WO2004001367A2 - Testsystem zum nachweis von krebserkrankungen - Google Patents

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WO2004001367A2
WO2004001367A2 PCT/DE2003/002156 DE0302156W WO2004001367A2 WO 2004001367 A2 WO2004001367 A2 WO 2004001367A2 DE 0302156 W DE0302156 W DE 0302156W WO 2004001367 A2 WO2004001367 A2 WO 2004001367A2
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cancer
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Ulf R. Rapp
Hans-Harald Sedlacek
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MedInnova Gesellschaft für medizinische Innovationen aus akademischer Forschung mbH
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    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds

Definitions

  • the invention relates to a test system for detecting cancer or the risk of cancer, screening methods for finding substances for the treatment and / or prophylaxis of cancer, cells and transgenic non-human mammals for carrying out the screening method and uses of active substances identified by means of such screening methods.
  • Raf kinases are critically involved in signaling from receptors of different growth factors.
  • Raf-MEK-ERK signal transmission path which regulates cell growth, differentiation, proliferation and survival
  • Three Raf isoenzymes (A, B and C Raf) are known to date. These have overlapping functions in the control of the classic signal transmission path. However, they also each have specific functions when interacting with metabolic enzymes, proteasome regulator proteins and proteins of the Bcl-2 family.
  • Raf kinases also influence the Raf-MEKK-IKK-NFkB signal transmission path. Activation of NFkB is associated with cell transformation by Raf oncogenes. Dommant negative mutants that block the activation of NFkB also inhibit cell transformation by oncogenic C-Raf (Baumann et al., PNAS USA 97: 4615-4620 (2000)).
  • Another signal transmission path connects C-Raf with Bcl-2, some Bcl-2-interacting proteins such as BAG-1 and the pore protein VDAC (voltage-dependent anion channel) in the outer membrane of the mitochondria.
  • C-Raf binds to these proteins, is localized with them on the outer membrane of the mitochondria and cooperates with Bcl-2 in the inhibition of cytochrome C release and apoptosis (Wang et al., Oncogene 9: 2751-2756 (1994); Wang et al., Cell 87: 629-638 (1996); Wiese et al., Nat Neurosi 4: 137-142 (2001); Troppmaier et al., Curr Top Microbiol Im unol 182: 453-460 (1992).
  • the Bcl-2 family of proteins consists of both inhibitors and promoters of apoptosis. Its main 20 functions are that of an ion channel and a binding protein.
  • Inhibitors of apoptosis include Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Brag-1, Mc-1, and All. Members of this group have 4 domains, exclusive of the BH4 domain, via which these apoptosis inhibitors bind C-Raf and other regulatory proteins and can couple to the mitochondrial membrane.
  • Promoters of apoptosis include Bax, BAD, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, and Hrk. These promoters lack at least one domain, in most cases (with the exception of Bcl-Xs) the BH4 domain. (For an overview, see Kroemer et al., Nature Med, 3: 614 (1997); Chang et al. , EMBO J 16: 968-977 (1997)).
  • Bcl-2 family apoptosis inhibitors are considered oncogenic. Their expression is induced, for example, by Myb, Ras, and AML-ETO (Klampfer et al., PNAS USA, 93: 14059-14064, (1996); Taylor et al., Genes Dev 10: 2732-2744, (1996)) ,
  • the expression of Bcl-2 is often increased in myeloid leukemia and in tumors of the esophagus, stomach, colon and rectum and often inversely proportional to the expression of p53 and c-myc (Choi et al., Oncogene 11: 1693- 1698, (1995); Delia et al., Blood 79: 1291-1298, (1992), Vietnamese et al., Eur J Cancer 34: 1268-1273, (1998); Torzewski et al., Clin Cancer Res 4: 577-583, (1998) Kroemer and Reed, Nat Med 6: 513-519 (2000)).
  • Bcl-2 family apoptosis promoters are considered tumor suppressors. Negative mutations can be found in tumors (Rampmo et al., Science 275: 967-969,
  • All members of the Bcl-2 family form homodimers or selected combinations of heterodimers.
  • the formation of heterodimers from apoptosis inhibitors with apoptosis promoters neutralizes the anti-apoptotic effect of the inhibitors.
  • small molecular inhibitors Huang et al., WO 00/04901; Hockenberry et al., WO 01/14365; Wang et al., WO 02/13833
  • antibodies against Bcl-2 beets et al., WO 01/57060 used to inhibit Bcl-2.
  • Bcl-2 overexpression could not reduce the cytokm-dependency of Raf overexpressing cells and, on the other hand, Bcl-2 overexpression did had a protective effect on Raf overexpressing cells in that Bcl-2 delayed the exit from the S and G2 / M phases of cell division (Moye et al., Leukemia 14: 1060-1079 (2000)). It is also known from other systems that high levels of Bcl-2 can inhibit cell cycle progression (Pietenpol et al., Cancer Res 54: 3714-3717 (1994)); O'Connor et al Curr Opin Cell Biol 12: 257-263 (2000)).
  • the invention is based on the technical problem of improving the reliability of diagnosis of cancer diseases, in particular of risks of cancer, and of specifying means for improved treatment of cancer diseases. Outlines of the invention and preferred embodiments.
  • the invention teaches a test system with means for detecting at least one anti-apoptotic member of the Bcl-2 family and with means for detecting at least one member of the Raf family.
  • the invention teaches the use of a test system according to the invention for the (vitro) diagnosis of cancer or a risk of cancer in human and / or non-human mammals.
  • a diagnostic method can thus be carried out with the invention, wherein m vitro or in vivo cells of a patient are examined for co-expression of a member of the Bcl-2 family and a member of the Raf family, if appropriate for overexpression of a member of one or both families ,
  • the invention teaches the use in screening for substances which express the expression or function of the member of a cell in a cell which constitutively expresses both an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family and a member of the Raf family Bcl-2 family reduced.
  • the invention further teaches an isolated human or non-human cell or a transgenic non-human mammal, in particular Rodent, for use in a method according to the invention, the cell or cells of a defined tissue of the transgenic non-human mammal being both an anti-apoptotic member the Bcl-2 family as well as a member of the Raf Family constitutively expressed and a method of screening for active substances for the treatment of cancer, wherein a prospective active substance or a mixture of such substances is supplied to the cell or the non-human mammal in a physiologically effective dose, followed by the amount and / or activity of the anti-apoptotic member of the Bcl-2 family is measured, the amounts and / or activities of the anti-apoptotic member of the Bcl-2 family being compared before and after the addition of the prospective active substance or the mixture, and a prospective active substance which leads to a reduction the quantity and / or activity, if necessary after deconvolution, is selected.
