WO2004001414A1 - Nanoparticules magnetiques fluorescentes - Google Patents

Nanoparticules magnetiques fluorescentes Download PDF

Info

Publication number
WO2004001414A1
WO2004001414A1 PCT/FR2003/001884 FR0301884W WO2004001414A1 WO 2004001414 A1 WO2004001414 A1 WO 2004001414A1 FR 0301884 W FR0301884 W FR 0301884W WO 2004001414 A1 WO2004001414 A1 WO 2004001414A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
particles
particles according
fluorescent
nanoparticles
magnetic
Prior art date
Application number
PCT/FR2003/001884
Other languages
English (en)
Inventor
Abdelhamid Elaissari
Thierry Delair
Raphaël VEYRET
Bernard Mandrand
Christian Pichot
Mohammed Sabor
Original Assignee
bioMérieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by bioMérieux filed Critical bioMérieux
Priority to AU2003260611A priority Critical patent/AU2003260611A1/en
Publication of WO2004001414A1 publication Critical patent/WO2004001414A1/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles

Definitions

  • the technical field of the invention is that of colloidal supports, used in particular as a solid support for the transport of biological molecules. More specifically, the present invention relates to magnetic and fluorescent particles with a diameter of between 50 and 1000 nm, colloidal suspensions of such particles, as well as diagnostic, therapeutic or prophylactic compositions containing such particles.
  • international patent application WO 91/09141 describes a process for manufacturing such particles, said particles comprising a fluorescent polymer core, coated with a metal oxide layer, the assembly being coated with a protective polymer layer. If these particles have the advantage of being isodispersed, they remain a large size (greater than 1 ⁇ m), which promotes their sedimentation and have a small developed surface.
  • US patent 4,724,094 describes fluorescent magnetic particles, obtained by encapsulation of fluorescent pigments and magnetic powder with a layer of resin. However, the size of these particles thus obtained remains large (greater than one micron). In addition, the presence of metal oxide near the fluorescent groups can affect the fluorescence of the particle obtained.
  • the hydrodynamic diameter of the particles is determined by light scattering using a Malvern Zetasizer 3000 HS apparatus, (Malvem Instrument, UK). The measurement is carried out for an infinitely diluted dispersion in a 1 mM NaCl solution and at 20 ° C. This method makes it possible to determine the mean hydrodynamic diameter of the particles to plus or minus 5%, which means that their mean diameter by volume is defined to plus or minus approximately 5%.
  • the term “immobilized” designates any type of interaction, such as electrostatic interactions, complexations, specific, non-specific interactions, molecular reactions, physical adsoiption allowing immobilization. Immobilization can therefore be carried out by any means.
  • Another subject of the invention consists of a diagnostic reagent comprising at least one conjugate as defined above, as well as the diagnostic compositions comprising such a reagent.
  • the particles according to the invention in addition to being magnetizable or magnetic and having an average diameter of between 50 and 1000 nm, have the advantage of having improved visibility and resistance to photoextinction.
  • the fluorescent molecules, also called fluorophores, present in the particles are protected by the polymer matrix of the fluorescent nanoparticles, which makes it possible to increase their stability in the face of aggressions from the laser beam in particular during measurements of fluorescence.
  • These nanoparticles are immobilized, advantageously chemically grafted, on the surface of the nanosphere.
  • the magnetizable inorganic nanoparticles are based on metal oxides, such as iron oxides, magnetite, hematite, ferrites such as manganese, nickel, manganese-zinc ferrites, cobalt and nickel alloys , iron oxides being particularly preferred
  • the organic and / or inorganic nanospheres in which the magnetizable inorganic nanoparticles are distributed in a homogeneous manner, and on which the fluorescent nanoparticles are chemically grafted can, for example, be nanospheres of type (I) comprising:
  • the hydrophilic part of the amphiphilic copolymer can be ionic, anionic or cationic, or nonionic; it includes functional groups which are reactive, directly or indirectly.
  • the hydrophobic part is at least partially immobilized on or in the polymer matrix.
  • the immobilization of this hydrophobic part is always at least physical, and more precisely mechanical, of the imprisonment type, and can complement a prior fixation of the hydrophobic part, of chemical or physical nature such as fixation by adsorption, for example.
  • immobilization can result from the following events: the hydrophobic part of the amphiphilic copolymer is adsorbed on the surface of the matrix, then definitively immobilized in the matrix by the hydrophobic polymer;
  • hydrophilic part chosen from acrylic polyacids, polysulfates, polyamines, polyamides, polysaccharides, polycaprolactones and polylactides.
  • composite particles are obtained for which the hydrophobic part of the amphiphilic copolymer is at least partially immobilized on the polymer matrix, as follows: (i) there is a stable and isodisperse starting emulsion consisting two immiscible phases, a hydrophobic phase A consisting of droplets containing magnetizable nanoparticles dispersed in an organic phase containing a surfactant; and a hydrophilic phase B in which phase A is dispersed; (ii) hydrophobic monomers and at least one initiator are introduced into phase B;
  • the amphiphilic polymer is advantageously chosen from those previously mentioned in the description of the composite particles.
  • the decomposition of hydroperoxides generates a hydroxyl and an oxygen radical which will share in one of the phases depending on the nature of the peroxide used.
  • the cationic or anionic nature of the initiator will depend on the cationic or anionic nature of the particle and of the conjugate resulting from the invention, in the absence of functional monomer.
  • the initiating agent is introduced into the hydrophilic phase and enters the hydrophobic phase (a) either simultaneously with the introduction of the hydrophobic monomers (b), or prior to the step of introducing the hydrophobic monomers (c), or subsequently in the step of introducing said hydrophobic monomers.
  • step (iii) and optionally step
  • these nanospheres are functionalized on the surface, preferably by groups chosen from carboxylic groups, primary amine , thiol, hydroxyl, tosyl hydrazine, epoxide, anhydride, which allow grafting of fluorescent nanoparticles, these groups being provided either by a treatment of the surface of the nanospheres, for example chemical by hydrolysis or grafting of functional groups, or by the use of monomers or functionalized initiators, as the case may be, during the preparation of the naonoparticles.
  • the fluorescent nanoparticles used have on the surface at least one function capable of reacting chemically with the functions mentioned above, to allow their fixation.
  • the fluorescent nanospheres have reactive functional groups on the surface such as carboxylic, primary amine, thiol, aldehyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, epoxide, anhydride or receptor groups capable of reacting with at least one ligand.
  • the functionalized particles thus formed will be capable of immobilizing a ligand, for example a biological molecule, such as an antibody, an antibody fragment, a protein, a polypeptide, an enzyme, a polynucleotide, a probe, a primer, a nucleic acid fragment, chemical molecules, such as chemical polymers, drug substances, cage molecules, chelating agents, catalysts, biotin.
  • the present invention also relates to the nanoparticles obtained by filming the film-forming nanoparticles.
  • the present invention also relates to conjugates constituted by composite particles of the invention whose functional groups have reacted, directly or indirectly, with at least one ligand as defined above, as well as their uses.
  • the present invention therefore relates to conjugates consisting of particles - as defined above on which at least one ligand chosen from an antibody, an antibody fragment, a protein, a polypeptide, an enzyme, a polynucleotide, a fragment nucleic acid, a hapten and biotin is immobilized, in particular chemically grafted by reaction with one of the reactive functional groups present on the surface of the fluorescent nanoparticles.
  • said conjugates are used in immunoassays for the detection and / or quantification of proteins, antigens, antibodies in a biological sample or in assays using probe technology for detection and / or the quantification of a nucleic acid fragment in a biological sample.
  • probes for the detection and / or quantification of a nucleic acid in a sample is well known to those skilled in the art and the sandwich hybridization technique may be mentioned by way of illustration.
  • the conjugates of the invention can be used as “priming agents” for an amplification reaction of nucleic acids in a sample, for example by PCR (Polymerase Chain Reaction) or any other amplification technique appropriate, thus allowing the detection and / or quantification of nucleic acids in the biological sample.
  • the conjugates of the invention are capable of carrying a drug substance in a therapeutic or prophylactic composition which comprises said conjugate in association with an appropriate and pharmaceutically acceptable adjuvant and / or diluent and / or excipient, said drug substance being capable of be released in vivo.
  • an appropriate and pharmaceutically acceptable adjuvant and / or diluent and / or excipient said drug substance being capable of be released in vivo.
  • pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 ed., Mack Publishing Co.
  • the antisense oligonucleotides can be strictly complementary to the DNA or RNA target to which they must hybridize, but also not strictly complementary provided that they hybridize to the target. Likewise, they may be antisense oligonucleotides which are unmodified or modified at the level of the inter-nucleotide bonds. All these notions are part of the general knowledge of a person skilled in the art.
  • the average hydrodynamic diameter of the particles is determined by light scattering using Malvern Zetasizer 3000 HS, (Malvem Instrument, UK). The measurement is carried out for an infinitely diluted dispersion in a 1 mM NaCl solution and at 20 ° C.
  • Example 1 Preparation of fluorescent magnetic latex particles functionalized by - COOH functions.
  • al Preparation of magnetic latex nanospheres functionalized by - NH 2 functions.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

L'invention concerne des particules présentant un diamètre moyen compris entre 50 et 1000 nm, de préférence entre 100 et 500 nm, comprenant une nanosphère organique et/ou inorganique dans laquelle des nanoparticules inorganiques magnétisables sont distribuées de manière homogène, caractérisées en ce que des nanoparticules fluorescentes, comprenant une matrice polymère dans laquelle des molécules ou des cristaux fluorescents sont répartis, sont immobilisées en surface de la nanosphère. L'invention a également pour objet les conjugués de telles particules, ainsi que les compositions diagnostiques, thérapeutiques ou prophylactiques les contenant.

