WO2004002514A1 - 癌の予防・治療剤 - Google Patents

癌の予防・治療剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2004002514A1
WO2004002514A1 PCT/JP2003/008036 JP0308036W WO2004002514A1 WO 2004002514 A1 WO2004002514 A1 WO 2004002514A1 JP 0308036 W JP0308036 W JP 0308036W WO 2004002514 A1 WO2004002514 A1 WO 2004002514A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
amino acid
acid sequence
protein
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/008036
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Tanaka
Isao Kaieda
Kohei Honda
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company Limited filed Critical Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority to AU2003244191A priority Critical patent/AU2003244191A1/en
Priority to EP03761796A priority patent/EP1552845A4/en
Priority to US10/519,325 priority patent/US20060189518A1/en
Publication of WO2004002514A1 publication Critical patent/WO2004002514A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an agent for preventing and treating cancer, a diagnostic agent, and the like.
  • p53 is the most frequently detected tumor suppressor gene in human cancer, and has various physiological functions such as G-arrest, induction of apoptosis, and checkpoint mechanism when DNA is damaged. It has been shown to have It is thought that these functions are exerted by the p53 protein acting as a transcription factor and controlling the expression of its target gene. Therefore, if an abnormality occurs in p53 (mutant p53), these effects will not be exerted, and the cells will progress to cancer.
  • mutant p53 when introduced into cancer cells lacking p53, the cancer cells will form colonies even in soft agar, or will form tumors in a nude mouse model of biliary carcinoma.
  • mutant p53 is simply not only lose the function of normal p53 (wild-type P 53), a mutant P 53 itself, actively It is suggested that it is involved in canceration. Furthermore, it has been reported that this mutant p53, like wild-type p53, induces downstream genes (Oncogene, Vol. 12, pp. 1941-1952, 1996). Mutant p53 is divided into several types depending on the difference in the position of mutation. There is a report (Cancer Research, 55, 5217-5221, 1995).
  • EL0VL2 (Genbank Accession No. XM— 166355) is an enzyme that is homologous to the ELO (elongation of very long chain fatty acids protein) family of S. cerevisae and is an enzyme involved in long-chain fatty acid elongation reaction (EL0VL1). -Belongs to 5) You.
  • the EL0VL family is an enzyme required for the synthesis of long-chain (unsaturated) fatty acids or sphingolipids with 20 or more carbon atoms.
  • Staufen homolog 2 (STAU2) (Genomics, Vol. 62, pp. 113-118, 1999) is one of the human homologs of Drosophila Staufen, an RNA binding protein. Rats have been reported to be involved in the transport of mRNA in dendrites of hippocampal neurons (Molecular Biology of the Cell, Vol. 9, pp. 2945-2953, 1999).
  • STAU2 belongs to the RNA binding protein family together with PKR (double-stranded brittle activated protein kinase), TAR RNA binding protein (TRBP) and the like. It has been reported that cells overexpressing TRBP exhibit a transformed phenotype (Zampo Journal, Vol. 16, 611-624, 1997), but there is no report on the relationship between STAU2 and cancer.
  • PKR double-stranded brittle activated protein kinase
  • TRBP TAR RNA binding protein
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found a gene (EL0VL2 gene and STAU2 gene found as a mutant p53-inducible gene) whose expression is significantly increased in cancer tissues. Furthermore, they found that apoptosis was induced by suppressing the function of the gene. As a result of further study based on this finding, the present invention was completed.
  • a protein containing a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a compound inhibiting the activity of a salt thereof or a salt thereof Prevention and treatment of cancer
  • a diagnostic agent comprising the antisense polynucleotide according to (3) above
  • the diagnostic agent according to (7) above which is a diagnostic agent for cancer.
  • a tumor comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; / diagnosis of cancer comprising a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof Medicine,
  • the cancer is colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer,
  • Cancer is colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, organ cancer, monday cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer
  • a prophylactic / therapeutic agent for cancer comprising a compound having a function of inhibiting the activity of ELOVL 2 or a salt thereof;
  • an apoptosis-promoting agent comprising a compound having a function of inhibiting the activity of ELOVL 2 or a salt thereof
  • a prophylactic / therapeutic agent for cancer comprising a compound having an action of inhibiting the expression of ELOVL 2 or a salt thereof;
  • an apoptosis-promoting agent comprising a compound having a function of inhibiting ELOVL 2 expression or a salt thereof
  • a prophylactic or therapeutic agent for cancer characterized by using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof; Screening method,
  • the pharmaceutical compound is a compound for preventing or treating cancer, a compound used for preventing or treating cancer, or a compound having the effect of preventing or treating Z or cancer.
  • a prophylactic or therapeutic agent for cancer characterized by containing a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof; Screening kit,
  • a pharmaceutical compound comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof Screening kit, (23b) The screening according to (23a) above, wherein the pharmaceutical compound is a compound for preventing or treating cancer, a compound used for preventing or treating cancer and / or a compound having a preventive or treating effect for cancer. Kit,
  • (29) a method for screening for an apoptosis-promoting agent, which comprises using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof; (29a) the screening method according to (19a), wherein the pharmaceutical compound is a compound having an apoptosis promoting action;
  • a screen for an apoptosis-promoting agent characterized by using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof.
  • (31) Inhibits the activity of a protein, or a partial peptide or a salt thereof, containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in mammals
  • a method for preventing or treating cancer which comprises administering an effective amount of a compound or a salt thereof, or a compound or a salt thereof that inhibits expression of a gene of the protein.
  • (32) inhibits the activity of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof, or expresses a gene of the protein Cancer prevention and treatment methods characterized by inhibiting
  • a medical device comprising the antisense polynucleotide according to (36).
  • an agent for diagnosing cancer comprising a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof,
  • Cancer is colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor
  • Cancer is colorectal, breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, knee, brain
  • Prevention and treatment of cancer (5 1) a prophylactic or therapeutic agent for cancer comprising a compound having a function of inhibiting the expression of Staufen homolog 2 or a salt thereof,
  • a prophylactic or therapeutic agent for cancer characterized by using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a partial peptide thereof or a salt thereof; Screening method,
  • the pharmaceutical compound is a compound for the prevention and treatment of cancer, a compound for the prevention and treatment of cancer, and a compound having the effect of preventing or treating Z or cancer.
  • a prophylactic or therapeutic agent for cancer obtainable by using the screening method according to (52) or the screening kit according to (53).
  • a screening for an apoptosis-promoting agent which comprises using a polynucleotide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof;
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 16 used in the present invention (hereinafter referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention) are sometimes referred to as cells of human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, pigs, sheep, wedges, pests, monkeys, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells).
  • Nerve cells glial cells, splenic B cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, Immune cells (eg, macrophages, ⁇ cells, ⁇ cells, Vietnameseura / Rekiller cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes Spheres, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors, stem cells or cancer cells of these cells) or Any tissue where cells are present, such as the brain, parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebell
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more amino acid sequence IJ.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1
  • a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferable.
  • Examples of substantially the same activity include fatty acid elongation activity and cell growth promoting activity. Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) identical. Therefore, fatty acid elongation activity, cell growth promoting activity, etc. are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Although it is preferable, the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • Fatty acid elongation activity can be measured according to a method known per se, for example, the method described in The Journal of Cell Biology, pp. 707-717, 2000 or a method analogous thereto. Specifically, (a) an extract of cells into which an expression vector of the protein of the present invention (eg, EL0VL2) has been introduced, (b) a substrate fatty acid, and (c) labeled malol-CoA in an appropriate buffer In the reaction, the labeled fatty acid is extracted from the reaction solution and the amount of the labeled fatty acid is measured, whereby the degree of fatty acid elongation activity of the protein of the present invention (eg, EL0 VL2) can be measured.
  • an expression vector of the protein of the present invention eg, EL0VL2
  • a substrate fatty acid e.g., a substrate fatty acid
  • labeled malol-CoA in an appropriate buffer
  • the labeled fatty acid is extracted from the reaction solution and the amount
  • the cell growth promoting activity can be measured according to a method known per se, for example, a colony formation assay or a method analogous thereto. Specifically, cells into which the expression vector of the protein of the present invention (eg, EL0VL2) is introduced are cultured (eg, cultured in a medium that selects only the introduced cells), and the formed colonies are stained. After measuring the area, the protein of the present invention (eg, EL0VL2) is introduced are cultured (eg, cultured in a medium that selects only the introduced cells), and the formed colonies are stained. After measuring the area, the protein of the present invention (eg, EL0VL2) is introduced are cultured (eg, cultured in a medium that selects only the introduced cells), and the formed colonies are stained. After measuring the area, the protein of the present invention (eg, EL0VL2) is introduced are cultured (eg, cultured in a medium that selects only the introduced cells), and the formed colonies are stained. After measuring the area, the protein of
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 includes about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 Is an amino acid sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 above. And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 is preferred.
  • substantially equivalent activities include, for example, a cell growth promoting activity.
  • Substantially homogenous indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, it is preferable that the cell growth promoting activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times), Quantitative factors such as the degree of this activity and the molecular weight of the protein may vary.
  • the cell growth promoting activity can be measured according to a method known per se, for example, a colony formation assay or a method analogous thereto. Specifically, cells into which the expression vector of the protein of the present invention (eg, STAU2) has been introduced are cultured (eg, cultured in a medium that selects only the introduced cells), and the formed colonies are stained. After that, by measuring the area, the degree of the cell growth promoting activity of the protein of the present invention (eg, STAU2) can be measured.
  • a method known per se for example, a colony formation assay or a method analogous thereto. Specifically, cells into which the expression vector of the protein of the present invention (eg, STAU2) has been introduced are cultured (eg, cultured in a medium that selects only the introduced cells), and the formed colonies are stained. After that, by measuring the area, the degree of the cell growth promoting activity of the protein of the present invention (eg, STAU2) can be measured.
  • Examples of the protein used in the present invention include: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 16 (for example, 1 to 100 amino acids); Degree, preferably about 1 to 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably a number (1 to 5) amino acids deleted, (2) SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: : 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10 and more preferably about 1 to 10 in the amino acid sequence represented by 16) (3) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 16; For example, an amino acid sequence into which about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids have been inserted, (4) 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 16 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) in accordance with the convention of peptide labeling.
  • the proteins used in the present invention include a carboxyl group at the C-terminus (-C00H), a carboxylate (-C00-), Ami de (- C0NH 2) or Esutenore (- C00R) any derconnection also good Rere of.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl
  • C alkyl group such as n- Puchinore, for example, cyclopentyl
  • C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl, C 6 _ 12
  • Ariru groups such as ⁇ - naphthyl, for example, benzyl, phenylene Lou C! _ 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc.
  • ⁇ - Nafuchiru alkyl group of which C 7 _ 1 4 Ararukiru group such as phenethyl, A piperyloxymethyl group or the like is used.
  • the protein used in the present invention has a carboxyl group (or ethoxylate) at a position other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein used in the present invention. It is.
  • the ester in this case for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • an amino group at the N-terminal amino acid residue may have a protecting group (eg, a C ⁇ alkyl group such as a C w alkanol such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group eg, a C ⁇ alkyl group such as a C w alkanol such as a formyl group or an acetyl group.
  • Etc. N-terminal gnoretamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, Intramolecular Substituents (e.g.
  • - 0H, - SH amino group, imidazole group, I Ndoru group, Guanijino group, etc.
  • suitable protecting group e.g., C Micromax Al such as formyl group, Asechi Le group
  • a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, and the like.
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is the partial peptide of the protein used in the present invention described above, and preferably has the same properties as the protein used in the present invention described above. Le, it may be misaligned. For example, at least one of the constituent amino acid sequences of the protein used in the present invention.
  • a peptide having an amino acid sequence of 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more is used.
  • one or more (preferably about 1 to 10 and more preferably (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted.
  • one or more (preferably, about 1 to 20; more preferably, about 1 to 10; more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence May be substituted.
  • the partial peptide used in the present invention C-terminal carboxyl group (- C00H), Karupokishireto (- C0CT), ami de (- C0NH 2) or ester (- C00R) yo les be anything Re in the ,.
  • the partial peptide used in the present invention includes a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, similarly to the protein used in the present invention described above.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ A terminal amino acid residue (eg, methionine residue) whose amino group is protected with a protecting group, ⁇ ⁇
  • the glutamine residue generated by cleavage in vivo is pyroglutamine oxidation
  • those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bonded.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • a salt of a protein or a partial peptide used in the present invention a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, an organic acid) or a base (eg, an alkali metal salt) is used.
  • a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, an organic acid
  • a base eg, an alkali metal salt
  • acid addition salts that are chemically acceptable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Conodic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Conodic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid.
  • the protein or its partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced from the cells or tissues of the above-mentioned human warm-blooded animal by a known protein purification method, or a DNA encoding the protein. Can also be produced by culturing a transformant containing It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human mammalian tissues or cells are homogenized, extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, or the like. Purification and isolation can be achieved by combining chromatography such as chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • lusters include chloromethinole resin, hydroxymethinole luster, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and ⁇ resin. --Hydroxymethylmethylphenylacetamide methyl resin, polyacrylamide And 4- (2 ', 4, dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, and 4- (2,, 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid having an appropriately protected amino group and side chain functional group is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or an amide thereof. Get the body.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HOB t, HOOB t), or the protected amino acid may be preformed as a symmetric anhydride or HOB t ester or HOOB t ester. It can be added to the resin after activation.
  • a racemization inhibitor eg, HOB t, HOOB t
  • the protected amino acid may be preformed as a symmetric anhydride or HOB t ester or HOOB t ester. It can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, ⁇ -methinolepi lipidone, halogenated hydrocarbons such as chloroidene methylene, and chloro lip form
  • Alcohols such as trifluoroethanol, sulfoxides such as dimethyl snolefoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran
  • nitriles such as acetonitrile and propionitrile
  • esters such as methyl acetate and ethyl acetate.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 1 _Z, Br—Z, Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetinole, phthaloynole, honoleminole, 2-2 trophenylenolesnolephenyl, diphenylphosphinothioinole, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propynole, petitnole, t-pentinole, cyclopentinole, cyclohexynole, cycloheptyl, cyclootatyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propynole, petitnole, t-pentinole, cyclopentinole, cyclohexynole, cycloheptyl, cyclootatyl, 2-adamantyl, etc.
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-butoxy benzyl ester, 4-methoxy benzoyl ester, benzoyl ester, benzoyl dolino ester
  • Phenacino oleestenolation penzinoleoxy cycanolevonyl hydrazide, t-butoxycarbinole hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, groups derived from carbonic acid such as lower (C w) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, benzyloxycarbonyl group, and ethoxycarbon group.
  • C w lower alkanol groups
  • aroyl groups such as benzoyl group
  • benzyloxycarbonyl group ethoxycarbon group.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-12,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc. Can be
  • Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active raw ester [alcohol (for example, pentachlorophenol, 2 , 4,5-Trichloromouth phenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, Paranitrophenol, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ -Hydroxysuccinimide, ⁇ -Hydroxyphthalimide, HOB t)] Are used.
  • As the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., or with sodium in liquid ammonia Reduction is also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide (protein) chain is added to the amino group side of the desired chain.
  • the protein or partial peptide from which only the protecting group at the amino terminal at the ⁇ -terminal of the peptide chain has been removed and the protein or partial peptide from which only the protecting group at the carboxyl group at the C-terminal has been removed And mixing these proteins or peptides as described above. Condensate in a medium. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or peptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain an amide of the desired protein or peptide.
  • the desired protein can be obtained in the same manner as the amide of protein or peptide. It is possible to obtain an ester of quality or a peptide.
  • the partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to form the desired peptide. Can be manufactured. Examples of known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following (1) to (5).
  • the partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, 'distillation', column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. .
  • Partial peptides obtained by the above method When is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, the free form or another compound can be converted by a known method or a method analogous thereto Can be converted to a salt.
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell-tissue-derived cDNA, the above-described cell-tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the container may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method reverse transcription polymerase chain reaction (hereinafter, abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell'tissue.
  • Examples of the DNA encoding the protein used in the present invention include: (1) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a highly stringent condition with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 A DNA encoding a protein having a base sequence that hybridizes below and having substantially the same properties as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) SEQ ID NO: 17 Or a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17; Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence to be prepared.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions include, for example, about 50% or more, preferably about 60% with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. Or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably a DNA containing a base sequence having homology of about 95% or more. Are used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by the rooster sequence number: 17 under high stringent conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by the sequence number: 17 and about 50% or more, preferably Is a nucleotide sequence having a homology of about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. DNA or the like is used.
  • No. and hybridization are carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be.
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • No. and isstringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C., preferably about The conditions at 60 to 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2: DNA, sequence The DNA containing the nucleotide sequence represented by No. 3 is, for example, (2) the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 is SEQ ID NO: 17.
  • a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 and a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 are used.
  • the polynucleotide (e.g., DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention.
  • genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cells 'cDNA derived from tissue, the above-mentioned cells' group It may be a cDNA library derived from a tissue or a synthetic DNA.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include, for example, a DNA containing a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: D comprising a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 17 and encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention.
  • DNA containing a part of NA is used.
  • the DNA hybridizable with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 17 has the same significance as described above.
  • the protein of the present invention can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the region or labeled with a synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • DNA base sequence substitution can be performed using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the 0DA-LA PCR method. , Gapped duplex method, Kunkel method and the like, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA has an ATG as a translation initiation codon at its 5, terminal side, and Further, it may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 'end side. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. Can be manufactured.
  • Examples of the vector include plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast Origin plasmids (eg, pSH19, pSH15), pacteriophages such as input phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRcZCMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo and the like are used.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast Origin plasmids eg, pSH19, pSH15
  • pacteriophages such as input
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoter when animal cells are used as host, SR promoter, SV40 promoter, LTR motor, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV (site megaloinoles) promoter, SRct promoter It is preferable to use a tar or the like.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, P L promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., and if the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, SPOL promoter, SP
  • yeast such as ⁇ 2 promoter, penP promoter, etc., PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may further contain, if desired, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like.
  • an enhancer for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as N eo r, G4 1 8 resistance).
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • Amp r ampicillin phosphorus resistant gene
  • N eomycin resistant gene hereinafter sometimes abbreviated as N eo r, G4 1 8 resistance
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc.
  • the host is an yeast cell, the MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and if the host is an animal cell, the insulin signal sequence, one interferon 'signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Available.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escheric hia coli K12. DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research] , 9 volumes, 309 (1981)], JA221 (Journal of Molecular Biology, 120 volumes, 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, 41 volumes, 459 (1969)), C6 00 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus spp. include Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) MI 114 [Gene, 2 255 (1983)], 207—21 [Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (1984)], and the like. Used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH 22 R ⁇ , NA8 7—11 A, DKD— 5D, 20 B— 12. Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris KM71 and the like are used.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of Spodoptera (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), an MGl cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, or an egg derived from egg of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from amestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. If the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx raori N cell; Bm N cell) or the like is used.
  • S cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, J.L., et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells CS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cells). ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, and human FL cells.
  • Transformation of the genus Escherichia can be performed, for example, according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982).
  • Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • the yeast can be transformed according to the method described in, for example, Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, 1929 (1978). Can be.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like.
  • the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids is preferable.
  • a drug such as 3-indoleacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
  • the host, the transformant is cultivated in yeast, the culture medium, for example, Bakuho one Ruda (Burkholder) minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 7 7 Volume 4505 (1 9 80)] and 0. SD medium containing 5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 81 Certificates include 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the culture medium is Gr ace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature), 195, 788 (1962)) is used, which is prepared by appropriately adding a supplementary pulp material such as 10% serum which is immobilized.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4! /. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122 vol., 501 (1952)], a DMEM medium [Virology , 8 volumes, 396 (1959)), RPMI 1640 medium (The Journal of the American Medical Association 199 volumes, 519 (1967)), 19 9 medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 volumes) , 1 (1950)].
  • the pH is about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Methods that use specific affinity methods that use differences in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, and methods that use differences in isoelectric points such as isoelectric focusing .
  • the protein obtained by force When the protein obtained by force is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto. It can be converted to the free form or other salts by the method or a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. Good.
  • An antibody against the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the protein of the present invention in the description of the antibody) uses the protein of the present invention as an antigen, It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody upon administration by itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Warm-blooded animals used include, for example, monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, and mice. , Rats, sheep, goats, and chickens, but mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and included in them.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and included in them.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the PEG (preferably PEG100 to PEG600) power S is added at a concentration of about 10 to 80%, and the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • PEG preferably PEG100 to PEG600
  • Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) to which the protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and the supernatant is added.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme if the cells used for cell fusion are mice, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used
  • protein A the monoclonal antibody bound to the solid phase
  • a monoclonal antibody bound to a solid phase is prepared by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like. And a method for detecting antibody.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • HA T hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • a selection and breeding medium any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the cultivation temperature is usually 20 to 40 ° (preferably about 37 ° C.)
  • the cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody) You can do it.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Absorption / desorption method eg, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against the antibody and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier.
  • any material may be cross-linked at any ratio.
  • ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ psiloglopurine, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 1 hapten to 1 hapten.
  • a method of coupling at a rate of 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde ⁇ carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the dose is usually given about once every 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 1 ⁇ times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Polynucleotide encoding the protein or partial peptide used in the present invention e.g., DNA (hereinafter, in the description of antisense polynucleotides, these DNAs may be abbreviated as DNA of the present invention).
  • An antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of)) or a part thereof is a nucleotide sequence that is incompatible with the base sequence of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention refers to, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • Base sequences having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology are exemplified.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more
  • the antisense polynucleotide having about 95% or more homology is an antisense polynucleotide that directs RNA degradation by RNase H
  • Antisense polynucleotides having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with each other are suitable.
  • an antisense comprising a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 17, or a part thereof
  • the polynucleotide preferably, for example, contains a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 17, or a part thereof.
  • an antisense polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 17, or a part thereof preferably, an antisense polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 17, or a part thereof).
  • An antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense DNA are, for example, phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted by an acid residue.
  • the sugar (deoxylipose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2′-O-methylation, and the base (pyrimidine, purine) may also be chemically modified.
  • an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is designed based on the nucleotide sequence information of the DNA encoding the cloned or determined protein. And can be synthesized.