  • the invention teaches the use of an active substance identified by means of a method according to the invention for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of cancer.
  • the invention can be used to practice a method for the treatment of cancer, wherein a patient is given a physiologically effective dose of the identified active substance in a suitable galenical preparation, if necessary after prior use of the diagnostic method explained above.
  • the administration can be carried out in a defined treatment plan, the dosage (amounts of a dose and time intervals between doses) taking place with the proviso of a demonstrable reduction in the amount and / or activity of the member of the Bcl-2 family or a pathologically detectable improvement in the clinical picture.
  • the invention is based on the finding that the expression of an antiapoptotic member of the Bcl-2 family increases the susceptibility of a cell to tumor development by the Raf protein. It was found within the scope of the invention that, for example, the expression of Bcl-2 accelerates the tumor development by an oncogenic Raf protein, whereby this effect of Bcl-2 cannot be compensated for by a constitutive expression, ie an increased effect of the oncogenic Raf protein .
  • the detection of, for example, Bcl-2 and oncogenic Raf is ultimately predictive for the development of a tumor in the tissue from which the cells of the finding originate.
  • Anti-apoptotic members of the Bcl-2 family are, for example, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1 and AI.
  • Bcl-2 is preferably detected in the context of the invention.
  • Raf Raf
  • A-Raf A-Raf
  • B-Raf oncogenic mutations of C-Raf, A-Raf or B-Raf.
  • C-Raf or mutated C-Raf is preferably detected in the context of the invention.
  • the expression of at least one member of the Bcl-2 family and at least one member of the Raf family is detected by detecting the RNA or by detecting the protein.
  • the detection of the respective mRNA is preferably carried out with the help of the reverse transcriptase polychain reaction (RT-PCR) with the help of specific ones
  • the constitutive expression in the context of a transgenic non-human mammal or an isolated transformed human or non-human cell can be established by placing the gene of the Bcl-2 family and the gene of the Raf family under the control of suitable promoters.
  • the Raf gene for example, the SP-C promoter comes into question.
  • the constitutive expression takes place predominantly in lung cells.
  • the Bcl-2 gene for example, the HSK promoter comes into question. In particular, this allows screening for active substances which are suitable for the treatment of lung cancer.
  • Other suitable promoters can easily be used for other indications.
  • test system that is to say by the detection of at least one anti-apoptotic member of the Bcl-2 family and at least one member of the Raf family in a cell or in a tissue, for example in bronchial epithelial cells, it can be stated according to this invention whether a There is a risk that the respective tissue will transform into a tumor tissue. If this risk is detected, this test system enables early to ⁇ application of preventive measures, such as the avoidance of exposure to carcinogenic substances and the use of dietary, pharmacotherapeutic and / or surgical procedures.
  • the prospective active substance to be tested is added to the cells according to the invention, preferably kept in suspension and tested with the test system according to the invention, in concentrations of 0.1 nmol up to 100 ⁇ ol and it is checked whether the active substance is capable of expressing an anti-apoptotic member of the Reduce Bcl-2 family and / or a member of the Raf family.
  • homologs are also included in the scope of the invention, the homology with the known genes or proteins being at least 80%, preferably more than 90%, most preferably more than 95%.
  • complementary or allelic variants are also included.
  • sequences are included which only represent partial sequences of the known sequences, with the proviso that in the case of the nucleic acids these partial sequences have a length, at least 50 bases, sufficient for hybridization with a nuclear acid according to the invention and, in the case of the proteins or peptides, at least the same Affinity for a protein or peptide specific Bind target molecule.
  • all nucleic acids hybridizing with the known nucleic acids are included, namely those which are used under strict conditions (5 ° C. to 25 ° C. below the melting temperature; see additionally JM Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and EM Southern, J Mol Biol, 98: 503ff (1975)) hybridize.
  • the invention also includes expression cassettes, ie one or more of the nucleic acid sequences used according to the invention for em Bcl-2 member and Raf member, each with at least one control or regulatory sequence.
  • the terms of the Bcl-2 families and / or Raf families include nucleic acids or proteins in addition to the full lengths of the sequences mentioned (see also the preceding paragraph) and also partial sequences thereof, with a
  • Minimum length of 12 nucleotides preferably 30 to 90 nucleotides, in the case of nucleic acids and a minimum length of 4 amino acids, preferably 10 to 30 amino acids, in the case of peptides or proteins.
  • diagnosis and / or treatment of cancer also include the detection and / or treatment of metastases from primary tumors.
  • Mimicry molecules are compounds which emulate the variable region, in particular the region of an antibody, and bind to a target molecule in the same place as the underlying antibody.
  • the term antibody encompasses polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, non-human, human and humanized antibodies, as well as phage display antibodies, but also chimeric antibodies and anti-diotypic antibodies as well as specific fragments of the light and / or heavy chain of the variable region lying antibody of the above type.
  • the production or production of such antibodies with given immunogens is well known to the average person skilled in the art and need not be explained in more detail.
  • a reporter group set up as part of a detector substance is an atom, molecule or a compound which, in conjunction with an assay placed thereon, enables the detection of the reporter group and the compound or substance thus connected to the reporter group.
  • reporter groups and associated detection methods are: 32P label mg and intensity measurement using a phosphoimager. Many other examples are known to the average person skilled in the art and do not require a detailed list.
  • Example 1 Production and typing of transgenic mice.
  • mice transgenic for one shortened activated C-Raf kinase (C-Raf BxB) under the control of the surfactant protein-C (SP-C) promoter (Kerkhoff et al., Cell Growth Diff 11: 185-190 (2000)), mice, deficient in at -2 (Michaelidis et al., Neuron 17: 75-89 (1996) and mice, transgenic for human bcl -2 under the control of the HSK promoter (Domen et al., Blood 91: 2272-2282 (1998))
  • SP-C surfactant protein-C
  • mice strains were genotyped with the help of PCR (Invitrogen reagents) and primers, specifically for the respective transgenes.