Description

NANOPARTICULES MAGNEQUES FLUORESCENTES
Le domaine technique de l'invention est celui des supports colloïdaux, utilisés notamment comme support solide pour le transport de molécules biologiques. Plus précisément, la présente invention concerne des particules magnétiques et fluorescentes d'un diamètre compris entre 50 et 1000 nm, les suspensions colloïdales de telles particules, .ainsi que des compositions diagnostiques, thérapeutiques ou prophylactiques contenant de telles particules.
Les microsphères de type polymère présentent un intérêt comme support, vecteur ou véhicule dans les domaines de l'ingénierie biologique, du diagnostic et de la pharmacie. A cet effet, elles ont été utilisées dans le diagnostic médical comme support solide pour des molécules biologiques. Par rapport aux supports solides traditionnels utilisés dans ces domaines, tels que les tubes, plaques, billes, les particules colloïdales présentent plusieurs avantages notamment parce qu'elles permettent de disposer d'une grande surface pour des interactions spécifiques et parce qu'elles sont facilement modifiables chimiquement pour introduire à leur surface des groupements fonctionnels susceptibles de réagir avec d'autres molécules, par exemple des molécules biologiques telles que des anticorps ou des fragments d'anticorps, des protéines, des polypeptides, des polynucléotides, des acides nucléiques, des fragments d'acides nucléiques, des enzymes ou des molécules chimiques telles que des catalyseurs, des médicaments, des molécules cages, des chélatants. Parmi les particules colloïdales, les latex magnétiques ont suscité un grand intérêt dans le domaine analytique et sont utilisés par exemple comme moyen pour séparer et/ou détecter des analytes, tels que des antigènes, des anticorps, des molécules biochimiques, des acides nucléiques et autres. Les particules composites de type polymère/magnétique sont habituellement classées en trois catégories sur un critère de taille : les petites particules ayant un diamètre inférieur à 50 nm, les grosses particules ayant un diamètre supérieur à 2 μm et les particules intermédiaires d'un diamètre compris entre 50 et 1000 nm. Pour être considérées comme de bons candidats, en particulier pour une application diagnostique, ces particules doivent répondre à certains critères.
D'un point de vue morphologique, il est préférable qu'elles présentent une forme générale sphérique et que la charge magnétique soit répartie de façon relativement homogène dans la matrice polymère. Elles ne doivent pas s'agréger de manière irréversible sous l'action d'un champ magnétique, ce qui signifie qu'elles puissent être redispersées facilement, rapidement et de manière réversible. De même, elles doivent présenter une densité relativement faible pour réduire le phénomène de sédimentation. Avantageusement, elles doivent présenter une distribution granulométrique étroite. On parle encore de particules monodisperses ou isodisperses. Ainsi, en raison de leur taille et de leur densité, les grosses particules magnétiques en suspension dans une phase liquide ont tendance à rapidement sédimenter. Par ailleurs, elles tendent à s'agréger après avoir été soumises à un champ magnétique car elles sont susceptibles d'avoir été de ce fait magnétisées de manière rémanente. On parle d'aimantation rémanente. Elles ne constituent donc pas un bon candidat. A contrario, les petites particules magnétiques ont tendance à rester en suspension du fait de leur mouvement Brownien et sont difficilement attirées, voire pas du tout, par un aimant, en particulier si le champ magnétique appliqué est relativement faible. Elles ne sont donc pas bien appropriées pour les utilisations développées ci-dessus.
On retrouve dans la littérature différents types de particules. On peut citer ainsi les particules Dynal (nom commercial). Ces particules sont des microsphères constituées d'un cœur de polystyrène relativement poreux et d'oxydes de fer, les oxydes de fer ayant été déposés par imprégnation dans les pores disponibles à la surface du polystyrène, et d'une enveloppe de polymère qui encapsule les oxydes de fer des microsphères poreuses. Elles présentent un diamètre respectivement de 2,8 μm (particules M280) et de 4,5 μm (particules M450) et sont relativement uniformes en taille. Elles sont donc considérées comme des particules isodisperses mais en raison de leur taille élevée, un phénomène de sédimentation est rapidement observé. De plus, leur surface spécifique est faible.
La demande de brevet EP 0 390 634 décrit des microsphères composites magnétisables de polymère vinylaromatique réticulé hydrophobe d'un diamètre de l'ordre de 50 à 10000 nm et comprenant un cœur solide constitué de particules magnétisables et une écorce constituée d'un copolymère hydrophobe dérivé d'au moins un monomère vinylaromatique hydrophobe et d'au moins un polymère émulsifiant polyéthyléniquement insaturé soluble dans le ou les monomères vinylaromatiques et susceptible de réticuler avec le ou lesdits monomères. Toutefois, si ces particules présentent l'avantage d'être de petite taille, elles présentent l'inconvénient de ne pas avoir une répartition uniforme de la charge magnétique qui est localisée à l'intérieur du cœur. De plus, le procédé décrit ne permet pas d'obtenir des particules homogènes en taille mais un ensemble de particules polydisperses qui doit être fractionné pour ne retenir que les particules de taille attendue. Enfin, du fait que les particules magnétisables à l'intérieur du cœur solide sont orientées de manière aléatoire et figées dans leur orientation, le moment magnétique résultant des microsphères composites correspond donc à la somme algébrique des moments des particules magnétisables. Une diminution du moment résultant lié à cette distribution aléatoire des particules à l'intérieur du cœur solide est donc observée.
Il peut être également important que ces particules magnétiques soient marquées, notamment par fluorescence, et on retrouve dans l'état de la technique des procédés de fabrication de particules magnétiques fluorescentes.
Ainsi la demande de brevet internationale WO 91/09141 décrit un procédé de fabrication de telles particules, lesdites particules comprenant un cœur polymère fluorescent, enrobé d'une couche oxyde de métal, l'ensemble étant enrobé par une couche polymère protectrice. Si ces particules présentent l'avantage d'être isodisperses, elles restent d'une taille importante (supérieure à 1 μm), ce qui favorise leur sédimentation et présentent une faible surface développée. Le brevet US 4,724,094 décrit des particules magnétiques fluorescentes, obtenues par encapsulation de pigments fluorescents et de poudre magnétique par une couche de résine. Toutefois, la taille de ces particules ainsi obtenues reste importante (supérieure au micron). De plus, la présence d'oxyde de métal à proximité des groupements fluorescents peut affecter la fluorescence de la particule obtenue.
L'art antérieur décrit également des particules d'un diamètre supérieur à 1 μm sur la surface desquelles des molécules fluorescentes comme la streptavidine ou la biotine fluorescéine isothiocyanate (FITC) sont greffées chimiquement. Cependant, l'intensité de fluorescence de telles particules décroît très rapidement, dès les premières minutes d'illumination.
Il apparaît donc que les particules magnétiques et fluorescentes de l'art antérieur ne donnent pas entière satisfaction. Dans ce contexte, un des objectifs de la présente invention est de fournir de nouvelles particules qui soient à la fois magnétisables ou magnétiques et fluorescentes, qui présentent un diamètre moyen compris entre 50 et 1000 nm et qui soient capables d'émettre une intensité de fluorescence relativement stable dans le temps et pendant l'analyse. Les particules selon l'invention présentent en suspension colloïdale une bonne séparation sous l'action d'un champ magnétique, elles sont stables, c'est à dire que les phénomènes d'agrégation ou de sédimentation sont réduits. De plus, elles sont obtenues directement sous la forme d'une dispersion isodisperse, c'est à dire homogènes en taille, de sorte que des étapes ultérieures de fractionnement ne sont pas nécessaires. Selon l'invention, une dispersion colloïdale est dite isodisperse en diamètre hydrodynamique si la distribution en taille mesurée par diffusion de lumière est très resserrée, c'est à dire que toute les particules ont un diamètre moyen compris entre le diamètre moyen de la dispersion plus ou moins 10 nm. Plus la distribution en diamètre est resserrée plus le système est appelé isodisperse ou monodisperse. Aussi, la présente invention a pour objet des particules présentant un diamètre moyen compris entre 50 et 1000 nm, de préférence entre 100 et 500 nm , comprenant une nanosphere organique et/ou inorganique dans laquelle des nanoparticules inorganiques magnétisables sont distribuées de manière homogène. Selon l'invention, des nanoparticules fluorescentes, comprenant une matrice polymère dans laquelle des molécules ou des cristaux fluorescents sont répartis, sont immobilisées en surface de la nanosphere.
Le diamètre hydrodynamique des particules est déterminé par diffusion de lumière en utilisant un appareillage Malvern Zetasizer 3000 HS, (Malvem Instrument, UK). La mesure est réalisée pour une dispersion infiniment diluée dans une solution NaCl 1 mM et à 20°C. Cette méthode permet de déterminer le diamètre hydrodynamique moyen des particules à plus ou moins 5 %, ce qui signifie que leur diamètre moyen en volume est défini à plus ou moins environ 5 % près. Au sens de l'invention, le teπne « immobilisé » désigne tout type d'interactions, telles que des interactions électrostatiques, complexations, interactions spécifiques, non spécifiques, réactions moléculaires, adsoiption physique permettant l'immobilisation. L'immobilisation peut donc être effectuée par tout moyen.
Selon un mode de réalisation préféré, les particules selon l'invention présentent en surface des nanoparticules fluorescentes, des groupements fonctionnels réactifs tels que des groupements carboxylique, aminé, thiol, aldéhyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, époxyde, anhydride ou un récepteur susceptibles de réagir avec au moins un ligand. Dans ce cas, les particules selon l'invention présentent une bonne réactivité pour le greffage chimique ultérieur de biomolécules notamment.
L'invention a également pour objet des conjugués constitués d'une particule telle que définie ci-dessus sur laquelle au moins un ligand, choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un polypeptide, une enzyme, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un haptène et la biotine, est immobilisé, en particulier chimiquement greffé par réaction avec l'un des groupements fonctionnels réactifs présents en surface des nanoparticules fluorescentes.
Un autre objet de l'invention consiste en un réactif pour diagnostic comprenant au moins un conjugué tel que défini ci-dessus, ainsi que les compositions diagnostiques comprenant un tel réactif.
L'invention a également pour objet des conjugués constitués d'une particule telle que définie ci-dessus sur laquelle au moins un ligand, choisi parmi les molécules cages, les agents chélatants et les catalyseurs, est immobilisé en particulier chimiquement greffé par réaction avec l'un des groupements fonctionnels réactifs présents en surface des nanoparticules fluorescentes.
L'invention a également pour objet des conjugués constitués d'une particule telle que définie ci-dessus sur laquelle au moins un ligand, choisi parmi les substances médicamenteuses, les sondes anti-sens, les agents réparateurs de gènes, les agents bloquant ou inhibant une activité protéique, est chimiquement greffé par réaction avec l'un des groupements fonctionnels réactifs présents en surface des nanoparticules fluorescentes. Un autre objet de l'invention consiste en des compositions thérapeutiques ou prophylactiques comprenant un tel conjugué.
Les particules selon l'invention, en plus d'être magnétisables ou magnétiques et de présenter un diamètre moyen compris entre 50 et 1000 nm, ont l'avantage de présenter une visibilité et une résistance à la photoextinction améliorée. En effet, selon l'invention, les molécules fluorescentes, également nommées fluorophores, présentes dans les particules sont protégées par la matrice polymérique des nanoparticules fluorescentes, ce qui permet d'accroître leur stabilité face aux agressions du faisceau laser notamment, lors des mesures de fluorescence. Ces nanoparticules sont immobilisées, avantageusement greffées chimiquement, à la surface de la nanosphere.
De façon avantageuse, les nanoparticules fluorescentes ont un diamètre moyen compris entre 5 et 50 nm. De façon avantageuse, au moins six nanoparticules fluorescentes sont immobilisées en surface de la nanosphere et recouvrent, de préférence, jusqu'à au moins 54 % de la surface de la nanosphere.