  • a polynucleotide (nucleic acid) is an RN of the protein gene of the present invention. A that can hybridize with A and inhibit the synthesis or function of the RNA, or regulate and control the expression of the protein gene of the present invention through the interaction with the protein-related RNA of the present invention. be able to.
  • Polynucleotides that are complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention and polynucleotides that can specifically hybridize with the protein-related RNA of the present invention are used in vivo or in vivo. It is useful for regulating and controlling the expression of the protein gene of the present invention outside, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) under the direction derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. ing. 5, terminal hairpin loop, 5, terminal 6—base pair 'repeat, 5, terminal untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3, terminal untranslated region, 3, The terminal palindrome region and the 3 ′ terminal hairpin loop can be selected as preferred target regions, but any region within the protein gene can be selected as the target.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be that the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target is “antisense”.
  • Antisense polynucleotides are polynucleotides containing 2-dexoxy-D-reports, polynucleotides containing D-reports, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or Other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available proteins, nucleic acids or nucleic acid polymers specific to synthetic sequences) or other polymers containing special bonds (provided that the polymer is DNA or RNA) (Including nucleotides having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in the above).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified polynucleotides). Oligonucleotides) and those with known modifications, for example, in the art.
  • modified intramolecular nucleotides e.g., uncharged (E.g., those having a methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate, etc.), those having a charged or sulfur-containing bond (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.),
  • side chain groups such as proteins (nucleases, nucleases' inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides, etc.);
  • chelating compounds eg, For example, those containing metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc., those containing alkylating agents, and those with modified bonds (eg, alpha-an
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy.
  • the antisense nucleic acid is more stable in the cell, the cell permeability of the antisense nucleic acid is greater, the affinity for the target sense strand is greater, and if toxic, the Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It can be given in a stressed form.
  • additional forms include polythiones such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, and S, which enhances the interaction with the cell membrane and increases the uptake of nucleic acids.
  • Hydrophobic substances such as umami (eg, phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferable fats to be added include cholesterol and its derivatives (for example, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached to the 3, 5 'or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or molecular nucleoside linkage.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3, 5 or 5 ends of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. .
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid itself can be applied to cells by various methods known in the art.
  • the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), the protein or partial peptide of the present invention, DNA encoding the peptide (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention), an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), and ⁇ ⁇ ⁇ Antisense polynucleotide of the DNA of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention) The use of will be described.
  • protein A of the present invention a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof is referred to as protein A of the present invention and SEQ ID NO: 16 A protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the represented amino acid sequence may be abbreviated as the protein B of the present invention.
  • the expression of the protein of the present invention increases in cancer tissues, it can be used as a disease marker. That is, it is useful as a marker for early diagnosis in cancer tissues, determination of the severity of symptoms, and prediction of disease progression.
  • the antisense polynucleotide of the present invention has an excellent apoptosis-promoting effect on cancer cells to promote cell death.
  • the antisense polynucleotide of the present invention the compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention, the compound or its salt that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention, or the medicine containing the antibody of the present invention
  • colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, spleen cancer, brain tumor It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for cancer such as ovarian cancer or hematological tumors, and an apoptosis promoter.
  • the expression of the gene of the protein of the present invention is low in normal tissues, screening for a prophylactic / therapeutic agent for cancer with few side effects becomes possible.
  • cancer carrying mutant p53 has a high degree of malignancy, such as poor efficacy of anticancer drugs in clinical practice and poor prognosis.
  • the protein gene of the present invention acts downstream of the mutant p53, and thereby acts as an antisense polynucleotide of a polynucleotide encoding the protein of the present invention, a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention, or a salt thereof.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the above, or an antibody against the protein of the present invention is also effective for cancer with high malignancy.
  • the expression of the protein of the present invention is increased in cancer tissues, and when the activity of the protein of the present invention is inhibited, cancer cells undergo apoptosis. Therefore, the tank of the present invention
  • Compounds or salts thereof that inhibit the activity of protein include, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis
  • It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for cancer such as cancer, thyroid cancer, mucosal cancer, brain tumor, ovarian cancer, and blood tumor.
  • it is a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer, prostate cancer and the like.
  • the compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention can also be used, for example, as an apoptosis promoter.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for screening for a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein A of the present invention (eg, fatty acid elongation activity, cell growth promoting activity, etc.), which comprises using the protein A of the present invention. I do.
  • the activity of the protein A of the present invention eg, fatty acid elongation activity, cell growth promoting activity, etc.
  • a fatty acid elongation activity or a cell growth promoting activity of a cell capable of producing the protein A of the present invention and (i ia) a cell capable of producing the protein A of the present invention
  • a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention which is characterized by comparing the fatty acid elongation activity or the cell growth promoting activity of a mixture of a test compound and a test compound, is used.
  • fatty acid elongation activity can be determined by a method known per se, such as the method described in The Journal of Cell Biotechnology, pp. 707-717, 2000, or Measure and compare according to the equivalent method.
  • Substrate fatty acids include, for example, unsaturated fatty acids (eg, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, eicosatetraenoic acid, arachidonic acid, arachidonyl-coe Nzaim, docosatetraenoic acid, eicosatrienoic acid, meadoic acid, eicosatrienoic acid, eicosatrienoic acid, dihomo-gamma-linolenic acid, tetracosatetraenoic acid, tetracosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, octadecenoic acid, eicosenoic acid , Docosenoic acid, tetracosenoic acid, octadecadienoic acid, eicosaic acid, etc.).
  • unsaturated fatty acids eg, e
  • unsaturated fatty acids having 18 to 24 carbon atoms are used. More preferably, cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic acid (EPA), cis-7, 10, 13, 16, 19-docosapentaenoic acid (DPA), cis-5, 8, 11, 14- eicosatetraenoic acid (Arachidonic acid), Arachinonyl-CoA, cis-7, 10, 13, 16-docosatetraenoic acid, cis-5, 8, 11-eicosatrienoic acid, etc. are used.
  • Labeling agents include, for example, radioisotopes (eg, [3 ⁇ 4], [ 14C ], etc.), fluorescent substances (eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Bio Science Co., Ltd.), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc.).
  • radioisotopes eg, [3 ⁇ 4], [ 14C ], etc.
  • fluorescent substances eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Bio Science Co., Ltd.), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc.).
  • the measurement of the label amount may be performed by a known method.
  • Fatty acid elongation activity reaction solution containing substrate fatty acid [50mM phosphorylation power / sodium hydroxide (pH 6.5), 5 ⁇ rotenone (Wako Pure Chemical), ⁇ CoA (Wako Pure Chemical), ImM ATP, ImM NADPH, ImM Magnesium chloride]. Dispense this reaction solution into 96-well plates and incubate at 37 ° C for 1 minute. Thereafter, a test compound was added as an enzyme source to a cell extract from an animal cell (eg, CH0 cell) strain that highly expresses the protein A of the present invention (eg, EL0VL2). Incubate for minutes.
  • an animal cell eg, CH0 cell
  • EL0VL2 highly expresses the protein A of the present invention
  • the radioactivity (eg, 14 C) of the labeled (free) fatty acid is measured. Test compounds and 100 the activity when no added Caro, obtains 50% inhibitory concentration (IC 5. Value), lower IC 5.
  • the compound that gives the value is the activity of the protein A of the present invention (eg, EL0VL2) (eg, fatty acid (Prolonging activity).
  • the cell growth promoting activity is measured according to a method known per se, for example, a colony formation assay or a method analogous thereto, and compared.
  • culturing cells into which the expression vector of the protein A of the present invention has been introduced eg, culturing in a medium that selects only the introduced cells
  • forming the formed cells and when stained e.g. the culture cells and a test compound the expression vector is introduced protein a of the invention was (eg, medium in culture so as to select only transfected cells), formed colonies Measure and compare the area with that stained.
  • a host transformed with a vector containing the DNA encoding the protein A of the present invention described above is used.
  • animal cells such as COS 7 cells, CHO cells, HEK293 cells, and MCF-7 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein A of the present invention is expressed in a cell by culturing by the method described above is preferably used.
  • the method of culturing cells capable of expressing the protein A of the present invention is the same as the above-described method of culturing the transformant of the present invention.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the fatty acid elongation activity or the cell growth promoting activity in the case of the above (iia) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, compared with the case of the above (ia).
  • a test compound that inhibits at least% can be selected as a compound that inhibits the activity of protein A of the present invention.
  • the compound having an activity of inhibiting the activity of the protein A of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, It is a compound selected from synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the present invention also provides a method for screening for a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein B of the present invention (for example, a cell growth promoting activity or the like), characterized by using the protein B of the present invention.
  • a cell growth promoting activity of a cell capable of producing the protein B of the present invention and (iib) a cell capable of producing the protein B of the present invention and a test compound A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of protein B of the present invention, which is characterized by comparing with the cell growth promoting activity of the mixture of the above, is used.
  • the cell growth promoting activity is measured according to a method known per se, for example, a colony formation assay or a method analogous thereto, and compared.
  • cells into which the protein B expression vector of the present invention has been introduced are cultured (eg, cultured in a medium that selects only the introduced cells), and the formed colonies are stained.
  • culturing the cells and the test compound into which the protein B expression vector of the present invention has been introduced eg, culturing in a medium that selects only the introduced cells
  • staining the formed colonies Measure and compare the area with the case.
  • a host (transformant) transformed with the aforementioned vector containing DNA encoding the protein B of the present invention is used.
  • the host for example, animal cells such as COS 7 cells, CH ⁇ cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein B of the present invention is expressed on a cell membrane and in a cell by culturing by the method described above is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein B of the present invention is the same as the above-described method for culturing the transformant of the present invention.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, Synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • a test in which the cell growth promoting activity in the case of the above (i ib) is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of the above (ib) Compounds can be selected as compounds that inhibit the activity of protein B of the present invention.
  • the compound having an activity of inhibiting the activity of the protein B of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, It is a compound selected from animal tissue extract, plasma, etc.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • compounds that inhibit the expression of the gene of the protein of the present invention or salts thereof for example, breast cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus ⁇ , used as a prophylactic / therapeutic agent for cancers such as stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood tumor can do.
  • it is a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer, prostate cancer and the like.
  • the compound or its salt that inhibits the expression of the gene encoding the protein of the present invention can also be used, for example, as an apoptosis promoter.
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention.
  • the screening method includes (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention, and (iv) culturing cells capable of producing the protein used in the present invention in the presence of the test compound. There is a screening method characterized by performing comparison with the case.
  • the expression level of the gene Specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein is measured and compared.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
  • the amount of the protein can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like by a method such as Western analysis, ELISA method or the like.
  • the amount of mRNA that can be measured according to the method can be measured by a known method, for example, Northern hybridization using a nucleic acid containing a probe number 2 or a part thereof as a probe, or a sequence as a primer. It can be measured according to a PCR method using a nucleic acid containing No. 2 or a part thereof or a method analogous thereto.
  • the compound can be selected as a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • the screening kit of the present invention contains a protein or a partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, and plants.
  • a compound or a salt thereof that inhibits expression of the gene of the protein of the present invention are examples of the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • Compounds or salts thereof that inhibit the expression of protein genes include, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer , Testis cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain cancer, ovarian cancer or hematological cancer and other cancer prevention and treatment agents (preferably, breast cancer, prostate cancer and other prophylaxis and treatment agents) or as an apoptosis promoter, It is useful as a drug with extremely few side effects.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, intraarticular. Dosage forms such as agents.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used, and suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, It may be used in combination with propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant [eg, Positive Solvent 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50raol) adduct of hydrogenated castor oil)], and the like.
  • suitable solubilizing agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, It may be used in combination with propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant [eg, Positive Solvent 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50raol) adduct of hydrogenated castor oil)], and the like.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate,
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit forms to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, especially for injections. It is preferred that the compound contains 5 to 100 mg, and 10 to 25 Omg of the above compound in other dosage forms.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above compound.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans or warm-blooded animals (eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, monkeys). , Chimpanzees, etc.) orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, monkeys.
  • Chimpanzees, etc. orally or parenterally.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating breast cancer When the compound is orally administered, generally in adults (with a body weight of 6 O kg), the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably About 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound or a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating breast cancer is administered to an adult (with a body weight of 6 O kg) usually in the form of an injection
  • the compound or a salt thereof is about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0. It is convenient to administer by injection about ⁇ 20 mg, more preferably about 0:! ⁇ 1 Omg to the cancerous lesion. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the above compound can be used in combination with an existing anticancer agent, and the side effect of the anticancer agent on normal cells is reduced.
  • the timing of administration is not limited, and they may be administered to the subject at the same time, or may be administered with a time lag.
  • the dose can be selected appropriately based on the clinically used dose. it can.
  • the compounding ratio of the compound to the anticancer agent can be appropriately selected depending on the administration subject, administration route, target disease, symptom, combination, and the like.
  • Existing anticancer agents include, for example, chemotherapeutic agents, hormonal therapies, immunotherapeutics, and the like.
  • Chemotherapeutic agents include, for example, alkylating agents (eg, cyclophosphamide, diphosphamide, dimustine, lanimustine, carbone, etc.), antimetabolites (eg, methotrexet, 5-funolene radicinole, tegafur, carmofur) , UFT, doxyfluridine, cytarabine, enositabine, mercaptopurine, mercaptoprin riboside, thioguanine, etc.), anticancer antibiotics (eg, mitomycin, adriamycin, dau norebicin, epi ⁇ "bicine, pyranolevicin, idanomycin, thyromycin, bleomycin, bleomycin, bleomycin, bleomycin, thyromycin, bleomycin ), Plant-derived anticancer agents (e.g., vincristine, vinblastine, vindesine, etop
  • Hormonal therapies include, for example, corticosteroids (eg, prednisolone, prednisone, dexamethasone, cortisone acetate, etc.), estrogen drugs (eg, estoradionele, ethininolestradiol, phosphestroneole, cloguchi trianisen, etc.) , Anti-estrogen drugs (eg, epithiostanol, mepithiostan, tamoxifen, clomiphene, etc.), luteinizing hormone drugs (eg, hydroxyprogesterone dyprogestate, dydrogesterone, medroxyprogesterone, norethisterone, norletindrone, etc.), LHRH derivatives (Eg, leuprorelin acetate, etc.).
  • corticosteroids eg, prednisolone, prednisone, dexamethasone, cortisone acetate,
  • immunotherapeutic agent examples include microorganisms or bacterial components (eg, muramyl dipeptide derivative, picibanil, etc.), polysaccharides having immunopotentiating activity (eg, lentinan, schizophyllan, krestin, etc.), and gene engineering techniques.
  • Obtained site force in eg, interferon, interleukin 2 (IL-2), interleukin 12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), etc.
  • colony stimulating factor eg, granulocyte colony Stimulating factors, erythropoietin, etc.
  • Antibody to the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention)
  • the antibody of the present invention is allowed to react competitively with a test solution and a labeled protein of the present invention, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution comprising:
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which is characterized by measuring the activity.
  • one of the antibodies recognizes the N-terminal of the protein of the present invention.
  • the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter, sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • a monoclonal antibody against the protein of the present invention hereinafter, sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention
  • the body molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or the Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution.
  • Any measurement method may be used as long as the measurement is performed by detecting the amount of the body by chemical or physical means and calculating it from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephelometry, the competitive method, the I beam drink trick method Contact Yopi sandwich method are preferably used, in terms of sensitivity and specificity I 1 production, especially preferable to use a Sanditsuchi method described below.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [125 1], [131 1], [], are used like [14 c].
  • a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • 8-galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, norreciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding an antigen to a labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary and secondary reactions may be performed in the reverse order, simultaneously, or at different times. Is also good.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds. . That is, if the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction will be Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, such as the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method or a nephelometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen compete with the antibody.
  • the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (BZF separation), and the amount of B or F labeling is measured. Quantify the amount of antigen in.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody and a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • An immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and written documents.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus Cancers such as cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, S spleen cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood tumor (preferably breast cancer, prostate Cancer, etc.) or are likely to be affected in the future.
  • colon cancer such as cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, S spleen cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood tumor (preferably breast cancer, prostate Cancer, etc.) or are likely to be affected in the future.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • a subject such as a body fluid or a tissue.
  • detection of the protein of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, and the like. use can do.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys, (A chimpanzee or the like) can detect abnormalities (DNA abnormalities) in the DNA or mRNA that encodes the protein of the present invention or its partial peptide. Mutations that are mutated are useful as diagnostic agents for gene expression such as decreased expression, addition or overexpression of the DNA or mRNA.
  • warm-blooded animals e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys, (A chimpanzee or the like
  • Mutations that are mutated are useful as diagnostic agents for gene expression such as decreased expression, addition or overexpression of the DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)). Proceedings of the Nations ⁇ Academy of Sciences of the United States of America, 3 ⁇ 486, pages 2766-2770 (Proceedings of the Nations ⁇ Academy of Sciences of the United States of America) 1989)).
  • PCR-SSCP method for example, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer , Stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, 8 splenic cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood cancer (preferably breast cancer, prostate cancer) Etc.) can be diagnosed.
  • a drug containing an antisense polynucleotide for example, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer , Stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, 8 splenic cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood cancer (preferably breast cancer, prostate cancer) Etc.
  • the antisense polynucleotide of the present invention which complementarily binds to the DNA of the present invention and can suppress the expression of the DNA; Because it can suppress the metastasis (eg, fatty acid elongation activity, cell growth promotion activity, etc.), for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer.
  • metastasis eg, fatty acid elongation activity, cell growth promotion activity, etc.
  • cancers e.ophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood tumor Can be used.
  • the antisense polynucleotide of the present invention promotes apoptosis of cancer cells, and thus can be used, for example, as an apoptosis promoter.
  • the above antisense polynucleotide When used as the above preventive / therapeutic agent or promoter, it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • the antisense polynucleotide is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus vector, and then inserted into a human or a human according to a conventional method.
  • it can be administered orally or parenterally to mammals (eg, rats, rabbits, sheep, sheep, pigs, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as a scavenger to promote ingestion, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • the antisense polynucleotide was converted into an IJ (injection), alone or together with a carrier such as ribosome, to give an intravenous solution. It may be administered subcutaneously.
  • the dose of the antisense polynucleotide may vary more depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, etc. ⁇ : For example, when the antisense polynucleotide of the present invention is administered for the purpose of treating breast cancer, a general dose is generally used. In adults (body weight 6 O kg), the antisense polynucleotide is administered at about 0.1 to 10 O mg per day. Furthermore, the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention a lipozyme containing one of the RNAs encoding the protein of the present invention [5], etc. It can suppress the expression of the gene of the present invention.
  • the double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • Ribozymes can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, p. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of the RNA encoding the protein of the present invention. As a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme, can be mentioned.
  • the antibodies of the present invention include, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, visceral cancer, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent (eg, vaccine, etc.) for cancer such as brain tumor, ovarian cancer or hematological tumor. Preferred are preventive and therapeutic agents for breast cancer, prostate cancer and the like. Further, the antibody of the present invention can be used, for example, as an apoptosis promoter.
  • the antibodies of the present invention may be administered as such or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, vaccines, etc. are used.
  • Injections are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, etc. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • Injection preparations can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid used for usual injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing budose sugar and other auxiliary agents and the like are used, and suitable solubilizing agents such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol ( For example, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant [eg, polysorbate 80, HC0-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct oi hydrogenatea castor oil)], etc.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol for example, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate 80, HC0-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct oi hydrogenatea castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms such as tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), Syrups, emulsions, suspensions and the like can be mentioned.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation.
  • carriers and excipients for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above-mentioned parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to match the dosage of the active ingredient.
  • Such a dosage unit dosage form examples thereof include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the antibody content is usually about 5 to 50 mg per dosage unit dosage form, especially about 5 to 100 mg for injections, and about 10 to 250 mg for other dosage forms. preferable.
  • the dosage of the above-mentioned prophylactic / therapeutic agents and modulators containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, the target disease, the symptoms, the administration route, and the like.For example, it is used for the prevention and treatment of adult breast cancer. If necessary, use the antibody of the present invention as a single dose, usually 0.01
  • Omg / kg body weight preferably about 0.1 to 1 Omg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably 1 to 1 day. It is convenient to administer by intravenous injection about three times. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased depending on the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered by itself or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the present invention includes “a prophylactic / therapeutic agent for cancer comprising a compound having an ELOVL 2 activity inhibitory activity or a salt thereof” and a “compound having an ELOVL 2 expression inhibitory activity or a salt thereof”.
  • the “compound having an activity of inhibiting EL ⁇ VL2” may be any compound having an activity of inhibiting ELOVL2, such as colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, and liver cancer. , Biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood tumor and other cancer prevention and treatment agents (preferably, breast cancer, prostate cancer, etc.) It is used as a prophylactic / therapeutic agent) and an apoptosis promoter.
  • the “compound having an ELOVL 2 expression inhibitory action” may be any compound as long as it has an ELOVL 2 expression inhibitory action, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract Prevention and treatment of cancer such as cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, renal cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood tumor (preferably, prevention of breast cancer, prostate cancer, etc.) ⁇ Therapeutic agent), used as an apoptosis promoter.
  • the prophylactic / therapeutic agent and the promoting agent are produced in the same manner as described above.
  • a compound for preventing or treating cancer comprising a compound having an activity inhibiting activity of Staufen homolog 2 or a salt thereof according to the present invention and a compound or a salt thereof having an activity for inhibiting the expression of Staufen horaolog 2
  • the "compound having an activity inhibiting activity of rstaufen hohiolog 2" may be any compound as long as it is a compound having an activity inhibiting activity of Staufen homolog 2; for example, colorectal cancer, breast cancer , Lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain cancer, ovarian cancer or blood tumor It is used as a prophylactic and therapeutic agent and apoptosis promoter.
  • the ⁇ compound having an inhibitory action on the expression of rstaufen homolog 2 '' may be any compound having an inhibitory action on the expression of Staufen homolog 2, such as colon cancer, breast cancer, cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, It is used as a prophylactic / therapeutic agent for cancer such as biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood tumor, and as an apoptosis promoter.
  • Staufen homolog 2 '' may be any compound having an inhibitory action on the expression of Staufen homolog 2, such as colon cancer, breast cancer, cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, It is used as a prophylactic / therapeutic agent for cancer such as biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer,
  • the prophylactic / therapeutic agent and the promoting agent are produced in the same manner as described above.
  • the present invention has a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DN thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DN thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal is provided.
  • the non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof includes an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm, and a progenitor cell thereof.
  • the DNA transgenic animal of the present invention includes an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm, and a progenitor cell thereof.
