WO2004007713A1

WO2004007713A1 - 新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用

Info

Publication number: WO2004007713A1
Application number: PCT/JP2003/002342
Authority: WO
Inventors: Ichiro Hirao; Shigeyuki Yokoyama; Michiko Hirao; Tsuneo Mitsui
Original assignee: Riken; Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-01-22
Also published as: EP1544294A1; EP1544294B8; EP1544294A4; US20060263771A1; US7745417B2; CA2508468A1; JPWO2004007713A1; EP1544294B1; CA2508468C; JP4464272B2

Abstract

　本発明は、非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供することを目的とする。本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有する。好ましくは、前記塩基の５位が、以下の　　１）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；　　２）アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；　　３）ビオチン又はその誘導体；あるいは　　４）フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子からなるグループから選択される置換基によって置換されている。

Description

新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及ぴその利用技術分野

本発明は、新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用に関する。

背景技術

生体高分子である核酸（DNA， RNA) は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝情報を、僅か 4種類の塩基の組合せからなる配列として記録している。また、核酸は自分自身を铸型として DNAボリメラーゼにより自己複製し、さらに RN Aポリメラ一ゼによる転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、 DNAからDNAへ、 DNAからRNAへ、 R N Aからタンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成（A ' T/U、 G - C) のルールである。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、 i n V i t r oセレクション法によつて、アブタマ一やリポザィムの機能を有する新規核酸がこれまでに多数見つかつてきたこともその一つである。

しかし、 20種類のアミノ酸からなるタンパク質に比べて、天然の核酸には 4 種類の塩基（2種類の塩基対）しかないという事実は、核酸の化学的 ·物理的多様性に限界を与えている。たとえば、生体中の t RNA、 r RNA、 mRNA等の機能性 RNAは自分自身の構造を安定化したり RNA · RNA間、 RNA ·タンパク質問相互作用を安定化するために、様々な修飾塩基を利用している。したがって、新規機能性核酸の開発において、新たな塩基（対）のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられる。

核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製への取り組みが行われている。核酸に修飾塩基（もしくは非天然型塩基）を導入する手法として、 1) 化学合成により直接導入する方法、 2) 核酸合成酵素により導入する方法が考えられる。 1) の場合は、アミダイトュニットの安定性や塩基部分の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、これらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、その核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。 2) の場合は、もし、基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸の増幅 ·調製が可能となるが、そのような基質や塩基対 (非天然型ヌクレオチド) も未だ開発途中である。

非天然型人工塩基対の背景

天然の二本鎖 DN A中の Aと Tおよび Gと Cは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的」な塩基対を形成している（図 l a) 。 B e nn e rのグループはこの水素結合の様式に着目し、天然型塩基対の水素結合の組み合わせとは異なる新たな塩基対をデザインした。中でも i s o G · i s o Cおよび κ · X 塩基対（図 l b) は、いろいろな核酸合成酵素による DNA、 RNA分子中への取り込みについての解析が報告されている [P i c c i r i l l i e t a 1 . , 1 990 ; P i c c i r i l l i e t a 1. , 1 99 1 ; S w i t z e r e t a 1. , 1 993] 。

しかしながら、 1) i s oGは 1位と 2位の間でケト ·ェノールの互変異性をおこすため、 Tとも塩基対を形成してしまうこと、 2) 最近の核酸合成酵素の X 線結晶構造解析から核酸合成酵素との相互作用に重要である 2位のケト基が i s o Cや Kではアミノ基となっているため、核酸合成酵素の種類によっては基質として認識されないこと、 3) i s oCのヌクレオシド誘導体が化学的に不安定であること等の問題があり、これらの非天然型塩基対は現在ではほとんど使われていない。

一方、塩基の疎水性に着目して、水素結合をなくした疎水性塩基対がアメリカのグループから新たにデザインされた。まず Ko o 1 らのグループは、水素結合のドナーゃァクセプ夕一となる原子および官能基を含まないアデニン誘導体とチミン誘導体をそれぞれ合成し、 DNAへの取り込みを調べた。アデニン誘導体に相当するのが、 4一メチルベンズイミダゾール（Ζ) あるいは 9 _メチル— 1一 Ηイミダゾ [ (4， 5) — b] ピリジン（Q) であり、チミン誘導体に相当するのが、 2， 4ージフルォロトルエン（F) である（図 l c) 。これらの疎水性塩基対は対合する塩基間で水素結合をもたないが、大腸菌由来 DNAポリメラ一ゼ Iの K 1 e n owフラグメントにより相補的に DNA中に取り込まれ、また A · F、 Q · T、 Ζ · Τといった塩基対もそれぞれ相補的に取り込まれることが示された [Mo r a l e s & Ko o l， 1999] 。

その後、 Rome s b e r gと S c hu l t zらのグループは、疎水性の塩基対を数多く合成し、それらの塩基対の DN A中への取り込みを網羅的に調べた。彼らの結果は疎水性の塩基同士が効率よく対合することを示しており、その一つの例がピロ口ピリジン（PP) と C 3—メチルイソカルボステリル（M I C S) の塩基対である（図 I d) [Wu e t a 1. , 2000 ] 。しかしながら、疎水性塩基はシエイプフィッティングとは関係なく対合する性質があり、 Ρ Ρ同士ゃ M I C S同士の組み合わせでも効率よ'く DN Α中に取り込まれてしまうという問題点がある。そして、 K 1 e n owフラグメントを用いた場合、シエイプフイツティングしていないこのような組み合わせの塩基を取り込んだ後では伸長反応がほとんど進行しない。

最近、 7—ァザインドール（7A I) 同士の自己相補塩基対（図 I d) は、 K 1 e n owフラグメントと真核細胞由来の DNAポリメラーゼ /3を組み合わせて用いると伸長反応が進行することが示されたが [Ta e e t a 1. , 200 1] 、現段階ではこの方法も実用化には至っていない。

さらに、天然型塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創出の研究が行われている。例えば、 Oh t s uk i e t a 1. , 2001及び H i r a o e t a 1. ， 2002では、プリンの 6位にかさ高い置換基を導入した 2 _アミノー 6—ジメチルァミノプリン（X) と 2—アミノー 6—チェ二ルブリン（s ) 、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもったピリジン 2—オン（y) をデザインし、この x ' y、 s · y塩基対形成を K 1 e n owフラグメントによる D NA中への取り込み効率により調べている（図 2) 。その結果、铸型中の Xに対する yの取り込みは低い選択性しか示さなかったが、 sに対する yの取り込みは、比較的選択性も効率も良いことが示されている。上記 s— y塩基対の開発によって、 R N A中に選択的に yを導入することが可能になったので、 yに機能性の置換基が結合した物質が得られれば、アブタマ一ゃリポザィム等の新規機能性分子が創製可能になる。したがって、そのような y の誘導体の創製が希望されている。

発明の開示

本発明は、 5位置換一 2—ォキソ（1 H ) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供することを目的とする。

本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、好ましくは前記塩基の 5位が、以下の

1 ) ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；

2 ) アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；

3 ) ピオチン又はその誘導体；あるいは

4 ) フルォレセイン、 6—カルポキシフルォレセイン、テトラメチルー 6— カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子

からなるグループから選択される置換基によって置換されている。 5位の置換基は、最も好ましくはヨウ素又はピオチン誘導体である。

本発明はまた、前記ヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供することを目的とする。本発明の核酸は一態様において、前記ヌクレオチドと、 6位置換された 2 一アミノープリン一 9一ィル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している。

本発明はさらにまた、前記ヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、

6位置換された 2 _アミノープリン一 9一ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を铸型として転写、複製又は逆転写を行い、前記 6位置換された 2—アミノープリン一 9一ィル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記 5位置換一 2—ォキソ（1 H ) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオチドを組み込む

ことを含む。本発明はさらに、 5位置換— 2 _ォキソ（1H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸が、前記 5位の置換基を介して共有結合している、核酸と 1またはそれより多くの他分子（DNA、 RNA、タンパク質等の生体分子がより好ましくは例示される）との多量体を提供することを目的とする。

本発明はまた、 5位置換— 2—ォキソ（1H) —ピリジン _ 3—ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を近接させて、前記 5位の置換基を介して前記 DNA同士、 RNA同士、 DNA/RNA、 D N AZタンパク質又は R N A /タンパク質を共有結合させる、ことを含む、前記核酸と他分子（より好ましくは生体分子）との多量体の形成方法を提供することを目的とする。

図面の簡単な説明

図 1は、既知の天然型塩基対と人工塩基対を示す。 a) ワトソン 'クリック塩基対。 b) B e nn e rらによって報告された水素結合様式を変えた塩基対。 c ) Ko o 1 らによって報告された水素結合を持たない塩基対。 d) Rome s b e r gと S c hu 1 t zらによって報告された疎水性塩基対。 Rは s u g a rを示す。

図 2は、水素結合様式の違いと立体障害（シエイプフィッティング）の概念をもとにデザインされた人工塩基対を示す。 a) 2—アミノー 6—ジメチルァミノプリン（X) とピリジン一 2—オン（y) の塩基対。 b) Xと天然型ピリミジン塩基との塩基対。 c) 2—アミノー 6—チェ二ルブリン（s) と yの塩基対。 d) sと天然型ピリミジン塩基との塩基対。

図 3は、本発明の化合物、 3— —D—リポフラノシル）一 5—ョードピリジン一 2 ( 1 Η) 一オン 5，一三リン酸エステル及び 3— （/3— D—リボフラノシル）一 5— （2—フエ二ルェチニル）一ピリジン _ 2 ( 1 Η) 一オン 5 ' —三リン酸エステルの合成スキームを示す。

図 4は、本発明の化合物、 3— （3—D—リポフラノシル）一 5—ョ一ドピリジン一 2 (1 Η) 一オン 5 ' —三リン酸エステル（5 I yTP) の構造及び U V吸収を示す。 a) 3— （j3— D—リポフラノシル）一 5—ョ一ドピリジン一 2 ( 1 H) 一才ン 5， —三リン酸エステル（ 5 I y TP) 。

b) 1 0 mMリン酸緩衝液（ρΗ 7) 中での 5 I y TPの UV吸収。 ma x = 3 1 8 nm。

図 5は、 RNA 9 Aに 5 I yを位置選択的導入するための铸型 DNAを調製する際に用いたプライマー（a) と RNA 9Aの配列（b) を示す。（a) において、非天然型塩基 sを含む箇所は j_で示した。（b) において、 RNA 9 A中の 5 I yに導入する配列部分を下線で示した。

図 6は、 RNA 9 Aへの 5 I yの位置選択的導入を示す。

a) 0. 2 51!1 の5 1 が存在下（+ ) もしくは非存在下（一）で転写反応を行い、その反応産物を電気泳動した場合のオートラジオグラム。 5 I yが導入される位置および全長の位置を左横に示した。

b) RNA 9 Aの二次構造上に、 5 I yが導入される箇所を黒丸で示した。図 7は、転写反応産物の塩基組成分析を示す。 0. 2 5mM 5 I yの存在下 ( c - e , h - j ) もしくは非存在下（b， g) で転写された反応産物（全長；図 6参照）を RN a s e T₂で完全分解した後、 2D— TLCで解析した。それぞれの塩基に相当するスポットの位置を a) 、 f ) に示した。 b— e) [a __{32 p}] ATPを用いて標識した場合。 g— j ) [ひ一³² P] GTPを用いて標識した場合。それぞれのスポットを定量した結果は、表 1に示した。

図 8は、 5 I yを位置選択的に含む RNAの架橋反応を示す。各 RNAと GS T一 RBDを混合して 3 7。Cで 3 0分間インキュベートした後、氷上で UVトランスイルミネーターを用いて、 UV (3 1 2 nm) を 1時間照射した。そのサンプルを電気泳動した場合のオートラジオグラム。 RNA 9 A (5 I y 84) 、 9 A ( 5 I y 8 7) 、 9 A ( 5 I y 9 2) 、 9 A ( 5 I y 84/92) は、塩基が 84、 8 7、 9 2、 84と 9 2の位置に 5 I yが導入された RNA。 9A ( 5 I y) 、 9 A (5 I U) については、表 2参照。 U V照射により生じた架橋反応産物のバンドの位置を左横に示した。

図 9は、 RNA 9 A ( 5 I y 84) と 9A ( 5 I y 8 7) の架橋反応を示す。各 RNAを GS T— RBDの存在下（レーン 2— 4， 6 - 8) もしくは非存在 03002342

下（レーン 1， 5) で UVを照射した。照射後にプロテナーゼ K処理（PK) もしくはフエノ一ル ·クロ口ホルム抽出（p h e n o 1 ) によりタンパク質を除去したが、架橋反応産物のパンドに変化はなかった（レーン 3， 4, 7, 8) 。図 10は、 RNA (5 I y 87) の架橋反応産物 X Lは 9 Aが二量化したもので、 2分子の GST— RBDと結合することを示す。 a— d) 各 RNAと GST 一 RBDとの結合をゲルシフトアツセィにより解析した。 c) 各 RNA (a— d ) の配列を示した。 RNA 9 Aの配列と異なる部分を太字 '下線で示した。図 1 1は、 R a i— 1 RBDに結合する RNAアブ夕マーの i n v i t r oセレクションの概略を示す。タンパク質がニトロセルロースフィルタ一に吸着することを利用したフィルター結合法によるセレクションを用いた。ランダム配列を含んだ RNAプールから R a f — 1 RB Dに結合した RNAを選別し、 R T— P CRと転写反応により次のラウンドの RNAプールが増幅される。この一連の操作を繰り返すことで、 R a i— 1 RBDに結合する RNA分子が濃縮される。