La matrice polymère des nanoparticules fluorescentes est, par exemple, en un polymère hydrophobe choisi parmi les homopolymères de monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d'autres comonomères, tels que les acrylates d'alkyle et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 10 atomes de carbone, les esters d'acides éthyléniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, les acides méthacryliques, les dérivés styréniques. On pourra utiliser toute molécule fluorescente, comme la fluorescéine éventuellement substituée, les dérivés de la fluorescéine, par exemple, la fluorescéine isothiocyanate, la 5-carboxy fluorescéine, la 2',7'-difluorofluorésceine (commercialisée sous le nom Orange Green), la bromométhyle-fluorescéine, ou encore la rhodamine, les dérivés de la rhodamine, le succinimidyl de l'acide carboxylique de la trifluoroacétamide (commercialisé sous le nom Rhodamine Green), le 3-acide carboxylique de diéthylaminocoumarine, l'acide acétique de l'hydroxy-méthylcoumarine, le méthacrylate de méthyl d'antracényl (monomère), le 3,8-diméthacryloyl de bromure d'ethidiume (agent de réticulation), le diméthacrylate de la fluorescéine (agent de réticulation), le méthacryloxyéthyl thiocarbamoyl de la rhodamine B (monomère), l'acrylate ou le méthacrylate de 2'-naphthyl (monomère), les dérivés du pyrènes, comme le 1 -pyrénylméthyl méthacrylate (monomère), le thodol et ses dérivés, ou Texas Red, les cristaux CdS et les « quantum dots », nanocristaux fluorescents. On pourra notamment utiliser les particules commercialisées par les sociétés Prolabo ou Molecular Probes, contenant par exemple les groupements fluorescents suivants (excitation/émission) : fluorescent jaune-vert (505/515), fluorescent rouge (580/605), fluorescent bleu (365/415), fluorescent pourpre (625/645), fluorescent rouge foncé (660/680), fluorescent rouge nil (535/575), fluorescent infrarouge (715/755), fluorescent orange (540/560), fluorescent rouge-orange (565/580), fluorescent rouge lointain (690/720), fluorescent bleu- vert (430/465), luminescent europium (365/610), luminescent platine (390/650).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les nanoparticules fluorescentes présentent des propriétés filmogènes, c'est à dire qu'elles sont susceptibles de former un film venant entourer la nanosphere organique et/ou inorganique sur laquelle elles sont immobilisées. La formation du film se fait par simple chauffage à une température entraînant le ramollissement voire la fusion de la matrice polymère des nanoparticules fluorescentes.
Les nanoparticules inorganiques magnétisables sont à base d'oxydes métalliques, tels que les oxydes de fer, la magnétite, l'hématite, les ferrites telles que les ferrites de manganèse, de nickel, de manganèse-zinc, les alliages de cobalt, de nickel, les oxydes de fer étant particulièrement préférés
Avantageusement, les matériaux inorganiques sont choisis parmi les oxydes métalliques magnétisables, préférentiellement les oxydes de fer. La masse des nanoparticules inorganiques magnétisables représentent 5 à 95
%, de préférence 10 à 90 % et avantageusement 20 à 90 % de la masse totale de la particule composite, de préférence 25 à 85 %.
A l'intérieur des particules de l'invention, les nanoparticules inorganiques magnétisables sont avantageusement stabilisées par des agents de stabilisation choisis parmi les chaînes polymère amphiphiles, les agents tensioactifs ioniques ou non ioniques, fonctionnels ou non fonctionnels, polymérisables ou non polymérisables. Les agents tensioactifs fonctionnels sont en particulier choisis parmi les acides gras ou des dérivés d'acides gras, en particulier l'acide oléique ou ses dérivés, et les mélanges d'agents tensioactifs tels que définis précédemment.
Les nanosphères organiques et/ou inorganiques dans lesquelles les nanoparticules inorganiques magnétisables sont distribuées de manière homogène, et sur lesquelles les nanoparticules fluorescentes sont greffées chimiquement peuvent, par exemple, être des nanosphères de type (I) comprenant :
- un cœur essentiellement liquide constitué d'une phase organique dans laquelle les nanoparticules magnétisables sont distribuées et stabilisées, - une enveloppe entourant le cœur liquide, ladite enveloppe comprenant au moins un polymère hydrophile obtenu par polymérisation d'au moins un monomère hydrosoluble.
En particulier le monomère hydrosoluble est un N-alkylacrylamide, un NN- dialkylacrylamide et plus particulièrement le N-isopropylacrylamide (ΝIPAM), le N- méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n-propylacrylamide, le N-n- propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le NN-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropopylacrylamide, le N-méthyl-N-n- acrylamide.
Des nanosphères de type (I) sont, par exemple, décrites dans FR 9914194 auquel l'homme du métier pourra se référer.
Selon un autre aspect de l'invention, on peut utiliser des nanosphères de type (II) comprenant une matrice en un polymère hydrophobe dans laquelle les nanoparticules inorganiques magnétisables sont distribuées, ces nanosphères étant par exemple décrites dans FR 9914195. Le polymère hydrophobe de la nanosphere de type (II) est, par exemple, choisi parmi les homopolymères de monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d'autres comonomères, tels que les acrylates d'alkyle et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 10 atomes de carbone, les esters d'acides éthyléniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, les acides méthacryliques, les dérivés styréniques, les composés diéniques. Préférentiellement, le polymère est un polymère réticulé. Ceci est obtenu en ajoutant dans le ou les monomères une faible quantité (inférieure à 10 % en poids) de molécules ayant au moins deux doubles liaisons réactives, telles que le divinyl benzène, le méthacrylate de vinyle, le cyanurate de triallyle, le diacrylate de mono ou de polyéthylèneglycol.
Selon un mode de réalisation préféré, la matrice en polymère hydrophobe de la nanosphere de type (II) est entourée d'une enveloppe à base d'un polymère hydrophile obtenu par polymérisation d'au moins un monomère hydrosoluble, semblable à celui utilisé dans les nanosphères de type (I) ou bien par un copolymère amphiphile comportant une partie hydrophile et une partie hydrophobe au moins partiellement immobilisée dans ou sur le polymère hydrophobe. Ces dernières nanosphères comportant un copolymère amphiphile d'enveloppe sont nommées de type (III).
Par copolymère amphiphile, on entend un copolymère possédant une partie hydrophobe et une partie hydrophile, étant entendu que la partie hydrophobe et/ou la partie hydrophile peuvent être un ensemble de sous-parties respectivement hydrophobes et/ou hydrophiles constitutives du copolymère amphiphile. Ainsi, un copolymère amphiphile de l'invention est notamment choisi parmi les copolymères en blocs, les copolymères séquences, les polymères ramifiés dont le squelette est hydrophobe ou hydrophile et les ramifications sont respectivement hydrophiles ou hydrophobes, les polymères en peigne dont le squelette est hydrophobe ou hydrophile et les ramifications en peigne sont respectivement hydrophiles ou hydrophobes.
La partie hydrophile du copolymère amphiphile peut être ionique, anionique ou cationique, ou non ionique ; elle comporte des groupements fonctionnels qui sont réactifs, directement ou indirectement.
Selon l'invention, la partie hydrophobe est au moins partiellement immobilisée sur ou dans la matrice polymère. L'immobilisation de cette partie hydrophobe est toujours au moins de nature physique, et plus précisément mécanique, du type emprisonnement, et peut venir compléter une fixation préalable de la partie hydrophobe, de nature chimique ou physique comme une fixation par adsorption, par exemple. Ainsi, une immobilisation peut résulter des événements suivants : la partie hydrophobe du copolymère amphiphile est adsorbée à la surface de la matrice, puis définitivement immobilisée dans la matrice par le polymère hydrophobe ;
- ladite partie hydrophobe est solubilisée dans la phase organique, puis emprisonnée dans le polymère hydrophobe lors de la formation de la matrice ; ladite partie hydrophobe est uniquement emprisonnée mécaniquement lors de la formation de la matrice polymère.
Cette immobilisation conduit à des particules possédant une forte stabilité colloïdale, et notamment bien supérieure à celle des particules connues décrites précédemment.
Un copolymère amphiphile approprié comprend avantageusement : - une partie hydrophobe choisie parmi les polystyrènes, les polyalkyles tels que le polyéthylène, les chaînes d'acides gras, et/ou
- une partie hydrophile choisie parmi les polyacides acryliques,, les polysulfates, les polyamines, les polyamides, les polysaccharides, les polycaprolactones et les polylactides.
Les nanosphères (III) sont préparées selon un procédé de préparation des particules composites précitées qui permet d'obtenir directement des nanosphères de diamètre souhaité et isodisperses sans nécessiter d'étape de tri ou de fractionnement en fonction du diamètre. Selon un premier procédé de l'invention, on obtient des nanosphères (III) pour lesquelles la partie hydrophobe du copolymère amphiphile est au moins partiellement immobilisée dans la matrice polymère, comme suit :
(i) on dispose d'une émulsion magnétique de départ stable et isodisperse constituée de deux phases non miscibles, une phase A hydrophobe constituée de gouttelettes contenant des nanoparticules magnétisables dispersées dans une phase organique contenant un agent tensioactif ; et une phase B hydrophile dans laquelle la phase A est dispersée ; (ii) on introduit dans la phase B des monomères hydrophobes et au moins un agent amorceur ; et
(iii) on polymérise lesdits monomères hydrophobes à l'intérieur de la phase A, et, selon ce procédé, on introduit en outre, dans la phase B, au moins un copolymère amphiphile, avant l'étape (iii), c'est à dire avant ou après l'étape (ii).
Selon un second procédé de l'invention, on obtient des particules composites pour lesquelles la partie hydrophobe du copolymère amphiphile est au moins partiellement immobilisée sur la matrice polymère, comme suit : (i) on dispose d'une émulsion de départ stable et isodisperse constituée de deux phases non miscibles, une phase A hydrophobe constituée de gouttelettes contenant des nanoparticules magnétisables dispersées dans une phase organique contenant un agent tensioactif ; et une phase B hydrophile dans laquelle la phase A est dispersée ; (ii) on introduit dans la phase B des monomères hydrophobes et au moins un agent amorceur ;
(iii) on polymérise une fraction desdits monomères hydrophobes à l'intérieur de la phase A, et, selon ce procédé, on introduit en outre, dans la phase B, au moins un copolymère amphiphile, avant l'étape (iii) ou après l'étape (iii), puis, lors d'une étape
(iv), on polymérise la fraction restante des monomères hydrophobes à la surface de la matrice polymère. Quand le copolymère amphiphile est introduit avant l'étape (iii), il peut être introduit avant ou après l'étape (ii).
Pour obtenir les nanosphères (III), le polymère amphiphile est avantageusement choisi parmi ceux énoncés précédemment dans la description des particules composites.
Les monomères mis en œuvre doivent former des polymères hydrophobes. Ils sont insolubles dans la phase hydrophile et choisis parmi les monomères vinylaromatiques tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, amino-méthylstyrène, vinyltoluène. Ils sont utilisés seuls ou en mélange ou bien encore en mélange avec d'autres monomères polymérisables insolubles dans l'eau tels que les acrylates, les méthacrylates d'alkyle, les esters d'acides éthyléniques et d'alkyle, les acide méthacryliques, les dérivés styréniques, les acides éthyléniques, les composés diéniques.
Il est possible d'ajouter au monomère ou au mélange de monomères un agent de réticulation hydrophobe, par exemple un monomère réticulant de type divinylbenzène, diméthacrylate, en particulier diméthacrylate de vinyle.
L'amorceur organosoluble est choisi parmi les amorceurs de type azobis, tels que les 2,2'-azobis (2,4'-diméthyl valéronitrile), 2,2'-azobis (4-méthoxy-2,4- diméthylvaléronitrile), 2,2'-azobis (2-cyclopropylpropionitrile), 2,2'-azobis (2- méthylpropionitrile), 2,2 '-azobis (2-méthylbutyronitrile), 1,1 '-azobis (cyclohexane- 1-carbonitrile), l-((l-cyano-l-méthyléthyl)azo) formamide, 2-phénylazo-4-méthoxy- 2,4-diméthyl-valéronitrile, diméthyl 2,2'-azobis (2-méthylpropionate, 4,4'-azobis (4- acide cyanovalérique) et 2,2'-azobis (2-hydroxyméthyl)propionitrile). Si on choisit un amorceur hydrosoluble ou faiblement hydrosoluble, tels que les peroxydes, les hydroperoxydes et les persulfates, il engendre un début de polymérisation dans la phase hydrophile qui se propage dans la phase hydrophobe. Les persulfates, en particulier le persulfate d'ammonium, le persulfate de sodium et le persulfate de potassium sont solubles en phase aqueuse. Sous l'action de la chaleur, ils se décomposent et génèrent des radicaux sulfate qui contribueront à charger la nanosphere composite. Le peroxyde d'hydrogène est soluble en phase aqueuse et génère des radicaux hydroxyles non chargés. La décomposition des hydropéroxydes génère un hydroxyle et un radical oxygéné qui se partageront dans une des phases en fonction de la nature du peroxyde utilisé. De la nature cationique ou anionique de l'amorceur dépendra le caractère cationique ou anionique de la particule et du conjugué résultant de l'invention, en l'absence de monomère fonctionnel. L'agent amorceur est introduit dans la phase hydrophile et pénètre dans la phase hydrophobe (a) soit simultanément à l'introduction des monomères hydrophobes (b), soit préalablement à l'étape d'introduction des monomères hydrophobes (c), soit postérieurement à l'étape d'introduction desdits monomères hydrophobes. Dans un mode de réalisation préféré, l'étape (iii), et éventuellement l'étape