  • primers specifically for the respective transgenes.
  • sequence listing Seq. ID See also the sequence listing Seq. ID
  • H2K sense 5'- CGC GGA CGC TGG ATA TAA AGT C -3 '
  • mice transgenic for SP-C crafBxB are known to have all adenomas with a relatively short latency
  • Example 2 Influencing the Formation of Tumors.
  • mice deficient in bcl -2, live up to about a year without showing an accumulation of tumor diseases (Veis et al., Cell 75: 229-240 (1993)). Mice expressing human Bcl-2 also lived without an accumulation of tumors (Domen et al., Blood 91: 2272-2282 (1998)).
  • mice transgenic for SP-CcrafBXB In mice transgenic for SP-CcrafBXB, the level of endogenous bcl-2 RNA and protein rose up to about 1.5 months and then remained stable at this elevated level.
  • SP-CcrafBXB transgenic animals lacking the bcl-2 allele showed no difference in the latency of tumor development, whereas animals lacking both alleles showed a significant delay in the development of tumors.
  • the latency of tumor development was again approximately the same as in bcl -2 (+ / +) mice.
  • Bcl-2 increases the oncogenic effects of Raf in such a way that tumors with a shorter latency period occur.
  • This effect of Bcl-2 cannot be compensated for by a constitutive expression of, for example, C-Raf.
  • the detection of Bcl-2 and oncogenic Raf in a tissue is therefore predictive for the development of a tumor in this tissue.
  • the biopsy material is obtained according to the location of the respective tumor, it will be both healthy tissue and tumor tissue were removed.
  • the mRNA is then isolated using a suitable method.
  • the mRNA was isolated from lung tumor tissue and neighboring normal lung tissue using the commercially available RNeasy kit from Quiagen in accordance with the manufacturer's instructions.
  • the mRNA is then reverse transcribed, for example using the Omniscript RT Kit from Quiagen in accordance with the manufacturer's instructions and a
  • Oligo-dT primer A PCR reaction is now carried out with a cycler, for example the Robo-Cycler from Stratagene, with the following primers and conditions (Leng et al., Eur J Pharmacol 409 (2000): 123; Deshpande and Moore, Mol Cell Biochem 178 (1998 ): 47)):
  • the PCR is carried out in a volume of 50 ul with 1 ul RT product, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.1% Triton X-100, 1.5 1.5 mM MgC12, 0.3 ⁇ M of the corresponding specific 5 'and 3' primers and 2 U Taq DNA polymerase (Stratagene).
  • the conditions are as follows: 94 ° C, 5 mm, 30 cycles bcl-2 / b-Aktm or 35 cycles c-raf-1 / b-actin with 94 ° C 45 s, 55 ° C 45 s and 72 ° C 1 mm. Finally, a final extension was carried out at 72 ° C for 5 minutes.
  • the products are separated by agarose gel electrophoresis and the relative product concentration is determined densiometrically.
  • the quotient of the relative concentration of the bcl-2 or c-raf-1 product is formed with the b-actm product, which is equated to the relative expression of bcl-2 or c-raf-1.
  • transgenic non-human mammal that this advantageously expresses a member of the raf family and one of the Bcl-2 family in a tissue-specific manner.
  • Tissue specificity can be set up, for example, in that at least the member of the raf family is under the control of a tissue-specific regulatory sequence
  • An essential element of the invention is that the inhibition of the member of the Bcl-2 family inhibits the raf-correlated tumorigenesis, ie the tumorigenesis of tumors which are upstream of raf depending on the mitogenic cascade.
  • the invention therefore also relates to a method for the prophylaxis and treatment of cancer, the uncontrolled proliferation of the cancer cells being dependent on the function of the mitogenic cascade, a person suffering from such a disease or the risk of such a disease
  • a pharmaceutical composition containing a substance that inhibits at least one member of the Bcl-2 family, in a physiologically effective dose.
  • the pharmaceutical composition can additionally (in a mixture or separate administration form) contain a raf inhibitor in a physiologically effective dose.
  • the invention relates to the reduction of the interaction of a member of the Bcl-2 family with a member of the raf family of an organism, preferably by inhibiting one or both members of said families.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Testsystem mit Mitteln zur De­tektion zumindest eines antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie sowie mit Mitteln zur Detektion zumindest eines Mitgliedes der Raf Familie sowie Verwendungen eines solchen Testsystems.

Description

Testsystem zum Nachweis von Krebserkrankungen
Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft ein Testsystem zum Nachweis von Krebserkrankungen oder dem Risiko einer Krebserkrankung, Screening Verfahren zur Findung von Substanzen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krebserkrankungen, Zellen und transgene nicht menschliche Säugetiere zur Durchführung des Screening Verfahrens sowie Verwendungen mittels solcher Screening Verfahren identifizierter Wirkstoffe.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.
Ein Großteil von Tumoren ist vergesellschaftet mit genetischen Veränderungen. Zu diesen zählen im Besonderen Punktmutationen der Raf-aktivierenden Onkogene, hauptsäch- lieh von ras (Fong und Minna, Clin ehest Med 23: 83-101 (2002)) und Überexpression von C-Raf (Rapp et al . , J Int Assoc for the Study of Lung Cancer 4: 162-167, (1988)) oder Bcl-2 (Ranger et al., Nat Genet 28: 113-118 (2001)).
Raf-Kinasen sind an der Signalübertragung von Rezeptoren unterschiedlicher Wachstumsfaktoren in entscheidender Weise beteiligt.
Zum einen läuft diese Beteiligung über den klassischen Raf-MEK-ERK Signalübertragungsweg, welcher Zellwachstum, Differenzierung, Proliferation und Überleben reguliert (Daum et al . , Trends Biochem Sei 19: 474-480 (1994)). Hierbei scheint ein entscheidender Faktor die Intensität des Raf-Signales zu sein: geringe Intensität stimuliert die Proliferation und hohe Intensität inhibiert die Zellteilung und Differenzierung (Kerkhoff und Rapp Oncogene 17: 1457-1462, (1998)). Drei Raf-Isoenzyme (A-,B- und C-Raf) sind bislang bekannt. Diese haben überlappende Funktionen bei der Kontrolle des klassischen Signaluber- tragungsweges . Sie besitzen jedoch auch jeweils spezifische Funktionen bei der Interaktion mit metabolischen Enzymen, Proteasom-Regulator-Proteinen und Proteinen der Bcl-2-Famιlιe . Raf-Kinasen beeinflussen desweiteren den Raf-MEKK-IKK-NFkB Signalubertragungsweg. Aktivierung von NFkB ist vergesellschaftet mit der Zelltransformation durch Raf-Oncogene . Dommant-negativ-Mutanten, die die Aktivierung von NFkB blockieren, hemmen zugleich auch die Zelltransfomation durch oncogenes C-Raf (Baumann et al., PNAS USA 97: 4615-4620 (2000)).
Ein weiterer Signalubertragungsweg verbindet C-Raf mit Bcl-2, einigen Bcl-2 mteragierenden Proteinen wie BAG-1 und dem Porenprotein VDAC (voltage-dependent anion Channel) m der äußeren Membran der Mitochondrien. C-Raf verbindet sich mit diesen Proteinen, ist mit ihnen an der Außenmembran der Mitochondrien lokalisiert und kooperiert mit Bcl-2 in der Inhibition der Cytochrom C Freisetzung und der Apoptose (Wang et al . , Oncogene 9: 2751-2756 (1994); Wang et al . , Cell 87: 629-638 (1996); Wiese et al., Nat Neurosi 4: 137-142 (2001); Troppmaier et al . , Curr Top Microbiol Im unol 182: 453-460 (1992).
Die Inhibition der Apoptose durch C-Raf ist jedoch nicht zwingend an die Anwesenheit von Bcl-2 gebunden, da an Mitochondrien lokalisiertes C-Raf auch ohne Bcl-2 antiapoptotisch wirken kann (Zhong et al . , Oncogene 20: 137-142 (2001) ) .
Untersuchungen zur Bildung von Tumoren in Mausen m Ab- 5 hangigkeit von der Expression von Raf alleme oder in Kombination mit myc ergaben, dass die Neigung bzw. Suszeptibilitat für die Entstehung von Raf- oder Myc- exprimierenden Tumoren von wenigen, möglicherweise nur von einem Gen kontrolliert wird (Klinken et al . , J Virol 63:
10 2411-2414 (1989)). Dieses Suszeptibilitatsgen war bislang jedoch unbekannt. Seme Kenntnis wurde es ermöglichen, Patienten zu identifizieren, welche mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit Tumoren entwickeln. Bei derartigen Patienten konnten gezielte Vorsorgeprogramme zu Verhinderung
15 von Tumoren bzw. für deren Fruherkennung eingesetzt werden.
Die Bcl-2 Protem-Familie besteht sowohl aus Inhibitoren wie auch aus Promotoren der Apoptose. Ihre wesentlichen 20 Funktionen sind die eines Ionen-Kanales und eines Bindeproteins .
Zu den Inhibitoren der Apoptose gehören Bcl-2, Bcl-X, Bcl- w, Brag-1, Mc-1, und All. Mitglieder dieser Gruppe be- 25 sitzen 4 Domänen, klusiv der BH4 Domäne, über welche diese Inhibitoren der Apoptose C-Raf und andere regulatorische Proteine binden und an die Mitochondrien- Membran koppeln können.
30 Zu den Promotoren der Apoptose gehören Bax, BAD, Bak, Bcl- Xs, Bid, Bik, und Hrk. Diesen Promotoren fehlt zumindest eine Domäne, m den meisten Fallen (mit Ausnahme von Bcl- Xs) die BH4 Domäne. (Übersicht siehe bei Kroemer et al . , Nature Med, 3:614 (1997); Chang et al . , EMBO J 16: 968-977 (1997) ) .
Alle Inhibitoren der Apoptose der Bcl-2 Familie gelten als onkogen. Ihre Expression wird beispielsweise durch Myb, Ras, und AML-ETO induziert (Klampfer et al . , PNAS USA, 93: 14059-14064, (1996); Taylor et al . , Genes Dev 10: 2732- 2744, (1996)). Die Expression von Bcl-2 ist häufig gesteigert bei der myeloischen Leukämie und bei Tumoren der Speiserohre, des Magens, des Kolons und des Rektums und häufig umgekehrt proportional der Expression von p53 und c-myc (Choi et al., Oncogene 11: 1693-1698, (1995); Delia et al., Blood 79: 1291-1298, (1992), Popescu et al . , Eur J Cancer 34: 1268-1273, (1998); Torzewski et al . , Clin Cancer Res 4: 577-583, (1998) Kroemer und Reed, Nat Med 6: 513-519 (2000) ) .
Promotoren der Apoptose der Bcl-2 Familie gelten als Tu- morsuppressoren. Negativ-Mutationen können m Tumoren ge- funden werden (Rampmo et al . , Science 275: 967-969,
(1997), Ouyang et al . , Clin Cancer Res 4: 1071-1074,
(1998) ) .
Alle Mitglieder der Bcl-2 Familie bilden Homodimere oder ausgewählte Kombinationen von Heterodimere. Die Bildung von Heterodimeren aus Inhibitoren der Apoptose mit Promotoren der Apoptose neutralisiert die antiapoptotische Wirkung der Inhibitoren.
In Anbetracht des onkogenen Potentials von Bcl-2 oder von Raf wurde versucht, durch antisense-Oligonukleotide die Translation von bcl -2 spezifisch zu inhibieren (Tamm et al., Lancet 358: 489-497 (2001); Ackermann et al . , WO 00/40595; Zangemeister-Wittke et al . , WO 00/66724; Warrel et al., WO 02/17852). Alternativ wurden kleinmolekulare Inhibitoren (Huang et al . , WO 00/04901; Hockenberry et al., WO 01/14365; Wang et al . , WO 02/13833) oder Antikor- per gegen Bcl-2 (Rüben et al . , WO 01/57060) zur Inhibition von Bcl-2 verwendet.
Untersuchungen über die Wechselwirkung zwischen Bcl-2 und Raf in Hinblick auf eine Zytokin-abhangige Proliferation von hamatopoietischen Zellen ergaben, dass eine Bcl-2 Uberexpression die Cytokm-Abhangigkeit von Raf uberex- primierenden Zellen nicht reduzieren konnte und andererseits eine Bcl-2 Überexpression eine protektive Wirkung auf Raf uberexprimierende Zellen dadurch hatte, dass Bcl-2 den Exit aus den S- und G2/M Phasen der Zellteilung verzögerte (Moye et al . , Leukemia 14: 1060-1079 (2000)). Auch aus anderen Systemen ist bekannt, dass hohe Spiegel an Bcl-2 die Zellzyklusprogression inhibieren können (Pieten- pol et al., Cancer Res 54: 3714-3717 (1994)); O'Connor et al Curr Opin Cell Biol 12: 257-263 (2000)).