図 12は、各 RNAアブ夕マーのタンパク質への結合曲線を示す。各 RNAァプタマー（2 nM) が種々の濃度のタンパク質へ結合する効率（B i n d i n g %) をフィルタ一結合法により求めてプロットした。

RNA 9Aの R a f — l GST— RBDへの結合：黒丸

RNA 9Aの B—R a f GST— RBDへの結合：白丸

RNA 9Aの RGL GST— RBDへの結合： X

RNA 9 Bの R a f — l GST— RBDへの結合：黒四角

RNA 2 1. 0 1の Ra f — l GST— RBDへの結合：黒三角図 1 3は、 RNA 9 Aの二次構造を示す。 RNa s eによる限定分解と化学修飾を用いて、 RNA 9 Aの二次構造を予測した。固定領域を小文字で、ランダム領域を大文字で示した。 RN a s eによる切断パターンとアルキル化剤（ DMSと CMCT) による修飾パターンを二次構造上にそれぞれマツビングした。 R a f — l GS T— RBDの存在下、化学修飾がフットプリントされた配列部分を白丸で示した。 2003/002342

図 14は、ピオチン一アビジンの相互作用を利用した RNAの固定化法を示す。図の左側は従来技術の説明であり、ピオチンを結合した DNAをアビジン化担体に結合し、これに RNAをハイブリダィズさせる方法（従来法 1) 、並びに、ピオチンを 5位に結合したゥリジンを転写により RN A中にランダムに導入し、これをアビジン化担体に結合させる方法（図 14、従来法 2) を図示したものである。図の右側は、ピオチンを結合した第 5番目の塩基を、人工塩基対を介して、転写により RNA中の特定部位に導入させる、本発明の方法を図示したものである。

図 1 5は、エチレン型リンカ一を介してピオチンを結合させた本発明の. y誘導体の合成を示す。

図 16は、エチレン型リンカ一を介してピオチンを結合させた本発明の yの誘導体の三リン酸化を示す。

図 1 7は、アセチレン型リンカ一を介してピオチンを結合させた本発明の y誘導体の合成を示す。

図 18は、アセチレン型リンカ一を介してピオチンを結合させた本発明の yの誘導体の三リン酸化を示す。

図 1 9は、 RNAへの B i o— yTP (化合物 6 ) および B i o²— yTP ( 化合物 1 3) の位置選択的導入を示す。 ImM B i o— yTP又は B i o² - yTPの存在下（+) 、若しくは非存在下（一）で転写反応を行い、その反応産物を電気泳動した場合のオートラジオグラムを示した。 8 1 0— 丁？又は81 o²-y TPが導入された場合の産物の長さをお横に、導入されていない場合の産物の長さを左横に、それぞれ矢印で示した。

発明を実施するための最良の形態

非天然型塩基対 s · yを利用した場合には間違った Uの取り込みは無視できるほどの選択性を示し、 mRNA中の特定の位置に yを導入して、 s · y塩基対を新たなコドン ·アンチコドン相互作用に利用できることが示された [H i r a o e t a 1. , 2002] 。本発明者らは、 5位に置換基をもつ y誘導体を R

N A中に位置選択的に導入し、新たな機能をもつ RN Aの創製取り組み、本発明を想到した。 5位置換一 2—ォキソ（1 H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド

本発明は、 5位置換一 2—ォキソ（1 H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明の 5位置換ピリジン塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドは、ピリジン塩基の 1， 2又は 6位に置換基を導入したヌクレオシド又はヌクレオチドと比較して、塩基間の不要な干渉（塩基対形成時の立体障害や不要な結合形成）が起こりにくいという利点を有する。

本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、前記「核酸塩基」は、ァデニン、グァニン、シトシン、チミン、ゥラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。前記「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、 5位置換— 2—ォキソ（1 H) —ピリジン一 3—ィル基に相当する塩基や、 2—アミノー 6— ( 2—チェニル）プリン一 9ーィル基に相当する塩基、などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、 1ないし 3リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、 2 ' —デォキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を 2 ' 位に有する 2 ' —置換リポフラノシルであってもよく、また、リン酸部分は、チォリン酸であってもよい。つまり、糖部分およびリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリポフラノシルであるリポヌクレオチドは R N Aの構成成分となり、デォキ本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、好ましくは前記塩基の 5位が、以下の

1 ) ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；

3 ) ピオチン又はその誘導体；あるいは 4) フルォレセイン、 6—カルボキシフルォレセイン、テトラメチルー 6— カルポキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子

からなるグループから選択される置換基によって置換されている。

1) ヨウ素、臭素から選択される光反応性基は、光照射することによりラジカルを発生させ、隣接する分子を共有結合する。限定されるわけではないが、例えば、ヨウ素の場合（5—ョード y) 、好ましくは約 3 1 8111111；¥を約1時間照射する。

限定されるわけではないが、 5位の置換基は最も好ましくはヨウ素である。 3 一（)3—D—リポフラノシル）一 5—ョ一ドピリジン一 2 (1H) —オンの 5，一三リン酸誘導体（5 I yTP) の構造式は、図 4 a) に記載されている。

2) 本発明のヌクレオシド又はヌクレオチド中の塩基は、 5位の置換基として、アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体を有することも可能である。

アルケニル、アルキニル、アミノ基、又はその誘導体は、他分子と疎水的あるいは親水的な相互作用に役立ち、例えば、アブ夕マーとその夕一ゲットとなる分子との間の相互作用を強めることができる。また、リポザィムの場合には、新たな活性部位を創製することが出来る。さらに、ァミノ基の誘導体は、このものからビォチンや蛍光色素の結合した誘導体の合成中間体にもなる。

アルケニル基又はアルキニル基は、好ましくは、炭素数 2ないし 5、より好ましくは、炭素数 2ないし 3である。誘導体としては、例えば、一 C≡CC₆H₅ 、一 C三 CCH₂NH₂、一 CH=CH— CH₂— NH₂が含まれる。好ましくは、一 C≡CC₆H₅ (2—フエニルェチニル基）である。

3) ピオチンは補酵素 Rとも呼ばれ、ビタミン B群の 1種である。ビォチンは、卵白中に含まれる糖タンパク質であるアビジンと特異的に結合し、複合体を形成することが知られている。よって、 5位の置換基としてピオチンを有する本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、アビジンタンパク質に特異的に結合する。このため、ピオチンが結合した本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドを含む核酸は、アビジンを結合した担体と結合させることができるので、核酸を固定化することができ、特定の分子に結合する核酸（アブ夕マーなど）を固定化すれば、例えば、特定物質の検出や単離に、また、診断試薬として利用できる。

ピオチンを核酸に結合させるための従来技術としては、第一にピオチンを結合した短い DNAを化学合成により調製し、これをアビジン化担体に結合し、これに相補性を有する核酸をハイブリダィズさせる方法がある（図 14、従来法 1) 。 DNAの合成とハイブリダィゼ一シヨンが含まれ、操作が煩雑になり、また、 ' 核酸の固定化の効率も、ビォチン一アビジンの結合ではなく、ピオチンを結合した短い DNAと、標的配列を含む相補配列とのハイブリダィゼ一シヨンに依存してしまう。

また、ピオチンを 5位に結合したゥリジンを用い、転写により RNA中に（铸型 DNA中の Aに相補して）ランダムにピオチンを導入し、これをアビジン化担体に結合させる方法も知られている（図 14、従来法 2) 。この方法に関しては、 Ro c h e/B o e h r i ng e r Ma nh e i m、 C l o n' t e c h、 E n z o、 P e r k i nE l me rの各社からピオチンを結合したゥリジン（U) (A、 G、 Cの誘導体もある）の基質が販売されている。しかしながら、铸型 D NA中の Aに相補して RNA中に「ランダムに」ピオチンが結合したゥリジンが導入されるという本質的な問題がある。その結果、固定化された RNAの機能が失われたり、固定化の効率が低くなることがある。

従来技術に対して、ピオチンを結合した第 5番目の塩基を人工塩基対を介して、転写により核酸中の特定部位に導入できれば、核酸のピオチン化、そして、それによる核酸の固定化が非常に簡便になる。本発明では s—yという人工塩基対を用いて、これを可能にした。なお、本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドの 5位の置換基としてピオチンを導入するためには、ピオチンを直接導入してもよいが、アミノアルキル基、アミノアルケニル基、アミノアルキニル基等から選択されるリンカ一を介することが好ましい。例えば、本実施例 1 1一 1 5 (図 1 5 - 18) では、エチレン型又はアセチレン型の 2種類のリンカ一を介して、ピオチンを yの 5位に導入させた。本明細書において「ピオチン誘導体」とは、このようにヌクレオシド又はヌクレオチドに導入するために、リンカーを結合させたピオチンを含む。 4) 5位置換基として、フルォレセイン、 6—力ルポキシフルォレセイン、テトラメチルー 6—力ルポキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子を有する場合、蛍光分子の種類に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸の検出を行うことが可能である。よって、 5位に蛍光分子を有する本発明のヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。

限定されるわけではないが、例えば、フルォレセインの吸収極大波長は 5 13 nm、蛍光極大波長は 532 nmである。また、 6—カルボキシフルォレセインの吸収極大波長は 49 5 nm、蛍光極大波長は 521 n m、テトラメチルー 6— カルポキシローダミンの吸収極大波長は 5 55 nm、蛍光極大波長は 58 O nm である。それぞれの物質によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。

本発明の 5位置換— 2—ォキソ（1H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドの合成法は、特に限定されることなく、置換基の種類に応じて合成することができる。例えば、本明細書の実施例 1に記載したように、 3— （i3— D—リポフラノシル）一ピリジン一 2 ( 1 H) —ォンに、先ず 5位に置換基を導入し、次いで、 3リン酸を導入してもよい。あるいは、 3 - (/3— D—リポフラノシル) 一ピリジン一 2 ( 1 H) —オンに、先ず 3リン酸を導入し、次いで、置換基を導入してもよい。また、 2) ァルケニル、アルキニル、アミノ基、又はその誘導体のような大きな基を導入する場合、先ず、ョード等の光反応性基を導入して活性化してから、置換してもよい。また、置換基を導入する際の反応条件などは、ピリジンにこれら置換基を導入する反応の場合を参照して行うことができる。

本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み込まれた核酸

本発明は、 5位置換一 2—ォキソ（1H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖の RNA又は DNAを含む。二本鎖は、 DNAZDNA、 RNA/R NA、又は DNAZRNAであってもよい。また、 DNAには、 RNAを铸型として逆転写してなる c D N Aも含まれる。あるいは、核酸は 3本鎖、 4本鎖等も形成しうる。

本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、 6位置換された 2—アミノープリンー 9—ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドとが塩基対を形成することが可能である。図 2 c ) に示された yと s ( 2—ァミノ— 6— ( 2 —チェニル）プリン一 9ーィル基）と同様に、本発明の 5位置換一 2—ォキソ（ 1 H) 一ピリジン一 3 —ィル基は、 6位置換された 2—アミノープリン一 9ーィル基と、 2箇所で水素結合を生じる。 6位置換された 2—ァミノ—プリン— 9 一ィル基は、好ましくは 2—アミノー 6— ( 2 _チェニル）プリン— 9—ィル基（ s ) 又は 2—アミノー 6— （ジメチルァミノ）プリン一 9一ィル基（X ) である。より好ましくは、 2—ァミノ— 6— （2 —チェニル）プリン— 9一ィル基（s ) である。

本発明の 5位置換— 2—ォキソ（1 H) —ピリジン一 3—ィル基は、立体構造上、天然型プリン塩基 A (アデニン）及び G (グァニン）とは塩基対を形成できない。そして、 6位置換された 2—アミノープリン一 9—ィル基は立体障害のため、天然型 T (チミン）、 U (ゥラシル）及び C (シトシン）とは塩基対を形成できない。よって、本発明の 5位置換一 2 —ォキソ（1 H) —ピリジン— 3—ィル基は、 6位置換された 2—アミノープリン— 9ーィル基と特異的に塩基対を形成することが可能である。

よって、本発明の核酸は、 5位置換一 2 —ォキソ（1 H) —ピリジン— 3—ィル基を塩基として有するヌクレオチドと、 6位置換された 2—アミノープリン一 9—ィル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、態様を含む。 6位置換された 2 —アミノープリン一 9 一ィル基は、好ましくは、 2—ァミノー 6— （2—チェニル）プリン— 9—ィル基又は 2—アミノー 6— （ジメチルァミノ）プリン一 9ーィル基である。

本発明の 5位置換— 2—ォキソ（1 H) —ピリジン— 3 —ィル基を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、 D N A又は R N A等の核酸に取り込むことが可能である。

限定されるわけではないが、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、 6位置換された 2—ァミノ—プリンー 9—ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を铸型として転写、複製又は逆転写を行い、前記 6位置換された 2 _アミノープリン— 9一ィル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、本発明の核酸を組み込む

ことを含む、方法によって調製することが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によって D N A又は R NAに取り込んでもよい。

例えば、 5位にヨウ素原子をもつゥリジン (U)誘導体、 5—ョード U (5 I U ) を転写反応により RNA中に導入する場合には、 UTPと 5 I UTPの存在比を変えて転写反応を行い、 Uの位置をランダムに 5 I Uで置換するか、あるいは UTPの代わりに 5 I UTPだけを転写反応に用いて Uの位置を全て 5 I Uに置換するしかない。この場合、 5 I Uの導入によって RNAの高次構造が変化してしまったり、 RNAの機能に支障をきたすこともある [J e n s e n e t a 1. ， 1 995] 。これに対し、本発明の 5位置換一 2_ォキソ（1H) —ピリジン— 3—ィル基は、 6位置換された 2—アミノープリン— 9ーィル基と特異的に塩基対を形成する。よって、所望の位置に 6位置換— 2—ァミノ—プリン一 9 —ィル基が導入されている DNA又は RNAを铸型として、転写、複製又は逆転写反応を行うことにより、 5位置換—2—ォキソ（1 H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを位置選択的に導入することが可能となった。

転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応は T 7 RN Aポリメラ一ゼ（Ta k a r a等）、複製反応は、クレノウフラグメント（KF) 、逆転写反応は AMV Re v e r s e T r an s c r i p t a s e XL (AMV-RT) (L i f e S c i e n c e社）を使用することが可能である。複製反応は、反応中に 6位置換された 2—アミノープリンー 9—ィル基が除去されてしまうのを防ぐために、例えば、 3 ' ~ 5 ' ェキソヌクレアーゼ活性をもたない T a q DNA ポリメラ一ゼ（T a k a r a T a q™) を用いて sを含むプライマーによる鎊型 DNAの P CR増幅も可能である。なお、 6位置換された 2 _アミノープリン— 9—ィル基を塩基として有するヌクレオチドは、公知の方法、例えば、 [Fu j iwa r a e t a 1. , 20 01] に記載の方法で合成可能である。

本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンス DNA若しくは RNA、リポザィム又はアブタマ一として使用されうる。アンチセンス DNA若しくは RNAとは、ある特定の遺伝子の発現を抑える DNA又は RNAである。標的とする遺伝子配列（センス鎖）の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンス DN A又は RNAは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リポザィムは、 RNAを構成成分とする触媒の総称であり、広義のアンチセンス RNAに含まれる。ァプ夕マーは、 i n v i t r o セレクション法によって得られた、特定の分子に結合する機能を有する核酸である。

例えば、 i n V i t r oセレクションによって得られる 5位置換された 2— ォキソ（1H) —ピリジン _ 3—ィル基を含むアブ夕マーは、標的タンパク質と架橋反応する等の新機能を持つ RN A分子を創製することも可能となる。

まず、例えば sを含むプライマーを用いて铸型 DNAプールを P CRにより増幅し、これを転写して 3 ' 末端側の特定部位に 5 I yを含む RNAプールを調製する。この RNAプールから、光架橋反応を指標にして i n v i t r oセレクシヨンを行い、特定のアブタマ一を得ることができる。また、 5 I yは RNAァプタマ一中の 3 ' 側に位置しているので、セレクションにおける逆転写反応の効率に悪影響を及ぼすことも少ない。さらに、疎水的な置換基を導入して、タ一ゲットとする物質とアブ夕マーとの疎水一疎水結合を強めるセレクションも可能である。

また、 5位の置換基としてピオチンを導入した核酸分子の調製も、転写反応で可能である。これは、アビジンとの相互作用を利用した例えば RNAの固相化や、多量体化に適用可能である. 本明細書中で後述する実施例 1 6では、人工塩基 sを含む铸型 DNAを調製し、これに対して転写反応を行うことにより、その転写産物にピオチン化されたヌクレオシド又はヌクレオチドを部位特異的に取り込むことに成功した。

なお、実施例 1 6では、 17— me rの配列中に、本発明の 5位の置換基としてピオチンを導入した塩基を一つ導入する場合、その合成効率は、天然塩基対（ GC塩基対、又は AT塩基対）における効率と比較して約 50 %であった（図 1 9) 。

さらに、蛍光分子を RNAアブ夕マー中に導入してアナライト（a n a l y t e) として活用する例も報告されている [J h av e r i e t a 1. , 20 00 ; Yamamo t o e t a 1. , 2000 ; F an g e t a 1 . ， 200 1 ] 。

これまでに、修飾塩基のヌクレオシドフルォレセイン— 12—ゥラシル（F— 1 2— U) [J h av e r i e t a l . , 2000] 、 5— (1—ペンチ二ル）ゥラシル [L a t h am e t a 1. , 1 994] 、 5— (3 ' ' —アミノプロピニル）ゥラシル [B a t t e r s by e t a 1. , 1999] , 5 ーョードウラシル（5 1 U) [J e n s e n e t a 1. , 1 99 5] 、 5 - ブロモウラシル（5 B rU) [Go l d e n. , e t a l . ， 2000] を i n v i t r oセレクションで利用した例が報告されている。しかしながら、これらの例では全て、 DNAもしくは RNAプールの調製の段階から修飾塩基を天然型塩基（Tもしくは U) と置換している。本発明では、 5位置換— 2—ォキソ（1H) —ピリジン— 3—ィル基の、 6位置換された 2—アミノープリン— 9 ーィル基との特異的な塩基対を利用して、転写反応の 1段階で位置選択的に本発明のヌクレオチドを RNAに取り込むことが可能になった。本発明の非天然型の塩基を含む 5種類の塩基からなる RNAを任意に調製出来れば、その有用性 ·汎用性は非常に高い。

また、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた DN A又は RN Aは、タンパク質、ぺプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。

本発明のヌクレオチドを含む核酸と他分子（核酸、タンパク質等）含む多量体本発明はさらに、 5位置換— 2—ォキソ（1H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸が、前記 5位の置換基を介して共有結合している、核酸と 1またはそれより多くの他分子（DNA、 RNA、タンパク質等の生体分子がより好ましくは例示される）との多量体を提供することを目的とする。

本発明はまた、 5位置換— 2—ォキソ（1H) —ピリジン— 3—ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を近接させて、前記 5位の置換基を介して前記 DNA同士、 RNA同士、 DNAZRNA、 D N A/タンパク質又は RN A Zタンパク質を共有結合させる、ことを含む、前記核酸と他分子（より好ましくは生体分子）との多量体の形成方法を提供することを目的とする。

上述したように、本発明のヌクレオシド又はヌクレオチド中の 5位置換一 2— ォキソ（1H) —ピリジン一 3—ィル基において、 5位の置換基の種類によっては、近接する他分子と共有結合を結合しうる。

例えば、具体的には、 5位置換基が 1) ヨウ素、臭素から選択される光反応性基の場合、反応基の種類に応じた適当な波長の光照射を行うことにより、近接する他分子と共有結合を形成する。例えば、本明細書中の実施例で、参考例 1で得られた a n t i— （R a f _ 1 ) アブ夕マー（RNA 9 A) に 5 I yを位置選択的に導入して、ターゲットタンパク質（Ra f — 1 RBD) の存在下で架橋反応を行い、本発明の非天然型塩基の有用性を調べた。 RNA 9 A中の 5 I y の導入部位として、 RNAの高次構造の変化やピリミジンダイマ一等の形成を出来る限り避けるため、 RBDとの相互作用に重要でないとわかっている 3 ' 末端側の領域のうち、プリン塩基に挟まれた C 84、 C 87、 A92を選んだ。そして、それぞれの位置に 5 I yが選択的に導入された各 RNAと N末端に GST ( ダル夕チオントランスフェラーゼ）を融合させた R a f _ 1 RBD (GST— RBD) の存在下で光照射による架橋反応を行った。その結果、 84又は 87残基に 5 I yを含む RNAは、架橋反応により R N A同士の二量体を形成することがわかった。 GSTタンパク質は溶液中で二量体を形成することから、 GST— RBDも溶液中で二量体を形成し、 RNA 9Aが Ra f — 1 RBDに結合して 5 I yを含む配列部分が近接したときに、 RN A分子間の架橋反応が進行したと考えられる。この結果は、 5 I yが RNA間相互作用の解析に利用できることを示している。本発明において、 5位置換— 2—ォキソ（1H) —ピリジン一 3 一ィル基を塩基として有する核酸と他分子が近接するとは、 5位の置換基と他分子が共有結合を形成しうるくらい、物理的に近位に配置されることを意味する。本発明では 5位の置換基間で水素結合等よりも強い共有結合が形成され架橋されるため、分離、精製等が可能であり、核酸と他分子の相互作用をより直接的に調べることが可能となった。架橋反応産物の解析は公知の方法、例えばゲルシフトアツセィ、クロマトグラフ、マススペクトル等によって行うことが可能である。なお、本発明の核酸と他分子は二量体のみならず、 3又はそれより多くの多量体を形成することも可能である。

あるいは、本発明の 5位置換— 2—ォキソ（1H) —ピリジン— 3—ィル基を塩基として有する DNA又は RNAが結合しているタンパク質間相互作用を観察することも可能である。例えば、本明細書中の実施例では、 R a f — 1 RBD に結合する RNAァプ夕マーである RNA 9 Aについて、本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドを位置選択的に導入すると、 RN A分子間の二量体化が観察された。これは、実施例で使用した GST— RBDが溶液中で二量体を形成し、 RBD部分に結合した RNA 9 Aが近接したときに RNA分子間の架橋反応が進行したためと考えられる。 GSTタンパク質は二量体を形成しやすく、実際にタンパク質を二量体化させるドメインとして利用されている。よって、本発明の 5位置換— 2—ォキソ（1H) —ピリジン— 3—ィル基を塩基として有する DN A又は RNAの架橋反応を利用して、架橋反応物の解析を行えば、当該 DNA又. は RNAが結合しているタンパク質同士の相互作用の解析も可能である。

あるいは核酸分子とタンパク質間の相互作用を強固にして、アブ夕マーによる夕一ゲットタンパク質の活性の阻害や核酸 ·タンパク質の相互作用の解析などに有用な手法を提供することになる。例えば、ターゲットタンパク質の活性を阻害する既存のアブタマ一は、共有結合でターゲットタンパク質と結合しているわけではないので、そのタンパク質の活性を完全に阻害することはできない。しかし

、 5 I yを含むアブ夕マーを用いて、光照射によりターゲットタンパク質にアブタマ一を共有結合させることにより、そのタンパク質の活性を完全に阻害することも可能である。

実施例以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例 1 3— (j3—D—リポフラノシル）一 5—ョ一ドピリジン一 2 ( 1 H) —オン 5 ' —三リン酸エステルの合成

(1) 3— （ 3— D—リポフラノシル）一 5—ョードピリジン一 2 ( 1 H ) —オンの合成（図 3の 1→2)

3 - (j3 _D—リポフラノシル）一ピリジン一 2 ( 1 H) —オン 342m g ( 1. 5 mm o 1 ) (Ma t u 1 i c -Ad am i c, J . , B e i g e 1 ma n, L. , Te t r ah e d r on L e t t . , 1997, 38, p. 20 3 - 206. ； I s h i k awa, M. ， H i r a o, I . ， Y o k o y a m a , S . , Te t r a h e d r o n L e t t . , 2000, 4 1， p. 393 1— 3934) 、ヨウ素 57 3mg (2. 3 mm o 1 ) 、ヨウ化カリウム（K I ) 6 5 7 mg (7. 9 mm o 1 ) を、 5 OmM炭酸ナトリゥム 36m lに加え、 1 1 0°Cで 1 2時間加熱した。反応後にジクロロメ夕ンを加え、水層を分離し、ジクロロメタンで洗浄した。水層を減圧濃縮後 C 1 8逆相 HP L Cで精製し、 3— ( ]3— D—リポフラノシル） — 5—ョ一ドピリジン _ 2 ( 1 H) 一オン 1 5 5mgを得た。

(2) 3— （/3— D—リポフラノシル）一 5—ョ一ドピリジン一 2 ( 1 H) 一オン 5' —三リン酸エステルの合成（図 3の 2→4)

上記（ 1 ) の 3— （ 3— D—リポフラノシル）一 5—ョ一ドピリジン一 2 ( 1 H) —オン 0. lmmo l、プロトンスポンジ 48mg (0. 2 3 mm o 1 ) をトリメチルホスフエ一ト 50 0 1に溶解し、 0 °Cに冷却した。ォキシ塩化リン（POC l ₃) 1 3 1 ( 1. 3当量）を加え、 0 で 4— 5時間撹拌した。トリ— n—プチルァミン 1 1 9 1 (5. 0当量）、次いで 0 . 5 Mピストリブチルアンモニゥムピロホスフェート（ジメチルホルムァミド溶液） 1. 0m l (5. 0当量）（Lu dw i g. J . ， E c k s t e i n, F. , J . O r g. C h em. , 1989, 54， p. 63 1 - 635 ) を加える。 3 0分後0. 5 Mトリェチルアンモニゥムピカ一ポネート 5 0 O I を撹拌する。反応液を D E AEセフアデックス Α— 2 5、次いで、 C 1 8逆相 HP L Cで精製し、標題化合物 3— （ —D—リポフラノシル）一 5 —ョードピリジン一 2 (1H) —オン 5 ' —三リン酸エステル（本明細書において、場合により「5 I yTP」と呼称する）を得た。

E S I -M a s s

計算値： 5 9 3. 0 5、実測値： 5 9 1. 7 0 (M— H)

実施例 2 3 _ '(3—D—リポフラノシル） _ 5 _ (2—フエ二ルェチ二ル）一ピリジン一 2 ( 1 H) —オン 5 ' —三リン酸エステルの合成

(1 ) 3 _ ( )3— D—リポフラノシル）一 5— (2—フエ二ルェチニル）一ピリジン一 2 ( 1 H) —オンの合成（図 3の 2→3)

実施例 1 ( 1 ) の 3— (3 -D-リポフラノシル) — 5—ョードピリジン - 2 ( 1 H) 一オン 7 1 mg ( 0. 2 Ommo 1 ) を DMF 1. 0 m 1に溶解した。次いで、 C u I 6mg (0. 0 3 2 mm o 1 ) 、トリェチルァミン 4 2 1 (0. 3 Ommo 1 ) 、フエニルアセチレン 3 3 1 (0. 3 0m mo 1 ) 及び P d (P h 3 P) ₄1 1 mg (0. O l Omo l ) を加え、アルゴン雰囲気下、室温で 6時間撹拌した。酢酸ェチル 1 0m 1を加えた後、水 1 Om lづつで 3回抽出した。水層を合わせ、減圧下で濃縮した。逆相 HP L Cで精製し、白色の 3 _ (/3— D—リポフラノシル）一 5— (2—フエ二ルェチニル） —ピリジン— 2 ( 1 H) —オン 6 0mg (9 2 ) を得た。

^-NMR ( 2 7 0. 1 6 MHz、メタノール一 d₄) ； δ 7. 8 6 (d d, 1 H, J = 0. 8、 2. 4 H z , 6) , 7. 6 2 (d d, 1 H, J = 0 • 3、 2. 4 H z , 4) , 7. 46 (m， 2 H, フエニル) ， 7. 3 5 (m ， 3H，フエニル）， 4. 8 5 (d, 1 H， J = 4. 9 H z , 1，）， 4. 1 2 ( t , 1 H， J = 4. 9 H z、 3 ' ) , 4. 0 0— 4. 0 7 (m， 2 H , 2 ' , 4 ' ) ， 3. 84 (d d， 1 H, J = 2. 7， 1 2. 2H z、 5 ' ) , 3. 7 0 (d d, 1 H, J = 3. 8， 1 2. 2 H z、 5，）。 E S I'— MS (n e g a t i v e) ; 3 2 5. 8 5 [M— H] 。 Ama x= 28 7 n m ( ε = 7. 7 X 1 0³)

(2) 3— （ )3— D—リポフラノシル）一 5— (2—フエニルェチェル） —ピリジン一 2 ( 1 H) 一オン 5 ' —三リン酸エステルの合成（図 3の 3 → 5 )

上記（1 ) の 5 _ (2—フエニルェチェル）一 3— （]3— D—リポフラノシル）一ピリジン一 2 ( 1 H) 一オン 14mg (0. 043 mmo 1 ) および 1 , 8 _ビス（ジメチルァミノ）ナフタレン 1 4mg ( 0. 0 6 8 mm o 1 ) を、トリメチルホスフエ一ト 0. 43m 1に溶解した。氷冷下ォキシ塩化りん 5. 2 1 (0. 05 6 mmo 1 ) を加え、 0°Cで 2時間撹拌した。トリプチルァミン 52 1及び 0. 5 Mピストリブチルアンモニゥムピロホスフェート（ジメチルホルムアミド溶液） 0. 43m lの混合液を加え、 0 で 1 0分間撹拌した。 TEAB 5m l ( 5 Ommo 1 ) を加え、 4°Cで、 DEAEセフアデックス陰イオン交換カラムで 0. 0 5— 1 Mダラディエント TEABで精製した。標題化合物 3— (i3— D—リポフラノシル）一 5— (2—フエ二ルェチニル） —ピリジン— 2 ( 1 H) —オン 5， —三リン酸エステルを含む画分を凍結乾燥し、 2 7mg (6 5 %) の目的化合物を得た。最終物をさらに逆相 HPL Cで精製した。

E S I -MS (n e g a t i v e) ; 5 6 5. 58 [M - H]

実施例 3 非天然型塩基を含むヌクレオシド三リン酸の濃度およびモル吸光係数の決定

本願発明の 5位置換— 2—ォキソ（1 H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド等の、非天然型塩基を含む各ヌクレオチド（dNTP/NTP) の濃度は、アルカリフォスファターゼによりリン酸エステル結合を分解後、無機リン酸の含有量を求めることで決定した。また、各ヌクレオシド三リン酸のモル吸光係数ィプシロン（ε) の値は、 10mM リン酸緩衝液（pH7) 中での極大吸収波長および波長 260 nmにおける吸光度 Ab s (Ab s o r b an c e) を測定して、計算式 ε = A b s / C o n c (C on e ： dNTPZNTP濃度）から εを決定した。卖施例 1で作成した 5 I y TPの UV吸収について図 4に示した。 5 I yTP は、吸収極大波長が 3 18 nm付近である。

アルカリフォスファタ一ゼによるリン酸エステル結合の分解反応は、ヌクレオシド 5 ' —三リン酸、 5 OmM T r i s— HC 1 pH 9. 0、 1 mM Mg C 1₂、 20単位のゥシの腸由来のアルカリフォスファターゼ（T aKaRa) を含む反応溶液（40 1スケール）を 42 °Cで 1時間インキュベートすることにより行った。リンの定量は、 Ch e nの方法に従って行った [Ch e n e t a l . ， 1 956] 。反応溶液の半量 20 n 1を 4m 1の水と 4 m 1の試薬 C (6N硫酸、蒸留水、 2. 5 %モリブデン酸アンモニゥム溶液、 10 % L - ( + ) ァスコルビンを体積比 1 : 2 : 1 : 1で混合した溶液）に加えて、 37 °Cで 2時間振盪しながら反応させた、反応後のサンプルを室温に戻してから 8 20 nmの吸光度を測定して、検量線からリンの含有量を算出した。

実施例 4 RNA 9 Aに 5 I y T Pを位置選択的に導入するための铸型 D N A の調製

上述した 2—アミノー 6—チェ二ルブリン（s) 、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもったピリジン一 2—オン（y) からなる s · y塩基対は P C Rによる D N Aの増幅に耐えられるほどの選択性がない。しかしながら、 sを含むプライマ一を用いた P CRで铸型 DNAを増幅することができる。そこで、参考例 1で得られた RNA 9 A (全長 100ヌクレオチド）中の R a f - 1 RBDとの相互作用に重要でないとわかっている 3' 末端側の領域のうち、プリン塩基に挟まれた C 84、 C 87、 A 92を 5 I yの導入部位として選んだ。

具体的には、先ず P CR反応の铸型には、参考例 1で得られたベクタ一 TOP 〇一 9A (ァプタマ一 RNA 9 Aがサブクロ一ニングされたベクタ一）を B a mH Iで 1箇所切断して直鎖状にした二本鎖 DNA (d s DNA) を用いた。 R NA9Aは、本明細書中の配列番号 1及び図 5 b) に示した 1 00塩基からなる配列を有する。図 5 b) 中下線で示した、 84、 87及び 92は、 5 I yを導入する部分である。 P CR用のプライマーとしては、配列番号 2の塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号 3— 7のいずれかの塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いた。マ—

ggtaatacga ctcactatag ggagtggagg aattcatcg 39 (配列番号 2 ) gcagaagctt gctgtcgcta aggcatatg 29 (配列番号 3 ) gcagaagctt gctgtcgcta aggcatatg 29 (配列番号 4) gcagaagctt gctgtcgcta aggcatatg 29 (配列番号 5 ) gcagaagcat gctgtcgcta aggcatatg 29 (配列番号 6 ) gcagaagctt gctgtcgcta aggcatatg 29 (配列番号 7 )

'一（配列番号 2) の塩基 19一 39は、 RNA9A (配列番号 1 ) の塩基 1一 20に相当する。配列番号 2の 3 _ 18は、 T 7プロモーターに相補的な配列を含む。

3，末端側のアンチセンスプライマーとして、 RNA 9 A (配列番号 1) の固定領域（72— 100) に相補的な配列をもつ 29. 45、 sを 1箇所だけ含む 29. 45 s 84、 29. 45 s 87、 29. 45 s 92、 sを 2箇所含むプライマ一 29. 45 s 84Z92を化学合成した。（図 5 b) 、これらのプライマ一を用いた以下の P CRにより sを含む铸型 DNAを増幅した。

なお、プライマーに使用される 2—アミノー 6—チェ二ルブリン（s) のフォスフオアミダイトは、公知の方法、例えば、 [Fu j iwa r a e t a 1. , 2001] に記載の方法で合成可能である。

PCR反応は、 PCR中に sが除去されてしまうことを防ぐため、 3， →5，ェキソヌクレアーゼ活性がない T a Q DNAポリメラ一ゼ（TaKaRa T a q^TM) を用いて行った。反応組成は、 10mM Tr i s— HC 1 H 8 . 3、 5 OmM KC 1、 1. 5mM MgC l ₂、 0. 2 mM dNTP s、 1 Mの各プライマ一、 I ngZ l 铸型 d sDNA、 0. 025 J / 1 T a q DNAポリメラーゼである。反応は PTC— 100^TM P r og r am Th ema 1 C o n t r o l l e rを用いて [94。C、 30秒— 40° C、 30秒_60°(3、 1分] X 1 5もしくは 20サイクル、 60°C 5分の条件で行われた。

反応溶液をフエノールークロロホルム抽出した後、上清をエタノール沈殿して PCR産物を回収した。 sがプライマー中で比較的 3 ' 末端側に位置する 29. 45 s 84および 29. 45 s 84Z 92を用いた場合、 PCRの増幅効率が若干低下したが、転写反応に十分な純度の P CR産物を得ることができた（図省略 ) 。 P CR産物を 1 OmM N a C 1を含む 1 OmM T r i s— HC 1 (pH

7. 6) に溶かして保存し、以降の T 7転写反応の錶型とした。

実施例 5 T 7 RN Aポリメラ一ゼによる転写反応

本実施例では、実施例 4で得られた P CR産物を铸型とし、 T 7 RNAポリメラ一ゼによる転写反応によって、実施例 1で作成した 5 I yを 3' 末端側の特定の位置に導入した種々の RNA 9 A変異体を作成した。

T 7転写反応の組成は Oh t s u k i e t a 1. , 200 1に記載されたものと同様である。具体的には、 4 OmM T r i s -HC 1 pH 8. 0、 5 mM DTT、 24mM Mg C l ₂、 2mMスペルミジン、 0. 0 1 % T r i t o nX_ 100、 1 OmM GMP、 1 mM NTP s、 0— 0. 25 mM

5 I yTP、 0. 2 1 / 1铸型 DNA、 2. 5 U / 1 T 7 RNAポリメラーゼ（TaKaR a) である。 37。Cで 6時間酵素反応を行い、反応産物を 8 %ポリアクリルアミド— 7 M尿素ゲルで電気泳動して精製した。

図 6 a) は、 0. 25 mMの 5 1 yが存在下（+ ) 又は非存在下（一）で転写反応を行い、その反応産物を電気泳動した場合のオートラジオグラムを示す。図 6 b) は、 RNA 9 Aの 2次構造上に、 5 I yが導入される箇所を黒丸で示したものである。図 6に示されたように、 0. 25mMの 5 I yリポヌクレオシド三リン酸（5 I y TP) の存在下、効率よく転写反応が進行し、全長 1 00ヌクレォチドの産物をゲル電気泳動により確認できた。

なお、 5 I yTPの代わりに実施例 2で作成した 3— （j3— D—リポフラノシル） — 5— (2—フエ二ルェチニル）一ピリジン— 2 ( 1 H) —オン 5 ' 一三リン酸エステルを用いた場合にも、同様に転写反応が行われることが確認された。

実施例 7 転写反応産物の塩基組成分析

実施例 6で得られた全長の反応産物中に 5 I yがどれだけ選択的に導入されているかを調べるため、 RNAの塩基組成分析を行った。 [Q!_³²P] ATPもしくは [oi_³²P] GTP存在下で T 7転写反応を行った場合、 Aもしくは Gの 5 ' 側に隣接するヌクレオシド 3 ' —リン酸（Np) がそれぞれ³² Pで標識される。したがつで、ゲルから精製された RNAを RN a s e T₂ (S i gma ) を用いて Npに完全分解した。 84、 92残基の位置に 5 I yが導入されていれば 5 I yのヌクレオシド 3 ' —リン酸（ 5 I y T p ) が [ 一³² P ] GTP により³² Pで標識され、 87残基の位置であれば [ひ— ³²P] ATPにより標識される（図 5、図 6— b) 。完全分解された産物を 2D— TLCで分離してそれぞれのヌクレオチドを定量した 5 I yを含む RN Aの塩基組成分析を行った。具体的には、 RNAの完全分解では、ラベルされた RNAと 0. 250Dの E . c 0 1 i由来 t RNA混合物（S i gma) を含む水溶液 4. 25 1に 0 . 75 lの RN a s e T ₂溶液（ 5単位 1 ； 100 mM NaOAc pH4. 5、 10 %グリセロール）を加えて、 37°Cで一晩酵素反応を行った。反応溶液の一部を l O cmX l O cmの TLC板（フナセル S F ；フナコシ）にスポットして二次元に展開した。一次元目および二次元目の展開液の組成は、イソ酪酸 66 ：アンモニア 1 ：水 33 (体積比）、および 2 _プロパノール 70 ：塩酸 1 5 :水 1 5 (体積比）である。展開後のスポットをバイオイメージングアナライザ一（BAS 2 500、富士フィルム）で検出して、それぞれ定量した結果を図 7及び表 1に示す。表 1.—転写反応産物の塩基組成分析

RNA ^{3 e}P label SlyTP Ap Gp Cp Up 5lyp nilsincorpw ration*

9A ATP 5.91(6) 5.97(6) 7.02(7) 6.11(6)

ATP + 5.92(6) 6,01(6) 6.95(7) 6.10(6) 0.10(0) 0.45%

GTP 7.84(8) 4.91(5) 4.19(4) 5.06(5)

GTP + 7.77(8) 5.03(5) 4.18(4) 4.93(5) 0.09(0) 0.41%

9A(5ly84) ATP + 5.91(6) 5.99(6) 7.02(7) 5.97(6) 0.12(0) 0.41%

GTP + 7.81(8) 5.00(5) 3.10ί3) 5.13f5) 0.97(1)

9A(5ly87) ATP + 5.86(6) 5.98f6) 6.11(6) 6.03(6) 1.04(1)

GTP + 7.93(8) ' 5.03(5) 4.04(4) 4.94(5) 0.06(0) 0.27%

A(5ly92) ATP + 4.89(5) 5.94(6) 7.09(7) 5.97(6) 0.11(0) 0.46%

GTP + 6.90(7) 5.02(5) 4.23(4) 4.86(5) 0.98(1)

9A(5ly84/92) ATP + 5.09(5) 5.74(6) 7.07(7) 5.98(6) 0.12(0) 0.5%

GTP ' + 6.94(7) 4.98(5) 3.16(3) 4.92(5) 2.00(2)

各数値は以下の式により算出された。かつこ内は理論上のヌクレオチドの数を示す。

(各ヌクレオチド fNp)の ³²Pのカウント] X [Α'もしくは G**の 5'末端のヌクレオチド.の総数]

[全ヌクレオチドののカウント] ·

* [5 1 ypの数値] / [Aもしくは G* *の 5 ' 末端のヌクレオチドの総数 ] X 100 (%) 。

* * Gの場合は、 p G ϋのカウントを除いて計算した。その結果、铸型中の sに対して 5 I yが高い選択性で取り込まれ (97%以上) 、誤った 5 I yの取り込みは全体の僅か 0. 5 %以下であった。以上より、 sを含むプライマーを用いてプラスミド中の配列から P CRで铸型を調製することにより、 5 I yを RNA中に位置選択的に導入できることがわかった。

実施例 8 5 I yが導入された各 RNAの R a f — 1 RBDへの結合効率本実施例では、 5 I yが位置選択的に導入された各 RNAの R a f — 1 RB

Dに対する結合活性の変化を調べるために、フィルター結合法により結合効率を求めた（表 2) 。 1箇所に 5 I yが導入された 9 A (5 I y 84) , 9 A (5 I y 87) 、 9 A (5 I y 92) は 51 yを含まない RNA 9Aと同程度の結合効率を示した。 2箇所に 5 I yが導入された 9 A (5 I y 84/92) では結合効率が低下した。一方、 5—ョード U (5 I U) が 1分子あたり平均 5〜6塩基分ランダムに導入された RNA 9 A (5 I U) でも結合能が落ちた. 以上の結果から、少なくとも 5 I yを RNA 9 Aの 84、 87、 92残基の 1箇所にのみ導入した場合はアブタマ一の結合活性に与える影響がほとんどなく、位置選択的に 5 I yを導入できる本手法が有益であることがわかった。表 2— 5 I yが導入された各 RNAの R a f 一 1— RBDへの結合効率

各 RNAの Ra f — 1 RBDへの結合効率をフィルター結合法により求めた（ Ra f - 1 RBDZRNA = 300 ： 5 n M) 。実験は 3回行い、その平均値を示した。かっこ内の数値は標準偏差。 ^a0. 4 mMの 5 IUTP存在下、 sを含まない铸型 DNAから転写された RNA 9A。 ^b0. 25mMの 5 1 yTP存在下、 sを含まない铸型 DNAから転写された RNA · 9Α。

実施例 9 UV照射による架橋反応

本実施例では、 5 I yを位置選択的に含む各 RNAを用いて、光照射による架橋反応性を調べた。

先ず、 5' 末端が³² Pで標識された RNAを緩衝液 A中で 75°Cで 3分加温した後に室温で 10分以上放置して、 RNAの二次構造を形成させた。一方、 R a f - 1 RBDは、ヒト R a f — 1の RBD (アミノ酸残基 51 _ 1 3 1番 ) を GST (ダルタチオントランスフェラーゼ）融合タンパク質として大腸菌内で発現し、菌体を破砕後の上清からカラムクロマトグラフィーで精製した。 r a t RGLの RBD (アミノ酸残基 632— 734番） [Ko y ama e t a 1. , 1 996 ] および h uma n B— R a f の R B D (アミノ酸残基 14 9— 226番）も GST融合タンパク質として大腸菌内で発現し、同様に精製した。

二次構造を形成させた RN Aの溶液に等容量の R a f - 1 GST— RBD溶液（RBDの他、 B S A 160 g/m 1、 1 mM DTT、 7. 3 %グリセ口一ルを緩衝液 Aに溶かしたもの）を加えて 37 °Cで 30分間インキュベーシヨンして RNA · RBDの複合体を形成させた。そして、氷上にセットした 96 穴のマルチウエルプレート（COASTAR社）のゥエルにそのサンプルを 40 - 120 1ずつ分注した。 300 nm以下の波長の UVを減少させるためにポリスチレンの蓋をしてから UVトランスイルミネ一夕一 (TVC— 312 R/J S p e c t r o n i c s社、 UV波長 3 12 nm) を用いて約 1 c mの距離から UVを 1時間照射した。

光源に用いた UVの波長は、 5 I y TPの吸収極大波長が 31 8 nm付近であることを考慮して選択された（図 4) 。一方、 UVトランスイルミネータ一を用いた場合には、照射波長が 270 _ 400 nmと広がってしまう（8Z1 5W m e d i um wa v e UV— B f l u o r e s c e n t t u b eのスぺクトル表より。図省略） [Me i s e nh e ime r & Ko c h, 1997] 。そこで本実施例では、天然型塩基の吸収波長と重なる 300 nm以下の光を出来る限り減少させるため、サンプルにポリスチレン製の蓋をして UVを照射した。

反応溶液を 8%ポリアクリルアミドー 7 M尿素ゲルで電気泳動して、生成物を解析した。また、架橋反応産物を回収する際には、反応溶液をフエノ一ル ·クロ口ホルム抽出した後、電気泳動で分離してゲルから抽出た。その結果、 84又は 8 7残基に 5 I yを含む RNA 9 A (5 I y 84) と 9A (5 I y 87) において、未反応の RNA (100ヌクレオチド）と異なる位置に、架橋反応産物のバンドがはっきり検出された（図 8 レーン 6及び 8) 。

架橋反応産物が何であるかを同定することにした。 RNA 9Aは R a f — 1 RBDに結合するァプ夕マーなので R N Aと G S T— R B D間の架橋反応が一つの反応機構として考えられる。 GST—RBD非存在下で UVを照射したところ、架橋反応産物のパンドが僅かではあるが検出された（図 9 レーン 1及び 5) 。そこで、 G S T— RBD存在下で UVを照射した後に p r 0 t e i n a s e K処理（PK) やフエノール ·クロ口ホルム抽出（p h e n o l ) によってタンパク質を除去してみたが、そのバンドに変化はなかった（図 9 レーン 2— 4，及び 6— 8) 。

以上の結果から、架橋反応産物は RNA ·タンパク質（GST— RBD) 間の架橋反応に由来するものではないことがわかった。そして、 RN Aだけで架橋反応産物が検出されることと、架橋反応産物のバンドの移動度がほぼ RN A 9 A二量体分に相当すること（図省略）から、 GS T— RBD存在下で RNAが二量化したものが架橋反応より得られたと考えられる。そして、タンパク質共存下で、このァプタマ一の 2量化が促進されることもわかった。

実施例 10 RNA 9 Aの架橋反応による 2量体化

GSTタンパク質は二量体を形成しやすく、実際にタンパク質を二量体化させるドメインとして利用されている [I n o uy e e t a l . , 2000] 。したがって、本実施例で用いた GST— RBDも溶液中で二量体を形成し、 RB D部分に結合した R N A 9 Aが近接したときに R N A分子間の架橋反応が進行したと考えられる。その場合には、架橋反応産物は R a f — 1 RBDとの結合活性も保持したままである可能性がある。

そこで、 9A (5 I y 87) と Ra f — 1 RBDを等濃度 0. 1 Mで混合させた条件で架橋反応させた産物（XL) をゲルから精製して、 XLと GSTRB Dとの結合をゲルシフトアツセィにより調べた。また、 RNA 9 Aの二量体のコントロールとして、 RNA 9 Aをタンデムに連結させた RNA 9 AX 2 ( 全長 200ヌクレオチド）も新たに調製し、ゲルシフトアツセィを行った。 RN A 9 AX 2は、 RNA 9 Aの必須領域（ 1一 80残基部分）を分子内に 2つもつ全長 200ヌクレオチドの RNAであり、 T7 RNAポリメラーゼ（Ep i c e n t r e) を用いた転写反応により調製し、ベクタ一 p CR®I I— TO P O ( I n v i t r o g e n) にサブクローニングされている。

ゲルシフトアツセィ

5 ' 末端が³² Pで標識された RNA (0. 8 pmo 1 ) を 20 1の緩衝液 A中で 75 °Cで 3分加温した後に室温で 1 0分以上放置して、 RNAの二次構造を形成ざせた。この RN A溶液に、 20 1の緩衝液 Aに溶かした E. c o 1 i由来 t RNA 混合物の溶液（1 00 g/m 1 ; S i gm aから購入したサンプルをゲル精製したもの）を加えて、 5分以上室温で放置した後、その溶液を 5 1ずつ分注した。これに 5 1の R a f — 1 G S T— R B D溶液（R B D の他、 B SA 1 60 g/m 1 , ImM DTT、 10%グリセロールを緩衝液 Aに溶かしたもの）を加えて、 3 7°Cで 30分間インキュベートした後、非変性 5%ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド = 39 ： 1) 電気泳動により解析した。

電気泳動は、室温、定電圧（1 50 V) で約 2時間行った (ゲルサイズ 1 6 cm X 1 6 c mX 1 mm) 。泳動用緩衝液の組成は、 12. 5 mM T r i s、 1 2 5mM G 1 y c i n eである。泳動後のゲルはゲルドライヤーを用いて乾燥させ、バイオイメージングアナライザー（BAS 2500、富士フィルム）で解析した。

その結果、予想通り、 RNA XL 1分子と GST— RBD 2分子は効率よく複合体を形成することがゲルシフトのバンドパターンからわかった（図 10 c) また、 GS T— RBD非存在下の RNA X Lのバンド移動度は R N A 9 AX 2とほぼ同じだったことからも、 XLは RNA 9 Aが二量化したものであることが確認できた（図 10 c及び d) 。また、 2分子の GST— RBDとの結合活性は、 RNA 2 X 9Aよりも RNA X Lの方が高いことがゲルシフトのパタ一ンから示唆された。これは、 GST t a gで二量体化した R a f — 1 RBDの配向と RNA XLの RBDへの結合部分がうまく合致しているためと考えられる。それに対して RNA 9八は03丁_尺：60と 1 ： 1で結合した複合体を形成した（図 1 0 a) 。また、 R a f — 1 R B Dへの結合が無視できるほど弱い RNA 0 Cは、 GS T— RBD濃度を増やしてもゲルシフトは認められなかった（図 10 b) 。

以上の結果から、 5 I yを位置選択的に RNA 9 Aに導入することにより G S T— R B Dに依存した R N A間での架橋反応性を付与できることが明らかとなり、 5 I yが分子間相互作用の解析に応用できること、そして、新たな機能をもつ核酸の創製において人工塩基対 s · 5 I yが有用であることがわかった。

参考例 1 R a f — 1タンパク質に特異的に結合する RNA アブタマ一の単離

本参考例では、 R a f — 1タンパク質に特異的に結合する RN A アブタマ一を i n V i t r oセレクション法により単離した。この RNA分子は、タンパク質問相互作用を制御する細胞情報分子として機能することを示した。

R a f - 1タンパク質は、細胞質に発現される分子量 74 kD aのセリン Zトレオニンプロテインキナーゼであり、がん遺伝子として発見された c— r a f — 1の遺伝子産物である [R a p p e t a 1. , 1 988] 。哺乳類細胞では、 R a f — 1のァイソフォームとして A— R a f 、 B— R a f が存在することが知られている。 R a f — 1の活性化は、膜結合型タンパク質である R a sとの相互作用により引き起こされ、そして R a s以外のタンパク質もその制御機構に関与していることがわかってきている [Ko 1 c h、 2000] 。 R a sタンパク質は、がん遺伝子として発見された r a sの遺伝子産物であり、 GDPまたは GTPと結合する低分子量 Gタンパク質である [C amp b e 1 1 e t a 1 . ， 1 998] 。他の Gタンパク質と同様に、 R a sは GTPと結合した状態が活性化型である。この GTP結合型 R a sは、 R a f — 1のアミノ酸残基 5 1 一 1 3 1番からなるドメイン（R a s— b i n d i n g d oma i n ; RB D) と結合することが同定されている。 R a f — 1の活性化には、 Ra s - R a f相互作用によって引き起こされる膜上での何らかの構造変化や、他の因子とのさらなる相互作用等が必要であると考えられている。

本参考例では、 i n V i t r oセレクション法を用いて、 R a s ' R a f相互作用のみを選択的に阻害する制御分子の創製を試みた。核酸との相互作用が知られていないタンパク質に対しても、 i n V i t r oセレクション法を用いることで、そのタンパク質に特異的に結^する DNAや RNA分子（ァプ夕マー）を人工的に得ることができる。この i n V i t r oセレクション法は、選択 · 増幅の一連の操作（ラウンド）を繰り返すことにより、ランダムな配列を含んだ核酸のライブラリー（プール）から特定の機能を有する分子種を選別する手法である（図 1 1) [E l l i n g t o n & S z o s t a k, 19 90] 。本参考例では、細胞情報伝達における R a sと Ra f — 1の相互作用を選択的に制御する新規 RNA分子の創製をめざし、 i n V i t r oセレクション法により R a f — 1 RBDに特異的に結合する RNAアブ夕マーを単離した。 60 ヌクレオチド（N₆₀) のランダム配列を含むプールから得られた RNAァプタマ一は、 R a f — 1 RBDと R a sの相互作用を阻害した。しかし、この RN Aァプタマ一の阻害能は弱く、 R a sに対して大過剰の RNAが阻害に必要となつた。そこでセレクション法を一部改良し、新たにデザインした 45ヌクレオチド（N₄₅) の RNAランダム配列を含むプールを用いてセレクションを行った。 RT— PCR産物を TOPO TA C l o n i n g K i t Du a l ( I nv i t r o g e n) により T Aクローニングベクター p CR® I I -TOP Oにサブクローニングし、個々のクローンの塩基配列を、 dRh o d am i n e Te rm i n a t o r Cy c l e S e q u e n c i n g Re a dy R e a c t i o n K i t (Ap p l i e d B i o s y s t ems) を用レて決定した。その結果、さらに阻害能の高い二種類の RNAァプ夕マ一（RNA 9 A、 RNA 9 B) が得られた。

とりわけ阻害能の高かった RN A 9 Aは、 R a sおよび R a f — 1を発現させた S f 9細胞の膜画分および HEK 293細胞の細胞質画分を用いた無細胞系で、 R a sによる R a f — 1の活性化を強く阻害し、人為的制御分子として機能することがわかった。また RNA 9 Aは、 R a f _ 1のァイソフォームである B— R a f の RBDに結合するにも関わらず（図 12) 、 B _a f RBDと

R a sの相互作用は阻害せず、 R a s - R a f 一 1相互作用に対する阻害は特異的であることがわかった。また、 RNa s eによる限定分解、化学修飾を用いた R N Aの二次構造解析、そして RNAを切り詰めた RNAバリアントでの実験結果から、 RNA 9 Aはシユードノット構造を形成することが予測された（図 1 3) 。また、化学修飾を用いたフットプリンティングにより R a f — 1 RBD と相互作用する RNA 9Aの領域を調べた結果、特定のループ部分が R a f _ 1 R B Dとの結合表面に位置することが示唆された。

実施例 1 1 エチレン型リンカ一を介してピオチンを結合させた y誘導体の合成 (図 1 5)

N—ァリルビオチンアミド (図 15の化合物 2) の合成

アルゴン置換した 1 00m 1フラスコ中で 25 1 mg (0. 735mmo 1 ) の b i o t i n— N— hyd r o xy s u c c i n i m i d e (化合物 1 ) ( S i gma— A l d r i c h) を 26. 7 m 1の乾燥 DM Fに溶解させたものに 5 0 pi 1 ( 0. 668 mmo 1 ) の a l 1 y 1 am i n e (ナカライテスク）を加え、アルミホイルで遮光し、室温で撹拌した。反応の進行は C 1 8逆相 HPL C でモニタ一した（HPLC条件；カラム、 — B o n d s p h e r e 19 x 1 50 mm (Wa t e r s) ；移動相、 H₂〇中、 20 % ァセトニトリル；溶出速度、 10m 1 Z分；検出方法、 UV吸収（200 nm) ) 。反応開始から 3 時間後で原料の b i o t i n— N— hyd r o xy s u c c i n im i d eがほぼ完全に化合物 2に変化していることが確認された。この反応溶液をそのまま次の反応に用いた。

ピオチニル化 5— (3—ァミノ— 1一プロべ二ル） — 3— （ —D—リボフラノシル）一 2—ピリドン（図 1 5の化合物 4) 及びピオチニル化 5 _ (3—ァミノ一 1 _プロペン一 2—ィル）一 3— （/3—D—リポフラノシル）一 2—ピリドン（図 1 5の化合物 5) の合成

化合物 2の反応溶液（0. 668mmo 1の化合物 2が 26. 7m lの乾燥 D MFに溶解しているもの）に、 1 18mg (0. 334 mmo 1 ) の 5— i o d o— 3— (,/3— D— r i b o f u r an o s y l ) — 2— py r i d on e 1 - r y, 化合物 3) と 98. 3mg (0. 334 mm o 1 ) の d i s o d i um t e t r a c h l o r o p a l 1 a d a t e (S i gma— A l d r i c h) を 26. 7m lの 0. 1M 酢酸ナトリウム溶液（ p H 5. 2) に溶解させたものを加え、アルゴン雰囲気中、室温で 20時間撹拌した。反応終了後、溶媒を蒸留によって除き、残渣を H₂〇に懸濁させた。これを逆相カラム（固定相、 C o smo s i l 140 C 18 -p r e p (ナカライテスク）；移動相、 H₂0 中、 40% ァセトニトリル）に通した後、生成物を含むフラクション（UV吸収（260 nm) で検出）を回収し、エバポレートした。得られた残渣を H₂0 に溶かし、 C 18逆相 HPLCで生成物の精製を行った（HPLC条件；カラム、 Ai-B o n d s h e r e 1 9 x 1 50 mm (Wa t e r s) ；移動相、溶媒 A = H₂0、溶媒 B=H₂0中 50 % ァセトニトリル、 0— 1 5分、 10 - 80% B、 1 5- 1 5. 5分、 80— 100 % B、 1 5. 5— 18分、 1 00% B、 1 8.— 1 9分、 1 00— 10% B、 1 9一 24分、 10% B ；溶出速度、 10m 1 /分；検出方法、 UV吸収（260 nmおよび 3 18 nm) ) 。生成物の HP L C精製後の収率は 47. 4mg (0. 093 mm o し化合物 3より 27. 9 %) であった。

ここで精製したものは 4と 5の化合物の混合物となっていた。化合物 4と 5を分離するために、別の条件で再度 HPLC精製を行った（HPLC条件；カラム、 ^― B o n d s ph e r e 1 9 1 50 mm (Wa t e r s) ；移動相、 9% ァセトニトリル i n H₂0 ;溶出速度、 1 0m l Z分；検出方法、 UV吸収（26 0 nmおよび 318 nm) ) 。得られた 4と 5の量の比はそれぞれの化合物の¹ H— NMRにおけるエチレンプロトン（化合物 4に関しては— CH=CH―、化合物 5に関しては >C = CH₂) の積分値の比から求め、 4 : 5 = 0. 53 : 0. 47であった。

化合物 4に関する構造解析データ； ¹ H— NMR (DMSO— d₆) , δ (ρ pm) 1. 1 9 - 1. 68 (6 H, m， - C H ₂ C H^C H C H ₂ - C (〇） N H— ) , 2. 1 0 (2 H, t， -CH.-C (O) NH— , J = 7. 3 H z ) ， 2. 57 ( 1 H, d, -CHCH₂S J = 1 2. 7 H z ) , 2. 8 1 ( 1 H , d d， - CHCH₂ S -, J =4. 7, 1 2. 4H z ) , 3. 06— 3. 12 ( 1 H, m, -CHCHS -) , 3. 34 - 3. 66 (2 H, m, H 5 ' ， 5 ' ，）， 3. 76 - 3. 93 (5 H, m, H2 ' , 3，， 4 ' , -C (O) NHC H -) , 4. 0 9-4. 14 ( 1 H, m, -NHCHCHS -) ， 4. 27 - 4. 32 ( 1 H, m, -NHCHCH₂S -) , 4. 66 -4. 7 1 (2H, m ， H I ' ， 3 ' -OH) , 5. 04- 5. 1 3 (2H, m， 2 ' -OH, 5 ' 一 OH) ， 5. 93 ( 1 H, d t, - CH₂ CH=CH-, J = 5. 5， 1 6. 0 Hz) , 6. 25 (1H， d, -CH₂CH=CH-, J = 1 5. 8 H z ) , 6 . 36 ( 1H， s , -NHCHCH₂ S -) ， 6. 42 ( 1 H， s， -NHCH CHS -) ， 7. 32 (1H， s， H 6) , 7. 90 (1 H, s， H4) ， 7. 96 ( 1 H, t， — C (〇） NHCH₂-, J = 5. 1Hz) , 1 1. 72 (1 H， b s， H I) ； ¹³C-NMR (DMS O- d ₆) , δ (p pm) 25. 3, 28. 2， 35. 1， 55. 4， 59. 2, 61. 1， 70. 7 , 74. 4, 8 1. 0, 83. 6, 1 1 5. 2， 1 23. 6， 12 5. 7, 1 30. 7 , 13 1 . 7， 1 34. 1， 1 60. 9, 1 62. 5, 17 1. 6 ; E 1 e c t r o n s p r a y ma s s s p e c t r um, [M— H] ^_ (n e g a t i v e) = 507. 30 ( f o und) , 507. 1 9 (c a l c d. ) ， [M + N a] "•" (p o s i t i v e) = 531. 28 ( f o un d) , 53 1. 19 (c a 1 c d . ) ； U V a b s o r p t i on s p e c t r um (H₂0) ， A_max = 262 nm, 325 nm, A_{mi n}= 29 1 nm.

化合物 5に関する構造解析データ； ¹ H— NMR (DMSO-d₆) ， d (p pm) 1. 1 2 - 1. 64 (6 H, m, - C H ₂ C H ₂ C H ₂ C H ₂ - C (O) N H— ) ， 2. 08 (2 H, t , -CH - C (O) NH— , J = 7. 1Hz) , 2. 55 (1 H， d, - CHCH₂ S一, J = 12. 5 H z ) , 2. 8 1 ( 1 H , d d， -CHCH₂ S -, J = 5. 1， 12. 4Hz) , 2. 99— 3. 06 ( 1 H, m, -CHCHS -) ， 3. 46 - 3. 67 (2H， m, H 5 ' , 5 ' ，）， 3. 79 -4. 10 (6H， m， H2 ' ， 3，， 4，， — C (O) NHC H -, -NHCHCHS-) , 4. 26 -4. 3 1 ( 1 H, m， -NHCHC H₂ S -) , 4. 67 -4. 7 1 (2 H, m, H I ' ， 3 ' —OH) ， 5. 04 - 5. 1 3 (3H， m， 2 ' 一 OH, 5， -OH, >C = CH₂) ， 5. 38 ( 1H, s , >C = CH₂) ， 6. 36 (1H, s， -NHCHCH₂S-) , 6 . 41 ( 1 H, s , -NHCHCHS -) ， 7. 34 ( 1 H, d， H 6 , J = 2 . 3 H z ) , 7. 96 ( 1 H, d， H4， J = 1. 8 H z ) ， 8. 06 ( 1 H， t , 一 C (O) NHCH₂-, J = 5. 6 H z ) , 1 1. 79 (1 H, b s , H 1) ; ¹³C— NMR (DMS O- d ₆) ， δ (p m) 25. 4， 28. 1, 3 5. 1, 41. 0, 55. 4， 59. 1， 6 1. 0, 70. 4, 74. 4， 81 . 0， 83. 4, 1 10. 5, 1 1 5. 5， 129. 9, 130. 2, 1 35. 4， 139. 9, 160. 8， 162. 5, 17 1. 8 ; E 1 e c t r o n s p r ay ma s s s p e c t r um, [M_H] 一 (n e g a t i v e) = 507. 29 (f oun d) , 507. 1 9 (c a 1 c d. ) , [M + Na] + (p o s i t i v e) = 531. 2 5 (f o un d) , 53 1. 1 9 (c a 1 c d . ) ； U V a b s o r p t i o n s p e c t r um (H₂0) , A_max = 25 9 nm, 314 nm, A_{mi n}= 286 nm.

実施例 1 2 エチレン型リンカ一を介してピオチンを結合させた yの誘導体の三リン酸化（図 1 6)

ビォチニル化 5— (3—アミノー 1—プロべニル）一 3 _ (]3_D—リボフラノシル）一 2—ピリドン 5 ' —トリホスフェート（B i o— yTP，図 16 の化合物 6) の合成

アルゴン置換した 5m 1フラスコに 37. 3mg (0. 073mmo 1 ) の化合物 4と 23. 6 mg (0. l lmmo l ) の P r o t on S on g e (S i gma— A l d r i c h) を入れ、 734 1の t r ime t hy l h o s p h a t e (ナカライテスク）に懸濁させ、氷水中で 1 5分間撹拌した。ここに 8. 9 1 ( 0. 095 mm o 1 ) の p h o s p h o r u s o xy c h l o r i d e (ナカライテスク）を加え、 4°Cで 29時間撹拌した後、 733 1 (0 . 367 mm o 1 ) の 0. 5M b i s ( t r i— n— bu t y l ammo n i um) p y r o p h o s p h a t e— DMF溶液と 87 1 ( 0. 367 mmo 1) の t r i一 n— bu t y l am i n eを加えさらに 30分間撹拌した。その後、 367 1の 0. 5M TEAB (pH 7. 5) を加え反応を停止させた。この溶液から DEAE— S e ρ h a d e X A— 25 c o l umn (カラム、 DEAE— S e p h a d e x A— 25 (Am e r s h am B i o s c i e n c e s ) φ 1 5mmx 300mm、移動相； 5 OmM— 1 M TEAB (p H 7. 5) l i n e a r g r ad i e n t) によって化合物 6を精製したピオチニル化 5— （3 _アミノー 1一プロペン— 2—ィル）一 3— ( J3— D— リポルラノシル） —2 ピリドン 5 ' —トリホスフェート（図 1 6の化合物 7 ) の合成

アルゴン置換した 5m 1フラスコに 3 3. 1 mg (0. 0 65 mm o 1 ) の化合物 5と 20. 9 mg (0. 0 9 8 mm o l ) の P r o t o n S p o n e ( S i gma -A 1 d r i c h) を入れ、 3 2 5 1の t r i me t h y l p h o s p h a t e (ナカライテスク）に懸濁させ、氷水中で 1 5分間撹拌した。ここに 7. 911 1 (0. 0 8 5 mm o l ) の p h o s p h o r u s o xy c h l o r i d e (ナカライテスク）を加え、 4 °Cで 2 3時間撹拌した後、 6 5 0 /z l (

0. 3 2 5 mm o l ) の 0. 5 M b i s K t r i— n— b u t y l a mm o n

1 um) p y r o p h o s p h a t e— DMF溶液と 7 7 1 (0. 32 5mm o l ) の t r i— n— b u t y l am i n eを加えさらに 3 0分間撹拌した。その後、 3 2 5 1の0. 5M TEAB ( H 7. 5) を加え反応を停止させた。この溶液から D E AE— S e p h a d e X A— 2 5 c o l umn (カラム、 DEAE-S e ph a d e x A— 2 5 (Am e r s h am B i o s c i e n c e s ) 1 5 mm x 3 0 0mm、移動相； 5 OmM— 1 M TEAB ( pH 7. 5) l i n e a r r a d i e n t) によって化合物 7を精製した。

実施例 1 3 アセチレン型リンカ一を介してピオチンを結合させた y誘導体の合成（図 1 7)

N—プロパルギルージクロロアセトアミド（図 1 7の化合物 9) の合成アルゴン置換した 1 0 0m 1フラスコ中で 1. 3 7m l ( 20 mm o 1 ) の p r o p a r gy l am i n e (ィ匕合物 8 ) (S i gma— A l d r i c h) と 2 . 0 2 g (24mmo 1 ) の N aHC0₃ (ナカライテスク）を 40m 1の CH ₂C 1 ₂に加え、氷上で撹拌した。ここに d i c h l o r o a c e t y l c h l 0 r i d e (ナカライテスク） 2. 1 2m l (22mmo 1 ) を滴下し、室温で 3時間撹拌した。この溶液を 5 % N aHC〇₃水溶液 40m 1で 1回、飽和 N a C 1水溶液 40m lで 2回洗浄した後、有機層を N a ₂ S 0₄で乾燥させた。これをろ過した後、エバポレートし、化合物 9を得た。得られた化合物 9は 2. 60 g (1 5. 7mmo 1、 78. 3 %) であった。

化合物 9に関する構造解析データ； ¹ H— NMR (CDC 1₃) ， δ (ρ ρ m) 2. 26 (1H， t , -C≡CH, J = 2. 6Hz) ， 4. 06 (2 H, d d， - CH^-, J = 2. 6, 5. 3Hz) , 5. 88 ( 1 H, s， C 1₂C H-) ， 6. 62 ( 1 H, b s， -NH-) .

5 - (ジクロロアセチルー 3—ァミノ— 1一プロピエル）一 3— (/3 -D- リポフラノシル）一 2—ピリドン（図 1 7の化合物 10の合成）

5m lフラスコに 7 lmg (0. 20 mmo 1 ) の 5— i o d o— 3— (β D— r i b o f u r an o s y l ; — 2— py r i d o n e ( I一 r y、ィ匕合物 3) を入れ、乾燥ァセトニトリルで 2回共沸した。これを lm 1の乾燥 DMFに溶解させ、 6. lmg (0. 032 mmo 1) の Cu I (ナカライテスク）、 4 2 β 1 (0. 3 Ommo 1 ) の t r i e t hy l am i n e (ナカライテスク）、 50 mg (0. 3 Ommo 1 ) の化合物 9、および 12 mg (0. 010mm o 1 ) の P d (P P h₃) ₄ (ナカライテスク）を加え、アルゴン雰囲気中室温で 1 9時間撹拌した。反応終了後、 E t OAcZHsOで抽出を行い、有機層を 1 0m 1の H₂〇で 2回洗浄した。水層をェパポレートし、 0. 22 zmのフィルターユニットでろ過した後、 C 18逆相 HP L Cで生成物の精製を行った（H PLC条件；カラム、 At— B o n d s p h e r e 1 9 x 1 50 mm (Wa t e r s) ；移動相、溶媒 A = H₂0、溶媒 B=ァセトニトリル、 0— 10分、 5 - 20 % B、 1 0— 1 8分、 20% B、 18 _ 19分、 20 - 5% B、 1 9 - 24分、 5 % B ；溶出速度、 10m 1 Z分；検出方法、 UV吸収（26 0 nmおよび 3 18 nm) ) 。生成物（1 0) の HP L C精製後の収率は 25. 2mg (0. 064 mmo 1、 32. 2 %) であった。

化合物 10に関する構造解析データ； ¹ H— NMR (DMSO-d₆) , δ (p pm) 3. 45 - 3. 75 (2H， m， H5，， 5，，）， 3. 78— 3. 87 (3H， m， H2，， 3，， 4，）， 4. 16 (2H, d， — C (〇） NH CH₂-, J = 5. 3Hz) , 4. 64 ( 1 H, d， H 1 ' , J =4. 3 H z ) , 4. 70 ( 1 H, d， 3 ' 一 OH, J =4. 8Hz) , 4. 90 ( 1 H, t , 5 ' -OH, J = 5. 4H z) ， 5. 07 ( 1 H, b s , 2 ' -OH) , 6. 4 7 (1 H, s , C 1₂CH-) , 7. 54 - 7. 57 (2 H, m， H4, 6) ， 9. 09 (1H, t, — C (〇） NHCH₂-, J = 5. 1Hz) ， 12. 02 ( 1 H, b s, HI) ； E l e c t r on s r a y ma s s s p e c t r um, [M— H] — (n e g a t i v e) = 389. 1 6 ( f o und) , 3 89. 03 (c a l c d. ) , [M + H] ⁺ (p o s i t i v e) = 39 1. 2 0 (f ound) , 39 1. 05 (c a l c d. ) ； UV a b s o r p t i o n s p e c t r um (H₂0) , A_max=25 9 nm, 316 nm, λ _{mi n} = 280 nm.

5— （3—ァミノ一 1一プロピニル）一 3— （ ;3— D—リポフラノシル）一

2—ピリドン（図 1 7の化合物 1 1 ) の合成

スクリユーキャップ付きのガラス瓶に化合物 10を 45mg (0. 12mmo

1) 入れ、 5m 1の H₂0に溶解させた。ここに 28 %アンモニア水を 1 m 1加え、室温で 26時間撹拌した。

ピオチェル化 5— （3—ァミノ— 1—プロピニル） — 3— （j3— D—リボフラノシル）一 2—ピリドン（図 1 7の化合物 1 2 ) の合成

化合物 1 1の反応溶液を 5m 1フラスコに移し、エバポレートした。得られた残渣を乾燥ァセトニトリルで 3回共沸した後、 43mg (0. 1 3mmo 1 ) の b i o t i n— N— hy d r o xy s u c c i n im i d e (, S i gm a— A 1 d r i c h) を加え、 1 m 1の乾燥 DM Fに溶解させた。これを室温で 2時間撹拌した後、 5m lの H₂0を加え、 C 18逆相 HP L Cで生成物の精製を行った (HPLC条件；カラム、 — B on d s ph e r e φ 1 9 x 1 50mm (W a t e r s) ；移動相、溶媒 A = H₂〇、溶媒 B =ァセトニトリル、 0— 1 5分

、 10 -40% B、 1 5 - 1 5. 5分、 40— 50% B、 15. 5— 18分、 50% B、 18— 1 9分、 50— 10 % B、 1 9— 24分、 10% B ；溶出速度、 10m 1 Z分；検出方法、 UV吸収（260 nmおよび 3 18 nm)

) 。生成物（1 2) の H PLC精製後の収率は 35. 9mg (0. 07 1 mm o

1、化合物 10より 6 1. 6%) であった。化合物 12に関する構造解析データ； ¹ H— NMR (DMSO— d₆) , δ (p pm) 1. 2 3 - 1. 62 (6H, m, - C H ₂ C H ₂ C H ₂ C H ₂ - C (O ) NH-) , 2. 0 9 (2 H, t , -CH -C (O) NH -， J = 7. 4Hz ) , 2. 56 ( 1 H, d， - CHCH₂ S J = 1 2. 9 H z ) ， 2. 8 0 ( 1 H, d d, -CHCH₂S -, J = 5. 1, 1 2. 5Hz) , 3. 04- 3. 1 1 ( 1 H, m, -CHCHS -) , 3. 47— 3. 62 (2 H, m, H 5 ' ， 5，，）， 3. 7 8 - 3. 8 7 (3H， m， H2，， 3 ' , 4，）， 4. 04 (

2 H, d, -C (O) NHCH₂-, J = 5. 4H z ) ， 4. 09—4. 1 2 ( 1 H, m， -NHCHCHS -) ， 4. 26 -4. 3 1 ( 1 H, m， -NHCH CH₂ S -) , 4. 6 3 (1 H， d, H 1 ' ， J =4. 6 H z ) , 4. 7 1 (1 H, d， 3 ' -OH, J =4. 8Hz) ， 4. 9 2 ( 1 H， t， 5 ' -OH, J = 5. 3Hz) , 5. 1 1 ( 1 H， b s , 2， -OH) , 6. 34 ( 1 H, s , -NHCHCH₂ S -) ， 6. 41 ( 1 H， s， -NHCHCHS -) ， 7. 5

3 (2H， s , H4, 6) , 8. 2 7 ( 1H, t , — C (〇） NHCH₂-, J = 5. 4Hz) ， 1 1. 9 3 ( 1 H, b s , H I) ； E l e c t r o n s p r a y ma s s s p e c t r um, [M— H」 — (n e g a t i v e) = 50 5. 2 3 (f o u n d) , 50 7. 1 8 (c a l c d. ) ， [M + H] ⁺ (p o s i t i v e) = 50 7. 26 ( f o u nd) , 5 0 7. 1 9 (c a 1 c d. ) , [M + N a] + (p o s i t i v e) = 52 9. 2 6 ( f o un d) ， 52 9 . 1 7 (c a l c d. ) ； UV a b s o r p t i o n s p e c t r um (H ₂〇）， A_max= 2 5 9 nm, 3 1 8 nm, A_{mi n}= 2 80 nm.

実施例 14 アセチレン型リンカーを介してピオチンを結合させた yの誘導体の三リン酸化（図 1 8)

ピオチニル化 5— （3—ァミノ _ 1一プロピニル）一 3— （3— D—リボフラノシル）一 2—ピリドン 5 ' —トリホスフェート（B i o²— y TP, 図 1 8の化合物 1 3) の合成

アルゴン置換した 5m 1フラスコに 2 5. 6mg (0. 0 5mmo l ) の化合物 1 2と 16. 2mg (0. 0 7 5 mm o l ) の P r o t o n S p o ng e ( S i gm a - A 1 d r i c h) を入れ、 25 0 1の t r i me t h y l p h o s p a t e (ナカライテスク）に懸濁させ、氷水中で 1 5分間撹拌した。ここ ίこ 6 1 ( 0. 0 6 5 mm o 1 ) の p h o s p h o r u s o xy c h l o r i d e (ナカライテスク）を加え、 4°Cで 8時間撹拌した後、 50 0 1 (0. 2 5 mm o l ) の 0. 5M b i s (t r i— n— b u t y l a mm o n i um) p y r o p h o s p h a t e—DMF溶液と 6 0 1 ( 0. 2 5 mm o 1 ) の t r i -n-b u t y l am i n eを加えさらに 30分間撹拌した。その後、 2 5 0 1の0. 5M TEAB (pH7. 5) を加え反応を停止させた。この溶液から DE AE— S e p h a d e X A— 2 5 c o l umn (カラム、 DEAE — S e p h a d e x A— 2 5 (Am e r s am B i o s c i e n c e s) 1 5 mm x 3 0 0 mm、移動相； 5 0 mM— 1M TEAB (pH 7. 5) l i n e a r g r a d i e n t ) によって化合物 1 3を精製した。

実施例 1 5 B i o-yTP (化合物 6 ) 、 B i o²-y TP (化合物 1 3 ) の濃度およびモル吸光係数の決定

方法

B i o— yTP、 B i o ²— y TPの濃度は、アルカリフォスファターゼによりリン酸エステル結合を分解後、無機リン酸の含有量を求めることで決定した。また、ヌクレオシド 5 ' ―三リン酸のモル吸光係数、ィプシロン（E) 、の値は、 1 OmMリン酸緩衝液（pH 7) 中での極大吸収波長および波長 2 6 0 nmにおける吸光度 A b s (Ab s o r b a n c e) を測定して、計算式 E = Ab s /C o n e (C o n c ：ヌクレオシド 5 ' —三リン酸の濃度）より決定した。アル力リフォスファターゼによるリン酸エステル結合の分解反応は、ヌクレオシド 5 ' —三リン酸、 5 OmM T r i s— HC 1 pH 9. 0、 1 mM Mg C l ₂、 2 0 u n i t sの C a l f i n t e s t i n e由来のアルカリフォスファターゼ（T aKaR a) を含む反応溶液（40μ 1スケール）を 42°Cで 1 時間インキュべ一卜することにより行った。リンの定量は、 Ch e nの方法に従つて行った [Ch e n e t a l . 、 1 9 5 6] 。反応溶液の半量 2 0μ 1を 4m 1の水と 4m 1の R e a g e n t C (6 N 硫酸、蒸留水、 2. 5 %モリブデン酸アンモニゥム溶液、 1 0 %L_ ( + ) ァスコルビンを体積比 1 : 2 : 1 ： 1で混合した溶液）に加えて、 37 °Cで 2時間振とうしながら反応させた。反応後のサンプルを室温に戻してから 8 2 0 nmの吸光度を測定して、検量線からリンの含有量を算出した。

結果

B i o— y TPの極大吸収波長は 3 2 6 nmおよび 2 6 2 nmであり、その波長でのィプシロンの値はそれぞれ E 3 26 = 7. 5x1 0³および E 2 6 2 = 2 . 9xl 0⁴であった。また、 E 26 0 = 2. 8xl 0⁴であった。 B i o²— y TPの極大吸収波長は 3 1 7 nmおよび 2 5 8 nmであり、その波長でのィプシロンの値はそれぞれ E 3 1 7 = 5. 3x1 0³および E 2 5 8 = 1. 8x 1 0⁴であった。また、 E 26 0 = l . 8xl 0⁴であった。

6 RNA^\( B i o -y^^Z i o ² - y 0^¾¾^¾¾Λ 方法 ,

RN Aへの酵素反応による B i o— yおよび B i o ²— yの位置選択的導入は、 sを含む DNA ( t emp 3 5 s ； 3 5— me r) (配列番号 8) を錶型とした T 7 RNAポリメラ一ゼによる転写反応により行われた（図 1 9) 。 t em p 3 5 sもしくはコントロールの铸型鎖 t emp 3 5 A (配列番号 9) と相補的な配列を含む DN A (T 7 p r i m 2 8 N； 2 8 -me r) (配列番号 1 0) を、 1 OmM N a C lを含む l OmM T r i s— HC 1 (pH7. 6) 中で混合し、ァニ一リング操作により二本鎖とし、転写反応に用いた。

T 7転写反応は 20μ 1スケールで行い、その組成は 4 OmM T r i s— H C I pH 8. 0、 5mM DTT、 8 mM MgC l ₂、 2mM スペルミジン、 0. 0 1 % T r i t o nX- 1 0 0, 1 OmM GMP、 1 mM NTP s (N = A、 G、 C、 U、 B i o— yTP、 B i o²— yTP) 、 2μΟ i — ³²P] ATP、 0. 5μΜ 二本鎖 DNA、 2. 5 U/μ 1 T 7 RNA ポリメラ一ゼ（T aKaR a) である [Oh t s u k i e t a 1. , 20 0 1 ] 。 3 7。Cで 3時間酵素反応を行い、等量の 1 0M 尿素を含む TPE溶液を加えて 7 5°Cで 3分加温して反応を終了させた。そして、反応溶液の一部を 2 0 %ポリアクリルアミドー 7M 尿素ゲルで電気泳動して、 [ひ一³² P] AT Pによりラベルされた反応産物をバイオイメージングアナライザ一（BAS 2 5 0 0、富士フィルム）で解析した。結果

ェ！！！の八丁！³、 GTP、 B i o— y TPの存在下では、铸型中の sに対して B i 0— yが RNA中に取り込まれ、 1 5— me rの産物をゲル電気泳動により確認できた（図 19、レーン 2) 。同様に、 B i o—yTPと ATP、 GTP、さらに UTPの共存下でも、 B i ο—yTPが競合して、铸型中の sに対して選択的に取り込まれた 15—me rの産物（図 1 9、レーン 4) を確認できた。また、 B i o— yTPと ATP， GTP及び CTP、あるいは ATP， GTP、 U TP及び C TPの共存下でも、 B i o— y TPが競合して、铸型中の sに対して選択的に取り込まれた 1 7— me rの産物（図 1 9、レーン 6、 8) を確認できた。

ここでは、 B i o— yを含む RNAが B i o— yを含まない同じ長さの RNA と比較して移動度が小さくなることを利用して、 B i o— yが取り込まれた転写反応産物かどうかを電気泳動のバンドパターンにより区別することにより、铸型 DNAの sに相補した B i o— yの RNA中への選択的な取り込みを確認した（図 1 9、レーン 2— 8) 。また、図 1 9のレーン 1 0では B i o— yを含む RN A 1 7—me rに相当するバンド（図 19、レーン 8) が検出されず、鐯型中の sを含まない天然ヌクレオチドに対する B i o— yの誤った取り込みはほとんどないことが示唆された。以上の結果から、 sを含む铸型 DNAを用いた T 7転写反応により、 B i o— yを RNA中に位置選択的に導入できることがわかった。

B i o²— yTPでも、 B i o _y TPと同様の結果を得た。 ImMの ATP 、 GTP、 B i o²— yTPの存在下で、铸型 DNA中の sに対して B i o²— yTPが RNA中に取り込まれ（図 1 9、レ一ン 1 2) 、 ATP及び GTPに加えて UTP及び又はもしくは CTPの共存下でも、 B i o²— yTPが競合して、铸型中の sに対して選択的に取り込まれた（図 19、レーン 14、 16、 1 8) 。また、鐃型中の天然ヌクレオチドに対する B i o²— yの誤った取り込みは見られず（図 1 9、レーン 20) 、 B i o²— yを RNA中に位置選択的に導入できることがわかった。なお、 s ' B i o— yもしくは s ' B i o ² _ y塩基対を用いた転写反応効率は、全長 1 7— m e rの R N Aのバンドを比較することにより算出された。その結果、天然塩基対用いた転写反応効率を 1 0 0 %とした場合、 s · Β 1 ο— γ しくは s · B i o ²— y塩基対を用いた場合で約 5 0 %であった（図 1 9、レーン 1 8、 1 9、 2 1 ) 。参考文献

以下の文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。

丄 . Battersoy, T.R., Ang, D.N., Burgstaller, P., Jurczyk, S.C., owser , M.T" Buchanan, D.D., Kennedy, R.T. & Benner, S.A. (1999) Quantitativ e Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. A m. Chem. Soc. 121, 9781-9789.

2 . Campbell, S.L., Khosravi-Far, R.， Rossman, K.L., Clark, G.J. & D er, C.J. (1998) Increasing complexity of Ras signaling. Oncogene 17, 1395

-1413.

3 . Chen, P.S., Toribara, T.Y. & Warner, H. (1956) Microdeterminati on of Phosphorus. Anal. Chem. 28, 1756-1758.

4 . Ellington, A.D. & Szostak, J.W. (1990) In vitro selection of RNA molecules that omd. specific ligands. Nature 346, 818-822.

5 . Fang, X., Cao, Z., Beck, T. & Tan, W. (2001) Molecular aptamer for real-time oncoprotein platelet-derived growth factor monitoring by fluo rescence anisotropy. Anal. Chem. 73, 5752-5757.

6 . Fujiwara, T.， Kimoto, M.， Sugiyama, H.， Hirao, I. & Yokoyama, S. (2001) Synthesis of 6-(2-Thienyl)purine Nucleoside Derivatives That Form

Unnatural Base Pairs with Pyridin-2-one Nucleosides. Bioorg. Med. Che m. Lett. 11, 2221-2223. 7 . Golden, M.C, Collins, B.D., Willis, M.C. & Koch, T.H. (2000) Dia gnostic potential of PhotoSELEX-evolved ssDNA aptamers. J. BiotechnoL 81, 167-178.

8 . Hirao, I., Madin, K.， Endo, Y., Yokoyama, S. & Ellington, A.D. (2 000) RNA aptamers That Bind to and. Inhibit the Ribosome-inactivating

Protein, Pepocin. J. Biol. Chem. 275, 4943-4948.

9 . Hirao, I., Nojima, T.， Mitsui, T. & Yokoyama, S. (2001) Synthesis of DNA templates containing the Fifth base, 2- Amino - 6- (dimethy lamino)p urine, for Specific Transcription Involving Unnatural Base Pairs. Chem. Lett. 914-915.

1 0 . Hirao, L, Ohtsuki, T.， Fujiwara, T.， Mitsui, T.， Yokogawa, T.， Okuni, T.， Nakayama, K., Takio, K.， Yabuki, T.， Kigawa, T.， Kodama, K，

Yokogawa, T.， Nishikawa, K. & Yokoyama, S. (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs in to proteins. Nat. BiotechnoL 20, 177-182

1 1 . Inouye, K.， Mizutani, S.， Koide, H. & Kaziro, Y. (2000) Formati on of the Ras Dimer Is Essential for Raf-1 Activation. J. Biol. Chem. 275 ， 3737-3740.

1 2 . Ishikawa, Μ·, Hirao, I. & Yokoyama, S. (2000) Synthesis of 3-( 2-deoxy- -D-ribofuranosyl)pyridin-2-one and 2-amino-6-(N,N-dimethylamino

)-9-(2-deoxy- -D-ribofuranosyl)purine derivatives for an unnatural base pai r. Tetrahedron. Lett. 41， 3931-3034.

1 3 . Jensen, K.B., Atkinson., B.L., Willis, M.C, Koeh, T.D. & Gold， L. (1995) Using in vitro selection to direct the covalent attachment of hu man immunodeficiency virus type 1 Rev protein to high-affinity RNA liga nds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 12220-12224.

1 4 . Jhaveri, S.， Rajendran, M. & Ellington, A.D. (2000) In vitro sel ection of signaling aptamers. Nat. BiotechnoL 18, 1293-1297. 1 5 . Kolch, W. (2000) Meaningful relationships: the regulation of th e Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochem J. 351, 28 9-305.

1 6 . Koyama, S., Chen, Y.-W., Ikeda, M.， Muslin, A.J., Williams, L. T. & Kikuchi, A. (1996) Ras-interacting domain of RGL blocks Ras-depen dent signal transduction in Xenopus oocytes. FEBS Lett. 380, 113-117.

1 7 . Latham, J .A., Johnson, R. & Toole, J.J. (1994) The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers c ontaining 5-(l-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822.

1 8 . Ludwig. J., Eckstein, F., J. Org. Chem., 1989， 54, 631-635.

1 9 . Matulic-Adamic, J., Beigelman, L.， Tetrahedron Lett., 1997,38,2 03-206.

2 0 . Meisenheimer, KM. & Koch, T.H. (1997) Photocross-Linking of Nucleic Acids to Associated Proteins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 32， 1 01-40.

2 1 . Morales, J.C. & Kool, E.T. (1999) Minor Groove Interactions be tween Polymerase and DNA: More Essential to Replication than Watson- Crick Hydrogen Bonds? J. Am. Chem. Soc. 121, 2323-2324.

2 2 . Ohtsuki, T.， Kimoto, M.， Ishikawa, M.， Mitsui, T.， Hirao, I. & Yokoyama, S. (2001) Unnatural base pairs for specific transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98， 4922-4925.

2 3 . Piccirilli, J .A., Krauch, T.， Moroney, S.E. & Benner, S.A. (1990) Enzymatic incorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alphabet. Nature 343, 33-37.

2 4 . Piccirilli, J.A., Moroney, S.E. & Benner, S.A. (1991) A C-nucleo tide base pair: methylpseudouridine-directe incorporation of formycin tri phosphate into RNA catalyzed by T7 RNA polymerase. Biochemistry 30, 1 0350-10356. 2 5 . Rapp, U.R., Heidecker, G., Huleihel, M.， Cleverland, J.L., Choi, W.C., Pawson, T.， Ihle, J.N. & Anderson, W.B. (1988) raf family serine/t hreonine protein kinases in mitogen signal transduction. Cold Spring Har b. Symp. Quant. Biol. 53, 173-184.

2 6 . Switzer, C.Y., Moreney, S.E. & Benner， S.A. (1993) Enzymatic Recognition of the Base Pair between Isocytidine and Isoguanosine. Bioch emistry 32， 10489-10496.

2 7 . Tae, E.L., Wu, Y.， Xia, G.， Schultz, P.G. & Romesberg, F.E. (2 001) Efforts toward Expansion of the Genetic Alphabet: Replication of RN A with Three Base Pairs. J. Am. Chem. Soc. 123, 7439-7440.

2 8 . Wu, Y.， Ogawa, A.K., Berger, M.， McMinn, D.L., Schultz, P.G. & Romesberg, F.E. (2000) Efforts toward Expansion of the Genetic Alpha bet: Optimization of Interbase Hydrophobic Interactions. J. Am. Chem. So c. 122, 7621-7632.

2 9 . Yamamoto, R., Baba, T. & Kumar, P.K. (2000) Molecular beaco n aptamer fluorescences in the presence of Tat protein of HIV-1. Genes C ells. 5， 389-396.

Claims

請求の範囲

1. 5位置換一 2—ォキソ（1H) —ピリジン一 3—ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド。

2. 前記塩基の 5位が、以下の

1) ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；

2) アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；

3) ピオチン又はその誘導体；あるいは

4) フルォレセィン、 6一カルボキシフルォレセィン、テトラメチルー 6 - カルポキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子

からなるグループから選択される置換基によって置換されている、請求項 1に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。

3. 前記塩基の 5位が、 1) ヨウ素、臭素から選択される光反応性基、、 2 ) アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体、又は 3) ビォチン又はその誘導体で置換されている、請求項 1又は 2に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。

4. 前記塩基の 5位がヨウ素又はピオチン誘導体で置換されている、請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。

5. 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた、核酸。

6. 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載のヌクレオチドと、 6位置換された 2 _アミノープリン一 9—ィル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、請求項 5に記載の核酸。

7. 前記 6位置換された 2—ァミノ—プリン一 9ーィル基が 2—ァミノ— 6 一（2—チェニル）プリン— 9一ィル基又は 2—アミノー 6— （ジメチルァミノ ) プリン一 9ーィル基である、請求項 6に記載の核酸。

8. アンチセンス DNA若しくは RNA、リポザィム又はアブタマ一として使用される、請求項 5に記載の核酸。

9 . タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードする、請求項 5に記載の

1 0 . 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた、核酸を調製する方法であって、

6位置換された 2—アミノープリン— 9一ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を铸型として転写、複製又は逆転写を行い、前記 6位置換された 2 _アミノープリン一 9—ィル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載のヌクレオチドを組み込むことを含む、前記方法。