(iv) de polymérisation sont effectuées par élévation de la température jusqu'à environ 60 à 90°C, en particulier à une température de 70°C, en présence de l'amorceur de polymérisation, étant entendu que les conditions de la polymérisation seront déterminées par l'homme du métier en fonction de la nature de l'amorceur retenu, ou par photochimie à l'aide de rayonnements, par exemple, de rayonnements ultra violets ou d'un faisceau laser ou d'autres sources d'énergie. La phase organique est une phase comprenant un hydrocarbure aliphatique ou cyclique choisi parmi les composés comprenant de 5 à 12 atomes de carbone, leurs isomères et leurs mélanges ou une phase comprenant tout ou partie d'un composé organique polymérisable par voie radicalaire. De préférence, l'hydrocarbure est choisi parmi le pentane, l'hexane, l'heptane, l'octane, le nonane, le décane, le undécane et le dodécane, et le composé organique polymérisable par voie radicalaire est choisi parmi les monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux, étant entendu qu'il est à la portée de l'homme du métier d'adapter les conditions de polymérisation en fonction du choix du ou des hydrocarbure(s) retenu(s) et de la nature de l'amorceur choisi. En particulier, si la polymérisation est effectuée par élévation de la température ou engendre une élévation de température, le montage réactionnel devra être adapté aux solvants volatils, tels que le pentane.
De manière préférentielle la phase hydrophile est une phase aqueuse, telle que de l'eau.
Dans des modes de réalisation préférentiels de la présente invention, la fonctionnalisation des particules peut être complétée par introduction dans la phase B et pénétration dans la phase A de groupements réactifs fonctionnels. Les groupements réactifs fonctionnels sont apportés par exemple par des monomères faiblement hydrophiles susceptibles de polymériser avec les monomères hydrophobes de la matrice polymère. En particulier, les groupements réactifs fonctionnels sont apportés par des monomères hydrophiles choisis parmi les monomères des acides acryliques, méthacryliques, éthyléniques et sulfoniques, les monomères aminés, seuls ou en mélange, ou encore en mélange avec des monomères hydrophobes ; étant entendu qu'il est à la portée de l'homme du métier de déterminer la composition du mélange. Les groupements fonctionnels permettent les réactions ultérieures de greffage des nanoparticules fluorescentes, mais apportent également la stabilisation colloïdale nécessaire pour les applications ultérieures. Les groupements fonctionnels sont introduits dans la phase B et pénètrent à l'intérieur de la phase A (a) soit de manière simultanée à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (ii), (b) soit préalablement à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (ii), (c) soit postérieurement à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (ii).
Dans un mode de réalisation particulier, et si souhaité, l'étape (iii) est suivie d'une étape d'évaporation partielle ou totale de la phase organique A avec formation de particules composites poreuses. Les nanosphères (III) sont donc fonctionnalisées par la partie hydrophile du copolymère amphiphile, et peuvent également l'être par la présence, de groupements fonctionnels réactifs, apportés comme indiqué ci-dessus au cours du procédé de préparation.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la matrice en polymère hydrophobe de la nanosphere de type (II) est entourée d'une enveloppe à base d'au moins trois couches de polymères compatibles. Cette enveloppe comporte, de préférence, une première couche de polymère cationique, une deuxième couche de polymère anionique et une troisième couche de polymère cationique. Par polymère anionique, on entend un polymère fonctionnalisé, par exemple par des fonctions -COOH, susceptibles de former un anion et par polymère cationique, on entend un polymère fonctionnalisé, par exemple par des fonctions -NH2, susceptibles de former un anion. Ces dernières nanosphères comportant une enveloppe au moins tricouche sont nommées de type (IV). Elles sont préparées selon les méthodes de polymérisation bien connues de l'homme de l'art. Dans tous les cas, et ce qu'on utilise des nanosphères (I), (II), (III) ou (IV), ces nanosphères sont fonctionnalisées en surface, de préférence, par des groupements choisis parmi les groupements carboxylique, aminé primaire, thiol, hydroxyl, tosyl hydrazine, époxyde, anhydride, qui permettent le greffage des nanoparticules fluorescentes, ces groupements étant apportés soit par un traitement de la surface des nanosphères, par exemple chimique par hydrolyse ou greffage de groupements fonctionnels, soit par utilisation de monomères ou de d'amorceurs fonctionnalisés, selon le cas, pendant la préparation des naonoparticules. Les nanoparticules fluorescentes utilisées présentent en surface au moins une fonction susceptible de réagir chimiquement avec les fonctions ci-dessus mentionnées, pour permettre leur fixation. Ce greffage chimique se fait selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple par réaction d'une fonction aminé primaire présente en surface de la nanosphere avec une fonction acide carboxylique, après activation de la fonction carboxylique, par exemple par du dicyclohexylcarbodiimide (CDI) et du N-hydroxysuccinimide (ΝHS), ou encore par réaction d'une fonction aminé primaire avec une fonction aldéhyde.
De façon avantageuse, les nanosphères fluorescentes présentent en surface des groupements fonctionnels réactifs tels que des groupements carboxylique, aminé primaire, thiol, aldéhyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, époxyde, anhydride ou un récepteur susceptibles de réagir avec au moins un ligand. Les particules fonctionnalisées ainsi formées seront susceptibles d'immobiliser un ligand, par exemple une molécule biologique, telle qu'un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un polypeptide, une enzyme, un polynucléotide, une sonde, une amorce, un fragment d'acide nucléique, des molécules chimiques, telles que des polymères chimiques, des substances médicamenteuses, des molécules cages, des agents chélatants, des catalyseurs, la biotine.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les particules de l'invention comprennent également, outre les nanoparticules fluorescentes, des nanoparticules filmogènes immobilisées en surface de la nanosphere desdites particules.
Ces particules sur lesquelles sont immobilisées à la fois des nanoparticules fluorescentes et des nanoparticules filmogènes peuvent être préparées comme décrit précédemment, à ceci près qu'on ajoute les nanoparticules filmogènes en même temps que les nanoparticules fluorescentes. L'excès de nanoparticules filmogènes et fluorescentes est éliminé en présence d'un agent stabilisant. Les particules ainsi obtenues sont ensuite filmifïées comme décrit précédemment.
Des exemples de nanoparticules filmogènes sont décrits dans EP 644 205. Le polymère constitutif de ces nanoparticules filmogènes présente de préférence une température de transition vitreuse comprise entre 10 et 16° C. Ces nanoparticules filmogènes sont alors porteuses de groupements fonctionnels réactifs, tels que définis ci-dessus, susceptibles de réagir avec au moins un ligand. Ces groupements restent accessibles en surface après formation du film venant entourer la particule magnétique et emprisonnant les nanoparticules fluorescentes.
Les agents stabilisants sont largement connus de l'homme du métier et peuvent être, par exemple, des agents tensioactifs tels que des agents tensioactifs cationiques, anioniques et non ioniques, ou des polymères ou copolymères amphiphiles. Ces agents stabilisants sont emprisonnés lors de la filmification et peuvent participer à la fonctionnalisation de la particule pour le greffage ultérieur de ligands biologiques.
La présente invention a également pour objet les nanoparticules obtenues par filmification des nanoparticules filmogènes.
La présente invention a également pour objet les suspensions colloïdales en phase aqueuse des particules selon l'invention, en particulier les suspensions colloïdales isodisperses.
La présente invention a également pour objet les conjugués constitués d'une particule décrite ci-dessus, sur laquelle au moins un ligand choisi parmi les molécules cages, les agents chélatants et les catalyseurs, est immobilisé, en particulier chimiquement greffé par réaction avec l'un des groupements fonctionnels réactifs présents en surface des nanoparticules fluorescentes.
Aussi, la présente invention a également pour objet des conjugués constitués par des particules composites de l'invention dont les groupements fonctionnels ont réagi, directement ou indirectement, avec au moins un ligand tel que défini ci-dessus, ainsi que leurs utilisations.
La présente invention a donc pour objet des conjugués constitués de particules — telles que définies ci-dessus sur lesquelles au moins un ligand choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un polypeptide, une enzyme, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un haptène et la biotine est immobilisé en particulier chimiquement greffé par réaction avec l'un des groupements fonctionnels réactifs présents en surface des nanoparticules fluorescentes. A titre d'exemple, lesdits conjugués sont utilisés dans des tests immunologiques pour la détection et/ou la quantification de protéines, d'antigènes, d'anticorps dans un échantillon biologique ou dans des essais utilisant la technologie des sondes pour la détection et/ou la quantification d'un fragment d'acide nucléique dans un échantillon biologique. L'utilisation de sondes pour la détection et/ou la quantification d'un acide nucléique dans un échantillon est bien connue de l'homme du métier et on peut citer à titre d'illustration la technique d'hybridation sandwich. De même, les conjugués de l'invention peuvent être utilisés comme « agents porteurs d'amorces » pour une réaction d'amplification d'acides nucléiques dans un échantillon, par exemple par PCR (Polymerase Chain Reaction) ou toute autre technique d'amplification appropriée, permettant ainsi la détection et/ou la quantification d'acides nucléiques dans l'échantillon biologique.
La présente invention a donc également pour objet un réactif et une composition diagnostique comprenant en outre lesdits conjugués et l'utilisation dudit réactif dans un essai diagnostique.
Les conjugués trouvent également une application dans le domaine thérapeutique comme véhicule ou vecteur pour les substances médicamenteuses, les sondes anti-sens, les agents réparateurs de gènes, les agents bloquant ou inhibant une activité protéique, et de ce fait ils peuvent être utilisés dans une composition thérapeutique ou prophylactique.
Ainsi, les conjugués de l'invention sont susceptibles de véhiculer une substance médicamenteuse dans une composition thérapeutique ou prophylactique qui comprend ledit conjugué en association avec un adjuvant et/ou diluant et/ou excipient approprié et pharmaceutiquement acceptable, ladite substance médicamenteuse étant capable d'être relarguée in vivo. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 16 éd., Mack Publishing Co.
Les conjugués de l'invention sont également susceptibles de véhiculer un gène d'intérêt thérapeutique codant pour au moins une protéine d'intérêt ou un fragment d'une protéine d'intérêt, étant entendu que par protéine on entend à la fois une protéine dans sa définition la plus généralement utilisée et un anticorps. Bien entendu, un tel conjugué est incorporé dans une composition thérapeutique ou prophylactique qui comprend également les éléments nécessaires à l'expression dudit gène d'intérêt thérapeutique.
Les conjugués de l'invention sont également utilisables, quand incorporés dans une composition thérapeutique ou prophylactique, pour le transfert in vivo de sondes ou oligonucléotides anti-sens. Les anti-sens sont capables d'interférer spécifiquement avec la synthèse d'une protéine cible d'intérêt, par inhibition de la formation et/ou du fonctionnement polysome selon le positionnement de l'ARNm dans la cible. Donc le choix fréquent de la séquence entourant le codon d'initiation de la traduction comme cible pour une inhibition par un oligonucleotide anti-sens vise à prévenir la formation du complexe d'initiation. D'autres mécanismes dans l'inhibition par oligonucléotides anti-sens impliquent une activation de la ribonucléase H qui digère les hybrides oligonucléotides anti-sens/ ARNm ou une interférence au niveau de sites d'épissage par des oligonucléotides anti-sens dont la cible est un site d'épissage de l'ARNm. Les oligonucléotides anti-sens sont également complémentaires de séquences ADN et peuvent donc interférer au niveau de la transcription par la formation d'une triple hélice, l' oligonucleotide anti-sens s'appariant par des liaisons hydrogène dites de Hoogsteen au niveau du grand sillon de la double hélice d'ADN. Il est bien entendu que les oligonucléotides anti-sens peuvent être strictement complémentaires de la cible ADN ou ARN à laquelle ils doivent s'hybrider, mais aussi non strictement complémentaires à la condition qu'ils s'hybrident à la cible. De même, il peut s'agir d'oligonucléotides anti-sens non modifiés ou modifiés au niveau des liaisons inter-nucléotidiques. Toutes ces notions font partie des connaissances générales de l'homme de l'art.