  • For germ cells and the like preferably at the stage of embryo development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized egg cells and generally before the 8-cell stage), calcium phosphate method, electric pulse It can be produced by transferring the target DNA by the method, ribofusion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • the DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • non-human mammals for example, porcupines, pigs, higgs, goats, magpies, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • rodents and biological cycles are relatively short in terms of the creation of disease animal model systems, and rodents that are easy to breed, especially mice (for example, pure strains such as C57BLZ6 strain, DBA2 strain, etc.
  • mice for example, pure strains such as C57BLZ6 strain, DBA2 strain, etc.
  • crossing strain a B6C3F strain, a BDFi strain, a B6D2Fi strain, a BALBZc strain, an ICR strain, etc.
  • a rat eg, Wistar, SD, etc.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
  • DNA having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of base, deletion, substitution with another base, etc. DNA that has been used is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA refers to a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • a promoter capable of being expressed in animal cells For example, when transferring the human DNA of the present invention, the homology is high!
  • Various mammals having the DNA of the present invention eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice
  • Microinjection of a DNA construct eg, a vector, etc.
  • a DNA construct eg, a vector, etc.
  • the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing derived DNA into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include plasmid derived from Escherichia coli, plasmid derived from Bacillus subtilis, plasmid derived from yeast, batteriophage such as phage ⁇ , retrovirus such as Moroni leukemia virus, vaccinia virus or vaccinia virus. Animal viruses such as baculovirus are used. Of these, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoter that regulates the DNA expression examples include: (1) a promoter of DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) , (2) promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), such as anolebumin, insulin II, peroplaskin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine Kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor] 3, keratin K1, 1:10 and 1 ⁇ 14, collagen I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase] 3 I subunit, dystroph Down, tartrate-resistant alkaline phosphatase Ichize, atrial diisocyana
  • the 1a (EF-1a) promoter, human and chicken j3 actin promoter, and the like are preferred.
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the messenger RNA of interest in the DNA-transferred mammal (generally called terminator).
  • terminator a sequence that terminates the transcription of the messenger RNA of interest in the DNA-transferred mammal.
  • a sequence can be used, and preferably, SV40-taminator of simian virus or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. should be added 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, in order to further express the target foreign DNA. It is also possible to link 3 ′ downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention may be selected from human or various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), monkeys, kidneys, thyroid cells, fibroblasts Acquisition of all or part of genomic DNA from cell-derived DNA and various commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, and fibroblast-derived RNA as raw materials You can do it.
  • exogenous abnormal DNA changes the translation region of the normal protein obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis. Different translation regions can be created.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after the DNA transfer means that the progeny of the transgenic animal expresses the exogenous DNA of the present invention to all of its germ cells and somatic cells. Means to keep.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and can be subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after transfer of the DNA indicates that all the offspring of the animal produce the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. It means having extra. 0 that inherits the exogenous DNA
  • the offspring of the animal present invention having an excess of foreign "raw DNA of the present invention in all germ and somatic cells
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately promoted by promoting the function of endogenous normal DNA. It can develop hypertension and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention and the disease associated with the protein of the present invention, and study the treatment method for these diseases. It is possible to do.
  • a preventive / therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention such as colon cancer , Breast, Lung, Prostate, Esophageal, Gastric, Liver, Biliary, Spleen, Kidney, Bladder, Uterine, Testis, Thyroid, Knee, Brain, Ovarian or Hematological It can also be used in the screening test for cancer prevention and treatment of cancer.
  • a non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably maintained by mating. I can do it. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of the DNA means that the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is finally impaired by inhibiting the function of endogenous normal DNA. It may be active refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention (dominant negative action) in the inactive refractory disease of the protein of the present invention. ) Is a model for elucidating.
  • the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred is the released protein of the present invention.
  • a prophylactic / therapeutic agent for the protein or function-inactive refractory of the present invention for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, It can also be used in screening tests for the prevention and treatment of cancer such as spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, ovarian cancer, and blood tumor.
  • each organ is taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after Itoda cutting, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells by using a protease such as trypsin. It is possible.
  • the protein of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism can be examined, and its abnormality can be examined. It is an effective research material for elucidation.
  • the functional inactivity of the protein of the present invention In order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including type refractory disease, an effective and prompt screening of the therapeutic agent for the disease is carried out using the above-mentioned test method and quantitative method. Law can be provided. Also, using the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, an Escherichia coli-derived; S-galactosidase gene), and the reporter gene can be expressed under the control of the promoter for DN DN of the present invention.
  • a reporter gene eg, an Escherichia coli-derived; S-galactosidase gene
  • the non-human mammal embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the expression of the DNA, or Activity of the protein of the present invention encoded by the DNA To substantially eliminate the expression of the protein of the present invention (hereinafter, sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter, referred to as knockout DNA of the present invention
  • ES cell Abbreviated as ES cell
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by the target non-human mammal is isolated, and the exon portion thereof has a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or 1acZ (j8-galactosidase).
  • a DNA sequence (hereinafter, abbreviated as a targeting vector) having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination.
  • the DNA sequence on or near the DNA of the invention as a probe was used as a primer, and the DNA sequence on the targeting vector and the DNA sequence in a nearby region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector were used as primers. It can be obtained by analyzing by the PCR method and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or the methods described in the known methods of Evans and Kaufman may be used. A newly established one may be used.
  • mouse E Currently, in the case of S cells, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, a pure line alternative to this has a clear immunological genetic background.
  • the BDF emaus (C57BLZ6 and DBAZ2) BDFi mice can be used satisfactorily as well.
  • the BDFi mice have the advantage of being able to collect a large number of eggs and being robust, and have a background of C57BL / 6 mice.
  • the ES cells obtained by using the method can be advantageously used in that, when a disease model mouse is produced, the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by back-crossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used.However, it is more efficient to collect embryos at the 8-cell stage and culture them until blastocysts are used. Many early embryos can be obtained.
  • Either male or female ES cells may be used, but male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • the primary selection of ES cells in the early stage can be performed by gender discrimination, and by enabling the selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be greatly reduced.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good growth potential, It is necessary to carefully cultivate the subculture as it is easy to lose the ability to live.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, Cultured at about 37 ° C with about 30% CO2, 90% air
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5raM EDTA, preferably Can be made into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / ImM EDTA
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be cultured in monolayers at high densities or in suspension cultures to form cell clumps under appropriate conditions to produce various types of cells such as parietal, visceral, and cardiac muscles.
  • MJ Evans and MH Kaufra an Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634, 1981; TC Doetschman Journal of 'Ob' Embryology 'and' Experimentanole Monoreflology, Vol. 87, p. 27, 1985
  • Vesicles are useful in cell biology studies of the proteins of the invention in vitro.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression levels.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be obtained, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and inactivating the targeting vector to inactivate the DNA of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be knocked out by causing the homologous recombination of the modified DNA sequence to replace the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out may be on or near the DNA of the present invention.
  • Primers were used for Southern hybridization analysis or DNA sequencing on the targeting vector using the DNA sequence on the side as a probe, and the DNA sequence of the mouse-derived neighboring region other than the DNA of the present invention used in the targeting vector. It can be determined by analysis using the PCR method.
  • a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated is cloned by homologous recombination, and the cell is cloned at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like.
  • the individual thus obtained is usually an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention, and the offspring of the present invention are obtained from their offspring. An individual lacking homo-expression of the protein can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg cell by a microinjection method. Compared to non-human mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where one normal individual and plural homozygous animals are obtained. Heterozygous animal By crossing males and females, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated are very useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a preventive / therapeutic effect against a disease caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, and observing and measuring a change in the animal.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a preventive / therapeutic effect on a disease caused by the disease for example, cancer.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and tested using changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal as indices.
  • Compounds can be tested for their prophylactic and therapeutic effects.
  • Methods for treating a test animal with a test compound include, for example, oral administration, intravenous injection, and the like.
  • Can be The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and the incidence of cancer and the test compound non-administered group. Les, no! /, And the degree of cure of cancer! Observe the difference in / over time with the above tissue.
  • the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a prophylactic or therapeutic effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a preventive / therapeutic effect against a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a safe and low toxic prophylactic and therapeutic agent. Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can be used similarly.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkalis). And the like, for example, metals), and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, etc.). To dogs, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound when the compound is orally administered, generally, adult (assuming a body weight of 60 kg) breast cancer
  • the single dose of the compound varies depending on the administration target, target disease, etc., for example, the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (with a body weight of 60 kg) of a breast cancer patient.
  • the dose can be administered in terms of the body weight of 6 O kg.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention, and detects or inhibits the expression of a reporter gene.
  • a method for screening a compound or a salt thereof is provided.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, wherein the DNA of the present invention is inactive by introducing a reporter gene.
  • a reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the reporter gene the same one as described above is used, and a ⁇ -galactosidase gene (1 acZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene supports the promoter of the DNA of the present invention. Since it exists under the control of the promoter, the activity of the promoter can be detected by tracing the expression of the substance encoded by the reporter gene.
  • a tissue expressing the protein of the present invention originally -Galatatosidase is expressed instead of the protein of the invention. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate for 0-galactosidase, such as 5-promo 4-chloro-3-indolyl-
  • a reagent that is a substrate for 0-galactosidase such as 5-promo 4-chloro-3-indolyl-
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline overnight (PBS), and then stained with X_ga1 at room temperature or at room temperature. After reacting for about 30 minutes to 1 hour at around 37 ° C, the / 3-galactosidase reaction is stopped by washing the tissue sample with 1 mM EDTA / PBS solution, and the color is observed. Good. Further, mRNA encoding 1acZ may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity against DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, Alkali metal And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids
  • bases eg, Alkali metal And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Compounds which inhibit the promoter-one activity of the DNA of the present invention or salts thereof, such as salts with conodic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • salts can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for cancers such as spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, brain tumor, ovarian cancer, and blood tumor.
  • cancers such as spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, brain tumor, ovarian cancer, and blood tumor.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA when administered, generally the adult In breast cancer patients weighing 6 O kg, the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 O mg, more preferably about 1.0 to 2 O mg per day.
  • the single dose of the compound when administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound of the present invention that inhibits the activity of the promoter against DNA may be in the form of an injection.
  • the compound when administered to an adult (as 60 kg) breast cancer patient, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 2 Omg per day. It is convenient to administer about 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter of the DNA of the present invention.
  • Investigating or preventing the causes of various diseases caused by insufficient expression of DNA can greatly contribute to the development of therapeutic agents.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene transfer). Animal), it is possible to specifically synthesize the protein and examine its effects in the living body. . Furthermore, by linking an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line in which this is expressed, a low-molecular-weight molecule having the action of specifically promoting or suppressing the ability of the protein itself of the present invention to produce in the body can be obtained. Can be used as a search system for compounds.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DNA containing the full length gene encoding ELOVL2.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Examples 4 and 5.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Examples 4 and 5.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DNA containing the full-length gene encoding STAU2.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 11.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 12.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 13.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 13.
  • Example 14 shows the base sequence of a control oligonucleotide used in Example 13.
  • Example Example 1 Example Example 1
  • Fold-side and reverse-side primers (SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5) in which the 524th base counted from A of the translation initiation codon ATG of wild-type p53 was replaced with G to A were prepared.
  • Wild-type p53 (WTp53) (Genbank Accession No. AF136270) was incorporated into the BamHI-EcoRI site of pcDNA3.1 vector (Invitrogen) to obtain pcDNA3.1-WTp53 vector.
  • the QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGEN
  • the mutant p53 (MTp53) gene was prepared using E). The method followed the attached protocol.
  • the transfected cell lines H1299-MTp53, H1299-WTp53, and H1299-CAT with the respective genes were selected by using geneticin (GIBC0 BRL) and Zeosin (Invitrogen). These stable expression strains of H1299-MTp53 and H1299-WTp53 were tested using an anti-p53 antibody (Oncogene) to confirm that the addition of 5 ⁇ M Muristerone A (Invitrogen) induced the expression of MTp53 and WTp53, respectively. Confirmed by Western blotting method.
  • H1299- Mt P 53 (48hr ) H1299 cells which induce the expression of H1299 cells
  • CAT which induced the expression of the wild-type p53
  • H1299- EL0VL2 gene was found as a gene with increased expression compared to Wtp53 (48 hr) and H1299-CAT (48 hr). The expression level of this gene was below the detection limit in normal tissues other than the brain and testis (Table 2).
  • Genbank Marauder Two types of primers (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9) were prepared based on the sequence of the EL0VL2 gene described in 017770, and 5 ⁇ M Muristerone was generated using pyrobest DNA polym erase (Takara Shuzo). PCR was performed using the cDNA prepared from H1299-MTp53 to which A was added as type III to obtain a DNA fragment. This gene fragment, pCDNA3.1 (+) plasmid (Invitrogen), is digested with restriction enzymes EcoRV and Notl, and ligated using TaKaRa Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo).
  • human breast cancer cell lines MCF7 (ATCC), a human lung cancer cell line H1299 and (ATCC) 1. seeded lxlO five pieces, after Ichi ⁇ culture, according flop port tocol attached using FuGene6 (Roche), The pCDNA3.1 (+)-EL0VL2 and pCDNA3.1 (l) _LacZ (Invitrogen) obtained above were introduced. After the cultivation, the culture was cultivated for 6 days with dieteticin (Invitrogen) added to the medium. Thereafter, the cells were replated on a 6 cm Petri dish, and the cells were further cultured in a medium supplemented with geneticin for 3 weeks.
  • dieteticin Invitrogen
  • the cells were fixed in a 10% neutral formalin solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature for 30 minutes and washed with PBS. The cells were then stained with a crystal violet (SIGMA) solution (10% crystal violet dissolved in ethanol and diluted 100-fold with PBS) at room temperature for 2 hours. And air-dried. The area of the stained cells was measured with the ImagPro application (Media Cybernetics).
  • SIGMA crystal violet
  • Oligonucleotides using breast cancer cell line MCF7 (Dainippon Pharmaceutical) as test cells The day before transfection, 1.5 ⁇ 10 4 cells were seeded on a 24-well plate (Falcon). OligofectAMINE (Invitrogen) was used for oligonucleotide introduction, and the protocol was followed. Twenty hours after transfection, the RNA was released according to the protocol of the RNeasy mini kit (Qiagen) and cDNA was prepared using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystem).
  • the expression level of the EL0VL2 gene was corrected, and TaqMan human ⁇ -actin control reagent (Applied Biosystem) for correction PCR was performed according to the ABI7700 (Applied Biosystem) manual, assuming that the expression amount of 3actin was observed.
  • the reaction mixture in the reaction was composed of SYBR PCR Master Mix (Applied Biosystem) at 7.5 ⁇ l, and the cDNA template prepared above was tripled with sterile distilled water.
  • Example 3 Five lxlO 5 human breast cancer cell lines MCF-7 (ATCC) were seeded on a 6-well plate. After cultivation, the pcDNA3.1 (+)-EL0VL obtained in Example 3 was obtained using FuGene6 (Roche). 2 was introduced. -After the culture, dieneticin (Invitrogen) was added to the medium and cultured for 3 days. Thereafter, the cells were collected, diluted, replated on 15 96-well plates, and the medium was replaced every three days. After 15 days, a 96-cell line forming a single colony was re-inoculated on a 24-well plate in 2 l-wells and cultured for 6 days.
  • Dieneticin Invitrogen
  • the composition of the reaction solution was 7.5 ⁇ l of SYBR PCR Master Mix (Applied Biosystem), and the cDNA template prepared above was diluted three-fold with sterile distilled water. Then, 5 ⁇ 1 and two kinds of primers (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13) were added to each to give a solution volume of 15 / l. In the PCR reaction, a cycle of 50 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 10 minutes, 95 ° C for 15 seconds, and 60 ° C for 1 minute was repeated 40 times. The expression level of the EL0VL2 gene was corrected for the expression level of actin for comparison.
  • MCF7-EL0VL2-C2 two cell lines showing high expression of EL0VL2 26 times and 34 times as high as those of the MCF-7 cell line were selected and named MCF7-EL0VL2-C2 and MCF7-EL0VL2-C12, respectively.
  • MCF7-EL0VL2_C2, MCF7-EL0VL2-C12, and MCF-7 cells prepared in Example 5 (1) were seeded on a 96-well plate by two lxlO cells. One and seven days later, the number of viable cells was counted using Cell Coating Kit-8 (Dojindo) according to the attached protocol. As a result, it was confirmed that the cell growth rate of MCF7-EL0VL2-C2 and MCF7-EL0VL2-C12 cells was 3.1 and 2.3 times higher than that of MCF-7 cells, respectively.
  • D-MEM medium (invitrogen) Powder was dissolved in sterilized water at a concentration twice as high as usual to prepare 2 XD-MEM medium. To this, an equal volume of 1.2% agarose (BMA) solution was added to prepare a final concentration of 0.6% agarose / 1XD-MEM medium. A 0.6% agar medium was prepared.
  • MCF7-EL0VL2-C2 prepared in the above Example 5 (1), MCF7- EL0VL2- the C12 Oyopi MCF7 cells 1.
  • the MCF7-EL0VL2-C2, MCF7-EL0VL2-C12, and MCF-7 cells prepared in Example 5 (1) were seeded on a 10 cm petri dish at 5 ⁇ 10 5 cells each. After 4 ⁇ culture, remove the medium, remove the medium, and use a Complete Inhibitor (Protein Inhibitor), one tablet per 20 ml of Complete Mini (Roche), and a Phosphatase Inhibitor, a 1/1000 amount of PHOSPHATASE INHIBITOR COCKTAIL II (S IGMA) in RIPA buffer (50 mM).
  • a Complete Inhibitor Protein Inhibitor
  • one tablet per 20 ml of Complete Mini Roche
  • Phosphatase Inhibitor a 1/1000 amount of PHOSPHATASE INHIBITOR COCKTAIL II (S IGMA) in RIPA buffer (50 mM).
  • Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton-100, 0 • 1% SDS, 1% Deoxycholic acid) were added at 200/1 each, the cells were removed, and the cells were placed in a 1.5 ml Etpen tube. This was incubated at 4 ° C for 30 minutes while gently rotating, and then centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant. A portion was taken from the supernatant, and the protein content was measured using the BCA Protein Assay Kit (PIERCE) according to the attached protocol. To the remaining supernatant was added Lae lili Sample Buffer (BI0-RAD) and incubated at 95 ° C for 3 minutes.
  • PIERCE BCA Protein Assay Kit
  • Two kinds of primers were designed (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15), and a PCR reaction was performed using ExTaq (Takara Shuzo) using pcDNA3.1-EL0VL2 obtained in Example 3 as a template. After 1 minute at 94 ° C, the reaction was repeated 31 times at 94 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute and 30 seconds.
  • the resulting amplification product was digested with Xbal and EcoRI, inserted into the plasmid vector p3xFLAG-CMV10 (SIGMA) digested with the same enzyme using TaKaRa Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo), and the plasmid vector p3xFLAG10-EL0VL2 was inserted. Obtained.
  • the CH0-EL0VL2 cells prepared in (1) above were suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, ImM EDTA, 20% glycerol) containing 1 tablet of Complete Mini (Roche) per 20 ml as a protease inhibitor. Crush cells with sonication The mixture was centrifuged at 600 ° C. for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a supernatant. This cell extract was used as an enzyme source.
  • Fatty acid elongation activity reaction solution containing 100 ⁇ M 5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic acid as substrate fatty acid [50m phosphorylation power rim / sodium hydroxide (pH 6.5), 5 / M mouth tenone by Wako pure Chemical), 100 ⁇ CoA (Wako pure Chemical), ImM ATP, ImM NADPH, ImM magnesium chloride, ⁇ 185kBq [2 - 14 C ] - Malo - adjust Le CoA (Amersham Bioscience, Inc.)]
  • the reaction solution 90 ⁇ was dispensed into a 96-well plate and incubated at 37 ° C for 1 minute.
  • the group using the enzyme source prepared from the cells transfected with p3xFLAG10-EL0VL2 showed 5.2 times higher radioactivity compared to the control (the enzyme source prepared from the cells transfected with the p3xFLAG10 vector). It was confirmed that the sensitivity was equal to or greater than that of the extended activity measured in Example 7.
  • Example 8 Using the cell effluent derived from the CH0 cell line highly expressing EL0VL2 obtained in Example 8 (1), using the high-throughput EL0VL2 enzyme activity measurement method of Example 8 (2), cis-5,8 , 11, 14, 1 / -eicosapentaenoic acid, cis-7, 10, 13, 16, 19-docosapentaenoic acid, cis-5, 8, 11, 14-eicosatetraenoic acid, Arachinonyl-CoA, cis-7, 10, 13 , 16-docosatetraenoic acid and cis-5,8,11-eicosatrienoic acid were used as substrates to measure the fatty acid elongation activity of EL0VL2.
  • Fatty acid elongation activity reaction solution containing 100 / z M 5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic acid as substrate fatty acid [50mM phosphorylation power / sodium hydroxide ( ⁇ 6.5), 5 ⁇ tenone (Wako Pure) Drug), 100 ⁇ CoA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), ImM ATP, ImM NADPH, ImM Shii-Dai Magnesium, 1 ⁇ 1 Incubate at C for 1 minute. At this time, add the enzyme solution ( ⁇ ) and a DMF solution 2 / z L of the test compound.
  • the EL0VL2 enzyme reaction is started by mixing l ⁇ u L 185 kBq [2_ 14 C] -malonyl CoA (Amercham Bioscience) and incubated at 37 ° C for 60 minutes. After that, trichloroacetic acid was added to a concentration of 4%, and after stirring, the reaction product was recovered with Un: ifilter-96 GF / C (Packard) using Harvexter (Packard), and microscinti-20 (ParkinElmer) After addition and stirring, the radioactivity of 14 C is measured by TopCount (Packard).
  • the activity of adding a DMF solution containing no test compound as 100 can determine 50% inhibitory concentration (IC 5. Value). Lower IC 5 .
  • the compound giving the value is selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • Example 4 was performed using colon cancer cell line SW480, which hardly expresses EL0VL2, prostate cancer-derived cell line LNCap cells, and prostate cancer-derived cell line PC-3, which expresses EL0VL2, as test cell cells.
  • the effect of EL0VL2 on apoptosis of antisense oligonucleotides was examined in the same manner as described above.
  • Wild-type p53 (Genbank Accession No. AF136270) was incorporated into the Bam HI-Eco RI site of pcDNA3.1 vector (Invitrogen) to obtain pcDNA3.1-WTp53 vector.
  • mutant p53 This was treated with BamHI and EcoRI with restriction enzymes, and incorporated into pIND vector (Ecdysone-Inducible Mammalian Expression System (invitrogen) fT) treated with the same enzymes to obtain pIND-MTp53 vector.
  • the amino acid sequence at position 175 replaces arginine (R) with histidine (H).
  • a pIND-WTp53 vector in which the wild-type p53 gene was incorporated into the pIND vector was also prepared.
  • a pIND-CAT vector invitrogen in which CAT (chloram feniconorecetinoletransferase) was incorporated was also used.
  • the p53-deficient cell line H1299 (ATCC) lacking p53 was seeded in 4 ⁇ 10 5 cells in a 6-cm Petri dish, cultured overnight, and then, using Fugene6, according to the attached protocol, the pIND_MTp53 vector obtained in (1) above.
  • pIND-WTp53 vector and pIND-CAT vector were co-transfected with pVgRXR vector [attached to the Ecdysone-Inducible Mammalian Expression System (Invitrogen)].
  • the transgenic cell lines H1299-MTp53, H1299_WTp53, and ⁇ 1299-CAT, into which the respective genes had been introduced, were selected using dieneticin (GIBC0 BRL) and Zeosin (Invitrogen).
  • H1299-MTp53, H1299 - stable cell lines of WTp53 is a Muristerone A (Invitrogen) addition of 5 [mu] Micromax, respectively, that is induced expression of MTp53 Oyopi WTp53, using anti-p 53 antibody (Oncogene) was confirmed by Western blotting.
  • H1299-Mtp53 (48 hr) H1299-Mtp53 (48 hr) in which the expression of mutant ⁇ 53 was induced
  • H1299 cells in which the expression of wild-type p53 was induced H1299 cells in which the expression of CAT was induced
  • STAU2 gene was found as a gene whose expression was increased. The expression level of this gene was below the detection limit in normal tissues (Table 4).
  • STAU2 gene expression was examined using matched pair cDNA (Clontech) derived from cancer tissues and normal tissues of human breast cancer patients as type III. By performing a PCR reaction using two types of primers (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22), the expression level of STAU2 gene in cancer tissue and normal tissue was compared.
  • Two types of primers (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24) were prepared based on the sequence of the STAU2 gene described in Genbank BC008369, and 5 / z was obtained using pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo). PCR was performed using the cDNA prepared from H1299_MTp53 supplemented with M Muristerone A as type III to obtain a DNA fragment. This gene fragment and the pCDNA3.K +) plasmid (Invitrogen) are digested with restriction enzymes EcoRV and Notl, and ligated using TaKaRa Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). The obtained plasmid DNA is obtained by a known method.
  • the transformant (clone) was obtained by introducing the strain into a large S. cerevisiae DH5 strain. This transformation The plasmid was extracted from the recombinant, the nucleotide sequence of the insert portion was confirmed using Sequencer (Applied Biosystem: ABI3100), and an animal cell expression vector PCDNA3.1 (+)-STAU2 was constructed. (2) Cell proliferation effect by STAU2 gene
  • the cells were fixed with a 10% neutral formalin solution (Wako Pure Chemical Industries) at room temperature for 30 minutes, and washed with PBS.
  • the cells were then stained with a talli violet (SIGMA) solution (dissolved in ethanol to 10% crystal violet and diluted 100-fold with PBS) at room temperature for 2 hours, and added to distilled water. Washed and air dried.
  • the area of the stained cells was measured with an ImagPro application (Media Cybernetics). As a result, assuming that the area of the group into which pCDNA3.1 (+)-LacZ was introduced into H1299 cells was 100%, the area of the group into which pCDNA3.1 (+)-STAU2 was introduced was 110% (P 0.01). Met. From this, it was confirmed that the STAU2 gene promoted the cell proliferation ability.
  • SIGMA talli violet
  • a lung cancer cell line A549 (Dainippon Pharmaceutical) as test cells
  • 3.3 ⁇ 10 3 cells were seeded on a 96-well plate (Falcon) the day before the introduction of the oligonucleotide.
  • OligofectAMINE (Invitrogen) was used for oligonucleotide introduction, and the protocol was followed.
  • a comparison was made with the control oligo-introduced sample using Cell death dection ELISA (Roche). Apoptosis increased to 167% compared to control (100%).
  • the protein used in the present invention is specifically expressed in cancer cells and is one of diagnostic markers for cancer. Therefore, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein, a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene Salts include, for example, colon, breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, renal cancer, brain It can be used safely as a prophylactic and therapeutic agent for cancer such as severe ulcers, ovarian cancer or hematological tumors. Preferred are preventive and therapeutic agents for breast cancer, prostate cancer and the like. Further, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein, a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene, can also be used safely, for example, as an apoptosis promoter.
  • the antisense polynucleotide or antibody of the present invention can inhibit the expression of the protein used in the present invention.
  • colon cancer breast cancer, lung cancer, prostate cancer
  • cancer such as esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, ovarian cancer or blood tumor It can be safely used as an agent (preferably, an agent for preventing or treating breast cancer, prostate cancer, etc.) or as an apoptosis-promoting agent.
  • an agent preferably, an agent for preventing or treating breast cancer, prostate cancer, etc.
  • an apoptosis-promoting agent preferably, an agent for preventing or treating breast cancer, prostate cancer, etc.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