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, die Diagnosesicherheit für Krebserkrankungen, insbesondere von Risiken einer Krebserkrankung, zu verbessern, sowie Mittel zur verbesserten Behandlung von Krebserkrankungen anzugeben. Grundzuge der Erfindung und bevorzugte Ausfuhrungsformen .
Zur Losung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Testsystem mit Mitteln zur Detektion zumindest eines antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie sowie mit Mitteln zur Detektion zumindest eines Mitgliedes der Raf Familie .
Weiterhin lehrt die Erfindung die Verwendung eines er- fmdungsgemaßen Testsystems zur ( vitro) Diagnose einer Krebserkrankung oder eines Risikos einer Krebserkrankung bei menschlichen und/oder nicht-menschlichen Saugetieren. Mit der Erfindung kann somit ein Diagnoseverfahren ausgeübt werden, wobei m vitro oder in vivo Zellen eines Patienten auf Co-Expression eines Mitgliedes der Bcl-2 Familie und eines Mitgliedes der Raf Familie, ggf. auf Uberexpression eines Mitgliedes einer oder beider Familien, untersucht werden.
Als weitere Verwendung des erfmdungsgemaßen Testsystems lehrt die Erfindung den Einsatz beim Screenen nach Substanzen, welche in einer Zelle, die sowohl ein antiapop- totisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch ein Mitglied der Raf Familie konstitutiv exprimiert, die Expression oder Funktion des Mitgliedes der Bcl-2 Familie reduziert.
Weiterhin lehrt die Erfindung eine isolierte menschliche oder nicht-menschliche Zelle oder ein transgenes nicht- menschliches Saugetier, insbesondere Rodent, zur Ver- wendung in einem erfmdungsgemaßen Verfahren, wobei die Zelle oder Zellen eines definierten Gewebes des transgenen nicht-menschlichen Saugetiers sowohl ein antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch ein Mitglied der Raf Familie konstitutiv exprimiert und ein Verfahren zum Screenen nach Wirksubstanzen zur Behandlung von Krebs, wobei der Zelle oder dem nicht-menschlichen Säugetier eine prospektive Wirksubstanz oder eine Mischung solcher Sub- stanzen in einer physiologisch wirksamen Dosis zugeführt werden, wobei anschließend die Menge und/oder Aktivität des antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie gemessen wird, wobei die Mengen und/oder Aktivitäten des antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie vor und nach der Zugabe der prospektiven Wirksubstanz oder der Mischung miteinander verglichen werden und wobei eine prospektive Wirksubstanz, die zu einer Verringerung der Menge und/oder Aktivität geführt hat, ggf. nach Dekonvolution, selektiert wird.
Schließlich lehrt die Erfindung die Verwendung einer mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Wirksubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs. Mit der Erfindung kann ein Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen ausgeübt werden, wobei einem Patienten, ggf. nach vorheriger Anwendung des vorstehend erläuterten Diagnoseverfahrens, eine physiologisch wirksame Dosis der identifizierten Wirksubstanz, in geeigneter galenischer Herrichtung, verabreicht wird. Die Verabreichung kann in einem definierten Behandlungsplan erfolgen, wobei die Dosierung (Mengen einer Gabe und Zeitintervalle zwischen Gaben) mit der Maßgabe einer nachweisbaren Reduktion der Menge und/oder Aktivität des Mitgliedes der Bcl-2 Familie oder einer pathologisch detektierbaren Verbesserung des Krankheitsbildes erfolgt. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Expression eines antiapoptotisch wirkenden Mitgliedes der Bcl-2 Familie die Empfänglichkeit einer Zelle zur Tumorentwicklung durch das Raf Protein steigert. So wurde im Rahmen der Erfindung gefunden, dass beispielsweise die Expression von Bcl-2 die Tumorentwicklung durch ein onkogenes Raf- Protein beschleunigt, wobei diese Wirkung von Bcl-2 nicht durch eine konstitutive Expression, d.h. verstärkte Wirkung des onkogenen Raf-Proteins kompensiert werden kann. Der Nachweis von beispielsweise Bcl-2 und onkogenem Raf ist letztendlich prädiktiv für die Entwicklung eines Tumors in dem Gewebe, aus welchem die Zellen des Befundes stammen .
Antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind beispielsweise Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1 und AI. Bevorzugt im Rahmen der Erfindung wird Bcl-2 nachgewiesen.
Mitglieder der Raf-Familie sind beispielsweise C-Raf, A- Raf, B-Raf und onkogene Mutationen von C-Raf, A-Raf oder B-Raf. Bevorzugt im Rahmen der Erfindung wird C-Raf oder mutiertes C-Raf nachgewiesen.
Der Nachweis der Expression mindestens eines Mitgliedes der Bcl-2 Familie und mindestens eines Mitgliedes der Raf Familie erfolgt durch den Nachweis der RNA oder über den Nachweis des Proteins. Der Nachweis der jeweiligen mRNA wird vorzugsweise mit Hilfe der reverse transcriptase - polychain-reaktion (RT-PCR) mit Hilfe von spezifischen
Primern durchgeführt, der Nachweis der jeweiligen Proteine vorzugsweise mit Hilfe von spezifischen Liganden, beispielsweise mit Hilfe von spezifischen Antikörpern oder Mimikryverbindungen solcher Antikörper. Beide Nachweismethoden sind dem Fachmann bekannt. Antikörper gegen Bcl-2 sind beispielsweise sind käuflich zu erwerben (Santa Cruz Biotech, Dako) .
Die konstitutive Expression im Rahmen eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers oder einer isolierten transformierten menschlichen oder nicht-menschlichen Zelle kann dadurch eingerichtet sein, daß das Gen der Bcl-2 Familie und das Gen der Raf Familie unter die Kontrolle geeigneter Promotoren gestellt ist. Im Falle des Raf Gens kommt beispielsweise der SP-C-Promotor in Frage. Dann erfolgt die konstitutive Expression vorwiegend in Lungenzellen. Im Falle des Bcl-2 Gens kommt beispielsweise der HSK Promotor in Frage. Dies erlaubt insbesondere das Screenen nach Wirksubstanzen, welche zur Behandlung von Lungenkrebs geeignet sind. Für andere Indikationen lassen sich unschwer andere geeignete Promotoren anwenden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems, das heißt durch den Nachweis von mindestens einem antiapoptotisch wirkenden Mitglied der Bcl-2 Familie und mindestens einem Mitglied der Raf Familie in einer Zelle oder in einem Gewebe, beispielsweise in Bronchialepithelzellen, lässt sich gemäß dieser Erfindung aussagen, ob ein Risiko besteht, dass sich das jeweilige Gewebe zu einem Tumorgewebe transformieren wird. Falls dieses Risiko detektiert wird, ermöglicht dieses Testsystem die frühzeitige An¬ wendung von Vorbeugemaßnahmen, wie beispielsweise die Ver- meidung von Expositionen mit carcinogenen Substanzen und die Anwendung diätetischer, pharmakotherapeutischer und/oder chirurgischer Maßnahmen. Zu erfmdungsgemaßen, vorzugsweise in Suspension gehaltenen, mit dem erfmdungsgemaßen Testsystem geprüften Zellen wird die zu prüfende prospektive Wirksubstanz m Konzentrationen von 0.1 nmol bis zu 100 μ ol hinzugegeben und es wird geprüft, ob die Wirksubstanz in der Lage ist, die Expression eines antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie und/oder eines Mitgliedes der Raf Familie zu reduzieren.
Definitionen.
Die Sequenzen der genannten Gene bzw. Proteine sind aus der NIH Gendatenbank bekannt (AccNrs . : Bcl-2 : M14745; Bcl- XL: Z23115; Bcl-w: U59747; MCL-1: L08246; Al/Bfll:
NM_004049; Diva/boo: NM_020396; NRH (humanes Homolog von NR 13) : CAD30221; BAD (enthaltend die BH-3 Domäne) : AF031523; C-Raf: X03484; A-Raf: X04790; B-Raf: M95712; die drei letztgenannten Gene sind Mitglieder der Raf-Familie, die vorherigen sind antiapoptotisch wirkende Mitglieder der Bcl-2 Familie) . Im Rahmen der Erfindung sind aber auch Homologe umfaßt, wobei die Homologie mit den bekannten Genen bzw. Proteinen zumindest 80%, vorzugsweise mehr als 90%, hochstvorzugsweise mehr als 95%, betragt. Im Falle der Nuklemsauresequenzen sind auch komplementäre oder allelische Varianten mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen umfaßt, welche lediglich Teilsequenzen der bekannten Sequenzen darstellen mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer erfmdungsgemaßen Nuklemsaure hinreichende Lange, zumindest 50 Basen, aufweisen und im Falle der Proteine bzw. Peptide mit zumindest gleicher Affinität an ein protein- oder peptidspezifisches Zielmolekul binden. Weiterhin sind alle mit den bekannten Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren umfaßt, nämlich solche, die unter strmgenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der AufSchmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al . , A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Insbesondere sind auch Punktmutationen der bekannten Gene mit umfaßt, wie beispielsweise onkogene C-Raf Mutanten. Es versteht sich, daß die Erfindung auch Expressionskassetten umfaßt, i.e. eine oder mehrere der erfmdungsgemaß eingesetzten Nuk- lemsauresequenzen für em Bcl-2 Mitglied und Raf Mitglied mit jeweils mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz.
Im Zusammenhang mit erfmdungsgemaßen Verwendungen umfassen die Begriffe der Bcl-2 Familien und/oder Raf Familien Nukleinsäuren oder Proteine neben den Volllangen der angesprochenen Sequenzen (siehe auch vorstehender Absatz) auch Teilsequenzen hieraus, und zwar mit einer
Mindestlange von 12 Nukleotiden, vorzugsweise 30 bis 90 Nukleotiden, im Falle der Nukleinsäuren und einer Mindestlange von 4 Aminosäuren, vorzugsweise 10 bis 30 Aminosäuren, im Falle der Peptide oder Proteine.
Die Begriffe der Diagnose und/oder der Behandlung von Krebs umfassen auch die Detektion und/oder Behandlung von Metastasen aus Primartumoren.
Mimikry-Moleküle sind Verbindungen, die den variablen Bereich, insbesondere den Bmdungsbereich eines Antikörpers, nachbilden und an gleicher Stelle eines Zielmolekuls binden, wie der zu Grunde liegende Antikörper. Der Begriff der Antikörper umfaßt polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, nicht-humane, humane und humanisierte Antikörper, sowie Phage-Display-Antikorper, aber auch chimare Antikörper und antndiotypische Antikörper sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht naher erläutert zu werden.
Eine im Rahmen einer Detektorsubstanz eingerichtete Reportergruppe ist em Atom, Molekül oder eine Verbindung, welche in Verbindung mit einem hierauf abgestellten Assay den Nachweis der Reportergruppe und der somit mit der Reportergruppe verbundenen Verbindung oder Substanz ermöglicht. Beispiele für Reportergruppen und hiermit assoziierte Detektionsmethoden sind: 32P-Labelmg und In- tensitatsmessung mittels Phosphoimager . Viele weitere Beispiele sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und bedürfen nicht der detaillierten Aufzahlung.
Im Rahmen der vorstehenden Definition gegenüber dem engen Wortsmn erweiterte Begriffsbestimmungen umfassen auch die bestimmten Begriffe im engen Wortsmn.
Ausfuhrungsbeispiele :
Beispiel 1: Herstellung und Typisierung transgener Mause.
Folgende Mausestamme wurden gemäß der veröffentlichten Methoden wie folgt hergestellt: Mause, transgen für eine verkürzte aktivierte C-Raf-Kinase (C-Raf BxB) unter der Kontrolle des Surfactant Protein-C (SP-C) Promotors (Kerk- hoff et al., Cell Growth Diff 11: 185-190 (2000)), Mäuse, defizient in bei -2 (Michaelidis et al . , Neuron 17: 75-89 (1996) und Mäuse, transgen für humanes bcl -2 unter Kontrolle des HSK Promoters (Domen et al . , Blood 91: 2272-2282 (1998)). Durch Hybridisierung und Rückkreuzung wurden Mäusestämme gezüchtet, welche die jeweiligen Transgene wie folgt exprimieren: SP-CcrafBXB/bcl -2 (-/-) ; SP-Ccra BXB/Jbcl-2(+/-) . Desweiteren wurden durch Kreuzung die dreifach transgene Mäuse SP-CcrafBXB/jcl-2 (-/-) / SKbcl -2 erzeugt.