La présente invention concerne donc une composition thérapeutique comprenant, entre autres, un conjugué vecteur d'un oligonucleotide anti-sens tel que définis ci-dessus.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
Le diamètre hydrodynamique moyens des particules est déterminé par diffusion de lumière en utilisant Malvern Zetasizer 3000 HS, (Malvem Instrument, UK). La mesure est réalisée pour une dispersion infiniment diluée dans une solution NaCl 1 mM et à 20°C. Exemple 1 : Préparation de particules de latex magnétiques fluorescentes fonctionnalisées par des fonctions - COOH. al) Préparation de nanosphères de latex magnétiques fonctionnalisées par des fonctions - NH?.
L'élaboration de ces nanosphères de latex magnétiques est réalisée en deux étapes : une étape de polymérisation in situ et une étape de polymérisation par encapsulation. i) polymérisation in situ Dans un réacteur de polymérisation, on introduit 40,4 ml, soit 2 g d'émulsion magnétique constituée de gouttelettes d'environ 220 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxyde de fer (60 % en poids par rapport au poids de tensioactifs) dans de l'octane (11 mg d'octane /g d'émulsion solide) et un mélange de tensioactifs dodécylsulfate de sodium (SDS)) acide oléique, lesdites gouttelettes étant stabilisées dans une solution de Triton ® X-405 à 2 g / 1 (émulsion préparée selon l'exemple li) de FR 99 14195). Le pH de l'émulsion est égal à 7,05. Cette émulsion est agitée sous azote à 200 rpm pendant 1 heure 30 minutes. 0,099 g de styrène et 0,0019 g de 2,2'- azobis(2,4-diméthylvaléronitrile) comme amorceur de la polymérisation sont ajoutés et le mélange réactionnel est agité à 250 rpm pendant 30 minutes à
20°C. La polymérisation est amorcée par chauffage à une température égale à 70°C pendant 150 minutes. ii) encapsulation Au mélange obtenu en (i), on ajoute 0,0087 g de 2,2'-azobisamidinopropane repris avec 1 ml d'eau milli-Q (eau stérile déminéralisée) bouillie et dégazée puis, on additionne un mélange de 0,4648 g de N-isopropylacrylamide repris dans 1 ml d'eau milli-Q bouillie et dégazée, 0,0391 g de méthylène bisacrylamide repris dans 1 ml d'eau milli-Q bouillie et dégazée et 0,04 g d'aminoéthylméthacrylate, ce mélange étant introduit toutes les minutes, à raison de 1 ml/min. La polymérisation est réalisée pendant environ 18 heures.
Les nanosphères présentent un diamètre moyen de l'ordre de 235 nm. a2) Autre exemple de préparation de nanosphères de latex magnétiques fonctionnalisées par des fonctions - NH -
Des nanosphères de latex magnétiques sont préparées selon le même mode opératoire qu'au paragraphe (al) mais 0,02 g d'aminoéthylméthacrylate sont utilisés à l'étape (ii) à la place de 0,04 g. Dans ce cas, les nanosphères de latex magnétiques obtenues présentent un diamètre moyen de l'ordre de 230 nm.
b) Greffage chimique de nanoparticules fluorescentes de diamètre moyen de l'ordre de 20 nm. On utilise des nanoparticules fluorescentes présentant des fonctions -COOH en surface et à base de polystyrène. 1 mg de nanosphères magnétiques obtenues à l'étape (al) est mis en présence de 385 μl de tampon phosphate (10 mM, pH 6,8) - 1% Tween 20. A ce mélange, sont ajoutés 5 μl d'une solution de 1,3 dicyclohexylcarbodiimide (CDI, 10 μl/ml dans le DMSO), 50 μl de N- hydroxysuccinimide, (ΝHS, 130 mg/ml dans le DMSO) et 200 μg de nanoparticules fluorescentes carboxyliques (Molecular Probe, référence « Fluospheres carboxylate- modified microsphere », 20 nm, red fluorescent F-8786, 580/605). Après cette période d'incubation, le latex magnétique est lavé au moins trois fois avec de l'eau Milli-Q à 0,2% de Triton® X-405. Les particules obtenues présentent un diamètre moyen de l'ordre de 300 nm
Exemple 2 : Autre exemple de préparation de particules de latex magnétiques fluorescentes, fonctionnalisées par des fonctions -COOH.
Selon un mode opératoire analogue à l'exemple 1 (b), on réalise le couplage de particules fluorescentes fonctionnalisées avec des fonctions -COOH différentes (commercialisées par PROLABO sous la référence :Yellow-Green Estapor F-XC R97-06, diamètre 18nm, 505/515) sur des nanosphere obtenues aux exemples 1 (al) et 1 (a2). Les quantités présentés dans le Tableau 1 ci-après sont utilisées. Tableau 1
Exemple 2 a 2b
Nanosphères magnétiques obtenues à l'exemple 1 (al) 0 22,5μl à 8,9 %
Nanosphères magnétiques obtenues à l'exemple 1 (a2) 29,5 μl 0 à 6,84 %
Tampon Borate lOOmM pH 9,3 789,5μl 796,5μl
Tween 20 1 % 25 μl 25 μl
CDI/DMSO ( lOμl/ml) lOμl 10
NHS/DMSO (500 mg/ml) 26μl 26
Latex fluorescent (COOH) à 1 % 120μl 120μl
Prolabo Estapor F-XC R97-06
(diam : 18 nm) Yellow-Green
Incubation 3h à 37°C, 900 rpm
3 lavages en eau milli-Q + 0,2 % Triton X 405
Les particules obtenues à l'exemple 2a présentent un diamètre moyen de l'ordre de 226 nm.
Les particules obtenues à l'exemple 2b présentent un diamètre moyen de l'ordre de 258,9 nm.
Exemple 3 : Préparation de particules de latex magnétiques fluorescents fonctionnalisés par des fonctions aldéhyde.
32 μl d'une dispersion de nanosphères de latex magnétiques (6,2 g/100ml obtenue selon l'exemple 1 (a2)), 768 μl de tampon Borate (100 mM, pH 9,3) et 200 μl d'une solution de nanoparticules de latex fluorescentes présentant en surface des fonctions aldéhyde (2 g/100ml, Molecular Probe, référence « Fluospheres carboxylate modified microsphere », Yellow-Green F8760 0,02μm, 505/515) sont incubées pendant une heure à 37°C sous agitation douce. Après cette période d'incubation, un volume de 50 μl de NaBH , 1M est ajouté et l'incubation est menée pendant 1 heure à 37 °C. Le latex magnétique est lavé au moins trois fois avec de l'eau Milli-Q à 0,2% Tween-20. Les particules de latex magnétiques fluorescentes obtenues présentent un diamètre hydrodynamique moyen de l'ordre de 247 nm.
Exemple 4 : Autre exemple de préparation de particules de latex magnétiques fluorescents fonctionnalisés par des fonctions aldéhyde.
Selon un mode opératoire analogue, des particules de latex magnétiques fluorescents fonctionnalisés par des fonctions aldéhyde sont préparées à partir de 32 μl d'une dispersion de nanosphères de latex magnétique à un taux de solide de 5,1 % obtenue selon l'exemple 1 (al). Les particules de latex magnétiques fluorescentes obtenues présentent un diamètre hydrodynamique moyen de l'ordre de 259 nm.
Exemple 5 : Autre exemple de préparation de particules de latex magnétiques fluorescentes.
a) Préparation de nanosphères de latex magnétiques cationiques « 3 couches » par adsorption de polycations et polyanions :
L'élaboration de ces nanosphères de latex magnétiques est réalisée en trois étapes d'adsorption. Une première étape d'adsorption d'un polymère cationique : le PEI (polyéthylènimine), suivie d'une étape d'adsorption d'un polymère anionique : l'AMVE (anhydride maléique co-méthyl vinyl éther hydrolyse), puis la dernière couche est obtenue par une nouvelle étape d'adsorption de PEI.
i) Obtention de la première couche : couche cationique.
Dans un flacon en verre de 16 ml, on introduit 5 ml d'émulsion magnétique anionique (obtenu selon l'exemple li) de FR 99 14 195) à un taux de solide de 5%, soit 250 mg d'émulsion magnétique d'environ 200 nm de diamètre. On ajoute 5 ml d'eau milli-Q et, après homogénéisation, le mélange est lavé par séparation magnétique, élimination du surnageant et reprise des nanosphères magnétiques dans 10 ml d'eau milli-Q. Après redispersion totale, l' émulsion est à nouveau lavée par séparation magnétique, élimination du surnageant et reprise des nanosphères magnétiques dans 5 ml d'eau milli-Q.
Ces 5 ml d'émulsion magnétique lavée sont ajoutés rapidement, à l'aide d'une pipette de 5 ml, dans un flacon contenant 10 ml d'une solution aqueuse de PEI à 50 g/1. Après 15 minutes d'incubation sur un agitateur rotatif (roller), les particules magnétiques sont lavées par séparation magnétique, élimination du surnageant et reprise des nanosphères magnétiques dans 5 ml d'eau milli-Q. Après redispersion totale, 1 ml d'une solution aqueuse de PEI à 10 g/1 sont ajoutés à la solution de nanosphères magnétiques. Après homogénéisation, l'émulsion est à nouveau lavée par séparation magnétique, élimination du surnageant et reprise des nanosphères magnétiques dans.5 ml d'eau milli-Q.
ii) Obtention de la deuxième couche : couche anionique.
Dans un réacteur de polymérisation magnétique, on introduit 20 ml de tampon acétate 50 mM à pH 5,8, 15 ml d'une solution d'AMVE à 11 g/1 en tampon acétate 50 mM à pH 5,8 et 100 μl d'une solution de NaCl à 5M. Le mélange est homogénéisé pendant 5 minutes à une agitation de 250 rpm, puis la vitesse d'agitation est augmentée jusqu'à 520 rpm . Dans une ampoule en verre de 50 ml, équipée d'un robinet réglable et fixée sur le couvercle du réacteur de polymérisation, on ajoute les 5 ml de la dispersion de nanosphères magnétiques cationiques obtenue à l'étape (i) et 35 ml de tampon acétate 50 mM à pH 5,8.
La dispersion de nanosphères magnétiques ainsi diluée au l/8e est ajoutée au goutte à goutte sur le mélange réactionnel contenu dans le réacteur (eau milli-Q, AMVE, NaCl), sous une agitation constante de 520 rpm. Il faut un minimum de
30 minutes pour que la totalité des nanosphères magnétiques soit ajouté au mélange réactionnel. Après ces 30 minutes, la vitesse d'agitation est diminuée à 300 rpm. Au bout d'un temps total de 45 minutes (30 minutes à 520 rpm puis 15 minutes à 300 rpm) les nanosphères magnétiques sont récupérées est lavées par séparation magnétique, élimination du surnageant et reprise des nanosphères magnétiques dans 10 ml d'eau milli-Q. Ces nanosphères, redevenues anioniques, sont dispersées par ultrason pendant 10 minutes et filtrées sur voile de nylon.
iii) Obtention de la troisième couche : couche cationique. 5 ml d'émulsion magnétique anioniques « 2 couches » obtenue à l'étape ii) sont lavés et ajoutés rapidement, à l'aide d'une pipette de 5 ml, dans un flacon de 30 ml contenant 10 ml d'une solution aqueuse de PEI à 10 g/1. Après 15 minutes d'incubation sur un agitateur rotatif (roller), les particules magnétiques sont lavées par séparation magnétique, élimination du surnageant et reprise des nanosphères magnétiques dans 10 ml d'eau milli-Q. Après redispersion totale, les nanosphères magnétiques, redevenues cationiques, sont dispersées par ultrason pendant 10 minutes, puis sont filtrées sur voile de nylon. Le diamètre hydrodynamique moyen des nanosphères magnétiques obtenues est de l'ordre de 540 nm.
b) Obtention de particules magnétiques « 3 couches » fluorescentes :
De telles particules sont obtenues par deux techniques de greffage de nanophères fluorescentes possédant à leur surface des fonctions carboxyliques (-COOH) ou des fonctions aldéhydes (-CHO).
i) Greffage chimique de nanosphères fluorescentes carboxyliques :
On utilise des nanosphères fluorescentes à base de polystyrène et présentant des fonctions -COOH. 2 mg de nanosphères magnétiques « 3 couches » cationiques (à fonction aminé), obtenues à l'étape (a-iii) et possédant un taux de solide de 1,51% (soit 132 μl), sont mises en présence de 607 μl de tampon borate 100 mM pH 9,3, de 25 μl de Triton X405 à 1%, de 10 μl de CDI/DMSO (10 μl/ml), de 26 μl de
NHS/DMSO (500 mg/ml) et de 200 μl de nanosphères fluorescentes (-COOH) à 1 % (Prolabo Estapor F-xc R97-06, 18 nm, Yellow-Green). L'ensemble est incubé pendant 3heures à 37°C et sous une agitation de 900 rpm. Puis les nanosphères magnétiques sont lavées trois fois par séparation magnétique, élimination du surnageant et reprise des nanosphères magnétiques dans 1 ml de Triton X405 à
0,2%. Le diamètre hydrodynamique moyen des particules obtenues est de l'ordre de 628,8 nm. ii) Greffage chimique de nanosphères fluorescentes aldéhydes :
On utilise des nanosphères fluorescentes à base de polystyrènes est présentant des fonctions -CHO. 2 mg de nanosphères magnétiques « 3 couches » cationiques, obtenues à l'étape (a-iii) et possédant un taux de solide de 1,51% (soit 132 μl), sont mises en présence de 668 μl de tampon borate 100 mM pH 9,3 et de 200 μl de nanosphères fluorescentes (-CHO) à 1 % (Molecular Probes 20 nm, 505/515 Yellow-Green). L'ensemble est incubé pendant lheure à 37°C et sous une agitation de 900 rpm. Après 1 heure d'incubation, on ajoute 50 μl de NaBH 1M et l'ensemble est incubé pendant lheure à 37°C et 900 rpm. Puis, les nanosphères magnétiques sont lavées trois fois par séparation magnétique, élimination du surnageant et reprise des nanosphères magnétiques dans 1 ml de Triton X405 à 0,2%. Le diamètre hydrodynamique moyen des particules obtenues est de Tordre de 413,8 nm.
