WO2004009097A2 - Utilisation d'un analogue du nad, substrat des mono-adp-ribosyl transferases et antagoniste du nad, pour la preparation d'un medicament destine au traitement des pathologies liees aux recepteurs purinergiques - Google Patents

Utilisation d'un analogue du nad, substrat des mono-adp-ribosyl transferases et antagoniste du nad, pour la preparation d'un medicament destine au traitement des pathologies liees aux recepteurs purinergiques Download PDF

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Michel Seman
Sahil Adriouch
Friedrich Koch-Nolte
Friedrich Haag
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Universite Paris 7 - Denis Diderot
University Hospital Hambourg-Eppendorf
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide

Definitions

  • the present invention relates to the use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) analogs, substrates of mono-ADP-ribosyl transferases (ART) and NAD antagonists in the preparation of a medicament intended to modulate the activity of at least one purinergic receptor, advantageously of the P2X or P2Y type, said medicament being particularly intended for the treatment of pathologies in which the purinergic receptors participate in the pathophysiological process or of pathologies linked to a deregulation of the activity of the purinergic receptors.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • ART mono-ADP-ribosyl transferases
  • adenosine adenosine triphosphate (ATP) or nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)
  • purines such as adenosine, adenosine triphosphate (ATP) or nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)
  • ATP adenosine triphosphate
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • purinergic receptors of the PI type mainly sensitive to adenosine, or P2, mainly sensitive to ATP, and adenosine diphosphate-ribosyl transferases (ADP-ribosyl transferases) which have an enzymatic activity which their makes it possible to transfer an ADP-ribose group from NAD to target proteins.
  • ADP-ribosyl transferases adenosine diphosphate-ribosyl transferases
  • ATP in addition to its role as an enzyme co-factor and its role in the formation of phosphate bonds, is also an extracellular messenger involved in numerous biological processes, producing these effects via a particular family of purinergic receptors present in the cell surface of many tissues, the P2 receptors.
  • P2 receptors due to their presence in many tissues, are involved in a wide variety of biological functions and thus potentially involved in many pathologies such as, for example, and without limitation, neurological and neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases and ischemia, systemic inflammatory diseases, cancer or even autoimmune diseases such as diabetes.
  • pathologies such as, for example, and without limitation, neurological and neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases and ischemia, systemic inflammatory diseases, cancer or even autoimmune diseases such as diabetes.
  • G. Burnstoc and M. Williams The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2000, 295: 862-869).
  • the P2X and P2Y receptors are described in the central and peripheral nervous systems on which it is known that ATP produces both sedative and exciting effects. They are also described in the auditory system.
  • P2X receptor antagonists are described as potential anti-epileptic agents.
  • mice deficient in the P2X 3 receptor have a greatly diminished perception of pain.
  • P2 receptor antagonists have analgesic properties.
  • P2 receptors The involvement of P2 receptors is also described in the phenomena of cellular homeostasis, in the processes of neuroviability and neuroregeneration as well as in neurodegenerative pathologies, in pathologies of urinary incontinence (P2X), in psoriasis (P2X) , in scleroderma (P2X), male infertility (P2X) or even in basal cell carcinomas.
  • P2 receptors X and Y
  • modulating the activity of P2 receptors could be a potential treatment for osteoporosis, rheumatoid arthritis, periodontitis or even osteopenia.
  • purinergic receptors are also described in systemic inflammatory diseases such as lupus or polyarthritis, inflammatory colon diseases, cancer and autoimmune diseases such as diabetes.
  • mice or rats these proteins are mainly glypiated membrane proteins, anchored in the membrane by a phosphatidyl innositol group (GPI anchored). They are therefore present on the surface of cells but can be released under certain conditions thanks, in particular, to the intervention of metalloproteases (Kahl et al, J. Immunol., 2000, 165: 4463-4469).
  • NAD is known for its antagonistic properties of narcotics and its use as a deterrent in the treatment of alcoholism.
  • the subject of the invention is the use of an analog of NAD, substrate for mono-ADP-ribosyl transferases (ART) and antagonist of NAD in the preparation of a medicament intended to modulate the activity of at least a purinergic receptor, advantageously of the P2X or P2Y type.
  • ART mono-ADP-ribosyl transferases
  • antagonist of NAD in the preparation of a medicament intended to modulate the activity of at least a purinergic receptor, advantageously of the P2X or P2Y type.
  • analog of NAD, substrate of ART is meant a compound of the nucleotide-diphosphate-ribose-nicotinamide type, or a compound of chemical structure close to this sequence, which, like NAD, under the action of ART transfers a group nucleotide-diphosphate-ribose on target proteins.
  • NAD antagonist is meant a compound which, after elimination of the nicotinamide and covalent transfer of the nucleotide diphosphate ribose residue onto target proteins, results in an inhibition of the purinoreceptors, whereas the transfer from the NAD results in an activation of these same purine receptors.
  • modulation of the activity of at least one purinergic receptor is meant a decrease or an inhibition of the activity of said receptor.
  • the medicament is intended for the treatment of pathologies linked to a deregulation of the activity of at least one purinergic receptor, particularly a P2X or P2Y type receptor.
  • pathologies linked to a deregulation of the activity of at least one purinergic receptor is meant the pathologies linked either to the appearance, the increase, the decrease or the disappearance of the activity of said receptor.
  • analogues of NAD ART substrates is meant according to the invention, molecules onto which modifications of the nicotinamide group have been introduced, modifications of the 5'-5 'pyrophosphate bond, modifications of the ribose group of the ADP part of NAD , modifications of the adenine group or a combination of these different modifications.
  • the analogs of NAD are chosen from the compounds which differ from NAD in that the adenosine group has been replaced by another purine or a purine analog.
  • NAD analogs and known NAD antagonists which can be used according to the invention include etheno-NAD, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (NHD) or nicotinamide guanosine dinucleotide (NGD).
  • NAD analogs and known NAD antagonists include etheno-NAD, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (NHD) or nicotinamide guanosine dinucleotide (NGD).
  • the modulation of the purinergic receptor activity by an ADP-ribosylation induced by NAD or its analogues, substrate of ART can be done either by direct ADP-ribosylation of the purinergic receptors, or by ADP-ribosylation of other factors. surrounding proteins which themselves would then intervene on the purinergic receptors.
  • ARTs as well as the different purinergic receptors have ubiquitous distributions in the organism.
  • Several ARTs and several purinergic receptors can be present on the same cell. However, neither all ART nor all purinergic receptors are present on all cell types. Thus, there may exist on the surface of the cells couples ART / purinergic receptors specific for a cell type considered.