　本発明は、癌の予防・治療剤などを提供する。具体的には、配列番号：１または１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物、該タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチド、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体などは、癌などの予防・治療剤、アポトーシス促進剤として使用することができる。

Description

明細書
癌の予防 ·治療剤 技術分野
本発明は、 癌の予防 ·治療剤および診断薬などに関する。 背景技術
最近の研究の進展によって、 癌は、 複数の遺伝子変異が体細胞に蓄積し、 その 結果として細胞の増殖制御ができなくなる遺伝子の病気であることが証明されて きている。 これらのうち、 p53はヒ ト癌で最も高頻度に異常が検出されている癌 抑制遺伝子であり、 Gl arrest, アポトーシスの誘導、 DNAに傷を受けた場合のチ エックボイント機構など多様な生理機能を有していることが明らかにされている 。 これらの機能は、 p53タンパク質が転写因子として作用し、 その標的遺伝子の 発現制御を行うことにより発揮されるものと考えられている。 そのため、 p53に 異常が生じる （変異型 p53) と、 これらの作用が発揮されなくなり、 細胞は癌化 に進んでいくと考えられる。 一方、 p53を欠失している癌細胞に、 変異型 p53を導 入すると、 癌細胞が軟寒天中でもコロニーを形成する、 あるいは胆癌ヌードマウ スモデルで腫瘍を形成するようになる （ネィチャージヱネテイクス、 4卷、 42-46 頁、 1993年） 等の報告から、 変異型 p53は、 ただ単に正常な p53 (野生型 P53) の 機能を失うだけではなく、 変異型 P53自身が、 積極的に癌化に関わっていること が示唆されている。 さらに、 この変異型 p53も野生型 p53と同様に、 下流遺伝子を 誘導することが報告されている （オンコジーン、 12卷、 1941 - 1952頁、 1996年） 。 変異型 p53は、 変異している位置の相違によりいくつかのタイプに分かれるが、 1 75番目のアルギニン （R) がヒスチジン （H) に置換した変異型 p53を有する癌が 、 最も予後が悪いという報告がある （キャンサーリサーチ、 55巻、 5217-5221、 1 995年） 。
EL0VL2 (Genbank Accession No. XM— 166355) は、 S. cerevisae の ELO (elong ation of very long chain fatty acids protein) フアミリーに相同生を持ち、 長鎖脂肪酸伸長反応に関与する酵素である EL0VLファミリー （EL0VL1- 5) に属す る。 EL0VLファミリ一は、 炭素数 20以上の長鎖 （不飽和） 脂肪酸またはスフイン ゴ脂質の合成に必要な酵素である。
Staufen homolog 2 (STAU2) (ゲノミクス、 62卷、 113 - 118頁、 1999年）は、 RNA binding protein である Drosophila Staufenのヒトホモログの一つである。 ラ ットでは海馬神経細胞の樹状突起での mR Aの運搬に関与することが報告されてい る （モレキュラー バイオロジー ォブ ザ セル、 9卷、 2945- 2953頁、 1999年 ) 。 STAU2は、 PKR (double-stranded脆- activated protein kinase) 、 TAR RN A binding protein (TRBP) などと共に RNA binding protein フアミリーに属す る。 TRBPの過剰発現細胞は、 transformed phenotypeを示すことが報告されてい る （ザェンポジャーナル、 16卷、 611-624、 1997年） ものの、 STAU2と癌との関 連についての報告はない。
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、 癌細胞の増殖阻害、 またはアポト 一シス誘導を行える薬剤が切望されている。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 癌組織に 発現が顕著に増加する遺伝子 （変異型 p53誘導遺伝子として見出した EL0VL2遺伝 子おょぴ STAU2遺伝子） を見出し、 さらに、 該遺伝子の機能を抑制することによ り、 アポトーシスが誘導されることを見出した。 この知見に基づいて、 さらに検 討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性 を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤、
( 2 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻害 する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤、
( 3 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ' ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部 を含有する了ンチセンスポリヌクレオチド、
(4) 配列番号： 1 0で表される塩基配列を有する上記 （3) 記載のアンチセ ンスポリヌクレオチド、
(5) 上記 （3) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(6) 癌の予防 ·治療剤である上記 （5) 記載の医薬、
(7) 上記 （3) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断薬
(8) 癌の診断薬である上記 （7) 記載の診断薬、
(9) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドまたはその塩に対する 抗体、
(1 0) 上記 （9) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(1 1) 癌の予防 ·治療剤である上記 （1 0) 記載の医薬、
(1 2) 上記 （9) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(1 3) 癌の診断薬である上記 （1 2) 記載の診断薬、
(1 4) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタ; /パク質またはその部分ぺプチドをコードするポリヌ クレオチドを含有してなる癌の診断薬、
(1 5) 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 脖臓癌、 脳腫瘍、 卵巣 癌または血液腫瘍である上記 （1) 、 （2) 、 (6) または （1 1) 記載の予防 -治療剤、
(1 5 a) 癌が、 乳癌または前立腺癌である上記 （1) 、 （2) 、 (6) また は （ 1 1 ) 記載の予防 ·治療剤、
(1 6) 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 臓癌、 月旦道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣 癌または血液腫瘍である上記 （8) 、 (1 3) または （1 4) 記載の診断薬、
(1 6 a) 癌が、 乳癌または前立腺癌である上記 （8) 、 （1 3) または （1 4) 記載の診断薬、
(17) ELOVL 2の活性を阻害する作用を有する化合物またはその塩を含 有してなる癌の予防 ·治療剤、
(1 7 a) ELOVL 2の活性を阻害する作用を有する化合物またはその塩を 含有してなるアポトーシス促進剤、
(18) ELOVL 2の発現を阻害する作用を有する化合物またはその塩を含 有してなる癌の予防 ·治療剤、
(18 a) ELOVL 2の発現を阻害する作用を有する化合物またはその塩を 含有してなるアポトーシス促進剤、
(19) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用 いることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング方法、
(19 a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする医薬用化合物のスクリーユング方法、
(19 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物および Zまたは癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （
19 a) 記載のスクリーユング方法、
(20) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含 有することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット、
(20 a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 含有することを特徴とする医薬用化合物のスクリーニング用キット、
(2 O b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物およびノまたは癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （ 20 a) 記載のスクリーニング用キット、
(21) 上記 （1 9) 記載のスクリーニング方法または上記 （20) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤、 (2 1 a) 上記 （1 9 a) 記載のスクリーニング方法または上記 （20 a) 記 載のスクリーニング用キットを用いて得られうる医薬用化合物またはその塩、
(2 1 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物および または癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （ 2 1 a) 記載の化合物またはその塩、
(2 1 c) 上記 （2 1 b) 記載の化合物またはその塩を含有してなる癌の予防
-治療剤、
(2 1 d) 癌が乳癌または前立腺癌である上記 （2 1 c) 記載の予防 ·治療剤 (2 1 e) 上記 （1 9) 記載のスクリーニング方法または上記 （20) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる乳癌または前立腺癌の予防 ·治療剤
(2 2) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌ クレオチドを用いることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリ一-ング方法、
(22 a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする医薬用化合物のスクリーユング方法、
(22 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防，治療に用 いられる化合物および/または癌の予防，治療効果を有する化合物である上記 （ 2 2 a) 記載のスクリーニング方法、
(2 3) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌ クレオチドを含有することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キ ッ卜、
(23 a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有することを特徴とする医薬用化合物のスクリーニング用キッ 卜、 (23 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物および/または癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （ 23 a) 記載のスクリーニング用キット、
(24) 上記 （22) 記載のスクリーニング方法または上記 （23) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤、
(24 a) 上記 （2 2 a) 記載のスクリーニング方法または上記 （2 3 a) 記 載のスクリーユング用キットを用いて得られうる医薬用化合物またはその塩、
(24 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物および または癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （ 24 a) 記載の化合物またはその塩、
(24 c) 上記 （24 b) 記載の化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 •治療剤、
(24 d) 癌が乳癌または前立腺癌である上記 （24 c) 記載の予防 ·治療剤 (24 e) 上記 （2 2) 記載のスクリーニング方法または上記 （23) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる乳癌または前立腺癌の予防 ·治療剤
(25)· 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活 性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス促進剤、
(26) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻 害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス促進剤、
(27) 上記 （3) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなるアポ トーシス促進剤、
(28) 上記 （ 9 ) 記載の抗体を含有してなるアポトーシス促進剤、
(29) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を用 いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニング方法、 (2 9 a) 医薬用化合物が、 アポトーシス促進作用を有する化合物である上記 (1 9 a) 記載のスクリーニング方法、
(30) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌ クレオチドを用いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリー-ング方法
(30 a) 医薬用化合物が、 アポトーシス促進作用を有する化合物である上記 (22 a) 記載のスクリーニング方法、
(3 1) 哺乳動物に対して、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または該タンパク質の遺 伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする 癌の予防 ·治療方法、
(3 2) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活 性を阻害する、 または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする 癌の予防 ·治療方法、
(3 3) 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 配列番号： 1で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または 該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用、
(34) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の 活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤、
(3 5) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドの遺伝子の発現を 阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤、
(36) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその 一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(3 7) 配列番号： 2 5で表される塩基配列を有する上記 （3 6) 記載のアン チセンスポリヌクレオチド、
(3 8) 上記 （3 6) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医
(3 9) 癌の予防 ·治療剤である上記 （3 8) 記載の医薬、
(40) 上記 （3 6) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診 断薬、
(4 1) 癌の診断薬である上記 （40) 記載の診断薬、
(42) 配列番号： 1 6で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体、
(4 3) 上記 （42) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(44) 癌の予防 ·治療剤である上記 （4 3) 記載の医薬、
(45) 上記 （4 2) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(46) 癌の診断薬である上記 （4 5) 記載の診断薬、
(4 7) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有してなる癌の診断薬、
(48) 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣 癌または血液腫瘍である上記 （34) 、 （3 5) 、 （3 9) または （44) 記載 の予防 ·治療剤、
(49) 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣 癌または血液 J®瘍である上記 （4 1) 、 （46) または （4 7) 記載の診断薬、 (50) Staufen homolog 2の活性を阻害する作用を有する化合物またはその 塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤、 (5 1) Staufen homolog 2の発現を阻害する作用を有する化合物またはその 塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤、
(52) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする癌の予防'治療剤のスクリーニング方法、
(5 2 a) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする医薬用化合物のスクリ一二ング方法、
(5 2 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物および Zまたは癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （
52 a) 記載のスクリーニング方法、
(5 3) 配列番号： 1 6で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を 含有することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット、
(53 a) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 を含有することを特徴とする医薬用化合物のスクリーニング用キット、
(53 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物および Zまたは癌の予防，治療効果を有する化合物である上記 （ 53 a) 記載のスクリーニング用キット、
(54) 上記 （5 2) 記載のスクリーニング方法または上記 （53) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる癌の予防 '治療剤、
(54 a) 上記 （5 2 a) 記載のスクリーニング方法または上記 （5 3 a) 記 載のスクリーニング用キットを用いて得られうる医薬用化合物またはその塩、 (54 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物および Zまたは癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （
54 a) 記載の化合物またはその塩、
(54 c) 上記 （54 b) 記載の化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 •治療剤、 (5 5) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング方法 (5 5 a) 配列番号： 1 6で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポ リヌクレオチドを用いることを特徴とする医薬用化合物のスクリ一ユング方法、
(5 5 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物およびノまたは癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （ 5 5 a) 記載のスクリ一二ング方法、
(5 6) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用 キット、
(5 6 a) 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポ リヌクレオチドを含有することを特徴とする医薬用化合物のスクリ一ニング用キ ッ卜、
(5 6 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 瘅の予防 ·治療に用 いられる化合物および/または癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （ 5 6 a) 記載のスクリーニング用キット、
(5 7) 上記 （5 5) 記載のスクリーニング方法または上記 （5 6) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤、
(5 7 a) 上記 （ 5 5 a ) 記載のスクリ一二ング方法または上記 （5 6 a) 記 載のスクリーニング用キットを用いて得られうる医薬用化合物またはその塩、
(5 7 b) 医薬用化合物が、 癌の予防 ·治療用の化合物、 癌の予防 ·治療に用 いられる化合物および Zまたは癌の予防 ·治療効果を有する化合物である上記 （ 5 7 a) 記載の化合物またはその塩、
(5 7 c) 上記 （5 7 b) 記載の化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 •治療剤、
(58) 配列番号： 16で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の 活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス促進剤、
(59) 配列番号： 16で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドの遺伝子の発現を 阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス促進剤、
(60) 上記 （36) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなるァ ポトーシス促進剤、
(61) 上記 （42) 記載の抗体を含有してなるアポトーシス促進剤、
(62) 配列番号： 16で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 用いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリ一二ング方法、
(63) 配列番号： 16で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニング方 法、
(64) 哺乳動物に対して、 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または該タンパク質の 遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とす る癌の予防 ·治療方法、
(65) 配列番号： 16で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の 活性を阻害する、 または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することを特徴とす る癌の予防 ·治療方法、
(66) 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 配列番号： 1 6で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 また は該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用などを提供 する。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる配列番号： 1または配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 本 発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある） は 、 ヒ トゃ温血動物 （例えば、 モルモッ ト、 ラット、 マウス、 ニヮ トリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 (例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 瞎臓 B細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 Τ細胞、 Β細胞、 ナチユラ /レキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細 月包、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細 包、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） もしくはそれ らの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核 、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体 、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前 立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク質で あってもよく、 合成タンパク質であってもよレヽ。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては 、 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 % 以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ま しくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配 歹 IJなどが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Cen ter for Biotecnnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を 用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギヤップを許す；マトリクス二 BL0SUM62；フィ ルタリング =0FF) にて計算することができる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 実質的に同質の活性としては、 例えば、 脂肪酸延長活性、 細胞増殖促進活性な どが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に 、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 脂肪酸延長活性、 細 胞増殖促進活性などが同等 （例、 約 0 . 0 1〜 1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜 1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性 の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
脂肪酸延長活性の測定は、 自体公知の方法、 例えばザ ジャーナルォブセル バイオロジー、 707- 717頁、 2000年に記載の方法またはそれに準じる方法に従つ て測定することができる。 具体的には、 （a) 本発明のタンパク質 （例、 EL0VL2 ) の発現ベクターを導入した細胞の抽出液、 （b) 基質脂肪酸、 および （c) 標識 されたマロ -ル CoAを適当な緩衝液中で反応させ、 この反応液から標識された脂 肪酸を抽出し、その標識量を測定することにより、 本発明のタンパク質 （例、 EL0 VL2) の脂肪酸延長活性の程度を測定できる。
細胞増殖促進活性の測定は、 自体公知の方法、 例えばコロニーフォーメーショ ンアツセィ法またはそれに準じる方法などに従って測定することができる。 具体 的には、 本発明のタンパク質 （例、 EL0VL2) の発現ベクターが導入された細胞を 培養 （例、 導入された細胞のみを選択するような培地で培養） し、 形成されたコ ロニーを染色した後、 その面積を測定することにより、 本発明のタンパク質 （例
、 EL0VL2) の細胞増殖促進活性の程度を測定できる。
配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1 6で表わされるァミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に 好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列などが挙げられる。 アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Cen ter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を 用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；マトリタス =BL0SUM62；フィ ルタリング =0FF) にて計算することができる。
配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 細胞増殖促進活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的 に） 同質であることを示す。 したがって、 細胞増殖促進活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 この活性の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素 は異なっていてもよい。
細胞増殖促進活性の測定は、 自体公知の方法、 例えばコロニーフォーメーショ ンアツセィ法またはそれに準じる方法などに従つて測定することができる。 具体 的には、 本発明のタンパク質 （例、 STAU2) の発現ベクターが導入された細胞を 培養 （例、 導入された細胞のみを選択するような培地で培養） し、 形成されたコ ロニーを染色した後、 その面積を測定することにより、 本発明のタンパク質 （例 、 STAU2) の細胞増殖促進活性の程度を測定できる。
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （1)配列番号： 1ま たは配列番号： 1 6で表されるァミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに 好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （2)配列番号 ： 1または配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さ らに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付カロしたアミノ酸配列、 （3)配列 番号： 1または配列番号： 1 6で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例 えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度 、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （4 )配列番号： 1または配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換 されたァミノ酸配列、 または（5)それらを組み合わせたァミノ酸配列を含有する タンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入 、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1または 配列番号： 1 6で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする 、 本発明で用いられるタンパク質は、 C末端がカルボキシル基 （- C00H) 、 カル ボキシレート（-C00— ) 、 アミ ド （- C0NH2) またはエステノレ （- C00R) の何れであ つてもよレヽ。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピル、 n—プチノレなどの C アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチル などの C 6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C !_2 アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー アルキル基な どの C 7 _ 1 4ァラルキル基、 ピパロィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （または力ルポ キシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステル化さ れているものも本発明で用レヽられるタンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メ チォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C wアルカノィルなどの C ^ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断 されて生成する N末端のグノレタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば - 0H、 - SH、 アミノ基、 イミダゾール基、 ィ ンドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの C Μアル力ノィル基などの C wァシル基など） で保護されているもの 、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含 まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明で用 いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明で用 いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればレ、ずれのものでもよい。 例えば、 本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも
2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好まし くは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチ ドなどが用いられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァ ミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1また は 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好まし くは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （- C00H) 、 カルポキシレート （- C0CT) 、 アミ ド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) の何 れであってもよレ、。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられる タンパク質と同様に、 C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有しているもの、 Ν末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が 保護基で保護されているもの、 Ν端側が生体内で切断され生成したグルタミン残 基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な 保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺプチドなど の複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分べプチドは抗体作成のための抗原としても用いること ができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ぺプチドの塩としては、 生理学的に 許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩 が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩と しては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コノヽク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前 述したヒ トゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法に よって製造することもできるし、 タンパク質をコードする D N Aを含有する形質 転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド 合成法に準じて製造することもできる。
ヒ トゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒ トゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することが きる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそ のアミ ド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる 。 そのような樹月旨としては、 例えば、 クロロメチノレ樹脂、 ヒ ドロキシメチノレ樹月旨 、 ベンズヒ ドリルアミン榭脂、 アミノメチル樹脂、 4 _ベンジルォキシベンジル アルコール樹脂、 4一メチルベンズヒ ドリルァミン樹脂、 Ρ ΑΜ樹脂、 4ーヒ ド ロキシメチルメチルフエニルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹月旨 、 4一 ( 2 ' , 4， ージメ トキシフエ二ル一ヒ ドロキシメチル) フエノキシ樹脂 、 4一 ( 2， , 4 ' —ジメ トキシフエ二ル一 F m o cアミノエチル） フエノキシ 樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひ一ァミノ基と側鎖官 能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公 知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク 質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶 液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質もしくは部 分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護ァミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミ ド類としては、 D C C、 N， N'—ジイソプロピルカルボジイミ ド、 N—ェチ ルー N， 一 ( 3—ジメチルァミノプロリル) カノレボジイミ ドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t， H O O B t ) とともに保護ァミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活十生 化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N , N—ジメチルホルムアミ ド, N, N—ジメチルァセトアミ ド, Γ—メチノレピ 口リ ドンなどの酸アミ ド類、 塩ィ匕メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスノレホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒ ドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約 _ 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活'生化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応 を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十 分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて 未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないよう にすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t一ペンチルォキシ カルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4ーメ トキシベンジルォキシカル ボニル、 C 1 _ Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロア セチノレ、 フタロイノレ、 ホノレミノレ、 2—二 トロフエニノレスノレフエニル、 ジフエニル ホスフイノチオイノレ、 F m o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピノレ、 プチノレ、 t一プチノレ、 シク口ペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シクロへプ チル、 シクロオタチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4 - 二ト口べンジルエステノレ、 4ーメ トキシベンジノレエステノレ、 4一クロ口べンジル エステノレ、 ベンズヒ ドリノレエステノレ化） 、 フエナシノレエステノレ化、 ペンジノレオキ シカノレボニルヒ ドラジドィ匕、 t—プトキシカルボ二ノレヒ ドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテルィ匕によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （C w) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカ ルポ-ル基、 エトキシカルボ-ル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒ ドロ ピラニル基、 t -ブチル基などである。
チロシンのフエノーノレ ["生水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2— B z l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t _ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのィミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4ーメ トキシ 一 2 , 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル 、 B u m, B o c、 T r t、 F m o cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活个生エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 , 4 , 5—トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 Η Ο Ν Β、 Ν—ヒ ドロキシスクシミ ド、 Ν —ヒ ドロキシフタルイミ ド、 H O B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノーノレ、 チオアニソーノレ、 メタクレゾール、 パラクレゾーノレ、 ジメチノレスノレ フイ ド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2 _エタンジチ才ーノレなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2 , 4—ジニ トロフヱニル基はチオフエノ一ル処理により除去され 、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2—エタンジチオール、 1 , 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による 脱保護以外に、 希水酸化ナトリゥム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミ ド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミ ド化して保護した後 、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプ チド鎖の Ν末端のひ一アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ぺプ チドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ぺ プチドとを製造し、 これらのタンパク質またはぺプチドを上記したような混合溶 媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得 られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保 護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 この粗 タンパク質またはべプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を 凍結乾燥することで所望のタンパク質またはぺプチドのァミ ド体を得ることがで さる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端 アミノ酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステル とした後、 タンパク質またはペプチドのアミ ド体と同様にして、 所望のタンパク 質またはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ぺプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のぺプチドの 合成法に従つて、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダーゼ で切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例 えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用 いられる部分ぺプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の ぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例 えば、 以下の（1)〜（5)に記載された方法が挙げられる。
(1) M. Bodanszky および M. A. Ondetti, ペプチド、シンセシス (Peptide Synt hesis) , Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) Schroederおよび Luebke、 ザ ·ぺプチド (The Peptide)， Academic Press, Ne w York (1965年）
(3) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(4) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205 、 （1977年）
(5) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 '蒸留 'カラムクロマトダラ フィ一'液体クロマトグラフィー .再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述 した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 好ましくは D NAである。 D NAとしては、 ゲ ノム D N A、 ゲノム D N Aライブラリー、 前記した細胞 '組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D N Aのいずれでもよい ライブラリ一に使用するべクタ一は、 パクテリオファージ、 プラスミ ド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より total R N Aまたは mR N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcri ptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T— P C R法と略称する） によつ て増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードする D N Aとしては、 例えば、 （1 ) 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D N A、 または配列番号： 2で表さ れる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を 含有し、 前記した配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と 実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D N A、 （2 ) 配列番号： 1 7で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 1 7で表される塩 基配列とハイス トリンジヱントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し 、 前記した配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質 的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NAであれば何れのものでも よい。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ま しくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以 上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 酉己列番号： 1 7で表される塩基配列とハイストリンジヱントな条件下でハイブ リダィズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 1 7で表される塩基配列と 約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い 、 以下の条件 (期待値 = 10；ギャップを許す；フィルタリング =0N；マッチスコ ァ = 1 ; ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。
ノ、イブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え は、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. ， Cold Spring Harbor Lab. P ress, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライ ブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことが できる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことがで きる。
ノ、イストリンジヱントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜 4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5での 場合が最も好ましい。
より具体的には、 （1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質をコードする D N Aとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有す る： D N A、 配列番号： 3で表される塩基配列を含有する D NAなどが、 （2 ) 配 列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D NA としては、 配列番号： 1 7で表される塩基配列を含有する D NA、 配列番号： 1 8で表される塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D NA ) としては、 前述した本発明で用いられる部分べプチドをコードする塩基配列を 含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノ ム D N Aライプラリー、 前記した細胞 '組織由来の c D NA、 前記した細胞 '組 織由来の c D NAライブラリ一、 合成 D N Aのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配列 番号： 2または配列番号： 1 7で表される塩基配列を含有する D NAの一部分を 含有する D NA、 または配列番号： 2または配列番号： 1 7で表される塩基配列 とハイストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、 本発 明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする D NAの 一部分を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2または配列番号： 1 7で表される塩基配列とハイブリダィズでき る D NAは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダィゼーシヨンの方法およびハイストリンジヱントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする D NAのクローユングおょぴ発現の説明においては、 これらを単に本発明のタンパ ク質と略記する場合がある） を完全にコードする D NAのクローユングの手段と しては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 D NA プライマーを用いて P C R法によつて増幅する力、 または適当なベクターに組み 込んだ D N Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする D NA断 片もしくは合成 D NAを用いて標識したものとのハイブリダィゼーションによつ て選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 Molecula r Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販,のライブラリーを使 用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
D NAの塩基配列の置換は、 P C R、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA-LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる 方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする D N Aは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用することが できる。 該 D NAはその 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての A T Gを有し、 ま た 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本楽明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR322, p BR 32 5, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB 1 10， p TP 5, p C 1 94) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p SH1 9, p SH 15) 、 入ファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス , バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 p A 1— 1 1、 p XT 1、 p R cZCMV、 pRc/RSV、 p c D N A I /N e oなどが用いられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRひプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる これらのうち、 CMV (サイ トメガロウイノレス） プロモーター、 SRctプロモ 一ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 PLプロモー ター、 l p pプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SPO lプロモーター、 SP〇 2プロモーター、 p e nPプロモータ 一など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター 、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞で ある場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 S V40複製オリジン (以下、 S V40 o r i と略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 N e o rと略称する場合がある、 G4 1 8耐性） 等が挙げられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル配 歹 lj、 OmpA · シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミ ラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である 場合は、 MF a ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 インシユリン ·シグナル配列、 一インターフェロン ' シグナ ル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌の具体例としては、 例えば、 ェシェリヒア . コリ （Escheric hia coli) K1 2 . DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 160 (1968)〕 ， JM1 03 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1981)〕 , J A 2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120卷， 517 (1978)〕 , HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41卷， 459(1969)〕 ， C 6 00 [Genetics, 39卷， 440 (1954)〕 などが用い られる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス 'サブチルス （Bacillus subtilis ) MI 1 14 [Gene, 2 ¾ 255(1983)] ， 20 7— 2 1 [Journal of Biochemist ry, 95卷， 87(1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cere visiae) AH 22, AH 22 R~, NA8 7— 1 1 A， DKD— 5D, 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1 9 1 3, NCYC 2036, ピキア ノ ストリス （Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c NP Vの場合は、 ョ トウガの幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f 細胞) 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MGl細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 amestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vめ場合は、 カイコ由来株化細胞 （Bombyx raori N細胞； Bm N細胞） などが用いられる。 該 S ί細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC C RL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J. L.ら、 In Vivo, 13, 213-217， (1977) ) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 巻， 592(1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 C〇 S- 7, V e r o , チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， d h f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， マウス ATDC5細胞， ラット GH3, ヒ ト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，69卷， 2110 (1972)、 Gene， 17巻， 107(1982)などに記載の方法に従って行なうこと ができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, 1 68卷， 111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194卷， 182 - 187 (19 91)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929(1978)などに記載の方法に従って 行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6, 47-55 ( 1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52卷， 456 (1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする D N Aを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシヱリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ' リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸ニ水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成長促進因子など を添カ卩してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics , 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここ に必要によりプロモーターを効率よく働力せるために、 例えば、 3 —インドリ ルァクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔Bitter， G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330 (1984)〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4 〜7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace' s Insect Medium (Grace, T. C. C.， Nature) , 195, 788 (1962) ) に非動ィ匕した 1 0 %ゥシ血清等の添力卩物を適宜カ卩えたものなどが用いられる。 培地の p H:は約 6 . 2〜 6 . 4に調整するのが好まし!/、。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行 ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜2 0 %の胎児牛血清を含む M E M培地 [Science, 122卷， 501 (1952)〕 ， D M E M培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕 , R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of the American Medical Association 199卷， 519 (1967)〕 , 1 9 9培地 [Proceedi ng of the Society for the Biological Medicine, 73巻， 1 (1950)〕 などが用レ、ら れる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0〜4 0 °Cで糸勺 1 5 〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本癸明のタン パク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後 、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波 、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いら れる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリ トン X - 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよレ、。 培養液中にタンパク質 が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と 上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミ ドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマ トグ ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーな どの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水 性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など が用いられる。
力べして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当なタンパ ク修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部 分的に除去することもできる。 タンパク修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン 、 キモトリブシン、 アルギニルエンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリ コシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィム ィムノアツセィゃウェスタンプロッティングなどにより測定することができる。 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであって もよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗 体の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対する抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または 抗血清の製造法に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよぴラットが好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化タ ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミ ルスタインの方法 〔ネイチヤー (Nature)、 256、 495 (1975)〕 に従い実施するこ とができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0、 A P— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜 2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) 力 S 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加され、 2 0〜 4 0 °C、 好ましくは 3 0〜 3 7 °C で 1〜 1 0分間ィンキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添カ卩し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 通常 HA T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地として は、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例 えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ) あ るいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） な どを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜 4 0 ° (、 好ましくは約 3 7 °C である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗 体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリン の分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合 固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体の みを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことが できる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパグ質抗原） 自体、 あるい はそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体 の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパク質 に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造するこ とができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァータンパク質との複 合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル プミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、 マレイミ ド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1〇回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで さる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオ チド （例、 D NA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 こ れらの D NAを本発明の D N Aと略記する場合がある） ） の塩基配列に相補的な 、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌ クレオチドとしては、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) の塩基配列に相 補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該 D N Aの発 現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いず; のアンチセンスポリヌクレオ チドであってもよいが、 アンチセンス D NAが好ましい。
本発明の D NAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D NAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D N Aの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられ る。 特に、 本発明の D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻害を指向し たアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の N末端部位を コードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補鎖 と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も 好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、 （ 口） R N a s e Hによる R NA分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの 場合は、 イントロンを含む本発明の D N Aの全塩基配列の相捕鎖と約 7 0 %以上 、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である 具体的には、 配列番号： 2または配列番号： 1 7で表わされる塩基配列を含有 する D N Aの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 または その一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 好ましくは例えば、 配列 番号： 2または配列番号： 1 7で表わされる塩基配列を含有する D N Aの塩基配 列に相補な塩基配列、 またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチ ド （より好ましくは、 配列番号： 2または配列番号： 1 7で表わされる塩基配列 を含有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部分を有する了ン チセンスポリヌクレオチド) が挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分角军酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホスホ ロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修 pリン 酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシリポース ) は、 2 ' —O—メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、 塩 基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであってもよく、 配列番 号： 2または配列番号： 1 7で表わされる塩基配列を有する D NAにハイブリダ ィズするものであればいずれのものでもよレ、。 これらのアンチセンスポリヌクレ ォチドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害すること のできるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 あるいは 決定されたタンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し、 合成 しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝子の R N Aとハイプリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害すること ができる力、 あるいは本発明のタンパク質関連 R N Aとの相互作用を介して本発 明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のタンパク 質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明のタ ンパク質関連 R N Aと特異的にハイプリダイズすることができるポリヌクレオチ ドは、 生体内おょぴ生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御する のに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する 」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相同 性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列また は核酸とペプチド （タンパク質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核 酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド （タンパク質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5， 端ヘアピンループ、 5， 端 6—ベースペア ' リピート、 5， 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン 、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3， 端非翻訳領域、 3， 端パ リンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択 しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選扳しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相捕的なポリヌクレオチドとの関係 は、 対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、 「 アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンスボリヌクレオチドは、 2—デォキシ一D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポースを 含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシド であるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有す るその他のポリマー （例えば、 市販のタンパク質、 核酸おょぴ合成配列特異的な 核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマ 一は D NAや R N A中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容 する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA : R NAハ イブリツドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾ォ リゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で 知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以 上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のさ れたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステ ル、 ホスホルアミデート、 カルパメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合ま たは硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えばタンパク質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレアーゼ 'インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モ ノサッカライ ドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インター力レート化合物 (例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アル キル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の 核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾された その他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジ ン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド および修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1 個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはェ 一テル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 あるい は修^ ίされた核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミ ドゃ オリゴヌクレオシドアミ ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計 されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 ァ ンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性 をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性を より小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakarai et al. , Pharra Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992； Vol. 8， pp. 395, 1992； S. T. Cro oke et al. ed. , Antisense Research and Appl ications, CRC Press, 1993 な どに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付力 Dされた形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリ力チオン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような S旨質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付カ卩するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3， 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子內ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3， 端あるいは 5， 端に特 異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌ クレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用 の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトヲエチレングリコールなどのグリ コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それ に限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用 いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる 以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発 明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分ぺプチ ドをコードする D N A (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） 、 本発明 のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以下、 本発明の 抗体と略記する場合がある） 、 およぴ本発明の D N Aのアンチセンスポリヌクレ ォチド （以下、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある） の用途を説明する。
また、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドを、 本発明のタンパ ク質 Aと、 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドを、 本発明のタ ンパク質 Bと略記することもある。
本発明のタンパク質は、 癌組織で発現が増加するので、 疾患マーカーとして利 用することができる。 すなわち、 癌組織における早期診断、 症状の重症度の判定 、 疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。
また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 癌細胞に対して、 細胞死を促 進する優れたアポトーシス促進作用を有する。
よって、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活性 を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害す る化合物もしくはその塩、 または本発明の抗体を含有する医薬は、 例えば、 大腸 癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀 胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 瞎臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍など の癌の予防 ·治療剤、 アポトーシス促進剤などとして使用することができる。 また、 本発明のタンパク質の遺伝子は、 正常組織での発現が低いことから、 副 作用の少ない癌の予防 ·治療剤のスクリ一二ングが可能になる。 また、 変異型 p 5 3を保持している癌は、 臨床で抗癌剤が効きにくい、予後が悪い等、 悪性度が 高いことが知られている。 本発明のタンパク質遺伝子は、 変異型 p 5 3の下流で 働くことより、 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのアンチセン スポリヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその 塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、 また は本発明のタンパク質に対する抗体などは、 悪性度の高い癌にも効果的である。
( 1 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は癌組織で発現が増加しており、 さらに、 本発明のタンパ ク質の活性を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こす。 従って、 本発明のタン パク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前 立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 睦臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤 として使用することができる。 好ましくは、 乳癌、 前立腺癌などの予防 ·治療剤 である。 また、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、 例 えば、 アポトーシス促進剤として使用することもできる。
本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはそ の塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、 本発明のタンパク質 Aを用いることを特徴とする本発明のタンパク 質 Aの活性 （例えば、 脂肪酸延長活性、 細胞増殖促進活性など） を阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、 例えば、 （ia) 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細 胞の脂肪酸延長活性または細胞増殖促進活性と、 （i ia) 本発明のタンパク質 A を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物の脂肪酸延長活性または細胞 増殖促進活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性を阻害する 化合物またはその塩のスクリーニング方法が用いられる。
上記スクリーニング方法においては、 例えば (ia) と (i ia) の場合において 、 脂肪酸延長活性を自体公知の方法、 例えばザ ジャーナルォブセルバイオ口 ジー、 707- 717頁、 2000年に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定し 、 比較する。
具体的には、 （ia) (1) 本発明のタンパク質 A (例、 EL0VL2) の発現べクタ 一を導入した細胞の抽出液、 （2) 基質脂肪酸、 および （3) 標識されたマロニル CoAを適当な緩衝液中で反応させ、 この反応液から標識された脂肪酸を抽出した 場合と、 （iia) (1) 本発明のタンパク質 A (例、 EL0VL2) の発現ベクターを導 入した細胞の抽出液、 （2) 基質脂肪酸、 （3) 標識されたマロニル CoA、 (4) 試 験化合物を適当な緩衝液中で反応させ、 この反応液から標識された脂肪酸を抽出 した場合との、 遊離脂肪酸の標識量を測定し、 比較する。
基質脂肪酸としては、 例えば、 不飽和脂肪酸 （例、 エイコサペンタエン酸、 ド コサペンタエン酸、 エイコサテトラェン酸、 ァラキドン酸、 ァラキドニル-コェ ンザィム 、 ドコサテトラェン酸、 エイコサトリエン酸、 メアド酸、 エイコサテ トラェン酸、 エイコサトリエン酸、 ジホモ-ガンマ-リノレン酸、 テトラコサテト ラエン酸、 テトラコサペンタエン酸、 ドコサペンタエン酸、 ォクタデセン酸、 ェ ィコセン酸、 ドコセン酸、 テトラコセン酸、 ォクタデカジエン酸、 エイコサジェ ン酸など） が用いられる。 好ましくは炭素数 1 8〜 2 4 (好ましくは炭素数 2 0 または 2 2 ) の不飽和脂肪酸などが用いられる。 さらに好ましくは、 cis - 5, 8，11 , 14, 17-eicosapentaenoic acid (EPA) 、 cis- 7， 10, 13， 16， 19- docosapentaenoic acid (DPA) 、 cis-5, 8, 11, 14-eicosatetraenoic acid (Arachidonic acid) 、 Ar achinonyl - CoA、 cis-7, 10, 13, 16-docosatetraenoic acid、 cis - 5， 8， 11 - eicosatr ienoic acidなどが用いられる。
標識剤としては、 例えば、 放射性同位元素 （例、 〔¾〕 、 〔14C〕 など） 、 蛍光 物質 〔例、 シァニン蛍光色素 (例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバ ィォサイエンス社製） など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンィソチオシァ ネートなど〕 などが用いられる。
標識量の測定は、 公知の方法で行えばよい。
上記スクリーニング方法の具体例を以下に示す。
基質脂肪酸を含む脂肪酸延長活性反応液 〔50mM リン酸化力リゥム /水酸化ナト リウム （pH6. 5) 、 5μΜ ロテノン （和光純薬） 、 ΙΟΟμΜ CoA (和光純薬） 、 ImM A TP、 ImM NADPH、 ImM塩化マグネシウム〕 を調整し、 この反応液を 96ゥヱルプレ ートに分注し、 37°Cで 1分間インキュベートする。 その後、 試験化合物おょぴ本 発明のタンパク質 A (例、 EL0VL2) を高発現する動物細胞 （例、 CH0細胞） 株由 来の細胞抽出液を酵素源として添加、 攪拌後、 37°Cで 60分間インキュベートする 。 その後、 トリクロ口酢酸を 4%となるように添加、 さらに I L 185kBq [2 -14 C ]-マロニル CoA (Amercham Bioscience社）を添加して攪拌する。 この反応生成物 を Harvexter (Packard) を用いて Un ilter- 96 GF/C (Packard) で回収する。 mi croscinti - 20 (ParkinElmer) 添加、 攪拌後、 TopCount (Packard) により
、 標識された （遊離） 脂肪酸の放射活性 （例、 14C) を測定する。 試験化合物を 添カロしない場合の活性を 100とし、 50%阻害濃度 （IC5。値） を求め、 より低い IC5。 値を与える化合物を、 本発明のタンパク質 A (例、 EL0VL2) の活性 （例、 脂肪酸 延長活性） を阻害する化合物として選択する。
上記スクリーニング方法においては、 例えば （ia) と （iia) の場合において 、 細胞増殖促進活性を自体公知の方法、 例えばコロニーフォーメーションアツセ ィ法またはそれに準じる方法などに従って測定し、 比較する。
具体的には、 （ia) 本発明のタンパク質 Aの発現ベクターが導入された細胞を 培養 （例、 導入された細胞のみを選択するような培地で培養） し、 形成されたコ 口-一を染色した場合と、 （iia) 本発明のタンパク質 Aの発現ベクターが導入 された細胞および試験化合物を培養 （例、 導入された細胞のみを選択するような 培地で培養） し、 形成されたコロニーを染色した場合との、 その面積を測定し、 比較する。
本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質 Aをコードする D N Aを含有するべクタ一で形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C H O細胞、 H E K 2 9 3細胞、 MC F— 7細胞などの動物細胞が好ましく用いら れる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本 発明のタンパク質 Aを細胞内に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 本 発明のタンパク質 Aを発現し得る細胞の培養方法は、 前記した本発明の形質変換 体の培養法と同様である。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れる。
例えば、 上記 （iia) の場合における脂肪酸延長活性または細胞増殖促進活性 を、 上記 （ia) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好 ましくは約 5 0 %以上阻害させる試験化合物を、 本発明のタンパク質 Aの活性を 阻害する化合物として選択することができる。
本発明のタンパク質 Aの活性を阻害する活性を有する化合物は、 本発明のタン パク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーユング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などか ら選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質 の塩と同様のものが用いられる。
本発明は、 本発明のタンパク質 Bを用いることを特徴とする本発明のタンパク 質 Bの活性 （例えば、 細胞増殖促進活性など） を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法も提供する。
より具体的には、 例えば、 （ib) 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有す る細胞の細胞増殖促進活性と、 （iib) 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を 有する細胞と試験化合物の混合物の細胞増殖促進活性との比較することを特徴す る本発明のタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーユング 方法が用いられる。
上記スクリーニング方法においては、 例えば （ib) と （iib) の場合において 、 細胞増殖促進活性を自体公知の方法、 例えばコロニーフォーメーションアツセ ィ法またはそれに準じる方法などに従って測定し、 比較する。
具体的には、 （ib) 本発明のタンパク質 Bの発現ベクターが導入された細胞を 培養 （例、 導入された細胞のみを選択するような培地で培養） し、 形成されたコ ロニーを染色した場合と、 （iib) 本発明のタンパク質 Bの発現ベクターが導入 された細胞および試験化合物を培養 （例、 導入された細胞のみを選択するような 培地で培養） し、 形成されたコロニーを染色した場合との、 その面積を測定し、 比較する。
本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質 Bをコードする D N Aを含有するベクターで形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C H〇細胞、 H E K 2 9 3細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリー ニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタンパク質 Bを細胞膜上、 細胞内に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 本発明の タンパク質 Bを発現し得る細胞の培養方法は、 前記した本発明の形質変換体の培 養法と同様である。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れる。
例えば、 上記 （i ib) の場合における細胞増殖促進活性を、 上記 （ib) の場合 に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上 阻害させる試験化合物を、 本発明のタンパク質 Bの活性を阻害する化合物として 選択することができる。
本発明のタンパク質 Bの活性を阻害する活性を有する化合物は、 本発明のタン パク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のスクリーニング方法またはスクリ一二ング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などか ら選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質 の塩と同様のものが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質の遺伝子も、 癌組織において発現が増加するので 、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩も、 例えば 乳癌、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道瘅、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌 、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血 液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤として使用することができる。 好ましくは、 乳癌 、 前立腺癌などの予防 ·治療剤である。 また、 本発明のタンパク質をコードする 遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 アポトーシス促進剤と して使用することもできる。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) は、 本発明のタンパク 質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬 として有用である。
スクリーニング方法としては、 （iii) 本発明のタンパク質を産生する能力を 有する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存在下、 本発明で用いられる タンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特 徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、 （iii) と （iv) の場合における、 前記遺伝子の発現量 （ 具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードする m R N A 量） を測定して、 比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタン z ク質を認識する 抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェスタン解析 、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる m R NA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プローブとして酉己列番号： 2また はその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイプリダイゼーシヨン、 あるいは プライマーとして配列番号： 2またはその一部を含有する核酸を用いる P C R法 またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、 上記 （iv) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （i ii) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害 させる試験化合物を、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物とし て選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明で用いられるタンパク質もしくは 部分べプチドまたはその塩、 または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分 ぺプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーユング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非 ぺプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明のタンパク 質の活性 （例、 脂肪酸延長活性、 細胞増殖促進活性など） を阻害する化合物また はその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩で ある。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用い られる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 および本発明のタ ンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩はそれぞれ、 例えば大腸 癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀 胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 藤臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍など の癌の予防 ·治療剤 （好ましくは、 乳癌、 前立腺癌などの予防 ·治療剤） として 、 またはアポトーシス促進剤などの、 副作用が極めて少ない医薬として有用であ る。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に従つ て製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的に は錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カブ セル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられ る。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用 いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の 担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関節 内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例 えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性 液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては 、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ 、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポジソルベー卜 80、 HCO-50 (polyoxyethylene (50raol) adduct of hydrogen ated castor oil) ] などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコー ルなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填さ れる。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤 に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜 10 0mg、 その他の剤形では 10〜25 Omgの上記化合物が含有されていること が好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ 、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投 与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の 活性を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき該化合物またはその塩を約 0. 1〜10 Omg, 好ましくは約 1. 0〜 50 m g、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投 与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は投与 対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明の タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人 （体重 6 O k gとして） に投与する場合、 一日につき該化合物またはその塩を約 0. 0 1~3 Omg程度、 好ましくは約 0. ：！〜 20 m g程度、 より好ましくは約 0. ：!〜 1 Omg程度を癌病変部に注射により投与するのが好都合である。 他の動物 の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
また、 上記化合物は、 既存の抗癌剤と組み合わせて用いることができ、 抗癌剤 の正常細胞に障害を及ぼす副作用が軽減される。 この際、 投与時期は限定されず 、 これらを投与対象に対し、 同時に投与してもよいし、 時間差をおいて投与して もよい。 投与量は、 臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することが できる。 また、 上記化合物と抗癌剤の配合比は、 投与対象、 投与ルート、 対象疾 患、 症状、 組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。
既存の抗癌剤としては、 例えば、 化学療法剤、 ホルモン療法剤、 免疫療法剤な どが挙げられる。
化学療法剤としては、 例えばアルキル化剤 （例、 サイクロフォスフアミ ド、 ィ フォスフアミド、 二ムスチン、 ラニムスチン、 カルボコン等) 、 代謝拮抗剤 （例 、 メソトレキセ一ト、 5—フノレ才ロゥラシノレ、 テガフール、 カルモフール、 UFT 、 ドキシフルリジン、 シタラビン、 エノシタビン、 メルカプトプリン、 メルカプ トプリンリボシド、 チォグァニン等） 、 抗癌性抗生物質 (例、 マイトマイシン、 アドリアマイシン、 ダウノノレビシン、 エピ^ "ビシン、 ピラノレビシン、 イダルビシ ン、 ブレオマイシン、 ぺプロマイシン、 ァクチノマイシン等) 、 植物由来抗癌剤 (例、 ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 ビンデシン、 エトポシド、 カンプトテ シン、 ィリノテカン等) 、 シスプラチン、 カルボプラチン、 ネダプラチン、 パク リタキセル、 ドセタキセル、 エストラムスチン等が挙げられる。