Exemple 6 : Effet du greffage fluorescent sur les propriétés magnétiques des latex magnétiques.
Un test de vitesse de séparation magnétique est réalisé afin de comparer les conséquences du greffage de nanoparticules fluorescentes sur la vitesse de séparation des nanosphères de latex magnétiques.Pour cela, une cuve jetable en polypropylène de 4 ml est remplie avec 2 ml de solution de particules magnétiques à 25 μg/ml, et est placée dans un spectrophotomètre. Un aimant plat est disposé sous la cuve. Une mesure cinétique de la densité optique est réalisée à 500 nm pendant 20 minutes. Le Tableau 2 présente les résultats obtenus. Tableau 2 Vitesse moyenne
(en Abs/min.) Sur 1 min. Sur 2 min.
Nanosphères exemple 1 (al) 0,267 0,184
Nanosphères exemple 1 (a2) 0,422 0,287
Particules magnétiques 0,322 0,205 fluorescentes exemple 2a
Particules magnétiques 0,294 0,207 fluorescentes exemple 2b Comme présentées aux fig. 1 et 2 qui montrent l'évolution de l'ABS en fonction du temps t mesuré à 500 nm avec un spectrophotomètre UV-mc2 de Safas
Monaco, les mesures cinétiques effectuées ne montrent pas de différences significatives dans la vitesse de séparation magnétique avant (exemples 1 (al) et 1
(a2)) et après greffage de nanoparticules fluorescentes (exemples 2b et 2a).
Le protocole de greffage, tel que décrit dans les exemple 1 à 4 n'a pas d'influence notable sur les propriétés magnétiques des particules ainsi modifiées.
Exemple 7 : Résultat de photoextinction
Une étude visant à comparer la visibilité et la résistance à la photoextinction de particules magnétiques fluorescentes selon l'invention et de particules de l'art antérieur a été réalisé.
Des tests ont donc été réalisés d'une part avec les particules selon l'exemple 4 et d'autre part avec des nanosphères magnétiques immunicon commercialisées sous la référence « Streptravidin ferrofluid F-3106 » rendues fluorescentes par un greffage en surface de biotine FITC (Molecular Probes Fluorescein biotin B-1370), référencée 7. Dans les mêmes conditions d'illumination, la décroissance de la fluorescence pour ces différentes particules a été mesurée. Protocole de mesure
Une goutte de 4μl de suspension de particules magnétiques et fluorescentes en tampon TE Triton 0,1 M NaCl est placée entre une lamelle en Si /SiO2 et lamelle couvre-objet en verre, espacés de 0,27mm. Les particules sont ensuite confinées en un culot par un aimant « pyramide ». Enfin la décroissance de fluorescence est mesurée directement par un photomètre ANRITSU placé à la place d'un des oculaires du microscope. Le culot est éclairé en continu et la première mesure est prise dès le début de l' illumination.
Résultats Les résultats obtenus sous éclairage continu (avec un microscope ZEISS, objectif 10X, lampe HBO vapeur de mercure, photomètre Anritsu à l'oculaire) sont présentés à la fig.3 qui donne l'évolution de la luminosité relative (lr) en fonction du temps (t en min) pour les particules 4 selon l'invention et les particules 7 de l'art antérieur. On constate que la décroissance de la luminosité des particules Immunicon greffées avec de la biotine FITC est très rapide dès les premières minutes d'illumination. La luminosité, au-dessus du fond, n'est plus que de 30% de la luminosité initiale au bout de 5 minutes. Elle continue ensuite à décroître plus lentement et n'est plus que de 10% au bout de 15 minutes. En comparaison la luminosité des particules selon l'invention décroît régulièrement mais beaucoup plus lentement. Elle est de 88% de la valeur initiale au bout de 5 minutes, et elle est encore de plus de 55% après une heure d'éclairage permanent.
La photoextinction est due à une destruction irréversible des molécules de fluorophore soumises à des conditions d'éclairage intense. Cette destruction est très dépendante de l'environnement chimique des fluorophores et du temps. En particulier lorsque ceux-ci sont greffés sur une molécule biologique ou sur une surface, cette destruction ne se ramène pas à une simple constante de dissociation. De plus dans les conditions expérimentales, il existe dans le champ d'illumination et de mesure, des molécules (ou des particules) de fluorophore libres en solution. Ces molécules contribuent pour une part au bruit de fond de fluorescence ; par diffusion latérale, les molécules détruites dans cette zone peuvent être remplacées par des molécules neuves, diminuant ainsi le taux de décroissance. Dans le cas des particules selon l'invention, les fluorophores ou molécules fluorescentes sont protégées de l'environnement agressif.
Exemple 8 :
Soit 2mg (54 μl) de nanosphères magnétiques obtenues à l'exemple 1 (al) de taux de solide (4,74%) dans une solution tampon Borate lOOmM pH 9,3 contenant 746μl de nanolatex fluorescent (CHO) à 2% (Latex Aldéhyde-sulfate Molecular Probes (0,02 μm) (505/515) Yellow-Green.). La dispersion est incubée pendant lheure à 37°C et 900 rpm. Les particules magnétiques fluorescentes obtenues sont lavées puis redispersées dans le même tampon borate. A cette dispersion est ajouté 20 μl d'ODN (dT25) a une concentration de 673 nmoles/ml et la dispersion est incubée pendant lheure à 37°C et 900rpm avant d'ajouter 50μl de NaBH4 IM dans l'eau. La dispersion fluorescente magnétique est lavée 3 fois avec l'eau milli-Q avant d'être reprises dans 1ml d'eau milli-Q contenant le tensioactif Triton X-405 à 0,2%. Le greffage de l'ODN de capture et donc la formation d'un conjugué conforme à l'invention a été validé par un test ELOSA (de l'anglais "Enzyme-Linked OligoSorbent Assay », on pourra notamment se référer à « Préparation of Conjugates between Oligonucléotides and N-Vinylpyrrolidone/N-Acryloxysuccinimide Copolymers and Applications in Nucleic Acid Assays to Improve Sensitivity » Erout M.N., Troesch A., Pichot C. and Gros Ph. Bioconjugate Chemistry, 1996, 7(5) 568- 575 et « Amino-containing cationic Latex-Oligodeoxyribonucleotide Congugates : Application to Diagnostic test Sensitivity Enhancement » Th. Delair, F. Meunier, A. Elaïssari, M. H. Charles, C. Pichot. Colloid and Sufaces A., 1999, 153, 341-353). La cible est composée d'une partie dA et d'une séquence HIV. La révélation est réalisée en utilisant un oligonucleotide spécifique à la séquence HIV et portant l'HRP (« Horse Radish Peroxydase ») à son extrémité.
Après incubation, une analyse colorimétrique est réalisée. La densité optique (DO) de la coloration, proportionnelle à la quantité d'enzyme, et donc à la quantité de cibles hybridées, est mesurée à 492 nanometres. On obtient pour le conjugué selon l'invention (particules magnétiques fluorescentes -CHO + dT25) une DO de 0,422 et pour le témoin négatif, une DO de 0,039.
Ce test met donc en évidence l'adsorption et/ou le couplage des oligonucléotides sur les particules magnétiques et fluorescentes de l'invention.
Exemple 9 :
I) Synthèse de particules magnétiques fluorescentes
1) Conversion de nanosphères magnétiques anioniques en nanosphères magnétiques cationiques
2,5 ml d'eau milli-Q sont ajoutés à 0,83 ml d'émulsion magnétique (Référence AC7, diamètre de l'ordre de 285 nm, taux de solide de 18% ; fournie par la société Ademtech). Après homogénéisation, le surnageant est éliminé par séparation magnétique. Les gouttelettes d'émulsion magnétique sont reprises dans 5 ml d'eau milli-Q. Après homogénéisation puis séparation magnétique, 2,5 ml d'eau milli-Q sont ajoutés. Après redispersion, ces 2,5 ml d'émulsion magnétique lavée sont ajoutés à 5 ml de solution aqueuse de PEI à 50 g/1. Après 15 minutes d'agitation sur un agitateur rotatif, les gouttelettes d'émulsion magnétique sont lavées par séparation magnétique, élimination du surnageant puis ajout de 2,5 ml d'eau milli-Q. 0,5 ml d'une solution aqueuse de PEI à 10 g/1 est ensuite ajouté à l' émulsion magnétique. Après homogénéisation puis séparation magnétique, les gouttelettes d'émulsion ! magnétique sont lavées trois fois par 5 ml d'eau milli-Q. Finalement, les nanosphères magnétiques sont reprises dans 2,5 ml d'eau milli-Q.
2) Hétérocoagulation
0,73 ml de particules filmogènes dont le diamètre est de l'ordre de 47 nm (fournies par Rhodia, latex RHODOPAS ULTRAFINE PR 3500), 0,44 ml de particules fluorescentes (-COOH) (Molecular Probes F8787 « Fluospheres carboxylate modified microspheres » 0,02 μm Yellow Green Fluorescent (505/515) à 2 % de taux de solide), dont le diamètre est de l'ordre de 24 nm, ainsi que NaCl à 10" M (tel que le volume total soit de 20 ml) sont placés dans un réacteur en verre à double enveloppe de 100 ml. Le pH est au préalable ajusté à 7 avec HC1 IM. Les 2,5 ml d'émulsion de nanosphères magnétiques lavées obtenues dans l'étape précédente sont ajoutés à 15 ml de NaCl à 10"3 M et pH = 7, placés dans un pousse-seringue et additionnés au mélange particules filmogenes/particules fluorescentes, NaCl. La vitesse d'addition est d'environ 20 ml/h. Tout au long de la réaction, la température est maintenue à environ 2°C. La vitesse d'agitation est de 380 tours/min. Le réacteur est recouvert d'une feuille d'aluminium afin d'éviter toute perte de fluorescence.
3) Filmification
Avant de déclencher la filmification des nanoparticules filmogènes, il est nécessaire d'éliminer l'excès de nanoparticules puis de redisperser les heterocoagulats dans une solution d'un copolymère amphiphile, le Coatex M883 (fourni par la société Coatex). Les heterocoagulats sont séparés du surnageant puis redispersés dans une solution de Coatex M883 (0,8 g/1 de tampon borate à 10 mM). En pratique, un volume V d'émulsion magnétique est mélangé à un volume 2V de solution de Coatex. Après séparation magnétique, les heterocoagulats magnétiques sont redispersés dans un volume 2V de la solution de Coatex. Le diamètre hydrodynamique moyen des particules composites obtenues est de l'ordre de 306 nm. Elles sont enfin placées dans le réacteur préchauffé à 50°C. L'ensemble est chauffé durant 20h à 50°C sous une agitation de 150 tours/min. Le diamètre hydrodynamique moyen des particules filmifiees obtenues est de l'ordre de 291 nm et le taux de solide final de l'émulsion de 0,53 %.
II) Evaluation des performances biologiques des particules obtenues : test
ELOSA
Il faut tout d'abord synthétiser les conjugués particules magnétiques-ODN. Cette étape de fonctionnalisation a été réalisée sur les particules magnétiques fluorescentes filmifiees obtenues précédemment, brutes ou lavées, en utilisant différents tampons.
1) Préparation des conjugués particules magnétiques-ODN
1 mg de particules sont aimantés (échantillon brut : Taux de solide = 0,53 % donc 190 μl ; échantillon lavé en tampon borate 1 mM : Taux de solide = 0,184 % donc 540 μl engagés). Les particules sont reprises dans 50 μl :
- échantillons bruts : de tampon phosphate 10 mM à pH = 6,8 de tampon phosphate 10 M à pH = 6,8 et de Tween 20 à 0,01%
- échantillons lavés trois fois en tampon borate 1 mM : de tampon borate 1 mM à pH = 9,1
30 μl d'EDC (l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide) à 10 mg/ml du tampon approprié sont ajoutés au mélange précédent, puis la solution est complétée à 100 μl. 30 μg de streptavidine (6 μl à 5 mg/ml du tampon approprié) sont ajoutés au mélange précédent (streptavidine dans tampon phosphate 10 mM seul pour les 2 essais en tampon phosphate, dans tampon borate 1 mM pour l'essai en tampon borate). Une première incubation de lh à 37°C et 1000 tours/min est réalisée. Puis 100 μl de tampon de blocage (PB S (solution tampon phosphate)/ éthanolamine 40 mM / triton X100 à 0,05% / BSA (sérum d'albumine bovin) à 0,1%) sont ajoutés. Une nouvelle incubation de 30 min à 37°C et 1000 tours/min est réalisée. Le mélange est ensuite placé sous aimantation et, après séparation magnétique, repris en tampon PBS / Tween 20 à 0,1% / BSA à 0,1% (2 fois 100 μl). Finalement, les particules sont reprises dans 100 μl de ce même tampon. Le taux de solide est alors de l'ordre de 1%.
2.1015 copies d'oligonucléotide biotinylé (10 μl de dT25 6627) sont ajoutés. Puis une incubation de 30 min à 37°C et 1000 tours/min est réalisée. Après aimantation, les particules sont reprises en tampon PEG (2 fois 100 μl) et placées sous incubation durant 15 min à 37°C et 1000 tours/min.
2) TestELOSA
2 μl de conjugués à 1% (soit 20 μg de particules) sont dilués dans 50 μl de tampon PEG. Puis 1011 copies de C-det HIV dA (6384, ODN cible) (2,8 μl à 1/1000) et 5. 1011 copies de det HIV (6359B, ODN de détection) (1,5 μl à 1/100) sont ajoutés au mélange précédent. Après une incubation de 30 min à 37°C et 1000 tours/min, les particules sont placées sous aimantation puis reprises en tampon PEG (3 fois 50 μl). 50 μl d'OPD à 2 mg/ml dans l'eau oxygénée (bioMérieux, référence 07645A) sont ajoutés au mélange. Après trois minutes, la réaction de coloration est bloquée par addition de 50 μl de H2SO4 à IN. La lecture de densité optique à 492 nm de 100 μl du surnageant obtenu après aimantation permet d'estimer l'efficacité de capture de la cible, par comparaison avec un test "blanc" qui ne contient pas l'ODN cible. Les meilleurs résultats sont obtenus pour les essais de greffage de la streptavidine conduits en tampon borate sur des échantillons lavés au préalable en tampon borate.
Figure imgf000032_0001