  • NAD analogs specific for a particular ART itself involved in an ART / purinergic receptor pair specific for a given cell type, to modulate specifically the activity of said purinergic receptor.
  • the subject of the invention is also a method for evaluating the modulating effect of a mono-ADP-ribosyl transferase present on the surface of a cell, on a purinergic receptor present on the surface of the same cell, characterized in that in a first step, said cell is brought into contact with a compound known as a substrate for said mono-ADP-ribosyl transferase, and that in a second step, the activity level of said purinergic receptor in said cells is evaluated by any appropriate means compared to the level of activity of the same receptor in control cells, placed under the same experimental conditions.
  • the invention also relates to a method for evaluating the effect of a compound, substrate of a mono-ADP-ribosyl transferase, on purinergic receptors, characterized in that in a first step, said contact is brought into contact composed with cells carrying said mono-ADP-ribosyl transferase and at minus one purinergic receptor and that in a second step, the level of activity of the purinergic receptor in said cells is evaluated by any appropriate means relative to the level of activity of the same receptor in control cells placed under the same experimental conditions.
  • Figure 1 represents the results of the experiments carried out in order to demonstrate the implication of ART2 in the apoptosis of T cells.
  • Figures 2 and 3 show the results of experiments performed to show the effects of an NAD analog on T cells.
  • Figure 4 shows the results of experiments done to show the effects of NAD and ATP on the formation of membrane pores in the cells of lymph nodes.
  • FIG. 5 represents the results of the experiments carried out with a view to showing that apoptosis of T lymphocytes, induced by NAD, passes through activation of the P2X receiver.
  • Figures 6 and 7 represent the results of experiments carried out in order to show that apoptosis of T lymphocytes, induced by NAD, requires the presence of an ART2.
  • Figure 8 shows the results of experiments carried out to show that cellular apoptosis induced by NAD requires the simultaneous presence of an ART2 and the P2X receptor.
  • ATP Adenosine triphosphate
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • etheno-NAD nicotinamide hypoxanthine dinucleotide
  • NBD nicotinamide guanosine dinucleotide
  • oATP oxidized ATP
  • bzATP benzoyl-benzoyl ATP
  • the KN62 molecule, pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2 ', 4'-disulfonic acid (PPADS) or suramin are sold by the company Sigma.
  • the RPMI medium is sold by the company INVITROGEN. 2.
  • the specific monoclonal antibody of 1 ⁇ RT2-2, NIKA102, (rat IgG2a) was produced according to the method described by Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163: 6014).
  • the suspensions of individual cells originating from the thymus, spleen or lymph node were analyzed by flow cytometry using a FACScan (Becton Dickinson) according to the method described by Koch-Nolte F. et al., (J Immunology, 1999, 163: 6014).
  • the 1G4 mouse monoclonal antibody (IgG2a) specific for etheno-adenosine was produced according to the method described by Young and Santella (Carcinogenesis, 1988, 9: 589)
  • anti-CD3e 145-2C11
  • anti-CD4 GK1.5
  • anti-CD8 53-6.72
  • CALTAG Biotin, phycoerythrin (PE) and iso-thiocyanate fluorescein
  • FITC Fluorescence-Activated Factor
  • Pharmigen Becton-Dickinson / Pharmigen
  • the antibody GK1.5 (anti-CD4) was labeled with indocarbocyanine Cy3 TM according to the method described by Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163: 6014). 3. Exposure of phosphatidylserines and formation of membrane pores:
  • Apoptotic and necrotic cells were labeled with the annexin-V-FITC conjugate or propidium iodide, as described in Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163: 6014). After treatment with NAD or ATP at 37 ° C., the cells were washed in RPMI medium supplemented with 2 mM CaCl, then labeled in the same medium for 20 minutes on ice with annexin-V-FITC conjugate (1 ⁇ g / ml) and propidium iodide (10 ⁇ g / ml), or PE-conjugated anti-mouse IgG.
  • phosphatidylserines to the cell surface, an early sign of apoptosis detectable by annexin-V, is then measured by flow cytometry with the annexin-V-FITC conjugate.
  • YOPRO-1 permeable pore formation tests the cells were first incubated in the presence of the nucleotides in RPMI medium at 37 ° C. YOPRO-1 (final concentration of 10 ⁇ g / ml) is added in the last 2 minutes of incubation. The cells are placed on ice and washed with refrigerated medium at ice temperature and then counter-colored for 20 minutes at 4 ° C. with annexin-V-FITC conjugate (1 ⁇ g / ml); propidium iodide (10 ⁇ g / ml) or PE-conjugated anti-mouse IgG.
  • permeable pores are then measured by measuring the incorporation of YOPRO-1 and ethidium bromide in flow cytometry.
  • the cells were preincubated either 30 minutes on ice in RPMI medium containing specific anti-ART2 antibodies (at 3 ⁇ g / ml), or for 45 minutes at 37 ° C. in complete medium (RPMI supplemented with 10% serum calf, pyruvate, glutamate)), containing 10-50 ⁇ M of etheno-NAD or for 2 hours at 37 ° C in complete medium containing P2X antagonists at the concentrations indicated.
  • RPMI medium containing specific anti-ART2 antibodies at 3 ⁇ g / ml
  • complete medium RPMI supplemented with 10% serum calf, pyruvate, glutamate
  • the cells were then incubated in RPMI medium containing NAD, ATP for 30 minutes at 37 ° C. and subjected to staining with annexin-V, propidium iodide, YOPRO-1 or fluorescent antibodies according to the method described above.
  • NAD and etheno-NAD differ only in the adenosine group.
  • ADP-ribosylation but not etheno-ADP-ribosylation, induces apoptosis indicates that an essential secondary effector of NAD-induced apoptosis must be sensitive to a difference in the adenosine group.
  • the P2X 7 receptor is described as involved in the formation of membrane pores, induced by ATP, which can be easily followed by the capture of DNA dye such as ethidium bromide or YOPRO-1.
  • the results presented in Figure 4A show that the incubation of lymph node cells with either exogenous ATP or NAD results in staining of the cells with ethidium bromide or YOPRO-1.
  • EXAMPLE 6 Pretreatment of T cells prevents NAD-induced apoptosis:
  • the results presented in FIG. 5 A, obtained by flow cytometry show that preincubation of the cells with o-ATP, which irreversibly binds to the P2X receptor and blocks its ability to induce the formation of membrane pores, blocks NAD-induced apoptosis of T cells.
  • other P2X 7 receptor antagonists such as KN62, PPADS or suramin block induction NAD-induced apoptosis of T cells ( Figure 5B).
  • EXAMPLE 7 Apoptosis induced by NAD, but not that induced by ATP, requires the presence of an ART2:
  • the results presented in FIG. 6 show that T cells deficient in ART2_ (W Ohlrogge, et al. , T cells of ART2 knockout mice can not ADP-ribosylate cell surface proteins and are less sensitive to NAD-mediated supression of proliferation, Immunobiol., 2000, 203, 181) ( Figure 6B), having lost the capacity of ADP-ribosylation cell surface proteins are as sensitive to ATP-induced apoptosis as normal non-deficient mouse T cells ( Figure 6A) which have retained the ADP-ribosylation capacity of cell surface proteins.
  • ART2-deficient T cells are completely resistant to induced NAD apoptosis. This confirms the existence of an effect of NAD on the P2X receptor via direct ADP-ribosylation of the receptor or via ADP-ribosylation of proteins of the cell surface acting on the receptor.
  • FIGS. 6 and 7 show differences in the staining with annexin-V induced by NAD or by ATP.
  • the response to ATP shows a threshold effect: below 50 ⁇ M, ATP does not induce apoptosis whereas this is induced by doses of ATP of 100 ⁇ M and more. On the contrary, NAD immediately induces staining of cells with annexin-V at a concentration as low as 1 ⁇ M.
  • the transfected HEK293 cells were previously detached from the culture flasks by treatment with trypsin, then incubated at 37 ° C. for 1 hour in complete culture medium (DMEM / F12, Invitrogen). These cells were then treated with ATP or NAD at the indicated concentration for 30 min at 37 ° C. before being washed and then labeled with P annexin-V-FITC (BD Biosciences) and propidium iodide ( BD Biosciences) as described in the previous examples. The cells thus treated were then analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 8A show that the non-transfected HEK293 cells are resistant to apoptosis induced by NAD or ATP, even at high concentrations.
  • Figure 8B shows that the HEK293 cells transfected by the P2X 7 receptor are sensitive to apoptosis induced by ATP but not to that induced by NAD.
  • FIG. 8C reveals that only the double cells transfected by the genes coding for PART2 and the P2X receptor are sensitive to apoptosis induced by NAD.

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Abstract

La présente invention est relative a l'utilisation d'au moins un analogue du NAD, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) et antagoniste du NAD, dans la préparation d'un médicament destiné a moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique, avantageusement de type P2X ou P2Y, ledit médicament étant particulièrement destiné au traitement des pathologies dans lesquelles les récepteurs purinergiques participent au processus physiopathologique ou des pathologies liées a une dérégulation de l'activité des récepteurs purinergiques.

Description

UTILISATION D'UN ANALOGUE DU NAD, SUBSTRAT DES MONO-ADP- RIBOSYL TRANSFERASES ET ANTAGONISTE DU NAD, POUR LA PREPARATION D'UN MEDICAMENT DESTINE AU TRAITEMENT DES PATHOLOGIES LIEES AUX RECEPTEURS PURINERGIQUES. La présente invention est relative à l'utilisation des analogues du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), substrats des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) et antagonistes du NAD dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique, avantageusement de type P2X ou P2Y, ledit médicament étant particulièrement destiné au traitement des pathologies dans lesquelles les récepteurs purinergiques participent au processus physiopathologique ou des pathologies liées à une dérégulation de l'activité des récepteurs purinergiques.
L'analyse du génome de nombreuses espèces ne cesse de révéler de nouvelles protéines capables de lier les purines naturelles que sont l'adénosine, l'adénosine triphosphate (ATP) ou le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et qui interviennent dans la communication cellulaire par des actions pharmacologiques spécifiques. Il s'agit en particulier des récepteurs purinergiques de type PI, principalement sensibles à l'adénosine, ou P2, principalement sensibles à l'ATP, et des adénosine diphosphate-ribosyl transférases (ADP-ribosyl transférases) qui ont une activité enzymatique qui leur permet de transférer un groupement ADP-ribose du NAD sur des protéines cibles.
Il est connu que l'ATP, outre son rôle de co-facteur enzymatique et son rôle dans la formation de liaisons phosphates, est aussi un messager extracellulaire impliqué dans de nombreux processus biologiques, produisant ces effets via une famille particulière de récepteurs purinergiques présents à la surface des cellules de nombreux tissus, les récepteurs P2.
Les récepteurs P2 existent sous la forme de deux familles distinctes, les récepteurs P2X dont il est connu sept isoformes (P2X1-7) et qui sont des canaux ioniques qui sont constitués après activation par la formation d'homo- ou d'hétéro- polymères dans les membranes, et les récepteurs P2Y, protéines à sept domaines transmembranaires, qui sont couplés aux protéines G et dont il est connu 11 isoformes (P2Yι.π).
Les récepteurs P2, du fait de leur présence dans de nombreux tissus, sont impliqués dans une grande variété de fonctions biologiques et ainsi potentiellement impliqués dans de nombreuses pathologies comme par exemple et sans limitation, les maladies neurologiques et neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires et l'ischémie, les maladies inflammatoires systémiques, le cancer ou encore les maladies autoimmunes comme le diabète. On peut à cet égard se référer à la revue de G. Burnstoc et M. Williams (The Journal of Pharmacology and Expérimental Therapeutics, 2000, 295 : 862-869).
Les récepteurs P2X et P2Y sont décrits dans les systèmes nerveux central et périphérique sur lesquels on sait que l'ATP produit des effets aussi bien sédatifs qu'excitants. Ils sont aussi décrits dans le système auditif.
Il en est de même dans le système oculaire où les récepteurs P2X et P2Y seraient impliqués dans la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire qui peut être réduite par l'utilisation d'analogues de l'ATP via les récepteurs P2. A l'inverse, une activation du récepteur P2Y2 entraîne une augmentation des sécrétions oculaires, ce qui permet d'envisager l'utilisation d'activateur de ces récepteurs P2 pour le traitement des pathologies liées à la sécheresse oculaire. Au niveau rétinien, l'augmentation de l'activité des récepteurs P2Y serait impliquée dans les décollements de la rétine.
Des antagonistes des récepteurs P2X sont décrits comme de potentiels agents anti-épileptiques.
Il a été montré que des souris déficientes en récepteur P2X3 présentent une perception de la douleur fortement diminuée. Dans cet ordre d'idée, des antagonistes des récepteurs P2 présentent des propriétés analgésiques.
L'implication des récepteurs P2 est aussi décrite dans les phénomènes d'homéostasie cellulaire, dans les processus de neuroviabilité et de neurorégénération ainsi que dans les pathologies neurodégénératives, dans les pathologies de l'incontinence urinaire (P2X), dans le psoriasis (P2X), dans la sclérodermie (P2X), l'infertilité masculine (P2X) ou encore dans les carcinomes cellulaires basaux.
Des souris déficientes en récepteurs P2Yj. présentent une résistance accrue aux thromboses. Des antagonistes des récepteurs P2Y sont connus comme présentant une activité anti-thrombique.
Il est également évoqué que la modulation de l'activité des récepteurs P2 (X et Y) pourrait être un traitement potentiel de l'ostéoporose, de l'arthrite rhumatoïde, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie.
L'augmentation des sécrétions dans le colon et les canaux biliaires et pancréatiques, de même que la sécrétion de l'insuline par le pancréas sont décrites comme liées à une modification de l'activité des récepteurs P2Y.
L'implication des récepteurs purinergiques est aussi décrite dans les maladies inflammatoires systémiques telles le lupus ou la polyarthrite, les maladies inflammatoires du colon, le cancer et les maladies autoimmunes comme le diabète.
L'implication des récepteurs P2X dans l'apoptose cellulaire est bien décrite. L'activation des récepteurs P2 déclenche l'apoptose pour faciliter l'embryogenèse, mais également pour éliminer des tissus les cellules cancéreuses ou infectées. L'activation du récepteur P2X via l'ATP, induit une cytolyse des macrophages infectés, ce qui représente une voie potentielle de traitement des pathologies infectieuses, comme cela est par exemple décrit pour le traitement de la tuberculose (Stober C. B. et al., The Journal of Immunology, 2001, 166 : 6276-6286).
On comprend de ce qui précède l'importance des récepteurs purinergiques, particulièrement des récepteurs P2, (P2X et P2Y), et de la modulation de leur activité dans les mécanismes biologiques.
Cependant, il apparaît que peu de modulateurs (agonistes ou antagonistes) de l'activité des récepteurs P2 ont été décrits, n'offrant ainsi qu'un nombre restreint d'agents potentiellement utilisables dans la voie de la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques pour le traitement desdites pathologies (voir le document G. Burnstock et M. Williams, précédemment cité). Il reste donc un réel besoin pour de nouveaux modulateurs de l'activité des récepteurs purinergiques. C'est un des buts de la présente invention que de fournir de tels modulateurs.
Par ailleurs, parmi les ADP-ribosyl transférases, les mono-ADP- ribosyl transférases (ART) sont connues" depuis longtemps car elles correspondent aux toxines de nombreuses bactéries pathogènes comme Corynebacterium diphteriae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bordetella petrussis, Clostridium botulinum, Vibrio cholerae ou encore certaines salmonelles (Schmitt et al., Emerging Infectious Diseases, 5 : 224, 1999)
Ce n'est que récemment que l'existence d'ART a été décrite chez les vertébrés. On en connaît aujourd'hui au moins 5 isoformes (Haa g et Koch-Nolte, J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 1998, 12 ; 53. Okazaki et Moss, Ann. Rev. Nutr. 1999, 19 : 485). Chez l'Homme, la souris ou le rat, ces protéines sont en majorité des protéines membranaires glypiées, ancrées dans la membrane par un groupement phosphatidyl innositol (GPI anchored). Elles sont donc présentes à la surface des cellules mais peuvent être relarguées dans certaines conditions grâce, en particulier, à l'intervention de métalloprotéases (Kahl et al, J. Immunol., 2000, 165 : 4463-4469).
On sait encore peu de choses sur le rôle de ces ART. Elles sont capables de fixer un groupement ADP-ribose à partir du NAD sur les arginines, les cystéines, les asparagines ou les acides glutamiques de protéines cibles. Chez certaines souches de souris, cela peut aussi conduire à une inhibition de la migration cellulaire par ADP-ribosylation des intégrines et à un blocage des interactions cellulaires. Chez l'homme, l'activité des ART1 dans la peau semble conduire à une ADP-ribosylation de facteurs de croissances comme le facteur de croissance fibroblastique (FGF) et de son récepteur, modifiant ainsi l'homéostasie du tissu. D'une manière plus générale, des déficits dans l'expression des ART ont été décrits, chez le rat et chez la souris, comme des facteurs de prédisposition au diabète et aux maladies auto-immunes, ce qui confirme leur intervention vraisemblable dans la régulation de l'immunité naturelle et acquise.
Récemment, le sous-type ART2.2 a été décrit comme sélectivement présent dans les lymphocytes T matures de souris (Koch-Nolte et al., J.Immunol., 1999, 163 : 6014).
Le NAD est connu pour ses propriétés antagonistes des narcotiques et son utilisation comme produit dissuasif dans le traitement de l'alcoolisme.
A ce jour aucun lien n'a été établi entre les ART, leur activité d'ADP-ribosylation et les récepteurs purinergiques, particulièrement ceux de type P2.
Or de manière surprenante, les inventeurs viennent maintenant de démontrer que l'utilisation d'analogues du NAD, substrats des ART et antagonistes du NAD, peut entraîner un effet pharmacologique lié à la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques, particulièrement ceux de type P2. II a été démontré que le NAD, via une ART, particulièrement le sous-type ART2.2, induit rapidement l'apoptose des lymphocytes T naïfs chez la souris (Adriouch et al., J. Immunol., 2001, 167: 196-203).
Les inventeurs ont maintenant démontré qu'un analogue du NAD, l'éthéno-NAD, qui ne diffère du NAD que par une modification du groupement adénosine, mais qui demeure un substrat efficace des ART, particulièrement le sous- type ART2.2, n'induit pas l'apoptose des lymphocytes T naïfs chez la souris. Cela suggère donc l'existence d'un effecteur secondaire sensible à l'adénosine et non à ses analogues, dont la modulation de l'activité conduit au déclenchement de l'apoptose induite par le NAD via les ART. Les inventeurs ont de manière surprenante découvert que cet effecteur est un récepteur purinergique de type P2X . L'utilisation d'inhibiteurs des récepteurs P2X7 bloque en effet l'apoptose ART-dependante induite par le NAD.
De plus les inventeurs ont démontré que cet effet pharmacologique du NAD sur les lymphocytes T via les récepteurs purinergiques s'exerce à des concentrations cent fois inférieures à celles requises pour induire le même phénomène, via une activation directe par l'ATP des récepteurs purinergiques.
Cela démontre qu'il est possible de moduler l'activité des récepteurs purinergiques par une nucléotide diphosphate-ribosylation induite par ses analogues, substrat des ART, et antagonistes du NAD, et qu'ainsi il doit être possible de moduler les effets pharmacologiques dépendants desdits récepteurs et ce à des concentrations plus faibles que celles nécessaires pour obtenir des effets identiques avec les ligands libres spécifiques des récepteurs purinergiques.
C'est cette découverte qui est à la base de la présente invention. En effet, cela ouvre une nouvelle voie de modulation de l'activité des récepteurs purinergiques et en conséquence de nouvelles voies dans le traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité des récepteurs purinergiques.
Ainsi, l'invention a pour objet l'utilisation d'un analogue du NAD, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) et antagoniste du NAD dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique, avantageusement de type P2X ou P2Y.
Par « analogue du NAD, substrat des ART» on entend un composé du type nucléotide-diphosphate-ribose-nicotinamide, ou un composé de structure chimique proche de cette séquence, qui, comme le NAD, sous l'action des ART transfère un groupement nucléotide-diphosphate-ribose sur les protéines cibles. Par « antagoniste du NAD », on entend un composé qui, après élimination de la nicotinamide et transfert covalent du reste nucléotide diphosphate ribose sur des protéines cibles, entraîne une inhibition des purinorécepteurs, alors que le transfert à partir du NAD entraîne une activation de ces mêmes purinorécepteurs.
L'évaluation de l'activité de substrat des ART et antagoniste du NAD est illustrée dans les exemples.
Par modulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique on entend une diminution ou une inhibition de l'activité dudit récepteur.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le médicament est destiné au traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique, particulièrement un récepteur de type P2X ou P2Y.
Par pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique, on entend les pathologies liées soit à l'apparition, l'augmentation, la diminution ou la disparition de l'activité dudit récepteur.
Par analogues du NAD substrats des ART on entend selon l'invention, des molécules sur lesquelles ont été introduites des modifications du groupement nicotinamide, des modifications de la liaison 5'-5' pyrophosphate, des modifications du groupement ribose de la partie ADP du NAD, des modifications du groupement adénine ou une combinaison de ces différentes modifications.
Avantageusement , les analogues du NAD sont choisis parmi les composés qui diffèrent du NAD en ce que le groupement adénosine a été remplacé par une autre purine ou un analogue de purine.
A titre d'exemple d'analogues du NAD et antagonistes du NAD connus utilisables selon l'invention on peut citer l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) ou le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD).
Les travaux de Kim et al., (EMBO Journal, Vol. 20, N°22, pp 6347-6358, 2001) montrent que dans les cellules embryonnaires humaines de rein, le récepteur P2X7 est associé à 11 autres protéines, dont certaines pourraient avoir un rôle régulateur du récepteur P2X .
Ainsi, la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques par une ADP-ribosylation induite par le NAD ou ses analogues, substrat des ART, peut se faire soit par ADP-ribosylation directe des récepteurs purinergiques, soit par ADP- ribosylation d'autres facteurs protéiques environnants qui eux-mêmes interviendraient alors sur les récepteurs purinergiques.
Les différentes ART ainsi que les différents récepteurs purinergiques ont des distributions ubiquitaires dans l'organisme. Plusieurs ART et plusieurs récepteurs purinergiques peuvent être présents sur une même cellule. Cependant ni toutes les ART, ni tous les récepteurs purinergiques ne sont présents sur tous les types cellulaires. Ainsi, il peut exister à la surface des cellules des couples ART/récepteurs purinergiques spécifiques d'un type cellulaire considéré.
Dès lors il est envisageable d'utiliser des analogues du NAD spécifiques d'une ART particulière, elle-même impliquée dans un couple ART/récepteurs purinergiques spécifique d'un type cellulaire donné, pour moduler spécifiquement l'activité dudit récepteur purinergique.
Les nombreuses fonctions biologiques dans lesquelles les récepteurs purinergiques sont impliqués, permettent d'envisager l'utilisation d'au moins un analogue du NAD, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) et antagoniste du NAD dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies des systèmes nerveux central et périphérique, comme les troubles neurologiques ou les pathologies neurodégénératives, particulièrement en intervenant sur les processus de neuroviabilité et de neurorégénération, au traitement des pathologies du système cardiovasculaire, particulièrement les thromboses comme agent antithrombique, au traitement des pathologies du système auditif, au traitement des pathologies du système oculaire particulièrement celles liées à la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire ou encore celles liées à la sécheresse oculaire par une augmentation des sécrétions oculaires ou encore le traitement des décollements de la rétine, au traitement de la douleur par exemple comme analgésiques, au traitement des pathologies inflammatoires systémiques comme l'arthrite rhumatoïde, le lupus ou encore la polyarthrite, au traitement des pathologies du système gastro-intestinal comme les pathologies inflammatoires du colon ou les pathologies nécessitant une modulation des sécrétions dans le colon ou les canaux biliaires, au traitement des pathologies autoimmunes comme le diabète, par exemple par la stimulation de la sécrétion de l'insuline par le pancréas, au traitement du cancer et des carcinomes cellulaires basaux, au traitement de l'épilepsie, au traitement de l'incontinence urinaire, du psoriasis, de la sclérodermie, de l'infertilité masculine, de l'ostéoporose, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie, au traitement des pathologies infectieuses. L'invention a aussi pour objet un procédé d'évaluation de l'effet modulateur d'une mono-ADP-ribosyl transférase présente à la surface d'une cellule, sur un récepteur purinergique présent à la surface de la même cellule, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ladite cellule avec un composé connu comme substrat de ladite mono-ADP-ribosyl transférase, et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité dudit récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins, placées dans les mêmes conditions expérimentales.
L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation de l'effet d'un composé, substrat d'une mono-ADP-ribosyl transférase, sur les récepteurs purinergiques, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ledit composé avec des cellules porteuses de ladite mono-ADP-ribosyl transférase et d'au moins un récepteur purinergique et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité du récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins placées dans les mêmes conditions expérimentales. Dans les procédés selon l'invention, les cellules témoins sont des cellules qui, dans les mêmes conditions expérimentales, soit n'ont été mises en contact avec aucun composé substrat des mono-ADP-ribosyl transférases, susceptible d'induire un effet sur les récepteurs purinergiques, soit ont été mises en contact avec un composé substrat des mono-ADP-ribosyl transférases, connu pour avoir un effet sur les récepteurs purinergiques.
De même, les moyens appropriés pour évaluer le niveau d'activité du récepteur purinergique sont ceux que connaît l'homme du métier dans la mesure où il sait évaluer, indépendamment de tout effet dû à une mono-ADP-ribosyl transférase, l'activité du récepteur purinergique. On peut citer à titre d'exemple la détection d'un marqueur de ladite activité du récepteur purinergique par des anticorps spécifiques dudit marqueur, l'induction de flux calciques, l'activation de protéines G, la synthèse d'AMP-cyclique, l' ouverture d'un canal ionique détectable en électrophysiologie, l'induction d'une perméabilité à des molécules comme le YOPRO-1 ou le bromure d'éthidium, l'expression des phosphatidyl serines détectable par l'annexine-V, l'apoptose mesurée par l'analyse de la fragmentation de l'ADN, la sécrétion de cytokines, sans que cette liste soit limitative .
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
La Figure 1 représente les résultats des expériences réalisées en vue de démontrer l'implication des ART2 dans l'apoptose des cellules T.
Les Figures 2 et 3 représentent les résultats des expériences réalisées en vue de montrer les effets d'un analogue du NAD sur les cellules T. - La Figure 4 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer les effets du NAD et de l'ATP sur la formation de pores membranaires dans les cellules de ganglions lymphatiques.
La Figure 5 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose des lymphocytes T, induite par le NAD, passe par l'activation du récepteur P2X .
Les Figures 6 et 7 représentent les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose des lymphocytes T, induite par le NAD, requiert la présence d'une ART2. - La Figure 8 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose cellulaire induite par le NAD requiert la présence simultanée d'une ART2 et du récepteur P2X .
Les exemples suivants sont illustratifs de l'invention et ne la limitent aucunement. EXEMPLE 1 : Matériel et Méthodes
1. Produits
L'adénosine triphosphate (ATP), le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide
(NHD), le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD), l'ATP oxydé (oATP), benzoyl-benzoyl ATP (bzATP) sont vendus par la société SIGMA ; le YOPRO-
Yellow (ou YOPRO-1) est vendu par la société Molecular Probes.
La molécule KN62, l'acide pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2',4'- disulfonic (PPADS) ou la suramine sont vendus par la société SIGMA.
Le milieu RPMI est vendu par la société INVITROGEN. 2. Cellules, anticorps et analyse par immunofluorescence :
L'anticorps monoclonal spécifique de 1ΑRT2-2, NIKA102, (IgG2a de rat) a été produit selon la méthode décrite par Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163 : 6014).
Les suspensions de cellules individualisées issues de thymus, de rate ou de ganglion lymphatique ont été analysées par cytométrie de flux à l'aide d'un FACScan (Becton Dickinson) selon la méthode décrite par Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163 : 6014).
Lorsque nécessaire, la déplétion en cellule B a été réalisée par la technique de séparation cellulaire à l'aide d'anticorps anti-souris de chèvre (IgG) immobilisées sur billes magnétiques Dynabead (Dynal, Hambourg, Germany).
L'anticorps monoclonal de souris 1G4 (IgG2a) spécifique de l'éthéno-adénosine a été produit selon la méthode décrite par Young and Santella (Carcinogenesis, 1988, 9 : 589)
Les autres anticorps monoclonaux utilisés dans les essais d'immunofluorescence, anti-CD3e (145-2C11), anti-CD4 (GK1.5), anti-CD8 (53-6.72) proviennent de la société CALTAG. La biotine, la phycoérythrine (PE) et la fluorescéine iso-thiocyanate
(FITC) proviennent de la société Pharmigen (Becton-Dickinson/Pharmigen).
L'anticorps GK1.5 (anti-CD4) a été marqué avec Pindocarbocyanine Cy3™ selon la méthode décrite par Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163 : 6014). 3. Exposition des phosphatidylsérines et formation des pores membranaires :
Les cellules apoptotiques et nécrotiques ont été marquées avec le conjugué annexine-V-FITC ou de l'iodure de propidium, tel que décrit dans Koch- Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163 : 6014). Après traitement au NAD ou à l'ATP à 37°C, les cellules ont été lavées en milieu RPMI additionnée de 2 mM de CaCl , puis marquées dans le même milieu pendant 20 minutes sur de la glace avec du conjugué annexine-V-FITC (1 μg/ml) et de l'iodure de propidium (10 μg/ml), ou des IgG anti-souris PE-conjuguées.
L'exposition des phosphatidylsérines à la surface cellulaire, signe précoce de l'apoptose détectable grâce à l'annexine-V, est alors mesurée par cytométrie de flux avec le conjugué annexine-V-FITC.
Pour les essais de formation de pores perméables au YOPRO-1, les cellules ont d'abord été incubées en présence des nucléotides dans du milieu RPMI à 37°C. Le YOPRO-1 (concentration finale de 10 μg/ml) est ajouté dans les 2 dernières minutes de l'incubation. Les cellules sont placées sur la glace et lavées avec du milieu réfrigéré à la température de la glace puis contrecolorées pendant 20 minutes à 4°C avec du conjugué annexine-V-FITC (1 μg/ml); de l'iodure de propidium (10 μg/ml) ou des IgG anti-souris PE-conjuguées. La coloration des cellules au bromure d'éthidium (1 μg/ml) est réalisée dans du milieu RPMI en présence des nucléotides à 37°C. Les cellules ont ensuite été lavées et contrecolorées au conjugué annexine-V-FITC pendant 20 minutes sur de la glace.
La formation de pores perméables est ensuite mesurée par la mesure de l'incorporation de YOPRO-1 et du bromure d'éthidium en cytométrie de flux.
4. Protection des cellules contre l'apoptose par préincubation avec des anticorps, de l'éthéno-NAD ou des antagonistes P2X :
Les cellules ont été préincubées soit 30 minutes sur de la glace dans du milieu RPMI contenant des anticorps anti-ART2 spécifiques (à 3 μg/ml), soit pendant 45 minutes à 37°C en milieu complet (RPMI additionné de 10 % de sérum de veau fœtal, de pyruvate, de glutamate)), contenant 10-50 μM d'éthéno-NAD ou encore pendant 2 heures à 37°C en milieu complet contenant des antagonistes P2X aux concentrations indiquées.
Les cellules ont ensuite été incubées en milieu RPMI contenant du NAD, de l'ATP pendant 30 minutes à 37°C et soumises à une coloration avec de l'annexine-V, de l'iodure de propidium, du YOPRO-1 ou des anticorps fluorescents selon la méthode décrite précédemment.
EXEMPLE 2 : L'apoptose des cellules T est induite au travers de l' ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface catalysée par les ART2
L'incubation des cellules T de ganglions lymphatiques en présence de NAD exogène (10 μM) induit rapidement l'exposition de phosphatidylsérines, un signe précoce de l'apoptose (Figure 1A, encart central). A l'inverse, l'ADP-ribose, qui peut être généré à partir du NAD par les NAD-glycohydrolases, n'induit pas l'apoptose, même à des concentrations 100 fois supérieures (1 mM) (Figure 1A, encart droit). L'exposition de phosphatidylsérines induite par le NAD peut être prévenue par pré-incubation des cellules avec un mélange d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine de surface ADP-ribosyltransferase ART2.2 (Figure 1B, encart droit).
Cela indique que l'ADP-ribosylation NAD-dépendante d'autres protéines de la surface cellulaire, catalysée par 1ΑRT2.2, déclenche l'apoptose des cellules T.
EXEMPLE 3 : L'éthéno-ADP-ribosylation des protéines de surface prévient l'apoptose NAD induite :
L'analogue du NAD, l'éthéno-NAD est un substrat efficace des ecto- ART2.2 et l'éthéno- ADP-ribosylation des protéines de surface peut être facilement suivie par cytométrie de flux avec l'anticorps anti-éthéno-adénosine 1G4 (Figure 2A, encart central). L'incubation des cellules T avec de l'éthéno-NAD n'induit pas l'apoptose (Figure 2B, encart central), malgré une incorporation efficace d'éthéno- ADP-ribose dans les protéines de la surface cellulaire.
Cela suggère que l'ADP-ribosylation, mais non l'éthéno-ADP- ribosylation d'un même effecteur secondaire, peut déclencher l'apoptose.
Cela est démontré par un traitement préventif des cellules avec de l'éthéno-NAD, qui prévient l'induction de l'apoptose par un traitement subséquent des cellules avec du NAD (Figure 2C). La préincubation avec de l'éthéno-NAD protège les cellules de l'exposition des phosphatidylsérines induite par le NAD et de l'apoptose.
EXEMPLE 4 : Le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) et le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD) préviennent l'apoptose NAD induite : Le nicotinamide hypoxanthine dinucléoide (NHD) et le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD) sont des analogues structuraux du NAD.
L'incubation des cellules T avec des concentrations croissantes de NHD (Figure 3 A) ou de NGD (Figure 3B) pendant 30 minutes à 37°C n'induit pas l'apoptose. Cependant, la préincubation des mêmes cellules avec des concentrations croissantes de NHD (Figure 3 A) ou de NGD (Figure 3B) pendant 15 minutes, suivi d'une incubation avec 30 μM de NAD pendant 30 minutes, prévient l'exposition des phosphatidylsérines induite par le NAD et l'apoptose.
Ces observations démontrent, comme dans le cas de l'éthéno-NAD, que le NGD et le NHD sont des substrats des ART. Comme l'éthéno-NAD, les NHD et le NGD ne sont pas des analogues agonistes du NAD mais des antagonistes qui inhibent son activité.
Elles démontrent également qu'une modification du groupement adénosine du NAD est compatible avec le maintien de la propriété de substrat des ART mais prévient la capacité d'induire un signal apoptotique. EXEMPLE 5 : Le traitement des cellules T déclenche la formation de pores membranaires perméables au YOPRO-1, colorant de l'ADN :
Le NAD et l'éthéno-NAD ne différent que par le groupement adénosine. La découverte que l'ADP-ribosylation, mais pas l'éthéno-ADP- ribosylation, induit l'apoptose indique qu'un effecteur secondaire essentiel de l'apoptose NAD-induite doit être sensible à une différence dans le groupement adénosine.
Le récepteur P2X7 est décrit comme impliqué dans la formation de pores membranaires, induite par l'ATP, qui peut être facilement suivie par la capture de colorant de l'ADN tels que le bromure d'éthidium ou le YOPRO-1. Les résultats présentés à la Figure 4A montrent que l'incubation de cellules de ganglions lymphatiques avec soit de l'ATP exogène, soit du NAD, résulte en une coloration des cellules par le bromure d'éthidium ou le YOPRO-1.
La capture du colorant de l'ADN suit rapidement l'exposition des phosphatidylsérines et est complète après 30 à 45 minutes d'exposition au NAD (Figure 4B).
EXEMPLE 6 : Le prétraitement des cellules T prévient l'apoptose NAD-induite : Les résultats présentés à la Figure 5 A, obtenus par cytométrie de flux montrent qu'une préincubation des cellules avec de l'o-ATP, qui se fixe irréversiblement au récepteur P2X et bloque sa capacité à induire la formation de pores membranaires, bloque l'apoptose NAD-induite des cellules T. De manière similaire, d'autres antagonistes des récepteurs P2X7 comme le KN62, le PPADS ou la suramine bloquent l'induction de l'apoptose NAD-induite des cellules T (Figure 5B).
Ces résultats suggèrent que l'apoptose induite par le NAD passe par l'activation du récepteur P2X .
EXEMPLE 7 : L'apoptose induite par le NAD, mais pas celle induite par l'ATP, requiert la présence d'une ART2 : Les résultats présentés dans la Figure 6 montrent que des cellules T déficientes en ART2_(W Ohlrogge, et al., T cells of ART2 knockout mice can not ADP-ribosylate cell surface proteins and are less sensitive to NAD-mediated supression of prolifération, Immunobiol., 2000, 203, 181) (Figure 6B), ayant perdu la capacité d'ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface, sont aussi sensibles à l'apoptose ATP-induite que des cellules T de souris normales non déficientes (Figure 6A) ayant conservé la capacité d'ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface.
Au contraire, les cellules T ART2-déficientes sont totalement résistantes à l'apoptose NAD induites. Cela confirme l'existence d'un effet du NAD sur le récepteur P2X via une ADP-ribosylation directe du récepteur ou via une ADP-ribosylation de protéines de la surface cellulaire agissant sur le récepteur.
Le fait que le NAD n'affecte pas directement le récepteur P2X est confirmé par le fait qu'un pré-traitement des cellules avec de l'éthéno-NAD (eNAD) (Figure 7B) bloque l'apoptose NAD-induite mais pas l'apoptose ATP-induite (bzATP). Cet effet est à comparer à celui obtenu sans prétraitement à l'éthéno-NAD (Figure 7A). EXEMPLE 8 : Effet-dose de l'ATP et du NAD sur l'apoptose induite :
Les résultats présentés dans les Figures 6 et 7 montrent des différences dans la coloration à l'annexine-V induite par le NAD ou par l'ATP.
La réponse à l'ATP montre un effet de seuil : en dessous de 50 μM, l'ATP n'induit pas l'apoptose alors que celle-ci est induite par des doses d'ATP de 100 μM et plus. Au contraire, le NAD induit immédiatement la coloration des cellules à l'annexine-V à une concentration aussi basse que 1 μM.
EXEMPLE 9 : Seules les cellules transfectées par 1ΑRT2 et le récepteur P2X7 sont sensibles à l'apoptose induite par le NAD : 1. Clonage du P2X7 et de LΑRT2.2 :
Les ADNc de lymphocytes T purifiés provenant de la souris BALB/c ont été préparés puis amplifiés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant des amorces nucléotidiques spécifiques du gène codant pour le P2X de souris décrites par ailleurs (Chessell, I. P. et al., 1998. Cloning and functional characterisation of the mouse P2X receptor., FEBS Lett., 439 : 26). L'enzyme utilisée dans cette réaction de PCR est une polymérase de fidélité supérieure (High fidelity Platinium Taq polymérase, Invitrogen). Le produit de la réaction de PCR a ensuite été clone dans le vecteur commercial pCRBlunt-Topo (Invitrogen) en utilisant les recommandations du fabricant. La séquence nucléotidique du gène ainsi inséré dans ce vecteur a ensuite été vérifiée par séquençage (Génome Express, Montreuil, France). Le gène a ensuite été sous-cloné dans le vecteur d'expression pCDNA6/V5-HisB (Invitrogen) en utilisant les techniques standards de clonage.
Le clonage du gène codant pour 1ΑRT2.2 a été décrit en détail dans la publication de Koch-Nolte, F., et al., 1999. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J.
Immunol, 163 : 6014).
2. Transfection et expression dans les cellules HEK293 :
Les transfections ont été réalisées en combinant lμg de l'un ou l'autre des vecteurs codant pour le gène d'intérêt avec le réactif de transfection FuGENE 6 (ROCHE) en respectant les recommandations du fournisseur. Les cellules utilisées dans ces expériences sont des cellules HEK293 qui proviennent de P American Type Cell collection (ATCC nb : CRL-1573). Ces cellules ont été transfectées puis sélectionnées par la généticine 600μg/ml ou la blasticidine 6μg/ml (Invitrogen) pendant une semaine avant d'être analysées pour leurs sensibilités au NAD et à l'ATP. Les cellules HEK293 transfectées par les deux gènes ont d'abord été transfectées par le gène codant par le P2X , sélectionnées pendant une semaine par la blasticidine 6μg/ml avant d'être transfectées par le gène codant pour PART2.2 puis sélectionnées par la généticine 600μg/ml et enfin analysées pour leurs sensibilités au NAD et à l'ATP.
3. Analyse de la sensibilité à l'apoptose induite par le NAD ou l'ATP
Les cellules HEK293 transfectées ont été préalablement décollées des flasques de culture par traitement à la trypsine, puis incubées à 37°C pendant 1 heure dans du milieu de culture complet (DMEM/F12, Invitrogen). Ces cellules ont été ensuite traitées par de l'ATP ou du NAD à la concentration indiquée pendant 30 min à 37°C avant d'être lavées puis marquées par P annexine-V-FITC (BD Biosciences) et l'iodure de propidium (BD Biosciences) comme décrit dans les exemples précédents. Les cellules ainsi traitées ont ensuite été analysées en cytométrie de flux.
Les résultats présentés sur la Figure 8A, montrent que les cellules HEK293 non transfectées sont résistantes à l'apoptose induite par le NAD ou l'ATP, même à de fortes concentrations. La Figure 8B montre que les cellules HEK293 transfectées par le récepteur P2X7 sont sensibles à l'apoptose induite par l'ATP mais pas à celle induite par le NAD. La Figure 8C révèle que seule les cellules double transfectées par les gènes codant pour PART2 et le récepteur P2X sont sensibles à l'apoptose induite par le NAD.
Les résultats présentés dans les exemples précédents démontrent qu'il existe une voie de modulation de l'activité des récepteurs purinergiques, très puissante, via l'ADP-ribosylation induite par le NAD, soit directement sur les récepteurs soit au travers de l'ADP-ribosylation de protéines membranaires qui agiraient alors sur les récepteurs et leur activité.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un analogue du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) et antagoniste du NAD dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique.
2. Utilisation selon la revendication 1, dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique de type P2X ou P2Y.
3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans la préparation d'un médicament destiné à diminuer ou inhiber l'activité d'au moins un récepteur purinergique.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies des systèmes nerveux central et périphérique, comme les troubles neurologiques ou les pathologies neurodégénératives, particulièrement en intervenant sur les processus de neuroviabilité et de neurorégénération, au traitement des pathologies du système cardiovasculaire, particulièrement les thromboses comme agent antithrombique, au traitement des pathologies du système auditif, au traitement des pathologies du système oculaire particulièrement celles liées à la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire ou encore celles liées à la sécheresse oculaire par une augmentation des sécrétions oculaires ou encore le traitement des décollements de la rétine, au traitement de la douleur par exemple comme analgésiques, au traitement des pathologies inflammatoires systémiques comme l'arthrite rhumatoïde, le lupus ou encore la polyarthrite, au traitement des pathologies du système gastrointestinal comme les pathologies inflammatoires du colon ou les pathologies nécessitant une modulation des sécrétions dans le colon ou les canaux biliaires, au traitement des pathologies autoimmunes comme le diabète, par exemple par la stimulation de la sécrétion de l'insuline par le pancréas, au traitement du cancer et des carcinomes cellulaires basaux, au traitement de l'épilepsie, au traitement de l'incontinence urinaire, du psoriasis, de la sclérodermie, de l'infertilité masculine, de l'ostéoporose, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie, au traitement des pathologies infectieuses.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'analogue du NAD, substrat d'au moins une des ART, est choisi parmi des molécules sur lesquelles ont été introduites des modifications du groupement nicotinamide, des modifications de la liaison 5 '-5' pyrophosphate, des modifications du groupement ribose de la partie adénosine diphosphate (ADP) du NAD, des modifications du groupement adénine ou une combinaison de ces différentes modifications.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'analogue du NAD, substrat d'au moins une des ART, est choisi parmi l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) ou le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD).
8. Procédé d'évaluation de l'effet modulateur d'une mono-ADP- ribosyl transférase présente à la surface d'une cellule, sur un récepteur purinergique présent à la surface de la même cellule, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ladite cellule avec un composé connu comme substrat de ladite mono-ADP-ribosyl transférase, et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité dudit récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins, placées dans les mêmes conditions expérimentales.
9. Procédé d'évaluation de l'effet d'un composé, substrat d'une mono- ADP-ribosyl transférase (ART), sur les récepteurs purinergiques, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ledit composé avec des cellules porteuses d'au moins ladite mono-ADP-ribosyl transférase (ART) et d'au moins un récepteur purinergique et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité du récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins placées dans les mêmes conditions expérimentales.
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