Die jeweiligen Mäusestämme wurden mit Hilfe der PCR (Rea- gentien von Invitrogen) und Primern, spezifisch für die jeweiligen Transgene genotypisiert . Im Besonderen wurden folgende Primer (siehe auch die Sequenzprotokolle Seq.-ID
1 bis 6 in der folgenden Reihenfolge) verwendet:
craf : 5'- ATC TCC GTG CCA TTT ACC-3'
SP-C 5' -GAG AGG AGA GCA TAG CAC-3' bcl -2 sense : 5'-CAC CAG AAT CAA GTG TTC GGT G -3' bcl-2 antisense: 5'- GGT AGC GAC GAG AAG AGT CAT C-3'
H2K sense: 5'- CGC GGA CGC TGG ATA TAA AGT C -3'
H2k antisense 5'- ACA TCT CCC GCA TCC CAC TC -3'
Von für SP-C crafBxB transgenen Mäusen ist bekannt, dass sie mit einer relativ kurzen Latenzzeit alle Adenome der
Lunge entwickeln (Kerkhoff et al., Cell Groth Diff 11:
185-190 (2000) ) . Beispiel 2: Beeinflussung der Entstehung von Tumoren.
Mause, defizient in bcl -2, leben bis zu etwa einem Jahr ohne eine Häufung von Tumorerkrankungen aufzuweisen (Veis et al., Cell 75: 229-240 (1993)). Mause, welche humanes Bcl-2 exprimieren, lebten gleichermaßen ohne eine Häufung von Tumoren (Domen et al . , Blood 91: 2272-2282 (1998)).
In Mausen, transgen für SP-CcrafBXB stieg der Spiegel an endogenem bcl-2 RNA und Protein bis zu etwa 1,5 Monaten an und blieb dann auf diesem erhöhten Spiegel stabil. SP-CcrafBXB transgene Tieren, denen e Allel des bcl -2 fehlte, zeigten keine Unterschiede in der Latenzzeit der Tumorentwicklung, wahrend Tieren, denen beide Allele fe- hlten, eine deutliche Verzögerung m der Entwicklung von Tumoren aufwiesen. In den dreifach transgenen Mausen war die Latenzzeit der Tumorentwicklung jedoch wieder etwa gleich der in bcl -2 (+/+) Mausen.
Um die Frage zu beantworten, ob Bcl-2 die Initiation oder Promotion von Tumore beemflusst, wurden an 1,5, an 2,5 und an 6 Monate alten Mausen die Anzahl der Tumorherde pro mm2 Lunge histologisch untersucht. Alle transgenen Mausestamme zeigten makroskopisch wie auch histologisch eine normale Lungenentwicklung.
In Bcl-2 negativen SP-CcrafBXB transgenen Mausen waren jedoch nach 1,5 Monaten keine Tumorherde, nach 2,5 Monaten deutlich weniger Tumorherde und erst nach 6 Monaten gleich viel Tumorherde nachzuweisen wie m Bcl-2 positiven SP- CcrafBXB transgenen Mausen. Andererseits waren m den dreifach transgenen Mausen, welche eine erhöhte Expression von humanem Bcl-2 aufweisen, die Entwicklung der Tumorherde im Vergleich zu SP-CcrafBXB transgenen Mausen nicht beschleunigt.
In Lungenschnitten von 6 Monate alten Mausen wurden zusätzlich die Anzahl der apoptotischen Zellen mit Hilfe des Tunel assays (In situ cell detection POD kit, Röche) und die Anzahl der in der S-Phase befindlichen proliferi- erende Zellen in den Lungentumoren mit Hilfe von Antikörpern gegen PCNA (PharMmgen) bestimmt. Wahrend bei der Anzahl von apoptotischen Zellen keine eindeutigen Unterschiede nachweisbar waren, zeigten für Bcl-2 negative Mausestamme eine deutlich verminderte Anzahl proliferier- ender Tumorzellen im Vergleich zu allen anderen geprüften Mausestammen .
Zusammenfassend lasst sich somit sagen, dass die Anwesenheit von Bcl-2 die onkogene Wirkung von Raf derart verstärkt, dass Tumoren mit kürzerer Latenzzeit auftreten. Diese Wirkung von Bcl-2 kann nicht durch eine konstitutive Expression beispielsweise von C-Raf Kompensiert werden. Der Nachweis von Bcl-2 und onkogenem Raf m einem Gewebe ist demzufolge praediktiv für die Entwicklung eines Tumors in diesem Gewebe.
Beispiel 3: Bestimmung des Expressionsniveaus von Bcl-2 und Raf in Gewebebiopsien durch semiquantita-
Figure imgf000016_0001
In diesem Beispiel wird die Expression von Bcl-2 und C-Raf mRNA in Biopsien von Tumorgewebe mit nicht entartetem
Gewebe verglichen. Die Gewinnung des Biopsiematerials erfolgt entsprechend der Lage des jeweiligen Tumors, es wird dabei sowohl gesundes Gewebe als auch Tumorgewebe entnommen.
Ausgehend von 0,5 - 30 mg Gewebe (idealerweise 10 mg), je nach Tumorart, nach der Biopsie weiter aufgearbeitet, wird anschließend die mRNA mit einer geeigneten Methode isoliert. Im vorliegenden Beispiel wurde aus Lungentumor- gewebe und benachbartem normalem Lungengewebe mit dem kommerziell verfügbaren RNeasy Kit der Firma Quiagen entsprechend den Anweisungen des Herstellers die mRNA isoliert .
Anschließend wird die mRNA revers transkribiert, beispielsweise mit dem Omniskript RT Kit der Firma Quiagen ent- sprechend den Anweisungen des Herstellers und einem
Oligo-dT Primer. Nun wird mit einem Cycler, beispielsweise dem Robo-Cycler der Firma Stratagene, eine PCR Reaktion durchgeführt mit folgenden Primern und Bedingungen (Leng et al., Eur J Pharmacol 409 (2000) :123; Deshpande and Moore, Mol Cell Biochem 178 (1998) : 47) ) :
Primer (siehe auch die Sequenzprotokolle Seq.-ID 7 - 12 in der folgenden Reihenfolge) :
Figure imgf000017_0001
Die PCR wird in einem Volumen von 50 μl mit 1 μl RT- Produkt, 50 mM KCl, lOmM Tris-HCl (pH 9.0), 0, 1 % Triton X-100, 1,5 1,5 mM MgC12, 0,3 μM des entsprechenden spezifischen 5' und 3' Primern und 2 U Taq DNA Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Die Bedingungen sind wie folgt: 94°C, 5 mm, 30 Zyklen bcl-2 / b-Aktm bzw. 35 Zyklen c-raf-1 / b-Aktin mit 94°C 45 s, 55°C 45 s und 72°C 1 mm. Abschließend wurde eine finale Extension bei 72 °C über 5 Minuten durchgeführt. Die Produkte werden über Agarose- Gelelektrophorese aufgetrennt und die relative Produktkonzentration wird densiometrisch bestimmt. Dabei wird der Quotient der relativen Konzentration des bcl-2 oder c-raf-1 Produkts mit dem b-actm Produkt gebildet, was der relativen Expression von bcl-2 oder c-raf-1 gleichgesetzt wird.
Anschließend wird die relative Expression von bcl-2 und c-raf-1 zwischen Tumorgewebe und Normalgewebe verglichen. Im vorliegenden Beispiel war em deutlicher Anstieg zu beobachten.
Im Folgenden werden einige ergänzende Anmerkungen allgemeiner Art zur Erfindung und unabhängig von den vorstehenden Beispielen angebracht.
Zunächst ist hinsichtlich des transgenen nicht- menschlichen Saugetiers festzustellen, dass dieses vorteilhafterweise em Mitglied der raf Familie und eines der Bcl-2 Familie gewebespezifisch konstitutiv exprimiert.
Gewebespezifitat ist beispielsweise dadurch einrichtbar, dass zumindest das Mitglied der raf-Familie unter der Kon- trolle einer gewebespezifischen regulatorischen Sequenz
(Promotor) steht. Dann ist Gewebespezifitat bezüglich des
Mitgliedes der Bcl-2 Familie entbehrlich. Em wesentliches Element der Erfindung ist, dass durch Inhibierung des Mitgliedes der Bcl-2 Familie die raf- korrelierte Tumorgenese, also die Tumorgenese von Tumoren, die abhangig von der mitogenen Kaskade upstream von raf sind, gehemmt wird. Daher betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Prophylaxe und Behandlung von Krebserkrankungen, wobei die unkontrollierte Proliferation der Krebszellen abhangig von der Funktion der mitogenen Kaskade sind, wobei einer Person, die an einer solchen Er- krankung erkrankt ist oder dem Risiko einer solchen
Erkrankung ausgesetzt ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Substanz, die zumindest em Mitglied der Bcl-2 Familie inhibiert, in einer physiologisch wirksamen Dosis, verabreicht wird. Vorteilhafter- weise kann die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich (im Mischung oder getrennter Darreichungsform) einen raf-Inhibitor in physiologisch wirksamer Dosis enthalten. Desweiteren betrifft die Erfindung die Reduktion der Wechselwirkung eines Mitgliedes der Bcl-2 Familie mit einem Mitglied der raf Familie einem Organismus, vorzugsweise durch Inhibierung eines oder beider Mitglieder besagter Familien.

Claims

Patentansprüche :
1) Testsystem mit Mitteln zur Detektion zumindest eines antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie sowie mit Mitteln zur Detektion zumindest eines Mitgliedes der Raf Familie.
2) Testsystem nach Anspruch 1, wobei die Mittel zur Detektion Detektorsubstanzen sind, welche spezifisch für mRNA oder Protein des jeweiligen Mitgliedes sind, wobei die Mittel im Falle der mRNA Substanzen zur spezifischen Amplifikation der mRNA umfassen können.
3) Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei das antiapop- totisch wirkende Mitglied der Bcl-2 Familie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Bf1-1, Brag-1, Mcl-1 und AI".
4) Testsystem einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das
Mitglied der Raf Familie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C-Raf, B-Raf, A-Raf, mutiertes C-Raf, mutiertes A-Raf und mutiertes B-Raf".
5) Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei zu- mindest eine der Detektorsubstanzen em Antikörper ist. 6) Verwendung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Diagnose einer Krebserkrankung oder eines Risikos einer Krebserkrankung bei menschlichen und/oder nicht-menschlichen Saugetieren.
7) Verwendung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Screenen nach Substanzen, welche einer Zelle, die sowohl em antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch em Mitglied der Raf Familie exprimiert, die Expression oder Funktion des Mitgliedes der Bcl-2 Familie reduziert.
8) Transgenes nicht-menschliches Saugetier zur Verwendung m einem Verfahren nach Anspruch 7, insbesondere Ro- dent, dessen Zellen eines definierten Gewebes sowohl em antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch em Mitglied der Raf Familie konstitutiv exprimiert.
9) Isolierte menschliche oder nicht-menschliche Zelle zur Verwendung m einem Verfahren nach Anspruch 7, welche sowohl e antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch em Mitglied der Raf Familie konstitutiv exprimiert .
10) Verfahren zum Screenen nach Wirksubstanzen zur Behandlung von Krebs, wobei Zellen nach Anspruch 9 oder einem nicht-menschlichen Saugetier nach Anspruch 8 eine prospektive Wirksubstanz oder eine Mischung solcher Substanzen m einer physiologisch wirksamen Dosis zugeführt werden, wobei anschließend die Menge und/oder Aktivität des antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie gemessen wird, wobei die Mengen und/oder Aktivitäten des antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie vor und nach der Zugabe der prospektiven Wirksubstanz oder der Mischung miteinander verglichen werden und wobei eine prospektive Wirksubstanz, ggf. nach Dekonvolution, die zu einer Verringerung der Menge und/oder Aktivität gefuhrt hat, selektiert wird.
11) Verwendung einer mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 oder 10 identifizierten Wirksubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs .
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