Claims

REVENDICATIONS
1 - Particules présentant un diamètre moyen compris entre 50 et 1000 nm, de préférence entre 100 et 500 nm, comprenant une nanosphere organique et/ou inorganique dans laquelle des nanoparticules inorganiques magnétisables sont distribuées de manière homogène, caractérisées en ce que des nanoparticules fluorescentes, comprenant une matrice polymère dans laquelle des molécules ou des cristaux fluorescents sont répartis, sont immobilisées en surface de la nanosphere.
2 - Particules selon la revendication 1 , caractérisées en ce que les nanoparticules fluorescentes ont un diamètre moyen compris entre 5 et 50 nm. 3 - Particules selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que la matrice polymère des nanoparticules fluorescentes est en un polymère hydrophobe choisi parmi les homopolymères de monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d'autres comonomères, tels que les acrylates d'alkyle et les methacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 10 atomes de carbone, les esters d'acides éthyléniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, les acides méthacryliques, les dérivés styréniques.
4 - Particules selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisées en ce que les molécules fluorescentes sont choisis parmi : la fluorescéine éventuellement substituée, les dérivés de la fluorescéine, par exemple, la fluorescéine isothiocyanate, la 5-carboxy fluorescéine, la 2',7'-difluoroîTuorésceine, la bromométhyle- fluorescéine, ou encore la rhodamine, les dérivés de la rhodamine, le succinimidyl de l'acide carboxylique de la trifluoroacétamide, le 3-acide carboxylique de diethylaminocoumarine, l'acide acétique de l'hydroxy-méthylcoumarine, le méthacrylate de méthyl d'antracényl, le 3,8-diméthacryloyl de bromure d'ethidiume, le diméthacrylate de la fluorescéine, le méthacryloxyéthyl thiocarbamoyl de la rhodamine B, l'acrylate ou le méthacrylate de 2'-naphthyl, les dérivés du pyrènes, comme le 1-pyrénylméthyl méthacrylate, le thodol et ses dérivés. 5 - Particules selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce qu'au moins six nanoparticules fluorescentes sont immobilisées en surface de la nanosphere et recouvrent, de préférence, jusqu'à au moins 54 % de la surface de la nanosphere. 6 - Particules selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisées en ce que la nanosphere comprend :
- un cœur essentiellement liquide constitué d'une phase organique dans laquelle les nanoparticules magnétisables sont distribuées et stabilisées,
- une enveloppe entourant le cœur liquide, ladite enveloppe comprenant au moins un polymère hydrophile obtenu par polymérisation d'au moins un monomère hydrosoluble.
7 - Particules selon la revendication 6 caractérisées en ce que les nanoparticules inorganiques magnétisables sont stabilisées par des polymères, des agents ioniques, des agents tensioactifs, des acides gras ou des dérivés d'acides gras, seuls ou mélangés.
8 - Particules selon la revendication 7 caractérisées en ce que les nanoparticules inorganiques magnétisables sont stabilisées par du dodécylsulfate de sodium ou bien par un mélange dodécylsulfate de sodium, acide oléique.
9 - Particules selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisées en ce que la nanosphere comprend une matrice en un polymère hydrophobe dans laquelle les nanoparticules inorganiques magnétisables sont distribuées.
10 - Particules selon la revendication 9 caractérisées en ce que le polymère hydrophobe de la nanosphere est choisi parmi les homopolymères de monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d'autres comonomères, tels que les acrylates d'alkyle et les methacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 10 atomes de carbone, les esters d'acides éthyléniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, les acides méthacryliques, les dérivés styréniques.
11 - Particules selon la revendication 9 ou 10 caractérisées en ce que la matrice en polymère hydrophobe est entourée d'une enveloppe à base d'un polymère hydrophile obtenu par polymérisation d'au moins un monomère hydrosoluble.
12 - Particules selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisées en ce que la matrice en polymère hydrophobe de la nanosphere est entourée par un copolymère amphiphile comportant une partie hydrophile et une partie hydrophobe au moins partiellement immobilisée dans ou sur le polymère hydrophobe.
13 - Particules selon la revendication 12 caractérisées en ce que la partie hydrophobe du polymère amphiphile est choisie parmi les polystyrènes, les polyalkyles tels que le polyéthylène, les chaînes d'acides gras.
14 - Particules selon la revendication 12 ou 13 caractérisées en ce que la partie hydrophile du copolymère est choisie parmi les polyacides acryliques, les polysulfates, les polyamines, les polyamides, les polysaccharides, les polycaprolactones et les polylactides. 15 - Particules selon Tune des revendications 12 à 14 caractérisées en ce que le copolymère amphiphile est choisi parmi les polymères en bloc, les polymères ramifiés, les polymères en peigne.
16 - Particules selon la revendication 9 ou 10 caractérisées en ce que la matrice en polymère hydrophobe est entourée d'une enveloppe à base de trois couches de polymères compatibles.
17 - Particules selon la revendication 16 caractérisées en ce que l'enveloppe comporte une première couche de polymère cationique, une deuxième couche de polymère anionique et une troisième couche de polymère cationique.
18 - Particules selon Tune des revendications précédentes caractérisées en ce que les nanoparticules inorganiques magnétisables sont à base d'oxydes de fer, magnétite, hématite, ferrites telles que les ferrites de manganèse, nickel manganèse- zinc, ou bien les alliages de cobalt ou de nickel.
19 - Particules selon Tune des revendications précédentes caractérisées en ce qu'elles présentent en surface des nanoparticules fluorescentes des groupements fonctionnels réactifs tels que des groupements carboxylique, aminé, thiol, aldéhyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, époxyde, anhydride ou un récepteur susceptibles de réagir avec au moins un ligand.
20 - Particules selon les revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles comprennent également des nanoparticules filmogènes immobilisées en surface de la nanosphere.
21 - Particules obtenues à partir des particules selon la revendication 20, par filmification des nanoparticules filmogènes. 22 - Particules selon la revendication 20 ou 21, caractérisées en ce qu'elles présentent en surface des groupements fonctionnels réactifs tels que des groupements carboxylique, aminé, thiol, aldéhyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, époxyde, anhydride ou un récepteur susceptibles de réagir avec au moins un ligand. 23 - Suspension colloïdale de particules selon les revendications précédentes en phase aqueuse.
24 - Suspension de particules selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'elle est isodisperse.
25 - Conjugué constitué d'une particule selon la revendication 19 ou 22 sur laquelle au moins un ligand choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un polypeptide, une enzyme, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un haptène et la biotine est immobilisé, en particulier chimiquement greffé par réaction avec l'un des groupements fonctionnels réactifs présents en surface des nanoparticules fluorescentes. 26 - Réactif pour diagnostic comprenant au moins un conjugué selon la revendication 25.
27 - Composition diagnostique comprenant un réactif selon la revendication 26.
28 - Conjugué constitué d'une particule selon la revendication 19 ou 22, sur laquelle au moins un ligand choisi parmi les molécules cages, les agents chélatants et les catalyseurs est immobilisé, en particulier chimiquement greffé par réaction avec l'un des groupements fonctionnels réactifs présents en surface des nanoparticules fluorescentes.
29 - Conjugué d'une particule selon la revendication 19 ou 22, sur laquelle au moins un ligand choisi parmi les substances médicamenteuses, les sondes anti-sens, les agents réparateurs de gènes, les agents bloquant ou inhibant une activité protéique, est immobilisé, en particulier chimiquement greffé par réaction avec l'un des groupements fonctionnels réactifs présents en surface des nanoparticules fluorescentes.
30 - Composition thérapeutique ou prophylactique comprenant un conjugué selon la revendication 29.
PCT/FR2003/001884 2002-06-19 2003-06-19 Nanoparticules magnetiques fluorescentes WO2004001414A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003260611A AU2003260611A1 (en) 2002-06-19 2003-06-19 Fluorescent magnetic nanoparticles

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0207545A FR2841156B1 (fr) 2002-06-19 2002-06-19 Nouvelles particules magnetiques fluorescentes,ainsi que les conjugues de telles particules et les compositions diagnostiques , therapeutiques ou prophylactiques les contenant
FR02/07545 2002-06-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004001414A1 true WO2004001414A1 (fr) 2003-12-31

Family

ID=29719860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2003/001884 WO2004001414A1 (fr) 2002-06-19 2003-06-19 Nanoparticules magnetiques fluorescentes

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2003260611A1 (fr)
FR (1) FR2841156B1 (fr)
WO (1) WO2004001414A1 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1651957A1 (fr) * 2003-08-08 2006-05-03 Tsinghua University Nanoparticules magnetiques fluorescentes et leur procede de preparation
CN102023209A (zh) * 2009-09-11 2011-04-20 富士胶片株式会社 使用胶乳粒子的免疫测定方法
US20110262415A1 (en) * 2008-12-21 2011-10-27 Cnr - Consiglio Nazionale Delle Ricerche Erythrocyte-based delivery system, method of preparation and uses thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1718341A2 (fr) * 2004-01-20 2006-11-08 Alnis Biosciences, Inc. Articles comprenant un materiau magnetique et des agents bioactifs

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991009141A1 (fr) * 1989-12-14 1991-06-27 Baxter Diagnostics Inc. Particules polymeres fluorescentes a sensibilite magnetique et leur application
WO1998008094A1 (fr) * 1996-08-23 1998-02-26 Amcell Corporation Detection sensible de marqueurs de surface de cellules sur des cellules viables
WO1999062079A1 (fr) * 1998-05-26 1999-12-02 Bar-Ilan University Nucleation et croissance de nanoparticules d'oxyde metallique magnetique et utilisation de ces dernieres
WO2000043783A2 (fr) * 1999-01-23 2000-07-27 Minerva Biotechnologies Corporation Interaction entre des espèces immobilisées sur des colloïdes et des espèces existant sur des structures colloïdales
WO2000046839A2 (fr) * 1999-02-05 2000-08-10 University Of Maryland, Baltimore Nanoparticules tenant lieu de sondes a luminescence
WO2001073117A1 (fr) * 2000-03-31 2001-10-04 MEMOREC STOFFEL GmbH - MEDIZINISCH-MOLEKULARE ENTWICKLUNG, KÖLN Utilisation de particules, aptes a transmettre des signaux et possedant au moins un groupe d'affinite pour les acides nucleiques marques
US20010046602A1 (en) * 2000-04-06 2001-11-29 Chandler Don J. Magnetically-responsive microspheres
WO2001098765A1 (fr) * 2000-06-21 2001-12-27 Bioarray Solutions, Ltd. Analyse moleculaire multi-analyte
WO2002018643A2 (fr) * 2000-08-11 2002-03-07 Nanosphere Inc. Nanoparticules comportant des oligonucleotides fixes dessus et utilisations associees

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991009141A1 (fr) * 1989-12-14 1991-06-27 Baxter Diagnostics Inc. Particules polymeres fluorescentes a sensibilite magnetique et leur application
WO1998008094A1 (fr) * 1996-08-23 1998-02-26 Amcell Corporation Detection sensible de marqueurs de surface de cellules sur des cellules viables
WO1999062079A1 (fr) * 1998-05-26 1999-12-02 Bar-Ilan University Nucleation et croissance de nanoparticules d'oxyde metallique magnetique et utilisation de ces dernieres
WO2000043783A2 (fr) * 1999-01-23 2000-07-27 Minerva Biotechnologies Corporation Interaction entre des espèces immobilisées sur des colloïdes et des espèces existant sur des structures colloïdales
WO2000046839A2 (fr) * 1999-02-05 2000-08-10 University Of Maryland, Baltimore Nanoparticules tenant lieu de sondes a luminescence
WO2001073117A1 (fr) * 2000-03-31 2001-10-04 MEMOREC STOFFEL GmbH - MEDIZINISCH-MOLEKULARE ENTWICKLUNG, KÖLN Utilisation de particules, aptes a transmettre des signaux et possedant au moins un groupe d'affinite pour les acides nucleiques marques
US20010046602A1 (en) * 2000-04-06 2001-11-29 Chandler Don J. Magnetically-responsive microspheres
WO2001098765A1 (fr) * 2000-06-21 2001-12-27 Bioarray Solutions, Ltd. Analyse moleculaire multi-analyte
WO2002018643A2 (fr) * 2000-08-11 2002-03-07 Nanosphere Inc. Nanoparticules comportant des oligonucleotides fixes dessus et utilisations associees

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KERN N ET AL: "Vesicles decorated with magnetic particles", EUROPHYSICS LETTERS, 10 MAY 1997, EUR. PHYS. SOC, SWITZERLAND, vol. 38, no. 5, pages 395 - 400, XP008015610, ISSN: 0295-5075 *
ROBERTS D ET AL: "SYNTHESIS OF GADOLINIUM OXIDE MAGNETOLIPOSOMES FOR MAGNETIC RESONANCE IMAGING", JOURNAL OF APPLIED PHYSICS, AMERICAN INSTITUTE OF PHYSICS. NEW YORK, US, vol. 87, no. 9, 1 May 2000 (2000-05-01), pages 6208 - 6210, XP000953964, ISSN: 0021-8979 *
SANGREGORIO C ET AL: "A NEW METHOD FOR THE SYNTHESIS OF MAGNETOLIPOSOMES", JOURNAL OF APPLIED PHYSICS, AMERICAN INSTITUTE OF PHYSICS. NEW YORK, US, vol. 85, no. 8, 15 April 1999 (1999-04-15), pages 5699 - 5701, XP000902189, ISSN: 0021-8979 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1651957A1 (fr) * 2003-08-08 2006-05-03 Tsinghua University Nanoparticules magnetiques fluorescentes et leur procede de preparation
EP1651957A4 (fr) * 2003-08-08 2006-11-02 Univ Tsinghua Nanoparticules magnetiques fluorescentes et leur procede de preparation
US7875466B2 (en) 2003-08-08 2011-01-25 Capitalbio Corporation Fluorescent magnetic nanoparticles and process of preparation
US9512001B2 (en) 2003-08-08 2016-12-06 Capitalbio Corporation Fluorescent magnetic nanoparticles and process of preparation
US20110262415A1 (en) * 2008-12-21 2011-10-27 Cnr - Consiglio Nazionale Delle Ricerche Erythrocyte-based delivery system, method of preparation and uses thereof
CN102023209A (zh) * 2009-09-11 2011-04-20 富士胶片株式会社 使用胶乳粒子的免疫测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
FR2841156B1 (fr) 2004-09-10
AU2003260611A1 (en) 2004-01-06
FR2841156A1 (fr) 2003-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1397429B1 (fr) Particules composites, conjugues derives, procede de preparation et applications
EP1226438B1 (fr) Nanospheres composites et leurs conjugues avec des biomolecules
EP0840648B1 (fr) Particules superparamagnetiques et monodisperses
EP1966260B1 (fr) Procede de preparation de particules composites, particules composites obtenues et leur utilisation dans un test diagnostic
Di Corato et al. Water solubilization of hydrophobic nanocrystals by means of poly (maleic anhydride-alt-1-octadecene)
EP0712426B1 (fr) Latex fluorescent comportant au moins deux fluorochromes, procede d'obtention et application
KR20100066478A (ko) 분자 식별 재료와 그 제조 방법
CN1328641A (zh) 带有聚合物壳的纳米颗粒
US7129293B2 (en) Crosslinked polymers, fine polymer particle, and process for producing these
Tan et al. PMMA microspheres with embedded lanthanide nanoparticles by photoinitiated dispersion polymerization with a carboxy-functional macro-RAFT agent
CA2157811A1 (fr) Microsphere de latex biotinylee, procede de preparation d'une telle microsphere et utilisation en tant qu'agent de detection biologique
CN111944191B (zh) 一种量子点荧光微球及其制备方法
FR2691969A1 (fr) Nanoparticules de polymères fonctionnalisées, leur procédé de préparation et leur utilisation.
EP0777691B1 (fr) Procede de preparation par polymerisation en dispersion d'un latex monodisperse calibre
FR2762394A1 (fr) Compose ligand de coordination et utilisation pour fixer un materiel biologique
WO2004001414A1 (fr) Nanoparticules magnetiques fluorescentes
JPH02183165A (ja) 診断テスト用水性懸濁液
WO2023057582A1 (fr) Nouvelles nanoparticules destinées à être utilisées dans la détection de biomolécules cibles
FR2800636A1 (fr) Particules composites, conjugues derives, leur procede de preparation et utilisations
CA2476036A1 (fr) Chaines colloidales irreversibles porteuses de sites de reconnaissance
JP4086188B2 (ja) 架橋ポリマー、ポリマー微粒子およびそれらの製造方法
WO2016027021A1 (fr) Procédé de production d'une phase de capture pour la détection d'une cible biologique, procédés et kits de détection associes
JP2021036230A (ja) 粒子及びその製造方法、アフィニティー粒子、検査試薬、検査キット、並びに検出方法
JPH0725664B2 (ja) 生体成分を担持したマイクロカプセル化磁性体超微粒子

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP