WO2004009806A1 - Nadh-abhängige cytochrom b5 reduktase als target für herbizide - Google Patents

Nadh-abhängige cytochrom b5 reduktase als target für herbizide Download PDF

Info

Publication number
WO2004009806A1
WO2004009806A1 PCT/EP2003/007590 EP0307590W WO2004009806A1 WO 2004009806 A1 WO2004009806 A1 WO 2004009806A1 EP 0307590 W EP0307590 W EP 0307590W WO 2004009806 A1 WO2004009806 A1 WO 2004009806A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acid sequence
nucleic acid
seq
nadh
reductase
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/007590
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Reindl
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Priority to AU2003250050A priority Critical patent/AU2003250050A1/en
Priority to US10/521,584 priority patent/US20060160700A1/en
Priority to EP03764982A priority patent/EP1525304A1/de
Publication of WO2004009806A1 publication Critical patent/WO2004009806A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/004—Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to the use of a polypeptide with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase (EG 1.6.2.2), which causes growth retardation and chlorotic leaves in the absence of presence, and by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 or functional equivalents of the above Nucleic acid sequence is encoded as a target for herbicides.
  • SEQ ID NO: 1 nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 or functional equivalents of the above Nucleic acid sequence is encoded as a target for herbicides.
  • functional equivalents of SEQ ID NO: 1 are provided.
  • the present invention comprises the use of the polypeptide with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase in a method for identifying compounds with herbicidal activity which inhibit NADH-dependent cytochrome b5 reductase.
  • the invention relates to the use of these compounds identified via the method as herbicides.
  • the object of the present invention is therefore to identify new targets which are essential for the growth of plants or whose inhibition for the plant lead to reduced growth, and to provide methods which are suitable for identifying compounds with herbicidal activity.
  • the object was achieved by using a polypeptide with the biological activity of an NADH-dependent cytochrome b5 reductase encoded by a nucleic acid sequence consisting of
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code by back-translating the amino acid sequence of a functional equivalent of SEQ ID NO: 2, which has an identity with SEQ ID NO: 2 of at least 39%;
  • affinity tag denotes a peptide or polypeptide, the coding nucleic acid sequence of which can be fused with the nucleic acid sequence according to the invention directly or by means of a linker using common cloning techniques.
  • the affinity tag is used for the isolation, enrichment and / or targeted purification of the recombinant target protein by means of affinity chromatography from whole cell extracts.
  • the linker mentioned above can advantageously contain a protease interface (for example for thrombin or factor Xa), as a result of which the affinity tag can be split off from the target protein if necessary.
  • affinity tags examples include the "His tag” from Quiagen, Hilden, “Strep tag”, the “Myc tag” (Invitrogen, Carlsberg), the chitin-binding domain and an Intein tag from New England Biolabs, the maltose-binding protein (pMal) from New England Biolabs and the so-called CBD tag from Novagen.
  • the affinity tag can be at the 5 'or 3' end of the coding nucleic acid sequence with the sequence coding for the target protein.
  • An expression cassette contains a nucleic acid sequence according to the invention functionally linked with at least one genetic control element, such as a promoter, and advantageously with a further control element, such as a terminator.
  • the nucleic acid sequence of the expression cassette can be, for example, a genomic or a complementary DNA sequence or an RNA sequence as well as semisynthetic or fully synthetic analogues thereof. These sequences can be in linear or circular form, extra-chromosomal or integrated into the genome.
  • the corresponding nucleic acid sequences can be produced synthetically or obtained naturally, or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, and consist of different heterologous gene segments from different organisms.
  • Artificial nucleic acid sequences are also suitable here as long as they enable the expression of a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase in a cell or an organism.
  • synthetic nucleotide sequences can be generated which have been optimized with regard to the codon usage of the organisms to be transformed.
  • nucleotide sequences mentioned above can be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleotide building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • various DNA fragments can be manipulated so that a nucleotide sequence with the correct reading direction and correct reading frame is obtained.
  • the nucleic acid fragments are connected to one another using general cloning techniques, as described, for example, in T.
  • a functional or operative linkage means the sequential arrangement of regulatory sequences or genetic control elements in such a way that each of the regulatory sequences or each of the genetic control elements can perform its function as intended when expressing the coding sequence.
  • “Functional equivalents” here describe nucleic acid sequences which hybridize under standard conditions with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 or parts of SEQ ID NO: 1 and are capable of expressing a polypeptide with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase in a cell or an organism.
  • oligonucleotides For hybridization, it is advantageous to use short oligonucleotides with a length of about 10-50 bp, preferably 15-40 bp, for example of the conserved or other areas, which can be determined by comparison with other related genes in a manner known to the person skilled in the art.
  • longer fragments of the nucleic acids according to the invention with a length of 100-500 bp or the complete sequences for the hybridization can also be used.
  • the length of the fragment or the complete sequence or depending on the type of nucleic acid, i.e. DNA or RNA used for hybridization vary these standard conditions. For example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • the hybridization conditions for DNA: DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 65 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 30 ° C.
  • These specified temperatures for the hybridization are, for example, calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of approx. 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant textbooks on genetics, such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, for example, and can be calculated according to formulas known to the person skilled in the art, for example depending on the length of the nucleic acids, the type of hybrid or the G + C content. The specialist can obtain further information on hybridization from the following textbooks: Ausubel et al.
  • a functional equivalent of SEQ ID NO: 1 also means nucleic acid sequences which are homologous or identical to SEQ ID NO: 1 up to a defined percentage and furthermore in particular also natural or artificial mutations of the above-mentioned nucleic acid sequences which are necessary for a polypeptide encode with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying the abovementioned nucleic acid sequences.
  • modifications can be exemplified by techniques familiar to the person skilled in the art, such as “site directed mutagenesis”, “error prone PCR", “DNA shuffling” (Nature 370, 1994, pp. 389-391) or “staggered extension process” (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261).
  • the aim of such a modification can e.g. the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of DNA to shorten the sequence, the exchange of nucleotides for codon optimization or the addition of further sequences. Proteins that are encoded via modified nucleic acid sequences must still have the desired functions despite a different nucleic acid sequence.
  • the term functional equivalent can also refer to the amino acid sequence encoded by the corresponding nucleic acid sequence.
  • the term functional equivalent describes a protein whose amino acid sequence with SEQ ID NO: 2 is identical or homologous to a defined percentage.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here, as well as artificial nucleic acid sequences, for example those obtained by chemical synthesis and adapted to codon use, or the amino acid sequences derived therefrom.
  • Genetic control sequence describes sequences which have an influence on the transcription and, if appropriate, translation of the nucleic acids according to the invention in prokaryotic or eukaryotic organisms. Examples of this are promoters, terminators or so-called “enhancer” sequences.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified such that the natural regulation has been switched off and the expression of the target gene has been modified, that is to say increased or decreased.
  • control sequence is selected depending on the host organism or starting organism. Genetic control sequences also include the 5 'untranslated region, introns, or the 3' non-coding region of genes. Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome. Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters, and sequences influencing the chromatin structure (for example matrix attachment regions (MAR's)) which can modify the expression-controlling properties. Genetic control sequences can, for example, also result in tissue-specific expression depending on certain stress factors. Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991;
  • Homology between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is defined by the identity of the nucleic acid sequence / polypeptide sequence over the respective total length of the shorter of the two sequences, which by comparison using the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.2 Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin, USA) setting the following parameters for polypeptides
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on the 5 'or 3' side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 100 bp, particularly preferably at least 500 bp, very particularly preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • Plants in the sense of the invention are plant cells, tissues, organs or whole plants such as seeds, bulbs, flowers, pollen, fruits, seedlings, roots, leaves, stems or other parts of plants. Plants are also understood to mean propagation material such as seeds, fruits, seedlings, cuttings, tubers, cuts or rhizomes.
  • Response time means the time it takes to complete an activity test until a significant statement about an activity is obtained and depends both on the specific activity of the protein used in the test and on the method used and the sensitivity of the devices used. The determination of the reaction times is known to the person skilled in the art. In methods based on photometric methods for identifying compounds with a herbicidal action, the reaction times are, for example, generally between> 0 to 120 minutes.
  • Recombinant DNA describes a combination of DNA sequences that can be produced by recombinant DNA technology.
  • Recombinant DNA technology generally known techniques for fusing DNA sequences (described, for example, in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
  • Reporter genes code for easily quantifiable proteins. These genes can be used to carry out an evaluation of the transformation efficiency or of the expression site or time by means of growth, fluorescence, chemo, bioluminescence or resistance assay or by means of a photometric measurement (intrinsic color) or enzyme activity. Reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44) such as "green fluorescence protein” (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett 1996; 389 (1): 44-47; Chui WL et al., Gurr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques.
  • GFP green fluorescence protein
  • Selection markers confer resistance to antibiotics or other toxic compounds: Examples include the neomycin phosphotransferase gene, which is resistant to the aminoglycoside antibiotics neomycin (G 418), kamanyne, paromycin (Deshayes A et al ., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), the sul gene coding for a mutated dihydropteroate synthase (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15 (1): 127-136), the hygromycin B phosphotransferase Gene (Gen Bank Accession NO: K 01193) and the shble resistance gene, which is resistant to bleomycin antibiotics such as. Zeocin gives.
  • selection marker genes are genes which confer resistance to 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or phosphinotricin etc. or those which confer antimetabolite resistance, for example the dhfr gene (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994) 142-149). Also suitable are genes such as trpB or hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sei US A. 85 (1988) 8047-8051).
  • Mannose phosphate isomerase (WO 94/20627), the ODC (ornithine decarboxylase) gene (McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed.) Or the deaminase from Aspergillus are also suitable terreus (Tamura K et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
  • Transformation describes a process for introducing heterologous DNA into a pro- or eukaryotic cell.
  • a transformed cell describes not only the product of the transformation process itself, but also all transgenic progeny of the transgenic organism produced by the transformation
  • Target / Target Protein a polypeptide encodes the nucleic acid sequence according to the invention, which can be an enzyme in the classical sense or e.g. a structural protein, a protein relevant for development processes, regulatory proteins such as transcription factors, kinases, phosphatases, receptors, subunits of channels, transport proteins, regulatory subunits which give an enzyme complex substrate or activity regulation. What all targets or sites of action have in common is that their functional presence is essential for survival or normal development and growth.
  • Transgene Relating to a nucleic acid sequence, an expression cassette or a vector containing a nucleic acid sequence according to the invention or an organism transformed with the abovementioned nucleic acid sequence, expression cassette or vector, the expression transgenic describes all such constructions which have been produced by genetic engineering methods and in which either the nucleic acid sequence of the target protein or a genetic control sequence functionally linked to the nucleic acid sequence of the target protein or a combination of the abovementioned possibilities are not in their natural genetic environment or have been modified by genetic engineering methods. The modification can be achieved here, for example, by mutating one or more nucleotide residues of the corresponding nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 codes for a cytochrome b5 reductase that is specifically dependent on NADH (E.G. 1.6.2.2).
  • Characteristic of higher eukaryotes is the electron transfer system located on the membrane of the endoplasmic reticulum and consists of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase and cytochrome b5 (cytb ⁇ ).
  • the NADH-dependent cytochrome b5 reductase uses an FAD as a prosthetic group to transfer electrons from NADH to Cytb5, a protein containing heme.
  • Polypeptide with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase thus denotes an enzyme which is able to transfer electrons from NADH to Cytb5, a protein containing heme, using a FAD as a prosthetic group.
  • the enzymatic activity of an enzyme with the biological activity of an NADH dependent cytochrome b5 reductase can be determined by means of suitable activity tests, as are described below by way of example (see also example 5).
  • Cytb ⁇ has been described as a component of electron transport in the modification of fatty acids (Kearns et al, 1991; Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, Oxford, page 751). The electrons are then likely to be transferred from cytochrome b5 to desaturases or P450 monooxygenases (Fukuchi-Mizutani, Plant Physiology, 119; 353-361; 1999). Plant-based NADH-dependent cytochrome b5 reductases are found in almost all cell types, especially in immature seeds (Fukuchi-Mizutani, Plant Physiology, 119; 353-361; 1999).
  • NADH-dependent cytochrome b5 reductase was isolated and characterized for the first time from human erythrocytes (Yubisui T, Takeshita M., J Biol Chem., 1980; 255 (6): 2454-1456) and since then also from many other organisms.
  • Nucleic acid sequences of plant-dependent NADH-dependent cytochrome b5 reductases are known, e.g. from Arabidopsis (Gen Bank Acc. No. AB007799; Mizutani and Fukuchi-Mizutani, Plant Physiol.
  • NADH-dependent cytochrome b5 reductase from human erythrocytes can be inhibited by millimolar concentrations of inositol hexaphosphate (Palmieri et al, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1990, 280 (1), 224-228).
  • Thenoyltrifluoroacetone shows a 50% inhibition of the NADH-dependent cytochrome b5 reductase from rat liver microsomes at 0.5 mM (Golf et al., Biol. Chem. Hoppe- Seyler 1985, 366, 647-653).
  • NADH-dependent cytochrome b5 reductase Other substances which can inhibit NADH-dependent cytochrome b5 reductase from various organisms are Amytal, Mepacrin, Dicoumarol (Golf et al; 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 366, pp. 647-653), or N-ethylmaleimides and Atebrin (Tamura et al; 1983, J. Biochem. 94, pp. 1547-1555). However, inhibitors for plant-based NADH-dependent cytochrome b5 reductases have not yet been described.
  • the present invention relates to the use of a polypeptide with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase encoded by a nucleic acid sequence consisting of
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code by back-translating the amino acid sequence of a functional equivalent of SEQ ID NO: 2, which has an identity with SEQ ID NO: 2 of at least 39%;
  • the functional equivalents according to c) are characterized by essentially the same functionality, i.e. they have the physiological function of an NADH-dependent cytochrome b5 reductase.
  • SEQ ID NO: 1 The functional equivalents of SEQ ID NO: 1 according to the invention have a homology with SEQ ID No: 1 of at least 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, preferably at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76% particularly preferred at least 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% very particularly preferably at least 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
  • SEQ ID NO: 2 The functional equivalents of SEQ ID NO: 2 according to the invention have a homology with SEQ ID No: 2 of at least 39%, 40%, 41%, 42%, " 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% preferably at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64 %, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% , 81% o, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% particularly preferably at least 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% very particularly preferably at least 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%), 99%.
  • Examples of functional equivalents are the plant nucleic acid sequences already encoding NADH-dependent cytochrome b5 reductase or amino acid sequences of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase from Medicago truncatula (Gen Bank Acc. No. AA660929; Covitz, PA et al. Plant Physiol. 117 (4), 1325-1332 (1998)), Oryza sativa (Gen Bank Acc. No. BE039960), Solanum tuberosum (Gen Bank Acc. No. BE340917), Beta vulgaris (Gen Bank Acc. No. BI096337) and Pumpkin (Cucurbita maxima; Gen Bank Acc. No. AF274589).
  • nucleic acid sequences which code for a polypeptide with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase, comprising a partial area, are claimed within the scope of the present invention.
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code by back-translating the amino acid sequence of a functional equivalent of SEQ ID NO: 4, which has an identity with SEQ ID NO: 4 of at least 87%.
  • polypeptides encoded by the aforementioned nucleic acid sequences are also claimed.
  • the functional equivalents are characterized by a essentially the same functionality, ie they have the physiological function of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase.
  • nucleic acid sequences or “comprising” based on nucleic acid sequences means that the nucleic acid sequence according to the invention can contain additional nucleic acid sequences at the 3 'or at the 5' end, the length of the additional nucleic acid sequences 75bp at the 5 'and 50bp 3' end of the nucleic acid sequences according to the invention, preferably does not exceed 50bp at the 5 'and 10bp at the 3' end.
  • SEQ ID NO: 3 The functional equivalents of SEQ ID NO: 3 according to the invention have a homology with SEQ ID No: 3 of at least 77%, 78%, 79%, 80%, preferably at least 81%), 82%, 83%, 84%, 85% , 86%, 87%, 88%, 89%, 90% particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
  • SEQ ID NO: 4 The functional equivalents of SEQ ID NO: 4 according to the invention have a homology with SEQ ID No: 4 of at least 87%), preferably at least 88%), 89%), 89%> preferably at least 90%, 91%, 92%, 93 % particularly preferably at least 94%>, 95%, 96% very particularly preferably at least 97%, 98%, 99%.
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code by back-translating the amino acid sequence of a functional equivalent of SEQ ID NO: 2, which has an identity with SEQ ID NO: 2 of at least 39%;
  • Nucleic acid sequences coding for a polypeptide with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase containing a partial region a) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; or
  • Codes can be derived by back-translation from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; or
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerated genetic code by back-translating the amino acid sequence of a functional equivalent of SEQ ID NO: 4, which has an identity with SEQ ID NO: 4 of at least 87%;
  • nucleic acid sequences according to the invention are referred to below as “nucleic acid sequences according to the invention”.
  • the polypeptides encoded by a nucleic acid sequence according to the invention with the biological activity of an NADH-dependent cytochrome b5 reductase are referred to below as "NCR" for the sake of simplicity.
  • NCR cause growth retardation in reduced amounts as well as necrotic leaves in plants.
  • a reduction in the polypeptide means that the amount of the polypeptide is reduced using genetic engineering methods.
  • a plant modified in this way is compared with a plant which has no genetic modifications with respect to this polypeptide, but is otherwise identical to the genotype of the genetically manipulated plant under identical growth conditions.
  • the gene products of the nucleic acids according to the invention represent new targets for herbicides which make it possible to provide new herbicides for controlling unwanted plants.
  • undesirable plants are understood to mean all plants that grow up in places where they are undesirable, for example:
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or parts of the above-mentioned nucleic acid sequences can be used for the production of hybridization probes, via which e.g. the corresponding full length genes and / or functional equivalents of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 can be isolated.
  • the manufacture of these probes and the conduct of the experiments are known. This can be done, for example, by the targeted production of radioactive or non-radioactive probes by means of PCR and the use of appropriately labeled oligonucleotides with subsequent hybridization experiments. The technologies required for this are described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J.
  • the corresponding probes can also be modified using standard technologies (Lit. SDM or random mutagenesis) so that they can be used for other purposes, e.g. as a probe that hybridizes specifically to mRNA and the corresponding coding sequences for the purpose of analyzing the corresponding sequences in other organisms.
  • the above-mentioned probes can be used for the detection and isolation of functional equivalents of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 from other plant species on the basis of sequence identities.
  • part or all of the sequence of the corresponding SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is used as a probe for screening in a genomic or cDNA bank of the corresponding plant species or in a computer search for sequences of functional equivalents in electronic databases ,
  • Preferred plant species are the undesired plants already mentioned at the beginning.
  • the invention furthermore relates to expression cassettes containing
  • a nucleic acid sequence which, owing to the degenerate genetic code, is converted back from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. lets lead; or functional equivalents of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 with an identity of at least 86% to SEQ ID NO: 3; a nucleic acid sequence which can be derived from the degenerate genetic code by back-translating the amino acid sequence of a functional equivalent of SEQ ID NO: 4, which has an identity with SEQ ID NO: 4 of at least 87%;
  • an expression cassette according to the invention comprises a promoter at the 5 'end of the coding sequence and a transcription termination signal at the 3' end and optionally further genetic control sequences which are functionally linked to the nucleic acid sequence according to the invention in between.