ホルモン療法剤としては、 例えば副腎皮質ホルモン薬 （例、 プレドニゾロン、 プレドニゾン、 デキサメタゾン、 酢酸コルチゾン等) 、 エストロゲン薬 (例、 ェ ストラジオ一ノレ、 ェチニノレエス トラジオール、 ホスフェストローノレ、 クロ口 トリ ァニセン等) 、 抗エストロゲン薬 (例、 ェピチォスタノール、 メピチォスタン、 タモキシフェン、 クロミフェン等） 、 黄体ホルモン薬 （例、 力プロン酸ヒ ドロキ シプロゲステロン、 ジドロゲステロン、 メ ドロキシプロゲステロン、 ノルェチス テロン、 ノルェチンドロン等） 、 LHRH誘導体 （例、 酢酸リュープロレリン等） 等 が挙げられる。
免疫療法剤としては、 例えば微生物又は細菌成分 （例、 ムラミルジペプチド誘 導体、 ピシバニール等） 、 免疫増強活性のある多糖類 （例、 レンチナン、 シゾフ イラン、 クレスチン等) 、 遣伝子工学的手法で得られるサイ ト力イン (例、 イン ターフェロン、 インターロイキン 2 (IL-2) 、 インターロイキン 1 2 (IL - 12)、 腫瘍壌死因子 （TNF) 等） 、 コロニー刺激因子 （例、 顆粒球コロニー刺激因子、 エリスロポエチン等） 等が挙げられる。
更に、 動物モデルや臨床で悪液質改善作用が認められている薬剤、 即ち、 シク ロォキシゲナーゼ阻害剤 （例、 インドメタシン等） 〔Cancer Research 第 49卷 、 5935〜5939頁、 1989年〕 、 プロゲステロン誘導体 （例、 メゲステロールァセテ ート） journal of Clinical Oncology, 第 12卷、 213〜225頁、 1994年〕 、 糖質 ステロイ ド （例、 デキサメサゾン等） 、 メトクロプラミ ド系薬剤、 テトラヒドロ カンナビノール系薬剤 （文献は何れも上記と同様） 、 脂月お代謝改善剤 （例、 エイ コサペンタエン酸等） [British Journal of Cancer, 第 68卷、 314〜318頁、 199 3年〕 、 成長ホルモン、 I G F— 1、 あるいは悪液質を誘導する因子である T N F _ a、 L I F、 I L _ 6、 オンコスタチン Mに対する抗体等も上記化合物と併 用することができる。
( 2 ) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある
) は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中の本 発明のタンパク質の定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量などに使用す ることができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液およぴ標識化された本発明のタンパク質とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタ ンパク質の割合を測定 することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
(ϋ) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体およぴ標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶ィ匕担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する 上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端 に反応する抗体であ ることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノ クローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行な えるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗 体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あ るいは F a b画分を用いてもよレ、。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これ を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ れば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィム ノメ トリック法おょぴサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異 I1生の点 で、 後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔 〕 、 〔14c〕 などが用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ；8—ガラクトシダーゼ、 β—グ ルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素 酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォ レツセンイソチォシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ル ミノール、 ルミノール誘導体、 ノレシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さ らに、 抗体あるレ、は抗原と標識剤との結合にビォチンーァビジン系を用いること もできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常タ ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定ィヒするのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある いはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって もよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 ま た、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタンパク 質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応お ょぴ 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発 明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好まし くは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメ トリック法あるいはネフロメ トリーなどに用いることができる 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F )と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレングリコ ール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメ トリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリ一な どが好適に用いられる。 これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構 築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを 参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオイムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 |PJ書 Vol. 73 (I膽 unochemica 1 Techniques (Part B) )、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) ) 、 同 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D : Selected Immunoassays) ) 、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Antibodies a nd General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniqu es (Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカァ ミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することに よって、 本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、 例えば大腸癌、 乳 癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 S萃臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌 （ 好ましくは、 乳癌、 前立腺癌など） である、 または将来罹患する可能性が高いと 診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパク質 の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用 することができる。
(3) 遺伝子診断薬
本発明の DNAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ 、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジ一など) における本発明のタンパ ク質またはその部分ぺプチドをコードする DN Aまたは mRN Aの異常 （遺伝子 異常） を検出することができるので、 ί列えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるレ、は発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの增加あるいは発現過多 などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明の DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハ イブリダィゼーシヨンや PCR— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) ， 第 5 卷， 874〜 879頁 （1 989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ノレ ·アカデミー ·オフ、、 ·サイェンシィズ ·ォプ ·ユーエスエー (Proceedings of the Nations丄 Academy of Sciences of the United States of America) ， ¾ 86卷， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することができ る。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンにより発現過多が検出された場合や PCR-S S CP法により DNAの突然変異などが検出された場合は、 例えば大 腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 8萃臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍な どの癌 （好ましくは、 乳癌、 前立腺癌など） である可能性が高いと診断すること ができる。 (4) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の DN Aに相補的に結合し、 該 DN Aの発現を抑制することができる本 発明のアンチセンスポリヌクレオチド fま低毒性であり、 生体内における本発明の タンパク質または本発明の DNAの機肯 (例、 脂肪酸延長活性、 細胞増殖促進活 性など） を抑制することができるので、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状 腺癌、 萃臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤として使 用することができる。 好ましくは、 乳癌、 前立腺癌などの予防 ·治療剤である。 また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは癌細胞のアポトーシスを促進す るため、 例えば、 アポトーシス促進剤として使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤、 促進剤として使用 する場合、 自体公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロゥ ィルスべクタ一、 アデノウイノレスベクター、 アデノウイノレスァソシエーテツドウ ィルスべクタ一などの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトま たは哺¥し動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチセンスポ リヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために捕助剤などの生理学 的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ドロゲルカテーテルのよ うなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾル化して吸入剤として 気管内に局所投与することもできる。
さら【こ、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目的 に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担体と ともに製斉 IJ (注射剤） 化し、 静脈、 皮下等に投与してもよい。
該ァンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなど^:より差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンス ポリヌク レオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k g ) においては、 —日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0 . 1〜1 0 O m g投与する。 さら【こ、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブと して使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコードす る R N Aの一部を含有する二重鎖 R NA、 本発明のタンパク質をコードする R N Aの一き [5を含有するリポザィムなども、 本発明の遺伝子の発現を抑制することが でき、 生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられる D N Aの機能を抑制することができるので、 例えば、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立 腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌 、 甲状腺癌、 腾臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤 （ 好ましくは、 乳癌、 前立腺癌などの予防 ·治療剤） 、 アポトーシス促進剤などと して使用することができる。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷， 494頁， 2001年） に準じて 、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7卷， 221頁 , 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造する ことができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする R N Αの一部に公知の リボザィムを連結することによつて製造することができる。 本発明のタンパク質 をコードする R N Aの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され得る本 発明の R N A上の切断部位に近接した部分 （R NA断片).が挙げられる。
上記の二重鎖 R N Aまたはリボザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場合
.ポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる
( 5 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓 癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫 瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤 （例、 ワクチンなど） として 使用することができる。 好ましくは、 乳癌、 前立腺癌などの予防 ·治療剤である 。 また、 本発明の抗体は、 例えば、 アポトーシス促進剤として使用することもで ぎる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防.治療剤、 促進剤は低毒性であり、 そ のまま液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 (例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して 経口的または非経口的 （例、 血管内投与、 皮下投与など） に投与することができ る。 好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。 本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物とし て投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体および その塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであ つても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形とし て提供さ; ^る。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が用 いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射 剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調整で きる。 注射剤の調整方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはその塩を通 常注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁または乳化する ことによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブド ゥ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 80、 HC0- 50 (polyoxyethylene (50mol) adduct oi hydrogenatea castor oil) 〕 等と併用 してもよレ、。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶解補助 剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用してもよい。 調製され た注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好ましい。 直腸投与に用いられ る坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調 製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には锭剤 ( 糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 ( ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このよ うな組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる担 体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤として は、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。 上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤が挙げ られる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜50 Omg程度、 とりわけ注射剤では 5〜 100 m g程度、 その他の剤形では 1 0〜250mg程 度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防 ·治療剤、 調節剤の投与量は、 投与対象、 対 象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の乳癌の予防 •治療のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0.01
〜2 Omg/k g体重程度、 好ましくは 0. 1〜1 Omg/k g体重程度、 さら に好ましくは 0. l〜5mg/k g体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与 および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重 い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬糸且成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または非経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形として提 供される。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
(6 a) 本発明の 「ELOVL 2の活性阻害作用を有する化合物またはその塩を 含有してなる癌の予防 ·治療剤」 および 「ELOVL 2の発現阻害作用を有する 化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 .治療剤」 について
「EL〇VL 2の活性阻害作用を有する化合物」 は、 ELOVL 2の活性阻害 作用を有する化合物であればいかなるものでもよく、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌 、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防 ·治 療剤 （好ましくは、 乳癌、 前立腺癌などの予防 ·治療剤） 、 アポトーシス促進剤 などとして用いられる。 「ELOVL 2の発現阻害作用を有する化合物」 は、 ELOVL 2の発現阻害 作用を有する化合物であればいかなるものでもよく、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌 、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 睦臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防-治 療剤 （好ましくは、 乳癌、 前立腺癌などの予防 ·治療剤） 、 アポトーシス促進剤 などとして用いられる。
該予防 ·治療剤、 促進剤は、 上記と同様にして製造される。
(6 b) 本発明の 「Staufen homolog 2の活性阻害作用を有する化合物またはそ の塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤」 および 「Staufen horaolog 2の発現阻害 作用を有する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤」 について rstaufen hohiolog 2の活性阻害作用を有する化合物」 は、 Staufen homolog 2 の活 1生阻害作用を有する化合物であればいかなるものでもよく、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌 、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌 の予防 ·治療剤、 アポトーシス促進剤などとして用いられる。
rstaufen homolog 2の発現阻害作用を有する化合物」 は、 Staufen homolog 2 の発現阻害作用を有する化合物であればいかなるものでもよく、 例えば大腸癌、 乳癌、 癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌 、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 藤臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌 の予防 ·治療剤、 アポトーシス促進剤として用いられる。
該予防 ·治療剤、 促進剤は、 上記と同様にして製造される。
(7) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明の 外来性 DNAと略記する） またはその変異 DN Α (本発明の外来性変異 DNAと 略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 (2) 非ヒ ト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒ ト哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフヱクシヨン法 、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキ ストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作出することが できる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用する こともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法によ り融合させることにより本発明の D N A転移動物を作出することもできる。 非ヒ ト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ 、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも 、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57 BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6C 3 F 系統， BDFi 系統， B 6 D 2 Fi系統, BALBZc系統， I CR系統など) またはラット ( 例えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる糸且換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒ トなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒ ト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 .抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば 、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への 置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DNAとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DNAを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る DNAなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラク トとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒ ト D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高!/、本発明の D N Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草 菌由来のプラスミ ド、 酵母由来のプラスミ ド、 λファージなどのバタテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイノレス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミ ドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好 ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （1)ウィルス (例、 シミアンウィルス、 サイ トメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモー ター、 （2)各種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター 、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 ァノレブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋 クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチオン S—トランス フェラーゼ、 血小板由来成長因子 ]3、 ケラチン K1, 1：10ぉょび1^14、 コラ 一ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ ]3 Iサブ ユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナト リウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略され る） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素 （N a， K一 ATP a s e ) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロ ティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H- r a s 、 レニン、 ドーパミン B—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （ΤΡΟ) 、 ぺ プチド鎖延長因子 la (EF- 1 a) 、 βァクチン、 および ]3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 T h y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント 、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋ひァクチン、 プレプロエンケフアリン A 、 バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現 することが可能なサイ トメガロウィルスプロモーター、 ヒ トペプチド鎖延長因子
1 a (EF- 1 a) のプロモーター、 ヒ トおよぴニヮトリ j3ァクチンプロモータ 一などが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV4 0タ一ミネタ一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5 ' 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 ' 下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒ トまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の月干 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAラ イブラリーよりゲノム DN Aの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変 異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D N Aコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞およぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D N Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D NAが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来"生 D N Aを過剰に有する 0
導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA転移動物を用いて、 本発明 のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明おょぴこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患に 対する予防 ·治療剤、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝 臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳 腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤のスクリ一ユング試験にも 利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D N Aを前述のプラス ミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D N Aコン ストラタ卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞おょぴ 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明のタ ンパク質の増加症状を有すること力 ら、 本発明のタンパク質または機能不活性型 不応症に対する予防 ·治療剤、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 腌 臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防'治療剤のスクリーニング 試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の禾 ϋ用可能性として、 例 えば、
(1)組織培養のための細胞源としての使用、
(2)本発明の D N A転移動物の組織中の D NAもしくは R T Aを直接分析するか 、 または D N Αにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本発明の タンパク質により特異的に発現あるいは活性化するぺプチドとの関連性について の解析、
(3) D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用 して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(4)上記（3)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスク リーユング、 および
(5)本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、.糸田切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した D N A転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法おょぴ定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物ま たは本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク質が関連す る疾患の DNA治療法を検討、 開発することが可能である。
(8) ノックァゥト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞おょぴ本 発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DN Aがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン H生である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒ ト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の; S—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN Αに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒ ト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺 ¾動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーユング方法を提供する。
本亮明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒ ト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒ ト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DNA配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェクソンの機能を破壌することに より本発明のノックァゥト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性ィヒされた非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 ES細胞または本発明のノックアウト ES細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒ ト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェクソン部分にネオマイシン耐性遗伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z (j8—ガラク トシダーゼ遺伝子 ) 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表 とするレポータ一遺伝子等を挿入することによりェクソンの機能を破壊する力、 あるいはェクソン間のィントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列 （ 例えば、 p o 1 y A付加シグナルなど) を挿入し、 完全なメッセンジャー RNA を合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した D N A配列を有する DN A鎖 （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について 本発明の DNA上あるいはその近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイブ リダイゼーシヨン解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とター ゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配 列をプライマーとした PCR法により解析し、 本発明のノックアウト E S細胞を 選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Eva nsと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの E S細胞の場合、 現在、 一般的には 1 29系の E S細胞が使用されているが、 免疫 学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景 が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 5781^/6マゥスゃ 57 B L/6の採卵数の少なさを DBA/2との交雑により改善した B D Fェマ ウス （C 57 BLZ6と DBAZ2との を用いて樹立したものなども良好 に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利 点に加えて、 C 57 B L/6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた E S細胞は病態モデルマゥスを作出したとき、 C 57BLZ6マウスとバッククロ スすることでその遺伝的背景を C 57 BL/ 6マウスに代えることが可能である 点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 P C R法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる 。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要し ていたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数 （約 50個） で済むので、 培養 初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再ぴクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培'養することが必要である。 例え ば、 S T O繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で L I F (l〜10000U/ml ) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または 5 %酸素、 5 %炭酸ガス、 90 %空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で培養し 、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001〜0.5%トリプシ ン /0. l〜5raM EDTA, 好ましくは約 0.1%トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞 化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このよ うな継代は、 通常 1〜 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に 異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種 々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufra an, Nature 第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル 'ォブ 'ェ ンブリオロジー 'アンド .ェクスペリメンタノレ .モノレフォロジ一、 第 87卷、 27頁 、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化させて得られる本発明の DNA発現不全細 胞は、 インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用 である。
本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と 別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマゥス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクターの本発明の DNAが不活†¾化された DNA配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の DNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DNAを ノックアウトさせることができる。
本発明の DN Aがノックァゥトされた細胞は、 本発明の DN A上またはその近 '傍の D NA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析またはター ゲソティングベクター上の D NA配列と、 ターゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本^ S明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ ヱニック非ヒ ト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。 ( 8 a ) 本発明の D N Aの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防 ·治療効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷など に起因する疾病に対して予防 ·治療効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病、 例えば癌などに対して予防 ·治療効果を有する化 合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒ ト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが あげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し 、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を 指標として試験化合物の予防 ·治療効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓 癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または 血液腫瘍などの癌に対して予防 ·治療効果を有する化合物をスクリ一ユングする 場合、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、 試験化合 物非投与群と癌の発症度合レ、の違！/、や癌の治癒度合！/、の違レ、を上記組織で経時的 に観察する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましく は約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して予防 ·治療効 果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こさ れる疾患に対して予防 ·治療効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒性な 予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリー二 ングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例 、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸 付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 (例えば、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 (例えば、 酢酸、 ギ酸、 プ ロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用 レ、られる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） の乳癌患者においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100 m g、 好ましくは約 1. 0〜 50 m g、 より好ましくは約 1. 0〜 20 m g投与 する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患 などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60 k gとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜1 0mgを 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O k g当 たりに換算した量を投与することができる。
(8 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合 物をスクリーユング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポータ一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポータ一遺伝 子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 β—ガラク トシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ エラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レボータ一遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする D NA領域の一部を大腸菌由来の j3 一ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明のタ ンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに ーガラタトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4一クロロー 3—インドリル一 |3 一ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような 0—ガラクトシダーゼの基質とな る試薬を'用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩?夜 （P B S ) で洗浄後、 X _ g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近 で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を 1 mM E D T A/ P B S 溶液で洗浄することによって、 /3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観 察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする m R N Aを検出しても よい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 アル力 リ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が 好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化 水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン 酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コノヽク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安 息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質の発現の阻害、 該タンパク質の機能を阻害することができる ので、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 脾臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌ま たは血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造すること ができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまた は哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害する 化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） の乳癌患者に おいては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜 5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omg投与する。 非経口的に投与する場 合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例 えば、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物を注射剤の形 で通常成人 （60 k gとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日につき該化合物 を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好まし くは約 0. 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに対 するプロモータ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注 入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異 的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる 。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発 現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での産生 能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系と して使 用できる。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC - IUB Co 讓 ission on Biochemical Nomenclature による略号あるレヽは当該分野における 慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シトシン
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸
d ATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
S D S ドデシノレ硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 パリン
L e u ロイシン I 1 e イソロイシン
S e r セリン
Th r スレ才ニン
C y s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グノレタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g ァノレギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエニノレアラ-ン
T y r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グノレタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
S e c セレノシステ ン (selenocysteine) また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基おょぴ試薬を下記の記号で表記 する。
Me メチル基
E t ェチノレ基
B u プチル基
P h フヱニル基
T C チアゾリジン- 4 (R) —カルボキサミ ド基
T o s P _ -ノレ
CHO ホノレミノレ B z 1 ベンジノレ
Cl2 - Bzl 2， 6ージク口口べンジノレ
B om ベンジルォキシメチル
Z ベンジノレ才キシ力ノレボニノレ
C 1— z 2—クロ口ペンジノレオキシカルボ二ノレ
B r— Z 2一プロモべンジノレオキシカノレボニノレ
B o c t一ブトキシカノレボニノレ
DNP ジニト口フエニル
T r t トリチル
Bum tーブトキシメチノレ
F m o c N— 9 _フルォレニルメ トキシカルボ二ノレ
HOB t 1ーヒ ドロキシベンズト リ アゾーノレ
HOOB t 3， 4—ジヒ ドロー 3—ヒ ドロキシー 4ーォキソ一
1, 2, 3—べンゾトリァジン
HONB 卜ヒ ドロキシ- 5-ノルボルネン- 2， 3-ジカルポキシイミ ド DCC N, N' —ジシクロへキシノレカルポジイミ ド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
E LOVL 2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有する ELOVL 2をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
E LOVL 2をコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号： 6〕
実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
実施例 4で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 1〕
実施例 4で用いられたコントロールォリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 12〕
実施例 4および 5で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
実施例 4および 5で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 5〕
実施例 7で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
S T AU 2のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 7〕
配列番号： 16で表されるアミノ酸配列を有する STAU 2をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
STAU2をコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 9〕
実施例 1 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号： 20〕
実施例 1 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
実施例 1 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
実施例 12で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
実施例 13で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
実施例 13で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
実施例 1 3で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 26〕
実施例 13で用いられたコントロールオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
以下において、 実施例により本発明をより具体的にするが、 この発明はこれら に限定されるものではない。 実施例 実施例 1
(1) 変異型 p53ベクターの構築
野生型 p53の翻訳開始コドン ATGの Aから数えて 524番目の塩基を Gから Aに置換し たフォヮ一ド側およびリバース側のプライマー （配列番号： 4および配列番号： 5) を作製した。 野生型 p53 (WTp53) (Genbank Accession No. AF136270) を pc DNA3.1ベクター （Invitrogen) の Bam HI - Eco RIサイトに組み込み、 pcDNA3.1 - W Tp53ベクターを得た。 この pcDNA3.1- WTp53ベクターを鎳型として、 上記 2種類の プライマーを使用し、 QuikChange™ Site- Directed Mutagenesis Kit (STRATAGEN E)を用いて変異型 p53 (MTp53) 遺伝子を作製した。 方法は添付プロトコールに従 つた。 これを Bam HI と Eco RIで制限酵素処理し、 同酵素で処理した pIND vector (Ecdysone -丄 nducible Mammalian Expression System unvitrogen)に添付)に組 み込み、 pIND- MTp53 vectorを得た。 この変異型 p53は、 175番目のアミノ酸配列 力 アルギニン （R) からヒスチジン（H)に置換している。 コントロールとして野 生型 p53遺伝子を pIND vectorに組み込んだ PIND-WTp53 vectorも調製した。 もう 一つのコントローノレとして CAT (ク口ラムフエニコーノレァセチノレトランスフェラ ーゼ） が糸且み込まれた pIND- CAT vector (invitrogen)も使用した。 ( 2 ) 変異型 p53遺伝子発現制御細胞の構築
p53が欠失している肺がん由来細胞株 H1299 (ATCC) を 6cmシャーレに 4xl05個播 種し、 一晚培養後、 Fugene6を用いて、 添付プロトコールに従い、 上記 （1 ) で 得られた pIND- MTp53 vector, PIND-WTp53 vector, pIND-CAT vectorを、 pVgRXR vector し licdysone - Inducible Mammali n Expression System (Invitrogen) に 添付〕 と co- transfectionした。 ジヱネティシン （GIBC0 BRL) と Zeosin (Invitr ogen) により、 それぞれの遺伝子の導入細胞株 H1299- MTp53、 H1299- WTp53、 およ ぴ H1299- CATを選択した。 これら H1299- MTp53、 H1299- WTp53の安定発現株は、 5μ Μの Muristerone A (Invitrogen) 添加で、 それぞれ、 MTp53およぴ WTp53の発現 が誘導されることを、 抗 p53抗体 （Oncogene) を用いてウェスタンブロッテイン グ法で確認した。
( 3 ) GeneChip解析
変異型 p53によって発現誘導される遺伝子群を明らかにするため、 5μΜ Murist erone Aを添加後、 48時間後の H1299- MTp53、 H1299- WTP53、 H1299-CATから調製し た total RNAを材料とし、 GeneChip (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U9 5E; Affymetrix社） を用いて遺伝子発現解析を行った。 また、 23種類の正常組織 から抽出された total RNA (表 1 ) を材料とし、 同様に遺伝子発現解析を行った 。 実験方法は、 Affymetrix社の実験手引き書 （Expression analysis technical manual) こ従つ 7こ。 ' その結果、 変異型 p53の発現を誘導した H1299細胞 （H1299- MtP53 (48hr) ) にお いて、 野生型 p53の発現を誘導した H1299細胞および CATの発現を誘導した H1299細 胞 [H1299-Wtp53 (48hr)および H1299- CAT (48hr)〕 に比較し、 発現が増加して いる遺伝子として EL0VL2遺伝子を見出した。 この遺伝子は脳、 精巣以外の正常組 織では、その発現量が検出限界以下であった （表 2 ) 。
RNAを抽出した組織 販冗元
小腸 し lontech社
Clontech社
脂肪 BioChain Institute社
骨格筋 Clontech社
心臓 Clontech社
Clontech社
Clontech社
肝臓 Clontechf±
膝臓 Clontech社
脾臓 Clontech社
Clontech社
肺 Clontech社
全脳 Clontech社
小脳 Clontech社
胸腺 Clontech社
乳腺 Clontech社
唾液腺 Clontech社
Clontech社
BioChain Institute社
大腸 BioChain Institute千土
子宮 Clontech社 子宮頸 BioChain Institute社
Clontech社 表 2
組織 遺伝子発現
小腸 ND
前立腺 ND
脂肪 ND
骨格筋 ND
心臓 ND
ND
副腎 ND
肝臓 ND
ND
脾臓 ND
ND
肺 ND
全脳 1. 5
小月 ¾ 2. 5
胸腺 ND
乳腺 ND
唾液腺 ND
ND
ND
大腸 ND
子宮 ND
子宮頸 ND
6. 6
H1299-Mtp53 (48hr) 2. 6 H1299-Wtp53 (48hr) 0. 9
H1299-CAT _ (48hr) 0. 8
a遺伝子発現量は、 Genechipで発現が検出された全遺伝子の発現量の中央値を 1と して標準化した。
ND ; not detected 実施例 2
ヒト大腸がん、乳がんぉよぴ肺がん組織における EL0VL2遺伝子発現量の検討 ヒト大腸がん、乳がんおよび肺がん組織由来の cDNA (Biochain社） および健常 人大腸、 乳腺おょぴ肺組織由来 first- strand cDNA (Clontech社） を铸型として 用い、 EL0VL2遺伝子発現量の検討を行った。 なお、 これらのサンプルは事前に β -ァクチン遺伝子発現量で補正した。 2種類のプライマー （配列番号： 6および 配列番号： 7 ) を用いて PCR反応を行うことにより、 がん組織と正常組織での EL0 VL2遺伝子の発現量比較を行った。 その結果、 EL0VL2遺伝子はヒト大腸がん、乳が んおよび肺がん組織でそれぞれの正常組織に比較し、 顕著に発現が亢進している 患者が認められた。 実施例 3
( 1 ) 動物細胞発現ベクターの構築
Genbank匪— 017770に記載されている EL0VL2遺伝子の配列を基にして 2種類の プライマー (配列番号： 8および配列番号： 9 ) を作成し、 pyrobest DNA polym erase (宝酒造） を用いて 5 μ M Muristerone Aを添加した H1299 - MTp53 から調製 した cDNAを錶型として PCRを行レ、 DNA断片を得た。 この遺伝子断片おょぴ pCDNA3. 1 (+) plasmid (Invitrogen)を、 制限酵素 EcoRVおよび Notlで切断し、 TaKaRa Liga tion Kit Ver. 2 (宝酒造）を用いて結合させ、 得られたプラスミ ド DNAを公知の方 法により大腸菌 DH5aに導入し、 形質転換体 (クローン) を得た。 この形質転換 体からプラスミ ドを抽出しシークェンサ一 （Applied Biosystem社： ABI3100) を 用いてィンサート部分の塩基配列を確認し、 動物細胞発現ベクター pCDNA3. 1 (+) - EL0VL2を構築した。 ( 2 ) EL0VL2遺伝子による細胞増殖効果
6ゥヱルプレートに、 ヒト乳がん細胞株 MCF7 (ATCC)、 ヒト肺がん細胞株 H1299 ( ATCC)を 1. lxlO5個ずつ播種し、 一晚培養後、 FuGene6 (Roche)を用いて添付のプ 口トコールに従い、 上記で得られた pCDNA3. 1 (+) - EL0VL2および pCDNA3. l (+) _LacZ (Invitrogen)を導入した。 ー晚培養後、 ジヱネティシン （Invitrogen)を培地に カロえて 6日間培養した。 その後、 細胞を 6cmシャーレに播種しなおして、 さらにジ ュネティシンを添加した培地で 3週間細胞を培養した。 PBSで洗浄後、 10%中性フ オルマリン溶液 （和光純薬） にて室温で 30分間固定し、 PBSで洗浄した。 その後 に、 クリスタルバイオレツ ト (SIGMA) 溶液 (クリスタルバイオレツ 卜が 10%に なるようエタノールで溶解し、 それを PBSで 100倍に希釈したもの） で細胞を室温 で 2時間染色し、 蒸留水にて洗浄し風乾させた。 染色された細胞の面積を ImagPro アプリケーション（Media Cybernetics社）で測定した。
その結果、 MCF7細胞に pCDNA3. 1 (+) - LacZを導入した群の面積を 100%とすると 、 pCDNA3. 1 (+) - EL0VL2を導入した群の面積は 170% (Pく 0. 01) であった。 H1299細 月包に pCDNA3. 1 (+) -LacZを導入した群の面積を 100%とすると、 pCDNA3. 1 (+) - ELOVL 2を導入した群の面積は 130% (P<0. 01) であった。 実施例 4
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞死
EL0VL2遺伝子のアポトーシスに及ぼす影響を解析するために、 EL0VL2アンチセ ンスオリゴヌクレオチド導入実験を行った。
まず、 配列番号： 3で表される塩基配列に対するアンチセンス （配列番号： 1 O ) を設計後、 phosphorothioateィ匕オリゴヌクレオチドを合成し、 H P L C精製 して導入実験に用いた （Amersham Pharmacia Biotech) 。 コントロールオリゴヌ クレオチドとしては配列番号： 1 0で示される塩基配列のリバース配列 （配列番 号： 1 1 ) を同様に phosphorothioate化し、 HPLC精製して用いた （Amersham Pha rmacia Biotech; 0
被験細胞として乳がん細胞株 MCF7 (大日本製薬） を用い、 オリゴヌクレオチド 導入前日に 1· 5X104個の細胞を 24ゥエルプレート （Falcon社） に播種した。 オリ ゴヌクレオチド導入には OligofectAMINE (Invitrogen社） を使用し、 そのプロト コールに従った。 導入後 20時間で RNeasy mini kit (Qiagen社） のプロトコール ίこ従って R N Aを f由出し、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied B iosystem社） を用いて c D N Aを調製した。 2種のプライマー （配列番号： 1 2 および配列番号： 1 3 ) を用いて EL0VL2遺伝子の発現量を、 また補正のために Ta qMan human β -actin control reagent (Applied Biosystem社) を用レヽて /3ァク チン発現量を見ることとし、 ABI7700 (Applied Biosystem社） マニュアルに従い PCRを行った。 EL0VL2遺伝子の発現量を測定する際の該反応における反応液の組 成は、 SYBR PCR Master Mix (Applied Biosystem社） を 7. 5 μ 1、 上記で調製し た cDNAテンプレートを滅菌蒸留水で 3倍に希釈したものを 5 1、 2種のプライマ 一 （配列番号： 1 2および配列番号： 1 3 ) を各 0. 5 ί Μとなるように加え、 15 1の液量とした。 PCR反応は、 50°C2分、 95°C10分の後、 95°C15秒、 60°C1分のサイ クルを 40回繰り返した。 EL0VL2遺伝子の発現量は j8ァクチン発現量で補正して比 較した。
一方、 アポトーシスに及ぼす影響はアンチセンスオリゴヌクレオチド導入後 3 日目に Cell death detection ELISA (Roche社） を用いてコントロールオリゴ導 入サンプルと比較した。
その結果、 アンチセンスオリゴ導入後 20時間で EL0VL2の発現 （R NA) はコン トロール （リバース） オリゴヌクレオチド導入時 （100%) に比べ 56%に減少し ていた。 また、 導入後 3日目でのアポトーシスはコントロール （100%) に比べ 21 0%に増加していた。
これより、 EL0VL2の発現を抑制するとがん細胞はアポトーシスを起こして細胞 死を起こすことが確認、された。 実施例 5
( 1 ) EL0VL2高発現 MCF- 7細胞株の取得
6ゥエルプレートに、 ヒ ト乳がん細胞株 MCF-7 (ATCC)を 1. lxlO5個播種した。 一 晚培養後、 FuGene6 (Roche社） を用いて、 実施例 3で得られた pcDNA3. 1 (+) - EL0VL 2を導入した。 ー晚培養後、 ジエネティシン （Invitrogen社） を培地に加え 3日間 培養した。 その後、 細胞を回収し希釈して 96ゥヱルプレート 15枚に播種しなおし 、 3日毎に培地交換を行った。 15日後にシングルコロニーを形成している 96細胞 株を 24ゥエルプレートに 2ゥエルずつ播種しなおし、 さらに 6日間培養した。
2ゥエルに播種した細胞のうち 1ゥエルから細胞を回収し、 RNeasy mini kit (Q iagen社） を用いて添付のプロトコールに従って RNAを抽出し、 TaqMan Reverse T ranscription Reagents (Applied Biosystem社) 用いて cDNAを調製した。 2種 のプライマー （配列番号： 12および配列番号： 13) を用いて EL0VL2遺伝子の発現 量を、 まにネ |U£のために TaqMan human β -actin control reagent (Applied Bio system社） を用いて |3ァクチン発現量を見ることとし、 ABI7700 (Applied Biosy stem社） のマニュアルに従い PCRを行った。 EL0VL2遺伝子の発現量を測定する際 の該反応における反応液の組成は、 SYBR PCR Master Mix (Applied Biosystem 社） を 7. 5 μ 1、 上記で調製した cDNAテンプレートを滅菌蒸留水で 3倍に希釈した ものを 5 ^ 1、 2種のプライマー （配列番号： 12および配列番号： 13) を各 となるように加え、 15 / lの液量とした。 PCR反応は、 50°C2分、 95°C10分の後、 9 5°C15秒、 60°C1分のサイクルを 40回繰り返した。 EL0VL2遺伝子の発現量は ァク チン発現量で補正して比較した。 この結果、 MCF— 7細胞株と比較して、 26倍、 34 倍の EL0VL2高発現を示す細胞株を 2株選択し、 それぞれ MCF7- EL0VL2- C2および MCF 7-EL0VL2-C12と命名した。
( 2 ) EL0VL2高発現 MCF- 7細胞株での細胞増殖能の亢進
上記実施例 5 ( 1 ) で作製した MCF7- EL0VL2_C2、 MCF7- EL0VL2- C12および MCF-7 細胞を lxlO2個ずつ 96ゥエルプレートに播種した。 1日後および 7日後に Cell Coun ting Kit- 8 (同仁化学） を用いて、 添付プロトコールに従い、 生細胞数を計測し た。 その結果、 MCF7- EL0VL2- C2および MCF7- EL0VL2- C12細胞では MCF- 7細胞に比較 し、 それぞれ 3. 1倍および 2. 3倍、 細胞増殖速度が亢進していることが確認された
( 3 ) EL0VL2高発現 MCF-7細胞株での足場非依存的な細胞増殖能の亢進 W
86
D-MEM培地 （invitrogen社） 粉末を通常より 2倍濃い濃度で滅菌水に溶解し、 2 XD- MEM培地を作製した。 これに 1. 2%ァガロース （BMA社） 溶液を等量加え、 終 濃度 0. 6%ァガロース /1XD- MEM培地を作製し、 6ゥェルプレートに 3mlずつ分注し 、 室温で 15分間静置し、 0. 6%寒天培地を作製した。 上記実施例 5 ( 1 ) で作製 した MCF7—EL0VL2-C2、 MCF7- EL0VL2- C12およぴ MCF- 7細胞を 1. 2xl04個ずつ懸濁し た 2XD- MEM培地に、 0. 7%ァガロース （BMA社） 溶液を等量加え （終濃度 0. 35%ァ ガロース） 、 先に作製した 0. 6%寒天培地上に 3mlずつ分注し、 室温で 15分間静置 し 0. 35%寒天培地を作製した。 これを 37°C、 5%C02インキュベータ内で 3週間培 養し、 形成されたコロニーの大きさ、 数、 培地の色を調べることでコロニー形成 肯 とした。
その結果、 MCF7- EL0VL2- C2および MCF7 - EL0VL2- C12は、 MCF7細胞に比較し、 コ ロニー形成能が亢進していることが確認された。 実施例 6
EL0VL2高猪現 MCF- 7細胞株での APKのリン酸化の亢進
実施例 5 ( 1 ) で作製した MCF7 - EL0VL2- C2、 MCF7 - EL0VL2- C12および MCF- 7細胞 を 5X105個ずつ 10cmシャーレに播種した。 4晚培養後、 培地を除きプロテアーゼィ ンヒビタ——として 20mlあたり 1錠の Complete Mini (Roche社) を、 フォスファタ ーゼインヒビターとして 1000分の 1量の PHOSPHATASE INHIBITOR COCKTAIL II (S IGMA)を含む RIPA バッファー （50mM Tris—HCl， 150mM NaCl, 1% Triton - 100， 0 • 1% SDS, 1% Deoxycholic acid) を 200 / 1ずつ添加し、 細胞をはがし 1. 5mlの エツペンチューブに入れた。 これを 4°Cで緩やかにローテーションさせながら 30 分間インキュベーションした後、 15000rpmで 10分間遠心し、 上清を得た。 上清か ら一部を取り、 BCA Protein Assay Kit (PIERCE社） を用いて添付プロトコール に従いタンパク含量を測定した。 残りの上清に Lae讓 li Sample Buffer (BI0 - RAD ) を加え、 95°Cで 3分間インキュベートした。 タンパク量をそろえたサンプルを 、 常法に従い SDS - PAGE、 Western blottingを行った。 Blottingされたメンプレン は定法に従いブロッキングした後、 一次抗体は抗マウス抗リン酸ィヒ MAPK抗体 （Sa nta Cruz; で、 一次 JTL体は peroxidase - con iugated 抗マウス IgG 体 (Jackson. I 讓 noReserch社） で反応させ、 検出は ECL Western Blotting Detection System (Amersham社） で行った。 定法に従い、 同メンプランを strippingした後、 一次 几体は抗ラビット MAPKf几体 (Santa Cruz; で、 二次抗体は peroxidase- conjugate d抗ラビット IgG抗体 （Jackson. ImmunoReserch社） で反応させ、 検出は ECL West ern Blotting Detection System (Amershamネ土） で行った。 その結果、 MCF—7糸田胞 に比較し、 MCF7- EL0VL2- C2および MCF7- EL0VL2-C12では、 MAPKのリン酸化が亢進 していることが確認された。 実施例 7
( 1 ) FLAG tag付き動物発現ベクターの作製
2種のプライマーを設計 （配列番号： 14および配列番号： 15) し、 実施例 3で得 られた pcDNA3. 1-EL0VL2を templateとし、 ExTaq (宝酒造）を用いた PCR反応を行つ た。 該反応は 94°C 1分の後、 94°C 10秒 、 55°C 30秒、 72°C 1分 30秒のサイクル を 31回繰り返した。 得られた増幅産物を Xbal、 EcoRIで切断し、同酵素で切断した プラスミ ドベクター p3xFLAG- CMV10 (SIGMA社） へ TaKaRa Ligation Kit Ver. 2 ( 宝酒造）を用いて挿入し、 プラスミドベクター p3xFLAG10- EL0VL2を得た。
( 2 ) EL0VL2の脂肪酸延長活性
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株 CH0細胞株 （ATCC) を 10cmディッシュ に 1X106個播種した。 ー晚培養後、 FuGene6 (Roche社） を用いて、 上記 （1 ) で 得られた p3xFLAG10-ELOVL2または p3xFLAG10ベクター （SIGMA社） を導入した。 一 晚培養後、 細胞を回収し、 プロテアーゼィンヒビターとして 20mlあたり 1錠の Com plete Mini (Roche社） を含むバッファー A (10mM Tris- HC1 , 0. 25Mショ糖， ImM EDTA) に懸濁させた。 ポリ トロンホモジナイザーにて細胞を破砕し、 600重力加 速度で 4°Cで 10分間遠心した。 この上清を 10100重力加速]^で 4°Cで 20分間遠心し た。 さらに、 その上清を 126000重力加速度で 30分間遠心した。 得られた沈澱を 20 mlあたり 1錠の Complete Mini (Roche社） を含むバッファー B (50mM Tris-HCl, ImM EDTA, 20%グリセ口ール） で懸濁し、 これを酵素源とした。
基質脂肪酸として 100 /i M 5， 8, 11， 14, 17-eicosapentaenoic acidを含む脂肪酸 延長活性反応液 〔50mMリン酸化力リゥム /水酸化ナトリゥム（pH6. 5)、 5 Μ ロテ ノン （和光純薬） 、 100 μ Μ CoA (和光純薬） 、 ImM ATP、 lmM NADPH、 ImM塩化マ グネシゥム、 Ι μ ΐ 185kBq [2- 14C] -マロ-ル CoA (Amerchaiu Bioscience社） 〕 を調整し、 37°Cで 1分間インキュベートした。 その後、 上記酵素源をタンパク質 量として 50 /z g加え、 攪拌後、 37°Cで 20分間インキュベートした。 該反応液の総 量は ΙΟΟ μ Ιとした。 該反応液に、 10%メタノールを含む 5Μ K0H (和光純薬） を 10 Ο μ ΐ添カ卩し、 65°Cで 1時間インキュベート後、 5M HC1を ΙΟΟ μ Γ添加し、 さらに 100 β ΐ エタノールを添加、 攪拌した。 最後にへキサン 500 1を添加し、 激しく懸 濁し、 上層のへキサン 400 1を分別して、 シンチレーター Α (和光純薬） 30mlを 含む標準バイアル瓶に加えて攪拌した。 液体シンチレーシヨンカウンター （Alok a社） で14 Cの放射活性を測定した。
その結果、 コントロール （p3xFLAG10ベクターを導入した細胞から調製した酵 素源） と比較して、 P3xFLAG10 - EL0VL2を導入した細胞から調製した酵素源を用い た群では、 3. 8倍の放射活性を示した。 実施例 8
( 1 ) EL0VL2高発現 CH0細胞株の取得
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株 CH0細胞株 (ATCC) を 10cmディッシュ に lxlO6個播種した。 ー晚培養後、 FuGene6 (Roche社） を用いて、 実施例 7 ( 1 ) で得られた p3xFLAG10_EL0VL2ベクターまたは p3xFLAG10ベクター （SIGMA社） を 導入した。 ー晚培養後、 500 /^/πι1のジエネティシン （invitrogen社） を含む培 地に交換し、 更に 1週間培養を行い、 EL0VL2の安定発現 CH0細胞株を得た。 更にこ れを限外希釈法により、 モノクローナル細胞株を作製し、 CH0-EL0VL2細胞株と命 名した。
( 2 ) ハイスループット EL0VL2酵素活性測定法の構築
プロテアーゼィンヒビターとして 20mlあたり 1錠の Complete Mini (Roche社） を含むバッファー B (50mM Tris-HCl, ImM EDTA, 20%グリセロール） に上記 （ 1 ) で作製した CH0-EL0VL2細胞を懸濁させた。 ソニケーシヨンにて細胞を破砕し 、 600重力加速度で 4°Cで 10分間遠心し上清を得た。 この細胞抽出液を酵素源とし た。
基質脂肪酸として 100^ M 5, 8, 11， 14, 17 - eicosapentaenoic acidを含む脂肪酸 延長活性反応液 〔50m リン酸化力リゥム /水酸ィ匕ナトリウム （pH6.5) 、 5/ M 口 テノン （和光純薬） 、 100 μΜ CoA (和光純薬） 、 ImM ATP、 ImM NADPH, ImM塩化 マグネシウム、 Ιμΐ 185kBq [2 -14 C]-マロ-ル CoA (Amercham Bioscience社） 〕 を調整し、 この反応液 90 μΐを 96ゥヱルプレートに分注し、 37°Cで 1分間インキ ュペートした。 その後、 上記酵素源をタンパク質量として 15 g (10 μ ΐ) 加え攪 拌した後、 37°Cで 60分間インキュベートした。 その後、 トリクロ口酢酸を 4%と なるように加え、 攪拌した。 この反応生成物を Harvexter (Packard) を用いて Un ifilter- 96 GF/C (Packard) で回収し、 microscinti- 20 (ParkinElmer) を 20 L加え、 攪拌後 TopCount (Packard) により14 Cの放射活性を測定した。
その結果、 コントロール （p3xFLAG10ベクターを導入した細胞から調製した酵 素源） と比較して、 p3xFLAG10 - EL0VL2を導入した細胞から調製した酵素源を用い た群では、 5.2倍の放射活性を示し、 実施例 7で測定した延長活'卜生と同等以上の 感度を持つことが確認できた。
(3) EL0VL2の脂肪酸延長活性の基質特異性
実施例 8 ( 1 ) で得られた EL0VL2高発現 CH0細胞株由来の細胞キ由出液を用いて 、 実施例 8 (2) のハイスループット EL0VL2酵素活性測定法を使用し、 cis- 5, 8， 11, 14, 1 /-eicosapentaenoic acid、 cis-7, 10, 13, 16, 19-docosapentaenoic acid 、 cis-5, 8, 11, 14-eicosatetraenoic acid、 Arachinonyl - CoA、 cis - 7， 10, 13， 16 - d ocosatetraenoic acid、 および cis- 5， 8, 11 - eicosatrienoic acidを基質として EL 0VL2の脂肪酸延長活性を測定した。
これより、 上記脂肪酸は、 EL0VL2の基質であることがわかった。 実施例 9
スクリ一ニンク、'
実施例 8 (2) の方法で得られた細胞抽出液を酵素液としてスクリーニング実 験を行う。
基質脂肪酸として 100 /z M 5， 8， 11, 14, 17 - eicosapentaenoic acidを含む脂肪酸 延長活性反応液 〔50mMリン酸化力リゥム /水酸化ナトリウム （ρΗ6· 5) 、 5 μ Μ 口 テノン （和光純薬） 、 100 μ Μ CoA (和光純薬） 、 ImM ATP、 ImM NADPH、 ImM塩ィ匕 マグネシウム、 1 μ 1〕 を調製し、 この反応液 90 μ 1を 96ゥエルプレートに分注 、 37°Cで 1分間インキュベートする。 ここで、 上記酵素液 ΙΟ μ ίおよび試験化合 物の DMF溶液 2 /z Lを添加する。 最後に l ^u L 185kBq [2_14C]-マロニル CoA (Amerc ham Bioscience社） を混和することにより EL0VL2酵素反応を開始し、 37°Cで 60分 間インキュベートする。 その後、 トリクロ口酢酸を 4%となるように加え、 攪拌 後、 反応生成物を Harvexter (Packard) を用いて Un:if ilter-96 GF/C (Packard ) で回収し、 microscinti - 20 (ParkinElmer) 添加、 攪拌後、 TopCount (P ackard) により14 Cの放射活性を測定する。
試験化合物を含まない DMF液を添加した場合の活性を 100とし、 50%阻害濃度 （ IC5。値） を求めることができる。 より低い IC5。値を与える化合物を、 本発明のタ ンパク質の活性を阻害する化合物として選択する。 実施例 1 0
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞死
被験細胞細胞として EL0VL2をほとんど発現していない大腸がん細胞株 SW480、 前立腺がん由来細胞株 LNCap細胞および EL0VL2を発現している前立腺がん由来細 胞株 PC- 3を用いて、 実施例 4と同様の方法で、 EL0VL2のアンチセンスオリゴヌク レオチドのアポトーシスに及ぼす影響を検討した。
その結果、 MCF7細胞と同様、 PC-3細胞でもアポトーシス効果による細胞死が認 められたが、 EL0VL2をほとんど発現していない SW480細胞、 LNCap細胞ではこのよ うなアポトーシス効果による細胞死は認められなかった。 実施例 1 1
( 1 ) 変異型 P53ベクターの構築
野生型 p53の翻訳開始コドン ATGの Aから数えて 524番目の塩基を Gから Aに置換し たフォヮ一ド側およびリパース側のプライマー （配列番号： 1 9およぴ配列番号 : 2 0 ) を作製した。 野生型 p53 (WTp53) (Genbank Accession No. AF136270) を pcDNA3. 1ベクター （Invitrogen) の Bam HI- Eco RIサイトに組み込み、 pcDNA3 . 1 - WTp53ベクターを得た。 この pcDNA3. 1- WTP53ベクターを铸型として、 上記 2種 類のプライマーを使用し、 QuikChange™Site- Directed Mutagenesis Kit (STRAT AGENE)を用いて変異型 p53 (MTp53) 遺伝子を作製した。 方法は添付プロトコール に従った。 これを Bam HI と Eco RIで制限酵素処理し、 同酵素で処理した pIND ve ctor (Ecdysone— Inducible Mammalian Expression System (invitrogen) ίこ添 fT) に組み込み、 pIND - MTp53 vectorを得た。 この変異型 p53は、 175番目のアミノ酸 配列が、 アルギニン （R) からヒスチジン（H)に置換している。 コントロールとし て野生型 p53遺伝子を pIND vectorに組み込んだ pIND-WTp53 vectorも調製した。 もう一つのコントローノレとして CAT (クロラムフエニコーノレァセチノレトランスフ エラーゼ） が組み込まれた pIND- CAT vector (invitrogen)も使用した。 ( 2 ) 変異型 p53遺伝子発現制御細胞の構築
p53が欠失している肺がん由来細胞株 H1299 (ATCC) を 6cmシャーレに 4xl05個播 種し、 一晩培養後、 Fugene6を用いて、 添付プロトコールに従い、 上記 （1 ) で 得られた pIND_MTp53 vector, pIND - WTp53 vector, pIND- CAT vectorを、 pVgRXR vector 〔Ecdysone - Inducible Mammalian Expression System (Invitrogen) に 添付〕 と co-transfectionした。 ジエネティシン （GIBC0 BRL) と Zeosin (Invitr ogen) により、 それぞれの遺伝子の導入細胞株 H1299-MTp53、 H1299_WTp53、 およ ひ Ή1299 - CATを選択した。 これら H1299- MTp53、 H1299 - WTp53の安定発現株は、 5μ Μの Muristerone A (Invitrogen) 添加で、 それぞれ、 MTp53およぴ WTp53の発現 が誘導されることを、 抗 p53抗体 （Oncogene) を用いてウェスタンブロッテイン グ法で確認した。
( 3 ) GeneChip解析
変異型 p53によって発現誘導される遺伝子群を明らかにするため、 5 Μ Murist erone Aを添加後、 48時間後の H1299- MTp53、 H1299- WTp53、 H1299- CATから調製し た total RNAを材料とし、 GeneChip (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U9 5E; Affymetrix社） を用いて遺伝子発現解析を行った。 また、 23種類の正常組織 から抽出された total RNA (表 3 ) を材料とし、 同様に遺伝子発現解析を行った 実験方法は、 Affymetrix社の実験手弓 Iき書 (Expression analysis technical manual) ίこ従つ 7こ。
その結果、 変異型 ρ53の発現を誘導した H1299細胞 （H1299- Mtp53 (48hr) ) にお いて、 野生型 p53の発現を誘導した H1299細胞おょぴ CATの発現を誘導した H1299細 胞 [H1299-Wtp53 (48hr)および H1299-CAT (48hr)〕 に比較し、 発現が増加してい る遺伝子として STAU2遺伝子を見出した。 この遺伝子は正常組織では、ぞの発現量 が検出限界以下であった （表 4 ) 。 表 3
RNAを抽出した組織 販冗元
小腸 し lontech社
前立腺 し丄 ontechネェ
脂肪 BioChain Institute干: t
骨格筋 Clontech社
心臓 Clontech社
し lontech社
Clontech社
肝臓 Clontech社
Clontech社
脾臓 Clontechf土
Clontech社
肺 し lontech社
Clontech社
小脳 し lontech社
胸腺 Clontech社
乳腺 し lontech社 唾液腺 Clontech社
し丄 ontechf土
BioChain Institute社 大腸 BioChain Institute社 子宮 Clontech社
子宮頸 BioChain Institute社
Clontech社 表 4
組織 遺伝子発現量 a
小腸 ND
前立腺 D
脂肪 ND
骨格筋 ND
心臓 ND
ND
ND
肝臓 ND
ND
脾臓 ND
ND
肺 ND
全脳 ND
小脳 ND
胸腺 ND
乳腺 ND
唾液腺 ND
ND
ND 大腸 ND
子宮 ND
子宮頸 ND
ND
H1299- Mtp53 (48hr) 0. 9
H1299-Wtp53 (48hr) ND
HI 299- CAT __ (48hr) ND
a遺伝子発現量は、 Genechipで発現が検出された全遺伝子の発現量の中央値を 1と して標準化した。
ND; not detected 実施例 1 2
ヒ ト乳がん matched pairにおける STAU2遺伝子発現量の検討
ヒ ト乳がん患者の癌組織および正常組織由来の matched pair cDNA (Clontech 社） を铸型として用い、 STAU2遺伝子発現量の検討を行った。 2種類のプライマ 一 （配列番号： 2 1および配列番号： 2 2 ) を用いて PCR反応を行うことにより 、 がん組織と正常組織での STAU2遺伝子の発現量比較を行つた。
その結果、 STAU2遺伝子の癌組織での発現が、 正常組織に比較し顕著である患 者が確認された。 実施例 1 3
( 1 ) 動物細胞発現ベクターの構築
Genbank BC008369に記載されている STAU2遺伝子の配列を基にして 2種類のプ ライマー （配列番号： 2 3および配列番号： 2 4 ) を作成し、 pyrobest DNA pol ymerase (宝酒造） を用いて 5 /z M Muristerone Aを添加した H1299_MTp53 から調 製した cDNAを錶型として PCRを行い DNA断片を得た。 この遺伝子断片および pCDNA3 . K+) plasmid (Invitrogen)を、 制限酵素 EcoRVおよび Notlで切断し、 TaKaRa Li gation Kit Ver. 2 (宝酒造）を用いて結合させ、 得られたプラスミ ド DNAを公知の 方法により大 S昜菌 DH5ひに導入し、 形質転換体 （クローン） を得た。 この形質転 換体からプラスミドを抽出しシークェンサ一 （Applied Biosystem社: ABI3100) を用いてィンサート部分の塩基配列を確認し、 動物細胞発現ベクター PCDNA3. 1 (+ ) - STAU2を構築した。 ( 2 ) STAU2遺伝子による細胞増殖効果
6ゥエルプレートの各ゥヱルに、 ヒト肺癌細胞株 H1299 (ATCC)を 1. lxlO5個ずつ 播種し、 24時間培養後、 FuGene6 (Roche)を用いて添付のプロトコールに従い、 上記 （1 ) で得られた pCDNA3. 1 (+) _STAU2および pCDNA3. 1 (+) - LacZ (Invitrogen ) を導入した。 24時間培養後、 ジエネティシン （Invitrogen) を培地に加えて 6 日間培養した。 その後、 細胞を 6cmシャーレに播種しなおして、 さらにジエネテ イシンを添加した培地で 3週間細胞を培養した。 PBSで洗浄後、 10%中性フオルマ リン溶液 （和光純薬） にて室温で 30分間固定し、 PBSで洗浄した。 その後、 タリ スタルバイオレツト（SIGMA)溶液 （クリスタルバイオレットが 10%になるようェ タノールで溶解し、 それを PBSで 100倍に希釈したもの） で細胞を室温下、 2時間 染色し、 蒸留水にて洗浄し風乾させた。 染色された細胞の面積を ImagProアプリ ケーシヨン（Media Cybernetics社）で測定した。 その結果、 H1299細胞に pCDNA3. 1 (+) - LacZを導入した群の面積を 100%とすると、 pCDNA3. 1 (+) - STAU2を導入した群 の面積は 110% (Pく 0. 01) であった。 このことから STAU2遺伝子は細胞増殖能を促 進させることが確認された。 実施例 1 4
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞死
STAU2遺伝子のアポトーシスに及ぼす影響を解析するために、 STAU2アンチセン スオリゴヌクレオチド導入実験を行った。
まず、 配列番号： 1 8で表される塩基配列に対するアンチセンス （配列番号： 2 5 ) を設計後、 phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、 HPLC精製し て導入実験に用いた （Amersham Pharmacia Biotech) 。 コントロールオリゴヌク レオチドとしては、 配列番号： 2 5で表される塩基配列のリバース配列 （配列番 号： 2 6 ) を同様に phosphorothioate化し、 HPLC精製して用いた （Amersham Pha rmacia Biotech) 。
被験細胞として肺癌細胞株 A549 (大日本製薬） を用い、 オリゴヌクレオチド導 入前日に、 3. 3X103個の細胞を 96ゥエルプレート （Falcon社） に播種した。 オリ ゴヌクレオチド導入には OligofectAMINE (Invitrogen社） を使用し、 そのプロト コールに従った。 アンチセンスオリゴヌクレオチド導入後 3日目に Cell death d etection ELISA (Roche社） を用いてコントロールオリゴ導入サンプルと比較し た。 アポトーシスはコントロール （100%) に比べ 167%に増加していた。
これより、 STAU2の発現を抑制することにより、 癌細胞はアポトーシスを起こ して、 細胞死を起こすことが確認された。 産業上の利用可能性
本発明で用いられるタンパク質は、 癌細胞に特異的に発現し、 癌の診断マーカ 一であり、 したがって、 該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 該 タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 大腸癌、 乳 癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 睦臓癌、 脳重瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の 予防 ·治療剤として安全に使用することができる。 好ましくは、 乳癌、 前立腺癌 などの予防 ·治療剤である。 さらに、 該タンパク質の活性を阻害する化合物また はその塩、 該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 例えば 、 アポトーシス促進剤として安全に使用することもできる。
また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドや抗体は、 本発明で用いられる タンパク質の発現を阻害することができ、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌
、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲 状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤 （好ま しくは、 乳癌、 前立腺癌などの予防'治療剤） として、 あるいはアポトーシス促 進剤として安全に使用することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻害する 化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドをコードするポリヌクレオ チドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含 有するアンチセンスポリヌクレオチド。
4 . 配列番号： 1 0で表される塩基配列を有する請求項 3記載のアンチセンスポ リヌクレオチド。
5 . 請求項 3記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
6 . 癌の予防 ·治療剤である請求項 5記載の医薬。
7 . 請求項 3記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
8 . 癌の診断薬である請求項 7記載の診断薬。
9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体
1 0 . 請求項 9記載の抗体を含有してなる医薬。
1 1 . 癌の予防 ·治療剤である請求項 1 0記載の医薬。
1 2 . 請求項 9記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 3 . 癌の診断薬である請求項 1 2記載の診断薬。
1 4 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレ ォチドを含有してなる癌の診断薬。
1 5 . 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌ま たは血液腫瘍である請求項 1、 請求項 2、 請求項 6または請求項 1 1記載の予防
1 6 . 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌ま たは血液腫瘍である請求項 8、 請求項 1 3または請求項 1 4記載の診断薬。
1 7 . E L O V L 2の活性を阻害する作用を有する化合物またはその塩を含有し てなる癌の予防 ·治療剤。
1 8 . E L O V L 2の発現を阻害する作用を有する化合物またはその塩を含有し てなる癌の予防 ·治療剤。
1 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる ことを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング方法。
2 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有す ることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット。
2 1 . 請求項 1 9記載のスクリーニング方法または請求項 2 0記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤。
2 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリ一二ング方法。
2 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレ ォチドを含有することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット
2 4 . 請求項 2 2記載のスクリーニング方法または請求項 2 3記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤。
2 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を 阻害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス促進剤。
2 6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻害す る化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス促進剤。
2 7 . 請求項 3記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなるアポトーシ ス促進剤。
2 8 . 請求項 9記載の抗体を含有してなるアポトーシス促進剤。
2 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる ことを特徵とするアポトーシス促進剤のスクリーニング方法。
3 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドをコードするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリ一二ング方法。
3 1 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または該タンパク質の遺伝子 の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の 予防 ·治療方法。
3 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を 阻害する、 または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌の 予防 ·治療方法。 ， 3 3 . 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはそ の部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または該タ ンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用。
3 4 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性 を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
3 5 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻害 する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
3 6 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配歹 Uまたはその一部 を含有するァンチセンスポリヌクレオチド。
3 7 . 配列番号： 2 5で表される塩基配列を有する請求項 3 6記載のアンチセン スポリヌクレオチド。
3 8 . 請求項 3 6記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
3 9 . 癌の予防 ·治療剤である請求項 3 8記載の医薬。
4 0 . 請求項 3 6記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
4 1 . 癌の診断薬である請求項 4 0記載の診断薬。
4 2 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドまたはその塩に対する 抗体。
4 3 . 請求項 4 2會己载の抗体を含有してなる医薬。
4 4 . 癌の予防 ·治療剤である請求項 4 3記載の医薬。
4 5 . 請求項 4 2記載の抗体を含有してなる診断薬。
4 6 . 癌の診断薬である請求項 4 5記載の診断薬。
4 7 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌク レオチドを含有してなる癌の診断薬。
4 8 . 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 月 ¾JS瘍、 卵巣癌ま たは血液腫瘍である請求項 3 4、 請求項 3 5、 請求項 3 9または請求項 4 4記載 の予防 ·治療剤。
4 9 . 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 月 ¾腫瘍、 卵巣癌ま たは血液腫瘍である請求項 4 1、 請求項 4 6または請求項 4 7記載の診断薬。 5 0 . Staufen homolog 2の活性を阻害する作用を有する化合物またはその塩を 含有してなる癌の予防 ·治療剤。
5 1 . Staufen homolog 2の発現を阻害する作用を有する化合物またはその塩を 含有してなる癌の予防 ·治療剤。
5 2 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用い ることを特 =ί毀とする癌の予防 ·治療剤のスクリ一二ング方法。
5 3 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有 することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット。
5 4 . 項 5 2記載のスクリーニング方法または請求項 5 3記載のスクリーニング 用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤。
5 5 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドをコードするポリヌク レオチドを用いることを特^ [とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング方法。 5 6 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌク レオチドを含有することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キッ
5 7 . 請求項 5 5記載のスクリーニング方法または請求項 5 6記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤。
5 8 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性 を Ρ且害する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス促進剤。
5 9 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドの遺伝子の発現を阻害 する化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス促進剤。
6 0 . 請求項 3 6記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなるアポトー シス促進剤。
6 1 . 請求項 4 2記載の抗体を含有してなるアポトーシス促進剤。
6 2 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と伺一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用い ることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニング方法。
6 3 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌク レオチドを用いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーユング方法。 6 4 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または該タンパク質の遺伝 子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌 の予防 ·治療方法。
6 5 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性 を阻害する、 または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌 の予防 ·治療方法。
6 6 . 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは その部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または該 タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用。
PCT/JP2003/008036 2002-06-26 2003-06-25 癌の予防・治療剤 WO2004002514A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003244191A AU2003244191A1 (en) 2002-06-26 2003-06-25 Preventives/remedies for cancer
EP03761796A EP1552845A4 (en) 2002-06-26 2003-06-25 SUBSTANCES FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF CANCER
US10/519,325 US20060189518A1 (en) 2002-06-26 2003-06-25 Preventing/remedies for cancer

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-186815 2002-06-26
JP2002186799 2002-06-26
JP2002-186799 2002-06-26
JP2002186815 2002-06-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004002514A1 true WO2004002514A1 (ja) 2004-01-08

Family

ID=30002293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/008036 WO2004002514A1 (ja) 2002-06-26 2003-06-25 癌の予防・治療剤

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20060189518A1 (ja)
EP (1) EP1552845A4 (ja)
AU (1) AU2003244191A1 (ja)
WO (1) WO2004002514A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9393263B2 (en) 2011-06-03 2016-07-19 Allergan, Inc. Dermal filler compositions including antioxidants
WO2013144325A1 (en) * 2012-03-28 2013-10-03 Katholieke Universiteit Leuven Fatty acid elongation enzymes as targets for cancer diagnostics and therapeutics

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000070945A2 (en) * 1999-05-20 2000-11-30 Karolinska Innovations Ab Fatty acid elongation genes and uses thereof
WO2001042467A2 (en) * 1999-12-08 2001-06-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
WO2001053312A1 (en) * 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001053454A2 (en) * 2000-01-21 2001-07-26 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to g protein-coupled receptor-like polypeptides and polynucleotides
WO2001060860A2 (en) * 2000-02-17 2001-08-23 Millennium Predictive Medicine, Inc. Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
WO2001066733A1 (fr) * 2000-03-07 2001-09-13 Chiba-Prefecture Sequences d'acides nucleiques presentant une expression accrue dans le neuroblastome benin par rapport au neuroblastome humain acritique
WO2002008401A2 (en) * 2000-07-24 2002-01-31 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
WO2002044320A2 (en) * 2000-11-29 2002-06-06 Xenon Genetics Inc. Human elongase genes and uses thereof
WO2002059377A2 (en) * 2001-01-24 2002-08-01 Protein Design Labs Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
WO2002062975A2 (en) * 2001-02-08 2002-08-15 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human elongase hselo1-like protein
WO2002062974A2 (en) * 2001-02-08 2002-08-15 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human elongase hselo1-like protein
WO2002081638A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Origene Technologies, Inc Prostate cancer expression profiles
WO2002086443A2 (en) * 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
WO2002099122A1 (en) * 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis, Inc. Modifiers of the p53 pathway and methods of use
WO2002102235A2 (en) * 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000070945A2 (en) * 1999-05-20 2000-11-30 Karolinska Innovations Ab Fatty acid elongation genes and uses thereof
WO2001042467A2 (en) * 1999-12-08 2001-06-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
WO2001053312A1 (en) * 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001053454A2 (en) * 2000-01-21 2001-07-26 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to g protein-coupled receptor-like polypeptides and polynucleotides
WO2001060860A2 (en) * 2000-02-17 2001-08-23 Millennium Predictive Medicine, Inc. Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
WO2001066733A1 (fr) * 2000-03-07 2001-09-13 Chiba-Prefecture Sequences d'acides nucleiques presentant une expression accrue dans le neuroblastome benin par rapport au neuroblastome humain acritique
WO2002008401A2 (en) * 2000-07-24 2002-01-31 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
WO2002044320A2 (en) * 2000-11-29 2002-06-06 Xenon Genetics Inc. Human elongase genes and uses thereof
WO2002059377A2 (en) * 2001-01-24 2002-08-01 Protein Design Labs Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
WO2002062975A2 (en) * 2001-02-08 2002-08-15 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human elongase hselo1-like protein
WO2002062974A2 (en) * 2001-02-08 2002-08-15 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human elongase hselo1-like protein
WO2002081638A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Origene Technologies, Inc Prostate cancer expression profiles
WO2002086443A2 (en) * 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
WO2002099122A1 (en) * 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis, Inc. Modifiers of the p53 pathway and methods of use
WO2002102235A2 (en) * 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUCHNER G. ET AL.: "Identification of a novel homolog of the drosophila staufen protein in the chromosome 8q13-q21.1 region", GENOMICS, vol. 62, no. 1, 1999, pages 113 - 118, XP004444758 *
CAMARGO A.A. ET AL.: "The contribution of 700,000 ORF sequence tags to the definition of the human transcriptome", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, no. 21, 2001, pages 12103 - 12108, XP002973909 *
DATABASE GENBANK [online] 15 November 2001 (2001-11-15), TRACY A.: "Human DNA sequence from clone RP1-62D2 on chromosome 6", XP002973907, Database accession no. (AL121955) *
DUCHAINE T.F. ET AL.: "Staufen2 isoforms localize to the somatodendritic domain of n eurons and interact with different organelles", J. CELL SCI., vol. 15, no. 16, 15 August 2002 (2002-08-15), pages 3285 - 3295, XP002973908 *
LEONARD A.E. ET AL.: "Identification and expression of mammalian long-chain PUFA elongation enzymes", LIPIDS, vol. 37, no. 8, August 2002 (2002-08-01), pages 733 - 740, XP008011236 *
MARION R.M. ET AL.: "Human sequence homologue of staufen is an RNA-binding protein that is associated with polysomes and localizes to the rough endoplasmic reticulum", MOL. CELL BIOL., vol. 19, no. 3, 1999, pages 2212 - 2219, XP002919425 *
See also references of EP1552845A4 *
STRAUSGERG R.L. ET AL.: "Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, no. 26, 11 December 2002 (2002-12-11), pages 16899 - 16903, XP002245220 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1552845A4 (en) 2006-06-07
EP1552845A1 (en) 2005-07-13
AU2003244191A1 (en) 2004-01-19
US20060189518A1 (en) 2006-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007004692A1 (ja) 非小細胞肺がんの予防・治療剤および診断薬
WO2005097204A1 (ja) 癌の予防・治療剤
WO2003055506A1 (fr) Medicaments pour la prevention et le traitement du cancer
WO2007010628A1 (ja) 癌の予防・治療剤
WO2004002514A1 (ja) 癌の予防・治療剤
JP2003245076A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004222539A (ja) 新規な癌遺伝子、該癌遺伝子由来の組換えタンパク質、およびそれらの用途
JP4530631B2 (ja) 新規タンパク質および癌の予防・治療剤
JP2004217634A (ja) がんの予防・治療剤
WO2005061704A1 (ja) 癌の予防・治療剤
WO2004058817A1 (ja) 新規タンパク質およびその用途
JP4353697B2 (ja) がんの予防・治療剤
JP2004105171A (ja) 癌の予防・治療剤
WO2002033071A1 (fr) Polypeptides analogues a la survivine et leurs adn
WO2006101273A1 (ja) 癌の予防・治療剤
WO2004058969A1 (ja) がんの予防・治療剤
WO2004024760A1 (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
WO2003087155A1 (fr) Nouvelle proteine et son adn
WO2003097686A1 (fr) Nouvelle proteine, son adn et utilisation associee
WO2004018678A1 (ja) 癌の予防・治療剤
JP2004121245A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
WO2004039407A1 (ja) アポトーシス誘導剤
JP2004290177A (ja) 新規タンパク質およびその用途
WO2004055185A1 (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004075675A (ja) 骨・関節疾患の予防・治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006189518

Country of ref document: US

Ref document number: 10519325

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003761796

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003761796

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10519325

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003761796

Country of ref document: EP