées peuvent être construites par génie génétique, selon des techniques connues de l'homme de l'art, comme par exemple par synthèse artificielle, clonage, ligation, clivage enzymatique, amplification, mutagénèse dirigée, jonction d'oligonucléotides, etc.
Dans un mode de réalisation particulier, l'adénovirus selon l'invention est produit à partir d'un adénovirus de serotype 2 ou 5.
L'adénovirus recombinant comprenant la fibre modifiée peut être produit par différentes méthodes. Ainsi, le gène codant la fibre modifiée peut être introduit dans le génome adénoviral, ou introduit, sous forme intégrée ou extra-chromosomique, dans le génome de la cellule productrice des virus.
Dans ce contexte, un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant, comprenant (i) la construction d'un gène codant la fibre modifiée, en particulier codant la fibre dont la séquence comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21 ou codant la fibre dont la séquence comprend le bouton de la fibre d'un autre adénovirus selon la présente invention, (ii) l'introduction de ce gène dans un génome adénoviral, (iii) l'introduction du génome adénoviral dans une cellule d'encapsidation, (iv) l'amplification des virus et (v) la purification des virus produits.
La cellule d'encapsidation utilisée peut être toute cellule permissive comportant ou exprimant les protéines adénovirales défectives du génome recombinant. Dans le cas d'un vecteur adénoviral défectif pour la région El, on utilise toute cellule exprimant la région El d'un adénovirus, comme les cellules HEK 293, PER.C6, etc. Il est également possible d'utiliser des cellules co-transfectées avec un plasmide ou un virus helper apportant les fonctions nécessaires.
Dans le contexte de l'invention, la cellule d'encapsidation permettant de préparer les adénovirus recombinant présentant une substitution du bouton de la fibre doit aussi exprimer une fibre sauvage pour complémenter la fibre chimérique défective pour son interaction avec le récepteur hCAR. Pour obtenir une expression élevée de la fibre, le gène de la fibre de l'adénovirus 2 a été inséré dans un plasmide dérivé du pCDNA3 (Invitrogen), la séquence des exons 2 et 3 du TPL (Tri Partite Leader) de l'adénovirus 2 a été inséré entre le promoteur CMV et le gène de la fibre (Figure 7). La séquence au voisinage du codon d'initiation de la traduction a été modifiée par PCR, avec des oligonucléotides spécifiques, pour obtenir le consensus défini par KOZAC ((Kozak 1997); consensus favorisant le démarrage de la traduction.
Un autre objet de l'invention concerne une particule virale comprenant une fibre d'adénovirus telle que définie ci-dessus.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour le transfert d'un acide nucléique dans un lymphocyte B in vitro, ex vivo ou in vivo, comprenant la mise en contact d'un organisme, tissu, échantillon biologique ou cellules comprenant des lymphocytes B avec un adénovirus recombinant, ledit adénovirus recombinant comprenant ledit acide nucléique et comportant une fibre modifiée comprenant un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour le transfert d'un acide nucléique dans les cellules d'ovaires in vitro ou in vivo, comprenant la mise en contact d'un organisme, tissu, échantillon biologique ou cellules comprenant des cellules d'ovaire avec un adénovirus Mastadenovirus recombinant, ledit adénovirus recombinant comprenant ledit acide nucléique et comprenant une fibre chimérique présentant une substitution du bouton de la fibre selon la présente invention.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant et un véhicule acceptable sur le plan pharmacologique. Le véhicule ou excipient peut être toute solution, suspension, gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique, comme notamment une solution isotonique, tamponnée, saline, etc. L'invention peut être utilisée pour le transfert et l'expression d'acides nucléiques d'intérêt dans les lymphocytes B ou les cellules d'ovaire, dans des approches expérimentales ou thérapeutiques. L'acide nucléique peut être un gène suicide, c'est-à- dire tout acide nucléique codant une protéine toxique pour la cellule, soit de manière directe, soit de manière conditionnelle (e.g., TK, cytosine désaminase, etc.), un acide nucléique codant un facteur anti-tumoral, une cytokine, un antisens, un antigène, un marqueur, etc. (comme par exemple l'H2, 1112, l'ARN antisens anti bcr/abl). L'invention est utilisable dans le domaine thérapeutique, pour le traitement préventif ou curatif de pathologies impliquant ou affectant des lymphocytes B ou les cellules d'ovaire, comme des pathologies tumorales (leucémies, lymphomes, cancer des ovaires, etc.), des maladies immunitaires, inflammatoires, etc.
Dans un mode de réalisation particulier relatif aux adénovirus recombinants ayant perdu la capacité de reconnaissance du récepteur hCAR, la région El peut également être insérée dans le vecteur dans le but d'obtenir un adénovirus compétent pour la réplication mais avec une dépendance cellulaire pour celle-ci. Cet effet peut être obtenu en plaçant la région El A sous le contrôle d'un promoteur spécifique des cellules tumorales de cancer des ovaires par exemple, et/ou en utilisant des mutants dans l'une ou l'autre des protéines codées par la région E1B. Un tel virus compétent pour la réplication pourrait lyser spécifiquement les cellules tumorales, et ne pas diffuser dans les autres tissus du fait de la perte de reconnaissance du récepteur hCAR.
D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme ilmstratifs et non limitatifs.
Légende des Figures
Figure 1 : Principe de la dernière étape de construction des génomes viraux ayant un gène de fibre modifiée par recombinaison homologue chez E. coli (d'après Renaut, L et al, 2002). Figure 2 : Vecteur navette permettant l'insertion des fibres modifiées par clonage moléculaire entre les sites Mlul et Sali et la recombinaison homologue avec le vecteur pRECad.
Figure 3 : Schéma du pRECad, sa digestion par Swαl libère le génome viral.
Figure 4 : Tropisme des vecteurs adénoviraux. Le vecteur génétiquement modifié possède une fibre avec le peptide de ciblage du CD21 dans la boucle HI. Figure 4 A : étude de la fixation du vecteur marqué au FAM. Figure 4B : Expression du gène rapporteur lacZ. A549, cellules épithéliales contrôles ; Daudi et Raji, lignées cellulaires de Lymphocytes B ; HSB2, lymphocytes T ; Ad-CD21HI, vecteur adénoviral avec une fibre modifiée par insertion génétique du peptide EDPGFFNVEIPEFPF dans la boucle HI de la fibre. Les valeurs indiquent le gain (>1) ou la réduction (<1) de tropisme du vecteur modifié par rapport au vecteur possédant une fibre sauvage.
Figure 5 : Comparaison des protéines de fibre de HAdV-2 et BadV-4. Dans le domaine de la queue, la séquence de HAdV-2 impliquée dans une interaction avec la base du penton est indiquée en gras ; seule une partie de cette séquence (PVYP) a été conservée dans BadV-4. Les répétitions du domaine de la tige sont numérotées et semblent bien conservées dans la fibre BadV-4. Les résidus P et GXG responsables du coude sont en italique. La flèche indique la position dans la tige utilisée pour préparer la protéine de la fibre chimérique. Les codon K et L (AAR CTN) peuvent correspondre à un site de restriction HindUl.
Figure 6 : Construction d'un génome adénoviral avec un gène de fibre chimérique. Le plasmide ρ5Shut/HadV2/BadV4 contenant le gène de la fibre chimérique entre les nucléotides 31041 et 32788 a été préparé. PRECad a été linéarisé avec Pacï et p5Shut/ΗadV2/BadV4 avec Notl et Kpnl. Les fragments ont été co-introduits dans une souche E. coli ToplOF' électrocompétente. Les positions de la délétion dans la région E3, du gène de la fibre et des sites de restriction sont indiquées en référence aux séquence de HAdV5. Le site Sali qui a été inséré dans le gène de la fibre, en amont du signal de polyadénylation, est indiqué en italique. Figure 7 : Schéma de construction du vecteur ρC3-TPL23-fb permettant la synthèse de la fibre dans les cellules d'encapsidation. Le gène de la fibre est sous le contrôle du promoteur précoce du CMV. Les exons 2 et 3 du TPL de l'adénovirus 2 ont été insérés entre le promoteur et le gène de la fibre. Le gène de résistance à la néomycine est sous le contrôle du promoteur S V40, ce gène permet la sélection des cellules ayant intégré ce vecteur.
Figure 8 : Schéma du pRECad2/BAV4, sa digestion par Swαl libère le génome viral.
Figure 9 : Synthèse in vitro des protéines de fibre. Les protéines de fibre ont été synthétisées in vitro et isolées par SDS-PAGE. La modification dans la séquence voisine du codon d'initiation (Lignes 3 et 5) et la présence des exons TPL sont indiquées. Un ADNc complet de la fibre a été utilisé comme contrôle en ligne 6. Les flèches indiquent la protéine de fibre synthétisée en absence de TPL et sans la modification ATG.
Figure 10 : Analyse de la trimérisation des protéines de fibre. Figure 10A : les protéines de fibre ont été synthétisées in vitro et analysées sur gel non dénaturant 12.5 % en PAGE. Les flèches indiquent les formes monomériques (62 kDa) et trimériques (186 kDa) des protéines de fibre de HAdV-2. Figure 10B : Analyse in vivo. Des cellules COS ont été transfectées avec pC3fbAd2 et pC3fbAd2/BadV4. Les protéines des cellules transformées ont été préparées 24 h après la transfection et séparées par SDS-PAGE après (D) ou avant (N) dénaturation. Les protéines de fibre ont été révélées par immunodétection avec un anticorps monoclonal.
Figure 11 : Analyse par immunodétection des particules virales produites dans les cellules HEK-293. Les vecteurs Ad ont été produits dans les cellules HEK-293 et purifiés. Les protéines virales ont été séparées par SDS-PAGE et les protéines ont été transférées sur une membrane. Les protéines de fibre ont été révélées avec un anticorps monoclonal dirigé contre la partie N-terminal de la fibre. Ligne 1, virus contrôle HAdV5 ; Ligne 2, pas de virus ; Ligne 3, HAdV5-βgal ; Ligne 4, HAdV2/BadV4. Figure 12 : Etude du tropisme cellulaire des vecteurs adénoviraux modifiés. Figure 12A : Des cellules HeLa ont été infectées avec une quantité croissante de particules virales, 0, 0.5, 1, 2, 4 et 8 103 PP par cellule de l'avant vers l'arrière, respectivement. 24 h après l'infection, l'activité β-galactosidase a été déterminée par FACS (cytométrie en flux). Figure 12B : le pourcentage de cellules HeLa positives, déterminé en Fig 12A, a été exprimé en fonction de la quantité de virus initiale. Figure 12C : Des cellules HepG2 ont été infectées et analysées dans des conditions similaires à la Fig 12 A. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules positives. Figure 12E : Des lignées cellulaires Daudi (lymphocytes B) et Jurkat (lymphocytes T) ont été infectées avec 2 10 PP par cellule de virus HAdV2 et HAdV2/BadV4 comme indiqué en Fig 12A. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules positives. Fig 12C à E : Barre ouverte = vecteur avec fibre HAdV2 ; Barre pleine = vecteur avec fibre HAdV2/BadV4. Les résultats sont des moyennes d'au moins 3 expériences indépendantes réalisées en triplicate, excepté pour la fig 12A qui est expérimentalement significative.
Figure 13 : Infection de cellules CHO indépendante de hCAR par un vecteur Ad hybride présentant une fibre chimérique HAdV2/BadV4. Des cellules CHO exprimant ou non le récepteur hCAR ont été infectées avec 1 103 (blanc) ou 3 103 (noir) PP par cellule de vecteur parental ou hybride. 24 h après l'infection, l'activité du rapporteur β- galactosidase a été déterminée par FACS et est indiquée en tant que pourcentage de cellules positives.
Figure 14 : Etude du tropisme cellulaire des vecteurs Ad modifiés sur la lignée cellulaire SKOV3. Les cellules ont été infectées avec des quantités croissantes de particules virales, 0, 0.5, 1, 2, 4 et 8 103 PP par cellule. 24 h après l'infection, l'activité du rapporteur β-galactosidase a été déterminée par FACS. Le pourcentage de cellules positives SKOV3 a été exprimé en fonction de la quantité de virus initiale. Exemple 1. Construction de fibres chimériques comprenant un peptide de ciblage des lymphocytes B.
1. Sélection de peptides de ciblage Les peptides de ciblages choisis comprennent la séquence GEDPGFFNVE (SEQ
ID No 4) ou une partie fonctionnelle de celle-ci. Afin de vérifier que le peptide produit est capable de se fixer puis d'être internalisé dans les lymphocytes B, son internalisation dans différents types cellulaires a été testée, après marquage fluorescent des peptides par microscopie confocale. Les résultats obtenus démontrent que le peptide est capable de se fixer et d'être internalisé dans les lymphocytes B.
2. Construction des gènes codant les fibres chimériques
Afin d'effectuer les modifications de la fibre, le gène codant la fibre de l'adénovirus 2 (HAdV2) a été clone dans le pBluescript-ïï-SK (Stratagene) entre les sites de restriction Notl et Sαfl. Une PCR a été effectuée sur le génome de l'HAdV2 avec les amorces 5'-AggAAAAAAgCggCCgCATgAAACgCgCCAgAC-3' (SEQ ID Νo 8) en 5' et 5'-AggAAAAAAggTCgACTTATATCgATTCCTgggCAATgTAg-3' (SEQ ID Νo 9) en 3'. La deuxième amorce contient un site Clal immédiatement avant le codon Stop.
Les oligonucléotides 5'-CgggTTCAggATCCggAgAggATCCCgggTTTTTCAACgTTg AATgTTAACg-3' (SEQ ID Νo 10) et 5'-TcgACGTTAACATTCAACGTTGA AAAACCCGGGATCCTCTCCGGATCCTGAACC-3* (SEQ ID Νo 11) codant le peptide EBV court ont été introduits à l'extrémité 3' du gène de la fibre entre les sites Clal et Sali. Une séquence d'espacement a également été introduite entre la séquence codant la fibre et celle codant le peptide EBV. Cette séquence permet de ne pas avoir d'encombrement et ainsi de garder une conformation optimale de la fibre et du peptide. L'extrémité C-terminale de la fibre a pour séquence : AQE(SG)6EDPGFFΝVEC (SEQ ID No 12).
En ce qui concerne le peptide long, les amorces 5'- AggAAAAAACgTCgACgTTAgAACgggAATTCgggAATTTCAACgTTgAAAAACC Cggg-3' (SEQ ID No 13) et 5'-CCCCCTggggTACTCTCTTTACgCgTATCCgA ACCTCTAgTTACC-3' (SEQ ID No 14) ont été utilisées. La première s'hybride avec l'extrémité 3' du gène de la fibre avec le peptide court et permet de rallonger ce dernier et la deuxième s'hybride au niveau du site M situé à 147 pb de l'extrémité 5'du gène de la fibre. Ce fragment de PCR a été clone à la place du fragment MluVSatt. de la fibre sauvage clonée dans le pBs-sK. L'extrémité C-terminale de la fibre résultante a pour séquence : AQE(SG)6EDPGFFNVEIPEFP (SEQ ID No 15).
En ce qui concerne l'insertion des peptides au niveau de la boucle HI, des oligonucléotides ont été insérés dans un site S^el situé à 1615 pb de l'extrémité 5' du gène de la fibre clone dans le pBluescript-fl-SK. Pour le peptide court, les oligonucléotides 5'-CTAgCggCgAAgATCCCgggTTTTTCAACgTTgAAATTC-3 '
(SEQ ID No 16) et 5'CTAggAATTTCAACgTTgAAAAACCCgggATCTTCgCCg-3' (SEQ ID No 17) ont été utilisés et pour le peptide long, les oligonucléotides 5'- CTAgCggCgAAgATCCCgggTTTTTCAACgTTgAAATTCCCgAATTCC-3' (SEQ ID No 18) et 5'-CTAgggAATTCgggAATTTCAACgTTgAAAAACCCgggAT CTTCgCCg-3' (SEQ ID No 19) ont été utilisés.
3. Expression des Fibres chimériques et fonctionnalité Les gènes codant les fibres modifiées ont été transférés dans un plasmide qui contient en 5' du gène d'intérêt l'élément du bactériophage T7 permettant une transcription in vitro. Ainsi, afin de démontrer que les fibres modifiées sont capables de se trimériser, des synthèses in vitro ont été effectuées avec le kit de transcription/traduction in vitro de Promega et leurs produits séparés sur gel de polyacrylamide non dénaturant.
Exemple 2. Construction et Production d'adénovirus recombinant comportant une fibre chimérique comprenant un peptide de ciblage des lymphocytes B. et fonctionnalité
Les gènes codant les fibres modifiées ont ensuite été clones dans un vecteur navette pour permettre leur introduction dans un génome viral préalablement construit (Renaut et al, 2002), à la place du gène codant la fibre sauvage. Cette étape a été effectuée par recombinaison homologue chez E. coli (Chartier et al, 1996). Le vecteur navette utilisé contient 5502 pb de l'extrémité droite du génome de PHAdV5 qui ont été amplifiées avec les amorces 5'-TTgTATAAAAAgC^CggCC^CAACTACCTTGCCTACCACTC- 3' (SEQ ID No 20) qui s'hybride à 25690 pb dans le génome viral et l'amorce 5'- TTgTATAAAAAgCgrC^[CCCTCCCgTgTgTgACTCgCAg-3' (SEQ ID No 21) qui s'hybride à 34322 pb dans ce même génome. Ce fragment a été amplifié à partir du pBHGll (Graham et al, 1989) qui est un plasmide contenant tout le génome de l'HAdV5, dans la partie qui nous intéresse, un fragment de 3130 pb contenant la région E3 compris entre 27865 pb et 30995 pb avait été délété. Ce fragment a été clone entre les sites Notl et Xhό dans le pBS-SK, et un site Ml l, absent dans la fibre de l'HAdV5, a été ajouté avec les amorces complémentaires 5'- CCCCCTggggTACTCTCTTTACgCgTATCCgAACCTCTAgTTACC-S' (SEQ ID Νo 22) et 5'-ggTAACTAgAggTTCggATACgCgTAAAgAgAgTACCCCAggggg-3' (SEQ ID Νo 23). De même un site Sαfl a été inséré par mutagénèse à l'extrémité 3' du gène de la fibre, en amont du site d'addition du polyA de la région L5 à l'aide des amorces 5'- CTTACACTTTTTCATACATT^rCg4CgAATAAAgAATCgTTTgTgTTATg-3' (SEQ ID Νo 24) et 5'-CATAACACAAACgATTCTTTATTC^rCg<4CAATgTATgAAA AAgTgTAAg-3' (SEQ JJJ Νo 25).
A ce stade, les différents gènes codant les fibres modifiées ont été clones dans le vecteur navette à la place du gène codant la fibre sauvage par MlύllSaï. Après une étape de recombinaison homologue chez E. coli, nous avons obtenu les génomes recombinants portant les gènes codant les fibres modifiées (figurel).
Après digestion par Swαl, libérant ainsi des plasmides les génomes viraux, ceux-ci ont été introduits dans des cellules HEK293 (Graham et al, 1977) exprimant la fibre de l'adénovirus 2 par lipofection. Ces cellules permettent la production de virus recombinants car elles expriment El ce qui permet une transcomplémentation puisque ce gène est délété dans les génomes des virus précédemment obtenus.
Un adénovirus recombinant a ainsi été construit et produit. Les protéines apicales de la capside sont des fibres de l'HAdV2 avec, à leur extrémité C-terminale, le peptide de ciblage. Ce virus a été produit avec un titre équivalent à celui du virus portant la fibre sauvage (virus témoin), et, il infecte les cellules épithéliales avec la même efficacité que le virus témoin. Ces résultats démontrent que le fait d'avoir ajouté ce peptide ne gêne ni l'assemblage du virus, ni son trafic intracellulaire qui est important pour le transport de l'ADN viral et par conséquent du gène d'intérêt au noyau.
Une deuxième construction a été obtenue avec une séquence de ciblage du
CD21, dérivant de la GP350/220 de EBV et ayant pour séquence :
EDPGFFNVEIPEFPF qui a été insérée dans la boucle HI de la fibre de l'adénovirus 2 par l'intermédiaire de l'insertion d'un oligonucleotide dans un site unique de restriction
(Spe l).
Les études réalisées avec ces virus donnent de bons résultats en ce qui concerne la permissivité des lignées cellulaires exprimant le CD21, ceci tant au niveau de la fixation des virus sur les cellules que de l'expression du transgène (voir Figure 4). De plus, les inventeurs ont observé une diminution de la fixation des particules virales et de l'expression du transgène dans les lignées cellulaires exprimant le récepteur hCAR et n'exprimant pas le CD21. Le pourcentage de cellules positives est équivalent pour une lignée cellulaire de lymphocytes B (Daudi) à celui observé avec les cellules épithéliales contrôles, ce qui représente un gain de tropisme d'un facteur 30 environ.
Exemple 3. Construction et Production d'adénovirus recombinant comportant une fibre chimérique comprenant un bouton de la fibre de EPS ou BAV4, et fonctionnalité
1- Amplification des gènes des fibres des adénovirus EPS et BAV4. Afin d'effectuer les modifications des fibres, les gènes codant la fibre de l'adénovirus 2 (HAdV2), celles de EDS et de BAV4 ont été clonées dans le pBluescript- II-SK (Stratagene) entre les sites de restriction Notl et Sali. Une PCR a été effectuée sur le génome de l'HAdV2 avec les amorces 5'-
AggAAAAAAgCggCCgCATgAAACgCgCCAgAC-3' (SEQ ID Νo 8) en 5' et 5'- AggAAAAAAggTCgACTTATATCgATTCCTgggCAATgTAg-3' (SEQ ID Νo 9) en 3'. De même, une PCR a été effectuée sur le génome d'EDS avec les amorces 5'- AggAAAAAAggCggCCgCCATggCgAAgCgACTACggTTggACCCTgATCC-3' (SEQ ID No 26) en 5' et 5'-AggAAAAAAggTCgACTACTgTgCTCCAACATATgTAAAg-3' (SEQ ID No 27) en 3' et sur le plasmide ρVM404, contenant la région codant la fibre de BAV4, avec les amorces 5'-AggAAAAAAgCggCCgCATgAAAAgAgCACgTTg-3' (SEQ ID No 28) en 5' et 5'-AggAAAAAAggTCgACTTATATCgATTgCgTgCgAgTTATgC-3' (SEQ ID No 29) en 3' (La deuxième amorce contient un site Clal immédiatement avant le codon Stop). Le site Htwdlïï, présent dans le gène de la fibre de l'adénovirus 2 a été modifié, par mutagénèse dirigée, en utilisant les amorces complémentaires suivantes : 5'- gAgCgggTTTAAgTTTTgACAACTCAgg-3' (SEQ ID No 30) et 5'- CCTgAgTTgTCAAAACTTAAACCCgCTC-3' (SEQ ID No 31); cette mutation n'affecte pas la séquence de la fibre. De la même manière des sites H dlïï ont été introduits dans les gènes des fibres des adénovirus 2, EDS et BAV4, en utilisant les couples d'amorces complémentaires suivantes :
5'-gTCAgATggAAAgCTTgCCCTgCAAACATC-3' (SEQ ID No 32) et 5'-TTTgCAgggCAAgCTTTCCATCTgACACTg-3' (SEQ ID No 33); 5'-gTTAAAATTggCCgATggCAAgCTTggTgTAAATgTgggCCTTggg-3' (SEQ ID No 34) et
5'-CCCAAggCCCACATTTACACCAAgCTTgCCATCggCCAATTTTAAC-3' (SEQ ID No 35);
5'-CCCggAgggAAAgCTTTTTATACAACTATC-3' (SEQ ID No 36) et 5'-gTTgTATAAAAAgCTTTCCCTCCggggTgg-3' (SEQ ID No 37), respectivement.
2. Construction et expression des gènes des fibres chimériques et fonctionalité.
Les gènes des fibres chimériques ont été obtenus par le remplacement de l'extrémité 3' du gène de la fibre de l'adénovirus 2 par celle de EDS et BAV4 en utilisant les sites de restriction H dïïl et Sαfl.
Les gènes codant les fibres chimériques ont été transférés dans un plasmide qui contient en 5' du gène d'intérêt l'élément du bactériophage T7 permettant une transcription in vitro. Ainsi, afin de démontrer que les fibres chimériques sont capables de se trimériser, des synthèses in vitro ont été effectuées avec le kit de transcription/traduction in vitro de Promega et leurs produits séparés sur gel de polyacrylamide non dénaturant.
Contrairement à hAdV2, la protéine chimérique synthétisée in vitro migre seulement à la masse moléculaire prédite comme monomère (61 kDa, HAdV2/BAdV4) (Figure 10A). De manière surprenante, la protéine de fibre contrôle BadV4 a également été observée seulement comme monomère dans ce test in vitro (Figure 10, ligne 3) bien que la protéine de fibre de BadV4 dans la capside virale soit probablement sous forme de trimère. Pour évaluer l'homotrimérisation de la protéine de fibre chimérique HAdV2/BAdV4 dans les cellules de mammifères, une expression transitoire a été réalisée dans des cellules COS après transfection par pC3-TPL23-Fb- HAdV2/BAdV4. Les protéines de fibre ont été visualisées par immunodétection après électrophorèse dans des conditions non-dénaturantes. Les protéines de fibre sont apparues sous forme de trimère (Figure 10B) lorsqu'elles sont synthétisées in vivo, bien qu'une partie significative des protéines synthétisées soient sous forme monomérique. Ces résultats ont permis de construire et de produire des adénovirus recombinant avec une protéine de fibre chimérique HAdV2/BAdV4.
3. Production des virus recombinants.
Les gènes codant les fibres chimériques ont ensuite été clones dans un vecteur navette pour permettre leur introduction dans un génome viral préalablement construit (Renaut et a , 2002) à la place du gène codant la fibre sauvage. Cette étape a été effectuée par recombinaison homologue chez E. coli (Chartier et al, 1996). Le vecteur navette utilisé a été décrit dans l'exemple 2 ci-dessus.
A ce stade, les différents gènes codant les fibres chimériques ont été clones dans le vecteur navette à la place du gène codant la fibre sauvage par MlullSaK. Après une étape de recombinaison homologue chez E. coli, nous avons obtenu les génomes recombinants portant les gènes codant les fibres chimériques (figure 8). Après digestion par Swαl, libérant ainsi des plasmides les génomes viraux, ceux- ci ont été introduits dans des cellules HEK293 exprimant la fibre de l'adénovirus par lipofection. Ces cellules permettent la production de virus recombinants car elles expriment El ce qui permet une transcomplémentation puisque ce gène est délété dans les génomes des virus précédemment obtenus.
Plusieurs adénovirus recombinants ont ainsi été construits et produits. Les protéines apicales de la capside sont de deux types : la fibre sauvage de l'adénovirus 5 et l'une des fibre chimérique Ad2/EDS ou Ad2/BAV4. Ces virus sont ensuite utilisés pour infecter des cellules HEK293. Les protéines apicales des particules virales ainsi obtenus sont uniquement de type chimérique.
4. Obtention d'une lignée cellulaire exprimant la fibre de l'adénovirus 2. Le polylinker présent dans le vecteur pCDNA3 (Invitrogen) a été remplacé par un site multiple de clonage à l'aide des deux oligonucléotides complémentaires suivants : 5'-CCCgAATTCgAAgCTTCgCggCCgCAATTgTCgACggTCTAgAC-3' (SEQ ID No 38) et 5'-CCgggTCTAgACCgTCgACAATTgCggCCgCgAAgCTTCgAATTCgg gAgCT-3' (SEQ ID No 39). Le gène de la fibre de l'adénovirus 2, après amplification par PCR, à l'aide des amorces suivantes 5'- AggAAAAAAgCggCCgCCACCATggCgAAACgCgCCAgACCgTC-3' (SEQ ID No 40) en 5' et 5*-AggAAAAAAggTCgACCATgCAACAggTTCACg-3' (SEQ ID No 41) en 3', a été inséré entre les sites Notl et Sali. L'amorce en 5' a été dessinée pour modifier la séquence au voisinage du codon d'initiation de la traduction (consensus de Kozak).
Finalement, l'ADΝc des exons 2 et 3 du TPL de l'adénovirus 2 a été inséré entre les sites HmdlII et Notl du vecteur. Cet ADΝc a été obtenu par amplification PCR après rétrotranscription des ARΝ extraits de cellules HeLa 24h après infection par la souche sauvage de l'adénovirus 2. Les amorces utilisées ont pour séquence : 5'- AggAAAAAAgAAgCTTCTCgCggTTgAggACAAACTCTTCgC-3' (SEQ ID Νo 42) en 5' et 5'-AggAAAAAAggCggCCgCTTgCgACTgTgACTggTTAgACgCC-3 (SEQ ID Νo 43) en 3'.
Le plasmide obtenu a été transfecté par lipofection dans la lignée cellulaire HEK293 (Graham et al, 1977), les clones cellulaires résistants à la Généticine ont été analysés pour l'expression de la fibre de l'adénovirus. Le clone ayant l'expression la plus élevée (247E) a été utilisée pour la transfection des génomes viraux et les premiers cycles de production des adénovirus recombinants ayant une fibre chimérique.
Le stade de maturation et le contenu en protéines de toutes les particules virales recombinantes ont été comparés par une analyse SDS-PAGE de préparations de virus. Les adénovirus ont été isolés par ultracentrifugation en gradient isopycnique de chlorure de césium de façon à purifier la population de virus infectieux à une densité de 1,34 g mL. L'analyse SDS-PAGE des virus a montré que la maturation des particules virales n'est pas altérée par la présence des protéines de fibre chimériques. Les différentes protéines précurseur ont été clivées en protéines matures, en particulier la protéine pVH Les protéines virales ont été transférées sur membrane et les protéines de fibre ont été révélées avec un anticorps monoclonal. La protéine de fibre apparaît à la taille attendue (Figure 11 A, ligne 4).
5- Tropisme cellulaire
Un ensemble de lignées cellulaires humaines ont été testées pour leur sensibilité au vecteur présentant une fibre chimérique en déterminant le niveau d'activité de la β- galactosidase (Figure 12). Le vecteur présentant les fibres HAdV2/BAV4 a montré une capacité réduite pour infecter les cellules humaines. Pour obtenir un niveau similaire d'activité du rapporteur, la quantité de virus initiale a été augmentée 5 à 10 fois par rapport un virus naturel (Figure 12A, B). Pour des cellules non-permissives Daudi et Jurkat, le vecteur adénoviral présentant une fibre chimérique a montré une infectivité réduite comparé au vecteur présentant une fibre HAdV5 (Figure 12E). Afin d'analyser l'interaction du vecteur avec hCAR, l'infectivité de cellules
CHO exprimant ou non hCAR a été comparée. Contrairement au vecteur naturel, aucune différence en infectivité n'a été observée avec le vecteur présentant une fibre HAdV2/BAV4 dans les deux types de lignées cellulaires CHO (Figure 13). De façon surprenante, ce vecteur présentant une fibre chimérique infecte très efficacement les cellules CHO parentales, suggérant la présence d'un récepteur non-identifié spécifique sur ces cellules. Ces résultats confirment également la maturation normal des vecteurs modifiés, puisque ces particules de vecteur hybride infectent efficacement les lignées cellulaires CHO. L'infectivité des cellules CHO a poussé les inventeurs à analyser le tropisme du vecteur présentant la fibre chimérique sur des cellules cancéreuses humaines d'ovaire. La lignée cellulaire SKOV3 a été infectée avec des quantités croissantes des deux vecteurs et l'expression du gène rapporteur a été déterminée 24 h après l'infection. La lignée cellulaire SKOV3 (Figure 14) est apparue plus permissive au vecteur présentant la fibre chimérique qu'au vecteur contrôle. Ces résultats suggèrent que le vecteur adénoviral présentant la fibre chimérique HAdV2/BAV4 reconnaît un récepteur exprimé à la surface des cellules d'ovaire. Ce vecteur adénoviral dénué d'interaction avec hCAR et présentant un tropisme pour les cellules ovariennes est un candidat très intéressant pour l'élaboration d'un vecteur de gène thérapeutique pour une thérapie in vivo.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Adénovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte une fibre modifiée dont la séquence comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21.
2. Adénovirus selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide de ciblage comprend la séquence GEDPGFFNVE, GEDPGFFNVEIP, EDPGFFNVEIPEFPF ou GEDPGFFNVEIPEFP, ou une partie fonctionnelle de celle- ci.
3. Adénovirus selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le peptide de ciblage est introduit à l'extrémité C-terminale de la fibre ou dans la séquence de la boucle HI.
4. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le peptide de ciblage est lié directement à la protéine de la fibre, ou par l'intermédiaire d'une séquence d'espacement.
5. Adénovirus selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence d'espacement comprend une séquence d'acides aminés (SG)j dans laquelle i est un entier compris entre 1 et 7.
6. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fibre comporte en outre une (ou plusieurs) altération supplémentaire dans le bouton de la fibre réduisant ou bloquant son interaction avec le récepteur CAR.
7. Adénovirus selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'altération supplémentaire est choisie parmi une mutation dans la boucle DG du bouton de la fibre, le remplacement du bouton de la fibre par le domaine qui permet la trimérisation de la fibritine du bactériophage T4 et le remplacement du bouton de la fibre par le bouton de la fibre d'un adénovirus non Mastadenovirus.
8. Adénovirus Mastadenovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comporte une fibre modifiée dont le bouton de la fibre a été remplacé par le bouton de la fibre d'un adénovirus de la famille des Atadenovirus.
9. Adénovirus selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit adénovirus de la famille des Atadenovirus est l'adénovirus bovin 4 (BAV4) ou du virus responsable chez le poulet de « l'Egg Drop Syndrome » (EDS).
10. Adénovirus selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit adénovirus de la famille des Atadenovirus est l'adénovirus bovin 4 (BAV4).
11. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte un génome adénoviral recombinant comprenant deux régions terminales ITR, une séquence d'encapsidation (ψ) et une séquence d'ADN d'intérêt, dont le transfert ou l'expression dans un hôte déterminé est souhaité.
12. Adénovirus selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comporte un génome adénoviral défectif pour la région El.
13. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est produit à partir d'un adénovirus de serotype 2 ou 5.
14. Procédé de production d'un adénovirus recombinant selon l'une des revendication 1 à 13, comprenant (i) la construction d'un gène codant la fibre modifiée,
(ii) l'introduction de ce gène dans un génome adénoviral, (iii) l'introduction du génome adénoviral dans une cellule d'encapsidation, (iv) l'amplification du virus et (v) la purification des virus produits.
15. Protéine de fibre d'adénovirus, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21.
16. Protéine selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une modification du bouton de la fibre réduisant l'interaction avec le récepteur CAR.
17. Protéine de fibre d'un adénovirus Mastadenovirus, caractérisée en ce que le bouton de la fibre a été remplacé par le bouton de la fibre d'un adénovirus de la famille des Atadenovirus.
18. Protéine selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit adénovirus de la famille des Atadenovirus est l'adénovirus bovin 4 (BAV4).
19. Acide nucléique codant une protéine de fibre selon l'une des revendications 15 à 18.
20. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 19.
21. Méthode pour le transfert d'un acide nucléique dans un lymphocyte B in vitro ou ex vivo, comprenant la mise en contact d'un organisme, tissu, échantillon biologique ou cellules comprenant des lymphocytes B avec un adénovirus recombinant, ledit adénovirus recombinant comprenant ledit acide nucléique et comportant une fibre modifiée comprenant un peptide de ciblage spécifique d'un récepteur CD21.
22. Méthode pour le transfert d'un acide nucléique dans une cellule d'ovaire in vitro ou ex vivo, comprenant la mise en contact d'un organisme, tissu, échantillon biologique ou cellules comprenant des cellules d'ovaires avec un adénovirus Mastadenovirus recombinant, ledit adénovirus recombinant comprenant ledit acide nucléique et comportant une fibre modifiée dont le bouton de la fibre a été remplacé par le bouton de la fibre d'un adénovirus de la famille des Atadenovirus.
23. Composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 13 et un véhicule acceptable sur le plan pharmacologique.
24. Utilisation d'un adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition destinée au transfert de gènes dans les lymphocytes B.
25. Utilisation d'un adénovirus recombinant selon l'une des revendications 8 à
10 pour la préparation d'une composition destinée au transfert de gènes dans les cellules d'ovaires.
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