  • the expression cassettes according to the invention are also to be understood as analogs which can come about, for example, from a combination of the individual nucleic acid sequences on a polynucleotide (multiple constructs), on several polynucleotides in a cell (co-transformation) or through sequential transformation.
  • Advantageous genetic control sequences according to point a) for the expression cassettes according to the invention or for vectors containing expression cassettes according to the invention are, for example, promoters such as cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, T5, T3 , gal, trc, ara, SP6, ⁇ -PR or in the ⁇ -PL promoter, which can be used to express the NCR in gram-negative bacterial strains.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, T5, T3 , gal, trc, ara, SP6, ⁇ -PR or in the ⁇ -PL promoter, which can be used to express the NCR in gram-negative bacterial strains.
  • Further advantageous genetic control sequences are, for example, in the amy and SPO2 promoters, which can be used to express the NCR in gram-positive bacterial strains, and in the yeast or fungal promoters AUG1, GPD-1, PX6, TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PHO5, AOX1, GAL10 / CYC1, CYC1, OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa or NMT or combinations of the above promoters (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11 (7): 629-40; Romanos et al. Yeast 1992 Jun; 8 (6): 423-88; Benito et al. Eur. J. Plant Pathol.
  • Suitable genetic control sequences for expression in insect cells are the polyhedrin promoter and the p10 promoter (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio / Techn. 6, 47-55).
  • Advantageous genetic control sequences for the expression of the NCR in cell culture are in addition to polyadenylation sequences such as e.g. from Simian Virus 40 eukaryotic promoters of viral origin such as e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or simian virus 40.
  • Simian Virus 40 eukaryotic promoters of viral origin such as e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or simian virus 40.
  • Promoters of viral origin are particularly preferred, such as the promoter of the 35S transcript of the cauliflower mosaic virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294; Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812).
  • Further preferred constitutive promoters are, for example, the promoter of nopaline synthase from Agrobacterium, the TR double promoter, the OCS (octopine synthase) promoter from Agrobacterium, the ubiquitin promoter (Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29: 637- 649), the promoters of the vacuolar ATPase subunits or the promoter of a proline-rich protein from wheat (WO 91/13991).
  • the expression cassettes can also contain a chemically inducible promoter as a genetic control sequence, by means of which the expression of the exogenous gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • a chemically inducible promoter such as, for example, the PRP1 promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), one that can be induced by salicylic acid (WO 95/19443), one that can be induced by benzenesulfonamide (EP-A-0388186), one which is inducible by tetracycline (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397404), one which is inducible by abscisic acid (EP-A 335528) or one by ethanol or cyclohexanone inducible (WO 93/21334) promoter can also be used.
  • promoters which express tissue or organ-specific expression e.g. mediate in anthers, ovaries, flowers and flower organs, leaves, guard cells, trichomes, stems, lead tissues, roots and seeds.
  • tissue or organ-specific expression e.g. mediate in anthers, ovaries, flowers and flower organs, leaves, guard cells, trichomes, stems, lead tissues, roots and seeds.
  • those promoters which ensure leaf-specific expression are also suitable.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potato WO 97/05900
  • the SSU promoter small subunit
  • the Rubisco ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase
  • ST-LSI promoter from potato
  • Seed-specific promoters are, for example, the promoter of phaseolin (US 5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1 (9): 839-53), of the 2S albuming gene (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987 , 262: 12196-12201), leguminum (Shirat A et al., Mol Gen Genet. 1989; 215 (2): 326-331), USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991, 225 (3): 459-67) of the Napin gene (Stalberg K, et al., L.
  • phaseolin US 5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1 (9): 839-53
  • the 2S albuming gene Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987 , 262: 12196-12201
  • leguminum Shirat
  • sucrose binding protein WO 00/26388
  • LeB4 promoter Baumlein H et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128; Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090.
  • promoters suitable as genetic control sequences are, for example, specific promoters for tubers, storage roots or roots, such as, for example, the patatin promoter class I (B33), the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato, the promoter of the starch synthase (GBSS1) or the sporamine promoter, fruit-specific promoters, such as the fruit-specific promoter from tomato (EP-A 409625), fruit-ripening-specific promoters, such as the fruit-ripening-specific promoter from tomato (WO 94/21794), flower-specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92 / 16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593) or specific plastid or chromoplast promoters, such as the RNA polymerase promoter (WO 97/06250) or the promoter of the phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase from Glycine max (see also
  • Additional functional elements b) are to be understood as examples, but not by way of limitation, of reporter genes, origins of replication, selection markers and so-called affinity tags, fused with the NCR directly or optionally containing a protease interface by means of a linker.
  • Other suitable additional functional elements are sequences which ensure targeting in the apoplasts, plastids, the vacuole, the mitochondrium, the peroxisome, the endoplasmic reticulum (ER) or, due to the lack of corresponding operative sequences, a retention in the compartment of formation, the cytosol (Kermode, Grit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
  • Vectors according to the invention also contain at least one copy of the nucleic acid sequences according to the invention and / or the expression cassettes according to the invention.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally. Chromosomal replication is preferred.
  • the nucleic acid construct according to the invention can also advantageously be introduced into the organisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the nucleic acid construct as a vector or the nucleic acid sequences used.
  • the expression cassette according to the invention and vectors derived therefrom can be used for the transformation of bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi and algae and eukaryotic, non-human cells (for example insect cells) with the aim of recombinantly producing the NCR, the production of which a suitable expression cassette according to the organism in which the gene is to be expressed.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention can also be introduced into an organism alone.
  • nucleic acid sequences in addition to the nucleic acid sequences, further genes are to be introduced into the organism, they can all be introduced into the organism together in a single vector or each individual gene can be introduced into the organism, the different vectors being able to be introduced simultaneously or successively.
  • nucleic acid (s) according to the invention, the expression cassette or the vector can be introduced into the corresponding organisms (transformation) by all methods known to the person skilled in the art.
  • Suitable methods are the biolistic method or by protoplast transformation (cf. e.g. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New Y-ork-Basel-Cambridge), electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium. The methods mentioned are published, for example, in B.
  • the transformation using agrobacteria and the vectors to be used for the transformation are known to the person skilled in the art and are described in detail in the literature (Bevan et al., Nucl. Aeids Res. 12 (1984) 8711.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation). Binary vectors can replicate in both E.
  • coli and agrobacteria contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria (; Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187), EP A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Grit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al. EMBO J. 4 (1985) 277-287).
  • Agrobacteria transformed with a vector according to the invention can also be used in a known manner to transform plants such as test plants such as Arabidopsis or crops such as cereals, corn, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, tobacco, tomatoes, carrots, peppers, rapeseed, tapioca, cassava, arrowroot, tagetes , Alfaifa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • test plants such as Arabidopsis or crops such as cereals, corn, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, tobacco, tomatoes, carrots, peppers, rapeseed, tapioca, cassava, arrowroot, tage
  • the genetically modified plant cells can be regenerated using all methods known to the person skilled in the art. Appropriate methods can be found in the above-mentioned writings by S.D. Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer can be found.
  • transgenic organisms produced by transformation with one of the above-described embodiments of an expression cassette containing a nucleic acid sequence according to the invention or a vector containing the abovementioned expression cassette and the recombinant NCR obtainable by expression from the transgenic organism are the subject of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of transgenic organisms containing an expression cassette according to the invention, e.g. for the provision of recombinant protein and / or the use of these organisms in in vivo test systems.
  • yeasts, mosses, algae and fungi preferred organisms for recombinant expression are also eukaryotic cell lines.
  • mosses are Physcomitrella patens or other mosses described in Kryptogamen, Vol. 2, Moose, Farne, 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515).
  • bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes or Cyanobacteria, for example of the genus Synechocystis or Anabena are preferred.
  • yeasts are Candida, Saccharomyces, Schizosaccheromyces, Hansenula or Pichia.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995).
  • Preferred plants are selected in particular from monocotyledonous crop plants, such as, for example, cereals such as wheat, barley, millet, rye, ritical, maize, rice or oats, and sugar cane.
  • the transgenic plants according to the invention are selected in particular from dicotyledonous crop plants, such as, for example, Brassicacae such as rape, cress, Arabidopsis, Kohiart or Canola; Leguminosae such as soybean, alfalfa, pea, bean family or peanut solanaceae such as potato, tobacco, tomato, eggplant or paprika; Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula; Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini, or flax, cotton, hemp, flax, red pepper, carrot, carrot, sugar beet or various tree, nut and wine species.
  • Brassicacae such as rape, cress, Arabidopsis, Kohiart or Canola
  • Leguminosae such as soybean, alfalfa, pea, bean family or peanut solanaceae such as potato, tobacco, tomato, eggplant or paprika
  • Asteraceae such as sunflower,
  • transgenic animals such as C. elegans are also suitable as host organisms.
  • the typical advantageous, commercially available fusion and expression vectors pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) which contains glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein, or Protein A, the pTrc- Vectors (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) the "pKK233-2" from CLONTECH, Palo Alto, CA and the "pET” and the "pBAD” vector series from Stratagene, La To call Jolla.
  • vectors for use in yeast are pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES derivatives, pGAPZ derivatives, pPICZ derivatives and the vectors of the "Pichia Expression Kit” (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors for use in filamentous fungi are described in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., Eds., P. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • insect cell expression vectors can also be used advantageously, for example for expression in Sf9, Sf21 or Hi5 cells, which are infected via recombinant baculoviruses.
  • These are, for example, the vectors of the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the Baculovirus expression systems "MaxBac 2.0 Kit” and "Insect Select System” from Invitrogen, Calsbald or “BacPAK Baculovirus Ex- pression system "from CLONTECH, Palo Aito, CA.
  • Insect cells are particularly suitable for overexpression of eukaryotic proteins, since they carry out post-translational modifications of the proteins which are not possible in bacteria and yeasts.
  • the handling of insect cells in cell culture and their infection for the expression of Proteins are known to the person skilled in the art and can be carried out analogously to known methods (Luckow and Summers, Bio / Tech. 6, 1988, pp.47-55; Glover and Harnes (eds) in DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205-244).
  • plant cells or algal cells can advantageously be used for gene expression.
  • plant expression vectors can be found in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 or in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be expressed in mammalian cells.
  • Examples of corresponding expression vectors are pCDM ⁇ and pMT2PC mentioned in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 or Kaufman et al. (1987) EM-BO J. 6: 187-195).
  • Promoters to be used are preferably of viral origin, e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or simian virus 40.
  • prokaryotic and eukaryotic expression systems are mentioned in chapters 16 and 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Further advantageous vectors are described in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000).
  • transgenic organism according to the invention The organisms transformed with an expression cassette according to the invention are referred to under the term “transgenic organism according to the invention”.
  • Another object of the present invention is the use of NCR in a method for identifying compounds with herbicidal activity.
  • the method according to the invention for identifying compounds having a herbicidal action preferably comprises the following steps:
  • the detection according to step (ii) of the above method can be carried out using techniques which show the interaction between protein and ligand.
  • Either the test compound or the enzyme may contain a detectable label, e.g. a fluorescent, radioisotope, chemiluminescent or enzymatic label.
  • a detectable label e.g. a fluorescent, radioisotope, chemiluminescent or enzymatic label.
  • enzymatic labels are horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or lucifierase.
  • the subsequent detection depends on the marking and is known to the person skilled in the art.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • Test connections is displaced ("displacement assay").
  • the compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • the fluorescence polarization uses the property of a quiescent fluorophore excited with polarized light also to emit polarized light again. However, if the fluorophore can rotate during the excited state, the polarization of the emitted fluorescent light is more or less lost. Under otherwise identical conditions (e.g. temperature, viscosity, solvent), the rotation is a function of the molecular size, which means that the measurement signal provides information about the size of the residue bound to the fluorophore. (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300).
  • a method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of a test compound marked by a fluorescent molecule to the NCR. Alternatively, the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1. The compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • Fluorescence Resonance Energy Transfer is based on the radiationless energy transfer between two spatially adjacent fluorescence molecules under suitable conditions. A prerequisite is the overlap of the
  • the fluorescence labeling of the NCR and the bonded tet compound can be measured using FRET (Cytometry 34, 1998, pp. 159-179).
  • FRET Fluorescence labeling 34, 1998, pp. 159-179
  • the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay” described under 1.
  • a particularly suitable embodiment of the FRET technology is the "Homogeneous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), as sold by Packard BioScience. The compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • the measurement of surface plasmon resonance is based on the change in the refractive index on a surface when a test compound binds to a protein immobilized on said surface. Since the change in the refractive index for a defined change in the mass concentration at the surface is virtually identical for all proteins and polypeptides, this method can in principle be applied to any protein (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304 ; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). For example, the measurement can be carried out in one throughput with the aid of the automated analyzers based on surface pasmon resonance sold by Biacore (Freiburg) of currently up to 384 samples per day.
  • Biacore Biacore
  • a method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of a test compound to the NCR.
  • the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1.
  • the compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention which is based on steps i) and ii), consists in that
  • an NCR is expressed in a transgenic organism according to the invention or an organism which naturally contains an NCR is cultivated;
  • the NCR from step i) is brought into contact with a test compound in the cell disruption of the transgenic or non-transgenic organism, in partially purified form or in a form purified to homogeneity;
  • a compound is selected which reduces or blocks the activity of the NCR, the activity of the NCR incubated with the test compound being determined with the activity of an NCR not incubated with a test compound.
  • the NCR-containing solution can consist of the lysate of the original organism or of the transgenic organism transformed with an expression cassette according to the invention. If necessary, the NCR can be partially or completely cleaned using common methods.
  • common methods for protein purification can be found, for example, in Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6.
  • the protein fused to an affinity tag can be purified using affinity chromatography known to those skilled in the art.
  • the purification of the NCR from human tissue can, for example, by the method of Jollie et al. (Plant Physiol. 85, pp. 457-462, 1987).
  • the NCR required for in vitro methods can thus be isolated either by heterologous expression from a transgenic organism according to the invention or from an organism which contains an NCR activity, preferably from an undesired plant, the term “undesired plant” being used at the beginning mentioned species are to be understood.
  • the NCR is now incubated with a test compound. After a reaction time, the activity of the NCR incubated with the test compound is determined with the activity of an NCR not incubated with a test compound.
  • NCR is inhibited, a significant decrease in activity compared to the activity of the non-inhibited polypeptide according to the invention is observed, a decrease of at least 10%, advantageously at least 20%, preferably at least 30%, particularly preferably by at least 50% up to a 100 % Reduction (blocking) is achieved.
  • at least 50% inhibition at concentrations of the test compound of 10 ⁇ M, preferably at 10 ⁇ M, particularly preferably of 10 ⁇ M based on enzyme concentration in the micromolar range.
  • the determination of the enzymatic activity of the NCR can be carried out, for example, using an activity test in which the increase in the product, the decrease in the substrate (or starting material) or the decrease in a specific cofactor, or in a combination of at least two of the aforementioned parameters depending on a defined one Period of time can be determined.
  • suitable substrates are, for example, ferricytochrome b5, potassium ferricyanide, 2,6-dichlorophenolindophenol, methemerythrin, p-benzoquinone or 5-hydroxy-1, 4-naphthoquinone, preferably ferricytochrome b5, potassium ferricyanide, 2,6-dichlorophenolindophenol, particularly preferably ferricytochrome b5, potassium ferricyanide very particularly preferably potassium ferricyanide and, for suitable cofactors, NADH.
  • derivatives of the abovementioned compounds which contain a detectable label such as, for example, a fluorescent, radioisotopic or chemiluminescent label, can also be used.
  • the amounts of substrate to be used for the activity test are between 0.5-10 mM and amounts of NADH between 0.1-5 mM based on 1-10 ⁇ jt / g / ml enzyme.
  • the conversion of a substrate is monitored photometrically, based on a method described by Mihara and Sato (Methods Enzymol., 52, 1978, pp. 102-108), which is based on the reduction of potassium ferrcyanide and the photometric measurement based at 420 nm.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention which is based on steps i) and iii), consists of the following steps:
  • test compounds that cause a reduced growth or limited survivability of the non-transgenic organism compared to the growth of the transgenic organism.
  • the polypeptide with the biological activity of an NCR is overexpressed in the transgenic organism according to i).
  • the transgenic organism thus has an increased NCR activity compared to a non-transgenic organism, wherein with increased NCR activity of the transgenic organism one compared to the non-transgenic organism of the same genus by at least 10%, preferably by at least 25%, particularly preferably by at least 40%, particularly preferred to understand at least 50% higher activity.
  • the growth difference in step iv) for selecting an inhibitor with a herbicidal action is at least 10%, preferably 20%, preferably 30%, particularly preferably 40% and very particularly preferably 50%.
  • the transgenic organism here is a bacterium, a yeast, a fungus, a plant or a eukaryotic cell line (from insects or mammals such as, for example, mouse), preferably plants, bacteria or yeasts, which can be easily transformed using common techniques, such as Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Nicotiana Tabacum or Saccharomyces cerevisiae in which the poly- peptide coding sequence was incorporated via transformation. These transgenic organisms therefore have an increased tolerance to compounds which inhibit the polypeptide according to the invention.
  • Saccharomyces cerevisiae is particularly useful here because its genome is completely sequenced and it can easily be used to produce "knock-out” mutants and the analog NCR gene present in this organism can be specifically switched off (eg Methods in Yeast Genetics, Kaiser, Michaelis, Mitchell (eds.) CSHL Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994: 73-85).
  • the above-mentioned embodiment of the method according to the invention can, however, also be used to identify compounds with a growth regulatory effect.
  • a plant is used as a transgenic organism.
  • the method for identifying compounds with growth regulatory activity thus comprises the following steps:
  • the polypeptide with the biological activity of an NCR is overexpressed in the transgenic plant according to i).
  • the transgenic plant thus has an increased NCR activity compared to a non-transgenic plant of the same genus, with an increased NCR activity of the transgenic plant compared to a non-transgenic plant of the same genus by at least 10%, preferably by at least 25%. , particularly preferably by at least 40%, very particularly preferably by at least 50% higher activity.
  • test compounds are selected which bring about a change in the growth of the non-transgenic organism compared to the growth of the transgenic organism.
  • Modified growth is to be understood as an inhibition of the vegetative growth of the plants, which can manifest itself in particular in a reduction in the growth in length.
  • the treated Plants accordingly have a compact stature; a darker leaf coloration can also be observed.
  • test compounds can also be used in one inventive method. If the target is influenced by a group of test compounds, then it is either possible to directly isolate the individual test compounds or to divide the group of test compounds into different subgroups, e.g. if it consists of a large number of different components, so as to reduce the number of different test compounds in the method according to the invention.
  • the method according to the invention is then repeated with the individual test compound or the corresponding subgroup of test compounds.
  • the steps described above can be repeated several times, preferably until the subgroup identified according to the method according to the invention comprises only a small number of test compounds or only one test compound.
  • All of the compounds or substances identified using the method according to the invention can then be checked for their herbicidal activity in vivo.
  • One way of testing the compounds for herbicidal activity is to use the Lemna minor duckweed in microtiter plates. Changes in chlorophyll content and photosynthesis performance can be measured as parameters. It is also possible to apply the compound directly to undesired plants, the herbicidal action e.g. about limited growth can be determined.
  • the method according to the invention can also advantageously be carried out in high-throughput methods, so-called HTS, which enables parallel testing of a large number of different connections.
  • HTS high-throughput methods
  • the use of carriers which carry one or more of the nucleic acid molecules according to the invention, one or more vectors containing the nucleic acid sequence according to the invention, one or more transgenic organisms which contain at least one of the nucleic acid sequences according to the invention or one or more (poly ) contain peptides encoded via the nucleic acid sequences according to the invention.
  • the carrier used can be solid or liquid, is preferably solid, particularly preferably a microtiter plate.
  • the above-mentioned carriers are also the subject of the present invention.
  • microtiter plates According to the most widespread technique, 96-well, 384-well and 1536-well microtiter plates are used, which can usually contain volumes of 200 // l.
  • the other components of a HTS system are commercially available to match the corresponding microtiter plates, such as many instruments, materials, automatic pipetting devices, robots, automated plate readers and plate washers.
  • the invention further relates to compounds with herbicidal activity identified by the processes according to the invention.
  • These compounds are referred to below as "selected compounds". They have a molecular weight of less than 1000 g / mol, advantageously less than 500 g / mol, preferably less than 400 g / mol, particularly preferably less than 300 g / mol.
  • Compounds with herbicidal activity have a Ki value of less than 1 mM, preferably less than 1 ⁇ M, particularly preferably less than 0.1 ⁇ M, very particularly preferably less than 0.01 ⁇ U.
  • the selected compounds can of course also be present in the form of their agriculturally useful salts.
  • Agriculturally useful salts include, in particular, the salts of those cations or the acid addition salts of those acids whose cations or anions do not adversely affect the herbicidal activity of the selected compounds.
  • the selected compounds contain asymmetrically substituted ⁇ -carbon atoms, either as racemates, mixtures of enantiomers, pure Enantiomers or, if they have chiral substituents, also exist as mixtures of diastereomers.
  • the selected compounds can be chemically synthesized or microbiologically produced substances and can occur, for example, in cell extracts from, for example, plants, animals or microorganisms.
  • the reaction mixture can be a cell-free extract or can comprise a cell or cell culture. Suitable methods are known in the art and are generally described in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), for example chapter 17.
  • the selected compounds from comprehensive substance libraries come for example.
  • test compounds can be expression libraries such as cDNA expression libraries, peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic substances, hormones, PNAs or the like (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs , Cell. 79 (1994), 193-198 and references cited therein).
  • the selected compounds can be used to control undesired plant growth, under certain circumstances also for defoliation, for example of potatoes, or desiccation, for example of cotton, and as growth regulators.
  • Herbicidal compositions containing the selected compounds control plant growth very well on non-cultivated areas. In crops such as wheat, rice, maize, soybeans and cotton, they act against weeds and grass weeds without significantly damaging the crop plants. This effect occurs especially at low application rates.
  • the selected compounds can be used to control the harmful plants already mentioned above.
  • selected compounds or herbicidal compositions containing them can advantageously also be used in a further number of crop plants for eliminating unwanted plants.
  • the following crops are considered, for example:
  • the selected compounds can also be used in crops which are tolerant to the action of herbicides by breeding, including genetic engineering methods. The preparation of these cultures is described below.
  • the invention further relates to a process for the preparation of the herbicidal composition already mentioned above, characterized in that selected compounds are formulated with suitable auxiliaries to give crop protection agents.
  • the selected compounds can e.g. be formulated in the form of directly sprayable aqueous solutions, powders, suspensions, including high-proof aqueous, oily or other suspensions or suspoemulsions or dispersions, emulsifiable concentrates, emulsions, oil dispersions, pastes, dusts, sprinkling agents or granules, and by spraying, atomizing, dusting, Scattering or pouring can be applied.
  • the application forms depend on the intended use and the nature of the selected compounds and should in any case ensure the finest possible distribution of the selected compounds.
  • the herbicidal composition contains a herbicidally effective amount of at least one selected compound and auxiliaries customary for the formulation of herbicidal compositions.
  • emulsions, pastes or aqueous or oil-containing formulations and dispersible concentrates the selected compounds can be dissolved or dispersed in an oil or solvent, it being possible to add further formulation auxiliaries for homogenization.
  • liquid or solid concentrates which are suitable for dilution with water can also be prepared from selected compound, optionally solvents or oil and optionally further auxiliaries.
  • EC, EW emulsifiable concentrates
  • SC suspensions
  • SL soluble concentrates
  • DC dispersible concentrates
  • pastes, pastilles, wettable powders or granules emulsifiable concentrates
  • Corresponding powders or granules or Tablets can also be provided with a solid coating which prevents abrasion or premature release of the active ingredient ("coating").
  • auxiliary means the following classes of compounds: anti-foaming agents, thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants, emulsifiers, bactericides and / or thixotrophic agents.
  • anti-foaming agents thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants, emulsifiers, bactericides and / or thixotrophic agents.
  • SLs, EWs and ECs can be produced by simply mixing the corresponding ingredients, powder by mixing or grinding in special mill types (e.g. hammer mills).
  • DC, SCs and SEs are usually produced by wet milling, it being possible to produce an SE from a SC by adding an organic phase which may contain further auxiliaries or selected compounds.
  • the manufacture is known.
  • Powders, materials for broadcasting and dusts can advantageously be prepared by mixing or grinding the active compounds together with a solid carrier.
  • Granules, e.g. Coating, impregnation and homogeneous granules can be produced by binding the selected compounds to solid carriers. Further details of the production are known to the person skilled in the art, and e.g.
  • liquid additives such as medium to high boiling point mineral oil fractions such as kerosene or diesel oil, also coal tar oils as well as oils of vegetable or animal origin, aliphatic, cyclic and aromatic hydrocarbons, e.g.
  • Solid carriers are, for example, mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth. de, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, ureas and vegetable products such as cereal flour, tree bark, wood and nutshell flour, cellulose powder or other solid carriers.
  • mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth. de, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, ureas and vegetable products such as cereal flour, tree
  • surfactants suitable for the formulations according to the invention are known to the person skilled in the art, such as, for example. Alkali, alkaline earth, ammonium salts of aromatic sulfonic acids, e.g.
  • the herbicidal compositions or the selected compounds can be applied pre- or post-emergence. If the selected compounds are less compatible with certain crop plants, application techniques can be used in which the selected compounds are sprayed with the aid of sprayers in such a way that the leaves of the sensitive crop plants are not hit, if possible, while the selected compounds are applied to the leaves underneath growing unwanted plants or the uncovered floor area (post-directed, lay-by).
  • the application rates of selected compounds are 0.001 to 3.0, preferably 0.01 to 1.0 kg / ha, depending on the control target, season, target plants and growth stage.
  • the provision of the herbicidal target further enables a method for identifying a protein with the biological activity of an NCR which is not or only to a limited extent inhibited by a herbicide which has the NCR as the site of action, for example the herbicidally active selected compounds.
  • a protein which differs from the NCR is referred to as an NCR variant, which is encoded by a nucleic acid sequence which i) encodes a polypeptide with the biological activity of a NADH-dependent cytochrome b5 reductase which is not inhibited by substances having a herbicidal action which inhibit NCR and have been determined by the abovementioned methods; and
  • the above-mentioned method for generating nucleic acid sequences encoding NCR variants of nucleic acid sequences comprises the following steps:
  • SEQ ID NO: 1 The functional equivalents of SEQ ID NO: 1 according to the invention have a homology with SEQ ID No: 1 of at least 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, preferably at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76% particularly preferred at least 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%), 90% very particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%., 98%, 99%.
  • SEQ ID NO: 2 The functional equivalents of SEQ ID NO: 2 according to the invention have a homology with SEQ ID No: 2 of at least 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48 %, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% preferably at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64% , 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%), 80% , 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% particularly preferably at least 87%, 88%, 89%, 90%), 91%>, 92%, 93% very particularly preferably at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
  • the sequences selected according to the method described above are advantageously introduced into an organism.
  • Another object of the invention is therefore an organism produced by this method.
  • the organism is preferably a plant, particularly preferably one of the crop plants defined above.
  • Modified proteins and / or nucleic acids which can impart resistance to the selected compounds in plants, can also be produced from the nucleic acid sequences mentioned above by means of the so-called "site directed mutagenesis".
  • This mutagenesis can, for example, improve the stability and / or activity of the Target proteins or the properties such as binding and action of the above-mentioned inhibitors according to the invention can be specifically improved or changed.
  • Zhu et al. (Nature Biotech., Vol. 18, May 2000: 555-558) describes a "site directed mutagenesis" method in plants which can be used advantageously.
  • this microorganism creates mutations in the introduced nucleic acids and thus leads to a change in the genetic information.
  • isolating the modified nucleic acids or the modified proteins and testing for resistance it is easy to identify advantageous nucleic acids and the proteins encoded by them. These can then express resistance there after introduction into plants and thus lead to resistance to the herbicides.
  • mutagenesis and selection are, for example, methods such as the in vivo mutagenesis of seeds or pollen and selection of resistant alleles in the presence of the inhibitors according to the invention, followed by genetic and molecular identification of the modified, resistant alleis. Furthermore, mutagenesis and selection of resistances in cell culture by multiplying the culture in the presence of successively increasing concentrations of the inhibitors according to the invention. The increase in the spontaneous mutation rate can be exploited by chemical / physical mutagenic treatment. As described above, modified genes can also be isolated using microorganisms which have an endogenous or recombinant activity of the proteins coded by the nucleic acids used in the method according to the invention and which are sensitive to the inhibitors identified according to the invention. The cultivation of the microorganisms on media with an increasing concentration of inhibitors according to the invention allows the selection and evolution of resistant variants of the targets according to the invention. The frequency of the mutations can in turn be increased by mutagenic treatments.
  • Another object of the invention is therefore a method for producing nucleic acid sequences which code for gene products which have a changed biological activity, the biological activity being changed in contrast to the fact that there is increased activity.
  • Increased activity means that at least 10% of the parent organism or the parent gene product is preferably by at least 30%, particularly preferably by at least 50%, very particularly preferably by at least 100% higher activity.
  • the biological activity may have been changed so that the substances and / or agents according to the invention no longer or no longer bind correctly to the nucleic acid sequences and / or the gene products encoded by them.
  • no longer or no longer correctly means that the substances have changed by at least 30%, preferably at least 50%, particularly preferably by at least 70%, very particularly preferably by at least 80%) or not at all Bind nucleic acids and / or gene products in comparison to the starting gene product or the starting nucleic acids.
  • Yet another aspect of the invention therefore relates to a transgenic plant which has been transformed with a nucleic acid sequence which codes for a gene product which has an altered biological activity or with a nucleic acid sequence which codes for an NCR variant.
  • Methods for transformation are known to the person skilled in the art and are exemplified above.
  • transgenic plants which are resistant to the substances and / or agents containing these substances found by the method according to the invention can also be produced by transformation followed by overexpression of a nucleic acid sequence according to the invention.
  • a further subject of the invention is therefore a method for producing transgenic plants which are resistant to substances which have been found by a method according to the invention, characterized in that nucleic acids coding for an NCR variant are overexpressed in these plants.
  • a similar method is described by way of example in Lermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75-83.
  • Protein or nucleic acid such as RNA or DNA is changed so that the changed structure no longer has a herbicidal effect, that is to say the interaction of the herbicide with the target site can no longer take place.
  • transgenic plants are produced using one of the above-described embodiments of the expression cassette according to the invention using common transformation methods also described above.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed NCR can be determined, for example, in vitro by proliferation or by a germination test.
  • a change in the type and level of expression of the NCR gene and its effect on the resistance to inhibitors of the NCR on test plants can be tested in greenhouse experiments.
  • the invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting.
  • Cloning methods such as RestrictionNC switching, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of Escherichia coli cells, cultivation of bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as in Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6.
  • the bacterial strains used below (E. coli DH5 ⁇ , XL-1 blue, XL10 Gold, BL21DE (3), JM 109) were obtained from Stratagene, BRL Gibco or Invitrogen, Carlsberg, CA.
  • the primer pair Rei 156 / Rei 157 became a cDNA sequence coding for NCR from Arabidopsis thaliana (accession number AB007799; Mizutani.M. And Fukuchi-Mizutani.M., 1997)
  • Rei 156 5'-TATACCCGGGATGGATACCGAGTTTCTCCGAA-3 '(SEQ ID NO: 5) and
  • Rei 157 5 - TATACCCGGGGAACTGGAATTGCATCTCCGGA-3 '(SEQ ID NO: 6).
  • the primers Rei 156/157 were then used in a PCR reaction to amplify a cDNA fragment from an Arabidopsis thaliana cDNA library (Stratagene). The PCR was carried out according to the conditions listed in Table 1. Table 1
  • the vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer 1990, Plant Science 66, 221-230) was cleaved with Smal and ligated with the NCR fragment isolated from the vector pPCRScript-NCR via Smal (pBinAR-NCR).
  • the ligation mixture was transformed into XL10 Gold E. coli cells and clones containing pBinAR-NCR were identified using a digoxigenin-labeled NCR probe (Röche) with the aid of anti-digoxigenin antibodies.
  • the detection of the antisense orientation of the NCR cDNA in pBinAR-NCR was carried out by sequencing and by PCR reactions with 2 different primer pairs (Rei 143 and Rei 196, or Rei 144 and Rei 195) according to the conditions listed in Table 2.
  • the antisense orientation of the NCR could match the primers
  • the construct pBinAR-NCR was transformed into agrobacterial strain pGV 2260.
  • a positively transformed agrobacterial colony was used to transform Arabidopsis plants.
  • the detection of the presence of the construct pBinAR-NCR in an agrobacterial colony was carried out via PCR with the primers Rei 156 and Rei 157 via PCR according to the conditions listed in Table 2. An amount of an agrobacterial colony taken directly from the agar plate served as the DNA template.
  • a 4 ml LB medium culture (LB medium: 10 g / l peptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl; pH 7.0; 80 mg / l kanamycin) was taken from a single colony of positively transformed agrobacteria on a plate / I and 25 mg / l rifampicin), incubated overnight at 28 ° C.
  • a 400 ml LB medium culture (LB medium with 80 mg kanamycin / ml and 25 mg / ml rifampicin) was subsequently inoculated with this culture. After 12 hours of incubation at 28 ° C.
  • Plants grown on the selection plates were placed on soil after 3-4 weeks and incubated for 4-8 weeks in long-term conditions in climatic chambers (22-24 ° C during the day, 19 ° C at night; 65% relative humidity). The seeds were harvested after 6 weeks.
  • the integration of the antisense NCR gene into the genome of the transgenic plants was verified by PCR according to the conditions listed in Table 3.
  • Genomic DNA (isolation using the "DNeasy Plant Mini” kit from QIAGEN according to the manufacturer's instructions), which was prepared from leaf material of the corresponding transgenic lines, served as a template.
  • the NCR antisense pBinAR construct used for the transformation served as a positive control.
  • the intrinsic genomic gene which contains an intron and is therefore longer than the antisense NCR cDNA, as well as the antisense NCR cDNA itself could be detected by targeted selection of the primers.
  • the expected fragment length for the genomic NCR was approximately 1800 bp when using the primers
  • Transgenic plants which contained the construct pBinAR-NCR Antisense, showed high anthocyanin accumulations, i.e. heavily stressed leaves and veins, chlorotic leaves and a drastic growth delay: Transgenic plants (TO generation) only had 1-10% of the fresh mass of wild type plants 6 weeks of cultivation on earth in long-term conditions in climatic chambers (daytime 22-24 ° C, night 19 ° C; 65% relative humidity. The seeds that developed in the pods of the plants of the transformed TO generation were stunted and germinated in 100 % of all cases not.
  • NCR is suitable as a herbicide target.
  • an Arabidopsis cDNA coding for an NCR (Genbank Accession Number: AB007799) was overexpressed in E. coli bacteria.
  • the nucleic acid sequence coding for NCR was determined according to standard conditions via PCR (for example according to Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press; 34 cycles; annealing temperature 60 ° C; polymerization time 2 min) with pBinAR-NCR as template and the primers
  • NCR The activity of the NCR was compared with NCR which was recombinantly expressed according to Example 4 (Fukuchi-Mizutani et al., Plant Physiol. 119, pp. 353-361, 1999) or according to the method described by Jollie et al. (Plant Physiol. 85, pp. 457-462, 1987) was isolated, determined by the method of Mihara and Sato (Methods Enzymol., 52, 1978, pp. 102-108).
  • the reduction of potassium ferricyanide at 420 nm and 25 ° C. over a period of 5 to 15 minutes is measured photometrically.
  • Example 6 Identification of a functional analogue from tobacco
  • cDNA bank a cDNA library (hereinafter referred to as "binary cDNA bank") in a vector which can be used directly for the transformation of plants
  • mRNA was isolated from various plant tissues and analyzed using the TimeSaver cDNA synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) rewritten into double-stranded cDNA.
  • the first strand cDNA synthesis was performed with T 2 . 18 oligonucleotides carried out according to the manufacturer's instructions.
  • the method according to Kohci et al, 1995, Plant Journal 8, 771-776 was used, the cDNA being amplified by PCR with the oligonucleotide N1 under the conditions listed in Table 4.
  • the PCR product obtained was bound to the column matrix of the PCR purification kit (Qiagen, Hilden) and eluted with 300 mM NaP buffer, pH 7.0, 0.5 mM EDTA, 0.04% SDS.
  • the DNA was denatured in a boiling water bath for 5 minutes and then renatured at 60 ° C. for 24 hours. 50 l of the DNA were applied to a hydroxyl pathite column and this was washed 3 times with 1 ml of 10 mM NaP buffer, pH 6.8.
  • the bound single-stranded DNA was eluted with 130 mM NaP buffer, pH 6.8, precipitated with ethanol and dissolved in 40 // I water. Of these, 20 / I were used for a further PCR amplification as described above. After further enrichment of ssDNA, a third PCR amplification was carried out as described above.
  • the plant transformation vector for recording the cDNA population prepared as described above was produced by restriction enzyme digestion of the vector pUC18 with Sbfl and BamHI, purification of the vector fragment followed by filling in the overhangs with Pfu DNA polymerase and religation with T4 DNA ligase (Stratagene).
  • the construct thus produced is referred to below as pUC18Sbfl-.
  • the vector pBinAR was first cleaved with Notl, religated after filling in the ends, cleaved with Sbfl, religated after filling in the ends and then cleaved with EcoRI and HindIII.
  • the resulting fragment was ligated into a derivative of the binary plant transformation vector pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25: 989-994), which enables plants to be transformed using Agrobacterium and mediated kanamycin resistance in transgenic plants.
  • the construct generated here is referred to below as pSun12 / 35S.
  • pUC18Sbfl- was used as a template for a polymerase chain reaction (PCR) with the oligonucleotides V1 and V2 (see Table 3) and Pfu DNA polymerase.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the resulting fragment was ligated into the Smal digested pSun12 / 35S, generating pSunblues2. After cleavage with Notl, dephosphorylation with
  • pSunblues2 was ligated with the normalized and also NotL-cleaved cDNA population. After transformation in E.coli XMblue (Stratagene), the clones generated in this way were placed in microtiter plates.
  • the binary cDNA bank contains cDNAs in “sense” and in “antisense” orientation under the control of the flower Kohlmosaikvirus 35s Promotors, which can lead to "Cosuppressions” and "Antisene” effects after the transformation in tobacco plants.
  • NCR A sequence coding for NCR was identified using a digoxygenin-labeled probe produced using the DIG DNA Labeling Mix (Röche, Mannheim) according to the manufacturer's instructions, the plasmid pMAL-c2x-NCR under standard conditions using PCR with the primers
  • Rei 111 S'-ATGGATACCGAGTTTCTCCGAA-S '(SEQ ID NO: 21) and
  • the probe thus produced was used to screen the Nicotiana tabacum cDNA bank.
  • the cDNA bank was plated out with a titer of 2.5 ⁇ 10 5 plaque-forming units and analyzed using the plaque screening method (T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989). 12 phage populations were isolated, with which a second screening was carried out, whereby genetically uniform phage populations could be isolated, which were used for in vivo excision. Restriction analysis showed no differences between the cDNA clones and four clones with the largest insertions were selected for sequencing. The sequence data of these clones gave SEQ ID NO: 3, which is 77% identical to SEQ ID NO: 1.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase (E.C. 1.6.2.2), welches bei Nichtanwesenheit Wachstumsretardierungen sowie chlorotische Blätter bedingt, und durch die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 oder funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenz codiert wird, als Target für Herbizide. In diesem Rahmen werden funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:1 bereitgestellt. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung des Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung, welche NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase inhibieren. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung dieser über das Verfahren identifizierten Verbindungen als Herbizide.

Description

NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase als Target für Herbizide
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase (E.G. 1.6.2.2), welches bei Nichtanwesenheit Wachstumsretardierungen sowie chlorotische Blätter bedingt, und durch die Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 oder funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsauresequenz codiert wird, als Target für Herbizide. In diesem Rahmen werden funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:1 bereitgestellt. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung des Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung, welche NADH- abhängige Cytochrom b5 Reduktase inhibieren. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung dieser über das Verfahren identifizierten Verbindungen als Herbizide.
Das grundlegende Prinzip, Herbizide über Inhibierung eines definierten Targets zu i- dentifizieren ist bekannt (z.Bsp. US 5,187071, WO 98/33925, WO 00/77185). Generell besteht ein großer Bedarf, Enzyme zu detektieren, welche neue Targets für Herbizide darstellen könnten. Gründe hierfür sind auftretende Resistenzproblematiken von an bereits bekannten Targets wirkenden herbiziden Wirkstoffen und das ständige Bemühen neue herbizide Wirkstoffe zu identifizieren, die sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Verträglichkeit und/oder geringe Aufwandmengen auszeichnen.
Die Detektion von neuen Targets ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbunden, da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines Stoffwechselweges ist, häufig das Wachstum der Pflanze nicht weiter beeinflusst. Dies kann daran liegen, dass die Pfanze auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Existenz nicht be- kannt ist, oder dass das inhibierte Enzym nicht limitierend für den Stoffwechselweg ist. Ferner zeichnen sich pflanzliche Genome durch eine große funktionelle Redundanz aus. Im Genom von Arabidopsis thaliana liegen funktional äquivalente Enzyme im Vergleich zu Insekten oder Säugern häufiger in Genfamilien vor (Nature, 2000, 408(6814):796-815). Diese Annahme wird experimentell bestätigt durch die Tatsache, dass grosse Gen-Knock-out-Programme durch T-DNA- oder Transposoninsertion in Arabidopsis bisher weniger ausgeprägte Phänotypen lieferten als erwartet (Gurr. Op. Plant Biol. 4, 2001, pp.111-117).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, neue Targets zu identifi- zieren, die für das Wachstum von Pflanzen essentiell sind bzw. deren Inhibierung für die Pflanze zu einem verminderten Wachstum führen, sowie Verfahren bereitzustellen, welche zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung geeignet sind.
Die Aufgabe wurde gelöst durch die Verwendung eines Polypeptides mit der biologi- sehen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodiert durch eine Nukleinsauresequenz bestehend aus
a) einer Nukleinsauresequenz. mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz;
b) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt;
c) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktioneilen Ä- quivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten läßt; oder
d) einem funktioneilen Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1.
als Target für Herbizide.
An dieser Stelle werden nun weitere der in der Beschreibung verwendeten Begriffe definiert.
"Affinitäts-Tag": Bezeichnet ein Peptid oder Polypeptid, dessen kodierende Nukleinsauresequenz mit der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz direkt oder mittels eines Linkers über gängige Klonierungstechniken fusioniert werden kann. Das Affinitäts-Tag dient zur Isolierung, Anreicherung und/oder gezielten Aufreinigung des rekombinanten Zielproteins mittels Affinitäts-Chromatographie aus Gesamtzellextrakten. Der oben erwähnte Linker kann vorteilhaft eine Protease-Schnittstelle (z.B. für Thrombin oder Faktor Xa) enthalten, wodurch das Affinitäts-Tag bei Bedarf vom Zielprotein abgespal- ten werden kann. Beispiele für gängige Affϊnitäts-Tags sind das "His-Tag" z.B. von Quiagen, Hilden, "Strep-Tag", das "Myc-Tag" (Invitrogen, Carlsberg), das aus einer Chitin bindenden Domäne und einem Intein bestehende Tag von New England Biolabs, das Maltose-bindende Protein (pMal) von New England Biolabs und das sogenannte CBD-Tag von Novagen. Der Affinitäts-Tag kann dabei am 5'- oder 3'-Ende der kodierenden Nukleinsauresequenz mit der für das Zielprotein kodierenden Sequenz angebracht sein.
"Erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz": Dieser Begriff wird weiter unten definiert.
"Expressionskassette": Eine Expressionskassette enthält eine erfindungsgemäße Nukleins uresequenz funktionell verknüpft mit mindestens einem genetischen Kontrollele- ment, wie einem Promotor, sowie vorteilhaft mit einem weiteren Kontrollelement, wie einem Terminator. Die Nukleinsauresequenz der Expressionskasette kann beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA- Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon sein. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form, extra-chromosomal oder integriert in das Ge- nom vorliegen. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Auch artifizielle Nukleinsäuresequenzen sind hierbei geeignet, solange sie die Expression eines durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuesequenz kodierten Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase in einer Zelle oder einem Organismus ermöglichen. Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen erzeugt werden, die bezüglich der Kodon-Nutzung des von den zu transformierenden Organismen optimiert wurden.
Alle vorstehend erwähnten Nukleotid-Sequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragment-Kondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleotidbausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise in bekannter Weise nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander erfolgt über allgemeine Klonierungstechniken wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T . Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind.
"Funktionelle Verknüpfung": Unter einer funktioneilen oder operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung regulativer Sequenzen bzw. genetischer Kontrollelemente derart, daß jede der regulativen Sequenzen bzw. jedes der genetischer Kontrollelemente ihre Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
"Funktionelle Äquivalente" beschreiben hier Nukleinsäuresequenzen, die unter Standardbedingungen mit der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 oder Teilen der SEQ ID NO:1 hybridisieren und befähigt sind, die Expression eines Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase in einer Zelle oder einem Organismus zu bewirken.
Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 10- 50 bp, vorzugsweise 15-40 bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-500 bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure/Oligonukleotid, der Länge des Fragmentes oder der vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart, d.h. DNA oder RNA, für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispiels- weise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardhybridisierungsbbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Kon- zentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie bei- spielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fach- mann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, "Current Proto- cols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford Univer- sity Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter einem funktioneilen Äquivalent der SEQ ID NO:1 versteht man weiterhin auch Nukleinsäuresequenzen die mit der SEQ ID NO:1 bis zu einem definierten Prozentsatz homolog bzw. identisch sind und ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodieren.
Es werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der vorstehend genannten Nuk- leinsäuresequenzen erhält. Beispielhaft können solche Modifikationen durch dem Fachmann geläufige Techniken, wie "Site Directed Mutagenesis", "Error Prone PCR", "DNA-shuffling" (Nature 370, 1994, pp.389-391) oder "Staggered Extension Process" (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261) erzeugt werden. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung von DNA zur Verkürzung der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon- Optimierung oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifizierte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, müssen trotz abweichender Nukleinsauresequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen.
Der Begriff des funktionellen Äquivalents kann sich auch auf das durch die entsprechende Nukleinsauresequenz kodierte Aminosäuresequenz beziehen. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktionelles Äquivalent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2 bis zu einem definierten Prozentsatz identisch bzw. homolog ist.
Funktionelle Äquivalente umfassen somit natüriich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch adaptierte Nukleinsäuresequenzen bzw. die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen. "Genetische Kontrollsequenz" beschreibt Sequenzen, die einen Einfluss auf die Transkription und gegebenenfalls Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in prokaryotischen oder eukaryontischen Organismen haben. Beispiele hierfür sind Promotoren, Terminatoren oder sogenannte "enhancer" Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so modifiziert worden sein, dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression des Zielgens modifiziert, also erhöht oder erniedrigt wurde. Die Auswahl der Kontrollsequenz erfolgt abhängig vom Wirtsorganismus oder Aus- gangsorganismus. Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'- untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weite- re Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, sowie die Chromatinstruk- tur beeinflussende Sequenzen (z.B. Matrix attachment regions (MAR's)) die die ex- pressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Bei- spiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991;
266(26): 17131 -17135), Kälte- und Trockenstress (Plant Gell 1994, (6): 251-264) und Hitzestress (Molecular & General Genetics, 1989, 217(2-3): 246-53) beschrieben.
"Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge der kürzeren der beiden Sequenzen definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.2 Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin, USA) unter Einstellung folgender Parameter für Polypeptide
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2,003
und folgender Parameter für Nukleinsäuren
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10.000 Average Mismatch: -0.000
berechnet wird. Anstelle des Begriff "homolog" oder "Homologie" wird im Folgenden auch gleichbedeutend der Begriff Identität verwendet.
"Mutationen" von Nuklein- oder Aminosäuresequenzen umfassen Substitutionen (=Ersetzungen), Additionen (Hinzufügung), Deletionen (Löschung), Inversion (Veränderungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann, wobei jedoch insgesamt die funktioneilen Eigenschaften des Zielproteins im wesentli- chen beibehalten werden.
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsauresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsauresequenz zumindest an 5'- oder 3'- Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 100 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am meisten bevorzugt mindestens 5000 bp.
"Pflanzen" im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke zu verstehen.
"Reaktionszeit" bezeichnet die Zeit, die man für die Durchführung eines Aktivitätstests bis zum Erhalt einer signifikanten Aussage über eine Aktivität benötigt und hängt sowohl vonder spezifischen Aktivität des im Test eingesetzten Proteins als auch von der verwendeten Methode und der Empfindlichkeit der verwendeten Geräte ab. Dem Fachmann ist die Ermittlung der Reaktionszeiten bekannt. Bei auf photometrischen Methoden basierenden Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung liegen die Reaktionszeiten beispielsweise im allgemeinen zwischen > 0 bis 120 Minuten.
"Rekombinante DNA" beschreibt eine Kombination von DNA-Sequenzen herstellbar durch rekombinante DNA-Technologie. "Rekombinate DNA-Technologie": allgemein bekannte Techniken zur Fusionierung von DNA-Sequenzen (z.B. beschrieben in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
"Replikationsursprünge" gewährleisten die Vermehrung der erfindungsgemäßen Ex- pressionskassetten oder Vektoren in Mikroorganismen und Hefen z.B. der pBR322 ori oder der P15A ori in E. coli (Sambrook et al.: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und der ARS1 ori in Hefe (Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068).
"Reportergene" kodieren für leicht quantifizierbare Proteine. Über Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung (Eigenfarbe) oder Enzymaktivität kann mittels dieser Gene eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes vorge- nommen werden. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) wie das "green fluorescence pro- tein" (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1 ):44-47; Chui WL et al., Gurr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5):912-8, 1997), die Chloramphenicolacetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sei 1996, 116:59- 72; Scikantha, J Bact 1996, 178:121 ; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324- 414), sowie Luziferasegene, im allgemeinen die yS-Galactosidase oder die /?- Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das Ura3-Gen.
"Selektionsmarker" verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika, oder andere toxische Verbindungen: Beispielhaft zu nennen seien hier das Neomycin-Phosphotransferase- Gen, das eine Resistenz gegen die Aminoglycosid-Antibiotika Neomycin (G 418), Ka- namyein, Paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), das sul Gen kodierend für eine mutierte Dihydropteroat Synthase (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15(1): 127-136), das Hygromycin B Phosphotransferase-Gen (Gen Bank Accession NO: K 01193) und das shble Resistenzgen, das eine Resistenz gegen die Bleomycin Antibiotika wie zB. Zeocin verleiht. Weitere Beispiele für Selektionsmarker- Gene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder Phosphinotricin etc. verleihen oder solche, die eine Antimetaboliten- Resistenz verleihen, zum Beispiel das dhfr-Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994) 142-149). Geeignet sind ferner Gene wie trpB oder hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sei U S A. 85 (1988) 8047-8051). Geeignet ist auch das Gen der Mannose-Phosphat Isomerase (WO 94/20627), das ODC (Ornithin- Decarboxylase) Gen (McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus (Tamura K etal., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338). "Transformation" beschreibt einen Prozess zur Einführung heterologer DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt das Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus
"Target/Target Protein": ein Polypeptid codiert über die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz, welches ein Enzym im klassischen Sinne sein kann oder z.B. ein Strukturprotein, ein für Entwicklungsprozesse relevantes Protein, Regulationsproteine wie Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Phosphatasen, Rezeptoren, Untereinheiten von Kanälen, Transportproteine, regulatorische Untereinheiten die einem Enzymkomplex eine substrat- oder Aktivitätsregulation verleihen. Allen Targets oder Wirkorten gemein ist dabei, dass deren funktionale Anwesenheit essentiell für das Überleben oder die normale Entwicklung und das Wachstum sind.
"Transgen": Bezogen auf eine Nukleinsauresequenz, eine Expressionskassette oder einen Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz oder einen Organismus transformiert mit der vorstehend genannten Nukleinsauresequenz, Expressi- onskassette oder Vektor beschreibt der Ausdruck transgen alle solche durch gentech- nisehe Methoden hergestellten Konstruktionen, in denen sich entweder die Nukleinsauresequenz des Zielproteins oder eine mit der Nukleins uresequenz des Zielproteins funktioneil verknüpfte genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination der vorstehend genannten Möglichkeiten sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden. Die Modifikation kann hier beispielsweise über Mutation eines oder mehrerer Nukleotidreste der entsprechenden Nukleinsauresequenz erreicht werden.
Die Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 codiert für eine spezifisch von NADH abhängige Cytochrom b5 Reduktase (E.G. 1.6.2.2).
Charakteristisch für höhere Eukaryoten ist das an der Membran des endoplasmati- schen Retikulums lokalisierte Elektronen-Transfersystem besteht aus einer NADH- abhängigen Cytochrom b5 Reduktase und Cytochrom b5 (Cytbδ). Die NADH- abhängige Cytochrom b5 Reduktase überträgt mit einem FAD als prosthetischer Grup- pe dabei Elektronen von NADH auf Cytb5, ein Häm-haltiges Protein. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase bezeichnet somit ein Enzym, welches in der Lage ist, mit einem FAD als prosthetischer Gruppe dabei Elektronen von NADH auf Cytb5, ein Häm-haltiges Protein, zu übertragen. Die enzymatische Aktivität eines Enzyms mit der biologischen Aktivität einer NADH- abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kann mittels geeigneter Aktivitätstests bestimmt werden, wie sie beispielhaft weiter unten beschrieben werden (s. u.a. auch Beispiel 5).
In Pflanzen wurde Cytbδ als Komponente des Elektronentransports bei der Modifikati- on von Fettsäuren beschrieben (Kearns et al, 1991 ; Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, Oxford, Seite 751). Vermutlich werden die Elektronen anschließend von Cytochrom b5 weiter auf Desaturasen oder P450 Monooxygenasen übertragen (Fukuchi-Mizutani, Plant Physiology, 119; 353-361 ; 1999). Plfanzliche NADH- abhängige Cytochrom b5 Reduktasen werden in nahezu allen Zelltypen gefunden, ins- besondere in unreifen Samen (Fukuchi-Mizutani, Plant Physiology, 119; 353-361; 1999).
Erstmals isoliert und charakterisiert wurde die NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus menschlichen Erythrozyten (Yubisui T, Takeshita M., J Biol Chem., 1980;255(6):2454-1456) und seitdem auch aus vielen anderen Organismen. Bekannt sind Nukleinsäuresequenzen pflanzlicher NADH-abhängiger Cytochrom b5 Reduktasen z.B. aus Arabidopsis (Gen Bank Acc. No. AB007799; Mizutani und Fukuchi- Mizutani, Plant Physiol. 119, 353-361; 1999) sowie ESTs pflanzlicher NADH- abhängiger Cytochrom b5 Reduktasen aus Medicago truncatula (Gen Bank Acc. No. AA660929; Covitz,P.A. et al. Plant Physiol. 117 (4), 1325-1332 (1998) Identität zur SEQ ID NO:1 = 68.763%, Identität mit SEQ ID NO:2 = 46,897%), Oryza sativa (Gen Bank Acc. No. BE039960; Identität zur SEQ ID NO:1 = 69.457%, Identität mit SEQ ID NO:2 = 75,912%), Solanum tuberosum (Gen Bank Acc. No. BE340917, Identität zur SEQ ID NO:1 = 75.564%, Identität mit SEQ ID NO:2 =81,675%) und Beta vulga- ris (Gen Bank Acc. No. BI096337; Identität zur SEQ ID NO:1 = 52.727%; Identität mit SEQ ID NO:2 = 39,552%) und Kürbis (Cucurbita maxima; Gen Bank Acc. No. AF274589; Identität mit SEQ ID NO: 1=56.703%, Identität mit SEQ ID NO:2 =43.621%).
NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus menschlichen Erythrozyten kann durch millimolare Konzentrationen von Inositol Hexaphosphat gehemmt werden (Pal- mieri et al, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1990, 280(1), 224-228). The- noyltrifluoraceton zeigt bei 0.5 mM eine 50%ige Hemmung der NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus Rattenleber-Mikrosomen (Golf et al, Biol. Chem. Hoppe- Seyler 1985, 366, 647-653). Weitere Substanzen, die NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus verschiedenen Organismen hemmen können, sind Amytal, Mepacrin, Dicoumarol (Golf et al; 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 366, pp. 647-653), oder N- Ethylmaleimide und Atebrin (Tamura et al; 1983, J. Biochem. 94, pp. 1547-1555). Inhibitoren für pflanzliche NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktasen wurden jedoch bisher nicht beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass Pflanzen, in denen gezielt die Aktivität der NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase verringert wurde, Phänotypen aufwiesen, die mit durch Herbizdidapplikation erzeugten Phänotypen vergleichbar sind. Beobachtet wurden Wachstumsretardierungen und nekrotische, gestresste Blätter sowie in einigen Fällen das Absterben ganzer Pflanzen oder von Pflanzenteilen. Die Schoten dieser Pflanzen waren entweder leer oder enthielten verkümmerte Samen, die allesamt nicht in der Lage waren, zu keimen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von einem Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodiert durch eine Nukleinsauresequenz bestehend aus
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz;
b) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt;
c) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktioneilen Ä- quivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten läßt; oder
d) einem funktioneilen Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1;
als Target für Herbizide. Die funktioneilen Äquivalente gemäß c) zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Funktionalität aus, d.h. sie haben die physiologische Funktion einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase.
Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO:1 weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:1 von mindestens 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%,59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,68%,69% und 70% bevorzugt mindestens 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76% besonders bevorzugt mindestens 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf. Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO:2 weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:2 von mindestens 39%, 40%, 41%, 42%," 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%,59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%o, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% besonders bevorzugt mindestens 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% ganz besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%), 99% auf.
Beispiele für funktionelle Äquivalente sind die bereits oben erwähnten für NADH- abhängigen Cytochrom b5 Reduktase codierenden pflanzlichen Nukleinsäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase aus Medicago truncatula (Gen Bank Acc. No. AA660929; Covitz,P.A. et al. Plant Physiol. 117 (4), 1325-1332 (1998)), Oryza sativa (Gen Bank Acc. No. BE039960), So- lanum tuberosum (Gen Bank Acc. No. BE340917), Beta vulgaris (Gen Bank Acc. No. BI096337) und Kürbis (Cucurbita maxima; Gen Bank Acc. No. AF274589).
Weiterhin werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen beansprucht, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodieren, enthaltend einen Teilbereich umfassend:
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:3 mit einer Identität von mindestens 77% zu der SEQ ID NO:3.
d) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Ä- quivalents der SEQ ID NO:4, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:4 von mindestens 87% aufweist, ableiten läßt.
Ebenfalls beansprucht werden die durch die vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen kodierten Polypeptide. Die funktionelle Äquivalente zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Funktionalität aus, d.h. sie haben die physiologische Funktion einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase.
Der Begriff "umfassend" oder "umfassen" bezogen auf Nukleinsäuresequenzen meint, daß die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz am 3' oder am 5' Ende zusätzliche Nukleinsäuresequenzen enthalten kann, wobei die Länge der zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen 75bp am 5' und 50bp 3' Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise 50bp am 5' und 10bp am 3' Ende nicht überschreitet.
Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO:3 weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:3 von mindestens 77%, 78%, 79%, 80% bevorzugt mindestens 81%), 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf.
Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO:4 weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:4 von mindestens 87%) vorzugsweise mindestens 88%), 89%), 89%> bevorzugt mindestens 90%, 91%, 92%, 93% besonders bevorzugt mindestens 94%>, 95%, 96% ganz besonders bevorzugt mindestens 97%, 98%, 99% auf.
Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase bestehend aus
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Ä- quivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten läßt; oder
d) einem funktionellen Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1; oder
Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase enthaltend einen Teilbereich urπfas- send: a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen
Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:3 mit einer Identi- tat von mindestens 86% zu der SEQ ID NO:3; oder
d) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Ä- quivalents der SEQ ID NO:4, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:4 von min- destens 87% aufweist, ableiten läßt;
werden im folgenden als "erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen" bezeichnet. Die durch eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz kodierten Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase werden im fol- genden der Einfachheit halber als "NCR" bzeichnet.
NCR verursachen in reduzierter Menge Wachstumsretardierungen sowie nekrotische Blätter in Pflanzen. Eine Reduktion des Polypeptides bedeutet, daß die Menge des Polypeptides über gentechnische Methoden reduziert wird. Verglichen wird eine derar- tig modifizierte Pflanze mit einer Pflanze, die bezüglich dieses Polypeptides keine genetischen Modifikationen aufweist, ansonsten aber mit dem Genotyp der genetisch manipulierten Pflanze identisch ist unter identischen Wachstumsbedingungen.
Die Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen neue Targets für Her- bizide dar, welche die Bereitstellung neuer Herbizide zur Bekämpfung unerwünschter Pflanzen ermöglichen.
Unter unerwünschten Pflanzen sind im weitesten Sinne alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind, zum Beispiel:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen: Sinapis, Lepidium, Galiυm, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xan- thium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum. Monokotyle Unkräuter der Gattungen: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagitiaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.
Die SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 oder Teile der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen können für die Herstellung von Hybridisierungssonden verwendet werden, über welche z.B. die entsprechenden Vollängengene und/oder funktionelle Äqui- valente der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 isoliert werden können. Die Herstellung dieser Sonden sowie die Durchführung der Experimente ist bekannt. Sie kann zum Beispiel über die gezielte Herstellung radioaktiver oder nicht radioaktiver Sonden mittels PCR und der Verwendung von entsprechend markierten Oligonukleotiden mit anschließenden Hybridisierungsexperimenten erfolgen. Die hierfür erforderlichen Techno- logien sind beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) aufgeführt. Die entsprechenden Sonden können weiterhin mittels Standardtechnologien (Lit. SDM bzw. random Mutagenesis) so modifiziert werden, dass sie für weitere Zwecke eingesetzt werden können, z.B. als Sonde, die spezifisch zu mRNA sowie den entsprechenden codierenden Sequenzen hybridisiert zwecks Analyse der entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen.
Des weiteren können die oben genannten Sonden für die Detektion und Isolation von funktionellen Äquivalenten der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 aus anderen Pflan- zenspezies aufgrund von Sequenzidentitäten verwendet werden. Hierbei wird ein Teil oder die gesamte Sequenz der entsprechenden SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 als Sonde zum Screening in einer genomischen oder cDNA Bank der entsprechenden Pflanzenspezies oder in einer Computer-Recherche nach Sequenzen funktioneller Ä- quivalente in elektronischen Datenbanken verwendet.
Bevorzugte Pflanzenspezies sind hierbei die bereits eingangs erwähnten unerwünschten Pflanzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Expressionskassetten enthaltend
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer Nukleinsauresequenz umfassend einen Teilbereich enthaltend eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:4 dargestellten Aminosäuresequenz ab- leiten läßt; oder funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:3 mit einer Identität von mindestens 86% zu der SEQ ID NO:3; eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:4, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:4 von mindestens 87% aufweist, ableiten läßt;
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b);
sowie die Verwendung von Expressionskassetten enthaltend
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer erfindungs- gemäßen Nukleinsauresequenz;
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b);
zur Expression einer NCR, die in "in vitro" Testsystemen verwendet werden kann. Beide Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Expressionskasetten werden im folgenden als erfindungsgemäße Expressionskassette bezeichnet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette am 5'-Ende der kodierenden Sequenz einen Promotor und am 3'-Ende Transkriptions-Terminations-Signal und gegebenenfalls weitere genetische Kontrollsequenzen, welche mit der dazwischenliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz funktioneil verknüpft sind.
Unter den erfindungsgemäßen Expressionskassetten sind auch Analoga zu verstehen, die zum Beispiel durch eine Kombination der einzelnen Nukleinsäuresequenzen auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte), auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Kotransformation) oder durch sequenzielle Transformation zustande kommen können.
Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen nach Punkt a) für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder für Vektoren enthaltend erfindungsgemäße Expressionskasetten sind beispielsweise Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, Ipp-, lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, Λ-PR- oder im Λ-PL-Promotor, die zur Expression der NCR in gram-negativen Bakterienstämmen verwendet werden können. Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den Promotoren amy und SPO2, die zur Expression der NCR in gram-positiven Bakterienstämmen verwendet werden können, sowie in den Hefe- oder Pilzpromotoren AUG1, GPD-1 , PX6, TEF, CUP1 , PGK, GAP1 , TPI, PHO5, AOX1 , GAL10/CYC1 , CYC1 , OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa oder NMT oder Kombinationen der vorstehend genannten Promotoren (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11 (7): 629-40; Romanos et al. Yeast 1992 Jun;8(6):423-88; Benito et al. Eur. J. Plant Pathol. 104, 207-220 (1998); Cregg et al. Biotechnology (N Y) 1993 Aug;11(8):905-10; Luo X., Gene 1995 Sep 22; 163(1 ): 127- 31 ; Nacken et al., Gene 1996 Oct 10;175(1-2): 253-60; Turgeon et al., Mol Cell Biol 1987 Sep;7(9):3297-305) oder den Transkriptionsterminatoren NMT, Gcy1, TrpC, AOX1, nos, PGK oder CYC1 (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11(7):629-40; Brunelli et al. Yeast 1993 Dec9(12): 1309-18; Frisch et al., Plant Mol. Biol. 27 (2), 405-409 (1995); Scorer et al., Biotechnology (N.Y.) 12 (2), 181-184 (1994), Genbank acc. num- ber Z46232; Zhao et al. Genbank acc number : AF049064; Punt et al., (1987) Gene 56 (1), 117-124) enthalten, die zur Expression der NCR in Hefestämmen verwendet werden können.
Als zur Expression in Insektenzellen geeignete genetische Kontrollsequenzen sind exemplarisch der Polyhedrin-Promotor sowie der p10-Promotor (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio/Techn. 6, 47-55) zu nennen.
Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression der NCR in Zellkultur sind sind neben Polyadenylierungssequenzen wie z.B. aus Simian Virus 40 eukaryontische Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cyto- megalovirus oder Simian Virus 40.
Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression der NCR in Pflanzen sind in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940) oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten, vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt sind Promotoren viralen Ursprungs wie der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohlmosaik- virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294; Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812). Weitere bevorzugte konstitutive Promotoren sind zum Beispiel der Promotor der Nopa- linsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29:637-649), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991 ). Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor als genetische Kontrollsequenz enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Pro- motoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361- 366), ein durch Salicylsäure induzierbarer (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfona- mid-induzierbarer (EP-A-0388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können ebenfalls verwendet werden.
Geeignet sind ferner Promotoren die eine gewebe- oder organspezifische Expression z.B. in Antheren, Ovarien, Blüten und Blütenorganen, Blättern, Schließzellen, Tricho- men, Stengel, Leitgeweben, Wurzeln und Samen vermitteln. Ebenfalls geeignet sind hier neben den oben genannten konstitutiven Promotoren, insbesondere solche Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1 ,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 245). Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseo- lins (US 5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989;1(9):839-53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262:12196-12201), des Legumins (Shir- sat A et al., Mol Gen Genet. 1989;215(2):326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991 , 225(3):459-67) des Napin Gens (Stalberg K, et al., L. Planta 1996, 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al., Mol Gen Genet 1991 , 225: 121- 128; Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090).
Weitere als genetische Kontrollsequenzen geeignete Promotoren sind beispielsweise spezifische Promotoren für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1 ) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593) oder spezifische Piastiden- oder Chro- moplasten-Promotoren, wie beispielsweise der RNA-Polymerase Promotor (WO 97/06250) oder auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nr U87999) oder ein anderer No- dien-spezifischer Promotor wie in EP-A 249676 können vorteilhaft verwendet werden.
Unter zusätzlichen Funktionselementen b) sind beispielhaft aber nicht einschränkend Reportergene, Replikationsursprünge, Selektionsmarker und sogenannte Affinitäts- Tags, fusioniert mit der NCR direkt oder mittels eines Linkers optional enthaltend eine Protease-Schnittstelle zu verstehen. Weitere geeignete zusätzliche Funktionselemente sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das Peroxisom, das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Grit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die mindestens eine Kopie der erfindungsge- mäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthalten.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nuk- leinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem line- arisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual." 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant scien- ce, 5, 2000) beschrieben.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette sowie davon abgeleitete Vektoren können zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen und eukaryontischen, nicht humanen Zellen (z.B. Insektenzellen) mit dem Ziel der rekombinanten Herstellung der NCR eingesetzt werden, wobei sich die Herstellung einer geeigneten Expressionskassette nach dem Organismus, in welchen das Gen exprimiert werden soll, richtet.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Hierbei kann das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n), der Expressionskassette oder des Vektors in die entsprechenden Organismen (Transformation) prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) "Current protocols in molecu- lar biology", John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1 , (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, 1994, Aeademic Press entnehmen.
Für dikotyle Pflanzen können die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden. Geeignete Methoden sind das biolisti- sche Verfahrens oder durch Protoplastentransformation (vergl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New Y- ork-Basel-Cambridge), die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, herausge- geben von S.D. Kung und R. Wu, Aeademic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.BioI. 42 (1991) 205-225) beschrieben.
Die Transformation mittels Agrobakterien sowie die für die Transformation zu verwendenden Vektoren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur ausführlich be- schrieben (Bevan et al., Nucl. Aeids Res. 12 (1984) 8711. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir- Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (; Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187) , EP A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Grit. Rev. Plant. Sei., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287).
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobacterium basierender Vek- toren wurde beschrieben ( Chan et al, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al,
Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al; Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11,(1992) 76-80; May et al; Biotechnology 13 (1995) 486-492; Con- ner und Domisse; Int. J. Plant Sei. 153 (1992) 550-555; Ritchie et al; Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al; Biotechnology 11 (1992), 667-674; Ritala et al, Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spencer et al, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625- 631) die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen ; die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z.B. WO 95/06128; EP 0513849 A1; EP 0465875 A1 ; EP 0292435 A1; Fromm et al, Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziei et al, Biotechnology 11 (1993) 194-200; Moroc et al, Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726). Bei der Transformation von filamentösen Pilzen bieten sich zum einen die Herstellung von Pro- toplasten und Transformation mit Hilfe von PEG (Wiebe et al. (1997) Mycol. Res. 101 (7): 971-877; Proctor et al. (1997) Microbiol. 143, 2538-2591), zum anderen die Transformation unter zur Hilfe nähme von Agrobacterium tumefaciens (de Groot et al. (1998) Nat. Biotech. 16, 839-842) an.
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben z.B. für Gerste ( Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al, s.o.; Weizen ( Nehra et al, Plant J. 5(1994) 285-297).
Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfaifa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies verwendet werden, z.B. indem verwun- dete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Die durch Transformation mit einer der oben beschriebenen Ausführungsformen einer Expressionskassette, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz oder einem Vektor, enthaltend die vorstehend genannte Expressionskassette, hergestellten transgenen Organismen sowie die mittels Expression aus dem transgenen Organismus erhältliche rekombinante NCR sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von transgenen Organismen enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionskassette z.B. für die Bereitstellung rekombinanten Proteins und/oder die Verwendung dieser Organismen in in vivo Testsystemen.
Bevorzugte Organismen für die rekombinante Expression sind sind neben Bakterien, Hefen, Moose, Algen, Pilze auch eukaryontische Zellinien.
Bevorzugte Moose sind Physcomitrella patens oder weitere in Kryptogamen, Bd.2, Moose, Farne, 1991 , Springer Verlag (ISBN 3540536515), beschriebene Moose.
Innerhalb der Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Flavobacteri- um, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis oder Anabena bevorzugt.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Schizosaccheromyces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian Chem Engr. Secti- on B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze. Bevorzugte Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, f riticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Bei- spiel Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohiarten oder Canola; Legumino- sae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika; Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula; Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini, oder Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe oder verschiedene Baum-, Nuss- und Weinspecies.
Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet wie beispielsweise C. elegans.
Bevorzugt ist auch die Verwendung von Expressionsystemen und Vektoren, die öffentlich zugänglich oder kommerziell erhältich sind.
Zur Verwendung in E. coli Bakterien sind die typischen vorteilhaften, kommerziell erhältlichen Fusions- und Expressionsvektoren pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A, die pTrc-Vektoren (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) der "pKK233-2" von CLONTECH, Palo Alto, CA und die "pET"-, und die "pBAD"-Vektor-Serien von Stratagene, La Jolla zu nennen.
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES-Derivate, pGAPZ- Derivate, pPICZ-Derivate sowie die Vektoren des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf9, Sf21 oder Hi5 Zellen, welche über rekombinante Baculoviren infiziert werden. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31- 39). Weiterhin genannt seien die Baculovirus Expressionssysteme "MaxBac 2.0 Kit" und "Insect Select System" von Invitrogen, Calsbald oder "BacPAK Baculovirus Ex- pressionssystem" von CLONTECH, Palo Aito, CA. Insektenzellen eignen sich in besonderer Weise zur Überexpression eukaryontischer Proteine, da sie posttranslationale Modifikationen der Proteine durchführen, die in Bakterien und Hefen nicht möglich sind. Die Handhabung von Insektenzellen in Zellkultur sowie ihre Infektion zur Expression von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und können in Analogie zu bekannten Methoden erfolgen (Luckow und Summers, Bio/Tech. 6, 1988, pp.47-55; Glover and Harnes (eds) in DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205-244).
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich wie obenstehend erwähnt in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. A- cid. Res. 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDMδ und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EM- BO J. 6:187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Die mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformierten Organismen werden unter dem Begriff "erfindungsgemäßer transgener Organismus" bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von NCR in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Verbin- düngen mit herbizider Wirkung die folgenden Schritte:
i. Inkontaktbringen einer NCR mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbindung(en) an die NCR erlauben; und ii. Nachweis, ob die Testverbindung an die NCR aus i) bindet; oder
iii. Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität der NCR aus i) reduziert oder blockiert; oder
iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression der NCR aus i) reduziert oder blockiert.
Der Nachweis gemäß Schritt (ii) des oben stehenden Verfahrens kann anhand von Techniken, welche die Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand aufzeigen, erfolgen. Hierbei kann entweder die Testverbindung oder das Enzym eine detektierbare Markierung enthalten, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope, chemilumineszie- rende oder enzymatische Markierung. Beispiele für enzymatische Markierungen sind Meerrettich Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Luzifierase. Die anschließende Detektion richtet sich nach der Markierung und ist dem Fachmann bekannt.
Hierbei sind insbesondere fünf bevorzugte Ausführungsformen zu nennen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch für Hochdurchsatzmethoden (High Troughput Screening, HTS) geeignet sind:
1. Über Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994) 11753-11575) läßt sich die durchschnittliche Diffusionsrate eines Fluoreszenzmoleküls in Abhängigkeit zur Masse in einem kleinen Probenvolumen bestimmen. Durch Messen der Massenänderung bzw. der daraus resultierenden veränderten Diffunsionsrate einer Testverbindung beim Binden an die NCR läßt sich FCS zur Bestimmung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen einsetzten. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren so konzipiert sein, dass eine durch ein Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch weitere
Testverbindungen verdrängt wird ("Verdrändungsassay"). Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
2. Die Fluoreszenzpolarisation nutzt die Eigenschaft eines mit polarisiertem Licht angeregten ruhenden Fluorophors ebenfalls wieder polarisiertes Licht zu emittieren. Kann der Fluorophor allerdings während des angeregten Zustands rotieren, so geht die Polarisation des emittierten Fluoreszenzlichts mehr oder weniger verloren. Bei sonst gleichen Bedingungen (z.B. Temperatur, Viskosität, Lösungsmittel) ist die Rotation eine Funktion der Molekülgröße, womit man über das Mess- signal eine Aussage über die Größe des am Fluorophor gebundenen Rests tref- fen kann (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300). Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung an die NCR aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebe- nen "Verdrängungsassays" konzipiert sein. Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
3. Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer" (FRET) basiert auf der strahlungslosen Energieübertragung zwischen zwei räumlich benachbarten Fluoreszenzmolekü- len unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung ist die Überlappung des
Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des Akzeptormoleküls. Durch Fluoreszenzmarkierung der NCR und den auf Bindung Tetsverbindung kann mittels FRET die Bindung gemessen werden (Cytometry 34, 1998, pp. 159-179). Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein. Eine besonders geeignete Ausführungsform der FRET Technologie ist die "Homogenous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), wie sie von Packard BioScience vertrieben wird. Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
4. Surface Enhanced-Laser Desorption/Ionisation (SELDl) in Kombination mit einem "Time of Flight" Massenspektrometer (MALDI-TOF) ermöglicht die schnelle Analyse von Molekülen auf einem Träger und kann zur Analyse von Protein- Ligand Wechselwirkungen verwendet werden (Worral et al., (1998) Anal. Bio- chem. 70:750-756). In einer bevorzugten Ausführungsform immobilisiert man nun die NCR auf einem geeigneten Träger und inkubiert diesen mit der Testverbindung. Nach einem oder mehreren geeigneten Waschschritten kann man die an die NCR zusätzlich gebundenen Moleküle der Testverbindung mittels der oben erwähnten Methodik detektieren und somit Inhibitoren selektieren. Die so identifi- zierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
5. Die Messung von Oberflächen Plasmonenresonanz basiert auf der Änderung des Brechnungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer Testverbindung an ein auf besagter Oberfläche immobilisierten Protein. Da die Änderung des Bre- chungsindex für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, kann diese Methode prinzipiell auf jedes Protein angewendet werden (Lindberg et al. Sensor Actua- tors 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). Die Messung kann beipielsweise mit Hilfe der von Biacore (Freiburg) vertriebenen auf Oberflä- chen-PIasmonenresonanz basierenden Analyseautomaten in einem Durchsatz von derzeit bis zu 384 Proben pro Tag durchgeführt werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer Testverbindung an die NCR aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein. Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Substanzen können anschließend in einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ihre herbizide Wirkung überprüft werden.
Auch besteht die Möglichkeit, über Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der NCR mittels Röntgenstrukturanalyse weitere potentielle herbizide Wirkstoffe mittels "Molecular Modelling" zu detektieren. Die Herstellung von für die Röntgenstrukturanalyse benötigten Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen dieser Messungen, die Detektion einer Bindungstelle im Protein sowie die Vorhersage möglicher Inhibitorstrukturen sind dem Fachmann bekannt. Über "Molecular Modelling" ist prinzipiell auch eine Optimierung der über die oben genannten Verfahren identifizierten Verbindungen möglich.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und ii) basiert, besteht darin, daß
i. eine NCR in einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß eine NCR enthält, kultiviert wird;
ii. die NCR aus Schritt i) im Zellaufschluss des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und
iii. eine Verbindung selektiert wird, welche die Aktivität der NCR reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten NCR mit der Ak- titivtät einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten NCR ermittelt wird.
Die NCR enthaltende Lösung kann aus dem Lysat des ursprünglichen Organismus oder des transgenen, mit einer erfindungsgemäßen Expressionskasette transformierten Organismus bestehen. Falls erforderlich kann die NCR partiell oder vollständig ü- ber gängige Methoden aufgereinigen werden. Eine allgemeine Übersicht über gängige Techniken zur Reinigung von Proteinen sind beispielsweise in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben. Bei rekombinanter Darstellung kann eine Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Proteins über nach dem Fachmann bekannten Affinitätschromoatographie erfolgen. Die Aufreinigung der NCR aus menschlichem Gewebe kann beispielsweise nach dem Verfahren von Jollie et al. (Plant Physiol. 85, pp. 457-462, 1987) erfolgen.
Die für in vitro Verfahren benötigte NCR kann somit entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus oder aus einem Organismus, der eine NCR Aktivität enthält, isoliert werden, vorzugsweise aus einer un- erwünschten Pflanze, wobei unter dem Begriff der unerwünschten Pflanze die eingangs erwähnten Spezies zu verstehen sind.
Zur Identifizierung von herbiziden Verbindungen wird nun die NCR mit einer Testver- bindung inkubiert. Nach einer Reaktionszeit wird die Aktivität der mit der Testverbin- düng inkubierten NCR mit der Aktitivtät einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten NCR ermittelt. Bei Inhibition der NCR beobachtet man eine signifikante Abnahme der Aktivität im Vergleich zur Aktivität des nicht inhibierten erfindungsgemäßen Polypeptides, wobei eine Abnahme von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% bis hin zu einer 100% Reduktion (Blockierung) erzielt wird. Bevorzugt mindestens 50% Hemmung bei Konzentrationen derTestverbindung von lO^M, bevorzugt bei lO^M, besonders bevorzugt von lO^M bezogen auf Enzymkonzentration im mikromolaren Bereich.
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der NCR kann beispielsweise über einen Aktivitätstest erfolgen, in welchem die Zunahme des Produktes, die Abnahme des Substrates (oder Eduktes) oder die Abnahme eines spezifischen Cofaktors oder über eine Kombination aus mindestens zwei der vorstehend genannten Parameter in Abhängigkeit einer definierten Zeitspanne bestimmt werden.
Beispiele für geeignete Substrate sind z.B. Ferricytochrom b5,Kalium-Ferricyanid, 2,6- Dichlorphenolindophenol, Methemerythrin, p-Benzoquinon oder 5-Hydroxy-1 ,4- Naphtoquinon bevorzugt Ferricytochrom b5, Kalium-Ferricyanid, 2,6- Dichlorphenolindophenol besonders bevorzugt Ferricytochrom b5, Kalium-Ferricyanid ganz besonders bevorzugt Kalium-Ferricyanid und für geeignete Cofaktoren NADH. Gegebenenfalls können auch Derivate der vorstehend genannten Verbindungen verwendet werden, die eine detektierbare Markierung enthalten, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope oder chemilumineszierende Markierung. Die für den Aktivitätstest einzusetzenden Mengen an Substrat liegen zwischen 0.5- 10 mM und Mengen an NADH zwischen 0.1-5 mM bezogen auf 1-10Ö jt/g/ml Enzym.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Umsatz eines Substrates photometrisch verfolgt, angelehnt an ein von Mihara und Sato (Methods Enzymol., 52, 1978, pp. 102-108) beschriebenes Verfahren, welches auf der Reduktion von Kalium- Ferrcyanid und der photometrische Messung bei 420 nm basiert.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und iii) basiert, besteht aus den folgenden Schritten:
i. Herstellung eines erfindungsgemäßen transgenen Organismus;
ii. Aufbringen einer Testverbindung auf den transgenen Organismus nach i) und auf einen nicht-transgenen Organismus des gleichen Genotyps;
iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der Aufbringung der Testverbindung; und
iv. Selektion von Testverbindungen, die ein vermindertes Wachstum oder eingeschränkte Überlebensfähigkeit des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organismus bewirken.
In diesem Verfahren wird in dem transgenen Organismus gemäß i) das Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NCR überexprimiert. Der transgene Organismus weist somit gegenüber einer nicht-transgenen Organismus eine erhöhte NCR-Aktivität auf, wobei unter erhöhter NCR-Aktivtät des transgenen Organismus eine gegenüber dem nicht transgenen Organismus der gleichen Gattung um mindestens 10% , bevorzugt um mindestens 25%, besonders bevorzugt um mindestens 40%, ganz besonders be- vorzugt um mindestens 50%» höhere Aktivität zu verstehen ist.
Hierbei beträgt der Wachstumsunterschied der in Schritt iv) zur Selektion eines Inhibitors mit herbizider Wirkung mindestens 10%, vorzugsweise 20%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 40% und ganz besonders bevorzugt 50%.
Der transgene Organismus ist hierbei ein Bakterium, eine Hefe, ein Pilz, eine Pflanze oder eine eukaryontische Zellinie (aus Insekten oder Säugetieren wie z.B. Maus), bevorzugt Pflanzen, Bakterien oder Hefen, die sich mittels gängiger Techniken leicht transformieren lassen, wie Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Nicotiana Taba- cum oder Saccharomyces cerevisiae in welchen die für ein erfindungsgemäße Poly- peptid kodierende Sequenz über Transformation inkorporiert wurde. Diese transgenen Organismen weisen daher eine erhöhte Toleranz gegen Verbindungen auf, welche das erfindungsgemäße Polypeptid inhibieren. Saccharomyces cerevisiae bietet sich hier insbesondere an, weil ihr Genom vollständig sequenziert ist und sie leicht zur Herstel- lung von "knock-out"-Mutanten verwendet werden kann und das in diesem Organismus vorhandene analoge NCR-Gen gezielt ausgeschaltet werden kann (z.B. Methods in Yeast Genetics, Kaiser, Michaelis, Mitchell (eds.) CSHL Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994: 73-85).
Die vorstehend genannte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedoch auch zur Identifizierung von Verbindungen mit wachstumsregulatorischer Wirkung verwendet werden. Hierbei wird als transgener Organismus eine Pflanze eingesetzt. Das Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit wachstumsregulatorischer Wirkung umfasst somit die folgenden Schritte:
i. Herstellung einer transgenen Pflanze enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz kodierend für eine NCR;
ii. Aufbringen einer Testsubstanz auf die transgene Pflanze nach i) und auf eine nicht-transgene Pflanze der gleichen Sorte;
iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht transgenen Pflanze nach dem Aufbringen der Testsubstanz; und
iv. Selektion von Testsubstanzen, die ein verändertes Wachstum der nicht- transgenen Pflanze bewirken verglichen mit dem Wachstum der transgenen Pflanze.
In diesem Verfahren wird in der transgenen Pflanze gemäß i) das Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NCR überexprimiert. Die transgene Pflanze weist somit gegenüber einer nicht-transgenen Pflanze der gleichen Gattung eine erhöhte NCR- Aktivität auf, wobei unter erhöhter NCR-Aktivtät der transgenen Pflanze eine gegenüber einer nicht transgenen Pflanze der gleichen Gattung eine um mindestens 10% , bevorzugt um mindestens 25%, besonders bevorzugt um mindestens 40%, ganz be- sonders bevorzugt um mindestens 50% höhere Aktivität zu verstehen ist.
Hierbei werden in Schritt iv) Testverbindungen selektiert, die ein verändertes Wachstum des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organmismus bewirken. Unter verändertem Wachstum ist hierbei eine Hemmung des vegetativen Wachstums der Pflanzen zu verstehen, was sich insbesondere in einer Reduzierung des Längenwachstums äußeren kann. Die behandelten Pflanzen weisen demgemäß einen gedrungenen Wuchs auf; außerdem ist eine dunklere Blattfärbung zu beobachten. Weiterhin ist unter verändertem Wachstum auch eine zeitliche Veränderung des Reifeverlaufs, eine Heummung oder Vermehrungen seitlicher Verzweigungen der Pflanzen, eine Verkürzung bzw. Verlängerung der Entwick- lungsstadien, eine Erhöhung der Standfestigkeit, das Wachstum größerer Mengen an Knospen, Blüten, Blättern, Früchten, Samenkörnern, Wurzeln und Knollen, eine Erhöhung des Zuckergehaltes in Pflanzen wie Zuckerrüben, Zuckerrohr sowie Zitrusfrüch- ten, des Proteingehaltes in Pflanzen wie Getreide oder Soja oder eine Stimulierung des Latexfluß an Gummibäumen zu verstehen. Die Detektion dieses veränderten Wachs- tums ist dem Fachmann bekannt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch mehrere Testverbindungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Wenn durch eine Gruppe von Testverbindungen eine Beeinflussung des Targets erfolgt, dann ist es entweder mög- lieh, die einzelnen Testverbindungen direkt zu isolieren oder die Gruppe von Testverbindungen in verschiedene Untergruppen zu teilen, z.B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Testverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren wiederholt man dann mit der einzelnen Testverbindung oder der entspre- chenden Untergruppe von Testverbindungen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Untergruppe nur noch eine geringe Anzahl von Testverbindungen oder nur noch eine Testverbindung umfaßt.
Alle oben beschriebenen Verfahren für die Identifizierung von Inhibitoren mit herbizider Wirkung werden im folgenden als "erfindungsgemäße Verfahren" bezeichnet.
Sämtliche, über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen oder Substanzen können anschließend auf ihre herbizide Wirkung in vivo überprüft werden. Eine Möglichkeit zur Prüfung der Verbindungen auf herbizide Wirkung ist die Verwendung der Wasserlinse Lemna minor in Mikrotiterplatten. Als Parameter können Veränderungen des Chlorophyllgehalts und die Photosyntheseleistung gemessen werden. Es ist auch möglich, die Verbindung auf unerwünschte Pflanzen direkt zu applizieren, wobei die herbizide Wirkung z.B. über eingeschränktes Wachstum festgestellt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch vorteilhaft in Hochdurchsatzverfahren, sog. HTS durchgeführt werden, welches das parallele Testen einer Vielzahl verschiedener Verbindungen ermöglicht. Im HTS bietet sich für die praktische Durchführung die Verwendung von Trägern an, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, einen oder mehrere die erfingungsgemäße Nukleinsauresequenz enthaltenden Vektoren, einen oder mehrere transgene Organismen, welche mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten oder eines oder mehrere (Poly)peptide codiert über die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten. Der verwendete Träger kann fest oder flüssig sein, ist bevorzugt fest, besonders bevorzugt eine Mikrotiterplat- te. Die vorstehend genannten Träger sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Gemäß der am weit verbreitesten Technik werden 96-weII, 384-well und 1536 well Mikrotiterplatten verwendet, die in der Regel Volumina von 200 //l umfassen können. Neben den Mikrotiterplatten sind die weiteren Bestandteile eines HTS-Systems passend zu den entsprechenden Mikrotiterplatten wie viele Instrumente, Materialien, automatische Pipettiervorichtungen, Robotoren, automatisierte Plattenleser sowie Plat- tenwascher kommerziell erhältlich.
Neben den auf Mikrotiterplatten basierenden HTS-Verfahren können auch sogenannte "free format assays" oder Testsysteme, die zwischen den Proben keine physischen Barrieren aufweisen, verwendet werden wie z.B. in Jayaickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 19 (1994) 161418; Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libaries, First Annual Conference of The Society for Biomoleeular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995); Salmon et al., Molecular Diversity 2 (1996), 5763 und US 5,976,813.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen mit herbizider Wirkung iden- tifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren. Diese Verbindungen werden im folgenden "selektierte Verbindungen" genannt. Sie weisen ein Molekulargewicht von kleiner als 1000 g/mol, vorteilhaft kleiner 500 g/mol, bevorzugt kleiner 400 g/mol, besonders bevorzugt kleiner 300 g/mol. Verbindungen mit herbizider Wirkung weisen einem Ki-Wert kleiner 1 mM, bevorzugt kleiner 1 μM, besonders bevorzugt kleiner 0,1 μM ganz besonders bevorzugt kleiner 0,01 μU aufweisen.
Die selektierte Verbindungen können natürlich auch in Form ihrer landwirtschaft brauchbaren Salze vorliegen. Unter landwirtschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen Kationen oder die Säureadditionssalze derjenigen Säuren in Betracht, deren Kationen beziehungsweise Anionen die herbizide Wirkung der selektierte Verbindungen nicht negativ beeinträchtigen.
Ferner können die selektierte Verbindungen sofern sie asymmetrisch substituierte a- Kohlenstoffatome enthalten, entweder als Racemate, Enantiomerengemische, reine Enantiomere oder, sofern sie chirale Substituenten aufweisen, auch als Diastereome- rengemische vorliegen.
Die selektierten Verbindungen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z.B. in Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17. Die selektierte Verbindungen können auch aus umfangreichen Substanzbibliotheken stammen.
Mögliche Testverbindungen können Expressionsbibliotheken wie z.B. cDNA- Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches sein (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen).
Die selektierte Verbindungen können zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs, unter Umständen auch zur Defoliation, beispielsweise von Kartoffeln, oder De- sikkation, beispielsweise von Baumwolle, sowie als Wachstumsregulatoren verwendet werden. Herbizide Zusammensetzungen, welche die selektierten Verbindungen enthalten, bekämpfen Pflanzenwuchs auf Nichtkulturflächen sehr gut. In Kulturen wie Weizen, Reis, Mais, Soja und Baumwolle wirken sie gegen Unkräuter und Schadgräser, ohne die Kulturpflanzen nennenswert zu schädigen. Dieser Effekt tritt vor allem bei niedrigen Aufwandmengen auf. Die selektierten Verbindungen können zur Bekämpfung der oben bereits erwähnten Schadpflanzen verwendet werden.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können selektierten Verbindungen bzw. diese enthaltende herbizide Zusammensetzungen vorteilhaft noch in ei- ner weiteren Zahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung unerwünschter Pflanzen eingesetzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctori- us, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineen- sis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossy- pium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hor- deum vulgäre, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec, Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Pha- seolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec, Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylestre, Ricinus communis, Saccha- rum officinarum, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgäre), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.
Darüber hinaus können die selektierten Verbindungen auch in Kulturen, die durch Züchtung einschließlich gentechnischer Methoden gegen die Wirkung von Herbiziden tolerant sind, verwandt werden. Die Herstellung dieser Kulturen wird weiter unten beschrieben.
Weiter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der oben bereits erwähnten herbiziden Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man selektierten Verbindungen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln formuliert.
Die selektierten Verbindungen können z.B. in Form von direkt versprühbaren wässrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, emulgierbaren Konzentraten, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten formuliert werden und durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken und der Natur der selektierten Verbindungen und soll- te in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der selektierten Verbindungen gewährleisten. Die herbiziden Zusammensetzung enthalten eine herbizid wirksame Menge mindestens einer selektierten Verbindung und für die Formulierung von herbiziden Zusammensetzungen übliche Hilfsstoffe.
Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wässrigen oder ölhaltigen Formulierungen sowie dispergierbaren Konzentraten (DC) können die selektierten Verbindungen in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst oder dispergiert werden, wobei weitere Formulierungshilfsstoffe zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus selektierter Verbindung, gegebenenfalls Lösungsmitteln oder Öl sowie optional weiteren Hilfsmitteln bestehende flüssige oder feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind. Hier zu nennen sind emulgierbare Konzentrate (EC, EW), Suspensionen (SC), lösliche Konzentrate (SL), dispergierbaren Konzentrate (DC), Pasten, Pastillen netzbaren Pulvern oder Granulaten, wobei die festen Formulierungen entweder in Wasser löslich (soluble) oder dispergierbar (wet- table) sein können. Desweiteren können entsprechende Pulver bzw. Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den Abrieb oder eine vorzeitige Wirkstofffreisetzung verhinderenden Überzug ("coating") versehen werden.
Prinzipiell sind unter dem Begriff "Hilfsmittel" folgende Verbindungsklassen zu verste- hen: Antischäumungsmittel, Verdicker, Netzmittel, Haftmittel, Dispergiermittel, Emulgiermittel, Bakterizide und/oder thixotrophe Agentien. Die Bedeutung der oben genannten Mittel ist dem Fachmann bekannt.
SLs, EWs und ECs können durch einfaches Mischen der entsprechenden Inhaltsstoffe hergestellt werden, Pulver über Mischen oder Vermählen in speziellen Mühlentypen (z.Bsp. Hammermühlen). DC, SCs und SEs werden üblicherweise über Naßvermahlung ("wet milling") hergestellt, wobei ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organischen Phase, die weitere Hilfsmittel oder selektierte Verbindungen enthalten kann, hergestellt werden kann. Die Herstellung ist bekannt. Pulver-, Streu- und Stäubemittel können vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermählen der wirksamen Verbindungen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden. Granulate, z.B. Umhül- lungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der selektierten Verbindungen an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Weitere Details der Herstellung sind dem Fachmann bekannt, und z.Bsp. in folgenden Schriften aufgeführt: US 3,060,084, EP-A 707445 (für flüssige Konzentrate), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 und ff. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961 , Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 und Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Federal Republic of Germany), 2001. Inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe geeignet für die erfindungsgemäßen Formu- lierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.Bsp. flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclo- hexanon oder stark polare Lösungsmittel, z.B. Amine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser.
Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Sili- kate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeener- de, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nußschalenmehl, Cel- lulosepulver oder andere feste Trägerstoffe.
Oberflächenaktive Stoffe (Tenside) geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.Bsp. Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z.B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Di- butylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl- , Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Oc- tadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfonier- tem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxye- thylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglykolether, Alkylarylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalko- holethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Po- lyoxypropylenalkylether, Laurylalkoholpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin- Sulfitablaugen oder Methylcellulose.
Die Applikation der herbiziden Zusammensetzungen bzw. der selektierten Verbindungen kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind die selektierten Verbindungen für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Ausbringungstechniken angewandt werden, bei welchen die selektierten Verbindungen mit Hilfe der Spritzgeräte so gespritzt werden, daß die Blätter der empfindlichen Kultur- pflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die selektierten Verbindungen auf die Blätter darunter wachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen (post-directed, lay-by).
Die Aufwandmengen an selektierten Verbindungen betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0.001 bis 3.0, vorzugsweise 0.01 bis 1.0 kg/ha.
Die Bereitstellung des herbiziden Targets ermöglicht weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung eines Proteins mit der biologischen Aktivität einer NCR, welches nicht oder nur eingeschränkt durch ein Herbizid, welches als Wirkort die NCR hat, z.B. die herbi- zid wirkenden selektierten Verbindungen, gehemmt wird. Im folgenden wird ein sich derart von der NCR unterscheidendes Protein als NCR-Variante bezeichnet, welches durch eine Nukleinsauresequenz codiert wird, welche i) für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodiert, das durch nach den oben genannten Verfahren ermittelte Substanzen mit herbizider Wirkung, welche NCR inhibieren, nicht inhibiert wird; und
ii) welche ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1 umfasst; oder welche sich durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39%> aufweist, ableiten lässt.
In einer bevorzugten Äusführungsform besteht das oben genannte Verfahren zur Erzeugung von Nukleinsäuresequenzen codierend für NCR-Varianten von Nukleinsäuresequenzen umfassen aus folgenden Schritten:
a) Expression der von den oben genannten Nukleinsäuren kodierten Proteine in einem heterologen System oder in einem zellfreien System;
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure;
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid;
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufwei- sen;
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides;
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.
Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO:1 weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:1 von mindestens 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%,59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,68%,69% und 70% bevorzugt mindestens 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76% besonders bevorzugt mindestens 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%), 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%., 98%, 99% auf. Die erlϊndungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO:2 weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:2 von mindestens 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%,59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%), 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% besonders bevorzugt mindestens 87%, 88%, 89%, 90%), 91%>, 92%, 93% ganz besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf.
Die nach dem oben beschriebenen Verfahren nach ausgewählten Sequenzen werden vorteilhaft in einen Organismus eingebracht. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein nach diesem Verfahren hergestellter Organismus. Bevorzugt ist der Organismus eine Pflanze, besonders bevorzugt eine der oben definierten Kulturpflanzen.
Anschließend erfolgt die Regeneration ganzer Pflanzen und Überprüfung der Resistenz gegenüber der selektierten Verbindung in intakten Pflanzen.
Veränderte Proteine und/oder Nukleinsäuren, die in Pflanzen Resistenz gegen die selektierten Verbindungen vermitteln können, können aus den oben genannten Nuklein- säuresequenzen auch Über die sogenannte "site directed mutagenesis" hergestellt werden, durch diese Mutagenese kann beispielsweise die Stabilität und/oder Aktivität des Target Proteins oder die Eigenschaften wie Bindung und Wirkung der oben genannten erfindungsgemäßen Inhibitoren sehr gezielt verbessern bzw. verändert werden.
Beispielsweise wurde von Zhu et al. (Nature Biotech., Vol. 18, May 2000: 555 - 558) eine "site directed mutagenesis'-Methode in Pflanzen beschrieben, die vorteilhaft verwendet werden kann.
Weiterhin können Veränderungen über die von Spee et al. (Nucleic Aeids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777- 78) beschriebenen PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese erzielt werden oder durch die von Rellos et al. (Protein Expr. Purif., 5, 1994 : 270-277) weiter verbessert Methode.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung dieser veränderten Proteine und/oder von Nukleinsäuren ist eine von Stemmer et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 91 , 1994: 10747-10751) beschriebene "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution oder die von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) beschriebene Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode. Ein weiterer Weg zur Mutagenese von Proteinen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (Vol. 57, 1996: 375-385) beschrieben. In EP-A-0 909821 wird eine Methode zur Veränderung von Proteinen unter Verwendung des Mikroorganismus E. coli XL-1 Red beschrieben. Dieser Mikroorganismus erzeugt bei der Replikation Mutan- tionen in den eingeführten Nukleinsäuren und führt so zu einer Veränderung der genetischen Information. Über Isolierung der veränderten Nukleinsäuren bzw. der veränderten Proteine und Testung auf Resistenz lassen sich leicht vorteilhafte Nukleinsäuren und die durch sie kodierten Proteine identifizieren. Diese können dann nach Einbringen in Pflanzen dort die Resistenz ausprägen und so zur Resistenz gegen die Herbizide führen.
Weitere Methoden der Mutagenese und Selektion sind beispielsweise Methoden wie die in vivo Mutagenese von Samen oder Pollen und Selektion resistenter Allele in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Inhibitoren, gefolgt von genetischer und molekula- rer Identifizierung des veränderten, resistenten Alleis. Weiterhin die Mutagenese und Selektion von Resistenzen in der Zellkultur durch Vermehrung der Kultur in Anwesenheit von sukzessiv steigenden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Dabei kann die Erhöhung der spontanten Mutationsrate durch chemische/physikalische mutagene Behandlung ausgenutzt werden. Wie vorgehend be- schrieben lassen sich auch mit Mikroorgansimen, die eine endogene oder rekombinante Aktivität der durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codierten Proteine haben, und die gegenüber den erfindungsgemäß identifizierten Inhibitoren sensitiv sind, veränderte Gene isolieren. Die Anzucht der Mikroorganismen auf Medien mit steigenden Konzentration von erfindungsgemäßen Inhibitoren erlaubt die Selektion und Evolution von resistenten Varianten der erfindungsgemäßen Targets. Die Frequenz der Mutationen kann wiederum durch mutagene Behandlungen erhöht werden.
Daneben stehen Verfahren zur gezielten Veränderungen von Nukleinsäuren zur Verfü- gung (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 96, 8768 - 8773 und Beethem et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol 96, 8774 - 8778). Diese Methoden ermöglichen es, in den Proteinen solche Aminosäuren, die für die Bindung von Inhibitoren von Bedeutung sind, durch funktionell analoge Aminosäuren zu ersetzen, die jedoch die Bindung des Inhibitors verhindern.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist deshalb ein Verfahren zur Erstellung von Nukleinsäuresequenzen, welche für Genprodukte kodieren, die eine veränderte biologische Aktivität aufweisen, wobei die biologische Aktivität dahingegen verändert wurde, daß eine erhöhte Aktivität vorliegt. Unter erhöhter Aktivität ist eine gegenüber dem Aus- gangsorganismus bzw. gegenüber dem Ausgangsgenprodukt um mindestens 10% , bevorzugt um mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 100% höhere Aktivität zu verstehen. Weiterhin kann die biologische Aktivität dahingegen verändert worden sein, daß die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel nicht mehr oder nicht mehr richtig an die Nukleinsäu- resequenzen und/oder die durch sie kodierten Genprodukte binden. Unter nicht mehr oder nicht mehr richtig ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, daß die Substanzen um mindestens 30%, bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 80%) oder gar nicht mehr an die veränderten Nukleinsäuren und/oder Genprodukte im Vergleich zum Ausgangsgenprodukt oder den Ausgangsnukleinsäuren binden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine transgene Pflanze, welche mit einer Nukleinsauresequenz, welche für ein Genprodukt kodiert, das eine veränderte biologische Aktivität aufweist, oder mit einer Nukleinsauresequenz codierend für eine NCR-Variante transformiert wurde. Verfahren zur Transformation sind dem Fachmann bekannt und beispielhaft weiter oben ausgeführt.
Genetisch veränderten transgene Pflanzen, die gegen die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen und/oder Mittel enthaltend diese Substanzen resistent sind, können auch durch Transformation gefolgt von Überexpression einer erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz erzeugt werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden wurden, resistent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen Nukleinsäuren codierend für eine NCR Variante überexprimiert werden. Ein ähnliches Verfahren wird beispielhaft in Lermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75 - 83 beschrieben.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung resistenter Pflanzen ermöglichen die Entwicklung neuer Herbizide, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung aufweisen (sog. Totalherbizide), in Kombination mit der Entwicklung von gegenüber dem Totalherbizid resistenten Nutzpflanzen. Gegenüber Totalherbiziden resistente Nutzpflanzen sind bereits verschiedentlich beschrieben worden. Dabei können mehrere Prinzipien zur Erzielung einer Resistenz unterschieden werden:
a) Resistenzerzeugung in einer Pflanze über Mutationsverfahren oder gentechnische Verfahren, indem das als Zielort für das Herbizid dienende Protein deutlich überproduziert wird und indem auf Grund des großen Überschusses des als Zielort für das Herbizid dienende Protein, die von diesem Protein in der Zelle ausgeübte Funktion auch nach Applikation des Herbizides beibehalten wird.
b) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß eine modifizierte Version des als Zielort des Herbizid fungierenden Proteins eingeführt wird und daß das neu ein- geführte modifizierte Protein vom Herbizid nicht in seiner Funktion beeinträchtigt wird.
c) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß ein neues Protein/ eine neue RNA eingeführt wird welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die für die herbizide Wirkung der niedermolekularen Substanz verantwortliche chemische Struktur des
Proteins oder der Nukleinsäure wie der RNA oder der DNA so verändert wird, daß durch die veränderte Struktur keine herbizide Wirkung mehr entfaltet werden kann, daß heißt die Interaktion des Herbizids mit dem Zielort nicht mehr erfolgen kann.
d) das die Funktion des Targets durch ein neues in die Pflanze eingebrachtes Gen ersetzt wird, und so ein sogenannter "alternativer Pathway" geschaffen wird.
e) Das die Funktion des Targets durch ein anderes in der Pflanze vorhandenes Gen bzw. dessen Genprodukt übernommen wird.
Dem Fachmann sind alternative Verfahren zur Identifizierung von den homologen Nukleinsäuren beispielsweise in anderen Pflanzen mit ähnlichen Sequenzen wie beispielsweise unter Verwendung von Transposons, bekannt. Gegenstand dieser Erfin- düng ist daher auch die Verwendung von alternativen Insertionsmutageneseverfahren zur Insertion von fremder Nukleinsäuren in die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 in von diesen Sequenzen aufgrund des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen und/oder deren Derivate in anderen Pflanzen.
Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt mit einer der oben beschrieben Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Expressionskassette nach ebenfalls oben beschriebenen gängigen Transformationsmethoden.
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten NCR kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des NCR Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber Hemmstoffen der NCR an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden. Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefaßt werden sollten.
Allgemeine DNA-Manipulations- und Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B. RestriktionNCRaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969- 309-6) und Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
Pflanzenmolekularbiologische Standardverfahren sowie Pflanzentransformationsverfahren sind beschrieben in Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Aeademic Publishers (1998), Reither et al., Methods in Arabidopsis Research, World sveientifie press (1992) und Arabidopsis: A Laboratory Manual (2001), ISBN 0-87969- 573-0.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli DH5σ, XL-1 blue, XL10 Gold, BL21DE(3), JM 109) wurden von Stratagene, BRL Gibco oder Invitrogen, Carlsberg, CA bezogen. Zur Klonierung wurden die Vektoren pCR T7CT TOPO, pCR T7/NT TO- PO und pCR 2.1 TOPO der Firma Invitrogen und pUC 19 der Firma Amersham Phar- macia (Freiburg), pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, 1990, 221-230) und pMALc2x (New England Biolabs) verwendet.
Beispiel 1 : Erzeugung eines Arabidopsis-Pflanzentransformationsvektors
Aus einer cDNA Sequenz, kodierend für NCR aus Arabidopsis thaliana (Accession Nummer AB007799; Mizutani.M. and Fukuchi-Mizutani.M., 1997) wurden das Primerpaar Rei 156/Rei 157
Rei 156: 5'-TATACCCGGGATGGATACCGAGTTTCTCCGAA-3' (SEQ ID NO:5) und
Rei 157: 5 - TATACCCGGGGAACTGGAATTGCATCTCCGGA-3' (SEQ ID NO:6) abgeleitet. Im Anschluss wurden die Primer Rei 156/157 in einer PCR-Reaktion zur Amplifiation eines cDNA Fragment aus einer Arabidopsis thaliana cDNA-Bibliothek (Stratagene) verwendet. Die PCR wurde nach den in Tabelle 1 aufgeführten Bedin- gungen durchgeführt. Tabelle 1
Figure imgf000044_0001
Nach Reinigung über Agarose-Gelelektrophorese wurde das erhaltene Fragment (SEQ ID NO:1) nach Herstellerangaben in den Vektor pPCRScript kloniert (pPCRScript- NCR). Durch Sequenzierung konnte die Identität des Arabidopsis NCR cDNA Klons in voller Länge bestätigt werden.
Der Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer 1990, Plant Science 66, 221-230) wurde mit Smal gespalten und mit dem aus dem Vektor pPCRScript-NCR über Smal isolierten NCR Fragement ligiert (pBinAR-NCR). Der Ligationsansatz wurde in XL10 Gold E. coli Zellen transformiert und pBinAR-NCR enthaltende Klone über eine Digoxigenin- markierte NCR-Sonde (Röche) mit Hilfe von Anti-Digoxigenin-Antikörpem identifiziert. Der Nachweis der Antisense Orientierung der NCR-cDNA in pBinAR-NCR erfolgte durch Sequenzierung sowie über PCR-Reaktionen mit 2 verschiedenen Primerpaaren (Rei 143 und Rei 196, bzw. Rei 144 und Rei 195) nach den in Tabelle 2 aufgeführten Bedingungen.
Tabelle 2
Figure imgf000044_0002
Die Antisense-Orientierung der NCR konnte mit den Primern
Rei 143: 5'-GCTATGACCATGATTACGCC-3' (SEQ ID NO:7) und
Rei 196: 5'-TGAGACATCCGTCCTTGC-3' (SEQ ID NO:8) konnte über das Entstehen eines 740bp langen DNA-Fragments und mit den Primern
Rei 144: 5'-ACGTTGTAAAACGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:9) und
Rei 195: 5'-CCGACTACGTTAGACTCTG-3' (SEQ ID NO: 10)
über das Entstehen eines 885bp langen DNA-Fragments nachgewiesen werden.
Beispiel 2: Transformation und Analyse von Arabidopsispflanzen
Das Konstrukt pBinAR-NCR wurde in Agrobakterienstamm pGV 2260 transformiert. Zur Transformation von Arabidopsispflanzen wurde eine positiv transformierte Agro- bakterienkolonie eingesetzt. Der Nachweis der Anwesenheit des Konstrukts pBinAR- NCR in einer Agrobakterienkolonie wurde über PCR mit den Primern Rei 156 und Rei 157 über PCR nach den in Tabelle 2 aufgeführten Bedingungen. Als DNA-Template diente eine direkt von der Agarplatte entnommenen Menge einer Agrobakterienkolonie.
Von einer einzelnen Kolonie positiv transformierter Agrobakterien auf einer Platte wurde eine 4 ml LB-Medium Kultur (LB-Medium: 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefe Extrakt, 10 g/l NaCI; pH 7.0; 80 mg/l Kanamycin/I und 25 mg/l Rifampicin) inokuliert, über Nacht bei 28°C inkubiert. Im Anschluß wurde mit dieser Kultur eine 400 ml LB-Medium Kultur (LB-Medium mit 80 mg Kanamycin/ml und 25 mg/ml Rifampicin) inokuliert. Nach 12 stündiger Inkubation bei 28°C und 220 rpm wurde die Kultur präzipitiert (8.000 rpm, 20 min.) und in Transformationsmedium resuspendiert (1/2 MS-Media nach Murashige T. und Skoog F. 1962. Physiologia Plantarum. 15: 473-497; Owen H.R. and Miller A.R. 1992. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28: 147-150; 0,5g/l 2-(N-Morpholino)- ethanesulfonic acid), pH 5,8; 50 g/l Saccharose). In die erhaltene Suspension wurden blütentragende Arabidopsispflanzen dreimal jeweils im Abstand von 2,5 Tagen ca. 5- mal hineingetaucht und anschließend in Töpfe mit feuchter Erde überführt. Nach 6 Wochen Inkubation unter Langtagbedingungen in Klimakammern (Tagsüber 22-24°C, Nachts 19°C; 65% relative Luftfeuchtigkeit) wurden die Samen der Pflanzen geerntet.
Beispiel 3: Analyse der transgenen Pflanzen
Zur Analyse werden Samen der transformierten Pflanzen aus Beispiel 2 auf Agar- Selektionsplatten (2,15 g/l Murashige+Skoog micro and macro elements (Fa. DUCHE- FA; nach Murashige T. und Skoog F. 1962. Physiologia Plantarum. 15: 473-497; Owen H.R.; Miller A.R. 1992. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28: 147-150) 0,1 g/l Myo- Inositol, 0,5 g/l MES, 10 g/l Saccharose, pH 5.7, 1ml Gew.-% Vitamin B5, 50 //g/l Ka- namycin; 15g/l Agar Agar).
Auf den Selektionsplatten gewachsene Pflanzen wurden nach 3 - 4 Wochen auf Erde gesetzt und 4 - 8 Wochen bei Langtagbedingungen in Klimakammern inkubiert (Tagsüber 22-24°C, Nachts 19°C; 65% relative Luftfeuchtigkeit). Die Samen wurden nach 6 Wochen geerntet. Die Integration des Antisense-NCR-Gens in das Genom der transgenen Pflanzen wurde über PCR nach den in Tabelle 3 aufgeführten Bedingungen verifiziert.
Tabelle 3
Figure imgf000046_0001
Als Template diente genomische DNA (Isolation mittels des "DNeasy Plant Mini "-Kits von QIAGEN nach Herstellerangaben), die aus Blattmaterial der entsprechenden transgenen Linien präpariert wurde. Als Positivkontrolle diente das zur Transformation verwendete NCR-Antisense-pBinAR-Konstrukt. Durch gezielte Wahl der Primer konnten sowohl das intrinsische genomische Gen, welches ein Intron enthält und somit länger ist als die Antisense-NCR-cDNA, als auch die Antisense-NCR-cDNA selbst nach- gewiesen werden. Bei Anwesenheit der Antisense-NCR-cDNA im Genom der transgenen Pflanzen betrugen die erwarteten Fragmentlänge für die genomische NCR (mit einem Intron) ca. 1800bp bei Verwendung der Primer
Rei 524: 5'-TTCGTTGCTTTCGTCGCCGTT-3' (SEQ ID NO:11) und
Rei 525: 5'-GTTTGCAGCCATGGCCTTGTT-3' (SEQ ID NO:12)
sowie 750bp für die Antisense-NCR-cDNA bei Verwendung der Primer
Rei 524: 5'-TTCGTTGCTTTCGTCGCCGTT-3' (SEQ ID NO:11 ) und
Rei 527: 5'- GGCGGGAAACGACAATCTGATC-3' (SEQ ID NO: 13). Transgene Pflanzen, die das Konstrukt pBinAR-NCR Antisense enthielten, wiesen hohe Anthocyaninanhäufungen, also stark gestresste Blätter und Adern, chlorotische Blätter sowie eine drastische Wachstumsverzögerung auf: So hatten Transgene Pflanzen (TO-Generation) nur 1-10% der Frischmasse von Wildtyppflanzen nach 6 Wochen Kultivierung auf Erde bei Langtagbedingungen in Klimakammern (Tagsüber 22-24°C, Nachts 19°C; 65% relative Luftfeuchtigkeit. Die Samen, die sich in den Schoten der Pflanzen der transormierten TO-Generation entwickelten, waren verkümmert und keimten in 100% aller Fälle nicht.
Hiermit wurde erstmalig und überraschend gezeigt, dass die natürliche Expression von für NCR codierenden Sequenzen essenziell für Pflanzen ist und eine verringerte Expression zu Schädigungen entsprechend den vorstehend genannten Phänotypen führt. Somit konnte gezeigt werden, dass sich NCR als Herbizidtarget eignet.
Beispiel 4: Expression in E.coli
Zur Erzeugung aktiven Proteins mit pflanzlicher NCR-Aktivität wurde eine cDNA aus Arabidopsis codierend für eine NCR (Genbank Accession Nummer: AB007799) in E. coli Bakterien überexprimiert. Hierfür wurde die für NCR kodierende Nukleinsäurese- quenz nach Standardbedingungen via PCR (z.B. nach Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press; 34 Zyklen; Annealingtemperatur 60°C; Polymerisationszeit 2 min) mit pBinAR-NCR als Template und den Primern
Rei 153: 5'- TATAGAATTCATGGATACCGAGTTTCTCCGAA-3' (EcoRI) (SEQ ID NO:14)
Rei 483: 5'- TATACTGCAGTCAGAACTGGAATTGCATCTCCGG-3' (Pstl) (SEQ ID NO:15)
enthaltend die Restriktionsenzymschnittestellen EcoRI und Pstl amplifiziert und in den Vektor pMAL-c2x (New England Biolabs) über die Restriktionsenzymschnittestellen EcoRI und Pstl kloniert (pMAL-c2x-NCR).
Die pMAL-c2x-NCR Konstrukte wurden in E.coli-Stamm JM109 (Stratagene) transformiert und NCR nach Herstellerangaben über IPTG als Fusionsprotein mit Maltose- Binding-Protein (NCR-MBP) exprimiert. Die Proteinaufreinigung via Affinitätschromatographie mit einer Maltosesäule wurde wie vom Hersteller New England Biolabs beschrieben durchgeführt. Beispiel 5: in vitro Testsysteme
Die Aktivität der NCR wurde mit NCR, die gemäß Beispiel 4 rekombinant exprimiert wurde (Fukuchi-Mizutani et al., Plant Physiol. 119, pp. 353-361 , 1999) oder nach dem von Jollie et al. (Plant Physiol. 85, pp. 457-462, 1987) beschriebenen Verfahren isoliert wurde, bestimmt nach der Methode von Mihara und Sato (Methods Enzymol., 52, 1978, pp. 102-108).
Nach Mihara und Sato (Methods Enzymol., 52, 1978, pp. 102-108) werden 1-10 /g ge- reinigtes NCR-MBP Protein in 100// 1 Puffer (100 mM K2HPO-/ KH2PO4-Puffer (zu gleichen Teilen gemischt) mit 1 mM Kalium-Ferricyanid versetzt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,3 mM ^-NADH gestartet.
Photometrisch gemessen wird die Reduktion von Kalium-Ferricyanid bei 420 nm und 25°C in einem Zeitraum von 5 bis 15 min gemessen.
Beispiel 6: Identifizierung eines funktionellen Analogon aus Tabak
Zur Erzeugung einer cDNA-Bibliothek (im folgenden "binäre cDNA-Bank" genannt) in einem Vektor, der direkt für die Transformation von Pflanzen verwendet werden kann, wurde mRNA aus verschiedenen Pflanzengeweben isoliert und mit dem TimeSaver cDNA Synthese Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) in doppelsträngige cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit T 2.18 Oligonucleotiden nach Herstellerangaben durchgeführt. Nach Größenfraktionierung und Ligation von EcoRI- Notl-Adaptern nach Herstellerangaben und Auffüllen der Überhänge mit Pfu DNA Po- lymerase (Stratagene) wurde die cDNA-Population normalisiert. Hierzu wurde die Methode nach Kohci et al, 1995, Plant Journal 8, 771-776 vorgegangen, wobei die cDNA durch PCR mit dem Oligonukleotid N1 unter den in Tabelle 4 aufgeführten Bedingungen amplifiziert wurde.
Tabelle 4
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Das erhaltene PCR-Produkt wurde an die Säulenmatrix des PCR-Purification Kits (Qiagen, Hilden) gebunden und mit 300 mM NaP-Puffer, pH 7.0, 0.5 mM EDTA, 0.04% SDS eluiert. Die DNA wurde 5 Minuten im kochenden Wasserbad denaturiert und anschließend 24 Stunden bei 60°C renaturiert. 50 I der DNA wurden auf eine Hydroxyla- pathitsäule aufgetragen und diese 3 Mal mit 1 ml 10 mM NaP-Puffer, pH 6.8 gewaschen. Die gebundene Einzelstrang-DNA wurde mit 130 mM NaP-Puffer, pH 6.8 eluiert, mit Ethanol gefällt und in 40//I Wasser gelöst. Hiervon wurden 20 /I für eine weitere PCR-Amplifikation wie oben beschrieben verwendet. Nach einer weiteren Anreicherung von ssDNA wurde eine dritte PCR-Amplifikation wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Herstellung des Pflanzentransformationsvektors zur Aufnahme der wie oben beschrieben hergestellten cDNA-Population erfolgte über Restriktionsenzym-Verdau des Vektor pUC18 mit Sbfl und BamHI, Reinigung des Vektorfragment gefolgt von Auffüllen der Überhänge mit Pfu DNA Polymerase und Religation mit T4 DNA Ligase (Stratagene). Das so hergestellte Konstrukt wird im folgenden als pUC18Sbfl- bezeichnet.
Der Vektor pBinAR wurde zunächst mit Notl gespalten, nach Auffüllen der Enden reli- giert, mit Sbfl gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert und im Anschluß mit EcoRI und Hindlll gespalten. Das resultierende Fragment wurde in ein Derivat des binären Pflanzentransformationsvektors pPZP (Hajdukiewicz,P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25:989-994) ligiert, der eine Transformation von Pflanzen mittels Agro- bakterium ermöglich und eine Kanamycinresistenz in transgenen Pflanzen vermittelt, ligiert. Das hierbei erzeugte Konstrukt wird im folgenden als pSun12/35S bezeichnet.
pUC18Sbfl- wurde als Template für eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) mit den Oligonucleotiden V1 und V2 (siehe Tabelle 3) und Pfu DNA Polymerase eingesetzt. Das resultierende Fragment wurde in den mit Smal gespalten pSun12/35S ligiert, wo- durch pSunblues2 erzeugt wurde. Nach Spaltung mit Notl, Dephosphorylierung mit
Shrimp Alkalischer Phosphatase (Röche Diagnostics, Mannheim) und Aufreinigung des Vektorfragmentes wurde pSunblues2 mit der normalisierten und ebenfalls mit Notl gespaltenen cDNA Population ligiert. Nach Transformation in E.coli XMblue (Stratagene) wurden die so erzeugte Klone in Mikrotiterplatten abgelegt. Die binäre cDNA-Bank ent- hält cDNAs in "Sense"- und in "Antisense"-Orientierung unter Kontrolle des Blumen- kohlmosaikvirus 35s Promotors, die dementsprechend nach der Transformation in Tabakpflanzen zu "Cosuppressions"- und "Antisene"-Effekten führen können.
Tabelle 3: Verwendete Oligonukleotide
Figure imgf000050_0001
Die Identifizierung einer für NCR kodierenden Sequenz erfolgte über eine Digoxygenin markierte Sonde hergestellt über den DIG DNA Labeling Mix (Röche, Mannheim) nach Herstellerangaben, wobei das Plasmid pMAL-c2x-NCR unter Standardbedingungen über PCR mit den Primern
Rei 111: S'-ATGGATACCGAGTTTCTCCGAA-S' (SEQ ID NO:21) und
Rei 222: 5'- AACTGGAATTGCATCTCCGGA-3' (SEQ ID NO:22)
amplifϊziert wurde. Die so hergestellte Sonde wurde zur Durchmusterung der cDNA Bank aus Nicotiana tabacum eingesetzt. Die cDNA Bank wurde mit einem Titer von 2,5x105 Plaque bildenden Einheiten ausplattiert und mit Hilfe der Plaque- Durchmusterungsmethode analysiert (T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Mole- cular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989). Es wurden 12 Phagenpopulationen isoliert, mit denen eine zweite Durchmusterung durchgeführt wurde, wodurch genetisch einheitlich Phagenpopulationen isoliert werden konnten, die zur in vivo Excision verwendet wurden. Durch Restriktionsanalyse konnten keine Unterschiede zwischen den cDNA Klonen festgestellt werden und es wurden vier Klone mit den größten Insertionen zur Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenzdaten dieser Klone ergaben die SEQ ID NO:3, die mit der SEQ ID NO:1 zu 77% identisch ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von einem Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH- abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodiert durch eine Nukleinsauresequenz bestehend aus
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten geneti- sehen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten läßt; oder
d) einem funktionellen Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1
als Target für Herbizide.
2. Pflanzliche Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der biologi- sehen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase enthaltend einen Teilbereich umfassend:
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:3 mit einer
Identität von mindestens 77% zu der SEQ ID NO:3;
d) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funk- tionellen Äquivalents der SEQ ID NO:4, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:4 von mindestens 87% aufweist, ableiten läßt.
3. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase als Target für Herbizide kodiert von einem Nukleinsäuremolekül nach
Anspruch 2.
4. Verfahren zur Detektion funktioneller Analoga der SEQ ID NO:1
a) durch Herstellung einer Sonde gefolgt von anschließenden Durchsuchen einer genomischen oder cDNA Bank der entsprechenden Spezies; oder
b) einer Computer-Recherche nach analogen Sequenzen in elektronischen Datenbanken.
Expressionskassette umfassend
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 2; oder
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b).
6. Vektor umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 5.
7. Nicht humaner transgener Organismus umfassend mindestens eine Nukleinsauresequenz kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase gemäß Anspruch 2, eine Expressi- onskassette gemäß Anspruch 5 oder einen Vektor gemäß Anspruch 6 ausgewählt aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen oder pflanzlichen Zellen.
8. Verwendung eines Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH- abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodiert durch eine Nukleinsauresequenz enthaltend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer
Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1 ;
d) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funk- tionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID
NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten läßt.
in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung.
9. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung umfassend die folgenden Schritte:
i. Inkontaktbringen eines Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodiert durch eine Nuklein- säuresequenz bestehend aus
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz;
b) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt;
c) einem funktionellen Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1 ; oder
d) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten lässt
mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbindung(en) an die NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase er- lauben; und ii. Nachweis, ob die Testverbindung an die NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus i) bindet; oder
iii. Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität der NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus i) reduziert oder blockiert; oder
iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression der der NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus i) redu- ziert oder blockiert.
10. Verfahren nach den Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
i. NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase, die durch eine Nukleinsäure- sequenz bestehend aus
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) einem funktionellen Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1 ; oder
d) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten lässt
kodiert wird, entweder in einem transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase ent- hält, kultiviert wird;
ii. die NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus Schritt i) im Zellauf- schluss des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testver- bindung in Kontakt gebracht wird; und iii. eine Testverbindung selektiert wird, welche die Aktivität der NADH- abhängige Cytochrom b5 Reduktase aus Schritt i) reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten NADH- abhängige Cytochrom b5 Reduktase mit der Aktivität einer nicht mit einer
Testverbindung inkubierten NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase verglichen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt iii) die Aktivität der NADH-abhängige Cytochrom b5 Reduktase photometrisch über den
Einsatz von Ferricytochrom b5, Kalium-Ferricyanid, 2,6-Dichlorphenolindophenol, Methemerythrin, p-Benzoquinon oder 5-Hydroxy-1 ,4-Naphtoquinon als Substrat bestimmt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte umfasst:
i. Herstellung eines transgenen Organismus nach Anspruch 7 oder eines transgenen Organismus enthaltend eine Nukleinsauresequenz kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen
Cytochrom b5 Reduktase bestehend aus
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt;
c) einem funktionellen Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID
NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1 ; oder
d) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten gene- tischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten lässt, wobei in dem transgenen Organismus das Polypeptid mjt der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase überexprimiert wird; und
ii. Aufbringen einer Testsubstanz auf den transgenen Organismus nach Anspruch i) und auf einen nicht-transgenen Organismus des gleichen Genotyps;
iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der Aufbringung der Testsubstanz; und
iv. Selektion von Testsubstanzen, die ein vermindertes Wachstum oder eine eingeschränkte Überlebensfähigkeit des nicht-transgenen Organismus be- wirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organismus.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem pflanzlichen Organismus oder einer Hefe durchgeführt wird.
14. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit wachstumsregulatorischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte umfasst:
i. Herstellung einer transgenen Pflanze enthaltend eine Nukleinsauresequenz kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH- abhängigen Cytochrom b5 Reduktase bestehend aus
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt;
c) einem funktionellen Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1 ; oder
d) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten lässt;
wobei in der transgenen Pflanze das Polypeptid mit der biologischen Akti- vität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase überexprimiert wird;
ii. Aufbringen einer Testsubstanz auf die transgene Pflanze nach i) und auf eine nicht-transgene Pflanze der gleichen Sorte;
iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht transgenen Pflanze nach dem Aufbringen der Testsubstanz; und Selektion von Testsubstanzen, die ein verändertes Wachstum der nicht-transgenen Pflanze bewirken verglichen mit dem Wachstum der transgenen Pflanze.
15. Träger, der eines oder mehrere der Nukleinsäuremoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 2, oder eine oder mehrere Expressionskassetten nach Anspruch 5, einen oder mehrere Vektoren nach Anspruch 6, einen oder mehrere Organismen nach Anspruch 7 oder eines oder mehrere (Poly)peptide nach Anspruch 3 aufweist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High-Throughput-Screening durchge- führt wird.
17. Verbindungen mit herbizider Wirkung identifiziert über eines der Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 13 und 16.
18. Verbindungen mit wachstumsregulatorischer Wirkung identifiziert über das Verfahren nach den Ansprüchen 14 und 16.
19. Verfahren zur Herstellung einer agrochemischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man
a) eine Verbindung mit herbizider Wirkung über eines der Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 13 und 16 oder eine Verbindung mit wachstumsregulatorischer Wirkung nach den Ansprüchen 14 und 16 identifiziert; und b) diese Verbindung zusammen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln mit herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung formuliert.
20. Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs und/oder zur Regulation des Wachstums von Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung nach Anspruch 17 oder 18 oder eine Zusammensetzung erhältlich über das in Anspruch 19 genannte Verfahren auf Pflanzen, deren Lebensraum und/oder auf Samen einwirken läßt.
21. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 17 oder 18 oder einer agrochemischen Formulierung erhältlich über das in Anspruch 19 genannte Verfahren in einem Verfahren nach Anspruch 20 zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs und/oder zur Regulation des Wachstums von Pflanzen.
22. Verfahren zur Erzeugung von Nukleinsäuresequenzen, welche für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase kodieren, welches durch Substanzen nach Anspruch17 nicht inhibiert wird; und durch ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit ei- ner Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1 umfasst werden, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Prozessschritte umfaßt:
a) Expression des von der Nukleinsauresequenz gemäß i) kodierten Proteins in einem heterologen System oder in einem zellfreien System;
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure;
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid;
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen;
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbi- zides; und
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Anspruch 22 f) ausgewählten Sequenzen in einen Organismus eingebracht werden.
24. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen nach An- spruch 17 resistent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen eine
Nukleinsauresequenz codierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer NADH-abhängigen Cytochrom b5 Reduktase, welche
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 39% aufweist, ableiten läßt; oder
d) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 52% zu der SEQ ID NO:1
umfasst, überexprimiert wird.
25. Transgene Pflanze hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 24.
PCT/EP2003/007590 2002-07-18 2003-07-14 Nadh-abhängige cytochrom b5 reduktase als target für herbizide WO2004009806A1 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003250050A AU2003250050A1 (en) 2002-07-18 2003-07-14 Nadh-dependent cytochrome b5 reductase as a target for herbicides
US10/521,584 US20060160700A1 (en) 2002-07-18 2003-07-14 Nadh-dependent cytochrome b5 reductase as target for herbicides
EP03764982A EP1525304A1 (de) 2002-07-18 2003-07-14 Nadh-abhängige cytochrom b5 reduktase als target für herbizide

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10232778 2002-07-18
DE10232778.5 2002-07-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004009806A1 true WO2004009806A1 (de) 2004-01-29

Family

ID=30469007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2003/007590 WO2004009806A1 (de) 2002-07-18 2003-07-14 Nadh-abhängige cytochrom b5 reduktase als target für herbizide

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20060160700A1 (de)
EP (1) EP1525304A1 (de)
AU (1) AU2003250050A1 (de)
WO (1) WO2004009806A1 (de)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010047982A1 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic benzimidazole derivatives useful anti-diabetic agents
WO2010051206A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic benzimidazole derivatives useful anti-diabetic agents
WO2011106273A1 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic benzimidazole derivatives useful anti-diabetic agents
WO2012116145A1 (en) 2011-02-25 2012-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic azabenzimidazole derivatives useful as anti-diabetic agents
WO2014022528A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic tricyclic compounds
WO2014130608A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic bicyclic compounds
WO2014139388A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel indole derivatives useful as anti-diabetic agents
WO2015051725A1 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic tricyclic compounds
WO2018106518A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic heterocyclic compounds
WO2018118670A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic spirochroman compounds

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080140431A1 (en) * 2006-12-07 2008-06-12 Noel Wayne Anderson Method of performing an agricultural work operation using real time prescription adjustment

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001038484A2 (en) * 1999-11-25 2001-05-31 Basf Plant Science Gmbh Moss genes from physcomitrella patens coding proteins involved in the synthesis of polyunsaturated fatty acids and lipids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001038484A2 (en) * 1999-11-25 2001-05-31 Basf Plant Science Gmbh Moss genes from physcomitrella patens coding proteins involved in the synthesis of polyunsaturated fatty acids and lipids

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAGNARESI PAOLO ET AL: "Cloning and characterization of a maize cytochrome-b5 reductase with Fe3+-chelate reduction capability", BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 338, no. 2, 1 March 1999 (1999-03-01), pages 499 - 505, XP002258120, ISSN: 0264-6021 *
BAGNARESI PAOLO ET AL: "Tonoplast subcellular localization of maize cytochrome b5 reductases", PLANT JOURNAL, vol. 24, no. 5, December 2000 (2000-12-01), pages 645 - 654, XP002258119, ISSN: 0960-7412 *
FUKUCHI-MIZUTANI MASAKO ET AL: "Microsomal electron transfer in higher plants: Cloning and heterologous expression of NADH-cytochrome b5 reductase from Arabidopsis", PLANT PHYSIOLOGY (ROCKVILLE), vol. 119, no. 1, January 1999 (1999-01-01), pages 353 - 361, XP002258118, ISSN: 0032-0889 *
SAKURADANI EIJI ET AL: "Identification of an NADH-cytochrome b5 reductase gene from an arachidonic acid-producing fungus, Mortierella alpina 1S-4, by sequencing of the encoding cDNA and heterologous expression in a fungus, Aspergillus oryzae", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 65, no. 9, September 1999 (1999-09-01), pages 3873 - 3879, XP002258121, ISSN: 0099-2240 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010047982A1 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic benzimidazole derivatives useful anti-diabetic agents
WO2010051206A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic benzimidazole derivatives useful anti-diabetic agents
WO2011106273A1 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic benzimidazole derivatives useful anti-diabetic agents
WO2012116145A1 (en) 2011-02-25 2012-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic azabenzimidazole derivatives useful as anti-diabetic agents
EP3243385A1 (de) 2011-02-25 2017-11-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Neue cyclische azabenzimidazolderivate als antidiabetika
WO2014022528A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic tricyclic compounds
WO2014130608A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic bicyclic compounds
WO2014139388A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel indole derivatives useful as anti-diabetic agents
WO2015051725A1 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic tricyclic compounds
WO2018106518A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic heterocyclic compounds
WO2018118670A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Antidiabetic spirochroman compounds

Also Published As

Publication number Publication date
EP1525304A1 (de) 2005-04-27
AU2003250050A1 (en) 2004-02-09
US20060160700A1 (en) 2006-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1487975A2 (de) Serin hydroxymethyltransferase als target für herbizide
EP1362059A2 (de) Verfahren zur identifizierung von substanzen mit herbizider wirkung
WO2004009806A1 (de) Nadh-abhängige cytochrom b5 reduktase als target für herbizide
WO2004058956A1 (de) Malat dehydrogenase als target für herbizide
EP1694833B1 (de) 2-methyl-6-solanylbenzochinon-methyltransferase als ziel für herbizide
EP1527168B1 (de) Saccharose-6-phosphat phosphatase als target für herbizide
WO2005047513A2 (de) Der glycin decarboxylase komplex als herbizides target
EP1315808A2 (de) Dehydroquinat dehydratase/shikimat dehydrogenase als herbizides target
DE102004012481A1 (de) UMP-Synthase (Orotat Phosphoribosyltransferase und Orotidin 5'-Phosphate Decarboxylase) als herbizides Target
US20070113300A1 (en) Clp-protease as target for herbicides
DE112005000590T5 (de) Polynukleotidphosphorylase (PNPase) als Ziel für Herbizide
DE10107843A1 (de) Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung
DE10125537A1 (de) Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003764982

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006160700

Country of ref document: US

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10521584

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003764982

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003764982

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10521584

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP