WO2003087366A1 - Lignees de cellules endocriniennes et procede d'utilisation desdites lignees - Google Patents

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Kazumi Miura
Satoshi Saeki
Misako Yoshizawa
Kazuya Kishimoto
Hirofumi Kunitomo
Tatsunari Nishi
Masuo Obinata
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Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining a DNA encoding a peptide acting as an agonist, an antagonist or an inverse agonist of a receptor, a method for detecting or obtaining the peptide, a cell line derived from an endocrine cell used in these methods, A method for producing a peptide using the cell line derived from the endocrine cell, a B cell line expressing the receptor used in the above method, and a peptide reacting with a test substance using the B cell line A method for obtaining a DNA encoding a peptide using the B cell line, a constitutively active mutant G protein-coupled receptor obtained by the obtaining method, and a method using the B cell line.
  • the present invention relates to a host-vector system using the B cell line as a host.
  • peptide hormones and neurotransmitters are produced as precursors (oral vesicles), and then turned into active peptides by the action of multiple processing and modifying enzymes. (Curr. Op in. Chem. Biol., 2, 31 (1998)) o
  • processing and modification enzymes are expressed only in certain endocrine cells, for example, active peptides produced by neurons and endocrine cells in the hypothalamus, pituitary gland, or the Langerhans island of the renal lump (for example, expression of a precursor gene for vasopressin (glucagon) in non-endocrine cells such as COS cells and CH0 cells, which are frequently used for gene expression, does not generally produce an active peptide.
  • a precursor gene for vasopressin glucagon
  • an active peptide by introducing a known active peptide precursor gene into a cell line established from endocrine cells (hereinafter referred to as an endocrine cell line) to produce an active peptide, a method of irradiating a rat induced by irradiation is used.
  • a method for producing insulin and amylin by introducing and expressing a pre-bub insulin gene or a pre-bu amylin gene into RIN cells established from cancer cells of Langerhans island (US6194176, US6110707), which occurs in transgenic mice.
  • a method of producing a C-peptide by introducing a preproinsulin gene into a MIN6 cell line established from three tumor cells and producing a C peptide [Nat. Cell Biol., 2, 805 (2000)] is known.
  • the following cell lines ( ⁇ to) are known as cell lines derived from the hypothalamus.
  • HT9 single clone cells derived from the HT9 cells (HT9-C7) and the like are known.
  • HT9-C7 expresses neurophysin and vasopressin CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3575 (1974).
  • HC 8 As the immortalized cells, HC 8, RCA-6, RCF-27, RCD-15, D12 and the like are known. These cell lines express the estrogen receptor [Endocrinology, 126, 235 (1990); Endocrinology, 140, 23928 (1999)].
  • somatosustin a neuropeptide expressed in neurons in the suprachiasmatic nucleus, vasoactive intestinal polypeptide (VIP), It expresses gastrin-releasing peptide (GRP) or arginine vasopressin (AVP) and does not express oxytocin or corticotropin releasing hormone (CRH), which is not expressed in neurons in the suprachiasmatic nucleus.
  • VIP vasoactive intestinal polypeptide
  • GFP gastrin-releasing peptide
  • AVP arginine vasopressin
  • CH corticotropin releasing hormone
  • GnRH Gonadotropin-releasing hormone
  • GT GTl-ls GT1- 3, GT1- 7 and the like are known (Neuron, 5 3 1 (1990 ) ].
  • GT1- 1 and GT1-7 cell holds a GnRH-producing ability Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1852 (1992); Endocrinology, 140, 1423 (1999)].
  • hypothalamus-derived cell line that expresses endogenous leptin receptor could be obtained, it would be possible to analyze the biological function of leptin on individual neurons. Neither do they express the leptin receptor, and no cell line derived from the hypothalamus that expresses the endogenous leptin receptor is known so far (Diabetes, 9, 1443 (2000), Neuron, 5, 1 (1990)].
  • Lebutin is being developed as an antiobesity drug and an antidiabetic drug, but due to the problem of lebutin resistance, the development of a drug that replaces lebutin is required. Elucidation of the mechanism of action of lebutin may lead to the discovery of new bioactive substances and the identification of drug discovery. If a cell line derived from the hypothalamus that expresses an endogenous leptin receptor can be obtained, screening and evaluation of the above drug can be performed using the cell line.
  • RFamide-related peptide Preproprotein gene, Preprolexin gene, Prevo mouth ovomelanocortin gene, Prebroni europeptide Y gene, Preproniuropeptide FF gene, Preprocorticotropin releasing hormone gene, Prebu mouth Thyrotropin-releasing hormone gene, prebu oral ghrelin gene, prepromelanin-aggregated white lemon 1E, cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) gene, type 2 neuromedin ⁇ receptor (NMU2R) gene, RFRP receptor gene , Type 4 melanocortin receptor (MC4R) gene, type 1 neuropeptide Y receptor (NPY1R) gene, type 5 neuropeptide Y receptor (NPY5R) gene, type 2 neuropeptide FF receptor ( ⁇ 2) gene, 1 Corticotropin releasing hormone receptor (CRHR-1) gene, type 2 corticotropin release Hormone receptor (CRHR-2) gene, ghrelin receptor gene, melanin-concentrating hormone receptor
  • hypothalamus has the most important regulatory function for maintaining life, and is also attracting attention as an evening gate for drugs. Therefore, if it is possible to obtain a hypothalamic-derived cell line that retains its function, it will be possible to study the function of individual hypothalamic neurons at the cellular and molecular levels. It is also very useful for the development of drugs using hypothalamic neurons as gates. It is known that endocrine cells present in the hypothalamus produce various active peptides, and a variety of hypothalamus-derived cell lines are very useful for searching for new active peptides. It is considered to be a source.
  • IiHQ- Gl, In-Rl- G3 s In- M-G7, In-Rl-G9 s In-Rl-G10 N In -. Rl-Gll etc. are known [an In Vitro Cell Dev Biol., 22, 120 (1986)]. These established strains are also considered to be cancerous cell lines of specific cells present on the island of Langerhans.
  • Hamster-derived HIT cells and the like are known as the established strains [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4339 (1981); Biochem. J., 219, 547 (1984)]. Because the frequency of transformation by SV40 is low and the frequency varies depending on the type of cells, these established strains are also considered to be cancerous cell lines of specific cells (such as? Cells) present in Langerhans Island. I have.
  • 5TC cells, NIT-1 cells, MIN6 cells and the like are known (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9037 (1988); Diabetes, 40, 842 (1991); Endocrinology, 127, 126 (1990)].
  • the SV40 large T antigen is expressed only in specific cells (such as? Cells) present in the islet of Langerhans, so it is considered that only specific cells are immortalized. Therefore, these established strains are also Is considered to be a cancerous cell line of a specific cell present in the cell.
  • ⁇ TC1 cells Diabetes, 39, 406 (1990); Diabetes, 39, 415 (1990)
  • a single clone cell aTCl clone 9 derived from TCI cells are known.
  • the SV40 large T antigen is expressed only in specific cells (such as ⁇ cells) present in Langerhans islets, and thus it is considered that only specific cells are immortalized. Therefore, these established strains are also considered to be cancerous cell lines of specific cells existing on the island of Langerhans.
  • TGP52 Carcinogenesis, 15, 61 (1994)].
  • SV40 large T antigen is expressed only in specific cells existing in Langerhans islets, it is considered that only specific cells are immortalized. Therefore, this established strain is also considered to be a cancerous cell line of specific cells present on the islet of Langerhans.
  • any cell line established from the cells of the above-mentioned Langerhans islet is a cancer cell or a cell derived from cancer, it may have different properties from normal cells.
  • To search for new physiologically active substances, receptors, ligands, active peptides, etc. it is desirable to obtain more diverse cell lines that retain the properties of normal cells. Since the various cells of Langerhans Island are thought to regulate each other, it is possible to analyze the role of individual cells by acquiring various cell lines and co-culturing them. .
  • Endocrine cells on Langerhans islet are known to produce various active peptides, including glucagon, insulin, somatosustin, Teng polypeptide, and so on. It is considered to be a very useful source for searching for active peptides.
  • a bioassay system or the like can be given as an example of a sensitive atsey system.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • GPCRs produce different signals depending on the subtype of the G protein to be coupled.
  • the detectable signal, sensitivity, signal / noise ratio, and the like differ depending on what kind of promoter is used to express the repo overnight gene.
  • promoter examples include a promoter having a TPA response element (TRE), a promoter having an NFAT (nuclear factor of activated T cells) responsive promoter, a promoter having a cAMP responsive element (CRE), and a promoter having a serum responsive element (SRE). It's being used.
  • TRE TPA response element
  • NFAT nuclear factor of activated T cells
  • CRE cAMP responsive element
  • SRE serum responsive element
  • G The three-dimensional structure of G, which couples to GPCRs, has already been elucidated and is important for interaction with GPCil.By replacing the amino acid at the C-terminus of a protein with the corresponding amino acid of another Go: protein, it is naturally coupled. It is known that it can be coupled to a GPCR [Mol. Pharmacol., 57, 13 (2000)].
  • a chimeric G shed protein replacing 5 amino acids of G shed q C-terminus to those Goii (6 shed qi) is a GPCR flow signal and coupled to 6, the 5 amino acids of the Ga s ® C-terminal Ga q chimeric G a protein was replaced with the (G o: s - q) is a GPCR flow signal and coupled to G q, chimeric protein was replaced with the 5 amino acids (end of G monument 3 (G ⁇ ) Can be conjugated to a GPCR that passes a signal in conjugate with Ghi.
  • a GPCR known as a constitutively active GPCR which, when overexpressed in a cell, transmits a signal even in the absence of a ligand, is known.
  • the signal that flows in the absence of ligand is called constitutive activity.
  • Constitutively active GPCI which is naturally occurring, and a mutant GPCR constructed by introducing mutations such as amino acid substitutions and deletions GCM CMol. Pharmacol., 57, 890 (2000); W098 / 46995] There is.
  • the mutant GPCI may be useful for searching for a ligand because the affinity with an agonist may increase. CJ. Biol. Chem., 72, 1822 (1997)].
  • GPCR bioassay system as cells for the assay, animal cells such as CH0 cells, C0S-7 cells, 293 cells, HEK293 EBNA cells, and the like melanophore (Mol. Pharmacol., 57, 125 (2000)) or yeast ( Trends Biotechnol., 15, 487 (1997); G protein Receptors, CRC Press, 49-68 (2000)].
  • animal cells such as CH0 cells, C0S-7 cells, 293 cells, HEK293 EBNA cells, and the like melanophore (Mol. Pharmacol., 57, 125 (2000)) or yeast ( Trends Biotechnol., 15, 487 (1997); G protein Receptors, CRC Press, 49-68 (2000)].
  • melanophore Mol. Pharmacol., 57, 125 (2000)
  • yeast Trends Biotechnol., 15, 487 (1997); G protein Receptors, CRC Press, 49-68 (2000).
  • An object of the present invention is to provide the following items (1) to (5).
  • the present invention relates to the following (1) to (106).
  • a method for obtaining a DNA encoding a peptide which acts as an agonist, an orthogonist, or an insect agonist of a target receptor comprising the following steps [1] to [: 5].
  • Transformation is obtained by introducing DM from any cDNA or chromosome into a cell line derived from endocrine cells
  • Transformants are obtained by introducing a mixture of cDNA clones from each pool into an endocrine cell-derived cell line
  • the endocrine cell-derived cell line is the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant of SV40.
  • Cell lines derived from endocrine cells are: lebutin receptor (Ob-Rb) gene, prebroni euromedin U gene, RFamide-related peptide (RFRP) preproprotein gene, preprolexin gene, prebu oral piomelanocortin gene , Prebroniuropeptide Y gene, Preproniuropeptide FF gene, Prebroco ruticotropin releasing hormone gene, Preprothyrotropin releasing hormone gene, Preproghrelin gene, Prebu oral melanin concentrating hormone gene, cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART ) Gene, type 2 neuromedin U receptor (U2H) gene, RFRP receptor gene, type 4 melanocortin receptor (MC4R) gene, type 1 neuropeptide Y receptor (NPY1R) gene, type 5 neuropeptide Y receptor (NPY5R) gene, type 2 neuropeptide Receptor (NPFF2) gene, type 1 corticotropin releasing hormone receptor (CMffi-1) gene
  • Endocrine cell-derived cell lines include lebutin receptor (Ob-Rb), neuromedin U, RFamide-related peptide (RFRP) protein, virgin lexin, opiomelanocortin, new mouth peptide Y, neuropeptide FF, corticotropin releasing hormone, thyrotropin releasing hormone, ghrelin, melanin concentrating hormone, cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART), type 2 neuromedin U receptor (NMU2R), M1P receptor, type 4 melanocortin receptor (MC4R), type 1 neuropeptide Y receptor (NPY1R), type 5 neuropeptide Y receptor (NPY5R) ), Type 2 neuropeptide FF receptor (NPFF2), type 1 corticotropin releasing hormone receptor (CRHR-1), type 2 corticotropin releasing hormone receptor (CRHR-2), ghrelin receptor, type 1 melanin Aggregating hormone receptor (MCHR1), agouti-related peptide, sulf
  • Endocrine cell-derived cell lines are the Prev mouth insulin gene, Prev mouth glucagon gene, Prebrosomatostin gene, Prebroten polypeptide gene, Prohormone conjugase 1 (PC1) gene, Prohormone competition Leuichiase 2 (PC2) gene, glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor gene, PDX1 (pancreatic -duodenal homeobox ⁇ gene, Pax4 gene, Pax6 gene, neurogenin 3 gene, Neuro D gene, Nkx2.2 gene, Nkx6.1 gene, Dalcokinase gene, Type 1 glucose transporter gene, Besselin cellulin gene, Sulfonylprea gene, Receptor gene, Glucagon-like peptide-1 (GLP- 1) receptor gene, type 1 somatosustin receptor gene, type 2 somatosustin receptor gene, type 3 somatosustin receptor gene, 4 Endogenous at least one gene selected from the group consisting of somato
  • cells expressing the receptor have at least one of the following [1;] to [3]
  • Ga protein or chimeric Go DNA construct for protein expression
  • the transcription factor response element is a cAMP response element (CRE), a TPA response element ( ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ), an NFAT (nuclear factor of activated T cells) response element, or a serum response element (SRE).
  • CRE cAMP response element
  • TPA TPA response element
  • NFAT nuclear factor of activated T cells
  • SRE serum response element
  • the repo overnight gene is the luciferase gene, the luciferase luciferase gene, the chloramphenicol acetyltransferase gene, the? -Galactosidase gene, the lactamase gene, or the green fluorescein gene.
  • the chimeric Ga protein has the following [1 :! (15)
  • Ga s ® C-terminal 5 amino acids of the chimeric G shed protein was replaced with the C-terminal 5 amino acids of Ga 12
  • Ga s chimeric G shed protein C-terminal 5 amino acids was substituted at the C-terminal 5 amino acids of Ga 13 of [7]
  • G S ⁇ C-terminal 5 amino acids of Ga gust chimeric G shed protein was replaced with the C-terminal 5 amino acids of [8]
  • Ga s C-terminal 5 Kinura amino acids were replaced with Ga t C-terminal 5 amino acids Go: protein [9 ]
  • Ga chimeric G protein the C-terminal 5 amino acids was replaced by Ga s ® C-terminal 5 amino acids of q [12]
  • Ga q chimeric protein was replaced with the C-terminal 5 amino acids of the C-terminal 5 amino acids of [13] G shed
  • Chimeric Ga protein is substituted with C-terminal 5 amino acids of [14]
  • Go chimeric G protein the C-terminal 5 amino acids is substituted with 0-terminal 5 amino acids of G 2 of q [15]
  • the C-terminal 5 amino acids of G q of Ga i2 chimeric G protein was replaced with the C-terminal 5 amino acids [16]
  • Go chimeric Go proteins [17] that the C-terminal 5 amino acids of q is substituted with C-terminal 5 amino acids of G monument 13 G q of C-terminal 5 amino acids of G C Chimera G protein with substitution at the 5 terminal amino acids [18] Chimera with the C-terminal 5 amino acids of Ga q substituted with the C-terminal 5 amino acids of Gcc t Go: Protein [19] Go: q ⁇ 5 C-terminal 5 amino acids Go: 14 Chimeric G protein with the C-terminal 5 amino acids replaced by G- q [20] Chimeric protein with the C-terminal 5 amino acids replaced with the
  • the transcription factor required for construction of the inducible expression system is a chimeric protein of the ligand binding region of yeast Gal4p and estrogen receptor, and a promoter having a transcription factor response element is a cAMP response element ( (15)
  • the transcription factors required for construction of the inducible expression system are yeast Gal4p and the kinula protein in the ligand-binding region of the estrodidin receptor.
  • the promoter containing the transcription factor response element is a cAMP response element (CRE).
  • a promoter having a repo Isseki monogenic is a firefly luciferase gene or Umishiitake-Rushifuweraze gene, chimeric G proteins, location of G 3 (the 'terminal 5 amino acids at the C-terminal 5 amino acids of G shed q
  • Cell response is arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ elevation, intracellular cAMP reduction, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, cell Protein phosphorylation, c-fos activation, intracellular pH fluctuation, cell proliferation, repo overnight gene expression, and marker gene expression
  • Lebutin receptor (Ob-lib) gene prebrony euromedin U gene, RFamide-related peptide (RFRP) preproprotein gene, preprolexin gene, prebu oral piomelanocortin gene, preproniuropeptide Y gene, preproniuropeptide FF gene, preprocorticotropin-releasing hormone gene, prebu oral thyro-oral bin releasing hormone gene, preproghrelin gene, prefu.
  • RFRP RFamide-related peptide
  • Oral melanin aggregation homolemon gene cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) gene, type 2 neuromedin U receptor (MU2R) gene, RFRP receptor gene, type 4 melanocortin receptor (MC4R) gene, type 1 neuro ⁇ Peptide Y receptor (NPY1R) gene, type 5 neuropeptide Y receptor (NPY5R) gene, type 2 neurolipid peptide FF receptor (NPFF2) gene, type 1 corticotropin releasing hormone receptor (CRHR-1) gene, Corticotropin-releasing hormone receptor type 2 (CRHR-2
  • ghrelin receptor gene type 1 melanin-concentrating hormone receptor (MCHR1) gene, pre-bloagout-related peptide gene, sulfonylprea receptor gene, ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor gene, 1 Neuromedin U receptor (NMU1R) gene, type 1 orexin receptor (0X1R) gene, type 2 orexin receptor (0X2R) gene, type 1 angiotensin II receptor gene, galanin receptor gene, glucagon-like A peptide derived from the hypothalamus that endogenously expresses at least one gene selected from the group consisting of peptide-1 (GLP-1) receptor gene and glucagon-like peptide-2 (GLP-2) receptor gene Cell line.
  • GLP-1 peptide-1
  • GLP-2 glucagon-like peptide-2
  • the immortalized cell line obtained from Langerhans islet is the prebu oral insulin gene, the preglobulcagon gene, the prebrosomatostin gene, the prebropolypeptide gene, the prohormone complease 1 (PC1) gene , Prophormon complexase 2 (PC2) gene, glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor gene, PDXl (pancreatic-duodenal homeobox 1) gene, Pax4 gene ⁇ Pax6;) fi gene, neurodinin 3 gene , Neuro D gene, Nkx2.2 gene, Nkx6.1 gene, Dalcokinase gene, Type 2 glucose transporter gene, Petacellulin gene, Sulfonylurea gene, Receptor gene, Glucagon-like peptide-1 (GLP- 1) Receptor gene, Somatos 1 receptor gene, Somatos 2 receptor gene, Somatos 3 receptor gene At least one of a gene selected from the group consisting of a receptor gene, a somatosustin
  • the production process is characterized by comprising a step of culturing using a serum-free medium, a medium containing 2% or less serum, or a medium in which N-supplement is added to a serum-free medium. (38) The production method according to any one of the above (38).
  • the method comprises a step of culturing a medium containing a receptor, a transporter or a channel, which is expressed in a host cell, and to which an agonist or an gonist is added. , (36) to (40).
  • the receptor is a G protein-coupled receptor, a nuclear receptor, a growth factor receptor, a sulfonylrea receptor, a ciliary neurotrophic factor receptor, a leptin receptor, a cytokinin receptor, or a sulfonylurea.
  • 8-Br-cAMP 8-bromo-cyclic AMP
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • ionomacin 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • activin activin, glucagon-like peptide-1 (GLP-1), follistatin, glucose, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, nicotinamide, vein Cellulin, parathyroid hormone-related peptide, thyrotropin-releasing hormone, vascular endothelial growth factor, islet neogenesis-associated protein, platelets Group consisting of Platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor I, fibroblast growth factor, nerve growth factor and Reg protein (36) The method according to any of (36) to (48), wherein the culturing is performed using a medium to which at least one substance selected from the group consisting of: The production method according to item 1.
  • a method for detecting or obtaining a peptide acting as an agonist, an antagonist or an inverse agonist of a target receptor comprising the following steps [1] to [4].
  • a peptide is obtained by the production method according to any one of (36) to (52).
  • (57) A cell that expresses the EBNA-1 gene of Epstein-Bair virus, in which at least one of the following [3] to [3] is integrated into chromosomal DNA, A serum-adapted B cell line, as described in (53) or (54). How to get out or get.
  • MA construct for expressing transcription factors necessary for construction of inducible expression system [2] DNA construct with reporter gene linked downstream of promoter having transcription factor response element [3] G protein or chimera Go: MA construct for protein expression
  • the transcription factor response element is a cAMP response element (CRE), a TPA response element (TM :), a nuclear factor of activated T cells response element, or a serum response element (SRE);
  • CRE cAMP response element
  • TM TPA response element
  • SRE serum response element
  • the reporter gene is the luciferase gene, the luciferase gene, the luciferase gene, the chloramphenicol acetyltransferase gene, the galactosidase gene, the? (57) The detection or acquisition method according to (57), wherein the gene is a lurecent protein gene.
  • Go Protein purchase, G ⁇ 16 ⁇ Ga: 15 , G «q ⁇ Galls G ⁇ s , Ga ⁇ G ⁇ . , G zS Ga 12N G c1 ⁇ 2, at least one Go of selected from the group consisting of G shed Ga t and G 14: a protein, detection or acquisition method according to (57).
  • the chimeric protein is [1]-!
  • the transcription factor necessary for construction of the inducible expression system is a chimeric protein of the ligand binding region of yeast Gal4p and estrogen receptor, and the promoter having a transcription factor response element is a cAMP response element (CRE).
  • CRE cAMP response element
  • the transcription factor required for construction of the inducible expression system is a chimeric protein of the ligand-binding region of yeast Gal4p and the estrogen receptor, and the promoter having the transcription factor response element binds to the cAMP response element (CRE).
  • a promoter having, repo Isseki monogenic is a Hoyuru-Rushifuwera Ichize gene or Umishii Yuke-Lucifera Ichize gene
  • chimeric G o protein
  • Go the s 0C terminal 5 amino acids of Ga q the C-terminal 5 amino acids of the chimeric Ga protein or Ga s that substitution on C-terminal 5 amino acids is a chimeric Ga protein is substitution on the C-terminal 5 amino acids of Goii, detection or acquisition method according to (57).
  • Cell response is arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ elevation, intracellular cAMP reduction, intracellular cAMP reduction, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, cell Protein phosphorylation, C-fos activation, intracellular pH fluctuation, cell proliferation, reporter gene expression, and marker gene expression
  • the transcription factor response element is a cAMP response element (CRE), a TPA response element (TM :), a NFAT (nuclear factor of activated T cells) response element, or a serum response element (SRE); 2.
  • CRE cAMP response element
  • TPA TPA response element
  • NFAT nuclear factor of activated T cells
  • SRE serum response element
  • the repo allergic gene is a firefly luciferase gene, a Pseudomonas luciferase gene, a chloramphenicol acetyltransferase gene, a galactosidase gene, a lactamase gene, or a green gene.
  • G shed protein, G monument 16, G shed from G q, Ga 21 s G s, G shed, Ga 0, G shed z, G «G monument i3, G shed have Ga tN and G monument 14 (68)
  • Ga s 0C terminal 5 amino acids are Ga.
  • the transcription factor required for construction of the inducible expression system is a chimeric protein of the ligand binding region of yeast Gal4p and estrodidin receptor, and the promoter having the transcription factor response element is capable of transcribing the cAMP response element (CM).
  • CM cAMP response element
  • the transcription factor required for construction of the inducible expression system is a chimeric protein of the ligand binding region of yeast Gal4p and estrogen receptor, and a promoter having a transcription factor response element is a cAMP response element ( a promoter Isseki one with CRE), reporter Isseki monogenic is Hoyuru luciferase gene or Umishii Yuke.
  • Cell response is arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ elevation, intracellular cAMP reduction, intracellular cAMP reduction, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, cell At least one response reaction selected from the group consisting of phosphorylation of internal proteins, activation of c-fos, fluctuation of intracellular pH, cell proliferation, repo overnight gene expression level, and marker gene expression level, (78) The method for obtaining DNA according to (79).
  • the test substance is obtained by culturing the cell line according to any one of (27) to (35).
  • a transformant is obtained by introducing any cDNA or chromosome-derived DNA into the host cell.
  • a chromosome comprising a DNA construct selected from the cell lines according to any one of (68) to (77) and having a repo overnight gene linked downstream of a promoter having a transcription factor response element. Select a cell line integrated into the DNA as a host cell
  • the peptide is a transcription factor, a signaling molecule, or an enzyme having an activity of increasing the activity of a promoter having a transcription factor response element, (78), (79), (83) or ( 84)
  • the method for obtaining a DNA according to the above.
  • cDNA is a random mutagenized cDNA encoding a mutant G protein-coupled receptor, and the peptide is a constitutively active mutant G protein-coupled receptor; (78), (79), ( 83) or the method for obtaining DNA according to (84).
  • the site where the random mutation is introduced is located in the second half of the third transmembrane region of the G protein-coupled receptor and the first half of the second intracellular region, or in the second half of the third intracellular region and in the sixth transmembrane region.
  • the site for introducing a random mutation is a proline residue present in the sixth transmembrane region which is one of the conserved amino acid residues in the G protein-coupled receptor or an amino acid residue corresponding to the proline residue.
  • a proline residue present in the sixth transmembrane region which is one of the conserved amino acid residues in the G protein-coupled receptor, or 20 amino acids closer to the N-terminal than an amino acid residue corresponding to the proline residue Constitutively active mutant G protein having a mutation at the amino acid at residue 22 or residue 22 White matter coupled receptor.
  • M1R melanocortin receptor type 1
  • PAMP proadrenomedullin N-20 terminal peptide
  • a transformant is obtained by introducing a DM encoding any G protein-coupled receptor into the cell line according to any one of (68) to (77).
  • a method for obtaining an agonist of a G protein-coupled receptor comprising the steps of:
  • Transformants are obtained by introducing MA encoding any G protein-coupled receptor into the cell line according to any one of (68) to (77).
  • Cell response is arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ increase, intracellular cAMP production, intracellular cAMP decrease, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein At least one response selected from the group consisting of phosphorylation, C-fos activation, intracellular pH fluctuation, cell proliferation, repo overnight gene expression level, and marker gene expression level, ( 100) or the method for obtaining an agonist or angiogonist of a G protein-coupled receptor according to (101).
  • a DNA encoding a peptide selected from the group consisting of any transcription factor, signal transduction molecule and enzyme is introduced into the cell line according to any one of (68) to (77). Obtain a transformant
  • Cell response is arachidonic acid release, acetylcholine flotation, intracellular Ca 2+ rise, intracellular cAMP production, intracellular cAMP decrease, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular At least one response selected from the group consisting of protein phosphorylation, c-fos activation, intracellular pH fluctuations, cell proliferation, repo overnight gene expression, and mouse gene expression
  • the cell strain according to any one of (68) to (77) as a host cell, and an expression vector having an arbitrary promoter and oriP of Epstein-Barr virus as one vector.
  • a host.vector system characterized by being used.
  • Any promoter is a Gal4p responsive inducible expression promoter, (106 The host-vector system according to (1).
  • a peptide refers to a substance in which two or more amino acids are linked by a peptide bond, and includes polypeptides and oligopeptides.
  • An expression cloning system for an active peptide precursor gene and an efficient production system for an active peptide can be constructed as follows.
  • the processing mode and post-processing modification of the active peptide from the precursor varies depending on the peptide.
  • Existing endocrine cell lines such as MIN6 can be used as a host, but the active peptide precursor gene can be introduced into host cells to efficiently produce the active peptide or to express the activity of the expressed peptide.
  • various types of endocrine cell lines are obtained, and cells expressing a processing enzyme or a modification enzyme suitable for the active peptide are selected from the cell lines. It is desirable to use it as a host.
  • An endocrine cell line can be established by the following method.
  • the endocrine cell-derived cell line of the present invention can be established by isolating and culturing cells from a tissue containing endocrine cells derived from a non-human transgenic animal into which an oncogene has been introduced.
  • Non-human transgenic animals include transgenic mice, transgenic rats, transgenic pigs, and transgenic egrets.
  • oncogenes include oncogenes derived from viruses such as SV40 and adenovirus, and examples include the large T antigen gene of SV40 and E1A and E1B of adenovirus. Specific examples include the large T antigen gene derived from the temperature-sensitive mutant SV40tsA58, E1A12S which is a hybrid of adenovirus 2 and adenovirus 5, and the like. In order to establish excellent cell lines, it is necessary to use the large T antigen of SV40tsA58. It is preferred to use a gene.
  • Promoters include endogenous promoters for viral oncogenes themselves and promoters for animal-derived genes expressed in endocrine cells.
  • Etc. can also be used.
  • endogenous flop Romo Isseki one large T antigen gene of SV40tsA58, can be used H-2K b class I promoter.
  • Transgenic mice into which the large T antigen gene of SV40tsA58 has been introduced are described in JP-A-05-292958, Jpn. J. Cancer Res., 82, 1344 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5096. (1991).
  • Transgenic rats into which the large T antigen gene of SV40tsA58 has been introduced can be prepared by the method described in JP-A-2000-228930 or Exp. Anim., 48, 255 (1999).
  • DNA (5,240 bp) containing the large antigen gene of SV40tsA58 is prepared by removing a part of the vector by using the vector. Since the promoter of the large T antigen gene of SV40tsA58 is endogenous in the DNA, the large T antigen gene of SV40tsA58 is expressed in the somatic cells into which the MA has been introduced.
  • Oocytes obtained by microinjecting the DNA containing the large T antigen gene of SV40tsA58 into the male pronucleus of a pronuclear stage fertilized egg, which is a totipotent cell of a rat, are transferred to the oviduct of a foster mother, and the offspring are born. After that, the offspring having the injected gene are selected, and individuals having the gene integrated stably are obtained. When the individual develops, the large T antigen gene of SV40tsA58 is integrated into the chromosome of the cells of each tissue. Transgenic rats can be efficiently produced.
  • hypothalamus-derived cells can be isolated by the enzymatic method described in J. Pharmacol. Toxicol. Method. 36, 45-52 (1996), and Langerhans islet cells described in Diabetes, 46, 1755 (1997). Can be isolated by the above method.
  • Culture of the isolated cells can be carried out according to a usual method for culturing animal cells.
  • a medium for culturing the cells commonly used RPMI1640 medium.
  • Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)] Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dalbe Modified Eagle's medium (DMEM medium) CVirology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)], or fetal bovine serum etc. And the like can be used.
  • the cultivation is usually performed under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and 5% CO 2 ; for! To 7 days.
  • an antibiotic such as kanamycin or penicillin may be added to the medium during the culture.
  • Immortalized cells can be obtained by subculturing the cells for 2-3 months ⁇
  • cell lines derived from endocrine cells such as a cell line derived from the hypothalamus and a cell line derived from Langerhans islets, can be obtained.
  • a large number of immortalized cell lines can be remarkably efficiently and reproducibly prepared from endocrine cells of transgenic animals (Exp.Anim. 48, 255 (1999)) transfected with the large T antigen gene of temperature-sensitive mutant SV40tsA58. It was found for the first time in the present invention that a large number of products could be acquired.
  • the obtained mixture of cell lines can be cryopreserved according to the usual method for cryopreservation of animal cells, and the cells can be raised when necessary and used for various analyzes and experiments.
  • the mixture of the cell lines obtained above can be isolated as individual cell lines by single cloning according to a conventional method such as the colony forming method Endocrinology 136, 4084 (1995)].
  • hypothalamic-derived cell line ⁇ Langerhans islet cell line-derived cells, prohormone convertase (Pl / P3, PC2, furin, PC4, PACE4, PC5 / PC6, PC7 / SPC7 / LPC / PC8), carboxy Selection of an endocrine cell line suitable for the purpose by examining the expression of genes such as peptidase E (CPE) or peptidylglycine-amidating monooxygenase (PAM) and the expression of the gene product it can.
  • CPE peptidase E
  • PAM peptidylglycine-amidating monooxygenase
  • endocrine cells for example, insulin, glucagon, somatosustin, Teng polypeptide, etc.
  • the expression of the target active peptide can be determined. Appropriate endocrine cells can be selected.
  • an arbitrary active peptide precursor gene is introduced into the above-mentioned cell line according to the method described in 3. below, and it is examined whether an active peptide is produced.
  • Endocrine cell lines suitable for peptide expression can also be selected.
  • Methods for examining the expression of various genes include the RT-PCR method and the Northern blot method.
  • Methods for examining the expression of various gene products or the production of active peptides include cell staining and Western blot using various antibodies.
  • the endocrine cell lines obtained as described above are extremely useful as peptide sources and cDNA sources for searching for various active peptides.
  • the characterization of the various immortalized cell lines obtained in (1) and the endocrine cell line selected in (2) is known to be expressed in cells of the tissue from which the cell line is derived.
  • the gene can be determined by examining the expression of the gene. For example, in cell lines derived from the hypothalamus, the lebutin receptor gene, prebu oral opiomelanocortin gene, CMT gene, prebloagouti-related peptide gene, prepro-nuromedin U gene, RFIIP preproprotein gene, prebrocolucotropin releasing hormone gene , Prebu oral melanin-concentrating hormone gene, Preprolexin gene, Preproghrelin gene, Prebu oral thyrotrobin releasing hormone gene, Prebronian bite peptide FF gene, MC4R gene, NPY1R gene, NPY5R gene, NMU2R gene, BJP receptor gene, Characterization can be performed by examining the expression of the CEHR-1 gene, CRHR-2 gene, MCIffil gene, g
  • the insulin gene for prebu mouth preproglucagon gene, prebrosomatostin gene, prepropolypeptide gene, prohormone convertase-1 (PC1) gene, prohormone convertase 2 (PC2 ) Gene, glucagon-like peptide-1 (6LP-1) receptor gene, PDX1 ancreatic-duodeim ⁇ homeobox 1) gene, Pax4 gene, Pax6 gene, neurodindin 3 gene, neuro! Gene, Nkx2.2 gene, Nkx6. Characterization can be performed by examining the expression of the 1 gene, the glucokinase gene, the type 2 glucose transport gene, etc. [Adv. Pharmacol., 47, 255 (2000)].
  • the characterization of the cell line is performed by examining the reactivity of the cell line with a ligand, agonist, or antagonist for a receptor known to be expressed in cells of the tissue from which the cell line is derived. You can also. Specific examples are shown below.
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • cell staining or Western blotting using an anti-STAT antibody or anti-phosphorylated STAT antibody can be performed to determine whether a functional CNTF receptor is expressed in the cells.
  • type 1 MU receptor NMU1R
  • type 2 NMU receptor NMU2R
  • ghrelin receptor type 1 orexin receptor (0X1R)
  • type 2 orexin Receptor type 1 angiotensin II receptor and the like
  • P2Yi receptor P2Yi receptor and the like in a cell line derived from Langerhans islets.
  • the increase in intracellular cAMP levels can be examined to determine whether functional receptors are expressed on the cells.
  • such receptors include melanocortin type 4 receptor (MG4R), type 1 CRH receptor (CRHR-1), type 2 CRH receptor (CRHR-2), and galanin.
  • M4R melanocortin type 4 receptor
  • CRHR-1 type 1 CRH receptor
  • CRHR-2 type 2 CRH receptor
  • galanin galanin.
  • the receptor, GLP-1 receptor, GLP-2 receptor and the like can be mentioned in the case of a cell line derived from Langerhans islets, such as GLP-1 receptor.
  • Functional receptor is a cell Can be examined.
  • the increase in the amount of intracellular cAMP can also be examined by the expression of the reporter gene.
  • NPY1R type 1 NPY receptor
  • NPY5R type 5 NPY receptor
  • RFRP receptor type 2 NPFF receptor
  • NPFF2R type 2 NPFF receptor
  • the increase in the amount of intracellular Ca 2+ can be examined by the expression of the reporter gene.
  • IRS-l insulin receptor substrate 1
  • IRS-2 insulin receptor substrate 1
  • glucagon that can be used as a primary cell for ⁇ cells
  • insulin that can be used as a marker for? Cells
  • Characterization by examining the expression of knee polypeptide which can be used as a marker for keratinocytes, and nestin (Diabetes, 50, 521 (2001)), which can be used as a marker for pluripotent stem cells. You can do it too.
  • the differentiation trait of the cell line can be controlled.
  • an endocrine cell line can be selected or an immortalized cell line can be characterized using the method described in (2) or (3) above. .
  • Examples of the culture method for controlling the differentiation trait include the culture methods described in (a) to (h) below and culture methods combining these methods.
  • differentiation is achieved by culturing at a temperature that does not inhibit the activity of the mutant (30 to 33 ° C, preferably 33 ° C).
  • the trait can be controlled and the cell line can be grown.
  • the cells When it is desired to induce a differentiation trait, the cells may be cultured under conditions that inhibit the expression of the oncogene or the activity of the oncogene product. That is, in the case of an immortalized cell line that expresses a temperature-sensitive mutant of SV40 large T antigen, the culture may be performed at 37 to 39 ° C, preferably at 37 ° C.
  • the presence of serum may increase the reporter activity of the back-drug, and thus the culture method using a serum-free or low-serum medium requires measurement of the activity of the active peptide. This is the preferred culture method.
  • a receptor, transporter or channel ligand, agonist or angonist expressed in the immortalized cell line, or a substrate of the transporter or channel is added and cultured.
  • a receptor for example, in a hypothalamus-derived host cell line, a GPCR (GLP-1 receptor or the like), a nuclear receptor, a growth factor receptor, a lebutin receptor, or the like is used. , GPCR (GLP-1 receptor, etc.), nuclear receptor, growth factor receptor (insulin receptor, etc.), cytokine receptor (activin A receptor, etc.), And sulfonyl perea receptors.
  • Examples of the transport include glucose transporters ( channels include Ca channel, K channel, C1 channel, and Na channel, etc.).
  • the cells can be cultured while controlling cell differentiation traits and gene expression.
  • Substances that can replace the receptor signal include, for example, protein kinases, protein kinases such as protein kinases and MAP kinases, substances that activate or suppress low molecular weight G proteins, and G protein-coupled receptors.
  • protein kinases protein kinases such as protein kinases and MAP kinases
  • substances that activate or suppress low molecular weight G proteins include G protein-coupled receptors.
  • G protein-coupled receptors forskolin, 8-bromo-cyclic AMP (8-Br-cAMP), 3-isobutyl-1-methylxanthine, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), and ionomycin.
  • Examples of the culture method include a method of culturing on a dish coated with laminin, and a method of culturing by adding succinylated concanavalin A [J. NeurobioL, 39, 1, (1999) ⁇ . It is suitable for culturing cell strains derived from the hypothalamus.
  • a method of culturing on a gelatin-coated dish [Diabetes, 48, 1402 (1999)], activin, GLP-1, follistatin, glucose, hepatocyte growth factor, Epidermal growth factor, nicotinamide, ⁇ itineru cellulin, parathyroid hormone-related protein, thyrotropin-releasing hormone, vascular endothelial growth factor ( vascular endotnelial growth factor), islet neogenesis-associated protein, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor I, fibroblast growth cultivation with the addition of a growth factor), nerve growth factor, or Reg protein [Saishin Igaku, 54, 2522 (1999); Nat. Med.
  • a gene of a signaling molecule or a transcription factor involved in intracellular signal transduction of a receptor expressed in the immortalized cell line, or a transcription important for differentiation or functional expression of the immortalized cell line Introduce, express, and culture the factor gene.
  • transcription factor genes include the Gsh-1 gene in cell lines derived from hypothalamus cells, and the PDX1, Pax4, Pax6, neurogenin 3, and neuro D genes in cell lines derived from Langerhans islets. CAdv. Pharmacol., 47, 255 (2000); Biochem. J., 341, 315 (1999), including the gene, the Nkx2.2 gene, the Nkx6.1 gene, the Is1 gene, and the upstream stimulatory factor gene. )]
  • the above-described receptor, signal transduction molecule, or gene of a constitutively active mutant or dominant negative mutant of a transcription factor may be introduced and expressed. Gene transfer can be performed according to the method described in 3. below.
  • DNA encoding the active peptide precursor can be obtained as follows. Based on the nucleotide sequence of the cDNA of the active peptide precursor, a region of the cDNA containing the region encoding the active peptide precursor is appropriately selected. DNA containing at the 3 'end a sequence of 5 to 20 bases at the 5' end of the base sequence of the selected region, DNA containing a sequence complementary to the base sequence of 20 to 40 bases at the 3 'end of the base sequence of the selected region at the 3' end Are synthesized using a DNA synthesizer. CDNA is prepared from a tissue or cell in which the active peptide is expressed.
  • a DNA encoding the active peptide precursor can be amplified and isolated by PCR using the prepared cDNA as type III and two types of synthetic DNA as primers. Preparation of cDNA from tissues and cells and PCR are described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (hereinafter referred to as Molecular Cloning). (Referred to as “12th edition 3rd edition”).
  • any peptide can be expressed and produced.
  • a random peptide library can be prepared by using a mixture of a plurality of MAs having a random sequence as DNA encoding any peptide by the above method.
  • a recombinant vector in which the active peptide precursor gene is inserted under an appropriate expression vector promoter By introducing the vector into the host cell, an expression system for the active peptide precursor gene can be constructed.
  • An expression unit for a foreign gene to be expressed (a DNA encoding the desired active peptide precursor downstream of the promoter) is a necessary component of the plasmid vector for expressing the active peptide precursor gene. (A structure in which a restriction enzyme site into which a DNA can be inserted and a poly-A addition signal are sequentially linked).
  • any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • a promoter having a sequence that responds to a specific transcription factor described later in 6. (2) can also be used.
  • an enhancer of the IE gene of human CV and the like can also be used.
  • a promoter that functions in response to a specific transcription factor in animal cells can be used.
  • an animal cell into which a transcription factor expression plasmid has been introduced such as the transcription factor. Need to use.
  • Such promoters include promoters that respond to the transcription factor Gal4p derived from yeast (Saccharomyces cerevisiae).
  • Promoters that respond to Gal4p react not only with GaUp but also with chimeric proteins of the DNA binding domain of Gal4p and the transcriptional activation domain of any transcription factor.
  • transcription activation region of transcription factors examples include the transcription activation domain of helpes simplex virus VP16 (Nature, 335, 563 (1988)), the ligand-binding region of estrogen receptor [Cell, 54, 199 ( Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1657 (1993)] When the ligand-binding domain of the estrogen receptor is used, transcription is initiated by adding estrogen to cells. Can be done.
  • any poly-A addition signal can be used.
  • a poly-A addition signal of the SV40 early gene a poly-A addition signal of the heron-globin gene, a poly-A addition signal of the Pacific growth hormone, etc. can be used.
  • a plasmid vector that has an origin of replication necessary for replication in animal cells I do.
  • the replication origin the replication origin of SV40 and the replication origin oriP of Epstein-Barr-virus can be used.
  • a plasmid vector having an SV40 origin of replication has a higher copy number in a host that expresses the SV40 large T antigen, and is therefore suitable for highly expressing a target gene.
  • the replication origin of SV40 should be set in the cell line cultured under the conditions in which the large T antigen functions.
  • the target gene can be highly expressed.
  • the vector containing oriP is not integrated into the host chromosome and is maintained extrachromosomally in the host expressing Epstein-Barr virus nuclear antigen-1 (EBNA-1).
  • a vector containing oriP is stably maintained extrachromosomally depends on the host.
  • the vector is generally stably maintained extrachromosomally. Even in cells that do not originally express EBNA-1, exogenous EBNA-1 gene can be introduced and expressed to transform the vector containing oriP into a plasmid. It is known that it may become preserved.
  • the plasmid vector contains a drug resistance gene containing an endogenous promoter for Escherichia coli (Escherichia coli) and the origin of replication necessary for replication in E. coli.
  • Escherichia coli an endogenous promoter for Escherichia coli
  • the replication origin required for replication in E. coli includes the replication origin of PBR322 and the replication origin of colEl.
  • a drug resistance gene expression unit for animal cells (a structure in which a drug resistance gene and a poly (A) addition signal are sequentially linked downstream of the promoter) must be used.
  • drug resistance genes for animal cells include a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, a plasticidin resistance gene, a puromycin resistance gene, a zeocin resistance gene, and the like.
  • promoter and poly-A addition signal those similar to those used for the expression unit for introducing the active peptide precursor gene can be used.
  • pcDNAI / Amp As plasmids for expression, pcDNAI / Amp, pcDNA3.1 (+) s pcDNA3.1 (-), pcDNA3.1 (+) Hygro, pcDNA3.1 (-) Hygro (all above in vitro (Invitrogen)), pCM8, pREP4, pAGE107, pAGE103, pAMo (J. Biol. Chem., 268, 22782 (1993), also known as pAMoPRC3Sc (Japanese Unexamined Patent Publication No. 05-336963)), pAMoA, pAS3-3, pAMoh ( Example 19), pAGal9-nd (see Example 18 below), pAGal9-d (see Example 18 below), and the like.
  • any method for introducing the recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • electoporation method [Cytoteclmology, 3, 133 (1990)], calcium phosphate method (special method) Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], and the methods described in Virology, 52, 456 (1973).
  • a commercially available DM introduction reagent can be used.
  • the DNA introduction reagent Lipofectamine plus (GIBCO-BRL), LiporfectAMINE 2000 (GIBCO-BRL), LipofectAMINE (GIBC0-BRL), Lipofectin (GIBCO-BRL), DMRIE-C (GIBCO-BRL), Superfect (QIAGEN), Effectene (QIAGEN), TransFast (Promega), GeneJammer (Stratagene), FuGENE (Roche), DuoFect (Q-biogene), Transfectam (BioSEPRA), etc. Can be raised.
  • the optimal conditions for gene transfer can be determined by detecting the activity of the produced peptide with high sensitivity by using the Atsey method using the repo overnight system described in Section 6. .
  • the optimal conditions for gene transfer can be determined extremely efficiently by using a 96-well plate and setting gene transfer conditions for each well.
  • a recombinant virus can be produced in packaging cells and contains a suitable promoter for expressing the target gene in a host cell strain.
  • Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-6737 (1995)] pBabePuro CNucleic Acids Research, 18, 3587-3596 (1990)), LL-CG ⁇ CL-CG ⁇ CS-CGs CLG CJ Journal of Virology, 72, 8150-8157 (1998)] and pAdexl [Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821 (1995)].
  • These viral vectors lack at least one of the genes encoding proteins required for packaging of the virus.
  • Proteins required for packaging include gag, pol, and env derived from mouse retrovirus in the case of a retrovirus vector, and gag, pol, ei, vpr, vpu, and the like derived from an HIV virus in the case of a lentivirus vector. vif, tat, rev, nef, etc .; Adenovirus-derived E1A, E1B, etc. for adenovirus vectors; Rep (p5, pl9, p40), Vp (Cap), etc. for adeno-associated viruses Can be given.
  • the promotion the promotion described in (1) above can be used.
  • the active peptide precursor gene is inserted downstream of the promoter in the virus vector to construct a recombinant virus vector.
  • the constructed recombinant virus vector-plasmid is introduced into a packaging cell suitable for the virus vector plasmid.
  • any cell can be used as long as it can supply a protein necessary for packaging which encodes the above-mentioned gene which is deficient in the virus vector.
  • HEK293 cells derived from human kidney and mouse fibroblast NIH3T3 can be used.
  • the recombinant virus vector is introduced into the packaging cells to produce a recombinant virus.
  • Examples of a method for introducing the above-mentioned virus vector into the above-mentioned packaging cells include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a lipofection method [Proc. Natl.
  • a virus vector By infecting a host cell with the produced recombinant virus, a virus vector can be introduced into the host.
  • the expression cloning system for the active peptide precursor gene can be constructed as follows.
  • the cDNA library is inserted by inserting cDM isolated from cells or tissues into the expression vector instead of a specific active peptide precursor gene. Make it.
  • any human or animal tissue or cell can be used as a cDNA source, in order to search for an active peptide, it is preferable to use a cell capable of expressing the active peptide--a tissue containing the cell.
  • a cell capable of expressing the active peptide--a tissue containing the cell For example, whole brain, various parts of the brain (hypothalamus, thalamus, pituitary, cerebellum, hippocampus, striatum, substantia nigra, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum), adrenal gland, kidney, small intestine, large intestine, heart, lymph Nodes, bone marrow, trachea, trachea, bone marrow, liver, mammary gland, uterus, lung, placenta, stomach, thyroid gland, skeletal muscle, Teng Langerhans island, ⁇ cells,? Cells, 5 cells, ⁇ cells, etc. be able to. Further, the immortalized cell line
  • the recombinant vector can be introduced into E. coli to prepare a cDNA library.
  • Examples of the cDNA library prepared by such a method include a cDNA library derived from the human hypothalamus prepared using the inducible expression vector pAGal9-nd (see Example 23). .
  • the cDNA library is diluted to an appropriate concentration and cultured on an agar medium, and the individual colonies that appear can be isolated as clones (E. coli).
  • a cDNA clone can be obtained by isolating a plasmid (recombinant vector) from each clone (Escherichia coli). Plasmids can be isolated by a conventional method described in Molecular 'Cloning Third Edition or by using a kit such as QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (manufactured by Qiagen).
  • the clone (Escherichia coli) isolated from the cDNA library is divided into pools of 1 to 10,000 clones, preferably 10 to 100 clones, and Escherichia coli is cultured for each pool to isolate a plasmid (mixture of cDNA clones). I do.
  • the obtained plasmid (recombinant vector) from each pool is introduced into the host cells by the method described in 3. using the cells obtained in 1. as host cells.
  • the obtained transformant is cultured by the method described in 5. (1) described later to express the protein encoded by each cDNA clone.
  • the activity is measured by the method described in 6. below, and a pool in which the activity is detected is selected. Perform a similar operation again on the selected pools. By repeating this process and finally performing the above operation for each clone, cDNA encoding the desired active peptide precursor can be identified.
  • the active peptide precursor By selecting a cDNA having a high possibility of encoding 03 04840 and performing the above operation, it is possible to efficiently search for a DNA having the desired activity.
  • a cDNA that is likely to encode an active peptide precursor has a signal sequence, consists of 80 to 250 amino acids, and has a sequence of two consecutive basic amino acids in the region other than the signal sequence. And those encoding peptides having the characteristic of being presumed to have no membrane-bound region.
  • the signal sequence and transmembrane region can be obtained from programs such as PSORT (Trends Biochem. Sciences 2 ⁇ , 34 (1999)) and SignalP C SignalP web site (http: //www.cbs.dtu.dk.services/SignalP/)). It can be predicted from the amino acid sequence using the analysis software MacMolly 3.5 (AROKA), the analysis software SOSUI system ver.
  • the desired active peptide can be obtained from a culture solution, cells, or an extract of the cells obtained by culturing the transformant obtained in the above 3.
  • the culturing can be carried out according to the culturing method described in 1. (1) above or the culturing method controlling the differentiation morphology of the immortalized cell line described in 1. (4) above.
  • known active peptides produced by a cell line derived from the hypothalamus include NPY, ⁇ -MSH, NPFFs CRH, TRH, etc.
  • known active peptides produced by a cell line derived from Langerhans islet include insulin, Glucagon, Somatos, Chin, Polypeptide, Ghrelin, etc. It is considered that a novel active peptide is also produced from various types of endocrine cell lines established by the method described in 1. above, and the cell line is extremely useful for searching for a novel active peptide.
  • the active peptide In endocrine cells, the active peptide accumulates in secretory granules, Is known to be released out of the cell at once. Therefore, in the production of an active peptide using the cell line derived from the endocrine cell of the present invention, it may be preferable to subject the cell to an appropriate secretion stimulation.
  • Secretion stimulants include high potassium (for example, 50 to 100 orchid ol / L), high glucose (for example, 25 lotus ol / L), Tolbutamide (for example, 100 mol / L), ATP (for example, lmol / L). ⁇ 10 thigh ol / L).
  • substances that can be used as secretion stimulants can be selected as follows.
  • a test substance is added to a cell line derived from an endocrine cell, and a test substance having an activity to increase the intracellular Ca 2+ concentration is selected.
  • the Ca 2+ concentration is measured using a device such as CAF-110 (manufactured by JASCO Corporation), FLIPR (manufactured by Molecular Devices), FDSS6000 system (manufactured by Hamamatsu Photonics) according to a known method. be able to.
  • An arbitrary active peptide precursor gene (for example, vasopressin precursor gene or CRH precursor gene) is introduced into an endocrine cell line, cultured for 2 to 4 days, and the test substance is added thereto. For example, measure the amount of vasopressin or CRH). Compared to the case where the test substance is not added, a substance whose addition increases the amount of active peptide is selected as a secretion stimulant.
  • a high-concentration peptide solution can be obtained.
  • Such a high-concentration peptide solution is preferable because the activity can be efficiently detected in the above-mentioned Atsushi system.
  • the concentration of peptides around the Atsey cells can be increased by adding an appropriate secretion stimulant without using a small amount of medium.
  • the activity can be detected more efficiently as compared with the case where no secretion stimulant is used.
  • Accumulation of produced active peptides in secretory granules can be controlled by culture conditions. May be possible.
  • MIN6 a mouse-derived /? Cell line
  • a medium containing high glucose 25 / ol / L glucose
  • insulin is highly produced but is constantly secreted into the medium.
  • a medium containing low glucose 5.5 mol / L glucose
  • insulin is accumulated in secretory granules, although production is low.
  • MIN6 expressing the active peptide precursor gene was added to a medium containing high glucose [eg, DMEM (HG) medium: 25 ml / L glucose, 15% fetal bovine serum, 25 U / ml penicillin, and 25 g / ml).
  • DMEM (HG) medium 25 ml / L glucose, 15% fetal bovine serum, 25 U / ml penicillin, and 25 g / ml.
  • a low glucose-containing medium eg, DMEM (LG) medium: 5.5 ml / L glucose, 15% fetal calf serum, 25 U / ml penicillin
  • DMEM (LG) medium 5.5 ml / L glucose, 15% fetal calf serum, 25 U / ml penicillin
  • the active peptide produced by culturing in DMEM (manufactured by Nissui Pharmaceutical) containing 25 ⁇ g / ml streptomycin] is accumulated in secretory granules, and then a suitable secretion stimulus is applied. Can be released.
  • the peptide After introducing and expressing the active peptide precursor gene into endocrine cells, the peptide is prepared using the culture supernatant of the cells, a cell extract of the cells, a membrane fraction of the cells, or the cells themselves. Can be measured.
  • any method that can measure the activity can be used, but it is preferable to use a method that is as sensitive as possible. Examples thereof include a sandwich ELISA method using an antibody that binds to the active peptide, and a bioassay method specific to the active peptide.
  • the active peptide when the active peptide is a ligand for a receptor such as a GPCR, the active peptide can be obtained with high sensitivity and a high signal / noise ratio by using the receptor-based Atsushi system. 3 04840 Can be detected easily.
  • the following is a specific example of the Atsushi system using the receptor and using the repo overnight gene.
  • the cells used for digestion (hereinafter also referred to as Atsuyi cells) have a repo overnight gene linked downstream of a promoter that responds to a signal from a receptor such as a GPCR, and a receptor gene for an active peptide. Is a cell having the expression unit of the above.
  • a signal flows from the receptor, and the expression of the repo overnight gene is induced. Therefore, the active peptide in the sample can be detected by bringing the sample into contact with Atsushi cells and measuring the expression level of the reporter gene.
  • the sample can also be contacted with Atsushi cells and the increase in intracellular Ca 2+ measured. Active peptides can be detected. Atssey cells can be constructed by the following method.
  • a host for expressing the DNA encoding the receptor for the active peptide can be constructed by the usual method described in Molecular Cloning, Third Edition and the like.
  • a plasmid having the replication origin oriP of Epstein-Barr virus is used as a vector, using the serum-free adapted B cell line expressing the Epstein-Barr virus EBNA-1 gene constructed in the present invention as a host.
  • the vector has the following properties (i) to (iii), which are stable in a plasmid state outside the chromosome of the host cell and are desirable for the construction of Atssey cells.
  • the efficiency of introduction of a vector into a host cell is high.
  • the host cells and the obtained assay cells are non-adherent cells (suspension cells), the culture operation is simple, and the ease and versatility of the assay are high. If the cell whose peptide expression is to be examined is an adherent cell, it is easy to overlay the cells with Atsuy cells on the cells, so that the detection sensitivity of the Atsuy system may be increased depending on the assy method. it can.
  • Host cells and the resulting Atsushi cells can be cultured without serum.
  • any B cell line that expresses the Epstein-Barr virus EBNA-1 gene can be used. Although it is possible, it is preferable from the viewpoint of safety to use a cell line that does not produce Epstein-Barr virus.
  • the cells for example, Namalwa cells (ATCC number: CRL-1432), Raji cells (ATCC number: CCL-86), and Daudi cells (ATCC number: CCL-213) can be used. More preferably, Najnalwa cells can be used.
  • Known methods [Cytotechnology, 1, 151 (1988); Dev. Biol. Stand., 99, 153 (1999); Pharmacol.
  • the above cell line was serum-free-adapted to express the EBNA-1 gene of Epstein-Barr virus.
  • a cell line can be obtained.
  • a B cell line that expresses the Epstein-Barr virus EBNA-1 gene and is serum-free conditioned it is preferably obtained by serum-free conditioned Namalwa cells, more preferably Namalwa cells obtained by serum-free conditioned.
  • Namalwa KJM-1 cell Cytotechnology, 1, 151 (1988)] is used.
  • the medium for culturing the serum-free conditioned B cell line expressing the Epstein-Barr virus-EBNA-1 gene is a commonly used ⁇ 1640 medium (J. Am. Med. Assoc., 199, 519). (1967)), Eagle's MEM medium (Science, 122, 501 (1952)), DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), 199 medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)], or a medium obtained by adding an additive for serum-free culture to these mediums [Cytotechnology, 1_, 151 (1988); Dev. Biol. Stand., 99, 153 (1999); Pharmacol. Ther., 53 , 355 (1992); Cytotechnology, 5, 3 (1991); Adv. Biochem. Eng. BiotechnoL, 34, 95 (1987)]. A commercially available medium for serum-free culture can also be used.
  • the culturing is carried out usually pH6 ⁇ 8,30 ⁇ 40 ° C, 5% C0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower. If necessary, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture. When a plasmid containing a drug resistance gene is introduced into the cells as described below, the corresponding drug may be added to the medium and cultured.
  • an expression vector for introducing a DNA encoding an active peptide receptor a vector capable of expressing the DNA in a host animal cell, and as a replication origin required for replication in an animal cell, The ones with the oriP of the virus in the bar are listed.
  • Examples of such an expression vector include pAMo, pAMoA pAMoh, etc., and those obtained by introducing the oriP into the expression vector described in 3. (1) above.
  • the DNA encoding the receptor for the active peptide is inserted downstream of the promoter of the expression unit for the foreign gene in the expression vector, and the receptor expression plasmid is constructed.c
  • the DNA encoding the receptor is as follows: It can be obtained as follows. Based on the nucleotide sequence of the cDNA encoding the receptor, a region of the cDNA including a region encoding the receptor is appropriately selected. MA containing DNA comprising 'an end 20 to 40 nucleotide sequence of the 3' 5 of the base sequence of the selected region to the edge, a 3 3 edge 20 to 40 bases complementary to the sequence of the nucleotide sequence of the selected area to the 3 'end Are synthesized using a DNA synthesizer.
  • CDNA is prepared from tissues or cells in which the receptor is expressed.
  • a DNA encoding the receptor can be amplified and isolated by PCR using the prepared cDNA as a type II and two kinds of synthetic DNA as primers.
  • Preparation of cDNA from tissues and cells and PCR can be performed according to the method described in Molecular Cloning, Third Edition.
  • the expression plasmid is introduced into the host cell obtained in 6. (1) (a) by the method described in 3. (1) above.
  • the transformant can be obtained and cultured according to a known method described in JP-A-2-227075 or JP-A-2-2577891.
  • Atsuse cells can be favorably grown.
  • the receptor is a GPCR
  • the constitutive activity of the GPCR is detected by transiently overexpressing the GPCR using an inducible expression system, as described in (2) of [II] below. Will be able to do it.
  • the inducible expression system has a structure in which an arbitrary DNA is linked downstream of a promoter that responds to the activated transcription factor to a host in which a transcription factor that is activated by addition of a specific drug or the like is expressed.
  • This system introduces an inducible expression vector, and induces and expresses the DNA by adding a drug.
  • Examples of the inducible expression system include a system using estrogen [Cell, 54, 199 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 1657 (1993)], a system using a tetracycline resistant operon [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547 (1992); Methods Enzymol.
  • a Gal4p-responsive promoter is used as an expression vector promoter.
  • the expression of any gene under the promoter can be induced by the addition of estrogen. Also, by changing the concentration of estrogen used, the expression level of the gene can be controlled.
  • tetracycline-resistant operon Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547 (1992); Science, 268, 1766 (1995); Methods Enzymol. 283, 159 (1997)
  • expression in the host was performed.
  • the transcription factor to be used is tetracycline-controlled transactivator [Escherichia coli tetracycline repressor and HSV W16 transcription activation region chimeric protein] or reverse tetracycline-controlled transactivator.
  • a mutant type of tetracycline reblessa-1 that activates transcription upon binding to tetracycline and a chimeric protein of the transcriptional activation region of VP16 of HSV and a promoter having a tetracycline response element as a promoter for the expression vector. Use every night. In this system, Removal of tetracycline or doxycycline when using Eclin, Controlled Transactivator, and addition of reverse drug when using Controlled Transactivator. Accordingly, also c can induce the expression of any DNA under the promoter, by varying the concentration of the present agent can and child control the expression of genes.
  • a lactose repressor of Escherichia coli is used as a transcription factor to be expressed in a host, and a promoter having a lactose operator is used as a promoter of a vector.
  • the expression of any DNA under the promoter can be induced by the addition of isopropyl-D-thiogalactoside.
  • a heterodimer of Drosophila ecdysone receptor and retinoic acid receptor RXR is used as a transcription factor to be expressed in a host, and a promoter having an ecdysone response element is used as a vector promoter. Used.
  • the expression of any DNA under the promoter can be induced by the addition of muristerone A (Muristerone A) or ponasterone A (ponasterone A).
  • the inducible expression vector can be constructed, for example, by the following method.
  • the promoter can also be constructed, for example, by inserting a DNA containing one or more response elements into the promoter for expressing a foreign gene described in 3. (1).
  • a Gal4p-responsive promoter having five Gal4p-responsive elements corresponding to the transcription factor Gal4-ER) (such as pAGalSdl in Example 18), and a tetracycline-responsive element in which a CMV promoter is connected downstream of the tetracycline-responsive element Promoter (such as PTRE2 manufactured by Clontech) and a promoter that has a lactose operator connected with a lactose operator at the downstream of the LTR Promoter of RSV (pORSVI / MCS, etc.), and Promoters having an ecdysone response element in which a heat shock promoter element is linked downstream of five ecdysone response elements (eg, EGSH manufactured by Straugene, pIND manufactured by Invitrogen, etc.).
  • EGSH EGSH manufactured by Stra
  • the sensitivity / signal / noise ratio can be optimized by examining the sequence, number, and position of the response sequence and TATA sequence during the promotion. 6.
  • a repo-overnight-inducible expression plasmid with the repo-overnight-gene inserted downstream of the promoter to be studied is constructed, and the repo-overnight-inducible expression plasmid is prepared for each.
  • a transformed strain is obtained by introducing the transformant into a host cell, and a repo overnight is induced and expressed in the transformed strain. The expression level of the repo overnight when non-induced is low, and the repo overnight when induced is not induced. By selecting a promoter with a high expression rate in the evening, the promoter can be optimized.
  • PAGal9-ds s pAGal9-nd (all Examples 18) and the like can be mentioned as an induction expression vector that has been optimized for such promotion.
  • a DNA encoding an active peptide receptor is inserted downstream of the inducible expression promoter to produce a plasmid capable of inducing and expressing a DNA encoding the active peptide receptor.
  • a host that expresses a transcription factor for inducing expression of the MA can be constructed as follows.
  • any vector can be used as long as it can express the transcription factor in animal details, and examples thereof include the vector described in 3. (1).
  • the expression plasmid of the transcription factor thus constructed is constructed according to a conventional method such as molecular cloning, third edition.
  • Examples of expression plasmids for such a transcription factor include Gal4-ER expression plasmid pGERbsrR2 (Example 18), tetracycline.
  • Controlled transactivator expression plasmid pTet-Off manufactured by Klontech
  • Reverse Tetracycline Controlled Reverse Tetracycline Controlled.
  • Transactivator Expression Plasmid pTet-On (Clontech), Lactose Repressor Expression Plasmid pCMVLacI (Stratagene), Exison Receptor and retinoic acid receptor RXR expression plasmids pERV3 (Stratagene), pVgRXR (Invitrogen) and the like.
  • the drug resistance gene for animal cells used in the vector for expressing a transcription factor it is desirable to use a drug resistance gene different from the drug resistance gene for animal cells used in the vector for inducible expression.
  • the expression plasmid for the transcription factor was obtained in Eps Using the method described in 6. (1), a large number of transformants are obtained by introducing into a serum-free conditioned B cell line that expresses the EBNA-1 gene of E. coli. In place of the DNA encoding the receptor for the active peptide, a repo overnight expression plasmid into which the repo overnight gene described in 6. (3) below is inserted is inserted into the above-mentioned vector for inducible expression. Prepared and introduced into these transformed strains.
  • Induction of the repo overnight gene is induced by adding a drug to induce transcription to each of the obtained transformants, and the expression level of the repo overnight gene is measured when induction is not performed and when induction is performed Then, calculate the induced expression fold (repo overnight expression at induction / repo overnight expression at non-induction).
  • a transformant having excellent properties in constructing Atsushi cells (a transformant having a low non-induction expression level and a high rate of induced expression) is selected as a host cell.
  • a host cell with excellent properties cannot be obtained even after selecting from a large number of transformants, examine the strength of the promoter for expressing the transcription factor, the promoter sequence in the inducible expression plasmid, etc.
  • the host cells may be selected again by the above method.
  • a cell line KJMGER8 (Example 18) in which Gal4-ER expression plasmid pGERbsrR2 is introduced into Namalra KJM-1 cells and integrated into chromosome MA is exemplified. .
  • KJMGER8 as a host and pAGal9-nd or pAGal9-d as a vector for inducible expression.
  • the host-vector system has no leakage of gene expression during non-induction and has a high induction ratio of gene expression. Induced expression system.
  • the expression vector for inserting the repo overnight gene is a promoter that has a response element corresponding to a transcription factor in the plasmid vector used to express the active peptide precursor gene described in 3. (1). It can be constructed by introducing.
  • the promoter can also be constructed by, for example, inserting an MA containing one or more response elements into a promoter for expressing a foreign gene described in 3. (1).
  • a promoter having a response element corresponding to a receptor signal is used as a promoter for expression of a reporter gene.
  • the receptor is a GPCR
  • the GPCR that binds to the active peptide to be measured is coupled.
  • binding to a ligand decreases intracellular cAMP or activates the MAP kinase cascade.
  • a promoter having a TPA response element (TRE) or NMT (nuclear factor of activated T cells) response element can be used.
  • each repo overnight plasmid having the promoter to be examined is constructed, and as described later in (b), each repo overnight plasmid is introduced into a host cell to obtain a transformant.
  • the transformed strain is stimulated to express a repo overnight, and the expression level of the repo overnight when unstimulated is low, and the ratio of the repo overnight expression when stimulated to the non-stimulated is high.
  • reporter gene for example, chloramphenicol-acetyltransferase gene,? -Galactosidase gene, ⁇ -lactamase gene, firefly luciferase gene, The luciferase gene and the green fluorescein protein (GFP) gene can be used [Mol. Biotec nol., 13, 29 (1999);
  • the drug resistance gene for animal cells is a drug resistance gene for animal cells that has already been introduced into the host cell into which this reporter plasmid is to be introduced (the receptor for the active peptide described in 6. (1) or (2)). It is preferable to use a drug resistance gene for animal cells which is different from the expression plasmid for the encoding DNA or the drug resistance gene for animal cells used in the plasmid for expressing a transcription factor described in 6. (2).
  • an EpsP gene containing a plasmid stably existing outside the host cell chromosome should be used as a replication origin necessary for replication in animal cells. It is preferable to use the oriP of the tine virus.
  • the repo overnight plasmid constructed as described above includes pACREpluc, which expresses H. luciferase under the control of a promoter having 16 CREs, which is a response element corresponding to a GPCR signal, Another example is pACRERluc, which expresses a rice luciferase under the control of a promoter with 16 CREs. (b) Incorporation of repo all-in-one system into host cells and selection of transformed strains
  • the repo overnight plasmid produced by the method described in (a) above is introduced into the host cell constructed by the method described in (1) or (2) above, and many stable transformants are obtained. . From these, a transformant having excellent properties (high responsiveness to stimulus and low background) in the construction of Atsushi cells is selected as described below, and used as a host cell for the construction of the Assey cells.
  • the method described in 3. (1) above can be used to introduce repo overnight. If the repo overnight plasmid contains the oriP of Epsuba in bar virus, the plasmid is transferred to the host cell after removal of the oriP by restriction enzyme digestion or disruption of the oriP function, followed by introduction into the host cell. It can be integrated into the chromosome of the cell.
  • the obtained transformant compare the expression levels of the repo overnight gene when induced with a drug for inducing transcription and when not induced, and select a cell line with good responsiveness to stimulation I do.
  • the reporter gene can be expressed by stimulating the cells with forskolin.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • a cell line is selected in which the expression level (background) of the repo gene is low as much as possible without stimulation with a substance that promotes transcription from the response element.
  • the expression level of the repo overnight gene can be determined by a known method (; Mol. BiotechnoL, 13, 29 (1999); Anal. Chemi., 70, 579A (1998); J. Eecept. Signal Transduct. Res., 19, 395 (1999); J. Recept. Signal Transduct. Res., 20, 189 (2000); Methods Mol. Biol., 130, 165 (2000)] Can be measured.
  • a repo overnight expressing a firefly-luciferase under the control of CRE GBC7 in which pACREpluc, a plasmid was introduced into KJMGER8, and repo, which expresses D. luciferase luciferase under the control of CRE—GBCR2, in which pACRERluc, which is a plasmid in the U.S.A., was introduced into KJMGER8, can be mentioned as examples.
  • the signal differs depending on the G protein coupled to the GPCR that binds to the active peptide, when measuring the activity of various peptides, it is generally necessary to change the assay method. That is, for each G protein to be coupled, it is necessary to construct a suitable repo overnight plasmid and a host cell into which the repo overnight plasmid has been introduced. At that time, since the expression level of each protein varies depending on the host cell used, expression of the G protein together may increase the sensitivity and signal-to-noise ratio of the repo overnight system.
  • Ga protein to be expressed Ga s, G shed q, G ⁇ Ga u, ( ⁇ shed 12, G monument 13, G shed 1 ⁇ 2, G monument 15, G monument 16, G monument., Ga ⁇ Ga t or G gu St and the like. also, G monument 15 or G monument 16, that is known to flow the same signal as the G monument. conjugated with many GPCR. Accordingly, G monument 15 or G monument 16 .
  • GPCR repo signals using NFAT response element and TRE of Isseki becomes so that can be detected in one system Go Ga "G Monument 15 or Go: 16 and for GPCR conjugating, although the signal from GPCR may be detected as an index the increase of intracellular Ca 2+, G q, G u, in the host cells expressing the G «15 or G monument 1 ⁇ 5 In some cases, an increase in intracellular Ca 2+ due to ligand stimulation may be more easily detected.
  • G shed s of the C-terminal 5 amino acids other G (Ga qS Ga ⁇ G u , G l2 G 14, G 1 5 G monument 16, G monument, Go; z, Go:. T or G, Facial t )
  • Mela Go by the expression in a host cell s, originally Go: GPCR to couple to G monument other than s is now conjugated with the chimeric Ga s, Sig of the signal from the GPCR via G «s Like the null, it can be detected in the repo overnight system using CRE.
  • the 5 C-terminal amino acids of the Ga q other G monument (Gcc s, G i Ga lls Gc1 ⁇ 2, Ga 14S G monument 15, Ga 16S G monument., G z G ratio t or G shed gust,) corresponding the chimeric G q which is substituted with an amino acid by expression in host cells originally Go: GPCR to couple to G monument other than q is now conjugated with the chimeric G shed q, the signal from the GPCR G Similar to the signal mediated by q , it can be detected in the report system using the NFAT response element or TRE. At this time, it is also possible to detect a signal from the GPCR using an increase in intracellular Ca 2+ as an index.
  • a transformant (eg, GBC7 or GBCR2) serving as a host for expressing the GPCR constructed by the method described in 6. (1) to (3) above is transformed with the following expression unit (a). ) And (b).
  • DNA encoding the chimeric Gcc protein can be obtained by a known method [Science, 29, 662 (1990); Nature, 363, 274 (1993); Mol. Pharmacol "50, 885 (1996); FEBS lett., 406, 165 ( Pharmacol., 57, 13 (2000)]
  • the DNA encoding the chimeric Go: protein can be constructed using the promoter of the expression vector described in 3. (1) above.
  • the expression plasmid for the chimeric Go: protein can be constructed by integrating the expression vector into a plasmid for expression of the drug resistance gene for animal cells used in the plasmid for expressing the chimeric protein. 1.The expression vector described in 6. (2), the expression plasmid for the transcription factor described in 6.
  • a drug resistance gene for animal cells that is different from the drug resistance gene.
  • a virus expressing the chimeric Go: protein can also be used.
  • An arbitrary chimeric G protein expression plasmid constructed by the method described in (a) above was added to the host cell constructed by the method described in 6. (1) to (3) above, as described in 3. (1).
  • a stable transformant can be obtained by introduction according to the method described in (1). If the plasmid expressing chimeric G protein contains oriP of Epsuba inva virus, the oriP is removed by restriction enzyme digestion or the function of oriP is disrupted, followed by introduction into host cells.
  • the chimeric protein expression plasmid can be integrated into the host cell chromosome.
  • the host cells constructed as described above are selected from, for example, GBCC13 selected from a transformant obtained by introducing pAMopGs-qMoGs-i into GBC7, and a transformed cell obtained by introducing pAMopGs-qMoGs-i into GBCR2.
  • GBCRC6 etc.
  • GBCC13 a signal from a GPCR conjugated to Go: s , Go :, and Go :; can be detected using the activity of mouse leuciferase as an indicator.
  • GBCRC6 G a s, a signal from GPCIi to couple to G q and Gd ⁇ , it can be detected as an index the activity of Umishiitake luciferase.
  • the host cells constructed in (2) to (4) are cultured in a medium containing an appropriate amount of a drug for selection in accordance with the drug resistance gene of the vector integrated into each cell. Is preferred.
  • the culture can be performed by the method described in 6. (1) (a).
  • KJMGER8 is a medium supplemented with blasticidin S (2.0 zg / ml)
  • GBC7 and GBCR2 are a medium supplemented with plastocidin S (2.0 g / ml) and hygromycin B (300 g / ml)
  • GBCC13 and GBCRC6 are blasticidin S (2.0 g / ml), high
  • the stable transformant can be obtained by culturing in a medium to which an appropriate amount of a selection drug corresponding to the drug resistance gene contained in the introduced plasmid is added.
  • a selection drug corresponding to the drug resistance gene contained in the introduced plasmid is added.
  • a medium containing 0.5 mg / ml of dieneticin is used. It is preferable that a drug that is preferably added when the above-mentioned host is cultured is simultaneously added to the medium.
  • an inducible expression vector having a response element corresponding to the transcription factor is used, as described in (2), using a host cell that expresses a transcription factor necessary for inducible expression.
  • a host cell expressing Gal4-ER for inducible expression such as GBCC13 or GBCHC6, is used, pAGal9-nd or pAGal9-d, which is an inducible expression vector containing a Gal4p response element, is activated. Used to construct expression plasmid for the receptor for the peptide.
  • the receptor for the active peptide can be expressed on the cell surface of Atssey cells only by culturing Atssey cells. it can.
  • the drug required for inducible expression described in 6. (2) is added, and the thus constructed Assay cells are cultured to express the receptor for the active peptide on the cell surface of the Assay cells. .
  • Atsushi cells obtained by introducing an expression plasmid for inducing an active peptide receptor containing a Gal4p response element into a host cell in which Gal4-ER has been expressed
  • 0.1 1000 nmol / L preferably 0.1 nmol / L
  • the receptor for the active peptide can be expressed on the cell surface of Atssei cells.
  • a sample for which the activity is to be measured is added to an Atsushi vesicle expressing the receptor for the active peptide on the cell surface, and cultured for 24 hours, preferably 6 hours, and then subjected to a known method [Mol. BiotechnoL, 13, 29 (1999). Anal. Chemi 70, 579A (1998); J. Recept. Signal Transduct. Res., 19, 395 (1999); J. Recept. Signal Transduct. Res., 20, 189 (2000); Methods Mol. Biol , 130, 165 (2000)], the expression level of the repo overnight gene, the expression level of the repo overnight polypeptide, or the reporter polypeptide. The activity of the peptide is measured.
  • the ligand peptide of the GPCR can be identified.
  • a novel active peptide precursor gene can be searched for by performing the activity measurement using these Atsushi cells.
  • a plasmid for expressing the receptor for the active peptide is prepared by the method described in (1) (b) or (2) (a), and the plasmid is transferred to the host cell constructed in 6. (1) to (4).
  • the stable transformant obtained by the introduction can be used as Atsey cells.
  • Obtaining, culturing, and expressing the peptide receptor on the cell surface can be performed in the same manner as in (a) above.
  • the immortalized cells obtained in the above 1 can be used as Atsushi cells.
  • the peptide in the sample can be detected by measuring a signal in Atsushi cells generated by the binding of the active peptide to the receptor.
  • Intracellular signals are receptor-dependent, such as arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ elevation, intracellular cAMP production, intracellular cAP reduction, intracellular cGMP production, inositol phosphate production , Cell membrane potential fluctuations, intracellular proteins (e.g., CREB, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a ⁇ STAT5b ⁇ STAT6, MAP kinase, ATF-2, c-Jun, c-fos, I-B, I-B?
  • intracellular proteins e.g., CREB, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a ⁇ STAT5b ⁇ STAT6, MAP kinase, ATF-2, c-Jun, c-fos, I-B,
  • the ligand peptide of the GPCR can be identified.
  • a novel active peptide precursor gene can be searched for by performing the activity measurement using these Atsushi cells.
  • the host-vector system constructed in [I] 6. above can be used not only for construction of an Atsushi system for receptors for active peptides, but also for the following.
  • test substance For the test substance, a similar test substance addition experiment was performed using Atsushi cells into which the control vector into which the GPCR gene was not inserted was introduced, and when the expression level of the reporter gene was not increased, A substance or ligand that acts on the GPCR, but not on the GPCR signaling system or the transcription of the repo allele. Can be confirmed.
  • GPCR specificity of the ligand or agonist can be evaluated by performing a similar experiment using Atsushi cells expressing other GPCRs.
  • the GPCR ligand or agonist and an arbitrary substance as a test substance are added to Atsushi cells expressing the arbitrary GPCR and cultured, and then the expression level of the repo overnight gene is measured.
  • the expression level of the repo overnight gene is measured.
  • the constitutive activity of a GPCR can be measured by transiently overexpressing an arbitrary GPCR gene in an atsushi system of a GPCR using an inducible expression system.
  • the GPCR of the transformed cells is induced and expressed, and the expression level of the repo overnight gene is compared with the case where the GPCR is not induced and expressed.
  • the expression level of the repo overnight gene increases when the GPCR is induced and expressed, it can be determined that the GPCR has a constitutive activity. In this way, a GPCR exhibiting constitutive activity (constitutively active GPCR) can be selected.
  • step 3 Search for inverse agonists or (agonists using active GPCRs)
  • construct Atsushi cells capable of inducing and expressing any constituent active GPCR.
  • the GPCR is induced and expressed, the expression level of the reporter gene is measured, and control (only the solvent in which the substance is dissolved is added).
  • an inverse agonist of the constitutively active GPCR can be obtained by selecting a substance that reduces the expression level of the repo overnight gene as compared to the case (1).
  • an agonist of the constitutively active GPCR can be obtained.
  • the expression level of the repo overnight gene was measured, and the control (only agonist) was used.
  • a substance that reduces the expression level of the reporter gene is selected compared to the case where no agonist is added, and when only the substance is added without adding an agonist, compared with the case where neither agonist nor the substance is added, A substance that does not decrease the expression level of the repo overnight gene can be selected as the neutral gonist (neutral neutral gonist) of the GPCR.
  • the GPCII-specificity of the angina gonist can be evaluated by conducting a similar experiment using the assay cells into which another component-activated GPCR has been introduced.
  • a cDNA library is prepared by inserting cDNA isolated from cells or tissues into the expression vector described in [I] 6. (1) (b) or [I] 6. (2) (a) .
  • Any human or animal tissue or cell can be used as a cDNA source.
  • tissue or cell can be used as a cDNA source.
  • MRNA is obtained from these cells, a double-stranded cDNA is synthesized from the mRNA, and the cDNA is used as [I] 6.
  • Plasmids can be isolated from each clone (Escherichia coli) as cDNA clones. Plasmid can be isolated by a conventional method described in Molecular Cloning, Third Edition, or using a kit such as QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (manufactured by Qiagen).
  • the cDNA library is divided into pools of 1 to 10,000 clones (Escherichia coli), preferably 10 to 100 clones, and Escherichia coli is cultured for each pool to isolate a plasmid (a mixture of cDNA clones). I do.
  • the recombinant vectors derived from each of the pools were assembled with the repo overnight system prepared in [I] 6. (3) (b) or [I] 6. (4) (b), respectively.
  • the transfected host cell is introduced by the method described in [I] 3. (1), and a stable transformant is obtained by the method described in [I] 6. (5).
  • the obtained stable transformant is cultured by the method described in [I] 6. (5) to express each cDNA clone.
  • the expression level of the reporter gene of the transformant is measured, and cDNA is not simultaneously expressed (in the case of inducible expression, the expression is not induced, in the case of constitutive expression, in the case of a host cell into which an empty vector has been introduced).
  • the gene expression level is also measured overnight. Compare the two, and select the pool in which the expression level of the reporter gene was increased when cDNA was expressed. Perform the same operation again for the selected pools.
  • a molecule having an activity to increase transcription from a response element controlling the expression of a reporter gene in a host cell for example, CDNA encoding active GPCRs, transcription factors, signal transduction molecules, enzymes, etc.
  • a plasmid is prepared from the entire cDNA library prepared by the above method using a conventional method or a kit such as Plasmid Maxi Kit (manufactured by Qiagen).
  • the plasmid is introduced into a host cell capable of expressing, as a reporter, a molecule that can be detected as a living cell such as GFP, which is a cell surface molecule, as a living cell, to obtain a stable transformant.
  • GFP a cell surface molecule
  • an arbitrary substance is added to cells in which cDNA has been expressed, and the cells are cultured, and then cells with high expression of the molecule are obtained.
  • the cells are stained with an antibody recognizing the molecule, and then the antibody is detected using a fluorescence activated cell sorter (hereinafter abbreviated as FACS). Sort cells with high binding capacity.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the molecule is GFP
  • cells with a high GFP expression level are sorted using FACS. After culturing the sorted cells, the same operation is repeated to concentrate cells that increase the expression of the molecule when the cDNA is expressed or that increase the expression of the molecule when an arbitrary substance is added.
  • the introduced plasmid can be recovered from the cells by a known method, for example, the Hart method [Mol. Cell. Biol., 8, 2837 (1988)].
  • the nucleotide sequence of the cDNA obtained by the above method is obtained by integrating the DNA fragment as it is or after cleaving with an appropriate restriction enzyme or the like, incorporating the DNA fragment into a vector by a conventional method described in Molecular Cloning Third Edition, etc. Sequence analysis methods, such as the dideoxy method of Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the determination can be made using a Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit or a BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems) and a DNA sequencer such as ABI PRISM 377 (manufactured by Applied Biosystems). From the nucleotide sequence, the amino acid sequence of the peptide encoded by the obtained cMA can be determined.
  • the expression plasmid of the peptide obtained in this manner is prepared according to the method described in [II] 1. or [ ⁇ ] 3. to construct an Atssey cell.
  • inhibition of the peptide can be carried out by adding an arbitrary substance and culturing, and measuring the expression level of the reporter gene. An agent or activator can be selected and obtained.
  • the strength of the constitutive activity of the GPCR encoded by the mutated DNA and the reactivity with the ligand, agonist, or angonistone vary.
  • it is desirable that the specificity for the ligand, agonist, and angelic gonist is not different from that of the natural GPCR.
  • a site with a high probability of not changing for example, the second half of the third transmembrane region to the first half of the second intracellular region, which is present in the above region, and is preserved by many GPCRs (Asp or Glu)-
  • Each amino acid corresponding to the Arg Tyr sequence (hereinafter referred to as the D / ERY motif) can be obtained by random mutagenesis from the second half of the third intracellular region to the first half of the sixth transmembrane region. it can.
  • a proline residue conserved in many G protein-coupled receptors present in the sixth transmembrane region in the case of a G protein-coupled receptor where the proline residue is not conserved, the proline residue is conserved).
  • Constitutively active mutant GPCI By determining the site and type (amino acid substitution, deletion, addition) of the introduced mutation, information on the correlation between the structure and activity of any GPCR can be obtained. . Constitutively active mutant GPCRs often cause disease, so that information can be used to determine the association with the disease.
  • a constitutively active mutant can be obtained by introducing a random mutation in the same manner as described above.
  • the use of the cell line of the present invention makes it possible to increase the number of specific endocrine cells in a large amount, so that it is possible to obtain a receptor or a physiologically active substance that is expressed in specific endocrine cells.
  • WO 03/087366 Can be used.
  • the measurement of the reactivity of a cell to an arbitrary substance can be performed, for example, according to the method of measuring the response of an Atssey cell described in [I] 6. (5) (b) above.
  • any drug can be used as the drug to be brought into contact with the cells.
  • drugs that act on the hypothalamus and show medicinal properties antiobesity drugs, cachexia drugs, antiallergic drugs, antiimmune drugs, Anti-inflammatory drugs, tumor remedies, virus remedies, psychiatric drugs, etc.
  • drugs that act on Langerhans Island and exert their effects anti-diabetic drugs, cachexia drugs, anti-immune drugs, anti-inflammatory drugs, Tumor drugs, virus drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • drugs that cause side effects in the hypothalamus or islets of Langerhans or molecules expressed in hypothalamic cells or islets of Langerhans (eg, various Receptors) can be used.
  • Any peptide can be used as the peptide to be brought into contact with the cells.
  • a peptide whose receptor is unknown a secreted protein whose function is unknown, a membrane protein, and a peptide can be used.
  • a cell expressing the peptide can be used.
  • any compound can be used, and for example, a substance known to be present in a living body of an animal can be used.
  • molecules that interact with the substance can be obtained from the cell line that reacts with the substance.
  • a method for obtaining a molecule that interacts with the substance for example, a purification method utilizing affinity for the substance or an expression cloning method can be used.
  • a physiologically active substance can be searched for using a culture solution, cells, or an extract of the cells after culturing the cell line of the present invention under various conditions.
  • the culture method the method described in the above [ ⁇ 1. (1) or [I] 1. (4) can be used.
  • cells expressing any protein may be added to the culture solution, cells, or extraction of the above cell lines, respectively.
  • a bioactive substance that acts on any protein by contacting the solution and examining whether cells expressing any protein (receptor, enzyme, transcription factor, etc.) react more strongly. Can be.
  • the measurement of cell reactivity can be performed, for example, using the assay described in [I] 6. (5) (b) above. It can be performed according to the method of measuring the reaction of the cells.
  • the bioactive substance can be detected using a general method, Spectrometric Identification of Organic Compounds, 6th Edition, John Wiley & Sons (1997)]. It can be isolated and its structure (whole or partial) determined.
  • the physiologically active substance is a peptide
  • the structure determined using a general method (protein structure analysis for gene cloning, Tokyo Kagaku Dojin, (1993)) is used.
  • the corresponding gene can be obtained.
  • the physiologically active substance is a peptide
  • the gene encoding the active substance is obtained by expression cloning using a cDNA library or a gene library prepared from cells showing the activity, and the structure of the active substance is clarified.
  • hypothalamus and Islets of Langerhans there are many types of cells in the hypothalamus and Islets of Langerhans, each of which is thought to perform a specific function that is important for the maintenance of homeostasis. These functions are exerted through the action of various receptors and various physiologically active substances expressed by hypothalamic cells or Langerhans islet cells.
  • Gene peptides specifically expressed in specific hypothalamic cells or specific Langerhans islet cells are thought to be involved in their cell-specific functions.
  • secretory peptides that are specifically expressed in specific hypothalamic cells or specific islets of Langerhans are likely to function as bioactive substances.
  • genes whose expression fluctuates when hypothalamic cells or Langerhans islet cells are stimulated also encode receptors and physiologically active substances that are important in regulating the function of hypothalamic cells or Langerhans islet cells. Is likely to be
  • peptides that are specifically expressed in specific hypothalamic cells or specific Langerhans islet cells peptides that are important for expressing the function of the cells (various receptors, various physiologically active substances, Various transcription factors, etc.) or genes encoding them can be obtained.
  • a cell line that retains the characteristics of hypothalamic cells or Langerhans islet cells obtained in the present invention one type of hypothalamic cells or Langerhans islet cells can be expanded in large quantities. Therefore, it becomes possible to obtain genes and peptides that are specifically expressed in specific hypothalamic cells or specific Langerhans islet cells.
  • the signal sequence method using any cell line of the present invention as a source [Science, 261, 600 (1993 Nat. BiotechnoL, 17, 487 (1999)], ligand-receptors expressed in the cell line can be efficiently obtained.
  • full-length cDM is obtained by hybridization using a probe specific to the sequence of the cDNA.
  • the nucleotide sequence of the full-length cDNA the peptide encoded by the cDNA can be identified.
  • the function of the peptide can be estimated. For example, From the above analysis, it can be estimated whether the peptide functions as a receptor, a ligand, a transport protein, an enzyme, or the like. By examining whether the peptide has a secretory signal sequence or a transmembrane region, it can be confirmed whether the peptide is a secretory protein or a membrane protein.
  • the peptide By expressing MA encoding the peptide in appropriate cells, the peptide can be produced, and the activity of the peptide can be experimentally examined.
  • an expression method a method according to the method shown in 3 below can be mentioned.
  • the acquisition method includes a method for obtaining genes whose expression is different between two different samples, such as the subtraction method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5738 (1988)) and representational difference analysis. Nucleic Acids Res., 22, 5640 (1994)].
  • the gene expressed in each cell line is analyzed using the DNA chip method [protein nuclease,, 1841 (2000); Japanese clinical practice, 465 (1999)], and expressed in other cell lines. By comparing with the expressed gene, the gene specifically expressed in each cell line can be identified.
  • a cell line other than the cell line for example, a cell line derived from the same tissue (hypothalamus or islet of Langerhans) and showing a different morphology, or derived from another tissue Subtraction is performed using the mRNA obtained from the cell or cell line.
  • the base sequence of the inserted cDNA in the differential cDNA library is randomly determined from the 5 'side.
  • the expression level of the gene having the sequence in the two types of cells used for differentiation can be determined. Thereby, a gene that is specifically expressed in the cell line can be identified.
  • the peptide encoded by the cDNA can be identified.
  • the cDNA in the differential library is a partial fragment
  • full-length cDNA can be obtained by hybridization using a probe specific to the sequence of the cDNA.
  • the peptide encoded by the cDNA can be identified.
  • the function of the peptide can be estimated.
  • the peptide functions as a receptor, a ligand, a transcription factor, a transporter, an enzyme, or the like.
  • the peptide has a secretory signal sequence or a transmembrane region, it is possible to determine whether the peptide is a secretory protein or a membrane protein.
  • the peptide By expressing DNA encoding the peptide in a suitable cell, the peptide can be produced, and the activity of the peptide can be experimentally examined.
  • a ligand ⁇ receptor specifically expressed in any cell line of the present invention can be efficiently obtained.
  • a vector capable of subtraction By preparing a library for signal sequence trapping using a vector capable of subtraction, subtraction and signal sequence trapping can be performed efficiently.
  • the expression levels of neuropeptides, hormones, and their receptors vary with various stimuli. Therefore, for any of the cell lines of the present invention that have undergone various stimuli, the genes whose expression changes with and without the various stimuli are compared to determine the genes encoding the ligand ⁇ receptors. It can be obtained efficiently.
  • the subtraction method, the representational difference analysis method, or the refill method described in the above (b) can be used.
  • the culture method and the stimulation method the methods described in the above [I] 1. (1) and [I] 1. (4) can be used.
  • the ligand ⁇ receptor whose expression fluctuates when stimulating any cell line of the present invention can be efficiently used. Can be obtained.
  • the subtraction and signal sequence strapping can be performed efficiently.
  • peptides present in a culture solution or a cell extract are analyzed. The same analysis was performed for peptides present in cultures or extracts of other cell lines, and by comparing the results of the two, peptides that were specifically expressed in a particular cell line were identified. can do.
  • Secreted peptides specifically expressed in hypothalamus-derived cell lines are expected to act as neuropeptide II hormones. Therefore, it is considered possible to obtain a peptide hormone by identifying a peptide that is specifically present in a culture of a hypothalamus-derived cell line.
  • neuropeptide II hormone fluctuate with various stimuli. Therefore, by culturing any hypothalamic cell line under different conditions and identifying secretory peptides whose expression fluctuates depending on the culture conditions, it is considered possible to obtain neuropeptides and hormones efficiently.
  • the partial amino acid sequence of the peptide obtained above can be determined using a known method.
  • a gene corresponding to the amino acid sequence can be obtained using a known method.
  • [I] 4. or [III] A gene encoding a peptide obtained by the method described in 2. or a human or other mammal, such as a mouse, obtained by utilizing homology with the gene. By expressing the corresponding gene in an appropriate host cell, a peptide encoded by the gene can be produced. As a method, a method described in Molecular 'Cloning Third Edition, Current' Protocols' in 'Molecular' Bioguchi, etc. can be used.
  • a gene encoding a peptide expressed by the cell line of the present invention should be appropriately expressed.
  • a recombinant vector expressing the peptide is obtained by constructing a recombinant vector inserted downstream of the promoter of the vector and introducing the vector into a host cell.
  • the peptide can be produced by culturing the body.
  • any prokaryotic cell yeast, animal cell, insect cell, plant cell, or the like can be used as long as it can express the gene of interest.
  • animal and plant individuals can be used.
  • the expression vector contains a promoter at a position suitable for transcription of the gene to be expressed (tentatively called A gene), which is capable of autonomous replication in the above host cells or integration into a chromosome. Can be used.
  • the A gene expression vector is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, an A gene, and a transcription termination sequence, while being capable of autonomous replication in the prokaryote. Is preferred.
  • a gene that controls the promoter may be included.
  • expression vectors examples include pLEX (manufactured by Invitrogen), pRSET (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30 (manufactured by Chiazin), pKYPIO (manufactured by Japanese Patent Application Laid-Open No. 110600), pKYP200 CAgric. Biol. Chem 48, 669 (1984)) pLSAl CAgric. Biol. Chem 53, 277 (1989)) pGELl (Proc. Natl. Acad.
  • any promoter can be used as long as it can initiate transcription in a host cell such as E. coli.
  • trp promoter lac promoter Isseki one (Plac) P L promoter, such as Pa promoter, promoter derived from E. coli, phage and the like, SP01 promoter, SP02 promoter Isseki one, Oh the penP Promo Isseki first class I can do it.
  • a promoter (Ptr X 2) in which two Pke's are connected in series, a ⁇ promoter, a lacT7 promoter, a promoter artificially designed and modified such as let I promoter, or the like can be used.
  • the ribosome binding sequence it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not always necessary for the expression of the A gene, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Examples of the host cell include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Previbacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Escherichia coli XL1-Blue Escherichiacoli XL2-Blue, Escherichia coli Dish, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109 S Escherichia col i HB101, Escherichia col i No.49, Escherichia col i W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL21 (DE3) coli DE3) pLysS, Escherichia col i HMS174 (DE3), Escherichia col i H S174 (DE3) pLysS, Serratia ficaria s
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cells.
  • Examples of the method include an elect-portion method (Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)), calcium Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (JP-A-63-248394), Gene, 17, 107 (1982), and Mol. Gen. Genet. , 168, HI (1979).
  • examples of expression vectors include YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCG37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • Any promoter can be used as long as it can initiate transcription in a yeast strain.
  • yeast strains belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluybium mycetes, Trichosporon, Zinomyces and the like yeast strains belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluybium mycetes, Trichosporon, Zinomyces and the like. Specifically, Saccharomyces cerevisiaes Schizosaccharomyces pombe ⁇ Kluyveromyces lactis ⁇ Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • electroporation Methods.Enzymol., 194, 182 (1990)
  • spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8, 1929 (1978)
  • lithium acetate method J. Bacteriol., 153, 163 (1983)
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 ( 1978) Transformants using animal cells as host cells can be obtained by the method described in [I] 3.
  • Host cells include mouse myeloma cells, rat myeloma cells, mouse hybridoma cells, Chinese hamster cells CH0 cells, BHK cells, African green monkey kidney cells, and human Namalwa cells. Cells, Namalwa KJM-1 cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (JP-A-63-299) s human colon cancer cell line, and the like.
  • Mouse / myeloma cells such as SP2 / 0 and NS0, rat's myeloma cells such as YB2 / 0, human fetal kidney cells such as HEK293 and 293, and human leukemia cells
  • BALL-1 African green monkey kidney cells include COS-1, COS-7, and human colorectal cancer cell lines include HCT-15.
  • the immortalized cell line of the present invention can also be used.
  • insect cells for example, Baculovinis Expression Vectors: A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), Molecular Biology Third Edition, Current Protocols, Molecular Peptides can be expressed by the methods described in biology and the like.
  • T JP03 / 04840 That is, the recombinant gene transfer vector and baculovirus were co-transfected into insect cells to obtain recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus was transmitted to insect cells.
  • the peptide can be expressed.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include PVL1392 (Pharmingen), PVL1393 (Pharmingin), pBlueBac4.5 (Invitrogen) and the like.
  • baculovirus for example, autographa californica nuclear poly edrosis virus, which is a virus that infects Noctuids insects, can be used.
  • ovary cells of Spodoptera frugiperda As the insect cells, ovary cells of Spodoptera frugiperda, ovary cells of Trichoplusia, cultured cells derived from silkworm ovary, and the like can be used.
  • Spodoptera frugiperda ovarian cells include Sf9, Sf21 CBaculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], and Trichoplusia ni ovarian cells such as High Five (manufactured by Invitrogen).
  • Cultured cells of origin include ⁇ ! ⁇ Ffiori N4 and the like.
  • Methods for co-transferring the above-described recombinant gene transfer vector into insect cells and the above baculovirus to prepare a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)).
  • DNA can be introduced into insect cells using the same method as that for introducing DM into animal cells.
  • electroporation (Cytotechnology, 3, 133 (1990)
  • calcium phosphate JP-A-2-227075
  • the Lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like.
  • the method of the present invention can be performed according to a known method [tissue culture, 20 (1994); tissue culture, 1 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)].
  • the cell line can produce the expressed peptide.
  • any promoter can be used as long as it can initiate transcription in plant cells, and examples thereof include the cauliflower mosaic virus 35S promoter and the geneactin 1 promoter.
  • JP03 / 04840 Gene expression efficiency can also be increased by inserting the maize alcohol dehydrogenase gene intron 1 between the promoter and the gene to be expressed.
  • host cells include plant cells such as potato, tobacco, corn, rice, rape, soybean, tomato, wheat, barley, rye, Alfalpha, flax and the like.
  • Agrobacterium Agrobacterium
  • Japanese Patent Application Laid-open No. 70080, W094 / 00977 Japanese Patent Application Laid-open No. 70080, W094 / 00977
  • Electro-Robolysis method Cytotechnology 3, 133 (1990)
  • a method using a particle gun (gene gun) Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • I can give it.
  • the cells and organs of the plant into which the gene has been introduced can be cultured in large quantities using a jar fermenter. By redifferentiating the transfected plant cells, it is also possible to create transgenic plants into which the gene has been introduced.
  • a peptide expressed by the cell line of the present invention can also be produced using an animal individual.For example, a known method [Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996); Am. J. Clin. Nutr. , 63, 627S (1996); Bio / Technology, 9, 830 (1991)], and the peptide can be produced in an animal into which a gene encoding the peptide has been introduced.
  • Any promoter can be used as long as it can initiate transcription in animals. Examples of such promoters include the mammary gland cell-specific promoter, the casein promoter, the 5-casein promoter, the lactoglobulin promoter, and whey. Acidic protein promoter, etc. is preferably used.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector incorporating a gene encoding a peptide expressed by the cell line of the present invention is cultured according to a conventional culture method to produce the peptide. By accumulating and collecting the peptide from the culture, the peptide can be produced.
  • the animal When the transformant is an animal or plant individual, the animal is bred or cultivated according to a conventional method to produce and accumulate the peptide, and the peptide is collected from the animal or plant individual.
  • Peptides can be produced. That is, in the case of an animal individual, for example, a non-human transgenic animal having a gene encoding the peptide is bred, the peptide is produced and accumulated in the animal, and the peptide is collected from the animal. By doing so, the peptide can be produced. Examples of the production / accumulation site in the animal include milk, eggs, and the like of the animal.
  • a transgenic plant having a gene encoding the peptide is cultivated, the peptide is produced and accumulated in the plant, and the peptide is collected from the plant to obtain the peptide. Can be manufactured.
  • the medium for culturing these organisms may be a carbon source, a nitrogen source, an inorganic Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium contains salts and the like and can efficiently culture the transformant.
  • Any carbon source may be used as long as the transformant can assimilate, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. Alcohols such as acids, ethanol, and propanol are used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic acids, ammonium salts of organic acids, and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn Chip liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and their digests can be used.
  • potassium (I) phosphate potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like can be used.
  • Culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 to 96 hours.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted by using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, carbonic acid, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin / tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • I promoter isopropyl-/?-D-thiogalactoside, etc.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • the medium for culturing the cell may be a commonly used RPMI1640 medium [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]. , Eagle's MEM medium [Science, 12, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] Alternatively, a medium or the like obtained by adding FCS or the like to these mediums can be used.
  • Culture is carried out usually pH6 ⁇ 8, 30 ⁇ 40 ° C, 5% C0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower. If necessary, an antibiotic such as kanamycin or penicillin may be added to the medium during the culture.
  • TNM-FH medium Pulsen
  • Sf-900II SFM medium Gibco
  • ExCell400 ExCell405
  • Grace insect medium a medium for culturing a transformant obtained by using an insect cell as a host cell.
  • the pH is 6-7
  • the culture temperature is 25-30 ° C
  • the culture time is usually 1-5 days.
  • an antibiotic such as genyumycin may be added to the medium during the culturing.
  • a partial peptide in addition to expressing the full length peptide, a partial peptide can also be expressed.
  • the full-length or partial peptides described above can be expressed as secreted proteins or fusion proteins in accordance with the method described in Molecular 'Cloning, 3rd edition, in addition to expressing them alone in cells. it can.
  • the proteins to be fused are -galactosidase, protein A, IgG-binding region of protein A, chloramphenicil 'acetyltransferase, polyarginine, polyglutamic acid, protein / maltose binding protein, and glucan.
  • Zion S-Trang Spherellases polyhistidine chains (His-tag), S-peptide, DNA-binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green fluorescein protein, FLAG peptide, and any antibody epitope [Experimental Medicine,, 469 ( 1995)).
  • a method for producing a peptide (including a partial peptide) expressed by the cell line of the present invention there are a method of producing the peptide in a host cell, a method of secreting it out of the host cell, and a method of producing it on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the host cell to be used or the structure of the peptide to be produced.
  • the peptide (including a partial peptide) is produced in the host cell or on the host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Lowe et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989); Genes Develop., 4, 1288 (1990)], or the methods described in JP-A-05-336963, W094 / 23021, etc. Thereby, the peptide can be actively secreted out of the host cell.
  • the target peptide is expressed in a form in which a signal peptide is added in front of the peptide (including the partial peptide), whereby the target peptide is actively secreted out of the host cell.
  • a tag for purification / detection can be added between the signal peptide and the peptide or at the C-terminus of the peptide.
  • Tags for purification and detection include galactosidase, protein A, the IGG binding region of protein A, chloramphenicil 'acetyltransferase, polyarginine, polyglutamic acid, protein G, maltose binding protein, Glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green fluorescein 'protein, FLAG peptide, and any antibody epitope [Experimental Medicine, 13, 469 (1995)].
  • the production amount can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • a general enzyme isolation / purification method can be used. Wear. For example, when the peptide accumulates in a dissolved state in the cells of the transformant, the cells in the culture are collected by centrifuging the culture, and the cells are washed. The cells are disrupted using a French press, a Mentongaulin homogenizer, a Dynomill, etc., to obtain a cell-free extract.
  • the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain a precipitate fraction.
  • the insoluble form of the peptide is solubilized with a peptide denaturant.
  • the solubilized solution is diluted or diluted with a solution containing no peptide denaturing agent or diluted so that the peptide denaturing agent does not denature the peptide, or the peptide is reconstituted into a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the culture is treated by a method such as centrifugation to obtain a soluble fraction.
  • a purified preparation of the peptide can be obtained in the same manner as in the isolation and purification method from the cell-free extract supernatant.
  • the peptide (including a partial peptide) can be produced as a fusion protein with another protein, and purified by affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein.
  • the peptide can be produced as a fusion protein with protein A and purified by affinity chromatography using imnoglobulin G.
  • the peptide is produced as a fusion protein with the FLAG peptide, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989); Genes Develop., 4, 1288 (1990)) which can be purified by affinity chromatography using the FLAG antibody.
  • the peptide can be purified by affinity chromatography using an antibody against the peptide itself.
  • the peptide can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), the tBoc method (T-butyloxycarbonyl method), and the like. Chemical synthesis can also be performed using a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Applied Biosystems, Amersham Biosciences, Shimadzu Corporation.
  • Structural analysis of the purified peptide can be performed by a method commonly used in protein chemistry, for example, the method described in "Protein Structural Analysis for Gene Cloning” (Hisashi Hirano, Tokyo Chemical Dojin, 1993). .
  • an antibody that recognizes a peptide expressed in hypothalamic cells or islets of Langerhans can be obtained. Synthesized peptides can also be used as antigens. Further, by using the cell line of the present invention or a cell membrane fraction prepared from the cell line as an antigen, an antibody that specifically recognizes a surface antigen of the cell line can be obtained.
  • a purified full-length or partial fragment of the peptide obtained by the above method 3 or a peptide (partial peptide) having a partial amino acid sequence of the peptide as an antigen is administered to an animal.
  • a peptide (partial peptide) having a partial amino acid sequence of the peptide as an antigen is administered to an animal.
  • the cell line of the present invention or a cell membrane fraction prepared from the cell line can be used as an antigen.
  • Animals to be administered include egrets, goats, 3-20 week old rats, mice, and hams.
  • the dose of the antigen is preferably from 50 to 100 g per animal.
  • the antigen should be a covalent bond of the partial peptide to a carrier protein such as keyhole limpet haemocyanin or bovine tilogin purine. desirable.
  • a partial peptide used as an antigen can be synthesized by a peptide synthesizer.
  • the cell line of the present invention is used as an antigen, 3 to 5 ⁇ 10 5 cells are administered per animal.
  • a cell membrane fraction prepared from the cell line is used as an antigen, 1 to 10 mg is administered per animal.
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • Blood is collected from the fundus venous plexus on days 3 to 7 after each administration, and the serum reacts with the antigen used for immunization by solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [Enzyme-linked immunosorbent assay: published by Medical Shoin 1976 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Methods for separation and purification include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, and prillic acid precipitation Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) or DEAE-Sepharose column, An example is a method of treating a chromatographic column using an ion exchange column, a protein A or G-column, a gel filtration column, or the like, alone or in combination.
  • a mouse or rat whose serum shows a sufficient antibody titer against a peptide expressed by the cell line of the present invention used for immunization in (i) or a partial fragment or partial peptide of the peptide is used to produce an antibody. Serve as a source of cells.
  • the spleen is removed 3 to 7 days after the final administration of the antigenic substance to the mouse or rat showing the antibody titer.
  • the spleen is shredded in a MEM medium (manufactured by Nissui Jie), tipped with tweezers, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded. Splenocytes of the resulting sediment fraction The cells are treated with Tris-ammonium chloride buffer (PH7.65) for 1 to 2 minutes to remove red blood cells, washed three times with MEM medium, and the obtained spleen cells are used as antibody-producing cells.
  • MEM medium manufactured by Nissui Jie
  • myeloma cells cell lines obtained from mice or rats are used.
  • 8-azaguanine-resistant mouse derived from BALB / c
  • P3-X63-Ag8653 J. Immunol., 123, 1548 (1979)]
  • P3-X63-Ag8 [: Nature, 256, 495 (1975)]
  • the antibody-producing cells obtained in (a) and the myeloma cells obtained in (b) were combined with MEM medium or PBS (1.83 g of disodium phosphate, 0.21 g of monolithium phosphate, 7.65 g of sodium chloride, 1 liter of distilled water, PH7 Mix well so that the number of cells becomes 5-10: 1 (antibody-producing cells: myeloma cells), centrifuge at 200 rpm for 5 minutes, and discard the supernatant.
  • MEM medium or PBS 1.83 g of disodium phosphate, 0.21 g of monolithium phosphate, 7.65 g of sodium chloride, 1 liter of distilled water, PH7 Mix well so that the number of cells becomes 5-10: 1 (antibody-producing cells: myeloma cells), centrifuge at 200 rpm for 5 minutes, and discard the supernatant.
  • HAT medium HAT medium
  • thymidine 15 mol / L
  • amino acid in a normal medium.
  • pterin 0.4 mol / L
  • a hybridoma that specifically reacts with a peptide expressed by the cell line of the present invention is selected by ELISA described in A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988) and the like.
  • ELISA ELISA-Linked Immunosorbent Assays, a peptide expressed by the cell line of the present invention used as an antigen, a partial fragment or partial peptide of the peptide is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or (d) described below is obtained.
  • the purified antibody is reacted as the first antibody, and the second antibody is reacted with an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with an enzyme such as peroxidase, followed by a color reaction corresponding to the labeled enzyme.
  • a peptide that specifically reacts with a peptide, a partial fragment of the peptide, or a partial peptide of the peptide is used as a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the peptide expressed by the cell line of the present invention. select.
  • Cloning was repeated twice by the limiting dilution method using the hybridoma (the first time using an HT medium (a medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium), and the second time using a normal medium).
  • the antibody with a strong antibody titer is selected as a hybridoma strain producing an antibody that specifically recognizes a peptide expressed by the cell line of the present invention.
  • pristane 0.5 mL of 2,6,10,14-tetramethylpentene decane (Pristane) was intraperitoneally administered and bred for 2 weeks
  • 5-20 ⁇ 10 s cells / animal producing monoclonal antibody-producing hybridoma cells specifically recognizing the peptide expressed by the cell line of the present invention obtained in the above step 2 are intraperitoneally injected.
  • the hybridoma becomes ascites cancer.
  • Ascites is collected from the mouse with ascites tumor and centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to remove solids. From the obtained supernatant, a monoclonal antibody can be purified and obtained by a method similar to that used for polyclonal.
  • the subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the protein content is calculated by the Lowry method or from the absorbance in 280 dishes.
  • cells expressing the peptide expressed in hypothalamic cells or islet cells of Langerhans can be identified.
  • the cells expressing the peptide expressed in the hypothalamus cells or the islet cells of Langerhans can be isolated using FACS.
  • the distribution of specific hypothalamic cells or specific Langerhans islet cells, or specific hypothalamic cells or specific Langerhans islet cells Cells can be isolated. Further, after culturing neural stem cells, somatic stem cells, or ES cells under various culture conditions, it is possible to detect and isolate cells differentiated into specific hypothalamic cells or specific Langerhans islet cells using the antibody. it can.
  • Methods for immunologically detecting and quantifying antigens using antibodies include immunofluorescence, enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), radioimmunoassay (RIA), immunohistochemical staining, and immunocytochemical staining.
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • Method Western plotting method, dot blotting method, immunoprecipitation method, sandwich ELISA [Monoclonal antibody experiment manual (Kodansha Scientific) (1987); (Tokyo Kagaku Doujin) (1986)].
  • the fluorescent antibody method is a method in which an antibody that specifically recognizes the peptide is reacted with a microorganism, animal cell, or insect cell or tissue that expresses the peptide expressed by the cell line of the present invention inside or outside the cell.
  • An antibody that reacts with the antibody labeled with a fluorescent substance such as fluorescein or isothiosyanate (FITC) (for example, when the antibody that specifically recognizes the peptide or peptide is a mouse IgG class, an anti-mouse IgG antibody
  • FITC fluorescein or isothiosyanate
  • EIA refers to an antibody that specifically reacts with a peptide containing a peptide expressed by the cell line of the present invention, and reacts with an antibody that is labeled with an enzyme such as peroxidase.
  • an enzyme such as peroxidase.
  • the peptide or the antibody that specifically recognizes the peptide is of the mouse IgG class
  • the antibody is reacted with an anti-mouse IgG antibody), followed by a color reaction using an enzyme, and measuring the amount of color development with a spectrophotometer. is there.
  • RIA refers to a measurement sample containing a peptide expressed by the cell line of the present invention, An antibody that specifically recognizes is reacted, and an antibody that reacts with the antibody labeled with a radioisotope (for example, when the antibody that specifically recognizes the peptide is a mouse IgG class, an anti-mouse IgG antibody) is reacted. After that, the radioactivity is measured with a scintillation counter or the like.
  • Immunohistochemical staining or immunocytochemical staining refers to a method in which a peptide expressed by a cell line of the present invention is specific to a microorganism, animal cell, insect cell, or tissue that expresses the peptide inside or outside the cell.
  • the stamp-rotating method is an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of an extract of a microorganism, animal cell or insect cell or tissue in which a peptide expressed by the cell line of the present invention is expressed intracellularly or extracellularly.
  • the gel was blotted on polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane or nitrocellulose membrane, and the peptide was specifically bound to the membrane.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • Antibodies that react with the antibody labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin for example, an antibody that specifically recognizes the peptide is a mouse IgG
  • a fluorescent substance such as FITC
  • an enzyme such as peroxidase
  • biotin for example, an antibody that specifically recognizes the peptide is a mouse IgG
  • this is a method in which a reaction according to the labeling substance is performed after reacting an anti-mouse IgG antibody) or a fragment thereof.
  • the dot blotting method is a method in which an extract of a microorganism, animal cell, insect cell or tissue expressing a peptide expressed by the cell line of the present invention inside or outside a cell is plotted on a nitrocellulose membrane.
  • An antibody that specifically recognizes the peptide is allowed to react with the membrane, and an antibody that reacts with the antibody labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, biotin, etc. If the antibody to be recognized is of the mouse IgG class, an anti-mouse IgG antibody) or a reactive fragment is reacted, and then the reaction is performed according to the labeling substance.
  • the immunoprecipitation method refers to an antibody that specifically recognizes an extract of a microorganism, animal cell, or insect cell or tissue in which a peptide expressed by the cell line of the present invention is expressed intracellularly or extracellularly, or the cell. After reaction with protein G-Sepharose etc. This is a method in which a carrier having a specific binding ability to glopurine is added to precipitate an antigen-antibody complex.
  • Sandwich EUSA refers to a microorganism, animal cell, insect cell, or the like which expresses the peptide intracellularly or extracellularly on a plate on which an antibody specifically recognizing the peptide expressed by the cell line of the present invention is adsorbed. After reacting the tissue extract, an antibody specifically recognizing the peptide labeled with an enzyme such as peroxidase (having a different antigen recognition site from the above antibody) is reacted, and the reaction according to the labeling substance is performed. How to do it
  • FIG. 1 shows immunostaining of immortalized cells derived from the hypothalamus with SV40 large T antigen.
  • (A) shows the results of immunostaining of SV40 large T antigen
  • (b) shows the results of nuclear staining, for a mixture of immortalized hypothalamus cells derived from fetal transgenic rats cultured at 33 ° C.
  • FIG. 2 shows the results of immunostaining of a mixture of immortalized hypothalamus cells derived from fetal transgenic rats and SV40 radioactive T antigen.
  • A shows the case of culturing at 33 ° C
  • (b) shows the case of culturing at 39 ° C.
  • Fig. 3 shows the cell morphology when the immortalized hypothalamic cell line AM2-100 was cultured in a medium containing 10% serum at different temperatures.
  • (A) shows the culture at 33 ° C
  • (b) shows the culture at 39 ° C.
  • Fig. 4 shows the morphology of cells when the immortalized hypothalamic cell line AMF2-20 was cultured at 33 ° C with the medium changed.
  • A was cultured in a medium containing 10% serum
  • (b) was cultured in DMEM / F-12 (N2) medium
  • (c) was cultured in DMEM / F-12 (-FCS) medium Indicates the case. .
  • Fig. 5 shows the cell morphology when the immortalized hypothalamus cell line AMF2-20 was cultured with the medium and temperature changed.
  • A after culturing at 33 ° C for 8 days using DMEM / F-12 (FCS) medium
  • FCS DMEM / F-12
  • FCS DMEM / F-12
  • FIG. 6 shows the results of immunostaining for lebutin receptors on a mixture of immortalized hypothalamic cells derived from adult transgenic rats.
  • Figure 7 shows the results of NPY immunostaining for the hypothalamic cell line AMN2-25. Show. (B) shows a negative control to which no anti-NPY antibody was added.
  • Fig. 8 shows the results of immunostaining of STAT3 for the immortalized hypothalamic cell line NC-12.
  • (A) shows the case without lebutin stimulation, and (b) shows the case with lebutin stimulation.
  • FIG. 9 shows the change in intracellular calcium concentration of an immortalized hypothalamus-derived cell line upon stimulation with sulfonylurea.
  • A shows a mixture of immortalized cells derived from the hypothalamus of an adult female transgenic rat, and
  • (b) shows the case using an immortalized hypothalamic cell line AMN2-25.
  • the horizontal axis represents time, and at the time indicated by the arrow, HBSS buffer or sulfonylurea was added to the cells, respectively.
  • the vertical axis represents the calcium concentration as the fluorescence intensity ratio at two excitation wavelengths.
  • Fig. 10 shows the results of immunostaining and nuclear staining of PC2 for the immortalized cell line F-8 derived from Langerhans islets.
  • (A) and (b) show PC2 immunostaining,
  • (c) and (d) show nuclear staining, (a) and (c) when cultured in RPMI1640 (05918) medium, (b) and (d) when cells cultured in RPMI1640 (05918) were cultured in DMEM. (D-5796) The case where the medium was replaced with the medium and cultured for 2 weeks is shown.
  • FIG. 11 shows the activity of Mycobacterium luciferase at the time of stimulating vasopressin in a stable transformant obtained by introducing pAGal9-V2 into host cell strain GBCR2. + Estrogen: 17; 5-Estradiol stimulation induced V2 gene expression; -Estrogen not stimulated with 17? -Estradiol; bar to the right of each stimulated vasopressin In each case, the bar on the left shows the activity without vasopressin stimulation.
  • the vertical axis represents the activity ratio when the activity without stimulation with vasopressin is defined as 1.
  • Stable transformant obtained by introducing a P AGal9- V2 in FIG. 12 host cell lines GBCRC6, 17 -? Umishii Yuke 'luciferase upon stimulation with V2 after gene expression induction, various concentrations Basopuretsushin by E Sutorajio Ichiru Show activity.
  • the horizontal axis represents the concentration of vasopressin [log (mol / L)], and the vertical axis represents the activity ratio when the activity without vasopressin stimulation is set to 1.
  • Fig. 13 Stability of a stable transformant obtained by introducing pAGal9-CRHRl into the host cell strain GBCRC6 and inducing CBJffil gene expression with 17-estradiol and then stimulating it with various concentrations of corticotropin-releasing hormone. Show activity.
  • the horizontal axis is The concentration of corticotropin-releasing hormone [log (mol / L)] is plotted, and the vertical axis represents the activity ratio when the activity without corticotropin-releasing hormone stimulation is set to 1.
  • Fig. 14 The stable transformant obtained by introducing ⁇ (3 ⁇ 419- ⁇ ) into the host cell strain GBCRC6, induced ATI gene expression by 173-estradiol, and stimulated with various concentrations of angiotensin II.
  • ⁇ Luciferase activity The horizontal axis represents the concentration of angiotensin II [log (mol / L)], and the vertical axis represents the activity ratio when the activity without angiotensin II stimulation is set to 1.
  • Fig. 15 The stable transformant in which pAGal9-B1 was introduced into the host cell strain GBCRC6, B1 gene expression was induced by 17 ⁇ -estradiol, and then stimulated with various concentrations of Des-Arg9-bradykinin.
  • ⁇ Shows luciferase activity.
  • the horizontal axis represents the concentration of Des-Arg9-bradykinin [ 10 g (mol / L)], and the vertical axis represents the activity ratio when the activity without stimulation with Des-Arg9-bradykinin is set to 1.
  • Fig. 16 Stability of a stable transformant obtained by introducing pAGal9-sst5 into host cell strain GBCRC6 and inducing sst5 gene expression with 17 / 5-estradiol and then stimulating it with various concentrations of somatosucine luciferase Is shown.
  • the abscissa represents the concentration of somatosustin (log (mol / L)), and the ordinate represents the activity ratio when the activity without somatosustin stimulation was set to 1.
  • Fig. 17 Insect transformant obtained by inducing pAGal9-MClR into host cell strain GBCR2 and inducing MC1R gene expression with 17-estradiol and then stimulating with various concentrations of PAP or PAMP-12. Shows enzyme activity.
  • the graph on the left shows the case stimulated with PAMP, and the graph on the right shows the case stimulated with PAMP-12.
  • the horizontal axis shows the PAMP concentration [log (mol / L)] on the left graph, the PAMP-12 concentration Gog (mol / L)] on the right graph, and the vertical axis shows the case without PAMP or PAMP-12 stimulation.
  • the activity ratio is expressed assuming that the activity of is 1.
  • hypothalamus-derived cells were performed as follows using an enzymatic method.
  • the excised hypothalamus was washed with Leibovitz's L-15 medium (manufactured by Gibco), cut into small pieces with scissors, and centrifuged at 800 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, and 50 l of 5 ml of a 0.25% trypsin solution (manufactured by Gibco) and 10 ⁇ g / ml of DNase I (manufactured by Boehringer Mannheim) were added. Enzyme treatment was performed for 10 minutes with shaking at 37 ° C. After confirming the progress of the enzyme treatment under an inverted microscope, 2 ml of fetal calf serum cooled to 4 ° C. was added and well suspended. The suspension was centrifuged at 800 rpm for 5 minutes to collect cells.
  • the cells were added to 10 ml of DMEM / F-12 (FCS) medium (containing DMEM medium and Ham's F-12 medium containing 10% fetal calf serum, 50 U / ml benicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin). In an equal ratio mixed medium (manufactured by Gibco)].
  • FCS DMEM / F-12
  • the cell suspension was spread on one piece of poly-lysine-coated 100 thigh dish (manufactured by Pecton Deitkinson), and cultured at 33 ° C; carbon dioxide concentration 5% and humidity 100%. Nourished. When the cells grew and became saturated, they were subcultured to 100 poly-lysine coated thigh dishes so that the cell density on the culture surface was about 70%. The culture was continued for about 3 months to obtain a mixture of immortalized cell lines derived from the hypothalamus. A mixture of immortalized cell lines obtained hypothalamus - derived, dispensed as divided approximately IX 10 6 cells the tube 21 present, and cryopreserved in a known manner.
  • Single cloning of cells was performed using colony formation. 100 or 500 cells were seeded on a 100-face dish coated with poly-lysine and cultured until colonies were formed. After culturing, each colony was peeled off at the tip of the chip while observing under a microscope, and at the same time, cells were collected by suction into the chip. The cells from each collected colony were spread on a 24-well plate coated with poly-lysine and cultured. When the cells grew and became saturated, they were sequentially scaled up to a 6-well plate and a 100-well dish (both coated with poly-lysine) and cultured. In this way, four single cloned cell lines were finally obtained.
  • EA-1 embryonic day 14
  • EA-2 and EA-4 are embryonic day 21
  • EA-8 is a cell line derived from embryonic day 17 fetus.
  • the obtained four cell lines were cryopreserved by known methods. The doubling time of the obtained cell line was 36-72 hours. In addition, no significant change in cell line proliferation was observed more than one year after the establishment.
  • the hypothalamus was excised from a neonatal transgenic rat (13 newborns at 0 days of age) into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 was introduced, and the obtained cells were excised for approximately 3 days. After culturing for months, a mixture of immortalized cell lines derived from the hypothalamus was obtained. The obtained mixture of the immortalized cell lines derived from the hypothalamus was dispensed into 20 tubes to obtain about 1 ⁇ 10 6 cells and cryopreserved by a known method.
  • Example 1 141 single-cloned cell lines were obtained from the cryopreserved strain according to the method described in Example 1.
  • the obtained 141 cell lines were also cryopreserved as described above.
  • the doubling time of the obtained cell line was 36-72 hours. No significant change in cell line proliferation was observed more than one year after the establishment.
  • the pituitary gland located in the center of the basilar base was identified with reference to the figure on page 52 of the dissected brain with the ventral side facing upwards, referring to the figure on page 52 of the “Color Atlas Rat Anatomy Guidebook” (Hirokawa Shoten). Using the pituitary gland as an index, the hypothalamus region was extracted with reference to the figure of The Rat Brain in Stereotaxic Coordinate, Second Edition, Academic Press (1986).
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the isolated male or female cells derived from the hypothalamus were separately separated into approximately 3 A mixture of cell lines derived from the hypothalamus that had been cultured for months and immortalized was obtained. The obtained mixture of immortalized cell lines derived from adult male or female hypothalamus was dispensed into each tube to give about 1 ⁇ 10 6 cells and cryopreserved by a known method.
  • 373 single-cloned cell lines were obtained according to the method described in Example 1. Each of the obtained 373 cell strains was cryopreserved by a known method. The doubling time of the obtained cell line was 36-72 hours. In addition, no significant change in cell line proliferation was observed more than one year after the establishment.
  • 280 single cloned cell lines were obtained from a mixture of immortalized cell lines derived from adult female hypothalamus.
  • the obtained 280 cell lines were cryopreserved by known methods.
  • the doubling time of the obtained cell line was 36-72 hours.
  • no significant change was observed in the proliferation of the cell line more than one year after the establishment.
  • Example 2 After culturing according to the method described in Example 1 using a mixture of the above immortalized cell lines, remove the medium, add a 4% paraformaldehyde solution, and react at 4 ° C for 10 minutes. Cells were fixed. After treating the immobilized cells with a 0.3% Triton X-100 solution, a 10-fold diluted antibody against SV40 large T antigen (manufactured by ONCOGENE) was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, the well was washed once with PBS, and a 40-fold diluted FITC-labeled anti-mouse IgG (manufactured by KPL) was added, followed by a reaction at room temperature for 60 minutes.
  • SV40 large T antigen manufactured by ONCOGENE
  • the nuclear stained cells are washed once with PBS, dried, and then washed with a solution containing an anti-fading agent [PBS containing 90% glycerol and 2.5% 1,4-diazabicyclo_ [2,2,2] -octane (DABC0)) S, hereinafter referred to as “anti-fading solution”), and observed under a fluorescence microscope. As shown in Fig. 1, most cells show positive expression of SV40 large T antigen. Sex staining was confirmed.
  • the fetal, neonatal, adult male, and adult female immortalized cell lines derived from the rat hypothalamus obtained in Examples 1 to 3 show that the SV40 large T antigen is expressed. It was considered immortal.
  • Each of the above immortalized cell lines (single clone and mixture) was cultured according to the method described in Example 1. After the culturing, about cells were spread on a 35-thigh dish coated with poly-lysine, cultured at 33 ° C., 37 ° C. or 39 ° C. for 5 days, and observed under a microscope.
  • FIG. 3 shows the results of an experiment performed using the immortalized cell line (AM 2-100) derived from the adult male hypothalamus obtained in Example 3.
  • DMEM / F-12 (FCS) medium DMEM / F-12 (N2) medium
  • FCS DMEM / F- 12
  • N-2 DMEM / F-12 (FCS) medium supplemented with 1% N-2 supplement (manufactured by GIPCO) in place of 10% fetal serum serum or DMEM / F-12 (FCS) medium without serum components (Hereinafter referred to as DMEM / F-12 (-FCS) medium) for 5 days, and observe the morphology under a microscope. I thought.
  • FIG. 4 shows the results of experiments performed using the immortalized cell line (AMF2-20) derived from the adult male hypothalamus obtained in Example 3.
  • Condition 1 is a condition in which the cells are cultured at 33 ° C for 8 days, and conditions 2 are cultured at 37 ° C for 5 days, and then replaced with DMEM / F-12 (-FCS) medium and cultured for another 3 days.
  • Example 1 Four rat embryo-derived cell lines obtained in Example 1, 57 rat neonatal cell lines obtained in Example 2, 49 rat adult male cell lines obtained in Example 3, and Example 3 The obtained 46 adult rat female-derived cell lines were cultured according to the method described in Example 1. After the culture, about 1 ⁇ 10 5 cells were spread on a 100 thigh dish coated with poly-lysine, and the culture temperature was shifted from 33 ° C. to 37 ° C. and cultured for 5 days.
  • RNA was obtained from each cell line using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Using 5 g of the total RNA, a single-stranded cDNA was synthesized by SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Gibco). The single-stranded cDNA It was diluted 50 times with water and used as a type II PCR.
  • the single-stranded cDNA (5 D, the gene-specific primers shown in Table 1 (20 pmol each) 2.5 mmol / L dNTP mixture was mixed with 1.6 ⁇ 1 S0 and 1 ⁇ 15 units // zl of Recombiiiant Ex Taq DNA Polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added in 0.1 ⁇ 1 10 x reaction buffer (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and 2 ⁇ 1 was added. The total volume was adjusted to 201 by adding sterilized water.
  • M4R melanocortin receptor
  • NPFF2 Type 2 neuropeptide FF receptor
  • Corticotropin-releasing hormone receptor type 2 (CRHR-2) 39, 40 60
  • Type 1 melanin-concentrating hormone receptor (MCHR1) 43, 44 65 After a part (8 ⁇ 1) of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, the gel was stained with SYBR Green I nucleic acid stain (Molecular Probes). The amount of the amplified DNA fragment was measured by analyzing the pattern of the amplified DNA fragment using a Fluor Imager SI (manufactured by Molecular Dynamics).
  • the transcript of each gene was quantified by a semi-quantitative PCR method according to a conventional method [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
  • G3PDH rat glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • differences in the amount of mMA between cells, and mRNA by reverse transcriptase between samples can be measured. It was confirmed that there was no significant difference in the conversion efficiency from to single-stranded cDNA.
  • the quantification of the G3PDH transcript is performed according to a conventional method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2725 (1990); J. Biol. Chem. 269, 14730 (1994); Japanese Patent Laid-Open No. 06-181759]. The PCR was performed.
  • Neonatal hypothalamus-derived cell line obtained in Example 2
  • Genes Corresponding to the genes listed in Table 1 Table 3-2 Gene expression in cell line derived from rat neonatal hypothalamus (2)
  • Cell line Cell line derived from adult male hypothalamus obtained in Example 3
  • Genes corresponding to the genes listed in Table 1.
  • Table 4-2 Gene expression in rat adult male hypothalamus-derived cell lines (2)
  • Ob-Rb levulin receptor
  • Many levulin receptor (Ob-Rb) genes are expressed in the arcuate nucleus of the hypothalamus, paraventricular nucleus, lateral area, ventromedial nucleus, and dorsolateral nucleus was expressed in the cell line.
  • Ob-Rb expressing cells present in the arcuate nucleus, paraventricular nucleus, lateral area, ventromedial nucleus, and dorsomedial nucleus are considered to have different functions. Since the expression of the gene of 22) differs depending on the cell line, a variety of different Ob-Rb gene expression cell lines could be obtained.
  • AMN2-25 is derived from the arcuate nucleus because it expresses the Ob-Rb gene, prebrony europeptide Y gene, prevbrulin gene, MC4R gene, NPY1R gene, NPY5II gene, ghrelin receptor gene, etc. NPY-producing cells.
  • NC-12 is presumed to be an arcuate-derived ⁇ -MSH-producing cell, since it expresses the Ob-Rb gene, Preb piyomelanocortin gene, CMT gene, MC4R gene, NPY1R gene, NPY5R gene, etc. Is done.
  • AFN2-4s AFF2-19 and AFF2-25 express a large amount of the preprocorticotropin-releasing hormone gene and the prebuilt oral thyrotropin-releasing hormone gene, and also express the MC4R gene, NPY1R gene, NPY5R gene, etc. It is presumed to be cells from the paraventricular nucleus. ⁇ 2-25 also expressed the Ob-Rb gene.
  • AFFl-21 ⁇ APF1-37, APFl-39, AFN1-411 S AMF-48, AMN2-72 and other cell lines expressing the preblolexin gene, cell lines expressing the melanin-concentrating hormone gene (AMF2- 14) Alternatively, cell lines expressing the NPFF2 gene (AIT1-19, AMF1-44) are presumed to be cells from the outer cortex.
  • Cell lines expressing the CRHR-1 or CRHR-2 gene are presumed to include cells from the ventromedial or dorsal nucleus.
  • the expression of the gene product was analyzed by the following immunostaining method.
  • hypothalamus-derived immortalized cell lines (mixture of single clones NC-6, NC-12 and AMN2-25) in which the Ob-Rb gene expression was confirmed in Example 6 were used in Example 1
  • the cells were cultured according to the method described. After culturing, spread about lx lO 3 cells into 8 chambers coated with CELL-TAK (Collaborative Biomedical Products), and raise the culture temperature from 33 ° C to 37 ° C. Shift to C and cultivate for 5 days Nourished.
  • the wells were washed once with PBS, lg / ml Hoechst 33342 solution (manufactured by Calbiochem) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 5 minutes to stain nuclei. After staining, the cells were washed once with PBS, dried, mounted with an anti-fading solution, and observed under a fluorescence microscope.
  • hypothalamic-derived immortalized cell line (mixture or single clone) in which the expression of preproniuropeptide Y (prebu NPY) gene was confirmed in Example 6 was replaced with an antibody against Ob-.
  • the analysis was performed using an antibody against NPY (Chemicon 'In Yuichi National (CHEMIC0N International)) diluted 200-fold and a cyanine 3-labeled anti-goat IgG (Jackson) diluted 200-fold.
  • NPY Non 'In Yuichi National
  • a cyanine 3-labeled anti-goat IgG Jackson
  • the transcription factor STAT3 is phosphorylated by It is a method that utilizes the transition from quality to the nucleus.
  • NC-6, NC-12 and AM2-25 expressing the lebutin receptor (Ob-Rb) protein were cultured according to the method described in Example 1. After the culturing, about 1 ⁇ 10 3 cells were spread in 8 chambers coated with CELL-TAK, and the culture temperature was shifted from 33 ° C. to 37 ° C. and cultured for 3 days. After the culture, the medium was removed, and the medium was replaced with a MEM / F-12 (-FCS) medium and cultured at 37 ° C for 17 hours. After the culture, the medium was replaced with a DMEM / F-12 (-FCS) medium. Two hours after medium exchange, the cells were stimulated with 100 nmol / L human lebutin (manufactured by R & D System) at 37 ° C for 15 minutes.
  • immunostaining was performed using an anti-STAT antibody (manufactured by NEB) and a 200-fold diluted cyanine 3-labeled anti-rabbit IgG (secondary antibody). Immunostaining was performed according to the manual of PhosphoPlus Stat3 (Tyr705) Antibody Kit (NEB). Further, nuclear staining was also performed by adding a 1 ⁇ g / ml solution of Hoechst 33342 (manufactured by Calbiochem) and reacting at room temperature for 5 minutes. After staining, the cells were dried, mounted with an anti-fading solution, and observed under a fluorescence microscope.
  • NC-6, NC-12 and AMN2-25 expressing the Ob-Rb protein stained cytoplasm in the absence of leptin stimulation, but stained in the nucleus by leptin stimulation. This result indicates that NC-6, NC-12 and AN2-25 express functional OB-Rb.
  • the results for cell line NC-12 are shown in FIG.
  • NC-6, NC-12 and AMN2-25 were cultured according to the method described in Example 1. After the culture, about 2 ⁇ 10 4 cells were spread on a 35-pan dish coated with poly-lysine, and the culture temperature was shifted from 33 ° C. to 37 ° C. and cultured for 5 days. After the culture, the medium was removed, the medium was replaced with a DMEM / F-12 (-FCS) medium not containing fetal bovine serum, and the cells were cultured at 37 ° C for 17 hours. After the culture, the medium was replaced with a DMEM / F-12 (-FCS) medium.
  • a DMEM / F-12 (-FCS) medium not containing fetal bovine serum
  • RNA was obtained using Kit (Qiagen).
  • Kit Qiagen
  • PCR was carried out using the cDNA as type III.
  • primer specific to the c-fos gene synthetic DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45 or 46 was used.
  • primer specific to the S0CS-3 gene synthetic MA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 47 or 48 was used. Using. The expression of G3PDH gene was also examined.
  • NC-6, NC-12 and AM 2-25 did not change the expression level of G3PDH gene, whereas c-fos gene and S0CS-3 gene were found to be up-regulated by lebutin stimulation Was. This result also indicates that NC-6, NC-12 and AMN2-25 express functional OB-Rb. In addition, this result was obtained by obtaining genes that respond to lebutin by searching for genes whose expression fluctuates by stimulating lebutin in cell lines that have been confirmed to express functional OB-Rb by the above method. It indicates that it is possible to do so.
  • Example 9 Construction of a peptide expression system using a hypothalamus-derived cell line as a host
  • Single-stranded cDNA prepared from human thymus-derived inRNA (1 ⁇ G; manufactured by Clontech) as type ⁇ has the sequence shown in SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50 as a preblovasopressin gene-specific primer
  • the preprovasopressin gene was obtained by PCR using two types of synthetic DNA. In the above primers, aindlll site and lsite are introduced respectively. After cutting the PCR amplified fragment with giidlll and l, an aifldl 11-I fragment was obtained.
  • Plasmid PCDM8 manufactured by Invitrogen
  • PCDM8-VP was constructed by binding the Sindiii-I fragment derived from the PCR amplified fragment and the lindin-1 fragment derived from PCDM8.
  • PcMAI / Amp-VP was constructed by incorporating the aifidin-I fragment between g ⁇ dlll-l of the expression plasmid pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen).
  • PCDNA3.1-VP was constructed by incorporating the Siadlll-MI fragment between lledlll-l of the expression plasmid pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).
  • a prebub corticotropin-releasing hormone gene was obtained by PCR using two types of synthetic DNAs having the sequences shown in SEQ ID NOS: 51 and 52. Each of the above primers has a Si dlll site and an Ml site.
  • PcDNAI / Amp-CRF was constructed by incorporating the lidin-Mi fragment between gldldl-MI of the expression plasmid pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen).
  • PCDNA3.1-CRF was constructed by incorporating the iindlll-l fragment between giadlII-Notl of the expression plasmid pcDNA3.1 (+) (manufactured by Invitrogen).
  • the immortalized cell line (single clone AFF2-34) derived from the adult rat male hypothalamus obtained in Example 3 was cultured according to the method described in Example 1. After the culture, about 1 ⁇ 10 4 cells were seeded in one well of a 96-well dish coated with poly-lysine, and cultured at 33 ° C. for 1 day.
  • lipofectamine 'plus manufactured by Gibco, consisting of lipofectamine reagent and plus reagent
  • PCDM8-VP preprovasopressin-expressing plasmid
  • pCDM8-CRF preprocorticotropin-releasing hormone expression plasmid
  • pCDM8-8 control plasmid
  • the transfected AIT2-34 strain was cultured in a DMEM / F-12 (FCS) medium 100/1 at 33 ° C for 1 day. After the culture, the medium was replaced with DMEM / F-12 (N2) medium 100/1, and the cells were further cultured at 33 ° C for 2 days.
  • FCS DMEM / F-12
  • vasopressin activity was measured using the Atsuse cells constructed in (1) of Example 21 below.
  • the corticotropin releasing hormone activity was measured using the Atsuse cells constructed in Example 21, (2).
  • Vasopressin activity is found in culture supernatants derived from cells into which preblovasopressin-expressing plasmid has been introduced, and corticotrobin-releasing hormone activity exists in culture supernatants derived from cells into which preprocorticotropin-releasing hormone-expressing plasmid has been introduced. was detected. No activity was detected in the culture supernatant derived from cells into which control plasmid had been introduced.
  • an active peptide can be produced by expressing an active peptide precursor gene using a hypothalamic-derived immortalized cell line (single clone AFF2-34) as a host.
  • Example 3 Using the immortalized cell line derived from the rat adult male hypothalamus obtained in Example 3 (single clone AFF2-404), an experiment similar to the above (3) was performed. However, gene transfer into AFF2-404 was performed using 0.2 ⁇ g of plasmid and 0.5 / 1 of Lipofectamine 2000 (manufactured by Gibco).
  • an active peptide could be produced by expressing a precursor gene of the active peptide.
  • the single clones AF2-E2 and AF2-G5 obtained in (5) above were cultured according to the method described in Example 1. After the culture, about 2 ⁇ 10 4 cells were seeded into each well of a 96-well dish coated with poly-lysine, and cultured at 33 ° C. for 1 day. After culturing, the following plasmids (i) to (iii) were transformed using Ribofectamine Plus (manufactured by Gibco). 4840 Each introduced. Gene transfer was performed using 0.2 ⁇ g of plasmid, 0.51 of ribofectamine reagent, and 1.1 of plus reagent according to the instructions attached to Ribofectamine +.
  • each cell was cultured in MEM / F-12 (FCS) medium 100 1 at 33 ° C for 1 day. After the culture, the medium was replaced with DMEM / F-12 (N2) medium 100/1, and the cells were further cultured at 33 ° C for 2 days. After overlaying the Atsuy cells constructed in Example 21 (1) on the cultured cells, 1 tmol / L of ATP was added.
  • coelenterazine h coelenterazine h: Molexura I.probes
  • a VIM camera MGUS-50 / 2D Luminome overnight / MP: Hamamatsu Photonics
  • the activity was detected even when the expression plasmid was diluted to 1/10 with a vector. Since the activity can be detected even when diluted to 1/10, by selecting and using an appropriate hypothalamic cell line as a host, at least 10 genes or libraries can be simultaneously introduced into the host cell, It became clear that the activity could be measured.
  • various types of peptides can be efficiently produced by expressing a gene encoding a random peptide using various cell lines suitable for the production of active peptides as hosts.
  • a gene that expresses a random peptide can be prepared by substituting the gene encoding the active peptide of any active peptide precursor gene with a gene encoding a random peptide.
  • Example 3 (1) Detection of sulfonylprea-responsive cell lines using immortalized cell lines (mixtures) derived from the hypothalamus
  • the immortalized cell line (mixture) derived from the rat adult female hypothalamus obtained in Example 3 was cultured according to the method described in Example 1. After culture, add 5 ⁇ mol / L Fura-2AM to the cells, 37. C. The cells were cultured for 1 hour. The obtained cells were washed twice with an HBSS buffer (manufactured by Gibco), and the cells were suspended.
  • the immortalized cell line contained a cell line responsive to sulfonylprea.
  • the results are shown in Fig. 8 (a).
  • an immortalized cell line (single clone) derived from the hypothalamus that reacts with sulfonylprea can be identified or selected.
  • the above results indicate that the immortalized cell line (mixture or single clone) derived from rat fetus, neonate, adult male, or adult female hypothalamus obtained in Examples 1 to 3 was converted to any substance (protein).
  • a peptide, a compound, a drug, a cell, a cell culture supernatant, or a cell extract, etc.) to determine whether there is a hypothalamus-derived cell line that reacts with the substance. It also shows that it is possible to search for substances that react with the derived cell line.
  • the precipitate was obtained by centrifuging the Teng tissue at 1200 rpm for 2 minutes using a centrifuge (himacSCT-5BA) manufactured by Hitachi, Ltd.
  • the precipitate was suspended by adding 40 ml of ice-cooled Hanks' solution, and then centrifuged at 1200 rpm for 2 minutes to obtain the precipitate. This operation was performed until the clarification after the eccentricity became clear.
  • the resulting precipitate was suspended by adding 40 ml of Hanks' solution, and the suspension was filtered through a metal tea strainer (Taiga Crown Co., Ltd.). After 20 ml of ice-cooled Hanks solution was added to the obtained filtrate, the precipitate was obtained by centrifugation at 1200 rpm for 2 minutes. This operation was repeated twice more.
  • the islets of Langerhans collected at the interface were collected using a pasteur pipet, 10 ml of a Hanks solution containing 0.5% BSA was added, and centrifuged at 1200 rpm for 2 minutes to obtain a precipitate. After adding 10 ml of Hanks solution containing 0.5% BSA to the precipitate, the precipitate (Langerhans Island) was obtained by centrifugation at 1200 rpm for 2 minutes. This operation was performed once more.
  • the obtained Langerhans islet was suspended in 10 ml of ice-cooled Hanks solution containing 0.5% BSA and centrifuged at 800 rpm for 30 seconds to obtain a precipitate.
  • the precipitate Ca of 10 ml 2+ ⁇ Mg 2+ free balanced salt solution [8g / l NaCl, 0.3g / l KC1 ⁇ 0.05g Na3 ⁇ 4P0 4 ⁇ H 2 0, 0.025g / l KH 2 P0 4, lg / 1 NaHCO 3, 2 g / l glucose: after suspended hereinafter abbreviated as CMF solution] were obtained precipitate was centrifuged for 1 min at 800 rev / min.
  • DMEM medium 10% fetal calf serum, 50 ⁇ / ⁇ 1 penicillin, and streptomicin
  • RPMI1640 medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Product No. 05918) [hereinafter referred to as RPMI1640 (05918) medium], and coated with poly-lysine;
  • the cells were cultured in Becton (Dickinson) under conditions of 33 ° C, carbon dioxide concentration of 5%, and humidity of 100%.
  • the cells When the cells grew and became saturated, the cells were subcultured into poly-lysine-coated 100-dish using each medium so that the cell density on the culture surface was about 70%. Culture was continued in each medium for about 3 months to obtain a mixture of immortalized cell lines derived from Langerhans islets.
  • the obtained mixture of the immortalized cell lines derived from Islets of Langerhans was dispensed into five tubes each having about 5 ⁇ 10 6 cells, and cryopreserved by a known method.
  • cryopreserved cells single cloning was performed by the following colony forming method. 100 or 500 cells were seeded on a poly-lysine-coated 100 thigh dish (manufactured by Becton's Dickinson) and cultured in each medium until colonies were formed. After the culture, each colony was peeled off at the tip of the chip while observing under a microscope, and at the same time, the cells were collected by suction into the chip. The cells from each collected colony were spread on a 24-well plate coated with poly-lysine, and cultured using each medium. When the cells grew and became saturated, they were sequentially scaled up to 6-well plates and 100 thigh dishes (both coated with poly-lysine).
  • 117 DMEM (D-5796) from RPMI1640 (05918) medium Using the medium, 144 single cloned cell lines were obtained.
  • the cell lines obtained using RPMI 1640 (05918) medium are R-1 ⁇ ! 1-45, ⁇ -1 to ⁇ -63, and F-1 to F-9, and cell lines obtained using MEM (D-5796) medium, D-1 to D-72 , And D2-1 to D2-72.
  • MEM D-5796
  • Example 12 Expression analysis of various genes in the cell line derived from Langerhans islets derived from Tengen Langerhans expression of the immortalized cell line (mixture or single clone) derived from Langerhans islets obtained in Example 11 The expression status of various genes shown in Table 6 was analyzed by the following method.
  • Example 11 The cell line obtained in Example 11 was cultured according to the method described in Example 11. After the cultivation, about lx10 5 cells were spread on a 100-L dish coated with poly-lysine, and cultured at a cultivation temperature of 33 ° C for 5 days.
  • RNA was obtained from each cell line using the RNeasy Mini Kit (Qiagen). Using 5 g of the total A, single-stranded cDNA was synthesized by Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Gibco). The single-stranded cDNA was diluted 50-fold with water and used as a type II PCR.
  • G3PDH rat glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • GLP-1 receptor GLP-1R
  • Betacellulin 85, 86 65 Of the analysis results, Table 7-1 to Table 7-6 show D-1! ) -72, D2-1 to D2-72, R- ;! ⁇ R-45 cell line, Prebu-mouth insulin (represented by Ins in the table), pre-blog glucagon (represented by Glu in the table), prebrosomatosin (represented by SM in the table) , Prev mouth knee polypeptides (represented by PP in the table), PC1, PC2, GLP-1 receptor (GLP-1R), and PDXK neuro D expression levels for +++, ++, + , +/-,-. It has been clarified that various cell lines having different expression patterns of the above-mentioned genes (1) to (17) have been obtained.
  • Cell line cell line derived from Langerhans islet obtained in Example 11 Genes: corresponding to the genes listed in Table 6 Table 7-2 Gene expression in rat Langerhans islet-derived cell line (2)
  • Cell line An islet-derived cell line obtained in Example 11 Genes: Corresponding to the genes listed in Table 6 Table 7-3 Gene expression of cell line derived from Rad Langerhans island (3)
  • Cell line cell line derived from Langerhans islet obtained in Example 11 Genes: corresponding to the genes listed in Table 6 Table 7-4 Gene expression of rat Langerhans islet-derived cell line (4)
  • Cell line cell line derived from Langerhans islet obtained in Example 11 Genes: corresponding to the genes listed in Table 6 Table 7-5 Gene expression in rat Langerhans islet-derived cell line (5)
  • Cell line islet-derived cell line obtained in Example 11 Genes: corresponding to the genes listed in Table 6 Table 7-6 Gene expression of rat Langerhans islet-derived cell line (6)
  • Cell line a cell line derived from La islet obtained in Example 11
  • Genes corresponding to the genes listed in Table 6
  • Example 13 Expression analysis of various gene products in a cell line derived from Tengen Langerhans Island
  • the plate was washed three times with PBS containing 1% fetal calf serum, and a 200-fold diluted Alexa488-labeled anti-goat IgG (manufactured by Molecular Inc.) was added, followed by a reaction at room temperature for 60 minutes. After the reaction, the wells were washed twice with PBS, added with l ⁇ g / ml Hoechst 33342 solution (manufactured by Calbiochem), and reacted at room temperature for 5 minutes to stain nuclei.
  • the cells were washed twice with PBS, dried, mounted with an anti-fading solution, and observed under a fluorescent microscope. As a result, it was determined that there were cells expressing insulin.
  • Example 11 For each single clone of the immortalized cell line described in Example 11 obtained using RPMI1640 (05918) medium, the presence of insulin-expressing cells was confirmed by the following method.
  • Each single clone (approximately 1 ⁇ 10 4 cells) described in Example 11 obtained using RPMI1640 (05918) medium was spread in one well of a 96-well plate, and was then incubated at 33 ° C using RPMI1640 (05918) medium. Cultured for 2 days. After the culture, immunostaining using anti-insulin antibody and nuclear staining using Hoechst 33342 were performed in the same manner as described above. As a result, single-clone M-8, -9 S and M-15 was found to be expressing Insurin.
  • Each single clone (approximately lx10 4 cells) of the immortalized cell line described in Example 11 obtained using the RPMI1640 (05918) medium was spread on one well of a 96-well plate, and the RPMI1640 (05918) medium was transferred to the well. And cultured at 33 ° C for 2 days.
  • Example 14 Identification of a Cell Line Derived from Langerhans Islets Responding to Sulfonylprea A Single Clone of the Immortalized Cell Line described in Example 11 Acquired Using RPMI1640 (05918) Medium (M-6, M- 9s M- 15, M-19, M - 20, M-33, M - 43, the F- 1, F-9) about 5 x l0 6 cells were plated in 60 thigh dish, using RPMI1640 (05918) medium And cultured at 33 ° C for 2 days.
  • Fura-2AM was added to these cells, and the cells were cultured at 37 ° C. for 1 hour. After culturing, the cells were washed twice with HBSS buffer (manufactured by Gibco) to suspend the cells. Sulfonylurea (manufactured by Tolbutamides Alexis) was added to about 1 ⁇ 10 6 cells at a final concentration of 0.5 ol / L, and the increase in intracellular Ca 2+ concentration was examined. The measurement of intracellular Ca 2+ concentration was performed using a CAF-110 instrument (manufactured by JASCO Corporation).
  • the immortalized cell line (mixture or single clone) derived from the rat islets of Langerhans obtained in Example 11 can be transformed into any substance (protein, peptide, compound, drug, cell, cell culture). , Or cell extract, etc.) to determine if there is a cell line derived from Langerhans islet that reacts with the substance, and to search for a substance that reacts with the cell line derived from Langerhans islet. It also shows what can be done.
  • Example 13 (1) Examination of medium Single clones (18 clones) confirmed to express PC2 in (3) of Example 13 were cultured at 33 ° C in RPMI1640 (05918) medium, and then cells in about lx garden were cultured for 96 hours. One well of a well plate was seeded, and cultured at 33 ° C. for 2 weeks using ⁇ 1640 (05918) medium or DMEM (D-5796) medium. After the culture, the expression levels of PC1 and PG2 were examined using the methods described in (13) and (2) of Example 13.
  • FIG. 9 shows the results obtained using the cell line F-8.
  • Example 16 An immortalized cell line (single clone F-4, F-5) derived from the islets of Langerhans obtained in Example 11 of an active peptide expression system using a cell line derived from Islets of Langerhans as a host , And F-88) were cultured in RPMI1640 (05918) medium at 33 ° C, and then 2 to 5 x 10 4 cells were seeded in one well of a 96-well plate and cultured at 33 ° C for 1 day. .
  • the ribofectamine plus (manufactured by Gibco) was used to prepare the preblovasopressin expression plasmid (pcDNA3.1-VP) prepared in (1) of Example 9 and prepared in (2) of Example 9
  • Prev mouth corticotropin releasing hormone expression plasmid ( pcDNA3.1-CRF) or a control plasmid [; pcMA3.1 (+)] was introduced into the cells. Transfection is performed according to the instructions attached to Ribofectamine Plus using 0.2 ⁇ g of plasmid, 0.5 ⁇ l of lipofectamine reagent, and 1.1 ⁇ l of brass reagent.
  • the transfected strain was cultured in RPMI1640 (05918) medium IOOI at 33 ° C. for 1 day. After the culture, the culture medium was replaced with a serum-free RPMI1640 (05918) medium 100/1, and the cells were further cultured at 33 ° C for 2 days. After the culture, a culture supernatant was obtained, and vasopressin activity and corticotropin releasing hormone activity in the culture supernatant were measured. Vasopressin activity was measured using the Atsuse cells constructed in (1) of Example 21 below. The corticotropin-releasing hormone activity was measured using the disease cells constructed in Example 21, (2).
  • Vasopressin activity was detected in the culture supernatant derived from cells transfected with the preblovasopressin expression plasmid, and corticotropin-releasing hormone activity was detected in the culture supernatant derived from cells transfected with preprocorticotropin-releasing hormone-expressing plasmid. . No activity was detected in the culture supernatant derived from cells into which the control plasmid had been introduced.
  • DMEM D-5796
  • RPMI1640 05918) medium.
  • Example 17 Construction of a cloning system for expression of active peptides using a cell line derived from islets of Langerhans in the knee as a host
  • a large number for example, 10 to 100 kinds of cDNAs
  • a large number for example, 10 to 100 kinds of cDNAs
  • the desired activity can be measured by using a culture supernatant of the cell, a cell extract of the cell, a membrane fraction of the cell, or the cell itself.
  • Example 23 (manufactured vivo Torojen Co.) appropriate expression base click evening one [pcDNA3.1 (+), P AGal9- nd ( Examples below 18) or P AGal9- d (hereinafter described Example 18)] was used to construct a cDNA library (E. coli).
  • the plasmid is recovered from each pool. Using a 96-well plate, the plasmid is introduced into an appropriate Langerhans islet-derived cell line and expressed.
  • an overlay cell that can be prepared according to the method described in Example 21 is overlaid, and after 6 hours, the repo overnight activity is measured.
  • 9600 clones can be screened on a single 96-well plate. By dividing the pool in which the activity is detected into smaller pools and performing the same operation, the desired active peptide precursor gene can be finally isolated.
  • pMCl [J. Mol. Biol., Cliff, 1 (1984)] is cut with MBI, treated with Klenow, and further cut with £ l to obtain a BI (blunt end) containing the 3 'end of the VP16 gene- ⁇ I fragment was obtained.
  • pAMo-nd was cut with l, it was treated with Klenow, and further cut with Hindi 11, to obtain a l (blunt end) -Sisdlll fragment containing the ampicillin resistance gene.
  • pAMo-Gal4VP16 was cut with Sindl 11 and 1 to obtain a Hindlll-Kpnl fragment containing the Gal4-VP16 chimeric gene.
  • pcMA3.1 + (Invitrogen) was cut with liadlll and l to obtain an Ekdin-l fragment containing the ampicillin resistance gene.
  • the Sindl II-Kpnl fragment derived from pAMo-Gal4VP16 and the giadl 11-Kml fragment derived from PcDM3.1 + were ligated to construct pcDNA3-Gal4VP16.
  • Various types of peptides can be efficiently produced by expressing a gene encoding a random peptide using various cell lines suitable for the production of active peptides as hosts.
  • a gene that expresses a random peptide can be prepared by substituting the gene portion encoding the active peptide of any active peptide precursor gene with a gene encoding a random peptide. .
  • pSV2bsr manufactured by Kaken Pharmaceutical was digested with MII and ⁇ RI, and treated with Klenow to obtain a 2.6 kb il (blunt end)-(blunt end) fragment.
  • ER min pM containing Gal4-ER chimeric gene [Cell, 54 3 199 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1657 (1993)] (distributed by Prof. Shigeaki Kato of the University of Tokyo) After cutting at ⁇ and ⁇ 1, By Klenow treatment, a ⁇ (blunt end) -1 (blunt end) fragment was obtained.
  • Plasmid pGERbsrR2 was constructed by combining the S (blunt end) -E ⁇ RI (blunt end) fragment from pSV2bsr and the il (blunt end)-1 (blunt end) fragment from ER AF2 in pM described above. did. pGERbsrR2 can express a chimeric protein (Gal4-ER) of the DNA binding domain of the transcription factor Gal4p derived from yeast (Saccharomyces cerevisiae) and the ligand binding domain of the estrogen receptor.
  • Gal4-ER chimeric protein
  • pcDNA3 (Invitrogen) was digested with Xhol and treated with Klenow to obtain a 1 (blunt-ended) fragment. Ligation of the fragment eliminated the Smi cleavage site
  • PCDNA3 was constructed.
  • the PCMA3 from which the 2 ⁇ 1 cleavage site had disappeared was cut with l, and treated with Klenow to obtain a 1 (smooth end) fragment.
  • PCDNA3 in which the and I cleavage sites had disappeared was constructed.
  • the plasmid was digested with ⁇ and treated with Klenow to obtain a ⁇ (blunt end) fragment.
  • pAMoERC3Sc Japanese Unexamined Patent Publication No. 05-336963
  • Plasmid PCDNA3-oriP was ligated by combining the DNA (blunt end) fragment derived from PCDNA3 and the ⁇ I (blunt end)-sil (blunt end) fragment derived from pAMoERC3Sc in which the above cleavage site and l cleavage site were eliminated. It was created.
  • pcDNA3-oriP was digested with 1 and Siadl 11 to obtain a 1-idi 11 fragment.
  • pSE01uc2 W098 / 14474 was cut with l and 1, it was treated with Klenow to obtain a ⁇ I (blunt-end) -1 ⁇ 1 (blunt-end) fragment containing the ambicillin resistance gene.
  • Klenow By ligating the fragments, a plasmid pASd nest1 was constructed.
  • PCDNA3-oriP-Sdl was digested with 1 and ⁇ E718 to obtain a ⁇ 1- ⁇ 718 fragment.
  • Four types of DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 87, 88, 89, and 90 were synthesized.
  • the synthetic DNA is mixed and annealed to form a double-stranded DNA having a poly-A addition signal.
  • the plasmid pcDNA3-oriP-Scp-pA was constructed by binding the double-stranded DNA to the I-5 £ 718 fragment derived from pcDNA3-oriP-Sdl.
  • pcDNA3-oriP-Sdl-pA was digested with ⁇ I and treated with Klenow to obtain a 1 (blunt end) fragment.
  • pFR-luc (manufactured by Stratagene) was digested with gifidlll and ⁇ HI and treated with Klenow to obtain a 0.14 kb Siidlll (blunt end) -I (blunt end) fragment.
  • the ⁇ I (blunt end) fragment derived from PCDNA3-oriP-Sdl-pA and the Bdlll-fragment derived from pFR-luc were ligated to prepare a plasmid pAGalSdl.
  • pAGalSdl contains a promoter with a sequence of 5 repeats of the Gal4p response sequence (UASG).
  • Plasmid pAGalSd luc was constructed by ligating the aindlll (blunt end)- ⁇ 1 (blunt end) fragment derived from pSE01uc2 and the ⁇ EJ (blunt end) fragment derived from pAGalSdl.
  • the expression plasmid pAGal9-luc having oriP of the Epstein-Barr virus was cleaved with aindlll and I to obtain a 6.9 kb Sindlll-l fragment containing oriP.
  • pAMo-d Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-211885 was cut with iHsdlll and I to obtain an Sdlll-I fragment containing a tetracycline resistance gene (Tc E ).
  • the plasmid in which the phorucyl luciferase gene portion in pAGal9-luc was replaced with the Stuffer sequence of pAMo_d pAGal9-d was constructed.
  • pAGal9-ic was digested with aindlll and l to obtain a 6.9kb Si ⁇ dlll- ⁇ 1 fragment.
  • ⁇ -nd was digested with g sdlll and I to obtain an Illidni-l fragment containing the tetracycline resistance gene.
  • the firefly luciferase gene portion in pAGal9-luc was ligated to the pAMo-nd Stuffer by binding the pAGal9-luc-derived pilus dill- ⁇ 1 fragment and the pAMo-nd-derived Hindlll-Sad fragment. Plasmid pAGal9-nd which replaced the sequence was constructed.
  • RPMI1640 'ITPSG medium RPMI1640 medium 8 ml (Nissui Pharmaceutical), 1/40 volume of 7.5% NaHC0 3, 3% 200mmol / LL - ( manufactured by Invitrogen) Group evening Min solution, 0.5% penicillin-streptomycin solution (Invitrogen,
  • blastcidin S blastcidin S
  • KK-400 manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
  • pGERbsrR2 was integrated into the chromosomal DNA
  • Induced expression of plasmid luciferase pAGalSdl-luc was added to each transformant.
  • the cells were introduced by the electoral poration method and cultured for 2 days. After the culture, 17-estradiol (E8875: manufactured by Sigma) (final concentration: lOnmol / L) was added, and after further culturing for 24 hours, the firefly luciferase activity was measured.
  • 17-estradiol E8875: manufactured by Sigma
  • the activity was measured using a Luminome overnight-LB953 (Berthold) and a cell lysis buffer (1% Triton X-100, 100 mmol / L KH2P04 (pH 7.8), 1 mmol / L dithiothreitol) the 100 ⁇ 1, after automatic injection into the culture solution, a substrate solution [25 mmol / L glycylglycine (pH7.8), 15 mmol / L MgS04 N 5 mmol / L ATP, 0.33 mmol / L luciferin] 300 ⁇ 1 was automatically injected, and the amount of luminescence for 10 seconds was measured to determine the luciferase activity. For comparison, the luciferase activity was also measured without adding 17? -Estradiol.
  • KJMGER8 / pAGal9-luc and KJMGER8Z pAGal9-nd were obtained.
  • the transformant cells were suspended in RPMI1640 'ITPSG medium 8 ml, in one Isseki base C0 2 incubator for 24 hours at 37 ° C. After the culture, plasticidin S (0.2 zg / ml) and dienetisin (Geneticin; manufactured by Gibco) (0.5 mg / ml) were added, and the cells were further cultured for 14 days to obtain a stable transformant.
  • the stable transformant was subcultured on RPMI1640'ITPSG medium containing plasticidin S (0.2 / g / ml) and dieneticin (manufactured by Gibco) (0.5 mg / ml).
  • pAGal9-luc As described above, in the system using pAGal9-luc as the inducible expression plasmid and KJMGER8 as the host, the luciferase activity during non-induction was very low and the luciferase activity during induction was very high.
  • the structure of pAGal9-luc is a structure in which a female resiferase gene is inserted as a repo overnight gene to be induced and expressed in pAGal9-nd or pAGal9-d.
  • a system using KJMGER8 as a host and pAGal9-nd or pAGAd as an inducible expression vector has a very low level of gene expression when not induced, and a very high induction expression system with high induction of gene expression. Turned out to be.
  • pACREpluc a repo overnight plasmid capable of expressing the firefly luciferase gene under the control of the cAMP response element (CRE), was constructed by the following method.
  • pACREpluc has the hygromycin resistance gene and oriP of Epstein-Barr virus.
  • pAMo CJ. Biol. Chem., 268, 22782 (1993), also known as pAMoPRC3Sc (Japanese Unexamined Patent Publication No. 05-336963)] was partially digested with ⁇ I to obtain a DNA fragment that had been cleaved at one site. The DNA fragment was partially digested with II to obtain a 9.5 kb fragment.
  • pAGE248 [J. Biol. Chem., ⁇ , 14730 (1994)] was cut with £ kl and MiI to obtain a 1.5 kb MiI fragment containing the hygromycin resistance gene.
  • the ⁇ I-ill fragment derived from pAMo and the ⁇ I-iiinl fragment derived from PAGE248 were ligated to construct a plasmid pAMoh.
  • I-Sindlll fragment containing the hygromycin resistance gene was obtained.
  • pAGal9-luc was digested with l and Sisdlll to obtain an I-Mfidni fragment containing oriP and Gal4UAS.
  • the plasmid pAGal9h was Was created.
  • a double-stranded DNA containing two CRE sequences was prepared by annealing synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 91 and 92.
  • the double-stranded DNA was ligated with the above-mentioned Il fragment derived from pBluescriptll KS + to construct a plasmid pBS-CREI containing two CRE sequences.
  • pBS-CREI is a plasmid in which the double-stranded DNA is integrated in a direction in which the l-cleavage site and the ⁇ I cleavage site are regenerated, and has one of the above-mentioned cleavage sites.
  • pBS-CREI was cut with Seal and Xhol to obtain a scal-Xhol fragment containing o of phage fl.
  • pBS-CREI was cut with ⁇ I and l to obtain a ⁇ I-I fragment containing ColEl ori.
  • the ⁇ I-I fragment and ⁇ fragment derived from pBS-CREI were ligated to construct pBS-CII containing four CUE sequences.
  • PBS-CREII was cut with Seal and Xhol to obtain a Seal-Xhol fragment containing the ori of phage ⁇ .
  • pBS-CREI I was cut with Seal and Sal I to obtain a ⁇ I-I fragment containing ColEl ori.
  • the l-kl fragment and the ⁇ I-l fragment derived from pBS-CREII were ligated to construct pBS-CREIV containing eight CRE sequences.
  • the pBS-CREIV was cut with Seal and Xhol to obtain a Scal-Xhol fragment containing ori of phage fl.
  • pBS-CREIV was cut with ⁇ I and l to obtain a ⁇ I-I fragment containing ColElori.
  • the Il fragment and the Il fragment derived from pBS-CREIV were ligated to construct pBS-CREVI 11 containing 16 CRE sequences.
  • pBS-CREVIII was digested with 1, digested with Klenow, and digested with Sindlll to obtain an lkdIII- ⁇ 2l (blunt-ended) fragment containing 16 CREs.
  • pAGalSdl was cut with Mil! and Sifidlll to obtain a 1.4kb ini-lindlll fragment.
  • pAGal9h was digested with 1, digested with Klenow, and digested with pylorus 1 to obtain a ⁇ I (blunt end) -kl fragment.
  • the gidlll-I (blunt end) fragment derived from pBS-CREVIII, the Mini-dlll fragment derived from pAGalSdl, and the I (blunt end) -1 fragment derived from pAGal9h were ligated to prepare a plasmid pACREh.
  • Cut pAGal9-luc with l and l MI fragment was obtained.
  • pACREh was cut with 1 and I to obtain a 2 ⁇ 1-l fragment containing the CRE sequence.
  • Plasmid pACREluc was prepared by ligating the I-Ml fragment derived from pAGal9-luc and the 21-1 fragment derived from pACREh.
  • pACREluc is digested with giiidin, treated with Klenow, and further digested with I. Sindlll (blunt end) -SIQI fragment containing CRE and ⁇ ⁇ (blunt end) -l fragment containing female luciferase gene was acquired respectively.
  • the plasmid pACRElucH in which the ndlll site upstream of the CRE sequence in pACREluc was deleted was prepared by ligating the two kinds of Siadin (blunt end) -Smi fragments derived from pACREluc.
  • the pGL3-Enhancer vector (Promega) was digested with Hindi II and Hpal to obtain a gidni-l fragment containing the luc + gene (a modified luciferase luciferase gene). After digesting pACRElucH with l, Klenow treatment and digestion with Sisdlll, a Sindlll-Notl (blunt end) fragment containing CRE was obtained. Plasmid pACREpluc was prepared by ligating an iisdlll-geil fragment derived from pGL3-Enhancer vector and a Hind111-NotI (blunt end) fragment derived from pACRElucH.
  • the transformed cells were suspended in 8 ml of E1640'ITPSG medium, and cultured in a (incubator) at 37 ° C. for 24 hours. After culturing, hygromycin B (300 g / ml) and further cultured for 14 days to obtain a stable transformant, which was subcultured in RPMI1640.ITPSG medium containing i.g., igromycin B (300 zg / ml).
  • the transformant was subjected to 5'-N-ethylcarboxamide adenosine (NECA: Sigma), an agonist of the type 2a adenosine receptor (A2a). ), Forskolin (manufactured by Sigma), which is an activator of adenylate cyclase, or A23187, which is a calcium ionophore (manufactured by Research Biochemicals International) And stimulated under the following conditions.
  • NECA 5'-N-ethylcarboxamide adenosine
  • A2a adenosine receptor
  • Forskolin manufactured by Sigma
  • A23187 which is an activator of adenylate cyclase
  • A23187 which is a calcium ionophore

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Description

明 細 書 内分泌系細胞株とその利用法 技術分野
本発明は、 受容体のァゴニスト、 アン夕ゴニストまたはインバースァゴニスト として作用するペプチドをコードする DNAの取得方法、 該ぺプチドの検出または取 得方法、 これらの方法に用いる内分泌細胞由来の細胞株、 該内分泌細胞由来の細 胞株を用いたぺプチドの製造方法、 上記の方法に用いる受容体を発現させる B細胞 株、 該 B細胞株を用いた被検物質に反応するぺプチドをコ一ドする DNAの取得方法、 該 B細胞株を用いたぺプチドをコ一ドする DNAの取得方法、 該取得方法により得ら れる構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 該 B細胞株を用いた G蛋白質共役型受容 体のァゴニスト、 アン夕ゴニスト、 インバースァゴニストの取得方法、 該 B細胞株 を用いたぺプチドの活性化剤または阻害剤の取得法。 該 B細胞株を宿主として用い る宿主 ·ベクター系に関する。 背景技術
一般に、 ペプチド性のホルモンや神経伝達物質は、 前駆体 （プレブ口体） とし て生産された後、 複数のプロセシング酵素や修飾酵素が作用することにより、 最 終的に活性型のペプチドとなることが知られている 〔Curr. Op in. Chem. Biol . , 2, 31 (1998)) o
特定のプロセシング酵素や修飾酵素は、 特定の内分泌細胞にしか発現していな いため、 例えば視床下部、 脳下垂体、 あるいは臈臓のランゲルハンス氏島の神経 細胞や内分泌細胞で生産される活性ぺプチド （例えばバソプレッシンゃグルカゴ ン） の前駆体遺伝子を、 遺伝子発現によく使用される COS細胞や CH0細胞などの非 内分泌系の細胞で発現させても、 一般に活性型のぺプチドは生産されない。
内分泌細胞のように、 もともと特定の活性ぺプチドを生産する能力のある細胞 は、 該活性ペプチドのプロセシング酵素や修飾酵素を発現しているため、 該細胞 を宿主として該ぺプチドの前駆体遺伝子を発現させれば、 該ぺプチドを活性のあ る形で発現することが可能と考えられる。 また、 該細胞で発現しているプロセシ ング酵素や修飾酵素によって正常のプロセシングや修飾を受けることのできる他 の活性べプチドに関しても、 該細胞を宿主としてその前駆体遺伝子を発現させる ことにより、 活性のあるペプチドを発現することができると考えられる。
内分泌細胞より樹立した株化細胞 （以下、 内分泌細胞株と呼ぶ） に既知の活性 ぺプチド前駆体遺伝子を導入して発現させ、 活性べプチドを生産させる方法とし て、 放射線照射により誘発したラットのランゲルハンス氏島の癌細胞より樹立さ れた RIN細胞に、 プレブ口インスリン遺伝子またはプレブ口アミリン遺伝子を導入 して発現させ、 インスリンやアミリンを生産させる方法 （US6194176、 US6110707 ) 、 トランスジエニックマウスに生じた腫瘍 3細胞から樹立された MIN6細胞株に、 プレプロインスリン遺伝子を導入して発現させ、 Cペプチドを生産する方法 〔Nat. Cell Biol. , 2, 805 (2000)〕等が知られている。
上記のように、 内分泌細胞株を用いた既知の活性ぺプチドの生産方法は幾つか 知られているが、 該分泌細胞株が新規の活性べプチドを探索するために有用であ ることを記載あるいは示唆する文献はない。
また、 新たな活性を有するぺプチドゃ該ぺプチドをコードする遺伝子を効率良 く見出すためには、 遺伝子発現用の宿主として使用する内分泌細胞株、 遺伝子ソ —スとして使用する内分泌細胞株、 およびぺプチドの活性を検出するためのアツ セィ系などに関してさらなる改善が求められている。
内分泌細胞株としては、 これまでに下記のような （1) 視床下部由来あるいは (2) ランゲルハンス氏島由来の細胞株が知られている。
(1) 視床下部由来の細胞株
視床下部由来の細胞株として、 下記 （υ 〜 ） の細胞株が知られている。
(i) マウス胎児 （胎生 14日目） の視床下部由来の初代培養細胞を SV40に感染させ ることにより取得された不死化細胞
上記不死化細胞として、 HT9、 該 HT9細胞由来のシングルクローン細胞 (HT9- C7) 等が知られている。 HT9- C7はニューロフィジンおよびバソプレツシンを発現する CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3575 (1974))。
(ii) ラット胎児 （胎生 16日目） の視床下部由来の初代培養細胞を SV40に感染さ せることにより取得された不死化細胞株
上記不死化細胞として、 HC 8、 RCA-6, RCF- 27、 RCD-15, D12等が知られている。 これらの細胞株はエストロゲン受容体を発現する 〔 Endocrinology, 126, 235 (1990) ; Endocrinology, 140, 23928 (1999)〕。
(iii) ラヅ ト胎児 （胎生 15日および 16日目） の視交差上核由来の初代培養細胞を、 アデノウイルス 2とアデノウイルス 5のハイブリツド E1A 12Sを発現可能なレトロゥ ィルスに感染させることにより取得された、 2種の視交差上核由来の不死化細胞株 上記不死化細胞として、 SCN1.4, SGN2.2等が知られている 〔J. Neurobiol. , 39, 1 (1999)〕。 SCN1.4および SCN2.2の細胞株の大部分はグリア細胞様の形態を示す が、 グリア細胞特異的抗原の発現は限られている。 また、 一部の細胞は神経細胞 に特徴的な性質を示し、 神経細胞特異的抗原ゃ視交差上核の神経細胞で発現して いる神経ペプチドであるソマトス夕チン、 vasoactive intestinal polypeptide ( VIP)、 gastrin- releasing peptide (GRP) 、 またはアルギニンバソプレツシン （ AVP) を発現し、 視交差上核の神経細胞では発現のみられないォキシトシンやコル チコトロピン放出ホルモン （CRH) は発現しない。 細胞の分化を促す条件下で培養 すると、 上記で発現のみられた神経べプチドを発現する細胞の数が増加する。
(iv) 視床下部で発現するゴナドトロピン放出ホルモン （GnRH) 遺伝子のプロモ —夕一を用いて SV40ラージ T抗原を発現させたトランスジエニックマウスの後脳に できた腫瘍から樹立された細胞株
上記細胞株として、 GT GTl-ls GT1- 3、 GT1- 7等が知られている (Neuron, 53 1 (1990)〕。 GT1- 1および GT1-7細胞は GnRH産生能を保持しており、 GnRHの発現調 節機構の解析に使用されている 〔Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 89, 1852 (1992) ; Endocrinology, 140, 1423 (1999)〕。
(v)視床下部で発現する GnEH遺伝子のプロモー夕一を用いて SV40ラージ T抗原を 発現させたトランスジエニックマウスの嗅球にできた腫瘍から樹立された細胞株 上記細胞株として、 GN等が知られている。 GN細胞は GnRHを発現している 〔Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 88, 3402 (1991 )〕。
内在性のレブチン受容体を発現する視床下部由来の細胞株が取得できれば、 個 々の神経細胞に対するレプチンの生物学的機能を解析することが可能になるが、 上記視床下部由来の細胞株はいずれも、 レブチン受容体を発現しておらず、 これ までに内在性のレプチン受容体を発現する視床下部由来の細胞株は知られていな い (Diabetes, 9, 1443 (2000)、 Neuron, 5, 1 ( 1990)〕。 レブチンは抗肥満薬ゃ抗糖尿病薬として開発が進んでいるが、 レブチン抵抗性 の問題から、 レブチンに変わる薬物の開発が求められている。 レブチンの作用メ 力二ズムの解明は、 新たな生理活性物質の発見や創薬夕一ゲットの同定につなが ると考えられる。 内在性のレプチン受容体を発現する視床下部由来の細胞株が取 得できれば、 該細胞株を用いて上記薬物のスクリ一ニングゃ評価を行うことも可 能となる。
レブチン受容体遺伝子だけでなく、 プレブロニユーロメディン ϋ遺伝子、
RFamide-related peptide (RFRP) プレプロ蛋白質遺伝子、 プレプロォレキシン遺 伝子、 プレブ口オビォメラノコルチン遺伝子、 プレブロニユーロペプチド Y遺伝子、 プレプロニユーロペプチド FF遺伝子、 プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺 伝子、 プレブ口サイロトロピン放出ホルモン遺伝子、 プレブ口グレリン 伝子、 プレプロメラニン凝集ホ レモン遺 1E子、 cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) 遺伝子、 2型ニューロメディン ϋ受容体 (NMU2R) 遺伝子、 RFRP 受容体遺伝子、 4型メラノコルチン受容体 (MC4R) 遺伝子、 1型ニューロペプチド Y 受容体 (NPY1R) 遺伝子、 5型ニューロペプチド Y受容体 (NPY5R) 遺伝子、 2型ニュ —口ペプチド FF受容体 （ΝΡΪΤ2)遺伝子、 1型コルチコトロピン放出ホルモン受容 体（CRHR-1) 遺伝子、 2型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-2) 遺伝子、 グレリン受容体遺伝子、 1型メラニン凝集ホルモン受容体 (MCHR1) 遺伝子、 スル ホニルゥレア受容体遺伝子またはプレブロアグーチ関連べプチド遺伝子、 あるい はこれら遺伝子にコードされたポリべプチドを発現する視床下部由来の細胞株も 知られていない。
視床下部は生命を維持するために最も重要な統制的機能を有しており、 薬物の 夕一ゲヅト部位としても注目されている。 したがって、 機能を保持した視床下部 由来の細胞株が取得できれば、 個々の視床下部神経細胞の機能を、 細胞レベルお よび分子レベルで研究することが可能になる。 また、 視床下部神経細胞を夕ーゲ ヅトとした薬物の開発にも極めて有用である。 視床下部に存在する内分泌性細胞 は様々な活性べプチドを生産していることが知られているため、 多様な視床下部 由来細胞株は、 新たな活性べプチドを探索する上でも非常に有用なソースとなる と考えられる。
(2) ランゲルハンス氏島由来の細胞株 これまで、 ランゲルハンス氏島由来の細胞株として、 下記 （i) 〜 (vii) の細 胞株が知られている。
(i)放射線で誘発したランゲルハンス氏島由来の癌から樹立された細胞株 上記樹立株として、 RIN- m細胞 （ラット細胞） 、 INS- 1細胞 （ラット細胞） 、
RIN-m細胞由来のシングルクローン細胞 (RIN-5F RIN-14B, RIN-m5F) 等が知られ ている Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 628 (1977) ; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 175, 35 (1984) ; Endocrinology, 1305 167 (1992)〕 。放射線による癌の誘 発頻度は低いため、 ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞 （ ?細胞等） しか 癌化しないと考えられる。 従って、 上記樹立株は特定の細胞の癌化細胞由来と考 えられる。
(ii) ハムスターのィンスリノ一マから樹立された細胞株
上記樹立株として、 IiHQ- Gl、 In-Rl-G3s In- M-G7、 In-Rl-G9s In-Rl-G10N In - Rl-Gll等が知られている 〔In Vitro Cell. Dev. Biol. , 22, 120 (1986)〕 。 これら樹立株も、 ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考え られている。
(iii) ランゲルハンス氏島の初代培養細胞を SV40でトランスフォームすることに よって樹立された細胞株
上記樹立株として、 ハムスター由来の HIT細胞等が知られている 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4339 (1981 ) ; Biochem. J. , 219, 547 (1984)〕。 SV40によ る形質転換頻度は低く、 また細胞の種類により該頻度が異なることより、 これら 樹立株も、 ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞 （ ?細胞等） の癌化細胞株 と考えられている。
(iv) ィンスリンプロモ一夕一のコントロ一ル下に SV40ラージ T抗原を発現するト ランスジヱニックマウスに生じた/?細胞由来と考えられる腫瘍から樹立された細 胞株
上記樹立株として、 5TC細胞、 NIT- 1細胞、 MIN6細胞等が知られている 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9037 (1988); Diabetes, 40, 842 (1991); Endocrinology, 127, 126 (1990)〕 。 ここで SV40ラージ T抗原は、 ランゲルハンス 氏島に存在する特定の細胞 （ ?細胞等） でのみ発現するため、 特定の細胞のみが 不死化されていると考えられる。 従って、 これら樹立株も、 ランゲルハンス氏島 に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考えられている。
(V) インスリンプロモ一夕一のコントロール下に転写因子を発現するトランスジ エニックマウスと該転写因子で活性化されるプロモ一夕一のコント口一ル下に
SV40ラージ T抗原を発現するトランスジエニックマウスを掛け合せることによって 生まれたマウスに生じた/?細胞由来と考えられる腫瘍から樹立された細胞株 上記樹立株として、 ?TC- tet細胞等が知られている 〔Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 92, 3576 ( 1995)〕 。 上記 （iv) 同様、 これら樹立株も、 ランゲルハンス氏 島に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考えられている。
(vi) プレグルカゴンプロモー夕一のコントロール下に SV40ラージ T抗原を発現す るトランスジェニヅクマウスに生じたアデノーマから樹立された細胞株
上記樹立株として、 《TC1細胞 〔Diabetes, 39, 406 (1990) ; Diabetes, 39, 415 ( 1990)〕 、 ひ TCI細胞由来のシングルクローン細胞 aTCl clone 9等が知られ ている。 ここで SV40ラージ T抗原は、 ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞 （ α細胞等） でのみ発現するため、 特定の細胞のみが不死化されていると考えられ る。 従って、 これら樹立株も、 ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞の癌化 細胞株と考えられている。
(vii) elastase-1プロモ一ターのコントロ一ル下に SV40ラージ T抗原を発現する トランスジエニックマウスに生じた腌臓癌から樹立された細胞株
上記細胞株として、 TGP52がある 〔Carcinogenesis， 15, 61 ( 1994)〕 。 ここで SV40ラージ T抗原は、 ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞でのみ発現するた め、 特定の細胞のみが不死化されていると考えられる。 従って、 この樹立株も、 ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考えられている。
上記ランゲルハンス氏島の細胞より樹立した細胞株はいずれも、 癌細胞あるい は癌由来の細胞であるため、 正常の細胞とは異なる性質を有する可能性がある。 新たな生理活性物質、 受容体、 リガンド、 あるいは活性ペプチドなどを探索す る上では、 正常の細胞の性質を保持したさらに多様な細胞株の取得が望まれる。 ランゲルハンス氏島の各種細胞はお互いを制御し合っていると考えられているた め、 多様な細胞株を取得し、 それらを共培養することで個々の細胞の役割を解析 することが可能になる。
また、 同じ遺伝的バックグラウンドを有するランゲルハンス氏島由来の多様な 細胞株が取得できれば、 個々の細胞株の分化ステージや機能を比較解析する上で も有用である。 これまでは、 同じ遺伝的バッググラウンドを有する、 ランゲルハ ンス氏島由来の多種の不死化細胞は存在しなかった。
ランゲルハンス氏島に存在する内分泌性細胞は、 グルカゴン、 インスリン、 ソ マトス夕チン、 滕ポリペプチドをはじめ、 様々な活性ペプチドを生産しているこ とが知られているため、 該内分泌性細胞は新たな活性べプチドを探索する上でも 非常に有用なソースとなると考えられる。
内分泌細胞株または任意の遺伝子を導入した内分泌細胞から生産されるぺプチ ドの活性を効率良く調べるためには、 該ぺプチドの活性を検出できる高感度で簡 便なアツセィ系が必要である。 新たな活性を有するぺプチドゃ該ぺプチドをコ一 ドする遺伝子を効率良く見出すためには、 高感度で簡便な、 多様なアツセィ系が 必要となる。 また、 多様な内分泌細胞株をペプチドソースまたは遺伝子ソースと して用いることにより、 新たな活性を有するぺプチドゃ該ぺプチドをコ一ドする 遺伝子を効率良く見出すことができると考えられる。
これまでに多くのァヅセィ系が構築されている。 感度のよいアツセィ系として、 例えばバイオアツセィ系等をあげることができる。
バイオアツセィ系の場合、 どのような細胞を使用するかにより検出感度、 シグ ナル /ノイズ比、 汎用性、 および簡便性が大きく変わる。 該細胞として形質転換 体を使用する場合には、 遺伝子導入効率がよいか、 遺伝子の発現量が高いか、 遺 伝子の誘導発現が可能か、 該誘導発現の倍率が高いか等で、 アツセィ効率に大き な影響を与える。 動物細胞を使用する場合には、 無血清培地で培養が可能か、 生 育が良好な非接着性細胞 （浮遊系細胞） であるか等で、 アツセィ効率が大きく変 わる。
活性ペプチド （リガンド） の探索に使用可能なアツセィ系の例としては、 G蛋白 質共役型受容体 （以下、 GPCRと略すこともある） を利用したバイオアヅセィ系が 知られている。 該 GPCRバイオアヅセィ系により、 新規リガンド、 ァゴニストまた はアン夕ゴニストが取得されている。 GPCRは、 Gひ、 G ?、 Gァの 3種の G蛋白質 （ guanine nucleotide- binding protein) から構成されるへテロ三量体 G蛋白質と共 役し、 G蛋白質の活性化を通して細胞内にシグナルを伝達する。 GPCRは 7個の膜貫 通領域を有することから、 7回膜貫通型受容体とも呼ばれる。 該 GPCRバイオアツセィ系には、 細胞内 Ca2+量の増加を検出する方法、 レポ一夕 一系を用いる方法等多くの方法が知られている。
GPCRは共役する G蛋白質のサブ夕ィプの違いによって、 異なるシグナルを流す。 レポ一夕一系を用いる方法の場合、 レポ一夕一遺伝子を発現させるためのプロモ 一夕一としてどのようなものを使用するかにより、 検出できるシグナル、 感度、 シグナル /ノィズ比等が異なる。
プロモーターとしては、 TPA応答配列 （TRE) を有するプロモーター、 NFAT ( nuclear factor of activated T cells) 応答性プロモー夕一、 cAMP応答配列 （ CRE) を有するプロモーター、 血清応答配列 （SRE) を有するプロモーター等が利 用されている。
GPCRと共役する G の立体構造は既に明らかにされており、 GPCilとの相互作用に 重要である 蛋白質の C末端のアミノ酸を他の Go:蛋白質の対応するアミノ酸に置 換することにより、 本来共役しない GPCRと共役できるようになることが知られて いる 〔Mol . Pharmacol. , 57, 13 (2000)〕 。
例えば、 Gひ q C末端の 5アミノ酸を Goiiのものに置換したキメラ Gひ蛋白質 （6ひ q-i) は、 6 に共役してシグナルを流す GPCRと、 Gas®C末端の 5アミノ酸を Gaqの ものに置換したキメラ G a蛋白質 （G o:s-q) は、 G qに共役してシグナルを流す GPCRと、 Gひ 3の(末端の 5アミノ酸を のものに置換したキメラ 蛋白質 （G ^ ) は、 Gひ iに共役してシグナルを流す GPCRと共役することができるようになる。
GPCRには、 細胞内で過剰に発現すると、 リガンドが存在しなくてもシグナルを 流す、 構成活性型 GPCRと呼ばれる GPCRが知られている。 リガンド非存在時に流れ るシグナルのことを構成的活性と呼ぶ。 構成活性型 GPCIこは、 天然に存在するも のと、 アミノ酸の置換、 欠失などの変異を導入することにより造成された変異 GPCR CMol . Pharmacol. , 57, 890 (2000) ; W098/46995〕 がある。 該変異 GPCIま、 ァゴニストとの親和性が増加する場合があるため、 リガンドの探索に有用である CJ. Biol . Chem. , 72, 1822 ( 1997)〕 。
GPCRバイオアツセィ系では、 アツセィ用の細胞として、 CH0細胞、 C0S-7細胞、 293細胞、 HEK293 EBNA細胞等の動物細胞、 力エルのメラノフォア 〔Mol. Pharmacol . , 57, 125 (2000)〕 あるいは酵母 〔 Trends Biotechnol. , 15, 487 (1997) ; G protein Receptors, CRC Press, 49-68 (2000)〕 等が利用されている。 04840 上記の GPCRバイオアツセィ系は優れたアツセィ系であるが、 検出感度、 シグナ ル ノィズ比、 汎用性、 簡便性、 および使用する宿主 'ベクター系などに関して 更なる改善が求められている。
上記のようなアツセィ細胞を宿主として発現クロ一ニングを行えば、 有用な遺 伝子を効率的に取得することが可能であり、 これまでにレポ一夕一遺伝子の発現 を指標にして、 イン夕一フエロンァ受容体の/?鎖や PACAP ( ituitary adenylylate cyclase- activating polypeptide) 受容体の遺伝子が取得されてい る 〔Nature， 365, 170 (1993); Cell, 76, 803 (1994)〕 。 しかし、 該発現クロー 二ング法に関しても GPCRノ ィオアヅセィ系と同様の改善が求められている。 また、 構成活性型の GPCR遺伝子を発現クローニング法により取得可能であることに関す る記載も示唆もない。 発明の開示
本発明は、 以下の ）〜 (5)を提供することを課題としている。
(1) 哺乳動物の内分泌細胞由来の多様な細胞株。
(2) 該細胞株を宿主として用いた、 活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニン グ系および活性ぺプチドの生産法。
(3) 該細胞株を用いた、 該細胞に作用する物質の探索法や評価法。
(4) 該細胞株を用いた有用遺伝子、 有用ペプチドの探索法および取得法。
(5) 上記の発現クロ一ニング系で使用する高感度で簡便な GPCRリガンドのアツセ ィ系。
本発明は以下の （1)〜（106) に関する。
(1) 下記 [1]〜[： 5]の工程を有する、 目的とする受容体のァゴニスト、 アン夕ゴニ ストまたはィンバ一スァゴニストとして作用するぺプチドをコ一ドする DNAの取得 方法。
[1]任意の cDNAまたは染色体由来の DMを内分泌細胞由来の細胞株に導入して形質 転換株を取得する
[2]上記 [1]の形質転換株を培養し、 導入した MAを発現させた後、 該形質転換株の 培養上清、 細胞抽出液、 膜画分、 または該形質転換株自身を、 目的とする受容体 を発現する細胞と接触させる T JP03/04840
[3]該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
[4]該形質転換株の培養上清、 細胞抽出液、 膜画分、 または該形質転換株自身が目 的の活性を示した形質転換株を選択する
[5]上記 [4]の形質 換株に導入した DNAを、 形質転換株に目的の活性を与える DNA として同定する
(2) 下記 [1；！〜 [7]の工程を有する、 目的とする受容体のァゴニスト、 アン夕ゴニ ストまたはィンバ一スァゴニストとして作用するぺプチドをコ一ドする DNAの取得 方法。
[1]発現ベクターを用いて作製した cDNAライブラリ一を 1〜： L0000のクローンずつの プールに分ける
[2]各プールに由来する cDNAク口ーンの混合物を内分泌細胞由来の細胞株に導入し て形質転換株を取得する
[3]上記 [2]の形質転換株を各プールごとに培養して、 導入した cDNAを発現させた 後、 該形質転換株の培養上清、 細胞抽出液、 膜画分、 または該形質転換株自身を、 プールごとに目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
[4]該受容体に基づく細胞の応答反応をプールごとに検出する
[5]該形質転換株の培養上清、 細胞抽出液、 膜画分、 または該形質転換株自身が目 的の活性を示したプールを選択し、 選択したプールを [1]よりも細かいプールに分 ける
[6] [2]~ [5]の操作をプールが 1クローンごとになるまで繰り返す
[7]形質転換株に目的の活性を与える cDNAを同定する
(3) 任意の cDNAまたは染色体由来の遺伝子が、 活性ペプチド前駆体をコードする 遺伝子である、 （1) または （2) に記載の DNAの取得方法。
(4) 受容体が G蛋白質共役型受容体である、 （1) または （2) に記載の DNAの取得 方法。
(5) G蛋白質共役型受容体がォ一ファン G蛋白質共役型受容体である、 （4) に記 載の MAの取得方法。
(6) 内分泌細胞由来の細胞株が、 SV40のラージ T抗原遺伝子を発現する内分泌細 胞由来の細胞株である、 （1) または （2) に記載の MAの取得方法。
(7) 内分泌細胞由来の細胞株が、 SV40の温度感受性変異株のラージ T抗原遺伝子 を発現する内分泌細胞由来の細胞株である、 （1) または （2) に記載の MAの取得 方法。
(8) 内分泌細胞由来の細胞株が、 非ヒト · トランスジヱニック動物細胞由来の細 胞株である、 （1)、 (Z)、 (6) または （7) に記載の DNAの取得方法。
(9) 非ヒト ' トランスジエニック動物がトランスジェニヅクラットである （8) に記載の DMの取得方法。
(10) SV40の温度感受性変異株が SV40tsA58である （7) に記載の DNAの取得方法。
(11) 内分泌細胞由来の細胞株が、 視床下部またはランゲルハンス氏島由来の細 胞株である、 ）、 (2)、 (6)、 (7) または （8) に記載の DNAの取得方法。
(12) 内分泌細胞由来の細胞株が、 レブチン受容体 (Ob-Rb) 遺伝子、 プレブロニ ユーロメディン U遺伝子、 RFamide- related peptide (RFRP) プレプロ蛋白質遺伝 子、 プレプロォレキシン遺伝子、 プレブ口才ピオメラノコルチン遺伝子、 プレブ ロニユーロペプチド Y遺伝子、 プレプロニユーロペプチド F F遺伝子、 プレブロコ ルチコトロピン放出ホルモン遺伝子、 プレプロサイロトロピン放出ホルモン遺伝 子、 プレプログレリン遺伝子、 プレブ口メラニン凝集ホルモン遺伝子、 cocaine - and amphetamine-regulated transcript (CART) 遺伝子、 2型ニューロメディン U 受容体 （ U2H) 遺伝子、 RFRP受容体遺伝子、 4型メラノコルチン受容体 （MC4R) 遺伝子、 1型ニューロペプチド Y受容体 (NPY1R) 遺伝子、 5型ニューロペプチド Y受 容体 （NPY5R) 遺伝子、 2型ニューロペプチド 受容体 （NPFF2) 遺伝子、 1型コ ルチコトロピン放出ホルモン受容体 （CMffi- 1) 遺伝子、 2型コルチコトロピン放出 ホルモン受容体 (CRH -2) 遺伝子、 グレリン受容体遺伝子、 1型メラニン凝集ホル モン受容体 （MCHR1) 遺伝子、 プレブロアグーチ関連ペプチド遺伝子、 スルホニル ウレァ受容体遺伝子、 毛様体神経栄養因子 （CNTF) 受容体遺伝子、 1型ニューロメ ディン U受容体 (NMU1R) 遺伝子、 1型ォレキシン受容体 (0X1R) 遺伝子、 2型ォレ キシン受容体 (0X2R) 遺伝子、 1型アンジォテンシン II受容体遺伝子、 ガラニン受 容体、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体遺伝子、 およびグルカゴン様ぺプ チド- 2 (GLP-2) 受容体遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも 1つの 遺伝子を内因性に発現する視床下部由来細胞である、 （1)、 (2)、 (6)、 (7 ) または （8) に記載の DNAの取得方法。
(13) 内分泌細胞由来の細胞株が、 レブチン受容体 (Ob-Rb) 、 ニューロメディン U、 RFamide-related peptide (RFRP) 蛋白質、 才レキシン、 ォピオメラノコルチ ン、 ニュ一口ペプチド Y、 ニューロペプチド F F、 コルチコトロピン放出ホルモン、 サイロトロピン放出ホルモン、 グレリン、 メラニン凝集ホルモン、 cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) 、 2型ニューロメディン U受容体 ( NMU2R)、 M1P受容体、 4型メラノコルチン受容体 (MC4R)、 1型ニューロペプチド Y受容体 （NPY1R)、 5型ニューロペプチド Y受容体 （NPY5R) 、 2型ニューロぺプチ ド F F受容体 (NPFF2)、 1型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 （CRHR-1) 、 2 型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-2) 、 グレリン受容体、 1型メラ二 ン凝集ホルモン受容体 （MCHR1) 、 ァグーチ関連ペプチド、 スルホニルゥレア受容 体、 毛様体神経栄養因子 （CNTF) 受容体、 1型ニューロメディン U受容体 (N U1R )、 1型ォレキシン受容体 (0X1R)、 2型ォレキシン受容体 (0X2 )、 1型アンジォ テンシン II受容体、 ガラニン受容体、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体、 グルカゴン様ペプチド- 2 (GLP-2) 受容体、 およびエンドルフィンからなる群より 選ばれるぺプチドの少なくとも 1つのべプチドを内因性に発現する視床下部由来 の細胞である、 （1)、 (2) 、 (6)、 (7) または （8) に記載の DNAの取得方法。
(14) 内分泌細胞由来の細胞株の細胞が、 プレブ口インスリン遺伝子、 プレブ口 グルカゴン遺伝子、 プレブロソマトス夕チン遺伝子、 プレブロ滕ポリペプチド遺 伝子、 プロホルモンコンベル夕一ゼ 1 (PC1) 遺伝子、 プロホルモンコンペル夕一 ゼ 2 (PC2) 遺伝子、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体遺伝子、 PDX1 ( pancreatic -duodenal homeobox 丄 逾伝子、 Pax4逾伝子、 Pax6遺 te子、 ニューロ ジェニン 3遺伝子、 ニューロ D遺伝子、 Nkx2.2遺伝子、 Nkx6.1遺伝子、 ダルコキナ ーゼ遺伝子、 2型グルコーストランスポー夕一遺伝子、 ベ一夕セルリン遺伝子、 ス ルホニルゥレア遺伝子、 受容体遺伝子、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受 容体遺伝子、 1型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 2型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 3型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 4型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 5型ソマトス 夕チン受容体遺伝子、 インスリン受容体遺伝子、 グルコーストランスポ一夕一遺 伝子、 およびネスチン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも 1つの 遺伝子を内因性に発現するランゲルハンス氏島由来細胞である、 （1)、 (2)、
(6)、 (7) または （8) に記載の DNAの取得方法。
(15) 受容体を発現する細胞が、 下記の [1；]〜 [3]の少なくとも 1つが染色体 DNAに 組み込まれた、 ェプス夕イン■バ一 ·ウィルス （Epstain- Barr virus) の EBNA-1 遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株である、 （1) または （2) に記載の DNA の取得方法。
[1]誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するための DNAコンストラクト
[2]転写因子の応答配列を有するプロモ一夕一の下流にレポ一夕一遺伝子を連結し た DNAコンストラクト
[3]Ga蛋白質またはキメラ Go:蛋白質を発現するための DNAコンストラクト
(16) B細胞株が、 無血清馴化 Namalwa細胞である、 （15) に記載の DNAの取得方法。
(17) 無血清馴化 Namalwa細胞が、 Namalwa KJM- 1細胞である、 （16) に記載の DNA の取得方法。
(18) 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受容 体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、 （15) に記載の DNAの取得方法。
(19) 転写因子の応答配列が、 cAMP応答配列（CRE)、 TPA応答配列（Ί¾Ε)、 NFAT( nuclear factor of activated T cells)応答配列、 または血清応答配列 (SRE)である、 （15) に記載の DNAの取得方法。
(20) レポ一夕一遺伝子が、 ホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ遺伝子、 ゥミシィタケ .ル シフェラーゼ遺伝子、 クロラムフエニコ一ル ·ァセチルトランスフェラーゼ遺伝 子、 ?-ガラクトシダーゼ遺伝子、 ラクタマ一ゼ遺伝子、 またはグリーン .フ ルォレツセント 'プロティン遺伝子である、 （15) に記載の DNAの取得方法。
(21) Go:蛋白質が、 Go:16、 Ga15、 GaqS Gcc11N GQ:s、 G ^ Gひ。、 G«z、 Ga12、 G «13、 Gat, および Gひ 14からなる群より選ばれるの少なくとも 1つの Ga 蛋白質である、 （15) に記載の DMの取得方法。
(22) キメラ Ga蛋白質が、 下記の [1：！〜 [20]からなる群より選ばれる少なくとも 1つのキメラ Go:蛋白質である、 （15) に記載の DNAの取得方法。
[1]6ひ3の(]末端 5ァミノ酸を Gaqの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
[2](}0^の(；末端 5アミノ酸を Ga^C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go蛋白質
[3](} の 末端 5アミノ酸を 。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
[4] Gひ 3の 末端 5アミノ酸を Gひ 2の(末端 5ァミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質
[5]Gas®C末端 5アミノ酸を Ga12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
[6]Gasの C末端 5アミノ酸を Ga13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [7]G S©C末端 5アミノ酸を Gagustの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [8]Gas C末端 5アミノ酸を Gat C末端 5アミノ酸に置換したキヌラ Go:蛋白質 [9]G S®C末端 5アミノ酸を G 14の C末端 5ァミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [10]Go:s©C末端 5アミノ酸を Ga16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [ll]Gaqの C末端 5アミノ酸を Gas®C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質 [12]Gaqの C末端 5アミノ酸を の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [13]Gひ q©C末端 5アミノ酸を Go:。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質 [14]Go:qの C末端 5アミノ酸を G 2の0末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質 [15]G qの C末端 5アミノ酸を Gai2の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質 [16]Go:qの C末端 5アミノ酸を Gひ 13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go蛋白質 [17]G qの C末端 5アミノ酸を G の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [18]Gaqの C末端 5アミノ酸を Gcctの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [19]Go:q©C末端 5アミノ酸を Go:14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質 [20]Gひ qの C末端 5アミノ酸を G iSの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(23) 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受容 体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプロ モ—夕—が、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモーターであり、 レポ一夕一遺伝子 が、 ホ夕ル ·ルシフヱラ一ゼ遺伝子またはゥミシィタケ ·ルシフヱラーゼ遺伝子 である、 （15) に記載の DNAの取得方法。
(24) 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受容 体のリガンド結合領域のキヌラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプロ モー夕一が、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモーターであり、 レポ一夕一遺伝子 が、 ホタル ·ルシフェラーゼ遺伝子またはゥミシィタケ ·ルシフヱラーゼ遺伝子 であり、 キメラ G 蛋白質が、 G 3の(]末端 5アミノ酸を Gひ qの C末端 5アミノ酸に置 換したキメラ Go:蛋白質または 6 の(末端 5アミノ酸を Gひ i©C末端 5アミノ酸に置 換したキメラ Go:蛋白質である、 （15) に記載の DNAの取得方法。 .
(25) 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+上 昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産 生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c- fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポ一夕一遺伝子の発現量、 およびマーカー遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 （1) または （2) に記載の DNA の取得方法。
(26) 目的とする受容体を発現する細胞との接触が、 該細胞を形質転換株上に重 層することによる接触である、 （1) または （2) に記載の DNAの取得方法。
(27) レブチン受容体 （Ob- lib) 遺伝子、 プレブロニユーロメディン U遺伝子、 RFamide-related peptide (RFRP) プレプロ蛋白質遺伝子、 プレプロォレキシン遺 伝子、 プレブ口才ピオメラノコルチン遺伝子、 プレプロニユーロペプチド Y遺伝子、 プレプロニユーロペプチド F F遺伝子、 プレプロコルチコトロピン放出ホルモン 遺伝子、 プレブ口サイロト口ビン放出ホルモン遺伝子、 プレプログレリン遺伝子、 プレフ。口メラニン凝集ホクレモン遺伝子、 cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) 遺伝子、 2型ニューロメディン U受容体 （MU2R) 遺伝子、 RFRP受容体遺伝子、 4型メラノコルチン受容体 (MC4R) 遺伝子、 1型ニューロぺプ チド Y受容体 （NPY1R) 遺伝子、 5型ニューロペプチド Y受容体 (NPY5R) 遺伝子、 2 型ニュ一口ペプチド F F受容体 （NPFF2) 遺伝子、 1型コルチコトロピン放出ホル モン受容体 (CRHR-1) 遺伝子、 2型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-2
) 遺伝子、 グレリン受容体遺伝子、 1型メラニン凝集ホルモン受容体 (MCHR1) 遺 伝子、 プレブロアグーチ関連ペプチド遺伝子、 スルホニルゥレア受容体遺伝子、 毛様体神経栄養因子 （CNTF) 受容体遺伝子、 1型ニューロメディン U受容体 （ NMU1R) 遺伝子、 1型ォレキシン受容体 （0X1R) 遺伝子、 2型ォレキシン受容体 （ 0X2R) 遺伝子、 1型アンジォテンシン II受容体遺伝子、 ガラニン受容体遺伝子、 グ ルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体遺伝子、 およぴグルカゴン様ペプチド- 2 ( GLP-2) 受容体遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも 1つの遺伝子を 内因性に発現する視床下部由来の細胞株。
( 28 ) レブチン受容体 （ Ob- Rb ) 、 ニューロメディ ン U、 RFamide-related peptide (RFRP) 蛋白質、 ォレキシン、 ォピオメラノコルチン、 ニューロペプチド Y、 ニューロペプチド F F、 コルチコトロピン放出ホルモン、 サイロトロピン放出 ホノレモン、 グレリ ン、 メラニン凝集ホルモン、 cocaine- and amphetamine- regulated transcript (CART) 、 2型ニューロメディン U受容体 (NMU2R)、 RFRP 受容体、 4型メラノコルチン受容体 （MC4I 、 1型ニューロペプチド Y受容体 （ NPY1R)、 5型ニューロペプチド Y受容体 （NPY5R)、 2型ニューロペプチド F F受容 4840 体 （NPFF2)、 1型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-1)、 2型コルチコ トロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-2)、 グレリン受容体、 1型メラニン凝集ホル モン受容体 (MCHR1) 、 ァグーチ関連ペプチド、 スルホニルゥレア受容体、 毛様体 神経栄養因子 （CNTF) 受容体、 1型ニューロメディン U受容体 (NMU1R)、 1型ォレ キシン受容体 (0X1R)、 2型ォレキシン受容体 (0X2R)、 1型アンジォテンシン II 受容体、 ガラニン受容体、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体、 グルカゴン 様ペプチド- 2 (GLP-2) 受容体、 およびエンドルフィンからなる群より選ばれるぺ プチドの少なくとも 1つのべプチドを内因性に発現する視床下部由来の細胞株。
(29) 細胞株が、 SV40のラージ T抗原遺伝子を発現する細胞株である、 （27) また は （28) に記載の細胞株。
(30) 細胞株が、 SV40の温度感受性変異株のラージ T抗原遺伝子を発現する細胞株 である、 （27) または （28) に記載の細胞株。
(31)細胞株が、 非ヒト · トランスジエニック動物細胞由来の細胞株である、 (27)〜 （30) のいずれか 1項に記載の細胞株。
(32) SV40の温度感受性変異株のラージ T抗原遺伝子を導入した非ヒト ' トランス ジエニック動物の視床下部またはランゲルハンス氏島から得られる不死化した細 胞株 o
(33) ランゲルハンス氏島から得られる不死化した細胞株が、 プレブ口インスリ ン遺伝子、 プレブログルカゴン遺伝子、 プレブロソマトス夕チン遺伝子、 プレブ ロ塍ポリペプチド遺伝子、 プロホルモンコンペル夕一ゼ 1 (PC1) 遺伝子、 プロホ ルモンコンペルターゼ 2 (PC2) 遺伝子、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体 遺伝子、 PDXl (pancreatic - duodenal homeobox 1) 遺 子、 Pax4遺伝子ヽ Pax6;)fi 伝子、 ニューロジヱニン 3遺伝子、 ニューロ D遺伝子、 Nkx2.2遺伝子、 Nkx6.1遺伝 子、 ダルコキナーゼ遺伝子、 2型グルコーストランスポーター遺伝子、 ペータセル リン遺伝子、 スルホニルゥレア遺伝子、 受容体遺伝子、 グルカゴン様べプチ ド- 1 (GLP-1) 受容体遺伝子、 1型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 2型ソマトス夕チ ン受容体遺伝子、 3型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 4型ソマトス夕チン受容体遺 伝子、 5型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 インスリン受容体遺伝子、 グルコースト ランスポ一タ一遺伝子、 およびネスチン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の 少なくとも 1つの遺伝子を内因性に発現する細胞株である、 （32) に記載の細胞 株。
(34) SV40の温度感受性変異株が SV40tsA58である （30) または （32) に記載の細 胞株。
(35) 非ヒト ' トランスジエニック動物がトランスジェニヅクラットである （31 ) または (32) に記載の細胞株。
(36) 下記 [1]および [2]の工程を有する、 ペプチドの製造方法。
[1] (27) 〜 （35) のいずれか 1項に記載の細胞株を培養し、 該細胞株が内在的に 発現しているべプチドを培養物中に生成蓄積させる
[2]上記 [1]で得られた培養物から該ペプチドを採取する
(37) 下記 [1：]〜 [3]の工程を有する、 ペプチドの製造方法。
[1] (27) 〜 （35) のいずれか 1項に記載の細胞株を宿主細胞として用い、 該宿主 細胞に目的とするペプチドをコードする DNAを導入し、 形質転換株を取得する
[2]該形質転換株を培養し、 培養物中にぺプチドを生成蓄積させる
[3]上記 [2]で得られた培養物から該ペプチドを採取する
(38) 培養を、 SV40の温度感受性変異株のラージ T抗原の活性を抑制しない温度で 行うことを特徴とする、 （36) または （37) に記載の製造法。
(39)製造において、 無血清培地、 2%以下の血清を含む培地、 または無血清培地 に N-サプリメントを添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴と する、 （36) 〜 （38) のいずれか 1項に記載の製造法。
(40) 製造において、 5〜30mmol/Lのグルコースを含有する培地を用いて培養を行 う工程を有することを特徴とする、 （36) 〜 （39) のいずれか 1項に記載の製造 法。
(41) 製造において、 宿主細胞で発現されている、 受容体、 トランスポー夕一ま たはチャネルの、 ァゴニストまたはアン夕ゴニストを添加した培地を用いて培養 を行う工程を有することを特徴とする、 （36) 〜 （40) のいずれか 1項に記載の
(42) 受容体が、 G蛋白質共役型受容体、 核内受容体、 増殖因子受容体、 スルホ二 ルゥレア受容体、 ciliary neurotrophic factor受容体、 レプチン受容体、 サイト 力イン受容体、 またはスルホニルゥレア受容体であることを特徴とする、 （41) に記載の製造法。 (43) トランスポーターがグルコーストランスポーターであることを特徴とする、 (41) に記載の製造法。
(44) チャネルが、 Caチャネル、 Kチャネル、 C 1チャネルまたは Naチャネルである ことを特徴とする、 （41) に記載の製造法。
(45) 製造において、 宿主細胞で発現されている受容体のシグナルを代替するこ とのできる物質を添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とす る、 （36) ~ (44) のいずれか 1項に記載の製造法。
(46) 受容体のシグナルを代替することのできる物質が、 アデニレ一トシクラ一 ゼ、 プロテインキナーゼ、 ホスホジエステラーゼ、 低分子量 G蛋白質、 細胞内 cAMP または細胞内 Ca2+含量を変動する物質、 フオルスコリン、 8-ブロモ -サイクリック AMP (8-Br-cAMP) 、 ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート （PMA)、 ィオノマ ィシンおよび 3-ィソブチル- 1-メチルキサンチンよりなる群より選ばれる物質の少 なくとも 1つの物質である、 （45) に記載の製造法。
(47) 製造において、 ラミニンまたはゼラチンをコートしたディヅシュ上で培養 を行う工程を有することを特徴とする、 （36) 〜 （46) のいずれか 1項に記載の
(48) スクシェル化コンカナバリン Aを添加した培地を用いて培養を行うことを特 徴とする、 （36) 〜 （46) のいずれか 1項に記載の製造法。
(49) ァクチビン、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 、 フォリス夕チン、 グルコ ース、 肝細胞増殖因子 （hepatocyte growth factor) 、 上皮増殖因子 （epidermal growth factor) 、 ニコチンアミ ド、 ベ一夕セルリン、 副甲状腺ホルモン関連ぺプ チド （parathyroid hormone- related peptide) 、 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモ ン ( thyrotropin - re leasing hormone ) 、 血管内皮增殖因子 ( vascular endothelial growth r actor) 、 islet neogenesis - associated protein、 血小板 由来増殖因子 （Platelet- derived growth factor) 、 インシュリン様増殖因子 I ( insulin-like growth factor I ) 、 繊維芽細胞増殖因子 ( fibloblast growth factor)、 神経成長因子 （nerve growth factor) および Reg蛋白質からなる群よ り選ばれる物質の少なくとも 1つの物質を添加した培地を用いて培養を行うこと を特徴とする、 （36) 〜 （48) のいずれか 1項に記載の製造法。
(50) 培養物中に活性ぺプチドを生成蓄積させた後に分泌刺激剤を添加すること を特徴とする、 （36) 〜 （49) のいずれか 1項に記載の製造法。
(51) 分泌刺激剤が、 カリウム、 グルコース、 Tolbutamideまたは ATPである、 (50) に記載の製造法。
(52) —種類以上のペプチドをコードする DNAを宿主細胞に導入し、 複数のぺプチ ドを製造することを特徴とする、 （37) 〜 （51) のいずれか 1項に記載の製造法 c
(53) 下記 [1]〜！: 4]の工程を有する、 目的とする受容体のァゴニスト、 アン夕ゴ 二ストまたはィンバースァゴニストとして作用するぺプチドの検出または取得方 法。
[1] (1) 〜 （26) のいずれか 1項に記載の方法で、 目的とする受容体のァゴニス ト、 アン夕ゴニストまたはインバースァゴニストとして作用するペプチドをコ一 ドする DNAを取得する
[2]該 MAがコードするペプチドまたは部分ぺプチドを、 目的とする受容体を発現 する細胞と接触させる
[3]該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
[4]上記 [3]で応答反応を与えることの示されたぺプチドまたは部分ペプチドを同 定する
(54) 下記 [1：]〜 [4]の工程を有する、 目的とする受容体のァゴニスト、 アン夕ゴ ニストまたはインバースァゴニストとして作用するぺプチドの検出または取得方 法。
[1] (36) 〜 （52) のいずれか 1項に記載の製造方法でペプチドを取得する
[2]該ぺプチドを、 目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
[3]該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
[4]上記 [3]で応答反応を与えることの示されたぺプチドを同定する
(55) 受容体が G蛋白質共役型受容体である、 （53) または （54) に記載の検出ま たは取得方法。
(56) G蛋白質共役型受容体がォーファン G蛋白質共役型受容体である、 （55) に 記載の検出または取得方法。
(57) 受容体を発現する細胞が、 下記の ]〜 [3]の少なくとも 1つが染色体 DNAに 組み込まれた、 ェプスタイン ·バ一 ·ウィルス （Epstain- Bair virus) の EBNA - 1 遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株である、 （53) または （54) に記載の検 出または取得方法。
[1]誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するための MAコンストラクト [2]転 写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結した DNA コンストラクト [3]Gひ蛋白質またはキメラ Go:蛋白質を発現するための MAコンス 卜ラク卜
(58) B細胞株が、 無血清馴化 Najnalwa細胞である、 （57) に記載の検出または取 得方法。
(59) 無血清馴化 Namalwa細胞が、 Namalwa KJM-1細胞である、 （58) に記載の検 出または取得方法。
(60) 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受容 体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、 （57) に記載の検出または取得方 法。
(61) 転写因子の応答配列が、 cAMP応答配列（CRE)、 TPA応答配列（TM：)、 請 (nuclear factor of activated T cells)応答配列、 または血清応答配列 (SRE)である、 （57) に記載の検出または取得方法。
(62) レポーター遺伝子が、 ホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ遺伝子、 ゥミシィタケ .ル シフェラ一ゼ遺伝子、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラーゼ遺伝 子、 ガラクトシダ一ゼ遺伝子、 ?-ラク夕マーゼ遺伝子、 またはグリーン -フ ルォレツセント ·プロテイン遺伝子である、 （57) に記載の検出または取得方法。
(63) Go:蛋白買が、 Gひ 16ヽ Ga:15、 G«qヽ Galls Gひ s、 Ga^ Gひ。、 G zS Ga12N G c½、 Gひ Gat および G 14からなる群より選ばれるの少なくとも 1つの Go: 蛋白質である、 （57) に記載の検出または取得方法。
(64) キメラ 蛋白質が、 下記の [1]〜！：20]からなる群より選ばれる少なくとも 1つのキメラ 蛋白質である、 （57) に記載の検出または取得方法。
[1]Gひ 8の0末端 5アミノ酸を Gaqの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
ひ S«C末端 5アミノ酸を Gc¾iの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
[3]6ひ!；の0末端 5アミノ酸を G 。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
[4]6ひ3の(；末端 5アミノ酸を Gaz0C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
[5]Gひ S©C末端 5アミノ酸を Go: 12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質
[6]Gひ 3の0末端 5アミノ酸を Go:13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [7〗Gas®C末端 5アミノ酸を Gひ の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [8]Gas©C末端 5アミノ酸を Gc ^の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質 [9]Gas®C末端 5アミノ酸を Gひ 14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [10]Gひ 3の(末端 5アミノ酸を Go;16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [ll]Go:q®C末端 5アミノ酸を Go:s©C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [12]Gひ qの C末端 5アミノ酸を の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [ ：^ひの C末端 5アミノ酸を Gひ。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [14]Go:qの C末端 5アミノ酸を Go:z©C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [15]Gひ qの C末端 5アミノ酸を Ga12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [16]Gaqの C末端 5アミノ酸を Gひ 13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質 [17]Gaqの C末端 5アミノ酸を 6ひ の(；末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [18]Go:q C末端 5アミノ酸を Go:t®C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [19]G qの C末端 5アミノ酸を Go:14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [20]Go:qの C末端 5アミノ酸を Gひ 16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
(65) 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受容 体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプロ モーターが、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモ一夕一であり、 レポーター遺伝子 が、 ホ夕ル ·ルシフヱラ一ゼ遺伝子またはゥミシィタケ 'ルシフェラーゼ遺伝子 である、 （57) に記載の検出または取得方法。
(66) 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受容 体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプロ モーターが、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモーターであり、 レポ一夕一遺伝子 が、 ホ夕ル ·ルシフヱラ一ゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ ·ルシフェラ一ゼ遺伝子 であり、 キメラ G o:蛋白質が、 Go:s0C末端 5アミノ酸を Gaqの C末端 5アミノ酸に置 換したキメラ Ga蛋白質または Gasの C末端 5アミノ酸を Goiiの C末端 5アミノ酸に置 換したキメラ Ga蛋白質である、 （57) に記載の検出または取得方法。
(67) 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+上 昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産 生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C- fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポーター遺伝子の発現量、 およびマーカー遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 （53) または （54) に記載の 検出または取得方法。
(68) 下記の [1]〜[： 3]の少なくとも 1つが染色体 DNAに組み込まれた、 エブス夕ィ ン · バー ·ウィルス (Epstain-Barr virus) の EBNA- 1遺伝子を発現する無血清馴 化した B細胞株由来の細胞株。
[1]誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するための DNAコンストラクト
[2]転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポー夕一遺伝子を連結し た DNAコンストラクト
[3]Gひ蛋白質またはキメラ Go:蛋白質を発現するための DNAコンストラクト
(69) 細胞株が、 無血清馴化 Namalwa細胞である、 （68) に記載の細胞株。
(70) 無血清馴化 Namalwa細胞が、 Najnalwa KJM-1細胞である、 （69) に記載の細 胞株。
(71)誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受容 体のリガンド結合領域のキヌラ蛋白質である、 （68) に記載の細胞株。
( 72 ) 転写因子の応答配列が、 cAMP応答配列（CRE)、 TPA応答配列（TM：)、 NFAT(nuclear factor of activated T cells)応答配列、 または血清応答配列 (SRE)である、 （68) に記載の細胞株。
(73) レポ一夕一遺伝子が、 ホタル .ルシフェラ一ゼ遺伝子、 ゥミシィタケ .ル シフェラーゼ遺伝子、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝 子、 ガラクトシダ一ゼ遺伝子、 ラク夕マーゼ遺伝子、 またはグリーン .フ ルォレツセント ·プロテイン遺伝子である、 （68) に記載の細胞株。
(74) Gひ蛋白質が、 Gひ 16、 Gひ 、 G q、 Ga21s G s, Gひ 、 Ga0、 Gひ z、 G« G ひ i3、 Gひ い GatN および Gひ 14からなる群より選ばれるの少なくとも 1つの Gひ 蛋白質である、 （68) に記載の細胞株。
(75) キメラ Ga蛋白質が、 下記の [1]〜 [20]からなる群より選ばれる少なくとも 1つのキメラ 蛋白質である、 （68) に記載の細胞株。
[l]G sの C末端 5アミノ酸を G qの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
[2]Go:s C末端 5アミノ酸を の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質
[3]Ga:s0C末端 5アミノ酸を Ga。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
[4]Gasの C末端 5アミノ酸を G z©C末端 5ァミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [5]Gひ 5の 末端 5アミノ酸を Ga12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 〔6]Gasの C末端 5アミノ酸を Ga13の C末端 5アミノ酸に置換したキヌラ Ga蛋白質 [7]G sの C末端 5アミノ酸を G gustの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [8]Gひ 3の0末端 5アミノ酸を G t©C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [9]Gひ S©C末端 5アミノ酸を Ga14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質 [10]Gひ 8の(末端 5アミノ酸を Ga16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [11]Gひ qの C末端 5アミノ酸を Gasの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [12]Gaqの C末端 5アミノ酸を Gひの。末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 [13]G«qの C末端 5アミノ酸を Gひ。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [14]Gaqの C末端 5アミノ酸を (}ひ2の 末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質 [15]Gaqの C末端 5アミノ酸を Gひ 12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質 [16]Gひ qの C末端 5アミノ酸を Gひ 13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質 [17]G"qの C末端 5アミノ酸を Gひ の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質 [18]G qの C末端 5アミノ酸を G tのC末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質 [19]Gひ qの C末端 5アミノ酸を Get 14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質 [20]Gaqの C末端 5アミノ酸を Ga16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質
(76) 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受容 体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプロ モーターが、 cAMP応答配列（CM)を有するプロモ一夕一であり、 レポーター遺伝子 が、 ホタル 'ルシフヱラ一ゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ 'ルシフヱラーゼ遺伝子 である、 （68) に記載の細胞株。
(77) 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受容 体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプロ モ一夕一が、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモ一夕一であり、 レポ一夕一遺伝子 が、 ホ夕ル ·ルシフェラーゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ .ルシフェラーゼ遺伝子 であり、 'キメラ 蛋白質が、 Gasの C末端 5アミノ酸を Gaqの C末端 5アミノ酸に置 換したキヌラ Gひ蛋白質または G S®C末端 5アミノ酸を & の(；末端 5アミノ酸に置 換したキメラ Get蛋白質である、 （68) に記載の細胞株。
(78) 下記 [1]〜[： 4]の工程を有する、 被検物質に反応するペプチドをコードする DNAの取得方法。 [1] (68) 〜 （77) のいずれか 1項に記載の細胞株に、 任意の cDNAまたは染色体由 来の DNAを導入して形質転換株を取得する
[2]導入した cDNAまたは染色体 DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の 存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
[3]導入した cDNAまたは染色体 DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の 非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
[4]上記 [2]と [3]の応答反応を比較し、 異なる応答反応を示す形質転換株を選択し、 該株に導入した MAを同定する
(79) 下記 [1：]〜 [7]の工程を有する、 被検物質に反応するペプチドをコードする DNAの取得方法。
[1]発現べクタ一を用いて作製した cDNAライブラリーを 1〜10000のクローンずつの プールに分ける
[2]各プールに由来する cDNAクローンの混合物を、 （68) 〜 （77) のいずれか 1項 に記載の細胞株に導入して形質転換株を取得する
[3]各プールごとに、 導入した cDNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の 存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
[4]各プールごとに、 導入した cDNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の 非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
[5]上記 [3]と [4]の応答反応を比較し、 異なる応答反応を示すプールを選択し、 選 択したプールを [1]よりも細かいプールに分ける
[6] [2]〜(： 5]の操作をプールが 1クロ一ンごとになるまで繰り返す
[7]被検物質の存在下と非存在下で異なる応答反応を示す形質転換株を同定し、 該 株に導入した DNAを同定する
(80) 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+上 昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産 生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c-fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポ一夕一遺伝子の発現量、 およびマーカー遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 （78) または （79) に記載の DNAの取得方法。
(81) 被検物質が、 （27) 〜 （35) のいずれか 1項に記載の細胞株を培養するこ とにより得られる被検物質である、 （78) または （79) に記載の DNAの取得方法。
(82) SV40の温度感受性変異株のラ一ジ T抗原の活性を抑制または消失させる温度 で培養を行うことを特徴とする、 （78) 〜 （81) のいずれか 1項に記載の MAの取 得方法。
(83) 下記 [1]〜 ]の工程を有する、 ペプチドをコードする DNAの取得方法。
[1] (68) 〜 （77) のいずれか 1項に記載の細胞株から選ばれる、 転写因子の応答 配列を有するプロモ一夕一の下流にレポ一夕一遺伝子を連結した DNAコンストラク トが染色体 DNAに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
[2]該宿主細胞に、 任意の cDNAまたは染色体由来の DNAを導入して形質転換株を取 得する
[3]上記 [2]で取得された形質転換株において、 導入した cDNAまたは MAを発現させ たときの、 レポ一夕一遺伝子の発現量を測定する
[4]宿主細胞における、 あるいは上記 [2]で取得された形質転換株において、 導入 した cDNAまたは DNAを発現させていないときの、 レポ一夕—遺伝子の発現量を測定 する
[5]上記 [3]と [4]のレポ一夕一遺伝子の発現量を比較し、 異なるレポ一夕一遺伝子 の発現量を示す形質転換株を選択し、 該株に導入した DNAを同定する
(84) 下記 [1]〜[8]の工程を有する、 ペプチドをコードする DNAの取得方法。
[1]誘導発現ベクターを用いて作製した cDNAライブラリ一を 1〜； L0000のクローンず つのプールに分ける
[2] (68) 〜 （77) のいずれか 1項に記載の細胞株から選ばれる、 転写因子の応答 配列を有するプロモー夕一の下流にレポ一夕一遺伝子を連結した DNAコンストラク トが染色体 DNAに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
[3]上記 [1]で分けた、 各プールに由来する cDNAクローンの混合物を、 上記 [2]で取 得した宿主細胞に導入して、 各プールごとに形質転換株を取得する
[4]上記 [3]の各プールごとの形質転換株において、 導入した cDNAを発現させたと きの、 レポ一夕一遺伝子の発現量を測定する
[5]上記 [3]の各プールごとの形質転換株において、 導入した cDNAを発現させない ときの、 レポーター遺伝子の発現量を測定する
[6]上記 [4]および [5]のレポ一夕一遺伝子の発現量をプールごとに比較し、 [4]の レポーター遺伝子の発現量の多いプールの形質転換株を選択し、 選択したプール を [1]よりも細かいプールに分ける
[7]上記 [2]〜[6]の操作をプールが 1クローンごとになるまで繰り返す
[8]導入した cDNAを、 発現させないときよりも発現させたときのレポ一夕一遺伝子 の発現量の多い形質転換株を同定し、 該株に導入した MAを同定する
(85) ペプチドが、 受容体、 転写因子、 シグナル伝達分子、 または酵素である、 (78)、 (79)、 (83) または （84) に記載の DNAの取得方法。
(86) 受容体が G蛋白質共役型受容体である、 （85) に記載の MAの取得方法。
(87) 受容体が構成活性型の G蛋白質共役型受容体である、 （85) に記載の DNAの 取得方法。
(88) G蛋白質共役型受容体がォーファン G蛋白質共役型受容体である、 （86) ま たは （87) に記載の DNAの取得方法。
(89) ペプチドが、 転写因子の応答配列を有するプロモー夕一の活性を増加させ る活性を有する転写因子、 シグナル伝達分子、 または酵素である、 （78)、 (79 )、 (83) または （84) に記載の DNAの取得方法。
(90) cDNAが変異 G蛋白質共役型受容体をコードするランダム変異導入 cDNA、 ぺプ チドが構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体あることを特徴とする、 （78)、 (79 )、 (83) または （84) に記載の DNAの取得方法。
(91) ランダム変異を導入する部位が、 G蛋白質共役型受容体の第 3膜貫通領域の 後半から第 2細胞内領域の前半部分あるいは第 3細胞内領域の後半から第 6膜貫通領 域の前半部分であることを特徴とする、 （90) に記載の DNAの取得方法。
(92) ランダム変異を導入する部位が、 G蛋白質共役型受容体における保存アミノ 酸残基の一つである第 6膜貫通領域中に存在するプロリン残基もしくは該プロリン 残基に相応するアミノ酸残基より N末側に 20残基目または 22残基目のアミノ酸であ ることを特徴とする、 （90) または （91) に記載の DNAの取得方法。
(93) (90) 〜 （92) のいずれか 1項に記載の方法を用いて取得される構成活性 型変異 G蛋白質共役型受容体。
(94) G蛋白質共役型受容体における保存アミノ酸残基の一つである第 6膜貫通領 域中に存在するプロリン残基もしくは該プロリン残基に相応するアミノ酸残基よ り N末側に 20残基目または 22残基目のアミノ酸に変異を有する構成活性型変異 G蛋 白質共役型受容体。
(95) 0GR1の N末端より 221番目のセリンをァスパラギンに置換した構成活性型変 異 G蛋白質共役型受容体、 0GR1の N末端より 118番目のァスパラギン酸をァラニンに 置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 0GMの N末端より 118番目のァスパ ラギン酸をァラニンに、 かつ 221番目のセリンをァスパラギンに置換した構成活性 型変異 G蛋白質共役型受容体、 RE2の N末端より 124番目のァスパラギン酸をァラニ ンに置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 GPR35の N末端より 113番目の ァスパラギン酸をァラニンに置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 GPCR25の N末端より 111番目のァスパラギン酸をァラニンに置換した構成活性型変 異 G蛋白質共役型受容体、 PGM0334の N末端より 135番目のグル夕ミン酸をフエニル ァラニン、 グルタミンまたはァラニンに置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受 容体、 PGM0334の N末端より 259番目のァスパラギン酸をセリンに置換した構成活性 型変異 G蛋白質共役型受容体、 GPR43の N末端より 217番目のアルギニンをプロリン に置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 および GPR43の N末端より 217番 目のアルギニンをプロリンに、 かつ 106番目のグル夕ミン酸をァスパラギン酸に置 換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体からなる群より選ばれる構成活性型変 異 G蛋白質共役型受容体。
( 96 ) 1型メラノコルチン受容体 （MC1R) および、 proadrenomedullin N-20 terminal peptide (PAMP)または PAMPの N末端から 9〜20番目のアミノ酸残基からな るペプチドを用いた、 MC1Rのアン夕ゴニストの探索法または取得法。
(97) ォーファン G蛋白質共役型受容体 GPR43および、 酢酸、 プロピオン酸、 酢酸 塩、 またはプロピオン酸塩を用いた、 GPR43のアン夕ゴニストの探索法または取得 法。
(98) ォーファン G蛋白質共役型受容体 GPR41および、 シクロプロパンカルボン酸、 プロピオン酸、 シクロプロパンカルボン酸塩、 またはプロピオン酸塩を用いた、 GP 1のアン夕ゴニス卜の探索法または取得法。
(99) ォーファン G蛋白質共役型受容体 GlOdおよび、 ひ-メラノサイト刺激ホルモ ンまたは副腎皮質刺激ホルモンを用いだ、 GlOdのアン夕ゴニス卜の探索法または 取得法。
(100) 下記 [1]〜[4]の工程を有する、 G蛋白質共役型受容体のァゴニストの取得 法。
[1] (68) 〜 (77) のいずれか 1項に記載の細胞株に、 任意の G蛋白質共役型受容 体をコードする DM導入して形質転換株を取得する
[2]導入した DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の存在下で該形質転 換株の応答反応を測定する
[3]導入した DMを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の非存在下で該形質 転換株の応答反応を測定する
[4]上記 [2]と [3]を比較し、 応答反応の変化を誘発する被検物質をァゴニストとし て取得する
(101) 下記 [1；！〜 [4]の工程を有する、 G蛋白質共役型受容体のアン夕ゴニストの 取得法。
[1] (68) 〜 （77) のいずれか 1項に記載の細胞株に、 任意の G蛋白質共役型受容 体をコードする MA導入して形質転換株を取得する
[2]導入した DNAを発現させた形質転換株を用いて、 該 G蛋白質共役型受容体のァゴ ニストの存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
[3]導入した DNAを発現させた形質転換株を用いて、 該 G蛋白質共役型受容体のァゴ ニストと被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
[4]ァゴニストに基づく該形質転換株の応答反応を消失させる被検物質をアン夕ゴ 二ストとして取得する
(102) 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+ 上昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C- fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポ一夕一遺伝子の発現量、 およびマーカ一遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 （100) または （101) に記載 の G蛋白質共役型受容体のァゴニストまたはアン夕ゴニストの取得法。
(103) 下記 [1：]〜 [5]の工程を有する、 G蛋白質共役型受容体のアン夕ゴニストま たはィンバ一スァゴニストの取得法。
[1] (68) 〜 （77) のいずれか 1項に記載の細胞株から選ばれる、 転写因子の応答 配列を有するプロモー夕一の下流にレポ一夕一遺伝子を連結した DNAコンストラク トが染色体 DNAに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する [2]該宿主細胞に、 任意の構成活性型 G蛋白質共役型受容体をコードする DNAを導入 して形質転換株を取得する
[3]被検物質の非存在下、 導入した DNAを発現させた形質転換株でのレポ一夕一遺 伝子の発現量を測定する
[4]被検物質の存在下、 導入した DNAを発現させた形質転換株でのレポ一夕一遺伝 子の発現量を測定する
[5]上記 [3]および [4]のレポ一夕一遺伝子の発現量を比較し、 レポ一夕一遺伝子の 発現量を低下させる被検物質を、 [2]の G蛋白質共役型受容体のアン夕ゴニストま たはィンバースァゴニストとして取得する
(104) 下記 [1]〜[： 4]の工程を有する、 転写因子、 シグナル伝達分子および酵素か らなる群より選ばれるぺプチドの活性化剤または阻害剤の取得法。
[1] (68)〜（77) のいずれか 1項に記載の細胞株に、 任意の転写因子、 シグナル 伝達分子および酵素からなる群より選ばれるぺプチドをコ一ドする DNAを導入して 形質転換株を取得する
[2]導入した DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の非存在下で該形質 転換株の応答反応を測定する
[3]導入した DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の存在下で該形質転 換株の応答反応を測定する
[4]上記 [2]と [3]を比較し、 応答反応を変動させる被検物質を、 該ペプチドの活性 化剤または阻害剤として取得する
(105) 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊籬、 細胞内 Ca2+ 上昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c-fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポ一夕一遺伝子の発現量、 およびマ一力一遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 （104) に記載の取得法。
(106) 宿主細胞として （68)〜（77) のいずれか 1項に記載の細胞株を、 ベクタ 一として任意のプロモーターとェプスタイン 'バー 'ウィルス （Epstain- Barr virus) の oriPを有する発現ベクターを用いることを特徴とする、 宿主 .ベクター 系。
(107) 任意のプロモ一夕一が Gal4p応答性の誘導発現プロモー夕一である、 （106 ) に記載の宿主 -ベクター系。
(108) 発現べクタ一が、 pAMo、 pAMo-nds pAMo-ds pAGal9- nd、 または pAGal9- dで あることを特徴とする、 （106) または （107) に記載の宿主 'ベクター系。
本明細書において、 ぺプチドとは 2つ以上のアミノ酸がべプチド結合で連結した 物質を意味し、 ポリペプチド、 オリゴペプチドを包含する。
[I] 活性べプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系および活性ぺプチドの効率 的な生産系の構築
活性べプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系および活性ぺプチドの効率的 な生産系は以下のようにして構築することができる。
1.内分泌細胞由来の株化細胞の取得
活性べプチドの前駆体からのプロセシング様式やプロセシング後の修飾は、 各 ぺプチドによって異なり多様である。 MIN6等の既存の内分泌細胞株を宿主として 利用することもできるが、 活性べプチドの前駆体遺伝子を宿主細胞に導入して、 活性べプチドを効率的に生産させたり、 発現したぺプチドの活性を指標に該前駆 体遺伝子をクロ一ニングするためには、 多種類の内分泌細胞株を取得し、 その中 から該活性べプチドに適したプロセシング酵素や修飾酵素を発現している細胞を 選択して宿主として利用するのが望ましい。 内分泌細胞株は下記方法により樹立 することができる。
(1) 内分泌細胞由来の株化細胞の樹立
本発明の内分泌細胞由来の株化細胞は、 癌遺伝子を導入した非ヒト · トランス ジエニック動物由来の内分泌細胞を含有する組織から細胞を単離し、 培養するこ とにより樹立することができる。
非ヒト ' トランスジエニック動物として、 トランスジエニックマウス、 トラン スジエニックラヅト、 トランスジエニックブタ、 トランスジエニックゥサギ等を あげることができる。
癌遺伝子としては、 SV40、 アデノウイルス等ウィルス由来の癌遺伝子をあげる ことができ、 例えば、 SV40のラージ T抗原遺伝子、 アデノウイルスの E1A、 E1B等を あげることができる。 具体的には、 温度感受性変異株 SV40tsA58由来のラージ T抗 原遗伝子、 アデノウイルス 2とアデノウイルス 5のハイブリッドの E1A 12S等をあげ ることができる。 優良な株化細胞を樹立するためには SV40tsA58のラ一ジ T抗原遺 伝子を用いることが好ましい。 癌遺伝子を内分泌細胞で発現させるためには、 癌 遺伝子産物をコ一ドする領域の上流に内分泌細胞で働く適当なプロモー夕一が存 在することが必要である。 プロモーターとしては、 ウィルス由来の癌遺伝子自体 の内在性のプロモー夕一、 内分泌細胞で発現する動物由来の遺伝子のプロモー夕
—等を用いることもできる。 例えば、 SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子の内在性プ ロモ一夕一、 H-2Kbクラス Iプロモーター等を用いることができる。
SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジエニックマウスは、 特開 平 05- 292958、 Jpn. J. Cancer Res. , 82, 1344 (1991 )、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 88, 5096 (1991 )に記載の方法により、 作製することができる。 また SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジェニヅクラットは特開 2000 - 228930または Exp. Anim. , 48, 255 (1999 )に記載の方法により作製することがで きる。 具体的には、 SV40tsA58の全ゲノム DNAを制限酵素 HIで開環してプラスミ ド BR322に揷入したプラスミ ド SVtsA58ori(-)-2 〔 Cytotechnology 7, 165 (1991 )〕 を制限酵素 ¾Πで切断してベクタ一部位を除去することによって、 SV40tsA58のラージ Τ抗原遺伝子を含む DNA (5, 240 bp)を調製する。 該 DNAには SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子のプロモ一夕一が内在するため、 該 MAを導入され た体細胞において SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子が発現することになる。 ラヅト の全能性細胞である前核期受精卵の雄性前核に、 上記の SV40tsA58のラージ T抗原 遺伝子を含む DNAをマイクロインジェクションして得られる卵子を仮親の卵管に移 植して産仔を得た後、 注入した該遺伝子を持つ産仔を選出し、 安定的に該遺伝子 が組み込まれた個体を得ることで、 個体発生時に SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子 が各組織の細胞の染色体に組み込まれたトランスジエニックラットを効率よく作 出することができる。
癌遺伝子を導入した非ヒト · トランスジエニック動物由来の内分泌細胞を含有 する組織から細胞を単離する方法としては、 公知の方法を用いることができる。 例えば、 視床下部由来の細胞は、 J. Pharmacol . Toxicol . Method. 36, 45-52 (1996)等に記載の酵素法により、 ランゲルハンス氏島細胞は、 Diabetes, 46, 1755 (1997)等に記載の方法により、 単離することができる。
単離した細胞の培養は、 通常の動物細胞の培養方法に準じて実施することがで きる。 該細胞を培養するための培地として、 一般に使用されている RPMI1640培地 . Am. Med. Assoc. , 199, 519 (1967)〕 、 Eagleの MEM培地 〔 Science, 122, 501 (1952)〕、 ダルべヅコ変法イーグル培地 （DMEM培地） CVirology, 8, 396 ( 1959) 〕、 199培地〔Proc. Soc. Exp. Biol . Med. , 73, 1 ( 1950)〕、 またはこれら培地 に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 pH6〜8、 30~40°Cs 5 %C02存在下等の条件下で;!〜 7日間行う。 温 度感受性変異株 SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジヱニック動 物由来の細胞を増殖させるためには、 温度感受性のラージ T抗原変異体の活性を阻 害しない温度 （30〜33°C、 好ましくは 33°C) で培養することが好ましい。
また培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に添 加してもよい。
2〜3ヶ月間細胞を継代することにより、 不死化した細胞を取得することができ ο
上記方法により、 視床下部由来細胞株、 ランゲルハンス氏島由来細胞株等、 内 分泌細胞由来の細胞株を多数取得することができる。
視床下部、 ランゲルハンス氏島等の内分泌組織には異なる多種類の細胞が存在 するが、 上記方法により、 多種類の不死化細胞株を取得することができる。
特に、 温度感受性変異株 SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジ ヱニック動物 (Exp. Anim. 48, 255 (1999)〕 の内分泌細胞より、 極めて効率的に、 しかも再現良く多種類の不死化細胞株を多数取得することができることを、 本発 明において初めて見出した。
取得した細胞株の混合物は、 通常の動物細胞の凍結保存法に準じて凍結保存す ることが可能であり、 必要な時に細胞を起して各種の解析や実験に使用すること ができる。
上記で取得した細胞株の混合物を、 コロニー形成法 Endocrinology 136, 4084 (1995)〕等の常法に準じて、 シングルクローン化することにより個々の細胞株と して単離することができる。
上記方法で取得される細胞株として、 下記実施例で取得された視床下部由来の 798個のシングルクローン （第 2表〜表 5- 2表に示したクロ一ンを含む） 、 ランゲル ハンス氏鳥由来の 261個のシングルクローン - 1~R- 45、 M-1〜M- 63、 F- 1〜F- 9、 D- 1〜！) - 72、 D2-1〜！ )2- 72) 等をあげることができる。 これら細胞株と同等の性質 を有する細胞株は、 上記本発明の方法により再現良く取得することができる。
(2) 内分泌細胞株の選択
上記 （1) で取得した多種類の不死化細胞株について、 内分泌細胞で発現してい ることが知られている各種のプロセシング酵素や修飾酵素の遺伝子の発現や、 該 遺伝子産物の発現を調べることにより、 目的とする活性べプチドの発現に適した 内分泌細胞を選択することができる。
例えば、 視床下部由来細胞株ゃランゲルハンス氏島細胞株由来の細胞に関して は、 プロホルモンコンペルターゼ （Pl/P3、 PC2、 furin、 PC4、 PACE4、 PC5/PC6、 PC7/SPC7/LPC/PC8) 、 カルボキシぺプチダーゼ E (CPE) 、 あるいはぺプチジルグ リシンひ-アミディティングモノォキシゲナ一ゼ （PAM) 等の遺伝子の発現や、 該 遺伝子産物の発現を調べることにより目的に適した内分泌細胞株を選択できる。 また、 上記の細胞株について、 内分泌細胞で発現している活性ペプチド （例え ば、 インスリン、 グルカゴン、 ソマトス夕チン、 滕ポリペプチドなど） の発現を 調べることにより、 目的とする活性べプチドの発現に適した内分泌細胞を選択す ることもできる。
さらに、 上記の細胞株に、 下記 3.に記載した方法に準じて、 任意の活性べプチ ド前駆体遺伝子を導入し、 活性型のぺプチドが生産されるか調べることにより、 任意の活性べプチドの発現に適した内分泌細胞株を選択することもできる。
各種遺伝子の発現を調べる方法としては、 RT- PCR法やノーザンブロット法をあ げることができる。 各種遺伝子産物の発現あるいは活性ぺプチドの生産を調べる 方法としては、 各種抗体を用いた細胞染色やウエスタンブロットをあげることが できる。
上記のようにして取得した内分泌細胞株は、 多様な活性べプチドを探索するた めのぺプチドソ一ス、 cDNAソースとしても極めて有用である。
(3) 不死化細胞株のキヤラク夕ライゼ一シヨン
上記 （1) で取得した多種の不死化細胞株、 および上記 （2) で選択した内分泌 細胞株のキャラクタライゼ一シヨンは、 該細胞株が由来する組織の細胞で発現す ることが知られている遺伝子ゃ該遺伝子産物の発現を調べることにより行うこと ができる。 例えば、 視床下部由来の細胞株においては、 レブチン受容体遺伝子、 プレブ口 ォピオメラノコルチン遺伝子、 CMT遺伝子、 プレブロアグーチ関連ペプチド遺伝 子、 プレプロニュ一ロメディン U遺伝子、 RFIIPプレプロ蛋白質遺伝子、 プレブロコ ルチコトロピン放出ホルモン遺伝子、 プレブ口メラニン凝集ホルモン遺伝子、 プ レプロォレキシン遺伝子、 プレプログレリン遺伝子、 プレブ口サイロトロビン放 出ホルモン遺伝子、 プレブロニュ一口ペプチド FF遺伝子、 MC4R遺伝子、 NPY1R遺伝 子、 NPY5R遺伝子、 NMU2R遺伝子、 BJ P受容体遺伝子、 CEHR- 1遺伝子、 CRHR- 2遺伝 子、 MCIffil遺伝子、 グレリン受容体遺伝子、 NPFF2遺伝子等の発現を調べることに より、 キャラクタライゼ一シヨンを行うことができる。
ランゲルハンス氏島由来の細胞株においては、 プレブ口インスリン遺伝子、 プ レプログルカゴン遺伝子、 プレブロソマトス夕チン遺伝子、 プレプロ脬ポリぺプ チド遺伝子、 プロホルモンコンベルタ一ゼ 1 (PC1) 遺伝子、 プロホルモンコンペ ルターゼ 2 (PC2) 遺伝子、 グルカゴン様ペプチド- 1 (6LP-1) 受容体遺伝子、 PDX1 ancreatic-duodeim丄 homeobox 1) 遺伝子、 Pax4遺伝子、 Pax6遺伝子、 ニュー ロジヱニン 3遺伝子、 ニューロ!)遺伝子、 Nkx2.2遺伝子、 Nkx6.1遺伝子、 グルコキ ナーゼ遺伝子、 2型グルコーストランスポー夕一遺伝子等の発現を調べることによ り、 キャラクタライゼーシヨンを行うことができる 〔Adv. Pharmacol . , 47, 255 (2000)〕。
各種遺伝子の発現および各種遺伝子産物の発現は下記 2.の方法に準じて行うこ とができる。
また、 上記細胞株のキャラクタライゼーシヨンは、 該細胞株が由来する組織の 細胞で発現することが知られている受容体に対するリガンド、 ァゴニスト、 ある いはアンタゴニストへの反応性を調べることにより行うこともできる。 具体例を 以下に示す。
〔レブチン受容体〕
細胞をレブチンで刺激後、 抗 STAT抗体 （NEB社製） または抗リン酸化 STAT抗体を 用いた細胞染色またはウエスタンプロットを行うことにより、 あるいは、 c-fos遺 伝子や S0CS- 3遺伝子の発現変動を調べることにより、 機能的なレブチン受容体 （ 0b-Rb) が細胞に発現しているか調べることができる。 また、 STATレポ一夕一を利 用してレポーター遺伝子の発現変動を調べることにより、 該レプチン受容体が機 能を有しているか確認できる。
(ciliary neurotrophic factor (CNTF) 受容体〕
細胞を CNTFで刺激後、 抗 STAT抗体または抗リン酸化 STAT抗体を用いた細胞染色 やウエスタンプロヅトを行うことにより、 機能的な CNTF受容体が細胞に発現して いるか調べることができる。
〔G«q蛋白質、 G u蛋白質、 Ga15蛋白質、 または G 16蛋白質に共役する GPCR〕 細胞をリガンドゃァゴニストで刺激後、 細胞内 Ca2+量が増加するか調べることに より、 機能的な受容体が細胞に発現しているか調べることができる。
Ca2+量の増加あるいはプロティンキナーゼ Cの活性化で発現が増加するレポ一夕 一遺伝子をあらかじめ細胞に導入しておくことにより、 レポ一夕一遺伝子の発現 を調べることにより、 機能的な受容体が細胞に発現しているか調べることができ る。
このような受容体として、 視床下部由来の細胞株においては、 1型 MU受容体 ( NMU1R) 、 2型 NMU受容体 （NMU2R) 、 グレリン受容体、 1型ォレキシン受容体 （0X1R )、 2型ォレキシン受容体 (0X2R)、 1型アンジォテンシン I I受容体等を、 ランゲ ルハンス氏島由来の細胞株においては、 P2Yi受容体等あげることができる。
〔G s蛋白質に共役する GPCR〕
細胞をリガンドゃァゴニス卜で刺激後、 細胞内 cAMP量が増加するか調べること により、 機能的な受容体が細胞に発現しているか調べることができる。
cAMP量の増加で発現が増加するレポ一夕一遺伝子をあらかじめ細胞に導入して おくことにより、 細胞内 cAMP量の増加をレポ一夕一遺伝子の発現で調べることも できる。
このような受容体として、 視床下部由来の細胞株においては、 4型メラノコルチ ン受容体 (MG4R) 、 1型 CRH受容体 (CRHR-1)、 2型 CRH受容体 （CRHR- 2) 、 ガラニ ン受容体、 GLP- 1受容体、 GLP- 2受容体等を、 ランゲルハンス氏島由来の細胞株に おいては、 GLP- 1受容体等をあげることができる。
〔G i蛋白質に共役する GPCI0
細胞をフオルスコリン単独で刺激した場合と、 フオルスコリンおよびリガンド (またはァゴニスト） で刺激した場合の細胞内の cAMP量を比較し、 後者において 細胞内 cAMP量の増加が減少することを調べることにより、 機能的な受容体が細胞 に発現していることを調べることができる。
cAMP量の増加で発現が増加するレポーター遺伝子をあらかじめ細胞に導入して おくことにより、 細胞内 cAMP量の増加をレポーター遺伝子の発現で調べることも できる。
このような受容体としては、 視床下部由来の細胞株においては、 1型 NPY受容体 (NPY1R)、 5型 NPY受容体 （NPY5R) 、 RFRP受容体、 2型 NPFF受容体 （NPFF2R) 等を、 ランゲルハンス氏島由来の細胞株においては、 5種 （1〜5型） のソマトス夕チン受 容体等あげることができる。
〔スルホニルゥレア受容体〕
細胞をスルホニルゥレアで刺激後、 細胞内 Ca2+量が増加するか調べることにより、 機能的な受容体が細胞に発現しているか調べることができる。
Ca2+量の増加で発現が増加するレポーター遺伝子をあらかじめ細胞に導入してお くことにより、 細胞内 Ca2+量の増加をレポーター遺伝子の発現で調べることもでき る。
〔インスリン受容体〕
細胞をィンスリンで刺激後、 ィンスリン受容体のリン酸化、 insulin receptor substrate 1 ( IRS-l)あるいは IRS- 2のリン酸化を調べることにより、 機能的なィ ンスリン受容体が細胞に発現しているかどうかを調べることができる。
〔グルコーストランスポーター〕
細胞を高濃度 （15〜30顧 ol/L) のグルコースで刺激後、 細胞内の Ca2+濃度が上昇 するか調べることにより、 機能的なグルコーストランスポー夕一が細胞に発現し ているか調べることができる。 細胞の膜電位を測定することによつても調べるこ とができる。
ランゲルハンス氏島には、 ^細胞のように、 高濃度 （15〜30雇 ol/L) のグルコ —スに反応して細胞が活性化 （例えば細胞内 Ca2+濃度が上昇） し、 インスリンの合 成や分泌が促進される細胞が存在する。 従って、 ランゲルハンス氏島由来の細胞 株については、 グルコース反応性を調べることによつても、 各細胞株のキャラク 夕ライゼ一シヨンを行うことができる。
また、 α細胞のマ一力一として利用できるグルカゴン、 ?細胞のマーカーとし て利用できるィンスリン、 （5細胞のマ一力一として利用できるソマトス夕チン、 ァ細胞のマ一カーとして利用できる膝ポリべプチド、 多能性幹細胞のマーカーと して利用できるネスチン 〔Diabetes, 50, 521 (2001 )〕 の発現を調べることによ り、 キャラクタライゼーシヨンを行うこともできる。
(4) 不死化細胞株の分化形質の制御
上記 1. (1) で取得した不死化細胞株を異なる条件下で培養することにより、 該 細胞株の分化形質を制御することができる。 また、 分化形質を変化させた細胞株 に関して、 上記 （2) または （3) に示した方法を用いて、 内分泌細胞株の選択ま たは不死化細胞株のキャラクタライゼーシヨンを行うことができる。
分化形質を制御するための培養方法として、 例えば、 以下 （a) 〜 （h) に記載 する培養方法およびこれらの方法を組み合わせた培養方法をあげることができる。
(a) 上記不死化細胞株の取得の際に使用した癌遺伝子の発現や癌遺伝子産物の活 性を阻害しなレ、条件で培養する。
例えば、 SV40ラージ T抗原の温度感受性変異体を発現する不死化細胞株において は、 該変異体の活性を阻害しない温度 （30〜33°C、 好ましくは 33°C) で培養する ことにより、 分化形質を制御し、 該細胞株を増殖させることができる。
分化形質を誘導したいときには、 該癌遺伝子の発現や癌遺伝子産物の活性を阻 害する条件で培養すればよい。 即ち、 SV40ラージ T抗原の温度感受性変異体を発現 する不死化細胞株では、 37〜39°C、 好ましくは 37°Cで培養すればよい。
(b) 無血清培地、 2%以下の血清を含む培地、 または無血清培地に低濃度 （1%) の N- 2サプリメント （GIBC0社製） を添加した培地で培養する。
下記 の活性測定法において、 血清が存在するとバックダラゥンドのレポー夕 一活性が上昇する場合があるため、 このように無血清または低血清の培地を用い た培養法は、 活性ぺプチドの活性測定が必要な場合には好ましい培養法である。
(c) 上記不死化細胞株で発現している受容体、 トランスポー夕一またはチャネル のリガンド、 ァゴニストまたはアン夕ゴニスト、 あるいは該トランスポー夕一ま たはチャネルの基質を添加して培養する。
受容体として、 例えば、 視床下部由来の宿主細胞株においては、 GPCR (GLP- 1受 容体等） 、 核内受容体、 増殖因子受容体、 またはレブチン受容体等を、 ランゲル ハンス氏島由来細胞株においては、 GPCR (GLP- 1受容体等） 、 核内受容体、 増殖因 子受容体 （インスリン受容体等） 、 サイトカイン受容体 （ァクチビン A受容体等） 、 スルホニルゥレア受容体等をあげることができる。
トランスポー夕一としてはグルコーストランスポーターをあげることができる ( チャネルとしては Caチャネル、 Kチャネル、 C1チャネル、 Naチャネル等をあげる ことができる。
例えば、 5〜30腿 ol/Lのグルコースを添加して培養することにより、 細胞の分化 形質や遺伝子の発現を制御して培養することができる。
(d) 上記不死化細胞株で発現している受容体のシグナルを代替することのできる 物質を添加して培養する。
受容体のシグナルを代替することのできる物質として、 例えば、 プロテインキ ナ一ゼ 、 プロテインキナーゼ プロテインキナーゼ MAPキナーゼ等のプロテ インキナーゼ、 低分子量 G蛋白質を活性化または抑制する物質、 G蛋白質共役型受 容体のシグナルを代替することのできるフォルスコリン、 8-ブロモ -サイクリック AMP ( 8-Br-cAMP ) 、 3-イソブチル -1-メチルキサンチン （ 3- isobutyl - 1 - methylxanthine) 、 ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート （PMA) 、 およびィ オノマイシン等をあげることができる。
(e) 神経細胞ゃグリァ細胞の分化を制御する培養法で培養する。
該培養法として、 ラミニンをコートしたディヅシュ上で培養する方法、 スクシ ニル化コンカナバリン A (succinylated concanavalin A) を添加して培養する方 法 〔J. NeurobioL , 39, 1, (1999)} 等をあげることができ、 視床下部由来の細 胞株の培養に適している。
(f) ランゲルハンス氏島細胞の分化を制御する培養法で培養する。
該培養法として、 ゼラチンをコートしたディッシュ上で培養する方法 〔 Diabetes, 48, 1402 ( 1999)〕、 ァクチビン、 GLP- 1、 フォリス夕チン、 グルコ一 ス、 肝細胞増殖因子 (hepatocyte growth factor) 、 上皮増殖因子 ( epidermal growth factor) 、 ニコチンアミド、 ぺ一夕セルリン、 副甲状腺ホルモン関連ぺプ チド （parathyroid hormone- related protein) 、 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモ ン ( thyrotropin - releasing hormone ) 、 血管内皮増殖因子 ( vascular endotnelial growth factor) 、 islet neogenesis - associated protein、 血小板 由来増殖因子 (platelet-derived growth factor) 、 インシュリン様増殖因子 I ( insulin-like growth factor I ) 、 繊維芽細胞増殖因子 ( f ibloblast growth factor) 、 神経成長因子 (nerve growth factor) 、 あるいは Reg蛋白質を添加し て培養する方法 〔最新医学， 54, 2522 ( 1999 ) ; Nat. Med. 6, 278 (2000 ) ; Eur. J. Biochem. , 267, 971 (2000) ; J. Biol . Chem. 274, 6360 ( 1999) ; Int. J. Mol . Med. , 3, 247 ( 1999)〕 等をあげることができ、 ランゲルハンス氏島由来の 細胞株の培養に適している。
(g) 上記不死化細胞株で発現している受容体のリガンドゃアン夕ゴニストを発現 している細胞と共培養する。
(h) 上記不死化細胞株で発現している受容体の細胞内シグナル伝達に関与してい るシグナル伝達分子または転写因子の遺伝子、 あるいは、 該不死化細胞株の分化 や機能発現に重要な転写因子の遺伝子を導入、 発現させて培養する。
転写因子遺伝子として、 例えば、 視床下部細胞由来の細胞株においては、 Gsh-1 遺伝子を、 ランゲルハンス氏島由来の細胞株においては、 PDX1遺伝子、 Pax4遺伝 子、 Pax6遺伝子、 ニューロジェニン 3遺伝子、 ニューロ D遺伝子、 Nkx2.2遺伝子、 Nkx6.1遺伝子、 Isト 1遺伝子、 upstream stimulatory factor遺伝子等をあげるこ とができる CAdv. Pharmacol. , 47, 255 (2000) ; Biochem. J.， 341, 315 ( 1999) 〕 。 また、 上記の受容体、 シグナル伝達分子、 または転写因子の構成活性型変異 体やドミナントネガティブ変異体の遺伝子を導入、 発現させてもよい。 遺伝子導 入は下記 3.の方法に準じて行うことができる。
2.活性べプチド前駆体遺伝子の取得
活性べプチド前駆体遺伝子としては、 活性べプチド前駆体をコードする DNAであ ればいかなるものも用いることができる。 活性べプチド前駆体をコードする DNAは 以下のようにして取得できる。 活性べプチド前駆体の cDNAの塩基配列を元にして、 該活性ぺプチド前駆体をコードする領域を含む該 cDNAの領域を適当に選択する。 選択した領域の塩基配列の 5'端 20〜40塩基の配列を 3'端に含む DNA、 選択した領域 の塩基配列の 3'端 20〜40塩基と相補的な配列を 3'端に含む DNAをそれぞれ DNA合成 機で合成する。 該活性ぺプチドが発現している組織や細胞から cDNAを調製する。 調製した cDNAを錶型とし、 2種類の合成 DNAをブライマ一として用いた PCRにより該 活性べプチド前駆体をコードする DNAを増幅し単離することができる。 組織や細胞 からの cDNAの調製、 および PCRは Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001 ) (以下、 モレキュラー ·クロ 一二ング第 3版と称する） に記載の方法に従って行うことができる。
また、 該活性べプチド前駆体遺伝子内の活性ぺプチドをコ一ドする領域を任意 のぺプチドをコ一ドする MAで置き換えることにより、 以下の 3.および 5.に記載の 方法を用いて、 任意のペプチドを発現し生産することができる。 また、 上記の方 法で任意のぺプチドをコ一ドする DNAとして、 ランダムな配列を有する複数の MA の混合物を用いることにより、 ランダムぺプチドライブラリ一を作製することも できる。
3.活性べプチド前駆体遺伝子の発現べク夕一の造成と宿主への導入
遺伝子発現用の宿生細胞として上記 1.で選択した内分泌細胞株を使用し、 活性 ぺプチド前駆体遺伝子を適切な発現べクタ一のプロモーター下に挿入した組換え 体べクタ—を造成し、 該ベクタ一を該宿主細胞に導入することにより、 活性ぺプ チド前駆体遺伝子の発現系を構築することができる。
(1) プラスミドベクタ一を用いた遺伝子の導入
活性べプチド前駆体遺伝子を発現するためのプラスミドぺク夕一に必要な構成 要素として、 発現させる外来遺伝子用の発現ユニット （プロモーターの下流に目 的の活性べプチド前駆体をコ一ドする DNAを挿入できる制限酵素サイトとポリ A付 加シグナルを順に連結した構造） を有するプラスミドがあげられる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で機能するものであればいずれも用いるこ とができ、 例えば、 ヒトサイトメガロウィルス （CMV) の IE ( immediate early) 遺伝子のプロモーター、 SV40の初期プロモーター、 モロニ一マウス白血病ウィル スのロング.ターミナル . リピート （LTR) プロモーター、 ラウス肉腫ウィルスの LTRプロモ一夕一、 単純へルぺスウィルス （HSV) のチミジンキナーゼ （TK) 遺伝 子のプロモーター、 レトロウイルスのプロモー夕一、 ヒートショックプロモー夕 ―、 SRひプロモーター、 メタ口チォネインのプロモーター等をあげることができ る。 また、 6. (2) に後述する特定の転写因子に応答する配列を有するプロモ一夕 —も用いることができる。 上記プロモーターと共に、 ヒト C Vの IE遺伝子のェンハ ンサ一等も用いることができる。 また、 プロモーターとしては、 動物細胞中で、 特定の転写因子に反応し機能するプロモ一夕一も用いることができる。
を発現することのできる動物細胞あるいは、 該転写因子を ように該転写因子の発現ブラスミドを導入した動物細胞を
Figure imgf000042_0001
利用する必要がある。
このようなプロモーターとして、 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 由来の転 写因子 Gal4pに応答するプロモ一夕一等をあげることができる。
Gal4pに応答するプロモー夕一は、 GaUpのみならず、 Gal4pの DNA結合領域と任 意の転写因子の転写活性化領域のキメラ蛋白質にも反応する。
転写因子の転写活性化領域としては、 helpes simplex virusの VP16の転写活性 化領域 （transactivation domain) (Nature, 335, 563 (1988)〕 、 エストロジェ ン受容体のリガンド結合領域〔Cell， 54, 199 (1988) ; Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A. , 90, 1657 (1993)〕 をあげることができる。 エストロジェン受容体のリガ ンド結合領域を利用する場合、 エストロジェンを細胞に添加することにより転写 を開始させることができる。
ポリ A付加シグナルとしては、 いかなるポリ A付加シグナルも利用できるが、 例 えば、 S V40初期遺伝子のポリ A付加シグナル、 ゥサギ ?グロビン遺伝子のポリ A 付加シグナル、 ゥシ成長ホルモンのポリ A付加シグナル等を用いることができる。 宿主に導入した発現プラスミドのコピー数を増加させるため、 あるいは宿主に 導入した発現プラスミドをプラスミ ド状態で維持させるためには、 動物細胞での 複製に必要な複製開始点を有するプラスミドベクタ一を使用する。 複製開始点と しては、 SV40の複製開始点やェプスタイン ·バ一 · ウィルスの複製開始点 oriPを 用いることができる。 SV40の複製開始点を有するプラスミドベクタ一は、 SV40の ラージ T抗原を発現する宿主中ではコピー数が増加するため、 目的の遺伝子を高発 現させる上で好適である。 上記 1.で取得した SV40の温度感受性ラ一ジ T抗原を発現 する不死化細胞株に関しては、 該ラージ T抗原が機能する条件下で培養された細胞 株中においては、 SV40の複製開始点を有するプラスミドベクタ一を用いることで、 目的の遺伝子を高発現することができる。 oriPを含むベクタ一は、 ェプス夕イン •ノ 一 ·ウィルスの EBNA-1 (Epstein-Barr virus nuclear antigen - 1) を発現す る宿主中では宿主の染色体に組み込まれず、 染色体外に維持される。
oriPを含むベクタ一が染色体外に安定に維持されるかどうかは宿主に依存して いる。 EBNA-1を発現する B細胞株を宿主とした場合、 該ベクタ一は一般に染色体外 に安定に維持される。 もともと EBNA- 1を発現しない細胞でも、 外来的に EBNA-1遺 伝子を導入して発現させることにより、 oriPを含むベクタ一がプラスミド状態で 維持されるようになる場合があることが知られている。
さらにプラスミ ドベクターには、 大腸菌 Escherichia coli (E. coli ))用の 内在性プロモーターを含む薬剤耐性遺伝子、 大腸菌中での複製に必要な複製開始 点が、 大腸菌を用いたベクタ一の調製のために必要である。 大腸菌用の薬剤耐性 遺伝子としては、 大腸菌由来のアンピシリン耐性遺伝子 ラク夕マーゼ遺伝子 ) 、 テトラサイクリン耐性遺伝子、 カナマイシン耐性遺伝子等があげられる。 大 腸菌での複製に必要な複製開始点としては、 PBR322の複製開始点、 colElの複製閧 始点等があげられる。
一過性の発現でなく安定した形質転換株の取得のためには、 さらに動物細胞用 の薬剤耐性遺伝子の発現ュニヅト （プロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子とポリ A 付加シグナルを順に連結した構造） を有するプラスミ ドが望ましい。 動物細胞用 の薬剤耐性遺伝子としては、 ネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺 伝子、 プラストサイジン耐性遺伝子、 ピュ一ロマイシン耐性遺伝子、 ゼオシン耐 性遺伝子等があげられる。 プロモー夕一とポリ A付加シグナルは活性ぺプチド前駆 体遺伝子を揷入する発現ュニットに用いられるものと同様のものを用いることが できる。
発現用のプラスミドぺク夕一としては、 pcDNAI/Amp、 pcDNA3.1( + )s pcDNA3.1(- )、 pcDNA3.1(+)Hygro、 pcDNA3.1(-)Hygro 〔以上全てイ ンビ トロジヱン （ Invitrogen) 社製〕 、 pCM8、 pREP4, pAGE107、 pAGE103, pAMo 〔J.Biol.Chem.， 268, 22782 (1993)、 別名 pAMoPRC3Sc (特開平 05- 336963) 〕、 pAMoA、 pAS3-3、 pAMoh (実施例 19)、 pAGal9-nd (下記実施例 18参照） 、 pAGal9- d (下記実施例 18 参照） 等をあげることができる。
活性べプチド前駆体をコ一ドする DNAを外来遺伝子用の発現ュニットのプロモ一 夕一の下流に挿入し、 組換えベクターを造成する。
組換えべクタ一の導入方法としては、 動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 〔Cytoteclmology, 3, 133 (1990)〕、 リン酸カルシウム法 （特開平 2-227075) 、 リボフヱクシヨン法 CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、 Virology, 52, 456 (1973) に記載の方法等をあげることができる。
また、 市販の DM導入試薬を用いることもできる。 該 DNA導入試薬として、 Lipofectamine plus (GIBCO- BRL社製） 、 LiporfectAMINE 2000 (GIBCO- BRL社製) 、 LipofectAMINE ( GIBC0-BRL社製） 、 Lipofectin (GIBCO- BRL社製） 、 DMRIE-C ( GIBCO-BRL社製） 、 Superfect ( QIAGEN社製） 、 Effectene ( QIAGEN社製） 、 TransFast (Promega社製） 、 GeneJammer (Stratagene社製） 、 FuGENE (Roche社製 ) 、 DuoFect (Q - biogene社製） 、 Transfectam (BioSEPRA社製） 等をあげること ができる。
上記方法による遺伝子導入において、 宿主として使用する内分泌細胞株ごとに、 できるだけ発現量の高い発現ベクターを使用することが好ましい。 従って、 使用 する宿主ごとに、 最適な発現ぺク夕一、 プロモーター、 および遺伝子の導入法の 最適化を試みることが好ましい。
6.に後述するレポ一夕一系を用いたアツセィ方法を利用し、 生産されたぺプチ ドの活性を高感度で検出することにより、 遺伝子導入のための最適条件を決定す ることができる。 該ァヅセィ系において、 96穴プレートを利用し、 各穴ごとに遺 伝子導入条件を設定することにより、 極めて効率良く遺伝子導入のための最適条 件を決定することができる。
(2) ウィルスベクターを用いた遺伝子の導入
目的とする活性ペプチド前駆体遺伝子を発現するためのウィルスベクタ一とし てはパッケージング細胞において組換えウィルスが生産でき、 宿主細胞株で目的 の遺伝子を発現させるために好適なプロモーターを含有しているものを用いるこ とができ、 例えば、 MFG CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-6737 (1995)〕、 pBabePuro CNucleic Acids Research, 18, 3587-3596 (1990)〕、 LL - CGヽ CL - CGヽ CS-CGs CLG CJournal of Virology, 72, 8150-8157 (1998)〕 、 および pAdexl 〔 Nucleic Acids Res. , 23, 3816-3821 (1995)〕等をあげることができる。 これら ウィルスベクターは、 該ウィルスのパッケージングに必要な夕ンパク質をコ一ド する遺伝子の少なくとも 1つが欠損している。
パッケージングに必要なタンパク質として、 レトロウイルスベクタ一の場合に はマウスレトロウイルス由来の gag、 pol、 env等、 レンチウィルスベクタ一の場合 には HIVウィルス由来の gag、 pol、 ei 、 vpr、 vpu、 vif、 tat、 rev、 nef等、 アデ ノウィルスベクタ一の場合にはアデノウイルス由来の E1A、 E1B等、 アデノ随伴ゥ ィルスの場合は Rep(p5,pl9，p40)、 Vp(Cap)等の蛋白質をあげることができる。 プロモー夕一としては、 上記 (1) に記載のプロモー夕一を使用することができ る。
活性べプチド前駆体遺伝子をウィルスベクタ一内のプロモー夕一の下流に挿入 し、 組換えウィルスベクターを造成する。
造成した該組換えウィルスベクタ一プラスミ ドを、 該ウィルスべク夕一プラス ミ ドに適合したパッケージング細胞に導入する。
パッケ一ジング細胞としては、 該ウィルスべク夕一が欠損する上記遺伝子のコ ードするパッケージングに必要なタンパク質を補給できる細胞であればいかなる ものも用いることができ、 例えば、 該遺伝子を発現させたヒト腎臓由来の HEK293 細胞やマウス線維芽細胞 NIH3T3等を用いることができる。
上記組換えウィルスべク夕一を上記パッケージング細胞に導入し、 組換えゥィ ルスを生産する。
上記パッケ一ジング細胞への上記ウィルスベクターの導入法として、 例えば、 リン酸カルシウム法 （特閧平 2- 227075 ) 、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl.
Acad. Sci . USA, 84, 7413 (1987)〕 等をあげることができる。
生産された組換えウィルスを宿主細胞に感染させることにより、 宿主にウィル スベクタ—を導入することができる。
使用する宿主ごとに、 最適な発現ベクター、 プロモーター、 および遺伝子の導 入法の最適化を試みることが好ましく、 上記 （1) と同様の方法で、 遺伝子導入の ための最適条件を決定することができる。
4.活性べプチド前駆体遺伝子の発現クロ一ニング系
活性べプチド前駆体遺伝子の発現クロ一ニング系は以下のようにして構築する ことができる。
(1) cDNAライブラリ一の作製
活性べプチド前駆体遺伝子の発現クロ一ニング系では、 特定の活性ぺプチド前 駆体遺伝子のかわりに、 細胞や組織から単離した cDMを発現べク夕一に挿入する ことにより cDNAラィブラリ一を作製する。
cDNAソースとして、 ヒトまたは動物のいかなる組織や細胞も使用することがで きるが、 活性ペプチドを探索するためには、 活性ペプチドを発現する能力のある 細胞ゃ該細胞を含む組織を用いることが好ましい。 例えば、 全脳、 脳の各種部位 （視床下部、 視床、 下垂体、 小脳、 海馬、 線条体、 黒質、 尾状核、 扁桃体、 脳梁） 、 副腎、 腎臓、 小腸、 大腸、 心臓、 リンパ節、 眷 髄、 気管、 滕臓、 骨髄、 肝臓、 乳腺、 子宮、 肺、 胎盤、 胃、 甲状腺、 骨格筋、 滕 臓ランゲルハンス氏島、 α細胞、 ?細胞、 5細胞、 ァ細胞などを使用することが できる。 また、 上記 1.で取得した不死化細胞株を使用することもできる。
上記の組識または細胞より mMAを取得し、 該 mRNAより 2本鎖 cDNAを合成し、 該 cDNAを 3. (1) に記載の発現ベクターのプロモー夕一の下流に挿入して組換えべク 夕一を作製する。 該組換えベクターを大腸菌に導入して cDNAライブラリーを作製 することができる。 このような方法で作製された cDNAライブラリ一としては、 例 えば、 誘導発現べクタ一 pAGal9- ndを用いて作製したヒト視床下部由来の cDNAライ ブラリー （実施例 23参照） 等をあげることができる。 該 cDNAライブラリ一を適当 な濃度に希釈して寒天培地上で培養し、 出現した個々のコロニ一をクロ一ン （大 腸菌） として単離することができる。 また、 各クロ一ン （大腸菌） からプラスミ ド （組換えベクター） を単離することにより、 cDNAクローン （プラスミド） を取 得することができる。 プラスミドはモレキュラー 'クロ一ニング第 3版等に記載の 常法あるいは QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (キアゲン社製） 等のキットを用い て単離できる。
(2) 活性ペプチド前駆体をコードする cDNAの探索
該 cDNAライブラリ一から単離したクローン （大腸菌） を 1〜10000クローンずつ、 好ましくは 10〜100クローンずつのプールに分け、 各プールごとに大腸菌を培養し プラスミ ド （cDNAクローンの混合物） を単離する。 得られた各プール由来のブラ スミド （組換えべク夕一） をそれぞれ、 1.で取得した細胞を宿主細胞として、 3. に記載の方法で宿主細胞へ導入する。 得られた形質 換株を後述する 5. (1) に記 載の方法で培養し、 各 cDNAクローンがコードする蛋白質を発現させる。 該形質転 換株あるいは培養上清を試料として、 後述する 6.に記載の方法で活性測定を行い、 活性が検出されたプールを選択する。 選択したプールについて再度より細かくプ ール分けし、 同様の操作を行う。 この工程を繰り返し、 最終的に 1クロ一ンごとに 上記の操作を行なうことにより、 目的の活性べプチド前駆体をコードする cDNAを 同定することができる。
各 cDNAクローンが含む cDNAの塩基配列が明らかな場合は、 活性べプチド前駆体 03 04840 をコードする可能性の高い cDNAを選択して上記の操作を行うことにより、 目的の 活性を有する DNAを効率的に探索することができる。 活性べプチド前駆体をコ一ド する可能性の高い cDNAとしては、 シグナル配列を有し、 80〜250アミノ酸からなり、 シグナル配列以外の領域に塩基性ァミノ酸が 2つ連続した配列を有し、 膜結合領域 を持たないと推定されるという特徴を有するぺプチドをコードするものがあげら れる。 各 cDNAがコードし得るアミノ酸配列について、 上記の特徴を解析すること により、 活性べプチド前駆体をコードする可能性の高い cDNAを選択することがで きる。 シグナル配列や膜貫通領域は、 PSORT (Trends Biochem. Sciences 2Λ, 34 ( 1999)〕 や SignalP C SignalP web site (http : //www. cbs . dtu. dk/services/ SignalP/) 〕 等のプログラムや、 解析ソフト MacMolly 3.5 (ァロカ社） 、 解析ソ フト SOSUI system verl .0/10 (≡井情報開発) 等を用いてアミノ酸配列から予測 することができる。
5.活性ペプチドの生産
(1)形質転換株を用いた活性ペプチドの生産
上記 3.で取得された形質転換株を培養することにより得た培養液、 細胞、 また は該細胞の抽出液から、 目的とする活性ぺプチドを取得することができる。
培養は、 上記 1. ( 1 ) の培養法、 あるいは上記 1. (4) の不死化細胞株の分化形 質を制御した培養方法に準じて行うことができる。
(2) 内分泌細胞株を用いた活性ペプチドの生産
上記 1.に記載した方法で樹立された多種類の内分泌細胞株を、 上記 1. (1) また は 1. (4) の方法に準じて培養することにより、 各細胞株特有の活性ペプチドを生 産することができる。
例えば、 視床下部由来の細胞株が生産する既知の活性ペプチドとしては、 NPY、 α-MSH, NPFFs CRH、 TRH等を、 ランゲルハンス氏島由来の細胞株が生産する既知 の活性ペプチドとしては、 インスリン、 グルカゴン、 ソマトス夕チン、 塍ポリべ プチド、 グレリン等をあげることができる。 上記 1.に記載した方法で樹立された 多種類の内分泌細胞株からは、 新規な活性ペプチドも生産されると考えられ、 該 細胞株は新規な活性ぺプチドの探索にも極めて有用である。
(3) 分泌刺激による活性ペプチドの放出
内分泌細胞においては、 活性ペプチドは分泌顆粒に蓄積され、 適当な分泌刺激 が加わると一気に細胞外へ放出されることが知られている。 従って、 本発明の内 分泌細胞由来の細胞株を用いた活性ぺプチドの生産においても、 該細胞に適当な 分泌刺激を施すことが好ましい場合がある。
分泌刺激剤としては、 高カリウム （例えば 50〜： 100蘭 ol/L) 、 高グルコース （例 えば 25蓮 ol/L) 、 Tolbutamide (例えば 100〃mol/L) 、 ATP (例えば l〃mol/L〜 10腿 ol/L)等をあげることができる。
また、 分泌刺激剤として使用できる物質を、 以下のようにして選択することも できる。
内分泌細胞由来の細胞株に被検物質を添加し、 細胞内の Ca2+濃度を增加させる活 性を有する被検物質を選択する。 Ca2+濃度の測定は、 公知の方法にしたがって、 CAF-110器機 （日本分光社製） 、 FLIPR (Molecular Devices社製） 、 FDSS6000シス テム（浜松ホトニクス社製） 等の機器を用いて測定することができる。
内分泌細胞株に任意の活性ペプチド前駆体遺伝子 （例えば、 バソプレツシン前 駆体遺伝子または CRH前駆体遺伝子） を導入し、 2~4日培養後、 該被検物質を添加 し、 培地中の活性ペプチド （例えば、 バソプレツシンまたは CRH) の量を測定する。 該被検物質を添加しない場合と比較し、 添加することにより活性べプチドの量が 増加する物質を分泌刺激剤として選択する。
最終的に使用する分泌刺激剤としては、 活性の検出に影響のないものを選択す ることが重要である。 下記 6.のレポ一夕一系を用いるァヅセィ細胞の場合には、 該アツセィ細胞に作用してレポ一夕一活性を上昇させない刺激剤を選択する必要 がある。
できるだけ少量の培地を用い、 適当な分泌刺激剤を添加してぺプチドを一気に 放出させることにより、 高濃度のペプチド溶液を取得することができる。 このよ うな高濃度ペプチド溶液は、 上記アツセィ系において、 効率よく活性を検出でき るため好ましい。
また、 下記 6.のアツセィ細胞を重層してアツセィする場合は、 少量の培地を用 いなくとも、 適当な分泌刺激剤を添加することによりアツセィ細胞周辺のぺプチ ド濃度を高めることができるため、 分泌刺激剤を使用しない場合と比較し、 より 効率よく活性を検出できる。
生産される活性べプチドの分泌顆粒への蓄積は培養条件により制御することが 可能な場合がある。
例えば、 マウス由来の/?細胞株である MIN6のインスリン生産において、 高グル コース （25顧 ol/Lグルコース） 含有培地で培養すると、 インスリンは高生産され るものの恒常的に培地中に分泌されるが、 低グルコース （5.5顧 ol/Lグルコース） 含有培地で培養した場合には、 生産量は低いもののィンスリンは分泌顆粒に蓄積 される。
従って、 活性べプチド前駆体遺伝子を発現させた MIN6を高グルコース含有培地 〔例えば DMEM (HG) 培地： 25腿 ol/Lグルコース、 15%牛胎児血清、 25U/mlぺニシ リン、 および 25 g/mlストレプトマイシンを含む DMEM培地 （日水製薬製） 〕 で培 養した後、 低グルコース含有培地〔例えば DMEM (LG) 培地： 5.5顧 ol/Lグルコース、 15%牛胎児血清、 25U/mlペニシリン、 および 25〃g/mlストレプトマイシンを含む DMEM (日水製薬製） 培地〕 で培養することにより生産された活性ペプチドを分泌 顆粒に蓄積させ、 その後適当な分泌刺激を行うことにより、 一気に多量の活性ぺ プチドを放出させることができる。
(4) 活性ペプチドの修飾
1.で取得した内分泌細胞株、 特に 1. (2) に記載の各種のプロセシング酵素ゃ修 飾酵素の遺伝子を発現している内分泌細胞株を用いて 5. (1) または （2) に記載 の方法でぺプチドを生産させることにより、 ぺプチドの活性に必要な適切な修飾 を受けることができる。 このようなペプチドの修飾としては C末端のァミノ酸のァ ミド化、 N末端へのピログルタミン酸の付加、 脂肪酸の付加、 糖鎖の付加等をあげ ることができる。
6.ペプチドの活性測定
活性べプチド前駆体遺伝子を内分泌細胞に導入して発現させた後、 該細胞の培 養上清、 該細胞の細胞抽出液、 該細胞の膜画分、 または該細胞自身を用いて、 ぺ プチドの活性を測定することができる。 活性の測定法としては、 活性を測定でき るいかなる方法も使用することができるが、 できるだけ感度の高い方法を用いる ことが望ましい。 例えば、 該活性ペプチドと結合する抗体を用いたサンドイッチ ELISA法、 該活性ぺプチド特異的なバイオアヅセィ法等をあげることができる。 例えば、 活性ペプチドが GPCRのような受容体のリガンドである場合は、 受容体 を利用したアツセィ系により、 活性ペプチドを高感度、 高シグナル/ノイズ比で、 3 04840 簡便に検出することができる。
以下、 受容体を利用したアツセィ系で、 レポ一夕一遺伝子を用いた具体例を示 す。 ァヅセィに用いる細胞 （以下アツセィ細胞ともいう） は、 GPCR等の受容体か らのシグナルに応答するプロモ一夕一の下流に連結されたレポ一夕一遺伝子を有 し、 活性ペプチドの受容体遺伝子の発現ュニットを有する細胞である。 活性ぺプ チドとアツセィ細胞上の受容体が結合すると、 受容体からシグナルが流れ、 レポ 一夕一遺伝子の発現が誘導される。 したがって、 アツセィ細胞に試料を接触させ、 レポーター遺伝子の発現量を測定することにより、 試料中の活性べプチドを検出 することができる。 活性べプチドの受容体が細胞内 Ca2+上昇を引き起こす夕ィプの GPCRである場合は、 アツセィ細胞に試料を接触させ、 細胞内 Ca2+上昇を測定するこ とによっても、 試料中の活性ペプチドを検出することができる。 アツセィ細胞は 以下の方法で構築することができる。
(1) 活性べプチドの受容体をコードする DNAを発現させるための宿主 ·ベクター 系の構築
活性ぺプチドの受容体をコードする DNAを発現させるための宿主 ·ぺク夕一系は、 モレキュラー ·クローニング第 3版等に記載の通常の方法により構築することがで きる。 本発明において構築されたェプス夕イン ·バ一 ·ウィルスの EBNA-1遺伝子 を発現する無血清馴化した B細胞株を宿主として、 ェプスタイン ·バー ·ウィルス の複製開始点 oriPを有するプラスミドをべクタ一とする系は、 ベクターが宿主細 胞の染色体外にプラスミド状態で安定に存在し、 アツセィ細胞の構築上望ましい 以下の （i)〜（iii) に示す性質をもつ。
(i) ベクタ一の宿主細胞への導入効率が高い。 （ii) 宿主細胞および得られるァ ッセィ細胞が非接着性細胞 （浮遊系細胞） のため、 培養操作が簡便で、 アツセィ の簡便性と汎用性が高い。 ぺプチドの発現を調べたい細胞が接着性細胞の場合、 該細胞の上にアツセィ細胞を重層してァヅセィすることが簡便にできるため、 ァ ヅセィ方法によっては、 アツセィ系の検出感度を上げることができる。 （iii) 宿 主細胞および得られるアツセィ細胞を無血清で培養することができる。 種々の成 分を含むためアツセィ系のバックグラウンドを上昇させる場合がある血清をアツ セィ系に用いる必要がないので、 ァヅセィ系の検出感度、 シグナル/ノイズ比、 汎用性、 および簡便性が高い。 以下、 本発明において構築された系について示す (a) ェプス夕イン ·バ一 ·ウィルスの EBNA- 1遺伝子を発現する無血清馴化した B 細胞株の取得
ェプス夕イン 'バ一 'ウィルスの EBNA- 1遺伝子を発現する B細胞株としては、 ェ ブスタイン ·バー ·ウィルスの EBNA-1遺伝子を発現する B細胞株であればいかなる B細胞株でも用いることができるが、 安全面からは、 ェプス夕イン 'バ一'ウィル スを産生しない細胞株を使用するのが好ましい。 該細胞としては、 例えば、 Namalwa細胞 (ATCC番号： CRL- 1432)、 Raji細胞 (ATCC番号: CCL- 86)、 Daudi細胞 を （ATCC番号： CCL- 213) を使用することができる。 より好適には、 Najnalwa細胞を 使用することができる。 公知の方法 〔Cytotechnology, 1 , 151 (1988) ; Dev. Biol. Stand. , 99, 153 (1999 ) ; Pharmacol . Ther. , 53, 355 (1992) ; Cytotechnology, 5, 3 (1991 ) ; Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , M, 95 (1987) ; 特許 1653986号〕 に従って、 上記細胞株を無血清馴化することにより、 ェ ブスタイン ·バー ·ウィルスの EBNA-1遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株を 取得することができる。 ェプス夕イン ·バー 'ウィルスの EBNA-1遺伝子を発現し、 無血清馴化した B細胞株としては、 好ましくは無血清馴化した Namalwa細胞、 より 好ましくは Namalwa細胞を無血清馴化することによつて取得した Namalwa KJM-1細 胞 Cytotechnology, 1, 151 ( 1988)〕 が用いられる。
ェプス夕イン ·バ一 ·ウィルスの EBNA-1遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞 株を培養する培地は、 一般に使用されている βΡΜΙ 1640培地〔J. Am. Med. Assoc. , 199, 519 ( 1967)〕、 Eagleの MEM培地〔Science， 122, 501 ( 1952)〕、 DMEM培地〔 Virology, 8, 396 (1959)〕 、 199培地 〔Proc. Soc. Exp. Biol. Med. , 73, 1 (1950)〕 、 またはこれら培地に無血清培養用の添加物を添加した培地 〔 Cytotechnology , 1_, 151 (1988) ; Dev. Biol. Stand. , 99, 153 (1999) ; Pharmacol . Ther. , 53, 355 (1992); Cytotechnology, 5, 3 (1991 ) ; Adv. Biochem. Eng. BiotechnoL , 34, 95 (1987)〕 等が用いられる。 また、 市販の無 血清培養用の培地を用いることもできる。
培養は、 通常 pH6〜8、30〜40°C、5%C02存在下等の条件下で 1〜7日間行う。 また 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に添加して もよい。 また、 以降に記載するように該細胞に薬剤耐性遺伝子を含むプラスミ ド を導入した場合は、 対応する藥剤を培地に添加して培養してもよい。 (b) ベクタ一の構築
活性べプチドの受容体をコードする DNAを揷入する発現用ぺク夕一としては、 宿 主動物細胞で該 DNAを発現できるベクターで、 動物細胞中での複製に必要な複製開 始点として、 ェプス夕イン ·バー ·ウィルスの oriPを有するものをあげることが できる。 このような発現用べクタ一として、 pAMo、 pAMoA pAMoh等、 あるいは上 記 3. (1) の発現べクタ一に該 oriPを導入したもの等をあげることができる。
発現用ベクタ一中の外来遺伝子用の発現ュニットのプロモーターの下流に活性 ペプチドの受容体をコードする DNAを揷入し、 該受容体発現プラスミドを造成する c 該受容体をコードする DNAは、 以下のようにして取得できる。 該受容体をコードす る cDNAの塩基配列を元にして、 該受容体をコ一ドする領域を含む該 cDNAの領域を 適当に選択する。 選択した領域の塩基配列の 5'端 20〜40塩基の配列を 3'端に含む DNA、 選択した領域の塩基配列の 33端 20〜40塩基と相補的な配列を 3'端に含む MA をそれそれ DNA合成機で合成する。 該受容体が発現している組織や細胞から cDNAを 調製する。 調製した cDNAを錶型とし、 2種類の合成 DNAをプライマ一として用いた PCRにより該受容体をコ一ドする DNAを増幅し単離することができる。組織や細胞 からの cDNAの調製、 および PCRはモレキュラー ·クローニング第 3版に記載の方法 に従って行うことができる。
(c) 宿主への発現プラスミドの導入と形質転換株の取得
発現プラスミドを、 上記 3. (1) に記載の方法により 6. (1) (a) で取得した宿 主細胞に導入する。 形質転換体の取得および培養は、 特開平 2- 227075号公報ある いは特開平 2- 257891号公報に記載されている公知の方法に準じて行なうことがで ぎる。
(2) 活性ぺプチドの受容体をコードする DNAを誘導発現させる宿主■ベクター系 上記 6. (1) で取得したエブス夕ィン ·バー ·ウィルスの EBNA- 1遺伝子を発現す る無血清馴化した B細胞株を宿主、 ェプス夕イン ·バー ·ウィルスの oriPを有する プラスミドをベクターとする宿主 ·ベクタ一系に、 活性ペプチドの受容体をコ一 ドする DNAの誘導発現系を組み込むことにより、 該 DNAの効率的な誘導発現が可能 な宿主 ·ベクタ一系を構築することができる。 外来の活性べプチドの受容体をコ 一ドする DNAを発現させた細胞はしばしば生育が悪くなるが、 ァッセィに用いるま で該 DNAの発現を抑えておくことにより、 アツセィ細胞を良好に生育させることが できる。 また、 受容体が GPCRの場合、 下記 [II] の （2) に記載するように、 誘導 発現系を用いて GPCRを一過的に高発現させることにより、 GPCRの構成的活性を検 出することができるようになる。
誘導発現系は、 特定の薬剤の添加等により活性化される転写因子を発現させた 宿主に、 該活性化された転写因子に応答するプロモー夕一の下流に任意の DNAを連 結した構造を有する誘導発現ベクターを導入し、 薬剤の添加等により該 DNAを誘導 発現させる系である。 誘導発現系としては、 例えばェストロジェンを用いる系 〔 Cell, 54, 199 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 90, 1657 (1993)〕 、 テ トラサイクリン耐性オペロンを用いる系 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547 (1992) ; Methods Enzymol. 283, 159 (1997)) 、 昆虫ホルモンェクジソンを 用いる系 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 93, 3346 (1996)〕 、 ラクトースオペ ロンを用いる系 〔Cell, 48, 555 (1987)〕 等を用いることができる。
エストロジェンを用いる系 〔Cell， 5 3 199 (1988); Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A. , 90, 1657 (1993)〕 では、 宿主に発現させる転写因子として酵母 （ Saccharomyces cerevisiae) 由来の転写因子 Gal4pの MA結合領域とエストロジェ ン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質 （Gal4- ER) を用い、 発現べクタ一の プロモ一夕一として、 Gal4p応答性プロモーターを用いる。 本系では、 エストロジ ェンの添加により、 該プロモータ一下にある任意の遺伝子の発現を誘導すること ができる。 また、 使用するェストロジェンの濃度を変えることにより、 遺伝子の 発現量を制御することができる。
また、 テトラサイクリン耐性オペロンを用いる系 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547 (1992) ; Science, 268, 1766 (1995) ; Methods Enzymol. 283, 159 (1997)〕 では、 宿主に発現させる転写因子として、 テトラサイクリン-コント ロールド · トランスァクチべ一夕一 〔大腸菌のテトラサイクリン . レプレッサー と HSVの W16の転写活性化領域のキメラ蛋白質〕 またはリバース ·テトラサイクリ ン ·コントロールド · トランスァクチべ一夕一 （テトラサイクリンとの結合時に 転写を活性化するような変異型のテトラサイクリン ·レブレッサ一と HSVの VP16の 転写活性化領域のキメラ蛋白質） を用い、 発現ベクターのプロモー夕一として、 テトラサイクリン応答配列を有するプロモ一夕一を用いる。 本系では、 テトラサ イクリン ·コントロールド · トランスァクチべ一夕一を用いた場合はテトラサイ クリンまたはドキシサイクリン （doxycycline) の除去により、 リバ一ス .テトラ サイクリン 'コントロールド · トランスァクチべ一夕一を用いた場合は該薬剤の 添加により、 上記プロモーター下にある任意の DNAの発現を誘導することができる c また、 存在する該薬剤の濃度を変えることにより、 遺伝子の発現量を制御するこ とができる。
大腸菌のラクトースォペロンを用いる系では、 宿主に発現させる転写因子とし て、 大腸菌のラクト一ス · レプレッサーを用い、 ベクタ一のプロモータ一として、 ラクトースオペレーターを有するプロモー夕一を用いる。 本系では、 イソプロピ ル- D -チォガラクトシドの添加により、 該プロモ一夕一下にある任意の DNAの 発現を誘導することができる。
昆虫のホルモンを用いる系では、 宿主に発現させる転写因子として、 ショウジ ョゥバエ由来のェクジソン受容体とレチノィン酸受容体 RXRのへテロダイマーを用 い、 ベクターのプロモーターとして、 ェクジソン応答配列を有するプロモー夕一 を用いる。 本系では、 ムリステロン A (Muristerone A) またはポナステロン A ( ponasterone A) の添加により、 該プロモーター下にある任意の DNAの発現を誘導 することができる。
誘導発現べクタ一は、 例えば以下の方法で構築することができる。
6. (1) (b) 記載の発現用プラスミ ドベクターに、 宿主に発現させる転写因子 に対応する応答配列を有する上記プロモーターを導入する。
該プロモー夕一は、 例えば 3. (1) に記載した外来遺伝子の発現用プロモ一夕一 に 1つ以上の応答配列を含む DNAを挿入することにより構築することもできる。 例 えば、 5つの Gal4p応答配列を有する Gal4p応答性プロモーター （転写因子 Gal4- ER に対応） （実施例 18の pAGalSdl等） 、 テトラサイクリン応答配列の下流に CMVプロ モ一夕一を連結したテトラサイクリン応答配列を有するプロモー夕一 （クロンテ ヅク社製の PTRE2等） 、 RSVの LTRプロモ一夕一の下流にラクト一スォペレ一夕一を 連結したラクトースオペレーターを有するプロモー夕一 （ストラ夕ジーン社製の pORSVI/MCS等） 、 5つのェクジソン応答配列の下流にヒートショックプロモー夕一 を連結したェクジソン応答配列を有するプロモー夕一 （ストラ夕ジーン社製の EGSH, インビトロジェン社製の pIND等） をあげることができる。 該プロモー夕一中の応答配列および TATA配列に関して、 それそれの配列、 数、 位置を検討することによって、 感度ゃシグナル /ノィズ比の最適化を行うことが できる。 6. (3) に後述するように、 検討するプロモーターの下流にレポ一夕一遺 伝子を挿入したレポ一夕一誘導発現プラスミドを造成し、 それそれのレポ一夕一 誘導発現プラスミ ドを宿主細胞に導入して形質転換株を取得し、 該形質転換株で レポ一夕—を誘導発現させ、 非誘導時のレポ一夕一の発現量が低く、 非誘導時に 対する誘導時のレポ一夕一発現量の倍率が高いプロモーターを選ぶことにより、 プロモーターの最適化を行うことができる。
このようなプロモー夕一の最適化を行なった誘導発現用べクタ一として、 pAGal9-ds pAGal9-nd (いずれも実施例 18) 等をあげることができる。
上記誘導発現用のプロモーターの下流に活性ぺプチドの受容体をコ一ドする DNA を挿入し、 活性べプチドの受容体をコードする DNAを誘導発現することのできるプ ラスミドを造成することができる。
該 MAの誘導発現を行なうための転写因子を発現する宿主は、 以下のように構築 することができる。
発現プラスミド構築のためのベクタ一としては、 動物細部で該転写因子を発現 できるベクターであればいずれも用いることができ、 例えば 3. (1) 記載のベクタ 一をあげることができる。 このように構築される転写因子の発現プラスミ ドをモ レキユラ一 ·クローニング第 3版等の常法に準じて造成する。 このような転写因子 の発現プラスミドとして、 Gal4- ERの発現プラスミ ド pGERbsrR2 (実施例 18) 、 テ トラサイクリン .コントロ一ルド · トランスァクチべ一夕一の発現プラスミ ド pTet-Off (クロンテツク社製）、 リバース ·テトラサイクリン ·コントロールド . トランスァクチべ一夕一の発現プラスミ ド pTet- On (クロンテック社製） 、 ラク ト一ス · レプレッサ一の発現プラスミ ド pCMVLacI (ストラ夕ジ一ン社製） 、 ェク ジソン受容体とレチノィン酸受容体 RXRの発現プラスミド pERV3 (ストラタジーン 社製） 、 pVgRXR (インビトロジヱン社製） 等があげられる。
転写因子を発現させるための上記ベクターにおいて使用する動物細胞用の薬剤 耐性遺伝子は、 上述の誘導発現用ベクターに用いる動物細胞用の薬剤耐性遺伝子 とは別の薬剤耐性遺伝子を用いることが望ましい。
転写因子の発現プラスミドを、 6. (1) で取得したェプス夕イン 'バー 'ウィル スの EBNA-l遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株に、 6. (1) に記載した方法 を用いて導入し、 多数の形質転換株を取得する。 上記の誘導発現用べクタ一に、 活性ペプチドの受容体をコードする DNAの代わりに、 後述する 6. (3) に記載のレ ポ一夕一遺伝子を挿入したレポ一夕一誘導発現プラスミドを作製し、 これらの形 質転換株に導入する。 取得された形質転換株各々にっき、 転写を誘導するための 薬剤等を添加することによりレポ一夕一遺伝子の発現を誘導し、 誘導しない時と 誘導時のレポ一夕一遺伝子の発現量を測定し、 誘導発現の倍率 （誘導時のレポ一 夕一発現量/非誘導時のレポ一夕一発現量） を算出する。 アツセィ細胞の構築に おいて優れた性質を有する形質転換株 （非誘導時の発現量が低く、 誘導発現の倍 率の高い形質転換株） を宿主細胞として選択する。
多数の形質転換株から選択しても、 優れた性質を有する宿主細胞が得られない 場合は、 転写因子を発現するためのプロモーターの強さや、 誘導発現プラスミ ド 中のプロモーター配列等を検討し、 再度、 上記方法により宿主細胞の選定を行う とよい。
上記の方法で取得した優れた性質を有する宿主細胞として、 Gal4-ER発現プラス ミ ド pGERbsrR2を Namalra KJM-1細胞に導入して染色体 MAに組み込んだ細胞株 KJMGER8 (実施例 18) 等があげられる。
KJMGER8を宿主、 pAGal9- ndまたは pAGal9- dを誘導発現用べクタ一として用いる 宿主 ·ベクター系は、 非誘導時の遺伝子発現のもれがなく、 かつ遺伝子発現の誘 導倍率が高い、 極めて優れた誘導発現系である。
(3) レポ一夕一系を組み込んだ宿主の構築
(a) レポ一夕一プラスミドの造成
レポ一夕一遺伝子を挿入する発現用ベクターは、 3. (1) に記載した活性べプチ ド前駆体遺伝子を発現させるために用いるプラスミ ドベクターに、 転写因子に対 応する応答配列を有するプロモーターを導入することにより構築することができ る。 該プロモーターは、 例えば 3. (1) に記載した外来遺伝子の発現用プロモー夕 —に 1つ以上の応答配列を含む MAを揷入することにより構築することもできる。 受容体のシグナルに応じたレポ一夕一系の場合にはレポーター遺伝子の発現用 プロモー夕一としては、 受容体のシグナルに応じた応答配列を有するものを用い る。 例えば受容体が GPCRの場合、 測定する活性ペプチドと結合する GPCRが共役す る G蛋白質の種類に応じた応答配列を用いる。 具体的には、 Gasと共役する GPCRの 場合はリガンドとの結合により細胞内 cAMPを增加させるので、 cAMP応答配列 （CUE
) を、 と共役する GPCRの場合はリガンドとの結合により細胞内 cAMPを減少さ せたり、 MAPキナーゼカスケ一ドを活性化するので、 CREあるいは血清応答配列 （
SRE) を、 Gひ q、 Gau, Gひ 15または Gひ 16と共役する GPCRの場合は、 リガンドとの結 合によりプロテインキナーゼ Cを活性化したり、 細胞内 Ca2+を増加させるので、 TPA 応答配列 (TRE) または NMT (nuclear factor of activated T cells ) 応答配列 を有するプロモーターを用いることができる。
プロモー夕一中の応答配列および TATA配列に関しては、 それそれの配列、 数、 位置を検討することによって、 感度やシグナル Zノィズ比の最適化を行うことが できる。 具体的には、 検討するプロモーターを有するレポ一夕一プラスミドをそ れそれ造成し、 （b) に後述するように、 それそれのレポ一夕一プラスミドを宿主 細胞に導入して形質転換株を取得し、 該形質転換株を刺激してレポ一夕一を発現 させ、 非刺激時のレポ一夕一の発現量が低く、 非刺激時に対する刺激時のレポ一 夕一発現量の倍率が高いプロモーターを選ぶ。
レポーター遺伝子としては、 いかなるレポーター遺伝子も利用できるが、 例え ば、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラ一ゼ造伝子、 ? -ガラクトシ ダ一ゼ遺伝子、 ^-ラクタマーゼ遺伝子、 ホタル .ルシフェラ一ゼ遺伝子、 ゥミシ ィ夕ケ 'ルシフェラ一ゼ遺伝子、 およびグリーン .フルォレヅセント .プロティ ン （GFP) 遺伝子を用いることができる 〔Mol. Biotec nol. , 13, 29 (1999) ;
Anal. Chemi. , 70, 579A (1998); J. Recept. Signal Transduct. Res. , 19, 395
(1999); J. Recept. Signal Transduct. Res. , 20, 189 (2000) ; Methods Mol.
Biol. , 130, 165 (2000)〕 。
動物細胞用の薬剤耐性遺伝子は、 本レポータープラスミ ドを導入する宿主細胞 にすでに導入されている動物細胞用の薬剤耐性遺伝子 〔6. (1) もしくは （2) に 記載した活性ペプチドの受容体をコードする DNAの発現プラスミ ドまたは 6. (2) に記載した転写因子の発現用プラスミ ドに用いた動物細胞用の薬剤耐性遺伝子〕 とは異なる動物細胞用の薬剤耐性遺伝子を用いるのが好ましい。 レポ一夕一遺伝 子発現ュニットのプロモーターの最適化を行う際には、 動物細胞での複製に必要 な複製開始点として、 宿主細胞の染色体外でプラスミドが安定に存在するェプス タイン ·バ一 ·ウィルスの oriPを用いるのが好ましい。
以上のようにして造成されたレポ一夕一プラスミドとしては、 GPCRのシグナル に応じた応答配列である 16個の CREを有するプロモーターの制御下でホ夕ル ·ルシ フェラ一ゼを発現する pACREpluc、 同じく 16個の CREを有するプロモー夕一の制御 下でゥミシィ夕ケ ·ルシフェラーゼを発現する pACRERlucをあげることができる。 (b) 宿主細胞へのレポ一夕一系の組み込みとすく、れた形質転換株の選択
上記 （a) に記載の方法で造成したレポ一夕一プラスミ ドを、 上記 （1) または (2) に記載の方法で構築した宿主細胞に導入し、 多くの安定形質転換株を取得す る。 この中から、 以下のようにして、 アツセィ細胞の構築上すぐれた性質 （刺激 に対する応答性がよくバックグラウンドが低い） をもつ形質転換株を選択し、 ァ ヅセィ細胞構築の宿主細胞とする。 レポ一夕一プラスミ ドの導入法は、 上記 3. (1 ) に記載した方法を用いることができる。 レポ一夕一プラスミドにェプス夕イン •バー ·ウィルスの oriPが含まれている場合は、 制限酵素切断により oriPを除去 または oriPの機能を破壊した後に宿主細胞に導入することにより、 該プラスミド を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。
取得された該形質転換株について、 転写を誘導するための薬剤等で誘導した時 と誘導しなかった時のレポ一夕一遺伝子の発現量を比較し、 刺激に対する応答性 がよい細胞株を選択する。 例えば、 GPCRを発現させる宿主細胞において CREを有す るプロモ一夕一を用いた場合は、 フォルスコリンで細胞を刺激することによりレ ポー夕一遺伝子を発現させることができる。 同様の宿主細胞で TREを用いた場合は、 PMA (ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート） でレポ一夕一遺伝子を発現させ ることができる。 その際、 該応答配列からの転写を促す物質で刺激しない時のレ ポ一夕一遺伝子の発現量 （バックグラウンド） ができるだけ低い細胞株を選択す る。 GPCRのリガンドまたはァゴニストで細胞を刺激した時と刺激しなかった時の レポーター遺伝子の発現量を比較し、 刺激に対する応答性がよい細胞株を選択す ることもできる。 その際、 刺激しない時のレポ一夕一遺伝子の発現量 （バックグ ラウンド） ができるだけ低い細胞株を選択する。 例えば、 Namalwa KJM-1および KJMGER8は Gasと共役する 2a型アデノシン受容体 (A2a)を内在的に発現しているの で、 これらの細胞に応答配列として CUEを含むレポ一夕一プラスミドを導入した形 質転換株の場合は、 A2aのァゴニストである 5' - N-ェチルカルボキサミドアデノシ ン （NECA) を刺激物質として用いることができる。
レポ一夕一遺伝子の発現量は、 公知の方法 （； Mol. BiotechnoL, 13, 29 (1999); Anal. Chemi., 70, 579A (1998); J. Eecept. Signal Transduct. Res., 19, 395 (1999); J. Recept. Signal Transduct. Res., 20, 189 (2000); Methods Mol. Biol., 130, 165 (2000)〕 にしたがって、 レポ一夕一ポリペプチド の量や活性を指標に測定することができる。
以上のようにして作製した、 レポ一夕一系を組み込んだ、 刺激に対する応答性 がよくバックグラウンドの低い形質転換株として、 例えば CREの制御下にホタル - ルシフェラ一ゼを発現するレポ一夕一プラスミドである pACREplucを KJMGER8に導 入した GBC7、 および CREの制御下にゥミシィ夕ケ ·ルシフェラーゼを発現するレポ —夕一プラスミ ドである pACRERlucを KJMGER8に導入した GBCR2等をあげることがで ぎる。
(4) 蛋白質またはキメラ Go:蛋白質を組み込んだ宿主の構築
活性べプチドと結合する GPCRが共役する G蛋白質によりシグナルが異なるため、 いろいろなぺプチドの活性測定を行う場合は、 一般にはアツセィ方法を変える必 要がある。 すなわち、 共役する G蛋白質ごとに、 それに適したレポ一夕一プラスミ ドと該レポ一夕一プラスミドを導入した宿主細胞を構築する必要がある。 その際、 使用する宿主細胞によって、 各 蛋白質の発現量が異なるため、 G 蛋白質を一 緒に発現させた方がレポ一夕一系の感度やシグナルノノイズ比が上昇する場合が ある。 発現させる Ga蛋白質としては、 Gas、 Gひ q、 G ^ Gau, (}ひ12、 Gひ 13、 G ひ ½、 Gひ 15、 Gひ 16、 Gひ。、 Ga^ Gatまたは G guStがあげられる。 また、 Gひ 15また は Gひ 16は、 多くの GPCRと共役して Gひ。と同様のシグナルを流すことが知られてい る。 したがって、 Gひ 15または Gひ 16を宿主細胞で発現させることにより、 多くの GPCRのシグナルを NFAT応答配列や TREを用いたレポ一夕一系で検出することができ るようになる。 Go Ga„ Gひ 15または Go: 16と共役する GPCRの場合は、 GPCRから のシグナルを細胞内 Ca2+の上昇を指標にして検出することもできるが、 G q、 G u、 G«15または Gひ 1ί5を発現させた宿主細胞においては、 リガンド刺激による細胞内 Ca2+の上昇をより検出しやすくなる場合がある。
一方、 Gひ sの C末端の 5アミノ酸を他の G (GaqS Ga^ G u、 G l2 G 14、 G 15 Gひ 16、 Gひ。、 Go;z、 Go:t、 または Gひ t) の対応するアミノ酸に置換したキ メラ Go:sを宿主細胞で発現させることにより、 本来 Go:s以外の Gひに共役する GPCR が該キメラ Gasと共役するようになり、 該 GPCRからのシグナルを G«sを介したシグ ナルと同様に CREを用いたレポ一夕一系で検出することができる。
また、 Gaqの C末端の 5アミノ酸を他の Gひ （Gccs、 G i Galls Gc½、 Ga14S G ひ 15、 Ga16S Gひ。、 G z Gひ t、 または Gひ gust) の対応するアミノ酸に置換したキ メラ G qを宿主細胞で発現させることにより、 本来 Go:q以外の Gひに共役する GPCR が該キメラ Gひ qと共役するようになり、 該 GPCRからのシグナルを Gひ qを介したシグ ナルと同様に、 NFAT応答配列や TREを用いたレポー夕一系で検出することができる。 この時、 細胞内 Ca2+の上昇を指標にして GPCRからのシグナルを検出することもでき る。
したがって、 例えば G sの C末端の 5アミノ酸を Gひ qの対応するアミノ酸に置換し たキメラ Gひ蛋白質と Gひ 3の(末端の 5アミノ酸を 6 の対応するアミノ酸に置換し たキメラ 蛋白質の両者を、 6. (3) で作製した CREの制御下でレポ一夕一遺伝子 を発現する宿主細胞で発現させることにより、 Go:sと共役する GPCRだけでなく、 G iと共役する GPCRおよび Gひ qと共役する GPCRのシグナルも検出可能なアツセィ細 胞の構築に有用な、 汎用性のある宿主細胞を作製することができる。
上記 6. (1) 〜 （3) に記載の方法で構築した GPCRを発現するための宿主となる 形質転換株 （例えば GBC7または GBCR2) にキメラ Gひ蛋白質遺伝子の発現ユニット を、 以下の （a) および （b) に記載した方法により組み込むことができる。
(a) キメラ Gひ蛋白質の発現プラスミドの造成
キメラ Gcc蛋白質をコードする DNAは公知の方法 〔Science, 2 9, 662 (1990); Nature, 363, 274 (1993); Mol. Pharmacol" 50, 885 (1996); FEBS lett., 406, 165 (1997); Mol. Pharmacol., 57, 13 (2000)〕 に準じて造成することができる。 該キメラ Go:蛋白質をコードする DNAを、 上記 3. (1) に記載した発現べクタ一の プロモーターの下流に組み込むことにより、 該キメラ Go:蛋白質の発現プラスミ ド を造成することができる。 該キメラ 蛋白質発現プラスミドに用いる動物細胞用 の薬剤耐性遺伝子は、 6. (1) に記載した発現べクタ一、 6. (2) に記載した誘導 発現ベクター、 6. (2) に記載した転写因子の発現プラスミド、 および 6. (3) に 記載したレポ一夕一プラスミ ドに用いた動物細胞用の薬剤耐性遺伝子とは異なる 動物細胞用の薬剤耐性遺伝子を用いることが好ましい。 例えば、 G«sのサブタイプである Gas4の C末端の 5アミノ酸を Gひ qの C末端の 5ァ ミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質 （G s-q) をコードする DNAを、 発現プラスミ ド pAMohに組み込むことにより、 Go qの発現プラスミ ド pAMoh-Gs- qを造成すること ができる。 また、 G as4の C末端の 5アミノ酸を G ttiOC末端の 5アミノ酸に置換した キメラ G 蛋白質 （G o i) をコードする DNAを発現プラスミ ド pAMohに組み込むこ とにより、 G o iの発現プラスミ ド pAMoh- Gs-iを造成することができる。 また、 pAMoh- Gs- qおよび pAMoh-Gs-iを用いて、 Go: および G s-iを共発現するためのプ ラスミド pAMopGs-qMoGs-iを造成することができる。
プラスミ ドの代わりに、 該キメラ Go:蛋白質を発現するウィルスを使用すること もできる。
(b) 宿主細胞へのキメラ Ga蛋白質遺伝子発現ュニットの組み込み
上記 （a) に記載の方法で造成された任意のキメラ Gひ蛋白質発現プラスミ ドを、 上記 6. (1) 〜 （3) に記載の方法で構築した宿主細胞に 3. (1) に記載の方法に準 じて導入することにより、 安定形質転換株を取得することができる。 キメラ Gひ蛋 白質発現プラスミ ドにェプス夕イン ·バ一 ·ウィルスの oriPが含まれている場合 は、 制限酵素切断により oriPを除去または oriPの機能を破壊した後に宿主細胞に 導入することにより、 キメラ 蛋白質発現プラスミ ドを宿主細胞の染色体に組み 込むことができる。
6. (3) に記載の方法で構築したレポ一夕一系を組み込んだ宿主細胞にキメラ G ひ蛋白質発現プラスミ ドを導入して取得した安定形質転換株の場合は、 上記 6. (3 ) (b) に記載の方法と同様にして、 GPCRのリガンドまたはァゴニストで刺激した 時と刺激しなかった時のレポーター遺伝子の発現量を指標として、 性質の優れた (刺激に対する応答性がよく、 バックグラウンドが少ない） 形質転換株を選択す ることができる。
6. (1) または （2) に記載の方法で構築したレポ一夕一プラスミ ドを組み込ん でいない宿主細胞にキメラ G 蛋白質発現プラスミドを導入して取得した安定形質 転換株の場合は、 個々の形質転換株に GPCR発現プラスミ ドとキメラ Go:蛋白質に対 応した応答配列を有するレポ一夕一プラスミ ドを共導入し、 上記と同様にして性 質の優れた （刺激に対する応答性がよく、 バックグラウンドが少ない） 形質転換 株を選択することができる。 以上のようにして構築した宿主細胞として、 '例えば GBC7に pAMopGs- qMoGs- iを導 入した形質転換株から選択された GBCC13、 GBCR2に pAMopGs-qMoGs- iを導入した形 質転換株から選択された GBCRC6等をあげることができる。 GBCC13を用いることに より、 G o:s、 G o:および G o:;に共役する GPCRからのシグナルを、 ホ夕ル レシフェ ラーゼの活性を指標に検出することができる。 GBCRC6を用いることにより、 G as、 G qおよび Gd^に共役する GPCIiからのシグナルを、 ゥミシィタケ ·ルシフェラーゼ の活性を指標に検出することができる。
(5) アツセィ系の構築
(a) レポ一夕一を用いるアツセィ系
6. ( 1) (b) または （2) (a) に記載した方法で活性ペプチドの受容体の発現 プラスミ ドを作製し、 該プラスミ ドを 6. (3) または （4) で構築した宿主細胞に 導入して得られる安定形質転換株をアツセィ細胞として用いることができる。
6. (1) または （2) で構築した宿主細胞に、 上記活性ペプチドの受容体の発現 プラスミ ドと上記 （3) (a) に記載した方法で構築できるレポ一夕一プラスミ ド を共導入して得られる安定形質転換株をアツセィ細胞として用いることもできる。
6. ( 1) または （2) で構築した宿主細胞に、 上記活性ペプチドの受容体の発現 プラスミ ド、 上記レポ一夕一プラスミ ド、 および上記 6. (4) (a) に記載した方 法で構築できるキメラ Gひ蛋白質の発現プラスミ ドを共導入して得られる安定形質 転換株をアツセィ細胞として用いることもできる。 上記レポ一夕一プラスミ ドと 上記キメラ Gひ蛋白質の発現プラスミ ドの代わりに、 キメラ Gひ蛋白質の発現ュニ ットを組み込んだレポ一夕一プラスミ ドを用いることもできる。
6. (3) で構築した宿主細胞に、 上記活性ペプチドの受容体の発現プラスミ ドと 上記キメラ Go:蛋白質の発現プラスミ ドを共導入して得られる安定形質転換株をァ ヅセィ細胞として用いることもできる。
6. (2) 〜 （4) で構築した宿主細胞は、 それそれの細胞に組み込まれたベクタ 一が有する薬剤耐性遺伝子に応じた選択用薬剤を適当な量添加した培地を用いて 培養するのが好ましい。 培養は 6. (1) (a) に記載の方法で行うことができる。 例えば、 KJMGER8はブラストサイジン S (2.0 zg/ml) を添加した培地、 GBC7およ び GBCR2はプラストサイジン S (2.0 g/ml) とハイグロマイシン B (300 g/ml) を添加した培地、 GBCC13および GBCRC6はブラストサイジン S (2.0 g/ml) 、 ハイ グロマイシン B (300 g/ml) およびピューロマイシン （2.0〃g/ml) を添加した培 地で培養することが好ましい。
安定形質転換株の取得は、 導入したプラスミドに含まれる薬剤耐性遺伝子に応 じた選択用薬剤を適当な量添加した培地で培養することにより行うことができる。 例えば、 G418耐性遺伝子を有する pAGal9- ndを用いた発現べクタ一を宿主細胞 GBCRC6に導入した場合、 0.5mg/mlのジエネティシン含む培地を用いる。 該培地に は、 上記の宿主を培養する際に添加するのが好ましい薬剤も同時に添加するのが 好ましい。
活性ペプチドの受容体の誘導発現を行う場合は、 （2) に記載したように誘導発 現に必要な転写因子を発現する宿主細胞を用い、 該転写因子に対応した応答配列 を有する誘導発現用ベクターを用いる。 例えば、 GBCC13または GBCHC6のように誘 導発現のために Gal4-ERを発現させた宿主細胞を用いる場合は、 Gal4p応答配列を 含む誘導発現べクタ一である pAGal9- ndまたは pAGal9- d等を活性べプチドの受容体 の発現プラスミドの造成に用いる。
6. (1) (b) に記載した発現プラスミドのように構成的プロモーターによる発 現の場合は、 アツセィ細胞を培養するだけで、 活性ペプチドの受容体をアツセィ 細胞の細胞表面に発現させることができる。 誘導発現の場合は 6. (2) に記載した 誘導発現に必要な薬剤を添加して、 上記で構築したアツセィ細胞を培養すること により、 活性ペプチドの受容体をアツセィ細胞の細胞表面に発現させる。 例えば、 Gal4- ERを発現させた宿主細胞に Gal4p応答配列を含む活性べプチドの受容体の誘 導発現プラスミドを導入して得られるアツセィ細胞の場合は、 0.1 1000nmol/Lの、 好ましくは 0.； lOmimol/Lの 17- ?エストラジオールを添加して、 3時間以上、 好 ましくは 6 48時間培養することにより、 活性ぺプチドの受容体をアツセィ細胞の 細胞表面に発現させることができる。
細胞表面に活性べプチドの受容体を発現したアツセィ棚胞に、 活性を測定する 試料を添加して 2 24時間、 好ましくは 6時間培養後、 公知の方法 〔Mol . BiotechnoL , 13, 29 (1999) ; Anal. Chemi 70, 579A ( 1998) ; J. Recept. Signal Transduct. Res. , 19, 395 ( 1999) ; J. Recept. Signal Transduct. Res. , 20, 189 (2000) ; Methods Mol. Biol. , 130, 165 (2000)〕 にしたがって、 レポ一 夕一遺伝子の発現量、 レポ一夕一ポリペプチドの発現量、 またはレポーターポリ ペプチドの活性を測定する。 コントロールとして、 種々の濃度の活性ペプチド標 品、 該活性ペプチドを含まない試料、 または活性ペプチド前駆体遺伝子を導入し ない細胞株の培養上清等を用いて同様のアツセィを行う。 コントロールの結果と 比較することにより、 試料中の活性ペプチドを検出、 測定することができる。
既知の GPCRの代わりに、 ペプチドをリガンドとすることが明らかになつていな い GPCR、 あるいはォ一ファン GPCRを用いたアツセィ細胞を構築した場合には、 該 GPCRのリガンドペプチドを同定することができる。 また、 上記 4.で記載した活性 ぺプチド前駆体遺伝子の発現クローニングの際に、 これらのアツセィ細胞を用い て活性測定を行うことにより、 新規な活性べプチド前駆体遺伝子を探索すること ができる。
(b) レポ一夕一を用いないアツセィ系
6. (1) (b) または （2) (a) に記載した方法で活性ペプチドの受容体の発現 プラスミドを作製し、 該プラスミドを 6. (1) 〜 （4) で構築した宿主細胞に導入 して得られる安定形質転換株をアツセィ細胞として用いることができる。 アツセ ィ細胞の取得、 培養、 および細胞表面へのペプチド受容体の発現は、 上記 (a) と 同様にして行うことができる。 また、 上記 1.で取得した不死化細胞をアツセィ細 胞として用いることもできる。
受容体への活性べプチドの結合により生ずるアツセィ細胞内でのシグナルを測 定することによって、 試料中の該ペプチドを検出することができる。 細胞内での シグナルは受容体に依存しており、 例えばァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 Ca2+上昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cA P減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシ トールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 （例えば、 CREB、STAT1、STAT2、 STAT3、 STAT4、 STAT5aヽ STAT5bヽ STAT6、 MAPキナーゼ、 ATF- 2、 c- Jun、 c - fos、 I - B 、 I - B ?、 Smadl, Smad2、 Smad3、 Smad5、 Smad8等） のリン酸化、 c- f os活性化、 細胞内 pH の変動、 細胞増殖等をあげることができ、 文献に記載の方法 〔J. Biol. Chem. , 271, 1857 (1996 ) ; Science, 268, 98 (1995) ; J. Pharmacol . Exp. Ther. , 275, 1274 ( 1995) ; J. Biol. Chem. , 272, 1822 ( 1997) ; J. Recept. Signal Transduct. Res. , 17, 57 ( 1997) ; Endocrinology 138, 1400 (1997) ; Endocrinology 1385 1471 (1997) ; Nat. Biotec nol. , 16, 1334 (1998) ; Biochem. Biophys. Res. Co腦 un.， 2513 471 ( 1998) ; Brit. J. Pharmacol . , 125, 4840
1387 (1998) ; Trends BiotechnoL , 15, 487 (1997) ; Anal. Biochem. , 252, 115
(1997) ; Nature, 358, 325 (1992) ; Nature, 393, 272 (1998) ; Cell, 92, 573
(1998) ; J. Biol . Chem. , 272, 27497 (1997) ; Trends Pharmacol . Sci.3 18, 430 (1997) ; Trends Pharmacol. Sci . , 20, 370 ( 1999) ; 翻/ 46995〕 に準じて 測定できる。 また、 受容体への活性ペプチドの結合により、 発現量が変動する遺 伝子あるいは発現量や状態が変動する蛋白質を測定することにより、 受容体に結 合する活性ぺプチドを検出することもできる。
既知の GPCIiの代わりに、 ペプチドをリガンドとすることが明らかになつていな い GPCR、 あるいはォーファン GPCRを用いたアツセィ細胞を構築した場合には、 該 GPCRのリガンドペプチドを同定することができる。 また、 上記 4.で記載した活性 ぺプチド前駆体遺伝子の発現クローニングの際に、 これらのアツセィ細胞を用い て活性測定を行うことにより、 新規な活性べプチド前駆体遺伝子を探索すること ができる。
[II]宿主 ·ベクタ一系の利用
上記 [I] 6.で構築した宿主 'ベクタ一系は、 活性ペプチドの受容体のアツセィ 系の構築だけでなく、 以下のことにも利用できる。
1.任意の GPCRのァヅセィ系の構築と該ァヅセィ系を用いた任意の GPCRのリガンド、 ァゴニストまたはアン夕ゴニストの探索
(a) レポ一夕一を用いるアツセィ系
[I] 6. (1) (b) または [I] 6. (2) (a) に記載した方法と同様にして任意 の GPCRの発現プラスミ ドを作製し、 [I] 6. (5) (a) と同様にしてアツセィ細胞 を構築し、 該 GPCRを細胞表面に発現させる。 該細胞に、 ペプチド、 化合物等任意 の物質を被検物質として添加して培養後、 レポ一夕一遺伝子の発現量を測定し、 コントロール （物質を溶解させた溶媒のみを添加して培養した場合） と比べてレ ポーター遺伝子の発現量が増加する物質を選択することにより、 該 GPCRのリガン ドまたはァゴニストを取得することができる。
該被検物質に関しては、 GPCR遺伝子を挿入していないコントロールベクタ一を 導入したアツセィ細胞を用いて同様の被検物質の添加実験を行い、 レポーター遺 伝子の発現量を増加させない場合に、 該物質が GPCRの情報伝達系やレポ一夕一造 伝子の転写に作用しているのでなく、 GPCRに作用するリガンドまたはァゴニスト であることを確認できる。 該リガンドまたはァゴニストに関して、 他の GPCRを発 現させたアツセィ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、 該リガンドまたは ァゴニス卜の GPCR特異性を評価することができる。
また、 任意の GPCRを発現させたアツセィ細胞に、 該 GPCRのリガンドまたはァゴ ニストおよび被検物質として任意の物質を添加して培養後、 レポ一夕一遺伝子の 発現量を測定し、 コントロール （リガンドまたはァゴニストのみを添加した場合 ) と比べてレポ一夕一遺伝子の発現量が減少する物質を選択することにより、 該 GPCRのアン夕ゴニス卜を取得することができる。
該物質に関しては、 他の GPCRを発現させたアツセィ細胞と該 GPCRのァゴニスト を用いて同様の実験を行い、 レポ一夕一遺伝子の発現量を減少させない場合に、 該物質が GPCRの情報伝達系やレポ一夕一遺伝子の転写に作用しているのでなく、 特定の GPCRのみに作用するアン夕ゴニストであることが確認できる。
(b) レポ一夕一を用いないアツセィ系
上記 （a) において、 レポーター遺伝子の発現を測定する代わりに、 [I] 6. (5 ) (b) に記載したアツセィ細胞内でのシグナルを測定する方法を用いて測定を行 うことにより、 任意の GPCRのリガンド、 ァゴニストまたはアン夕ゴニストの探索 を行うことができる。
2.任意の GPCRの構成的活性の評価
誘導発現系を用いた GPCRのアツセィ系において、 任意の GPCR遺伝子を一過的に 高発現させることにより、 該 GPCRの構成的活性を測定することができる。
GPCRの誘導発現に必要な転写因子を発現し、 レポ一夕一系を組み込んだ [I] 6. (3) または [I] 6. (4) に記載の方法で構築された宿主細胞に、 [I] 6. (2) ( a) に記載した方法で作製した任意の GPCRの誘導発現プラスミドを導入して得られ る安定形質転換株を評価用の細胞として用いる。
[I] 6. (5) と同様にして、 該形質転換細胞の該 GPCRを誘導発現させ、 GPCRを 誘導発現させない場合とでレポ一夕一遺伝子の発現量を比較する。 GPCRを誘導発 現した時にレポ一夕一遺伝子の発現量が増加する場合、 該 GPCRは構成的活性を有 すると判定できる。 このようにして、 構成的活性を示す GPCR (構成活性型 GPCR) を選択することができる。
3.構成活性型 GPCRを用いたインバースァゴニストまた (まァゴニストの探索 2.と同様にして任意の構成活性型 GPCRを誘導発現できるアツセィ細胞を構築す る。 該細胞に、 ペプチド、 化合物等任意の物質を被検物質として添加後、 該 GPCR を誘導発現させ、 レポ一ター遺伝子の発現量を測定し、 コントロール （物質を溶 解させた溶媒のみを添加した場合） と比べてレポ一夕一遺伝子の発現量が減少す る物質を選択することにより、 該構成活性型 GPCRのインバースァゴニストを取得 できる。
コントロールと比べてレポ一夕一遺伝子の発現量が増加する物質を選択するこ とにより、 該構成活性型 GPCRのァゴニストを取得できる。
該物質に関しては、 GPCR遺伝子を挿入していないコントロールベクタ一を導入 したアツセィ細胞を用いて同様の被検物質の添加実験を行い、 レポーター遺伝子 の発現量を変化させない場合に、 該被検物質が GPCRの情報伝達系やレポ一夕一遺 伝子の転写に作用しているのでなく、 GPCRに作用するインバースァゴニストまた はァゴニストであることを確認できる。 該インバースァゴニストまたはァゴニス 卜に関して、 他の構成活性型 GPCRを発現させたアツセィ細胞を用いて同様の実験 を行うことにより、 該インバースァゴニストまたはァゴニス卜の GPCR特異性を評 価することができる。
また、 [Π] 1.と同様にして該構成活性型 GPCRのァゴニストと任意の物質を添 加して培養後、 レポ一夕一遺伝子の発現量を測定し、 コントロール （ァゴ二スト のみを添加した場合） と比べてレポーター遺伝子の発現量が減少する物質を選択 し、 さらにァゴニストを添加しないで該物質のみを添加した場合には、 ァゴニス トも該物質も添加しない場合と比較して、 レポ一夕一遺伝子の発現量が減少しな い物質を該 GPCRのアン夕ゴニスト （ニュートラルアン夕ゴニスト） として選択す ることができる。 該アン夕ゴニストに関して、 他の構成活性型 GPCRを導入したァ ッセィ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、 該アン夕ゴニストの GPCII特異 性を評価することができる。
4.発現クロ一ニング
細胞や組織から単離した cDNAを [I] 6. (1) (b) または [I] 6. (2) (a) に 記載した発現べクタ一に挿入することにより cDNAラィブラリ一を作製する。
cDNAソースとして、 ヒトまたは動物のいかなる組織や細胞も使用することがで きる。 例えば、 ヒトゃ動物由来の各種組織、 細胞、 または細胞株を用いることが できる。
これら細胞より mRNAを取得し、 該 mRNAより 2本鎖 cDNAを合成し、 該 cDNAを [I] 6.
(1) (b) または [ I] 6. (2) (a) に記載した発現用ベクターのプロモーターの 下流に挿入して組換えベクターを作製後、 該組換えぺク夕一を大腸菌に導入して CDNAライプラリーを作製する。 以上の cDNAライブラリーの作製はモレキュラー · クロ一ニング第 3版、 特開平 05- 336963等に記載の公知の方法に準じて行うことが できる。得られた cDNAライブラリ一 （該組換えベクターを導入した大腸菌） を適 当な濃度に希釈して寒天培地上で培養し、 出現した個々のコロニーをクローンと して単離することができる。 また、 各クローン （大腸菌） からそれそれ cDNAクロ —ンとしてプラスミド （組換えべクタ一） を単離できる。 プラスミ ドはモレキュ ラー .クローニング第 3版等に記載の常法あるいは QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (キアゲン社製） 等のキヅトを用いて単離できる。
該 cDNAライブラリーを 1〜； 10000クロ一ン （大腸菌） ずつ、 好ましくは 10〜； 100ク ローンずつのプールに分け、 各プールごとに大腸菌を培養しプラスミド （cDNAク ローンの混合物） を単離する。 得られた各プール由来の組換えべクタ一をそれぞ れ、 [I] 6. (3) (b) または [I] 6. (4) (b) で作製したレポ一夕一系を組み 込んだ宿主細胞に、 [I] 3. (1) に記載の方法で導入し、 [I] 6. (5) に記載の 方法で安定形質転換株を得る。
得られた安定形質転換株を [I] 6. (5) に記載の方法で培養し、 各 cDNAクロー ンを発現させる。 該形質転換株のレポーター遺伝子の発現量を測定し、 同時に cDNAを発現させない場合 （誘導発現の場合は発現を誘導しない場合、 構成的発現 の場合は空べクタ一を導入した宿主細胞） のレポ一夕一遺伝子の発現量も測定す る。 両者を比較し、 cDNAを発現させた場合にレポーター遺伝子の発現量が上昇し たプールを選択する。 選択したプールについて、 再度より細かくプ一ル分けし、 同様の操作を行う。 この工程を繰り返し、 最終的に 1クローンごとに上記の操作を 行なうことにより、 宿主細胞中のレポーター遺伝子の発現を制御している応答配 列からの転写を増加させる活性を有する分子 （例えば、 構成活性型 GPCR、 転写因 子、 シグナル伝達分子、 または酵素等） をコードする cDNAを取得することができ る。
また、 上記と同様にして形質転換株に各プールの cDNAを発現させた後、 該形質 転換株に任意の物質を添加して 2〜； L2時間 （好ましくは 6時間） 培養後、 レポ一夕 一遺伝子の発現量を測定し、 同時に任意の物質を添加しないで培養した場合のレ ポーター遺伝子の発現量も測定する。 両者を比較し、 任意の物質を添加した場合 にレポ一夕一遺伝子の発現量が上昇したプールを選択する。 選択したプールにつ いて、 再度より細かくプール分けし、 同様の操作を行う。 この工程を繰り返し、 最終的に； Iクローンごとに上記の操作を行なうことにより、 任意の物質に反応して レポーター遺伝子の発現を制御している応答配列からの転写を増加させるぺプチ ド （例えば、 任意の物質をリガンドまたはァゴニストとする GPCR、 任意の物質が 存在した時に活性化または不活性化する転写因子、 任意の物質が存在した時に活 性化または不活性化するシグナル伝達分子、 あるいは任意の物質が存在した時に 活性化または不活性化する酵素等） をコードする cDNAを取得することができる。 また、 以下のようにしてプール分けしないで発現クローニングを行うこともで きる。
上記の方法で調製した全 cDNAライブラリーから常法あるいは Plasmid Maxi Kit (キアジェン社製） 等のキヅトを用いてプラスミドを調製する。 該プラスミ ドを、 細胞表面分子ある ゝは GFP等の生きた細胞のままで検出可能な分子をレポーターと して発現することのできる宿主細胞に導入して、 安定形質転換株を取得する。 上 記と同様にして cDNAを発現後、 これら検出可能な分子の発現の高い細胞を取得す る。 あるいは、 cDNAを発現させた細胞に任意の物質を添加して培養した後、 該分 子の発現の高い細胞を取得する。 該分子が細胞表面分子の場合は、 該分子を認識 する抗体で細胞を染色した後、 蛍光活性化セルソ一夕一 （fluorescence activated cell sorter；以下、 FACSと略記する） を用いて、 抗体への結合能が高 い細胞を分取する。 該分子が GFPの場合は、 FACSを用いて GFPの発現量が高い細胞 を分取する。 分取した細胞を培養後、 同様の操作を繰り返すことにより、 cDNAを 発現した時に該分子の発現が増加する細胞、 あるいは任意の物質を添加した時に 該分子の発現が増加する細胞を濃縮することができる。 該細胞から、 公知の方法、 例えば、 ハート法 〔Mol. Cell. Biol.， 8, 2837 (1988)〕 により、 導入プラスミ ドを回収することができる。 該プラスミドを再度宿主細胞に導入し、 同様の操作 を行うことにより、 該プラスミド中の cDNAを発現した時に該分子の発現が増加す るかどうか、 あるいは該 cDNAを発現した細胞に任意の物質を添加した時に該分子 の発現が増加するかどうかを確認することができる。
上記の方法により取得された cDNAの塩基配列は、 該 DNA断片をそのままあるいは 適当な制限酵素等で切断後、 モレキュラー 'クローニング第 3版等に記載の常法に よりベクターに組み込み、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕、 あるいは市販のキヅ 卜 (Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, d hodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitまたは BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, アプライ ド ·パ ィォシステムズ社製) と ABI PRISM 377 (アプライド ·バイオシステムズ社製) 等 の DNAシークェンサ一を用いて決定することができる。 該塩基配列より、 取得した cMAがコードするぺプチドのアミノ酸配列を決定することができる。
このようにして得られたペプチドの発現プラスミドを、 [II] 1.または [Π] 3. に記載の方法に準じて作製し、 アツセィ細胞を構築する。 ペプチドが構成的にあ るいは活性化を受けて転写を活性化する作用を有する場合は、 任意の物質を添加 して培養後、 レポーター遺伝子の発現量を測定することにより、 該ペプチドの阻 害剤または活性化剤を選択し、 取得することができる。
5.構成活性型の変異 GPCRの造成
構成活性型ではない GPCRをコードする MAに、 文献〔モレキュラー 'クローニン グ第 3版； Current Protocols m Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1987-2001) (以下、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー 'バイオ口 ジ一と称す） ； Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 48 (1985); Methods Mol. Biol., 57, (1996); BioTechniques, 25, 958 (1998); BioTechniques, 25, 958 (1998); BioTechniques, 2A, 428 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9670 (1996 ) 〕 に記載の方法に準じて、 部位特異的変異あるいはランダム変異を導入する。 変異導入した GPCRをコードする DNAを、 [I] 6. (2) (a) に記載した誘導発現 用ベクターのプロモ一夕一の下流に揷入して、 多数の変異導入 DNAのライブラリー を作製する。 [II] 4.記載の方法と同様にして、 該変異導入 DNAライブラリーをプ —ル分けした後、 各プールの DMを [I] 6. (3) または [I] 6. (4) 記載のレポ一 夕一系および誘導発現に必要な転写因子の発現ュニットを組み込んだ宿主細胞に 導入し、 安定形質転換株を取得する。 [I I] 2.記載の方法にしたがって、 DNAの発 現を誘導した時としない時のレポーター遺伝子の発現を比較し、 発現を誘導した 時にレポーター遺伝子の発現量が増加するプールを選択する。 選択したプールに ついて再度より細かくプール分けし、 同様の操作を行う。 この工程を繰り返し、 最終的に 1クローンごとに上記の操作を行なうことにより、 構成活性型の変異 GPCR をコードする DNAを取得することができる。 [II] 4.記載の方法を用いて、 FACSを 用いて選択を行うこともできる。
変異の部位や変異するァミノ酸の種類によつて該変異導入 DNAがコードする GPCR の構成的活性の強さや、 リガンド、 ァゴニスト、 またはアン夕ゴニストに対する 反応性が変化する。 インバースァゴニストゃァゴニストの探索のためには、 リガ ンド、 ァゴニスト、 およびアン夕ゴニストに対する特異性が天然型 GPCRと変わら ないことが望ましいが、 このような変異型 GPCIま、 これまでの知見 〔J. Biol. Chem. , 271, 1857 ( 1996); Science, 268, 98 ( 1995) ; J. Pharmacol . Exp. Ther. , 275, 1274 (1995) ; J. Biol. Chem. , 272, 1822 (1997) ; J. Recept. Signal Transduct. Res. , 17, 57 ( 1997) ; Mol. NeurobioL , 17, 109 ( 1998) ; J. Biol. Chem. , 274, 18574 (1999) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 7615 (2000) ; Mol. Pharmacol. , 57, 890 (2000) ; W098/46995) を参考に、 リガンド、 ァゴニスト、 およびアン夕ゴニストに対する特異性が天然型 GPCRと比較して変化 しない確率の高い部位〔例えば、 第 3膜貫通領域の後半から第 2細胞内領域の前半 部分、 上記領域中に存在し、 多くの GPCRで保存された （Aspまたは Glu)- Arg Tyr配 列 （以下、 D/ERYモチーフとよぶ） に対応する各アミノ酸、 第 3細胞内領域の後半 から第 6膜貫通領域の前半部分〕 にランダムに変異導入することにより取得するこ とができる。 また、 第 6膜貫通領域中に存在する多くの G蛋白質共役型受容体で保 存されたプロリン残基 （プロリン残基が保存されていない G蛋白質共役型受容体の 場合は該プロ.リン残基の位置に対応するアミノ酸残基） から数えて （該プロリン 残基を 0番目として） N末側に 20残基目あるいは 22残基目のアミノ酸にランダムに 変異導入することにより取得することができる。 また、 GPCRをコードする MAの全 域に渡ってランダムに変異を導入して、 その中から構成活性型の GPCRを選択し、 目的にあった変異体かどうかを評価することにより、 ィンバ一スァゴニストを感 度よく、 高いシグナル/ノイズ比で探索するのに適した、 構成的活性の強い変異 体を選択することができる。
構成活性型になった変異型 GPCI こ導入された変異の部位と種類 （アミノ酸置換、 欠失、 付加） を決定することにより、 任意の GPCRの構造と活性の相関についての 情報を得ることができる。構成活性型の変異 GPCRは、 しばしば疾患の原因となつ ているため、 該情報をもとに疾患との関連を調べることができる。
また、 使用した転写因子応答配列 （例えば、 CREや NF B応答配列） からの転写 を直接または間接的に増加させる活性を有する分子 （例えば、 転写因子、 シグナ ル伝達分子、 または酵素等） に関しても、 上記と同様にしてランダム変異を導入 することにより、 構成活性型の変異体を取得することができる。
また、 上記分子にランダム変異を入れることによって、 構成的活性を示さなくな つた変異体やドミナントネガティブ変異体を取得することもできる。
[III]視床下部および勝臓ランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株の利用
1.本発明の細胞株を用いた、 薬物、 生理活性物質、 受容体の探索法または評価法 本発明の方法により、 内分泌細胞、 例えば視床下部細胞、 ランゲルハンス氏島 細胞等の形質を保持する多種の細胞株を取得することにが可能となったため、 こ れらの細胞株を用いると、 様々な内分泌細胞、 例えば視床下部細胞、 ランゲルハ ンス氏島細胞等に作用する物質 （ペプチド、 化合物、 薬物等） を効率よく探索ま たは評価することが初めて可能となった。
また、 本発明の細胞株を用いれば、 特定の内分泌細胞を多量に増やすことが可 能なため、 特定の内分泌細胞で発現する受容体や生理活性物質を取得することが 可能である。
以下 （a) および （b) に視床下部由来あるいはランゲルハンス氏島由来の細胞 株を用いた具体例をあげる。
(a) 上記 [I] 1. (1) で取得した多種類の視床下部由来細胞株の混合物あるい は個々の視床下部由来細胞株、 または多種類のランゲルハンス氏島由来細胞株の 混合物あるいは個々のランゲルハンス氏島由来細胞株と任意の物質 （ぺプチド、 化合物、 薬物等） を接触させ、 任意の物質に対する該細胞の反応性を調べること により、 該細胞株に作用する物質を探索または評価することができる。
細胞の培養法としては上記 [I] 1. (1) あるいは [I] 1. (4) に示した方法を 、，，
WO 03/087366 使用することができる。
任意の物質への細胞の反応性の測定は、 例えば、 上記 [I] 6. (5) (b) で記載 したアツセィ細胞の反応を測定する方法に準じて行うことができる。
細胞と接触させる薬物としてはいかなる薬物も使用することができるが、 例え ば、 視床下部に作用して薬効を示す薬物 （抗肥満藥、 悪液質治療薬、 抗アレルギ 一薬、 抗免疫薬、 抗炎症薬、 腫瘍治療薬、 ウィルス治療藥、 および精神神経作用 薬等） 、 ランゲルハンス氏島に作用して薬効を示す薬物 （抗糖尿病薬、 悪液質治 療薬、 抗免疫薬、 抗炎症薬、 腫瘍治療薬、 ウィルス治療薬、 およぴ抗肥満薬等） 、 視床下部あるいはランゲルハンス氏島での副作用が問題となる薬物、 あるいは視 床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞に発現する分子 （例えば種々の受容 体等） を標的とした薬物を使用することができる。
細胞と接触させるぺプチドとしてはいかなるペプチドも使用できるが、 例えば、 受容体未知のペプチド、 あるいは機能未知の分泌蛋白質、 膜蛋白質、 ペプチドを 使用することができる。該ペプチドの代わりに、 該ペプチドを発現する細胞を用 いることもできる。
細胞と接触させる化合物としてはいかなる化合物も使用できるが、 例えば、 動 物の生体中に存在することが知られている物質を使用することができる。
該細胞株に作用する物質が見つかった場合は、 該物質に反応する細胞株から、 該物質と相互作用する分子 （受容体、 酵素、 転写因子等） を取得することができ る。 該物質と相互作用する分子の取得法としては、 例えば、 該物質との親和性を 利用した精製法、 あるいは発現クロ一ニング法を使用することができる。
(b) 本発明の細胞株を各種条件下で培養した後の培養液、 細胞、 または該細胞 の抽出液を用いて、 生理活性物質を探索することができる。 培養法としては、 上 記 [Π 1. (1) あるいは [I] 1. (4) に記載した方法を用いることができる。
例えば、 任意の蛋白質 （受容体、 酵素、 転写因子等） を発現させた細胞および 該蛋白質を発現させていない細胞に、 それそれ上記の細胞株の培養液、 細胞、 ま たは該細胞の抽出液を接触させ、 任意の蛋白質 （受容体、 酵素、 転写因子等） を 発現させた細胞の方が強く反応するかどうかを調べることによって、 任意の蛋白 質に作用する生理活性物質を探索することができる。
細胞の反応性の測定は、 例えば、 上記 [I] 6. (5) (b) に記載したアツセィ細 胞の反応を測定する方法に準じて行うことができる。
培養液中、 細胞中、 または細胞抽出液中に活性が検出された場合は、 一般的な 方法 Spectrometric Identification of Organic Compounds, 6th Edition, John Wiley & Sons (1997)〕 を用いて、 生理活性物質を単離し、 その構造 （全構 造または部分構造） を決定することができる。 生理活性物質がペプチドである場 合は、 一般的な方法 〔遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析、 東京化 学同人、 （1993)〕 を用いて決定した構造 （全構造または部分構造） を基に、 対応 する遺伝子を取得することができる。 生理活性物質がペプチドである場合は、 活 性を示した細胞をソースとして作製した cDNAライブラリ一や遺伝子ライブラリ一 を用いた発現クローニングによって活性物質をコードする遺伝子を取得し、 活性 物質の構造を明らかにすることができる。
2.視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞で発現する有用遺伝子、 有用ぺ プチドの取得法
視床下部およびランゲルハンス氏島には多種の細胞が存在しており、 それそれ の細胞は生体の恒常性の維持に重要な特定の機能を果たしていると考えられる。 それらの機能は、 視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞が発現する各種 の受容体や各種の生理活性物質の働きを介して発揮される。 特定の視床下部細胞 あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞で特異的に発現する遺伝子ゃぺプチドは、 その細胞特異的な機能に関与していると考えられる。 中でも特定の視床下部細胞 あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞で特異的に発現する分泌ぺプチドは、 生 理活性物質として機能している可能性が高い。 また、 視床下部細胞あるいはラン ゲルハンス氏島細胞を刺激した時に発現が変動する遺伝子も、 視床下部細胞ある いはランゲルハンス氏島細胞の機能を調節する上で重要な受容体や生理活性物質 をコードしている可能性が高いと考えられる。
したがって、 特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞で特 異的に発現する遺伝子やべプチドを探索することによって、 該細胞の機能発現に 重要なペプチド （各種受容体、 各種生理活性物質、 各種転写因子等） あるいはそ れらをコードする遺伝子を取得できると考えられる。 本発明で取得した視床下部 細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞の形質を保持する細胞株を用いれば、 1種 類の視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞を多量に増やすことが可能な ため、 特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞で特異的に発 現している遺伝子やペプチドを取得することが可能になる。 本発明では、 視床下 部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞の形質を保持する多種の細胞株を取得す ることに成功したため、 様々な視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞で 特異的に発現している遺伝子やべプチド、 特定の視床下部細胞あるいは特定のラ ンゲルハンス氏島細胞を刺激した際に発現が変動する遺伝子ゃぺプチド、 あるい は特定の視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞で発現される分泌蛋白質 等の探索と取得が可能となった。 以下 （a) 、 (b) 、 (c) および （d) に具体例 をあげる。 また、 （a) 〜 （d) の方法で取得したラヅト視床下部細胞あるいはラ ットランゲルハンス氏島細胞由来の遺伝子への相同性を利用して、 ヒトゃマウス 等の他の哺乳類の対応する遺伝子を取得することができる。 .
(a) シグナルシーケンストラヅプ法を用いた分泌シグナル配列を有するぺプチド をコードする遺伝子の取得
ペプチド性のリガンドゃ、 細胞表面に存在する受容体は、 一般にシグナル配列 を有していることから、 本発明の任意の細胞株をソースとして用いてシグナルシ —ケンストラヅプ法 〔Science, 261, 600 (1993); Nat. BiotechnoL , 17, 487 (1999)〕 を行うことにより、 該細胞株で発現しているリガンドゃ受容体を効率的 に取得することができる。
神経ペプチドやホルモン、 あるいはそれらの受容体は、 各種の刺激でその遺伝 子の発現量が変動することが知られている。 したがって、 各種の刺激を行った本 発明の細胞株をソースとしてシグナルシーケンストラップ法を行うことにより、 該細胞株で発現しているリガンドや受容体をより効率的に取得することができる。 細胞株の培養法または刺激法としては、 上記 [I] 1. (1) および [I] 1. (4) に記載した方法を用いることができる。
シグナルシーケンストラップ法で使用する cDNAは部分断片であるため、 該 cDNA の配列に特異的なプローブを用いたハイプリダイゼーシヨンにより全長 cDMを取 得する。 該全長 cDNAの塩基配列を決定することにより、 該 cDNAがコードするぺプ チドを同定することができる。
該ペプチドのアミノ酸配列対して、 相同性検索、 モチーフ検索、 あるいは疎水 性検索を行うことによって、 該ペプチドの機能を推定することができる。例えば、 上記解析により、 該ペプチドが、 受容体、 リガンド、 トランスポー夕一、 酵素等 として機能するかどうかを推定することができる。 分泌シグナル配列や膜貫通領 域を有するかどうかを調べることにより、 該ぺプチドが分泌蛋白質か膜蛋白質か を確認することもできる。
該ぺプチドをコ一ドする MAを適当な細胞で発現させることにより、 該ぺプチド を生産し、 該ペプチドの活性を実験的に調べることができる。 例えば、 発現方法 として、 下記 3.で示す方法に準じた方法をあげることができる。
(b) 特定の細胞株で特異的に発現している遺伝子の取得
該取得方法としては、 二つの異なるサンプル間で発現が異なる遺伝子を取得す る方法である、 サブトラクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5738 (1988)) や representational difference analysis Nucleic Acids Res. , 22, 5640 ( 1994)〕 による方法をあげることができる。 また、 DNAチップ法 〔蛋白質核 酸酵素， ， 1841 (2000) ; 日本臨床， ， 465 (1999)〕 等を用いて個々の細胞株 で発現している遺伝子を解析し、 他の細胞株で発現している遺伝子と比較するこ とにより、 各細胞株で特異的に発現している遺伝子を同定することができる。
以下、 サブトラクシヨン法を用いた例を記す。
本発明の任意の細胞株より作製した cDNAライブラリーに対して、 該細胞株以外 の細胞 （例えば、 同じ組織 （視床下部またはランゲルハンス島） 由来で異なる形 質を示す細胞株、 または別の組織由来の細胞または細胞株） より取得した mRNAを 用いてサブトラクシヨンを行う。 該細胞株特異的な遺伝子を濃縮した差分化 cDNA ライブラリーを調製した後、 該差分化 cDNAライブラリー中の挿入 cDNAの塩基配列 を 5'側からランダムに決定する。 決定した配列に特異的なプライマーを作製し、 該プライマーを用いた PCRを行うことにより、 差分化に使用した 2種類の細胞にお ける該配列を有する遺伝子の発現量を調べることができる。 これにより、 該細胞 株において特異的に発現する遺伝子を同定することができる。
特異的に発現する遺伝子に対応する cDNAの全塩基配列を決定することにより、該 cDNAがコードするべプチドを同定することができる。 差分化ライブラリ一中の cDNAが部分断片である場合、 該 cDNAの配列に特異的なプロ一プを用いたハイプリ ダイゼ一シヨンにより、 全長 cDNAを取得することができる。 該全長 cDNAの塩基配 列を決定することにより、 該 cDNAがコードするぺプチドを同定することができる。 該ペプチドのアミノ酸配列に対して、 相同性検索、 モチーフ検索、 あるいは疎 水性検索を行うことによって、 該ペプチドの機能を推定することができる。 例え ば、 上記解析により、 該ペプチドが、 受容体、 リガンド、 転写因子、 トランスポ 一夕一、 酵素等として機能するかどうかを推定することができ,る。 分泌シグナル 配列や膜貫通領域を有するかどうかを調べることにより、 該ペプチドが分泌蛋白 質か膜蛋白質かを決定することもできる。
該ぺプチドをコ一ドする DNAを適当な細胞で発現させることにより、 該ぺプチド を生産し、 該ぺプチドの活性を実験的に調べることができる。
また、 差分化した cDNAを用いて、 上記のシグナルシーケンストラップ法を行う ことにより、 本発明の任意の細胞株で特異的に発現しているリガンドゃ受容体を 効率よく取得することができる。 サブトラクシヨンが可能なベクターを用いてシ グナルシーケンストラップ用のライブラリ一を作製することにより、 サブトラク シヨンとシグナルシークェンストラヅプを効率的に行うことができる。
(c) リガンドゃ受容体をコ一ドする遺伝子の効率的取得
神経ペプチドやホルモン、 あるいはそれらの受容体は、 各種の刺激でその遺伝 子の発現量が変動することが知られている。 したがって、 各種の刺激を行った本 発明の任意の細胞株について、 各種刺激を行った場合と行わない場合で発現が変 動する遺伝子を比較することによってリガンドゃ受容体をコードする遺伝子をよ り効率的に取得することができる。 具体的な方法としては、 上記 （b) で記載した サフ卜ラクシヨン法、 representational difference analysis法、 または賺チヅ プ法を用いることができる。 培養法および剌激法としては、 上記 [I] 1. (1) お よび [I] 1. (4) に記載した方法を用いることができる。
サブトラクシヨン法で取得した差分化した cDNAを用いて、 上記のシグナルシー ケンストラップ法を行うことにより、 本発明の任意の細胞株を刺激した際に発現 が変動するリガンドゃ受容体を効率よく取得することができる。 サブトラクショ ンが可能なベクタ一を用いてシグナルシーケンストラヅプ用のライプラリーを作 製することにより、 サブトラクシヨンとシグナルシークェンストラップを効率的 に行うことができる。
(d) 特定の細胞株で特異的に発現しているペプチドや、 あるいは特定の細胞株を 刺激した際に発現が変動するぺプチドの同定および取得 一般に知られているプロテオミクスの手法 〔 Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics, Springer (1997) ; Proteome and Protein Analysis, Springer (2000)〕 を用いて解析し、 特定の細胞株で特異的に発現して いるべプチド、 あるいは特定の細胞株を刺激した際に発現が変動するべプチドを 同定することができる。 市販されている機器を用いることもできる。
例えば、 本発明の任意の細胞株を各種条件下で培養後、 培養液または細胞の抽 出液中に存在するべプチドを解析する。 他の細胞株の培養液または抽出液中に存 在するペプチドについても同様の解析を行い、 両者の結果を比較することで、 特 定の細胞株で特異的に発現しているぺプチドを同定することができる。 視床下部 由来細胞株で特異的に発現している分泌べプチドは、 神経べプチドゃホルモンと して作用することが期待される。 したがって、 視床下部由来細胞株の培養液中に 特異的に存在するべプチドを同定することにより、 神絰ぺプチドゃホルモンを取 得することが可能と考えられる。
また、 神経べプチドゃホルモンは各種の刺激で発現量や分泌量が変動すること が知られている。 したがって、 任意の視床下部細胞株を異なる条件下で培養し、 培養条件により発現が変動する分泌ぺプチドを同定することにより、 神経ぺプチ ドやホルモンを効率的に取得することが可能と考えられる。
培養法または刺激法としては、 上記 [I] 1. (1) および [I] 1. (4) に記載し た方法を用いることができる。
上記で取得したぺプチドの部分アミノ酸配列は公知の方法を用いて決定するこ とができる。 また、 公知の方法を用いて、 該アミノ酸配列を基に対応する遺伝子 を取得することができる。
3.視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するべプチドの生産法
[I] 4.または [III] 2.に記載の方法で取得されたペプチドをコードする遺伝 子あるいは、 該遺伝子との相同性を利用して取得される、 ヒトゃマウス等の他の 哺乳類の対応.する遺伝子を適当な宿主細胞中で発現させることにより、 該遺伝子 がコードするペプチドを製造することができる。 方法としては、 モレキュラー ' クロ一ニング第 3版、 カレント 'プロトコールズ 'イン 'モレキュラー 'バイオ口 ジ一等に記載された方法等を用いることができる。
即ち、 本発明の細胞株が発現するぺプチドをコードする遺伝子を適当な発現べ クタ一のプロモー夕一下流に挿入した組換え体べク夕一を造成し、 該ぺク夕一を 宿主細胞に導入することにより、 該ペプチドを発現する形質転換体を取得し、 該 形質転換体を培養することにより、 該ぺプチドを製造することができる。
宿主細胞としては、 原核細胞、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的 とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。 また、 動 物個体や植物個体を用いることができる。
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製が可能、 または染色体 中への組込みが可能で、 発現させる遺伝子 （仮に A遺伝子と呼ぶ） の転写に適した 位置にプロモータ一を含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、 A遺伝子の発現ベクターは、 原 核生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボソーム結合配列、 A 遺伝子、 転写終結配列、 より構成されていることが好ましい。 プロモーターを制 御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ぺク夕一としては、 例えば、 pLEX (インビトロジェン社製） 、 pRSET (イン ビトロジェン社製） 、 pGEMEX- 1 (プロメガ社製） 、 pQE- 30 (キアジヱン社製） 、 pKYPIO (特開昭 58- 110600) 、 pKYP200 CAgric. Biol. Chem 48, 669 (1984)〕 pLSAl CAgric. Biol. Chem 53, 277 ( 1989)〕 pGELl 〔Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 4306 (1985)〕 pCAL-n (ストラタジーン社製) 、 pTrs30 (FERM BP- 5407)、 pTrs32 (FERM BP- 5408)、 pGHA2 (FERM BP- 400)、 pGKA2 (FEBM B- 6798)、 pTerm2 (特開平 3- 22979、 US5342775) 、 pKK233-2 (アマシャム -バイオサイェン シズ社製） 、 pGEX (アマシャム ·バイオサイェンシズ社製) 、 pET3-a (ノバジェ ン社製） 、 pSupex pUBHO, pTP5 pC194、 p AL-c2X (ニュ一^ (ングランド 'バイ オラブズ社） 等を例示することができる
プロモータ—としては、 大腸菌等の宿主細胞中で転写を開始できるものであれ ばいかなるものでもよい。 例えば、 trpプロモーター (Ptrp) lacプロモ一夕一 (Plac) PLプロモーター、 Paプロモーター等の、 大腸菌やファージ等に由来する プロモーター、 SP01プロモーター、 SP02プロモ一夕一、 penPプロモ一夕一等をあ げることができる。 また Pkeを 2つ直列させたプロモーター (Ptr X 2) 、 ^プロ モータ一、 lacT7プロモーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変さ れたプロモータ一等も用いることができる。 リボゾーム結合配列としては、 シャイン-ダルガノ （ Shine- Dalgarno) 配列と開 始コドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜18塩基） に調節したプラスミ ドを用いる ことが好ましい。
A遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、 好適には構造遺伝 子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 プレビバクテ リウム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 シユードモナス属等 に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XL1-Blue Escherichiacoli XL2- Blue、 Escherichia col i 皿、 Escherichia coli MC1000、 Escherichia coli KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109S Escherichia col i HB101、 Escherichia col i No.49、 Escherichia col i W3110、 Escherichia coli NY49、 Escherichia coli BL21(DE3)、 Escherichia coli BLZl(DE3 )pLysS、 Escherichia col i HMS174(DE3)、 Escherichia col i H S174(DE3 )pLysS、 Serratia ficarias Serratia fonticola Serratia l iquefaciens、 Serratia marcescens^ Bacillus subtil is Baci l lus amyloliguefaciens 、 Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium immariophilum ATCC14068ヽ Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066 ヽ Corynebacterimn glutamicum ATCC13032 、 Corynebacterimn glut mi cum ATCC14067 ヽ Corynebacterimn glutamici ATCC13869ヽ Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Microbacterium ammoniaphilmn ATCC15354N Pseudomonas sp. D- 0110等をあげることができる。 組換えベクターの導入方法としては、 上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨン法 〔Nucleic Acids Res . , 16, 6127 ( 1988)〕 、 カルシウムイオンを用いる方法 [； Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 69, 2110 ( 1972 )〕 、 プロトプラスト法 （特開昭 63-248394)、 Gene, 17, 107 ( 1982 )や Mol . Gen. Genet. , 168, HI ( 1979)に記載の方法等をあ げることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEpl3 (ATCC37115 )、 YEp24 (ATCG37051 )、 YCp50 (ATCC37419 )、 pHS19、 pHS15 等を例示することができる。 プロモ一夕一としては、 酵母菌株中で転写を開始で きるものであればいかなるものでもよく、 例えば、 PH05プロモー夕一、 PGKプロモ 一夕一、 GAPプロモ一夕一、 ADHプロモーター、 gal 1プロモーター、 gal 10プロモ 一夕一、 ヒートショック蛋白質プロモ一夕一、 MF a: lプロモーター、 CUP 1プロモ —夕一等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、 サヅカロマイセス属、 シゾサヅカロマイセス属、 クルイべ 口ミセス属、 トリコスポロン属、 シヮニォミセス属等に属する酵母菌株をあげる ことができ、 具体的には、 Saccharomyces cerevisiaes Schizosaccharomyces pombeヽ Kluyveromyces lactisヽ Trichosporon pullulans、 Schwanniomyces alluvius 等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法 〔Methods. Enzymol . , 194, 182 (1990)〕 、 スフエロプラス ト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8 , 1929 ( 1978)〕 、 酢酸リチウム法 〔J. Bacteriol. , 153, 163(1983) ) 、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。 動物細胞を宿主細胞とする形質転換体は [ I] 3.に記載の方法により取得するこ とができる。
宿主細胞としては、 マウス · ミエ口一マ細胞、 ラヅト ' ミエローマ細胞、 マウ ス .ハイプリ ドーマ細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 BHK 細胞、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞、 ヒ トの細胞である Namalwa細胞または Namalwa KJM- 1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞、 ヒ ト白血病細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 299) s ヒト大腸癌細胞株等をあげることができる。
マウス · ミエ口一マ細胞としては、 SP2/0、 NS0等、 ラット ' ミエローマ細胞と しては YB2/0等、 ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293、 293等、 ヒト白血病細胞とし ては BALL- 1等、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞としては COS- 1、 COS- 7、 ヒト大腸癌 細胞株としては HCT- 15等をあげることができる。
上記 [I] の 3.に記載したように、 本発明の不死化細胞株を用いることもできる。 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えば、 Baculovinis Expression Vectors： A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, NewYork ( 1992)、 モレキュラー ·バイオロジー第 3版、 カレント ·プロトコ一ルズ ·ィン ·モレキュ ラー ·バイオロジー等に記載された方法によって、 ペプチドを発現することがで きる。 T JP03/04840 即ち、 組換え遺伝子導入べク夕一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 ぺプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 PVL1392 (フ ァーミンジェン社製） 、 PVL1393 (ファーミンジヱン社製）、 pBlueBac4.5 (イン ビトロジェン社製） 等をあげることができる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 ャガ科昆虫に感染するウィルスであるァ ゥ トグラファ · カリフォルニ力 · ヌクレア一 · ポリへドロシス · ウィルス (Autographa californica nuclear poly edrosis virus) 等を用いることができ る。
昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、 Trichoplusia の卵 巣細胞、 カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としては Sf9、 Sf21 CBaculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, NewYork ( 1992)〕 等、 Trichoplusia niの卵巣細胞としては High Five (インビトロジヱン社製） 等、 力 ィコ卵巣由来の培養細胞としては^!^ ffiori N4等をあげることができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ —と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 (特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 84, 7413 (1987)) 等をあげることができる。
また、 動物細胞に DMを導入する方法と同様の方法を用いて、 昆虫細胞に DNAを 導入することもでき、 例えば、 エレクトロポレ一シヨン法 〔Cytotechnology， 3, 133 (1990)〕 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法 〔 Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 84, 7413 (1987)〕 等をあげることができる
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、 公知の方法 〔組織培養， 20 ( 1994) ; 組織培養， 1 ( 1995) ; Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)〕 に準じて本発明の細胞株が発現するぺプチドを生産することができる。
遺伝子発現に用いるプロモー夕一としては、 植物細胞中で転写を開始できるも のであればいずれも用いることができ、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス の 35Sプロモーター、 ィネアクチン 1プロモーター等をあげることができる。 また、 JP03/04840 プロモーターと発現させる遺伝子の間に、 トウモロコシのアルコ一ル脱水素酵素 遺伝子のィントロン 1等を挿入することにより、 遺伝子の発現効率をあげることも できる。
宿主細胞としては、 ジャガイモ、 タバコ、 トウモロコシ、 イネ、 アブラナ、 大 豆、 トマト、 小麦、 大麦、 ライ麦、 アルフアルファ、 亜麻等の植物細胞等をあげ ることができる。 組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に DNAを導入する 方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム （ Agrobacterium) (特閧昭 59- 140885、 特開昭 60- 70080、 W094/00977) 、 エレクト ロボレ一シヨン法 Cytotechnology, 3, 133 (1990) ; 特開昭 60- 251887〕 、 パ一 ティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許第 2606856、 特許第 2517813) 等を あげることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、 ジャーファーメン夕ーを用いて大量培 養することができる。 また、 遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、 遺伝子が導入された植物個体 （トランスジヱニック植物） を造成することもでき o
動物個体を用いて本発明の細胞株が発現するペプチドを生産することもできる 例えば、 公知の方法 〔Am. J. Clin. Nutr. , 63, 639S (1996) ; Am. J. Clin. Nutr. , 63, 627S (1996) ; Bio/Technology, 9, 830 (1991 )〕 に準じて、 該ぺプチ ドをコードする遺伝子を導入した動物中に該ぺプチドを生産することができる。 プロモーターとしては、 動物で転写を開始できるものであればいずれも用いる ことができるが、 例えば、 乳腺細胞特異的なプロモーターであるひカゼインプロ モーター、 5カゼィンプロモーター、 ?ラクトグロプリンプロモーター、 ホェ一 酸性プロティンプロモー夕一等が好適に用いられる。
本発明の細胞株が発現するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ組換え体 ベクターを保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方法に従って培養し、 該ペプチドを生成蓄積させ、 該培養物より該ぺ プチドを採取することにより、 該ぺプチドを製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育ま たは栽培し、 該ペプチドを生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該ぺプ チドを採取することにより、 該ペプチドを製造することができる。 即ち、 動物個体の場合、 例えば、 該ペプチドをコードする遺伝子を保有する非 ヒト トランスジエニック動物を飼育し、 該ぺプチドを該動物中に生成 ·蓄積させ、 該動物中より該ぺプチドを採取することにより、 該ぺプチドを製造することがで きる。 該動物中の生成 ·蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク、 卵等をあ げることができる。
植物個体の場合、 例えば、 該ペプチドをコードする遺伝子を保有するトランス ジエニック植物を栽培し、 該ペプチドを該植物中に生成蓄積させ、 該植物中より 該ぺプチドを採取することにより、 該ぺプチドを製造することができる。
該ぺプチドを製造するための形質転換体が大腸菌等の原核生物、 酵母菌等の真 核微生物である場合、 これら生物を培養する培地は、 該生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば 天然培地、 合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、 該形質転換体が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクト一ス、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン 加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパ ノール等のアルコ一ル類が用いられる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の各種無機酸や有機酸のアンモニゥム塩、 そ の他含窒素化合物、 並びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチープ リカー、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体お よびその消化物等がを用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシ ゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。 培養温度 は 15〜40°Cがよく、 培養時間は、 通常 16〜96時間である。 培養中 pHは、 3.0〜9. 0 に保持する。 pHの調整は、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸力 ルシゥム、 アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培 地に添加してもよい。 03 04840 プロモー夕一として誘導性のプロモ一夕一を用いた発現べクタ一で形質転換し た微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデュ一サーを培地に添加しても よい。 例えば、 I プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培 養するときにはイソプロピル-/?- D-チォガラクトシド等を、 プロモ一夕一を 用 L、た発現べク夕一で形質転換した微生物を培養するときにはインドールァクリ ル酸等を培地に添加してもよい。
該ぺプチドを製造するための形質転換体が動物細胞である場合、 該細胞を培養 する培地は、 一般に使用されている RPMI1640培地 〔J. Am. Med. Assoc. , 199, 519 ( 1967)〕 、 Eagleの MEM培地 〔 Science, 1 2, 501 (1952)〕 、 DMEM培地 〔 Virology, 8, 396 ( 1959)〕 、 199培地 〔Proc. Soc. Exp. Biol. Med. , 73, 1 (1950)〕 またはこれら培地に FCS等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%C02存在下等の条件下で 1〜7日間行う。 また培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に添 加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている TNM-FH培地 （ファーミンジェン社製） 、 Sf - 900 II SFM培地 （ギ ブコ社製） 、 ExCell400、ExCell405 〔いずれも J R Hバイオサイエンシーズ （JRH Biosciences) 社製〕 、 グレース （Grace) の昆虫培地 〔Nature, 195, 788 ( 1962) 〕等を用いることができる。
pH6~7、 培養温度 25〜30°Cがよく、 培養時間は、 通常 1〜5日間である。
また、 培養中必要に応じて、 ゲン夕マイシン等の抗生物質を培地に添カ卩しても よい。
遺伝子の発現方法としては、 ペプチド全長を発現させる以外に、 部分ペプチド を発現させることもできる。
上記のぺプチド全長または部分ぺプチドは、 細胞内に単独で発現させる以外に、 モレキュラー 'クローニング第 3版に記載されている方法等に準じて、 分泌タンパ ク質または融合タンパク質として発現させることもできる。 融合させるタンパク 質としては、 -ガラクトシダーゼ、 プロティン A、 プロティン Aの IgG結合領域、 クロラムフエニコ一ル 'ァセチルトランスフェラ一ゼ、 ポリアルギニン、 ポリグ ル夕ミン酸、 プロテインお マルト一ス結合タンパク質、 グル夕チオン S -トラン スフエラーゼ、 ポリヒスチジン鎖 （His- tag)、 Sペプチド、 DNA結合タンパク質 ドメイン、 Tac抗原、 チォレドキシン、 グリーン ·フルォレヅセント ·プロテイン、 FLAGペプチド、 および任意の抗体のェピトープなどがあげられる 〔実験医学， ， 469 ( 1995))。
本発明の細胞株が発現するペプチド （部分ペプチドを含む） の生産方法として は、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に分泌させる方法、 あるいは宿主 細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿主細胞や、 生産させるペプチド の構造を変えることにより、 該方法を選択することができる。
該ペプチド （部分ペプチドを含む） が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生 産される場合、 ポールソンらの方法 〔J. Biol . Chem. , 264, 17619 (1989)〕、 ロウ らの方法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227 (1989) ; Genes Develop. , 4, 1288 ( 1990)〕 、 または特開平 05- 336963、 W094/23021等に記載の方 法を準用することにより、 該ペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることが できる。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 該ペプチド （部分ペプチドを含む） の手前にシグナルぺプチドを付加した形で発現させることにより、 目的のぺプチ ドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 さらに、 シグナルペプチド と該ペプチドの間、 または該ペプチドの C末端に、 精製 ·検出用のタグを付加する こともできる。
精製 ·検出用のタグとしては、 ガラクトシダ一ゼ、 プロテイン A、 プロティ ン Aの IGG結合領域、 クロラムフエニコ一ル 'ァセチルトランスフェラ一ゼ、 ポリ アルギニン、 ポリグルタミン酸、 プロテイン G、 マルト一ス結合タンパク質、 グル 夕チオン S -トランスフェラ一ゼ、 ポリヒスチジン鎖 （His-tag)、 Sペプチド、 DNA結合タンパク質ドメイン、 Tac抗原、 チォレドキシン、 グリーン ·フルォレヅ セント 'プロテイン、 FLAGペプチド、 および任意の抗体のェピトープなどがあげ られる 〔実験医学， 13, 469 (1995)〕。
また、 特開平 2- 227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵素 遺伝子等を用いだ遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
該ペプチド （部分ペプチドを含む） を製造するための形質転換体の培養物から、 該ぺプチドを単離 ·精製するには、 通常の酵素の単離 ·精製法を用いることがで きる。 例えば、 該ペプチドが形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、 培養物を遠心分離することにより、 培養物中の細胞を集め、 該細胞を洗浄した後 に、 超音波破碎機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノ ミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 溶媒抽出法、 硫 安等による塩析法脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル （DEAE ) -セファロース、 DIAION HPA-75 (三菱化学社製） 等レジンを用いた陰イオン交 換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF (フアルマシア社製） 等のレジンを用 いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 プチルセファロ一ス、 フエ二ルセファ ロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ一法、 分子篩を用いたゲルろ 過法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電 点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、 精製標品を得ることができる。
また、 該ペプチド （部分ペプチドを含む） が細胞内に不溶体を形成して発現し た場合は、 同様に細胞を回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿 画分より、 通常の方法により該ぺプチドを回収後、 該ぺプチドの不溶体をぺプチ ド変性剤で可溶化する。 該可溶化液を、 ペプチド変性剤を含まないあるいはぺプ チド変性剤の濃度がぺプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透 祈し、 該ペプチドを正常な立体構造に再構成させた後、 上記と同様の単離精製法 により精製標品を得ることができる。
細胞外に該ぺプチドが分泌される場合には、 該培養物を遠心分離等の手法によ り処理し、 可溶性画分を取得する。 該可溶性画分から、 上記無細胞抽出液上清か らの単離精製法と同様の手法により、 該ぺプチドの精製標品を得ることができる。 また、 該ペプチド （部分ペプチドを含む） を他のタンパク質との融合タンパク 質として生産し、 融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティ —クロマトグラフィーを利用して精製することもできる 〔実験医学， J^, 469 ( 1995 )〕 o例えば、 ロウらの方法 〔Proc . Natl . Acad. Sci . , USA, 86, 8227 ( 1989) ; Genes Develop. , 4, 1288 ( 1990)〕 、 特開平 05- 336963、 W094/23021に記載の方 法に準じて、 該ペプチドをプロテイン Aとの融合タンパク質として生産し、 ィムノ グロプリン Gを用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより精製することがで きる。 また、 該ペプチドを F LAGペプチドとの融合タンパク質として生産し、 抗 F LAG抗体を用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィ一により精製することがで きる Proc. Natl. Acad. Sci . , USA, 86, 8227 (1989) ; Genes Develop. , 4, 1288 (1990)〕 o
さらに、 該ぺプチド自身に対する抗体を用いたァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一で精製することもできる。
また、 公知の方法 〔<J. Biomol. NMR, 6, 129 (1995 ) ; Science, 2 2, 1162 ( 1988) ; J. Biochem. , 110, 166 ( 1991)〕 に準じて、 in vitro転写 .翻訳系を用 いて該ぺプチドを生産することができる。
さらに、 該ペプチドは、 ： Fmoc法 （フルォレニルメチルォキシカルボニル法） 、 tBoc法 （T-プチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によっても製造すること ができる。 また、 アドバンスト ·ケムテック （Advanced ChemTech )社、 ァプラ ィ ド 'バイオシステムズ社、 アマシャムバイオサイェンシズ社、 島津製作所等の ぺプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した該ペプチドの構造解析は、 蛋白質化学で通常用いられる方法、 例えば 「遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析」 （平野久著、 東京化学同人 発行、 1993年） に記載の方法により実施可能である。
4.視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するぺプチドを認識する抗 体の取得法
[I] 5.または [III] 3·に記載した方法で取得されたペプチドを抗原として用 いて、 視床下部細胞やランゲルハンス島細胞で発現するぺプチドを認識する抗体 を取得することができる。 合成したぺプチドを抗原として用いることもできる。 また、 本発明の細胞株あるいは該細胞株から調製した細胞膜画分を抗原として用 いることにより、 該細胞株の表面抗原を特異的に認識する抗体を取得することが できる。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製法を下記 （i) および （ii ) に記す。
(i) ポリクローナル抗体の作製
上記 3.の方法により取得したべプチドの全長または部分断片精製標品、 あるい は該ペプチドの一部のアミノ酸配列を有するペプチド （部分ペプチド） を抗原と して用い、 動物に投与することによりポリクロ一ナル抗体を作製することができ る。 また、 本発明の細胞株あるいは該細胞株から調製した細胞膜画分を抗原とし て用いることもできる。
投与する動物として、 ゥサギ、 ャギ、 3〜20週令のラヅト、 マウス、 ハムス夕一 等を用いることができる。 該抗原の投与量は動物 1匹当たり 50〜； lOO gが好ましい。 部分べプチドを用いる場合は、 部分べプチドをキ一ホール · リンぺット ·へモシ ァニン （keyhole limpet haemocyanin) ゃ牛チログ口プリンなどのキャリア蛋白 に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。 抗原とする部分ぺプチドは、 ぺプチド合成機で合成することができる。 本発明の細胞株を抗原として用いる場 合は、 動物 1匹当たり 3〜5 x l05cellsを投与する。 該細胞株から調製した細胞膜画 分を抗原として用いる場合は、 動物 1匹当たり l〜10mgを投与する。
該抗原の投与は、 1 回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜； 10回行う。 各投与後、 3 〜7日目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免疫に用いた抗原と反応することを固 相酵素免疫検定法 （ELISA) 〔酵素免疫測定法：医学書院刊 1976年、 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1988)〕等で確認する。 免疫に用いた抗原に対し、 その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物よ り血清を取得し、 該血清を分離、 精製することによりポリクローナル抗体を取得 することができる。
分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 40〜50%飽和硫酸アンモニゥムによ る塩析、 力プリル酸沈殿 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1988)〕、 または DEAE-セファロースカラム、 陰イオン交換力 ラム、 プロティン Aまたは G-カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグ ラフィ一等を、 単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
(ii) モノクロ一ナル抗体の作製
(a) 抗体産性細胞の調製
(i) で免疫に用いた本発明の細胞株が発現するぺプチドまたは該ぺプチドの部 分断片、 部分ペプチドに対し、 その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラ ットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したマウスまたはラットに抗原物質を最終投与した後 3〜7日目に、 脾臓を摘出する。 該脾臓を MEM培地 （日水製桀社製） 中で細断し、 ピンセッ卜でほ く、し、 l，200rpmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。 得られた沈殿画分の脾細 胞をトリス-塩化アンモニゥム緩衝液 （PH7.65) で 1〜2分間処理し赤血球を除去し た後、 MEM培地で 3回洗浄し、 得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
(b) 骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、 マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。 例えば、 8-ァザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8 - U1 CGurr. Top. Microbiol. Immunol. , 81. 1 (1978); Eur. J. Immunol. , 6, 511 (1976) 〕 、 SP2/0-Agl4 C Nature, 276, 269 (1978) 〕 、 P3-X63-Ag8653 〔 J. Immunol. , 123, 1548 (1979)]、 P3-X63-Ag8 [： Nature, 256, 495 (1975)〕 等を用 いることができる。
これらの細胞株は、 8-ァザグァニン培地 〔RPMI1640培地に 1.5雇 ol/Lグルタミン、 50〃mol/L 2-メルカプトエタノール、 10〃g/mLゲン夕マイシンおよび 10%ゥシ胎 児血清 （FCS) を加えた培地 （以下、 正常培地という） に、 さらに 15 g/mL 8 -ァ ザグァニンを加えた培地〕 で継代するが、 細胞融合の 3〜4日前に正常培地で培養 し、 融合には該細胞を 2xl07個以上用いる。
(c) ハイプリド一マの作製
(a) で取得した抗体産生細胞と （b) で取得した骨髄腫細胞を MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1.83g、 リン酸一力リウム 0.21g、 食塩 7.65g、 蒸留水 1リットル、 PH7.2) でよく洗浄し、 細胞数が、 抗体産生細胞：骨髄腫細胞 =5〜 10:1になるよう混合し、 l，200rpmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、 該細胞群に、 攪拌しながら、 37°Cで、 108抗体産生細胞あたり、 ポリエチレングリコ一ル -1000 (PEG- 1000) 2g、 MEM 2ml およびジメチルスルフォキシド （DMS0) 0.7mlを混合した溶液を 0.2~lmL添カロし、 さらに 1〜2分間ごとに MEM培地 l〜2mLを数回添加する。 添加後、 MEM培地を加えて 全量が 50mLになるように調製する。
該調製液を 900rpmで 5分間遠心分離後、 上清を捨てる。 得られた沈殿画分の細胞 を、 ゆるやかにほぐした後、 メスピペットによる吸込み、 吹出しでゆるやかに HAT 培地〔正常培地にヒポキサンチン （0.1 腦 ol/L) 、 チミジン （15 mol/L) および アミノプテリン （0.4〃mol/L) を加えた培地〕 lOOmL中に懸濁する。
該懸濁液を 96穴培養用プレートに 100 L/穴ずつ分注し、 5% C02インキュベー 夕一中、 37°Cで 7〜； 14日間培養する。 培養後、 培養上清の一部をとり Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)等に 述べられている ELISAにより、 本発明の細胞株が発現するべプチドと特異的に反応 するハイプリドーマを選択する。
ELISAの具体的例として、 以下の方法をあげることができる。 免疫の際、 抗原に 用いた本発明の細胞株が発現するべプチド、 該ぺプチドの部分断片または部分べ プチドを適当なプレートにコートし、 ハイプリドーマ培養上清もしくは後述の（d )で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、 さらに第二抗体としてペルォキ シダーゼ等の酵素で標識した抗ラットまたは抗マウスィムノグロプリン抗体を反 応させた後に標識酵素に応じた発色反応を行ない、 プレートにコートしたべプチ ド、 該ペプチドの部分断片または部分ペプチドに特異的に反応するものを、 本発 明の細胞株が発現するべプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生す るハイプリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、 限界希釈法によりクロ一ニングを 2回繰り返し 〔1 回目は、 HT培地 （HAT培地からアミノプテリンを除いた培地） 、 2回目は、 正常培 地を使用する〕 、 安定して強い抗体価の認められたものを、 本発明の細胞株が発 現するぺプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイプリ ドーマ株として選択 する。
( d ) モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2,6, 10, 14-テトラメチルペン夕デカン （Pristane) 0.5mLを腹 腔内投与し、 2週間飼育する〕 した 8〜10週令のマウスまたはヌ一ドマウスに、 （c ) で取得した本発明の細胞株が発現するべプチドを特異的に認識するモノクロ一 ナル抗体産生ハイプリド一マ細胞 5〜20 x 10s細胞/匹を腹腔内に注射する。 10〜 21日間でハイプリドーマは腹水癌化する。 該腹水癌化したマウスから腹水を採取 し、 3,000rpmで 5分間遠心分離して固形分を除去する。 得られた上清より、 ポリク ローナルで用いた方法と同様の方法でモノクロ一ナル抗体を精製、 取得すること ができる。
抗体のサブクラスの決定は、 マウスモノクローナル抗体タイピングキットまた はラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。 蛋白質量は、 ロー リー法あるいは 280皿での吸光度より算出する。
5.視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するべプチドを認識する抗 体の利用法
上記 4.で取得した抗体を用いて、 細胞または組織を染色することにより、 視床 下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するぺプチドを発現している細胞 を同定することができる。 また、 上記 4.で取得した抗体を用いて細胞を染色後、 FACSを用いて、 視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するぺプチド を発現している細胞を単離することができる。 ' すなわち、 上記 [III] 4.で取得した抗体を用いて、 特定の視床下部細胞あるい は特定のランゲルハンス氏島細胞の分布を調べたり、 特定の視床下部細胞あるい は特定のランゲルハンス氏島細胞を単離することができる。 また、 神経幹細胞、 体性幹細胞、 あるいは ES細胞を各種培養条件で培養後、 該抗体を用いて特定の視 床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞に分化した細胞を検出、 単離 することができる。
抗体を用いて抗原を免疫学的に検出および定量する方法としては、 蛍光抗体法、 酵素免疫抗体法 （EIA) 、 放射性物質標識免疫抗体法 (RIA) 、 免疫組織化学染色 法や免疫細胞化学染色法、 ウエスタンプロッティング法、 ドヅ トブロッテイング 法、 免疫沈降法、 サンドイッチ ELISA〔単クローン抗体実験マニュアル （講談社サ イエンティフィック） （1987); 続生化学実験講座 5,免疫生化学研究法 （東京化学 同人） （1986)〕等があげられる。
蛍光抗体法とは、 本発明の細胞株が発現するぺプチドを細胞内あるいは細胞外 に発現した微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、 該ペプチドを特異 的に認識する抗体を反応させ、 さらにフルォロセイン .イソチオシァネート （ FITC) などの蛍光物質で標識した該抗体と反応する抗体 （例えば、 該ペプチドま たはぺプチドを特異的に認識する抗体がマウス IgGクラスの場合、 抗マウス IgG抗 体） を反応させた後、 蛍光色素をフローサイトメ一夕一で測定する方法である。
EIAとは、 本発明の細胞株が発現するペプチドを含む測定試料に、 該ペプチドを 特異的に認識する抗体を反応させ、 さらにペルォキシダーゼなどの酵素で標識し た該抗体と反応する抗体 （例えば、 該ペプチドまたはペプチドを特異的に認識す る抗体がマウス IgGクラスの場合、 抗マウス IgG抗体） を反応させた後、 酵素によ る発色反応を行い、 発色量を分光光度計で測定する方法である。
RIAとは、 本発明の細胞株が発現するペプチドを含む測定試料に、 該ペプチドを 特異的に認識する抗体を反応させ、 さらに放射性同位体で標識した該抗体と反応 する抗体 （例えば、 該ペプチドを特異的に認識する抗体がマウス IgGクラスの場合、 抗マウス IgG抗体） を反応させた後、 放射能量をシンチレ一シヨンカウンターなど で測定する方法である。
免疫組織化学染色法や免疫細胞化学染色法とは、 本発明の細胞株が発現するぺ プチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞ま たは組織に、 該ペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、 さらに TCなどの 蛍光物質、 ペルォキシダーゼ等の酵素、 ビォチンなどで標識した該抗体と反応す る抗体 （例えば、 該ペプチドを特異的に認識する抗体がマウス IgGクラスの場合、 抗マウス IgG抗体） あるいはその断片を反応させた後、 顕微鏡を用いて観察する方 法である。
ゥヱスタンプロヅティング法とは、 本発明の細胞株が発現するぺプチドを細胞 内あるいは細胞外に発現した微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽 出液を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 〔Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 〕 で分画した後、 該ゲルをポリフヅ化ビ 二リデン （PVDF) 膜あるいはニトロセルロース膜にブロッテイングし、 該膜に該 ペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、 さらに FITCなどの蛍光物質、 ペル ォキシダ一ゼ等の酵素、 ビォチンなどで標識した該抗体と反応する抗体 （例えば、 該ぺプチドを特異的に認識する抗体がマウス IgGクラスの場合、 抗マウス IgG抗体 ) あるいはその断片を反応させた後、 標識物質に応じた反応を行う方法である。
ドットブロッテイング法とは、 本発明の細胞株が発現するぺプチドを細胞内あ るいは細胞外に発現した微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液 をニトロセルロース膜にプロッティングし、 該膜に該ぺプチドを特異的に認識す る抗体を反応させ、 さらに FITCなどの蛍光物質、 ペルォキシダーゼ等の酵素、 ビ ォチンなどで標識した該抗体と反応する抗体 （例えば、 該ペプチドを特異的に認 識する抗体がマウス IgGクラスの場合、 抗マウス IgG抗体） あるいは結令断片を反 応させた後、 標識物質に応じた反応を行う方法である。
免疫沈降法とは、 本発明の細胞株が発現するべプチドを細胞内あるいは細胞外 に発現した微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を、 該ぺプチ ドを特異的に認識する抗体と反応させた後、 プロティン G-セファロース等ィムノ グロプリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる 方法である。
サンドィツチ EUSAとは、 本発明の細胞株が発現するぺプチドを特異的に認識す る抗体を吸着させたプレートに、 該ぺプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した 微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を反応させた後、 ペルォ キシダーゼ等の酵素で標識した該ぺプチドを特異的に認識する抗体 （上記抗体と は抗原認識部位が異なる） を反応させ、 標識物質に応じた反応を行う方法である 図面の簡単な説明
第 1図 視床下部由来不死化細胞の SV40ラージ T抗原の免疫染色を示す。
33°Cで培養したトランスジヱニックラット胎児由来の不死化視床下部細胞の混合 物について、 （a) は SV40ラージ T抗原の免疫染色の結果を、 （b) は核染色の結果 を示す。
第 2図 トランスジエニックラット胎児由来の不死化視床下部細胞の混合物、 SV40ラ一ジ T抗原の免疫染色の結果を示す。 （a) は 33°Cで培養した場合、 (b) は 39°Cで培養した場合を示す。
第 3図 不死化視床下部細胞株 AM2- 100を、 10%血清を含む培地で温度を変えて 培養した場合の細胞の形態を示す。 （a) は 33°Cで培養した場合、 (b) は 39°Cで 培養した場合を示す。
第 4図 不死化視床下部細胞株 AMF2-20を、 33°Cで培地を変えて培養した場合の 細胞の形態を示す。 （a) は 10%血清を含む培地で培養した場合、 (b) は DMEM/F- 12 (N2) 培地で培養した場合、 （c) は DMEM/F- 12 (-FCS) 培地で培養した場合を 示す。 .
第 5図 不死化視床下部細胞株 AMF2-20を、 培地と温度を変えて培養した場合の 細胞の形態を示す。 （a) は DMEM/F- 12 (FCS) 培地を用いて 33°Cで 8日間培養した 場合、 (b) は DMEM/F-12 (FCS) 培地を用いて 37°Cで 5日間培養後、 培地を DMEM/F- 12 (-FCS) 培地に交換してさらに 37°Cで 3日間培養した場合を示す。
第 6図 トランスジェニヅクラット成体雌由来の不死化視床下部細胞の混合物に ついて、 レブチン受容体の免疫染色を行った結果を示す。
第 7図 （a) は視床下部細胞株 AMN2-25について NPYの免疫染色を行った結果を 示す。 （b) は抗 NPY抗体を添加しないネガティブコントロールを示す。
第 8図 不死化視床下部細胞株 NC-12について STAT3の免疫染色を行った結果を示 す。 （a) はレブチン刺激をしない場合、 （b) はレブチン刺激を加えた場合を示 す。
第 9図 不死化視床下部由来細胞株のスルホニルゥレア刺激による細胞内カルシ ゥム濃度の変化を示す。 （a) はトランスジェニヅクラット成体雌の視床下部由来 の不死化細胞の混合物を、 （b) は不死化視床下部細胞株 AMN2- 25を用いた場合を 示す。 横軸は時間で、 矢印で示した時点で HBSSバッファ一またはスルホニルウレ ァを細胞にそれぞれ添加した。 縦軸は 2励起波長での蛍光強度比でカルシウム濃度 を表す。
第 10図 ランゲルハンス氏島由来不死化細胞株 F- 8について、 PC2の免疫染色お よび核染色を行った結果を示す。 （a) および （b) は PC2の免疫染色を、
(c) および （d) は核染色を示し、 （a) および （c) は RPMI1640(05918)培地で培 養した場合、 (b) および （d) は RPMI1640(05918)で培養した細胞を DMEM(D- 5796) 培地に培地を置換し、 2週間培養した場合を示す。
第 11図 宿主細胞株 GBCR2に pAGal9- V2を導入した安定形質転換株のバソプレヅ シン刺激時のゥミシィ夕ケ 'ルシフェラーゼ活性を示す。 +エストロジェンは、 17；5 -エストラジオール刺激をして V2遺伝子の誘導発現を行った場合、 -エストロ ジェンは 17 ?-ェストラジオ一ル刺激をしない場合、 それそれの右側のバーはバソ プレッシン刺激をした場合、 左側のバーはバソプレッシン刺激をしない場合の活 性を示す。 縦軸はバソプレヅシン刺激をしない場合の活性をそれそれ 1としたとき の活性比を表す。
第 12図 宿主細胞株 GBCRC6に PAGal9- V2を導入した安定形質転換株を、 17 ? -ェ ストラジオ一ルにより V2遺伝子発現誘導後、 各種濃度のバソプレツシンで刺激し たときのゥミシィ夕ケ 'ルシフェラーゼ活性を示す。 横軸はバソプレツシンの濃 度〔log (mol/L) 〕 を、 縦軸はバソプレヅシン刺激をしない場合の活性を 1とした ときの活性比を表す。
第 13図 宿主細胞株 GBCRC6に pAGal9-CRHRlを導入した安定形質転換株を、 17 ? - エストラジオールにより CBJffil遺伝子発現誘導後、 各種濃度のコルチコトロピン放 出ホルモンで刺激したときのゥミシィ夕ケ ·ルシフェラ一ゼ活性を示す。 横軸は コルチコトロピン放出ホルモンの濃度 〔log (mol/L) 〕 を、 縦軸はコルチコトロ ピン放出ホルモン刺激をしない場合の活性を 1としたときの活性比を表す。
第 14図 宿主細胞株 GBCRC6に ρΑ(¾19-ΑΠを導入した安定形質転換株を、 17 3-ェ ストラジオ一ルにより ATI遺伝子発現誘導後、 各種濃度のアンジォテンシン IIで刺 激したときのゥミシィタケ ·ルシフェラーゼ活性を示す。 横軸はアンジォテンシ ン Πの濃度 〔log (mol/L) 〕 を、 縦軸はアンジォテンシン II刺激をしない場合の 活性を 1としたときの活性比を表す。
第 15図 宿主細胞株 GBCRC6に pAGal9- B1を導入した安定形質転換株を、 17^ -ェ ストラジオ一ルにより B1遺伝子発現誘導後、 各種濃度の Des- Arg9-ブラジキニンで 刺激したときのゥミシィ夕ケ ·ルシフェラーゼ活性を示す。 横軸は Des- Arg9-ブラ ジキニンの濃度 〔l0g (mol/L) 〕 を、 縦軸は Des- Arg9-ブラジキニン刺激をしない 場合の活性を 1としたときの活性比を表す。
第 16図 宿主細胞株 GBCRC6に pAGal9- sst5を導入した安定形質転換株を、 17/5 - エストラジオールにより sst5遺伝子発現誘導後、 各種濃度のソマトス夕チンで刺 激したときのゥミシィ夕ケ ·ルシフェラーゼ活性を示す。 横軸はソマトス夕チン の濃度 〔log (mol/L) 〕 を、 縦軸はソマトス夕チン刺激をしない場合の活性を 1と したときの活性比を表す。
第 17図 宿主細胞株 GBCR2に pAGal9-MClRを導入した安定形質転換株を、 17 ?-ェ ストラジオールにより MC1R遺伝子発現誘導後、 各種濃度の PA Pまたは PAMP-12で刺 激したときのゥミシィタケ レシフェラ一ゼ活性を示す。 左側のグラフは PAMPで 刺激した場合、 右側のグラフは PAMP- 12で刺激した場合を示す。 横軸は左側のグラ フは PAMPの濃度 〔log (mol/L) 〕、 右側は PAMP- 12の濃度 Gog (mol/L) 〕 を、 縦 軸はそれそれ PAMPまたは PAMP- 12刺激をしない場合の活性を 1としたときの活性比 を表す。 発明を実施するための最良の形態
[実施例 1] ラット胎児視床下部由来細胞株の樹立
Exp. Anim. , 48, 255 (1999) に記載の方法で作製した温度感受性変異株 SV40tsA58のラ一ジ T抗原遺伝子を導入したトランスジエニックラヅトの胎児 （胎 生 14日、 17日、 および 21日の胎児；各 10〜； 15匹） より視床下部を含む領域を摘出 した。 視床下部を含む領域の摘出は既知の方法 〔Endocrinology， 137, 5651 (1996)〕 に準じて行った。 トランスジェニヅクラットは、 ワイエスニューテクノ ロジ一研究所から入手した。
視床下部由来細胞の分離と回収は酵素法を用い、 以下のように行った。 摘出し た視床下部を Leibovitz' s L-15培地 （ギブコ社製） で洗浄し、 はさみで小さく刻 んだ後に、 800回転/分で 5分間遠心分離した。 遠心分離後、 上清を除去し、 5mlの 0, 25%トリプシン溶液 （ギブコ社製） および 10〃g/mlの DNase I (ベ一リンガー ' マンハイム （Boehringer Mannheim) 社製〕 を 50 l加え、 振とうしながら 37°Cで 10分間酵素処理した。 倒立型顕微鏡下で該酵素処理の進行状態を確認した後、 4°C に冷却したゥシ胎児血清を 2ml添加してよく懸濁した。 該懸濁液を 800回転/分で 5 分間遠心分離し、 細胞を回収した。
該細胞を、 10mlの DMEM/F-12 (FCS) 培地 〔10%ゥシ胎児血清、 50U/mlベニシリ ン、 および 50〃g/mlストレプトマイシンを含む、 DMEM培地と Ham' s F- 12培地の等 比率混合培地 （ギブコ社製） 〕 に懸濁した。
該細胞懸濁液を、 ポリ -リジンでコートされた 100腿ディヅシュ （ぺクトン 'デ イツキンソン社製） 1枚にまき、 33°C；、 炭酸ガス濃度 5%、 湿度 100%の条件下で培 養した。 細胞が増殖して飽和した時点で、 培養面に対する細胞密度が約 70%にな るように、 ポリ-リジンでコートされた 100腿ディッシュに継代した。 約 3ヶ月間培 養を継続し、 視床下部由来の不死化細胞株の混合物を得た。 取得した視床下部由 来の不死化細胞株の混合物を、 チューブを 21本に約 I X 106個の細胞となるように 分注し、 公知の方法で凍結保存した。
細胞のシングルクローン化はコロニ一形成法を用いて行った。 ポリ-リジンでコ ートされた 100顏ディヅシュに 100個あるいは 500個の細胞をまき、 コロニーが形成 されるまで培養した。 培養後、 顕微鏡下で観察しながらチップの先で各コロニー を剥がし、 同時にチップ内に吸引して細胞を回収した。 回収した各コロニー由来 の細胞は、 ポリ-リジンでコートされた 24穴プレートにまき、 培養した。 細胞が増 殖して飽和した時点で、 6穴プレートおよび 100雇ディッシュ （いずれもポリ-リジ ンでコートされたもの） に順次スケールアップして、 培養した。 このようにして、 最終的に 4個のシングルクローンィヒした細胞株を取得した。 該細胞株をそれぞれ EA-1、 EA- 2、 EA- 4、 EA- 8と命名した。 EA- 1は胎生 14日、 EA-2と EA- 4は胎生 21日、 EA - 8は胎生 17日の胎児に由来する細胞株である。 取得した 4個の細胞株はそれそれ 公知の方法で凍結保存した。 取得した細胞株のダブリングタイムは 36〜72時間で あった。 また、 樹立後 1年以上経過した後も、 細胞株の増殖性に顕著な変化は見ら れなかった。
[実施例 2] ラット新生児視床下部由来細胞株の樹立
実施例 1と同様にして、 温度感受性変異株 SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子を導入 したトランスジェニヅクラットの新生児 （生後 0日の新生児 13匹） から視床下部を 摘出し、 得られた細胞を約 3ヶ月間培養し、 視床下部由来の不死化細胞株の混合物 を得た。取得した視床下部由来の不死ィ匕細胞株の混合物を、 チューブ 20本に、 約 1 X 106個の細胞となるように分注し、 公知の方法で凍結保存した。
該凍結保存株より、 実施例 1に記載の方法に準じて 141個のシングルクローン化 した細胞株を取得した。 取得した 141個の細胞株も上記同様凍結保存した。 取得し た細胞株のダブリングタイムは 36〜72時間であった。 また、 樹立後 1年以上経過し た後も、 細胞株の増殖性に顕著な変化は見られなかった。
[実施例 3]成体ラット視床下部由来細胞株の樹立
温度感受性変異株 SV40tsA58のラ一ジ T抗原遺伝子を導入したトランスジェニヅ クラットの成体 (生後 8週齢：雄 1匹、 雌 2匹） を頸椎脱曰により致死させた後、 脳 を摘出した。 その脳を正中線で 2等分し、 髄膜を含まないように留意して視床下部 を摘出した。 視床下部の摘出は以下のように行った。
ラットを断頭後、 頭蓋骨を露出させるために、 頭部より皮膚ならびに筋肉を丁 寧に除去した。 断頭部より正中線に沿って頭蓋骨にはさみをいれて切断した後、 最初の切断面と直角にはさみをいれることで、 頭蓋骨上部を除去し、 脳を露出さ せた。 脳底に慎重にはさみをいれ視交差を切除し、 脳を頭蓋骨から取り出した。 取り出した脳は腹側を上にし、 「カラーアトラス ラヅトの解剖ガイドブヅク」 (廣川書店） の 52頁の図を参考にして、 脳底中心部にある下垂体を同定した。 本 下垂体を指標にして、 The Rat Brain in Stereotaxic Coordinate, Second Edition, Academic Press (1986)の図を参考に、 視床下部領域を摘出した。
実施例 1と同様にして、 摘出した雄または雌の視床下部由来の細胞を別々に約 3 ヶ月間培養し、 不死化した視床下部由来細胞株の混合物を得た。 取得した成体雄 または雌の視床下部由来の不死化細胞株の混合物を、 それぞれチューブ Π本に、 約 1 X 106個の細胞となるように分注し、 公知の方法で凍結保存した。
該成体雄の視床下部由来の不死化細胞株の混合物より、 実施例 1に記載の方法に 準じて、 373個のシングルクローン化した細胞株を取得した。 取得した 373個の細 胞株をそれぞれ公知の方法で凍結保存した。 取得した細胞株のダブリングタイム は 36〜72時間であった。 また、 樹立後 1年以上経過した後も、 細胞株の増殖性に顕 著な変化は見られなかった。
同様にして、 成体雌の視床下部由来の不死化細胞株の混合物より 280個のシング ルクローン化した細胞株を取得した。 取得した 280個の細胞株をそれそれ公知の方 法で凍結保存した。 取得した細胞株のダブリングタイムは 36〜72時間であつた。 また、 樹立後 1年以上経過した後も、 細胞株の増殖性に顕著な変化は見られなかつ た。
[実施例 4]視床下部由来細胞株における SV40ラージ T抗原の発現解析
実施例 1〜3で取得したラットの胎児、 新生児、 成体雄、 および成体雌の視床下 部由来の不死化細胞株の混合物に対して、 免疫染色法を用いて SV40ラージ T抗原の 蛋白質レベルでの発現を検討した。
上記の各不死化細胞株の混合物を用いて、 実施例 1に記載の方法に準じて培養し た後、 培地を除き、 4%パラフオルムアルデヒド溶液を加え、 4°Cで 10分間反応さ せ細胞を固定した。 該固定化細胞を 0.3% トリトン X- 100溶液で処理した後、 10倍 希釈した SV40ラージ T抗原に対する抗体〔オンコジーン （ONCOGENE) 社製〕 を添加 し、 37°Cで 60分間反応させた。 反応後、 PBSで 1回洗浄し、 40倍希釈した FITC標識 抗マウス IgG (KPL社製） を添加し、 室温で 60分間反応させた。 反応後、 PBSで 1回 洗浄し、 l〃g/mlのへキスト 33342溶液〔CALBI0CHEM (カルビオケム） 社製〕 を添 加し、 室温で 5分間反応させて核を染色した。
該核染色細胞を PBSで 1回洗浄した後、 乾燥させ、 退色防止剤を含む溶液 〔90% グリセロールおよび 2.5%1, 4-ジァザビシクロ _[2, 2, 2] -オクタン （DABC0) を含む PBSS 以下「退色防止剤溶液」 とよぶ〕 でマウントし、 蛍光顕微鏡下で観察した。 第 1図に示したように、 ほとんどの細胞において SV40ラ一ジ T抗原の発現を示す陽 性の染色が確認された。
以上の結果より、 実施例 1~3で取得したラッ卜の胎児、 新生児、 成体雄、 およ び成体雌の視床下部由来の不死化細胞株は、 SV40ラージ T抗原が発現されることに より不死化したものと考えられた。
さらに、 39°C培養条件下で同様に染色を行ったところ、 33°C培養条件下と比較 して明らかにシグナルの低下が認められた。 結果を第 2図に示した。 この結果より、 取得した細胞群は温度感受性の SV40ラージ T抗原を発現していると考えられた。
[実施例 5]視床下部由来細胞株の培養法の検討
実施例 1〜3で取得したラットの胎児、 新生児、 成体雄、 および成体雌の視床下 部由来の不死化細胞株を用い、 細胞の形態を指標として、 細胞の分化形質に及ぼ す培養法の影響を検討した。
(1) 培養温度の検討
上記の各不死化細胞株 （シングルクローンおよび混合物） を、 実施例 1に記載し た方法に準じて培養した。 培養後、 約 個の細胞をポリ-リジンでコートされ た 35腿ディッシュにまき、 33°C、 37°Cまたは 39°Cで 5日間培養し、 その形態を顕微 鏡で観察した。
その結果、 37°Cまたは 39°Cで培養することにより細胞の形態が変化し、 神経細 胞、 オリゴデンドロサイト、 またはァストロサイ トに特徴的な形態を示す細胞が 出現した。 この結果は、 37°Cまたは 39°Cで培養することにより、 上記視床下部由 来不死化細胞株を分化させることが可能なことを示している。 実施例 3で取得した 成体雄の視床下部由来の不死化細胞株 (AM 2-100) を用いて行った実験結果を第 3 図に示した。
(2) 培地の検討
上記の各不死化細胞株 （シングルクローンおよび混合物） を、 実施例 1に記載し た方法に準じて培養した。 培養後、 約 2 X 104個の細胞をポリ-リジンでコートされ た 35蓮ディ ッシュにまき、 DMEM/F- 12 (FCS) 培地、 DMEM/F- 12 (N2 ) 培地 〔 DMEM/F-12 (FCS) 培地の 10%ゥシ胎児血清の代わりに 1%の N- 2サプリメント （ギ プコ社製） を添加した培地〕 、 または血清成分を添加しない DMEM/F- 12 (FCS) 培 地〔以下 DMEM/F- 12 (-FCS) 培地と呼ぶ〕 で 5日間培養し、 その形態を顕微鏡で観 察した。
その結果、 DMEM/F- 12 (N2) 培地または DMEM/F- 12 (-FCS) 培地で培養すること により細胞の形態が変化し、 神経細胞、 オリゴデンドロサイト、 またはァストロ サイトに特徴的な形態を示す細胞が出現した。 この結果は、 DMEM/F- 12 (N2) 培地 または DMEM/F- 12 (-FCS) 培地のような血清を含まない培地で培養することにより、 上記視床下部由来不死化細胞株を分化させることが可能なことを示している。 実 施例 3で取得した成体雄の視床下部由来の不死化細胞株 (AMF2-20) を用いて行つ た実験結果を第 4図に示した。
(3) 培養温度と培地の検討
上記の各不死化細胞株 （シングルクローンおよび混合物） を、 実施例 1に記載し た方法に準じて培養した。 培養後、 約 2 X 104個の細胞をポリ-リジンでコートされ た 35廻ディッシュにまき、 下記の 2条件で培養後、 その形態を顕微鏡で観察した。 条件 1は 33°Cで 8日間、 条件 2は 37°Cで 5日間培養後、 DMEM/F-12 (-FCS) 培地に交換 してさらに 3日間培養する条件である。
その結果、 条件 2では細胞の形態が変化し、 神経細胞、 オリゴデンドロサイト、 またはァストロサイトに特徴的な形態を示す細胞が出現した。 この結果は、 条件 2 で培養することにより、 上記視床下部由来不死化細胞株を分化させることが可能 なことを示している。
[実施例 6] 視床下部由来細胞株における各種遺伝子の発現解析
実施例 1〜3で取得した細胞株の、 第 1表に示した視床下部細胞で発現している各 種遺伝子に関する発現状況を下記方法により角军析した。
実施例 1で取得したラヅト胎児由来細胞株 4種、 実施例 2で取得したラヅ卜新生児 由来細胞株 57種、 実施例 3で取得したラット成体雄由来細胞株 49種、 および実施例 3で取得したラット成体雌由来細胞株 46種を、 実施例 1に記載した方法に準じて培 養した。 培養後、 約 l x lO5個の細胞をポリ-リジンでコートされた 100腿ディヅシ ュにまき、 培養温度を 33°Cから 37°Cにシフトして 5日間培養した。
培養後、 各細胞株から RNeasy Mini Kit 〔キアゲン （QIAGEN)社製〕 を用いて全 RNAを取得した。 該全 RNAを 5〃g用い、 SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR (ギブコ社製） により一本鎖 cDNAを合成した。 該一本鎖 cDNAを 水で 50倍希釈し、 PCRの錶型として使用した。
該一本鎖 cDNA (5 D に、 第 1表に示した遺伝子特異的プライマー （各 20pmol) 2.5mmol/L dNTP混合液を 1.6〃1 S0を 1〃1 5単位// z lの Recombiiiant Ex Taq DNA Polymerase (宝酒造社製） を 0.1〃1 10 x反応緩衝液 （宝酒造社製） を 2〃1 添加し、 滅菌水を加えて全量を 20 1に調製した。 該調製液を用い、 下記条件で PCRを行った。 サ一マルサイクラ一 MA Engine (MJ Research社製） を用い、 95°C5 分間の熱処理後、 94°Cで 1分間、 55 60 65あるいは 67°C (各遺伝子増幅に対応す る反応温度を第 1表に示した） で 1分間、 72°Cで 1分間からなる反応を 25 35サイク ル行った。 /Λ
No. 通 feナ
(配列番号） CO 丄 レノァノ： 3C谷 1 (.UD- D 一 1, 4 __ 00
9 プレブ口一 C2 *ギノ ノづ zソ 1 U 1 0 fie
DO
>
JE ΌΟ
A プレプロ *-^^ォ~)レ シン uu
プレプロ—ォ °ォメラノコゾレチン q i n
6 プレプロニユーロペプチド γ 11, 12 60
7 プレプロニユーロペプチド FF 13, 14 65
8 プレプロコルチコトロピン放出ホルモン 15, 16 65
9 プレプロサイロトロピン放出ホルモン 17, 18 65
10 プレプログレリン 19, 20 65
11 プレプロメラニン凝集ホルモン 21, 22 60
12 CART 23, 24 60
13 2型-ユーロメディン U受容体 25, 26 65
14 RFRP受容体 27, 28 65
15 4型メラノコルチン受容体（MC4R) 29, 30 60
16 1型ニューロペプチド γ受容体（NPY1R) 31, 32 60
17 5型ニューロペプチド Y受容体（NPY5R) 33, 34 60
18 2型ニューロペプチド FF受容体（NPFF2) 35, 36 55
19 1型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR一 1) 37, 38 60
20 2型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR - 2) 39, 40 60
21 グレリン受容体 41, 42 67
22 1型メラニン凝集ホルモン受容体（MCHR1) 43, 44 65 該反応液の一部 （8〃1) をァガロースゲル電気泳動に供した後、 ゲルを SYBR Green I nucleic acid stain 〔モレキュラー - プロ一フズ (Molecular Probes ) 社〕 で染色した。 増幅された DNA断片のパターンをフルォロイメージャー 〔 Fluor Imager SI ；モレキュラー ·ダイナミヅクス (Molecular Dynamics) 社製〕 で解析することにより、 增幅された DNA断片の量を測定した。
各遺伝子の転写産物の定量は、 常法 〔PCR Protocols, Academic Press ( 1990) 〕 にしたがって半定量的 PCR法により行った。 ラヅ ト .グリセルアルデヒド 3-リン 酸デヒドロゲナーゼ （以下、 G3PDHと略す） の転写産物を同時に定量することによ り、 細胞間での mMA量の違いや、 サンプル間での逆転写酵素による mRNAから一本 鎖 cDNAへの変換効率に大差ないことを確認した。 G3PDH転写産物の定量は、 常法 〔 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2725 (1990); J. Biol. Chemり 269, 14730 (1994) ; 特開平 06-181759 〕 にしたがって定量的 PCR法により行った。
解析結果を第 2表〜第 5- 2表に示した。 上記の ）〜 (22)の遺伝子の発現パターン が異なる多様な細胞株が取得されていることが明らかになつた。 第 2表 ラット胎児視床下部由来細胞株の遺伝子発現
Figure imgf000104_0001
各遺伝子の発現量を、 +++,++，+, +/-，-で示した。 空欄は発現量未測定 細胞株：実施例 1で取得された胎児の視床下部由来の細胞株
遺伝子：第 1表に記載の遺伝子に対応
第 3-1表 ラット新生児視床下部由来細胞株の遺伝子発現 （1)
Figure imgf000105_0001
各遺伝子の発現量を、 +++,++,+,+/-,-で示した。 空欄は発現量未測定 c 細胞株：実施例 2で取得された新生児の視床下部由来の細胞株 遺伝子：第 1表に記載の遺伝子に対応 第 3- 2表 ラット新生児視床下部由来細胞株の遺伝子発現 （2)
Figure imgf000106_0001
各遺伝子の発現量を、 +++,++，+,+/-,-で示した。 空欄は発現量未測定 細胞株：実施例 2で取得された新生児の視床下部由来の細胞株 遺伝子：第 1表に記載の遺伝子に対応 第 4-1表 ラット成体雄視床下部由来細胞株の遺伝子発現 （1)
Figure imgf000107_0001
各遺伝子の発現量を、 +++, ++，+,+/-,-で示した 空欄は発現量未測) 細胞株：実施例 3で取得された成体雄の視床下部由来の細胞株 遺伝子：第 1表に記載の遺伝子に対応 第 4- 2表 ラット成体雄視床下部由来細胞株の遺伝子発現 （2)
Figure imgf000108_0001
各遺伝子の発現量を、 +++，++, +，+/-, -で示した 。 空欄は発現量未測定 細胞株：実施例 3で取得された成体雄の視床下 ¾由来の細胞株 遺伝子：第 1表に記載の遺伝子に対応 第 5-1表 ラット成体雌視床下部由来細胞株の遺伝子発現 （1)
Figure imgf000109_0001
各遺伝子の発現量を、 +++，++,+,+/-,-で示した。 空欄は発現量未測定 細胞株：実施例 3で取得された成体雌の視床下部由来の細胞株 遺伝子：第 1表に記載の遺伝子に対応 第 5-2表 ラット成体雌視床下部由来細胞株の遺伝子発現 （2)
Figure imgf000110_0001
各遺伝子の発現量を、 +++, ++，+, +/-, -で示した。 空欄は発現量未測定。
細胞株：実施例 3で取得された成体雌の視床下部由来の細胞株
遺伝子：第 1表に記載の遺伝子に対応 視床下部の弓状核、 室傍核、 外側野、 腹内側核、 背内側核に発現しているレブ チン受容体 (Ob-Rb) 遺伝子は多くの細胞株で発現されていた。 弓状核、 室傍核、 外側野、 腹内側核、 背内側核に存在する Ob-Rb発現細胞は、 それそれ別の機能を有 していると考えられており、 上記 ( 1 )〜(22)の遺伝子の発現は細胞株によって異な ることから、 異なる多種の Ob- Rb遺伝子発現細胞株を取得することができた。 核に特徴的な遺伝子の発現を指標に、 上記の Ob- Rb発現細胞株がどの核由来のど のような細胞かを下記のように推定することが可能である。 また、 Ob-Rbを発現し ていない細胞株についても、 同様にしてどの核由来の細胞かを推定することがで さる。
AMN2- 25は、 Ob- Rb遺伝子、 プレブロニユーロペプチド Y遺伝子、 プレブログレリ ン遺伝子、 MC4R遺伝子、 NPY1R遺伝子、 NPY5II遺伝子、 グレリン受容体遺伝子等を 発現していることから、 弓状核由来の NPY産生細胞であると推定される。
NC - 12は、 Ob- Rb遺伝子、 プレブ口才ピオメラノコルチン遺伝子、 CMT遺伝子、 MC4R遺伝子、 NPY1R遺伝子、 NPY5R遺伝子等を発現していることから、 弓状核由来 の α - MSH産生細胞であると推定される。
AFN2-4s AFF2-19, AFF2-25は、 プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子 およびプレブ口サイ口トロピン放出ホルモン遺伝子を多く発現しており、 かつ MC4R遺伝子、 NPY1R遺伝子、 NPY5R遺伝子等も発現していることから、 室傍核由来 の細胞であると推定される。 ΑΪ 2- 25は Ob-Rb遺伝子も発現していた。
AFFl-21^ APF1- 37、 APFl-39、 AFN1-411S AMF卜 48、 AMN2- 72等プレブロォレキシ ン遺伝子を発現している細胞株、 メラニン凝集ホルモン遺伝子を発現している細 胞株 （AMF2- 14) あるいは NPFF2遺伝子を発現している細胞株 （AIT1- 19、 AMF1-44 ) は、 外側野由来の細胞であると推定される。
CRHR- 1遺伝子または CRHR- 2遺伝子を発現している細胞株の中には、 腹内側核ま たは背内側核由来の細胞があると推定される。
[実施例 7]視床下部由来細胞株における各種遺伝子産物の発現解析
(1) Ob- Rbの発現解析
実施例 6で Ob- Rb遺伝子の発現が確認された視床下部由来の不死化細胞株につい て、 下記免疫染色法により該遺伝子産物の発現を解析した。
実施例 6で Ob- Rb遺伝子の発現が確認された視床下部由来の不死化細胞株 （混合 物おょぴシングルクロ一ン NC-6、 NC- 12および AMN2-25) を、 実施例 1に記載の方法 に準じて培養した。 培養後、 約 l x lO3個の細胞を CELL- TAK 〔コラボレ一ティブ- バイオメディカル ·プロダクツ （Collaborative Biomedical Products)社製〕 で コートされた 8チャンバ一にまき、 培養温度を 33°Cから 37°Cにシフトして 5日間培 養した。
培養後、 培地を除き 4%バラフオルムアルデヒド溶液を加え、 4°Cで 10分間反応 させ、 細胞を固定した。 該固定化細胞を 0.3%トリトン X- 100溶液で処理した後、 20倍希釈した Ob-Rbに対する抗体〔サン夕 ·クルズ （Santa Cruz) 社製〕 を添カロし、 37°Cで 60分間反応させた。 コントロールとしては、 Ob- Rbに対する抗体の代わりに 正常ャギ血清を用いた。 反応後、 PBSで 1回洗浄し、 200倍希釈した Alexa488標識抗 ャギ IgG (モレキユラ一 'プローブズ社製） を添加し、 室温で 60分間反応させた。 反応後、 PBSで 1回洗浄し、 l g/mlのへキスト 33342溶液 （カルビオケム社製） を 添加し、 室温で 5分間反応させて核を染色した。 染色後、 PBSで 1回洗浄し、 乾燥さ せ、 退色防止剤溶液でマウントし、 蛍光顕微鏡下で観察した。
その結果、 混合物およびシングルクローン NC- 6、 NC- 12および AMN2-25のいずれ においても、 Ob- Rbの発現を示す陽性の染色が確認された。 成体雌の視床下部由来 不死化細胞株 （混合物） の結果を第 5図に示した。
(2) ニューロペプチド Yの発現解析
また、 実施例 6でプレプロニユーロペプチド Y (プレブ口 NPY) 遺伝子の発現が確 認された視床下部由来の不死化細胞株 （混合物またはシングルクローン） に関し ても同様に、 Ob- に対する抗体の代わりに 200倍希釈した NPYに対する抗体〔ケミ コン 'イン夕一ナショナル （CHEMIC0N International) 社製〕 および 200倍希釈し たシァニン 3標識抗ャギ IgG〔ジャクソン （Jackson) 社製〕 を用いて解析した。 プレブ口 NPY遺伝子の発現が確認された視床下部由来の不死化細胞株は、 NPYの 発現を示す陽性の染色が確認された。 成体雄の視床下部由来不死化細胞株 AMN2-25 の結果を第 6図に示した。 同様の免疫染色法により、 実施例 6で発現の確認された 遺伝子が、 蛋白質レベルでも発現されていることを確認することができる。
[実施例 8]視床下部由来レブチン受容体発現細胞株におけるレブチン反応性の検 討
(1) 抗 STAT抗体を用いた免疫染色による解析
実施例 7に記載の方法でレブチン受容体 （0b- Rb) 蛋白質を発現していることの 確認された細胞株において、 機能的な 0b- が発現しているかどうかを下記方法で 解析した。 下記方法は、 レブチン刺激により転写因子 STAT3がリン酸化され、 細胞 質から核へ移行することを利用した方法である。
レブチン受容体 (Ob-Rb) 蛋白質を発現している NC- 6、 NC- 12および AM 2-25を、 実施例 1に記載の方法に準じて培養した。 培養後、 約 l x lO3個の細胞を CELL- TAKで コートされた 8チャンバ一にまき、 培養温度を 33°Cから 37°Cにシフトして 3日間培 養した。培養後、 培地を除き、 MEM/F-12 (-FCS) 培地に交換して 37°Cで 17時間培 養した。培養後、 DMEM/F- 12 ( -FCS ) 培地に交換した。 培地交換 2時間後に 100nmol/Lのヒト ·レブチン （R &Dシステム社製） で 37°C、 15分間細胞を刺激し た。
刺激後、 抗 STAT抗体 （NEB社製） 、 および 200倍希釈したシァニン 3標識抗ラビヅ ト IgG ( 2次抗体） を用いて免疫染色を行った。 免疫染色は PhosphoPlus Stat3(Tyr705)Antibody Kit (NEB社） のマニュアルに準じて行った。 また、 1〃 g/ml溶液のへキスト 33342 (カルビオケム社製） を添加し、 室温で 5分間反応させ ることにより核染色も行った。 染色後、 乾燥させ、 退色防止剤溶液でマウントし、 蛍光顕微鏡下で観察した。
Ob - Rb蛋白質を発現している NC- 6、 NC- 12および AMN2-25は、 レプチン刺激が無い 条件では細胞質が染色されたが、 レプチン刺激を行うことにより核内が染色され た。 この結果は、 NC-6、 NC- 12および A N2- 25は、 機能的な OB- Rbを発現しているこ とを示している。 細胞株 NC- 12の結果を第 7図に示した。
(2) c-fos遺伝子および S0CS- 3遺伝子の発現変動の解析
視床下部細胞においてレブチン刺激により発現が上昇することが知られている c - fos遺伝子および S0CS- 3遺伝子の発現を、 PCR法利用した下記方法により解析す ることにより、 上記 （1) で機能的な OB-Rbを発現していることの確認された細胞 株のレブチン反応性を、 別の角度から確認した。
NC - 6、 NC- 12および AMN2- 25を、 実施例 1に記載した方法に準じて培養した。 培養 後、 約 2 X 104個の細胞をポリ-リジンでコートされた 35画ディッシュにまき、 培養 温度を 33°Cから 37°Cにシフトして 5日間培養した。 培養後、 培地を除き、 ゥシ胎児 血清を含まない DMEM/F-12 (-FCS) 培地に交換して 37°Cで 17時間培養した。 培養後、 DMEM/F-12 (-FCS) 培地に交換した。
培地交換 2時間後に 100nmol/Lのヒト ' レブチン （： R &Dシステム社製） を添加 した。 37°Cで 0分間、 30分間、 または 1時間培養後、 各細胞株から RNeasy Mini Kit (キアゲン社製）を用いて全 RNAを取得した。 実施例 6に記載の方法に準じて、 該 全 RNAから一本鎖 cDNAを合成後、 該 cDNAを錶型として PCRを行った。 c- fos遺伝子特 異的プライマーとしては、 配列番号 45、 46の塩基配列を有する合成 DNAを、 S0CS-3 遺伝子遺伝子特異的プライマーとしては、 配列番号 47、 48の塩基配列を有する合 成 MAを用いた。 G3PDH遺伝子の発現も合わせて検討した。
NC- 6、 NC-12および AM 2-25のいずれも、 G3PDH遺伝子の発現レベルに変化がない のに対し、 c-fos遺伝子および S0CS- 3遺伝子はレブチン刺激により発現が上昇する ことが認められた。 この結果も、 NC-6、 NC- 12および AMN2- 25が、 機能的な OB-Rbを 発現していることを示している。 またこの結果は、 上記方法で機能的な OB- Rbを発 現していることの確認された細胞株をレブチン刺激して発現が変動する遺伝子を 探索することにより、 レブチンに応答する遺伝子群を取得することが可能なこと を示している。
[実施例 9]視床下部由来細胞株を宿主としたべプチド発現系の構築
(1) プレブロバソプレッシン遺伝子の発現ブラスミ ドの造成
錶型としてヒト胸腺由来の inRNA (1〃G ;クロンテック社製） から調製した一本 鎖 cDNAを、 プレブロバソプレツシン遺伝子特異的プライマーとして、 配列番号 49 および配列番号 50に記載した配列を有する 2種類の合成 DNAを用い、 PCRによりプレ プロバソプレヅシン遺伝子を取得した。 上記プライマーには、 それそれ aindlllサ ィ トおよび lサイトが導入されている。 上記 PCR増幅断片を giidlllおよび l で切断後、 aifldl 11- I断片を取得した。 プラスミド PCDM8 (インビトロジェン社 製） を Sl dinおよび lで切断後、 Skdin- I断片を取得した。 上記 PCR増幅 断片由来の Sindiii- I断片および PCDM8由来の lindin- 1断片を結合すること により、 pCDM8- VPを造成した。
PCD 8-VPを Hindi 11およぴ Not Iで切断後、 プレブロバソプレッシン遺伝子を含む
Hindiii- MI断片を取得した。 該 aifidin- I断片を、 発現プラスミ ド pcDNAI/Amp (インビトロジヱン社製） の g^dlll- l間に組み込むことにより pcMAI/Amp- VPを構築した。
また、 該 Siadlll-MI断片を、 発現プラスミド pcDNA3. 1(+) (インビトロジェン 社製） の lledlll- l間に組み込むことにより PCDNA3.1-VPを構築した。 (2) プレブ口コルチコトロピン放出ホルモン遺伝子の発現プラスミドの造成 錡型としてヒト視床下部由来の mRNA (1〃G ;クロンテック社製) から調製した 一本鎖 cDNAを、 プレブ口コルチコトロピン放出ホルモン遺伝子特異的プライマ一 として配列番号 51および 52に記載した配列を有する 2種類の合成 DNAを用い、 PCRに よりプレブ口コルチコトロピン放出ホルモン遺伝子を取得した。 上記プライマ一 には、 それそれ Si dlllサイトおよび Mlサイトが導入されている。 上記 PCR増幅 断片を iiindinおよび MIで切断後、 Si din- MI断片を取得した。 プラスミ ド
Figure imgf000115_0001
Sisdin- I断片を取得した。 上記 PCR増幅 断片由来の SiBdl I I-Notl断片および PCDM8由来の liiidl 11- I断片を結合すること により、 pCDM8- CRFを造成した。
pCDM8- CRFを isdlllおよび lで切断後、 プレプロコルチコトロピン放出ホル モン遺伝子を含む Sindin- MI断片を取得した。 該 li din-Mi断片を、 発現プ ラスミド pcDNAI/Amp (インビトロジェン社製） の gl dl Π- MI間に組み込むこと により pcDNAI/Amp-CRFを構築した。
また、 該 iindlll- l断片を、 発現プラスミ ド pcDNA3.1(+) (インビトロジェン 社製） の giadl I I-Notl間に組み込むことにより PCDNA3.1-CRFを構築した。
(3) シングルクロ一ン AFF2- 34を宿主としたべプチドの発現
実施例 3で取得したラット成体雄の視床下部由来の不死化細胞株 （シングルクロ —ン AFF2- 34) を、 実施例 1に記載した方法に準じて培養した。 培養後、 約 1 X 104 個の細胞をポリ-リジンでコートされた 96穴ディヅシュの 1穴にまき、 33°Cで 1日間 培養した。
培養後、 リポフエクトァミン ' プラス（ギブコ社製、 リポフエクトァミン試薬と プラス試薬からなる）を用いて、 プレブロバソプレヅシン発現プラスミド （PCDM8- VP) 、 プレプロコルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミド （pCDM8- CRF) また はコントロールプラスミド （pCDM8) を AFF2- 34に導入した。 遺伝子導入は、 ブラ スミド 0.5〃g、 リポフエクトァミン試薬 0.5〃1、 プラス試薬 1〃1用い、 リボフ ヱクトァミン · プラスに添付された説明書に準じて行った。遺伝子導入した AIT2- 34株を DMEM/F- 12 (FCS) 培地 100 / 1中で 33°Cで 1日間培養した。 培養後、 培地を DMEM/F-12 (N2) 培地 100〃1に交換し、 33°Cでさらに 2日間培養した。
培養後、 培養上清を取得し、 該培養上清中のバソプレツシン活性およびコルチ コトロピン放出ホルモン活性を測定した。 バソプレツシン活性は、 下記実施例 21 の （1) で構築したアツセィ細胞を用いて測定した。 コルチコトロピン放出ホルモ ン活性は、 実施例 21の （2) で構築したアツセィ細胞を用いて測定した。
プレブロバソプレツシン発現プラスミ ドを導入した細胞由来の培養上清中には バソプレツシン活性が、 プレプロコルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミ ド を導入した細胞由来の培養上清中にはコルチコトロビン放出ホルモン活性が検出 された。 コントロールプラスミ ドを導入した細胞由来の培養上清中にはいずれの 活性も検出されなかった。
以上の結果から、 視床下部由来の不死化細胞株 （シングルクローン AFF2-34) を 宿主として活性べプチドの前駆体遺伝子を発現させることにより、 活性ぺプチド を生産できることが明らかになった。
(4) シングルクローン AIT2- 404を宿主としたべプチドの発現
実施例 3で取得したラヅト成体雄の視床下部由来の不死化細胞株 （シングルクロ ーン AFF2- 404) を用い、 上記 （3) と同様な実験を行った。 ただし、 AFF2- 404への 遺伝子導入は、 プラスミ ドを 0.2〃g、 リポフエクトァミン 2000 (ギブコ社製） を 0.5 / 1使用して行った。
上記同様、 AFF2- 404を宿主として用いた場合にも、 活性ペプチドの前駆体遺伝 子を発現させることにより、 活性べプチドを生産できることが明らかになった。
(5) 活性ペプチドの生産に適した細胞株の選択法
実施例 3で取得したラット成体雄の視床下部由来の不死化細胞株 （混合物） を用 い、 再度シングルクロ一ン化することにより、 新たに 708個のシングルクロ一ンを 取得した。 上記 （3) の方法に準じて、 シングルクローンにプレブロバソプレヅシ ン発現ブラスミ ド （pcDNA3.1- VP) を導入した株のバソプレヅシン活性を測定した。 バソプレツシンの活性が高かった 6種のシングルクローン （AF2- C3、 AF2- Cll、 AF2- E2、 AF2- Ell、 AF2-F7S AF2-G5) を優良株として取得した。
(6) 活性べプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系の構築
上記 （5) で取得したシングルクローン AF2-E2および AF2-G5を、 実施例 1に記載 した方法に準じて培養した。 培養後、 約 2 X 104個の細胞をポリ-リジンでコートさ れた 96穴デッシュの各穴にそれぞれまき、 33°Cで 1日間培養した。 培養後、 リボフ ェクトァミン ·プラス（ギブコ社製）を用いて、 下記 （i) 〜（iii)のプラスミ ドを 4840 それそれ導入した。 遺伝子導入は、 プラスミ ド 0.2〃g、 リボフヱクトァミン試薬 0.5 1、 プラス試薬 1〃1用い、 リボフェクトァミン ·プラスに添付された説明書 に準じて行った。
(i)コントロールプラスミ ド 〔pcDNA3.1(+ )〕
(ii)プレブロバソプレツシン発現プラスミ ド （pcDNA3. :l-VP)
(iii) pcDNA3.1- VPを pcDNA3.1(+)で 1/10に希釈した混合プラスミド
導入後、 各細胞を MEM/F- 12 (FCS) 培地 100 1中で 33°Cで 1日間培養した。 培養 後、 培地を DMEM/F-12(N2)培地 100〃1に交換し、 33°Cでさらに 2日間培養した。 該 培養細胞上に、 実施例 21の （1) で構築したアツセィ細胞を重層後、 1腿 ol/Lの ATP を添加した。 添加 6時間後に、 セレンテラジン h (coelenterazine h：モレキユラ 一.プロ一ブズ社） （終濃度 250imol/L) を添加し、 VIMカメラ （MGUS- 50/2Dルミ ノメ一夕/ MP：浜松ホトニクス社製） を用い、 レポ一夕一（ゥミシィタケ 'ルシフ エラ一ゼ） の活性を測定した。
プレブロバソプレツシン発現プラスミド pcMA3. :l- VP (非希釈） を導入した場合 には、 いずれの細胞においても活性が検出され、 ベクター〔pcDNA3.1(+)〕 のみを 導入した場合は、 活性は検出されなかった。
また、 いずれの細胞においても、 発現プラスミ ドをべクタ一で 1/10まで希釈し ても活性が検出された。 1/10まで希釈しても活性が検出できることより、 適当な 視床下部細胞株を宿主として選択して用いることにより、 少なくとも 10種の遺伝 子やライブラリーを同時に宿主細胞に導入して、 目的の活性を測定することがで きることが明らかになった。
また、 活性ペプチドの生産に適した各種細胞株を宿主として、 ランダムべプチ ドをコ一ドする遺伝子を発現させることにより、 多種のぺプチドを効率よく生産 することができる。 例えば、 任意の活性ペプチド前駆体遺伝子の活性ペプチドを コードしている遺伝子部分を、 ランダムぺプチドをコードする遺伝子と置換する ことによって、 ランダムペプチドを発現する遺伝子を作製することができる。
[実施例 10] スルホニルゥレアに反応する視床下部由来細胞株の同定
(1) 視床下部由来の不死化細胞株 （混合物） を用いたスルホニルゥレアに反応す る細胞株の検出 実施例 3で取得したラヅ ト成体雌の視床下部由来の不死化細胞株 （混合物） を、 実施例 1に記載した方法に準じて培養した。 培養後、 細胞に 5〃mol/Lの Fura-2AMを 添加し、 37。Cで 1時間培養した。得られた細胞を HBSSバヅファー （ギブコ社製） で 2回洗浄後、 該細胞を浮遊させた。 約 I X 106個の細胞に最終濃度が 0.5雇 ol/Lにな るようにスルホニルゥレア （Tolbutamide；ァレキシス社製） を添加し、 細胞内 Ca2+濃度の上昇を調べた。 細胞内 Ca2+濃度の測定は、 CAF- 110器機 （日本分光社製 ) を用いて行った。
その結果、 上記不死化細胞株 （混合物） 中にスルホニルゥレアに反応する細胞 株が存在することが判明した。 結果を第 8図 （a) に示した。
(2) 視床下部由来の不死化細胞株 （シングルクローン） を用いたスルホニルウレ ァに反応する細胞株の同定
上記 （1) と同様にして、 実施例 3で取得したラヅ ト成体雄の視床下部由来の不 死化細胞株 （シングルクローン AM 2- 25) のスルホニルゥレアへの反応性を調べた c 第 8図 （b) に示したように、 細 2- 25も、 スルホニルゥレアに反応して細胞内 Ca2+ 濃度が上昇することが判明した。 この結果は、 シングルクローン AM 2- 25がスルホ ニルゥレア受容体を発現していることを示している。
上記方法により、 スルホニルゥレアに反応する視床下部由来の不死化細胞株 （ シングルクローン） を同定または選択することができる。 また、 上記結果は、 実 施例 1~3で取得したラットの胎児、 新生児、 成体雄、 あるいは成体雌の視床下部 由来の不死化細胞株 （混合物あるいはシングルクローン） を、 任意の物質 （蛋白 質、 ペプチド、 化合物、 薬物、 細胞、 細胞の培養上清、 あるいは細胞の抽出液等 ) と接触させ、 該物質に反応する視床下部由来細胞株が存在するかどうかを調ぺ ることにより、 視床下部由来細胞株に反応する物質を探索することができること も示している。
[実施例 11]膝臓ランゲルハンス氏島由来細胞株の樹立
Exp. Anim. 48, 255 ( 1999)に記載の方法で作製した、 温度感受性変異株 SV40tsA58のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジヱニックラット （ワイエス ニューテクノロジー研究所から入手） から、 既知の方法 〔高木良三郎、 浜口和之、 小野順子、 新生化学実験講座第 18巻、 細胞培養技術 154-159頁〕 に準じて滕臓を 摘出した。 即ち、 ラヅト滕臓に、 0.7mg/mlコラゲナーゼ （和光純薬社製） を含む ハンクス液を注入した後、 脬臓を摘出した。
該滕臓を 50mlチューブに入れ、 37°Cの恒温槽で 30分間振とうした後、 氷冷した 0.5%牛血清アルブミン 〔シグマ （Sigma) 社製：以下 BSAと略す〕 を含むハンクス 液 〔137雇 ol/L NaClヽ 5.4腿 ol/L K 0.3醒 ol/L Na2HP04、 0.4腿 ol/L ¾P04S 2.8雇 ol/L Glucoses 0.8纖 ol/L MgS04、 1.3蘭 ol/L CaCl2、 10雇 ol/L HEPES/NaOH ( PH7.4) 、 5蘭 ol/L Sodium pyruvate) を 8ml添加し、 激しく振とうして脬組織をほ ぐした。
該滕組織を、 日立社製の遠心分離機 （himacSCT- 5BA) を用いて、 1200回転/分で 2分間遠心分離して沈殿を取得した。 該沈殿に氷冷したハンクス液を 40ml加えて懸 濁後、 1200回転/分で 2分間遠心分離して沈殿を取得した。 この操作を違心後の上 清に濁りがなくなるまで行った。
得られた沈殿にハンクス液を 40ml加えて懸濁後、 懸濁液を金属の茶漉し （タイ ガ一クラウン社製） でろ過した。 得られたろ過液に氷冷したハンクス液を 20mlカロ えた後、 1200回転/分で 2分間遠心分離して沈殿物を取得した。 この操作をさらに 2 回繰り返した。
得られた沈殿にヒストパーク- 1077 (シグマ社製） を 10ml加えて懸濁後、 5mlず つ 15mlチューブ （FALCON社） に分注した。 該分注懸濁液の上に、 室温のハンクス 液 5mlを、 パスツールピペットを用いて静かに重層し、 室温、 2300回転/分の条件 で 15分間遠心分離した。
境界面に集まったランゲルハンス氏島をパスツールピぺヅトを用いて集め、 0.5 % BSAを含むハンクス液を 10ml加えた後、 1200回転/分で 2分間遠心分離して沈殿 を取得した。 該沈殿に 0.5% BSAを含むハンクス液を 10ml加えた後、 1200回転/分 で 2分間遠心分離して沈殿 （ランゲルハンス氏島） を取得した。 この操作をさらに 1回行った。
得られたランゲルハンス氏島を、 氷冷した 0.5% BSAを含むハンクス液 10mlに懸 濁し、 800回転/分で 30秒間遠心分離して沈殿を取得した。 該沈殿を 10mlの Ca2+ · Mg2+不含平衡塩類溶液 〔8g/l NaCl、 0.3g/l KC1ヽ 0.05g Na¾P04 · H20、 0.025g/l KH2P04、 lg/1 NaHC03、 2g/l グルコース：以下 CMF液と略す〕 に懸濁後、 800回転/ 分で 1分間遠心分離して沈殿を取得した。 該沈殿に 0.02% EDTAを含む CMF液を 10ml加え、 室温で 5分間ゆつくりと振とうし た後、 1200回転/分で 1分間遠心分離して沈殿を取得した。 該沈殿に KMの CMF液を 加えて懸濁後、 1200回転/分で 1分間遠心分離して沈殿を取得した。 該沈殿を 3.3mg/mlのデイスパーゼ （三光純薬社製） を含む CMF液 （10ml) に懸濁し、 室温で 15分間ゆっくり振とうしだ後、 1200回転/分で 1分間遠心分離して沈殿 （ランゲル ハンス氏島由来細胞） を取得した。
得られたランゲルハンス氏島由来細胞を 10mlの CMF液を用いて 3回洗浄後、 2つに 分け、 （1) 10%牛胎児血清、 50ϋ/πι1 ペニシリン、 および ストレブトマ イシンを添加した、 DMEM培地 （シグマ社製：製品番号 D- 5796) 〔以下、 EM
(D-5796) 培地と呼ぶ；該培地には 25mmol/Lのグルコースが含まれている〕、 ま たは （2) 10% 牛胎児血清、 50ϋ/ιη1 ペニシリン、 および 50〃g/ml ストレブトマ イシンを添加した、 RPMI1640培地 （日水製薬製：製品番号 05918) 〔以下、 RPMI1640(05918〉培地と呼ぶ〕 の 2種の培地 （10ml) を用い、 ポリ-リジンでコート された; 100翻ディッシュ （べクトン 'ディヅキンソン社製） 中、 33°C、 炭酸ガス濃 度 5%、 湿度 100%の条件下で培養した。
細胞が増殖して飽和した時点で、 それぞれの培地を用いて、 培養面に対する細 胞密度が約 70%になるように、 ポリ-リジンでコートされた 100雇ディヅシュ中に 継代した。 それぞれの培地で約 3ヶ月間培養を継続し、 ランゲルハンス氏島由来の 不死化細胞株の混合物を得た。 取得したランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株 の混合物を、 それそれ約 5 X 106細胞となるようにチューブ 5本に分注し、 公知の方 法で凍結保存した。
凍結保存細胞を用い、 下記コロニー形成法によりシングルクローン化を行った。 ポリ-リジンでコートされた 100腿ディッシュ （べクトン 'ディヅキンソン社製） に 100個あるいは 500個の細胞をまき、 それそれの培地を用いて、 コロニーが形成 されるまで培養した。培養後、 顕微鏡下で観察しながらチップの先で各コロニ一 を剥がし、 同時にチップ内に吸引して細胞を回収した。 回収した各コロニー由来 の細胞は、 ポリ-リジンでコートされた 24穴プレートにまき、 それそれの培地を用 いて培養した。 細胞が増殖して飽和した時点で、 6穴プレートおよび 100腿ディヅ シュ （いずれもポリ-リジンでコートされたもの） に順次スケールアップした。 上記コロニー形成法により、 RPMI1640(05918)培地より 117個の、 DMEM(D-5796) 培地を用いて 144個のシングルクローン化した細胞株を取得した。 RPMI 1640 (05918)培地を用いて取得された細胞株は、 それそれ R-1〜！ 1-45、 Μ-1〜Μ-63、 およ び F-1〜F- 9と、 MEM(D- 5796)培地を用いて取得された細胞株は、 それそれ D- 1~D - 72、 および D2- l~D2-72と命名した。 取得した細胞株をそれぞれ公知の方法で凍結 保存した。 取得した細胞株のダブリングタイムは 36〜72時間であった。 また、 樹 立後 1年以上経過した後も、 細胞株の増殖性に顕著な変化は見られなかった。
[実施例 12]滕臓ランゲルハンス氏島由来細胞株における各種遺伝子の発現解析 実施例 11で取得したランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株 （混合物またはシ ングルクローン） の、 ランゲルハンス氏島で発現している第 6表に示した各種遺伝 子に関する発現状況を下記方法により解析した。
実施例 11で取得した細胞株を、 実施例 11に記載の方法に準じて培養した。 培養 後、 約 l x lO5個の細胞をポリ-リジンでコートされた 100丽ディッシュにまき、 培 養温度を 33°Cで 5日間培養した。
培養後、 各細胞株から RNeasy Mini Kit (キアゲン社製）を用いて全 RNAを取得し た。 該全 Aを 5 g用い、 Superscript First-Strand Synthesis System for RT- PCR (ギブコ社製） により一本鎖 cDNAを合成した。 該一本鎖 cDNAを水で 50倍希釈し、 PCRの鐯型として使用した。
該一本鎖 cDNA (5 zl) に、 第 6表に示した遺伝子特異的プライマー （各 20piiol) 、 2.5mmol/L dNTP混合液を 1·6〃1、 DMS0を 1〃1、 5単位/〃 1の Recombinant Ex Taq DNA Polymerase (宝酒造社製） を 0.1〃1、 10 x反応緩衝液 （宝酒造社製） を 2 zl 添加し、 滅菌水を加えて全量を 20 lに調製した。 該調製液を用い、 下記条件で PCRを行った。 サ一マルサイクラ一 DNA Engine (MJ Research社製） を用い、 95°C5 分間の熱処理後、 94°Cで 1分間、 60、 65あるいは 67°C (各遺伝子増幅に対応する反 応温度を第 6表に示した） で 1分間、 72°Cで 1分間からなる反応を 25〜35サイクル行 つ /こ o
該反応液の一部 （8 l) をァガロースゲル電気泳動に供した後、 ゲルを SYBR Green I nucleic acid stain (モレキュラー ·プロ一ブズ社） で染色した。 增幅 された DNA断片のパターンをフルォロイメージャー （Fluorlmager SI; Molecular Dynamics社製） で解析することにより、 増幅された DNA断片の量を測定した。 4840 各遺伝子の転写産物の定量は、 常法 〔PCR Protocols, Academic Press(1990)〕 にしたがって半定量的 PCR法により行った。 ラット ·グリセルアルデヒド 3-リン酸 デヒドロゲナ一ゼ （以下、 G3PDHと略す） の転写産物を同時に定量することにより、 細胞間での mRNA量の違いや、 サンプル間での逆転写酵素による mRNAから一本鎖 cDNAへの変換効率に大差ないことを確認した。 G3P皿転写産物の定量は、 常法 〔 Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 87, 2725 (1990) ; J. Biol. Chem. , 2695 14730 ( 1994) ; 特開平 06- 181759 〕 にしたがって定量的 PCR法により行った。
プライ 反応温度
No. 通伝子
(配列番^)
1 プレプロインスリン 53, 54 60
2 プレブログルカゴン 55, 56 60
3 プレブロソマトスタチン 57, 58 65
4 プレプロ膝ポリペプチド 59, 60 60
5 PC1 61, 62 65
6 PC2 63, 64 65
7 GLP-1受容体 (GLP-1R) 65 66 67
8 PDX1 67, 68 65
9 ニューロ D 75, 76 60
10 Pax4 69, 70 65
11 Pax6 71, 72 65
12 ニューロジェニン 3 73, 74 65
13 Nkx2.2 77, 78 65
14 Nkx6.1 79, 80 65
15 グルコキナーゼ 81, 82 65
16 2型グルコーストランスポ一ター 83, 84 65
17 ベータセルリン 85, 86 65 解析した結果のうち、 第 7-1表〜第 7-6表に D-1〜！ )-72、 D2- 1〜D2- 72、 R-；！〜 R - 45 の各細胞株の、 プレブ口インスリン （表中では Insで表した） 、 プレブログルカゴ ン （表中では Gluで表した） 、 プレブロソマトス夕チン （表中では SMで表した） 、 プレブ口膝ポリペプチド （表中では PPで表した） 、 PC1、 PC2、 GLP- 1受容体 (GLP- 1R)、 PDXK ニューロ Dの各遺伝子についての発現量を +++、 ++、 +、 +/-、 -で示し た。 上記の（1 )〜（17)の遺伝子の発現パターンが異なる多様な細胞株が取得されて いることが明らかになった。
第 7-1表 ラットランゲルハンス氏島由来細胞株の遺伝子発現 （1)
Figure imgf000124_0001
各遺伝子の発現量を、 +++， ++， +, +/-， -で示した。
細胞株：実施例 11で取得されたランゲルハンス氏島由来の細胞株 遺伝子：第 6表に記載の遺伝子に対応 第 7- 2表 ラットランゲルハンス氏島由来細胞株の遺伝子発現 （2)
Figure imgf000125_0001
各遺伝子の発現量を、 +++，++，+，+/- で示した
細胞株：実施例 11で取得された' 島由来の細胞株 遺伝子：第 6表に記載の遺伝子に対応 7 - 3表 ラヅ ランゲルハンス氏島由来細胞株の遺伝子発現 （3)
Figure imgf000126_0001
各遺伝子の発現量を、 +++， ++ , +， +/- , -で示した。
細胞株：実施例 11で取得されたランゲルハンス氏島由来の細胞株 遺伝子：第 6表に記載の遺伝子に対応 表 7- 4 ラットランゲルハンス氏島由来細胞株の遺伝子発現 （4)
Figure imgf000127_0001
各遺伝子の発現量を、 +++， ++, +， +/-, -で示した。
細胞株：実施例 11で取得されたランゲルハンス氏島由来の細胞株 遺伝子：第 6表に記載の遺伝子に対応 第 7-5表 ラットランゲルハンス氏島由来細胞株の遺伝子発現 （5)
Figure imgf000128_0001
各遺伝子の発現量を、 +++, ++, +,+/-,-で示した (
細胞株：実施例 11で取得された 島由来の細胞株 遺伝子：第 6表に記載の遺伝子に対応 第 7- 6表 ラットランゲルハンス氏島由来細胞株の遺伝子発現 （6)
Figure imgf000129_0001
各遺伝子の発現量を、 +++,++,+, +/-, -で示した
細胞株：実施例 11で取得されたラ 島由来の細胞株 遺伝子：第 6表に記載の遺伝子に対応
[実施例 13] 滕臓ランゲルハンス氏島由来細胞株における各種遺伝子産物の発現 解析
(1) ィンスリンの発現解析およびィンスリン発現細胞の取得
RPMI1640(05918)培地を用いて取得した実施例 11に記載の不死化細胞株の混合物 (約 l x lO3細胞） を CELL- TAXでコートされた 8チャンバ一の Lab- Tek chamber slide (Nalge Nunc International社製) にまき、 RPMI1640 (05918) 培地を用い、 33°Cで 2日間培養した。
培養後、 培地を除き、 4%パラフォルムアルデヒド溶液を加え、 4°Cで 10分間反 応させ、 細胞を固定した。 該固定化細胞を 0.3%トリ トン X- 100溶液で処理した後、 1%牛胎児血清を含んだ PBSを添加し、 室温で 30分間放置し、 ブロッキングを行つ た。 ブロッキング後、 1000倍希釈した抗インスリン抗体 （シグマ社製） を添加し、 37°Cで 60分間反応させた。 反応後、 1 %牛胎児血清を含んだ PBSで 3回洗浄し、 200 倍希釈した Alexa488標識抗ャギ IgG (モレキユラ一 ·プロ一ブズ社製） を添加し、 室温で 60分間反応させた。 反応後、 PBSで 2回洗浄し、 l〃g/mlのへキスト 33342溶 液 （カルビオケム社製） を添加し、 室温で 5分間反応させて核を染色した。
染色後、 PBSで 2回洗浄し、 乾燥させ、 退色防止剤溶液でマウントし、 蛍光顕微 鏡下で観察した。 その結果、 インスリンを発現する細胞が存在していることが判 明した。
RPMI1640(05918)培地を用いて取得した、 実施例 11に記載の不死化細胞株の各シ ングルクロ一ンについても下記方法でィンスリン発現細胞の存在を確認した。
RPMI1640 ( 05918 )培地を用いて取得した、 実施例 11に記載の各シングルクローン (約 1 X 104細胞) を 96穴プレートの 1穴にまき、 RPMI1640(05918)培地を用いて 33 °Cで 2日間培養した。 培養後、 上記と同様の方法で、 抗インスリン抗体を用いた免 疫染色およびへキスト 33342を用いた核染色を行った。 その結果、 シングルクロー ン M-8、 -9S および M-15がィンスリンを発現していることが明らかになった。
(2) プロセシング酵素 PC1の発現解析および PC1発現細胞の取得
RPMI1640(05918)培地を用いて取得した実施例 11に記載の不死ィ匕細胞株の各シン グルクローン （約 l x lO4細胞） を 96穴プレートの 1穴にまき、 RPMI1640(05918)培 地を用いて 33°Cで 2日間培養した。
培養後、 上記 （1) の方法に準じて、 抗 PC1抗体を用いた免疫染色およびへキス ト 33342を用いた核染色を行った。 抗体としては、 50倍希釈した抗 PC1抗体 （ケミ コン .インタ一ナショナル社製） を使用した。 その結果、 シングルクロ一ン 9お よび M- 33が PC1を発現していることが明らかになった。
(3) プロセシング酵素 PC2の発現解析および PC2発現細胞の取得 HPMII1640培地を用いて取得した実施例 11に記載の不死化細胞株の各シングルク ローン （約 1 X 104細胞） を 96穴プレートの 1穴にまき、 RPMI培地を用いて 33°Cで 2 日間培養した。
培養後、 上記 （1) の方法に準じて、 抗 PC1抗体を用いた免疫染色およびへキス ト 33342を用いた核染色を行った。 抗体としては、 50倍希釈した Chemicon InteRNAtional社製の抗 PC2抗体を使用した。 その結果、 シングルクローン M- 9、 M - 15、 および F-1〜 9等多くの細胞が PC2を発現していることが明らかになった。
[実施例 14] スルホニルゥレアに反応するランゲルハンス氏島由来細胞株の同定 RPMI1640 (05918)培地を用いて取得した実施例 11に記載の不死化細胞株のシン グルクローン (M- 6、 M-9s M- 15、 M-19、 M - 20、 M-33、 M - 43、 F- 1、 F-9) 約 5 x l06 細胞を、 60腿ディッシュにまき、 RPMI1640 (05918)培地を用いて 33°Cで 2日間培養 した。
培養後、 これら細胞に 5〃mol/Lの Fura-2AMを添加し、 37°Cで 1時間培養した。 培 養後、 HBSSバッファー （ギブコ社製） で 2回洗浄し、 細胞を浮遊させた。 該細胞約 1 X 106個に最終濃度が 0.5匪 ol/Lになるようにスルホニルウレァ （Tolbutamides ァレキシス社製） を添加し、 細胞内 Ca2+濃度の上昇を調べた。 細胞内 Ca2+濃度の測 定は、 CAF- 110器機 （日本分光社製） を用いて行った。
その結果、 調べた全てのシングルクローンにおいて、 スルホニルゥレアに反応 して細胞内 Ca2+濃度が上昇することが判明した。 この結果は、 調べた全てのシング ルクローンがスルホニルゥレア受容体を発現していることを示している。
以上の結果は、 実施例 11で取得したラットのランゲルハンス氏島由来の不死化 細胞株 （混合物あるいはシングルクロ一ン） を、 任意の物質 （蛋白質、 ペプチド、 化合物、 薬物、 細胞、 細胞の培養上清、 あるいは細胞の抽出液等） と接触させ、 該物質に反応するランゲルハンス氏島由来細胞株が存在するかどうかを調べるこ とにより、 ランゲルハンス氏島由来細胞株に反応する物質を探索することができ ることも示している。
[実施例 15]滕臓ランゲルハンス氏島由来細胞株の培養法の検討
(1) 培地の検討 実施例 13の （3) で PC2を発現していることが確認されたシングルクローン ( 18クローン) を、 RPMI1640(05918)培地を用いて 33°Cで培養後、 約 l x庭の細 胞を 96穴プレートの 1穴にまき、 βΡΜΙ1640( 05918)培地あるいは DMEM(D- 5796 )培地 を用いて 33°Cで 2週間培養した。 培養後、 実施例 13の （2) および （3) に示した方 法を用いて、 PC1および PG2の発現量を検討した。
その結果、 多くの細胞株において、 DMEM(D- 5796)培地で培養することにより、 生育が遅くなり、 PC1および PC2の発現が増加することが明らかになった。 この結 果は、 RPMI1640(05918)培地で培養していた細胞を、 DMEM(D- 5796 )培地に置換して 2週間培養することにより、 上記ランゲルハンス氏島由来細胞株の分化形質を制御 することができることを示している。 第 9図に、 細胞株 F- 8を用いて得られた結果 を示した。
(2) 培養温度の検討
上記 （1) と同じシングルクロ一ンを、 RPMI1640(05918)培地を用いて 33°Cで培 養後、 約 l x lO4個の細胞を 96穴プレートの 1穴にまき、 RPMI1640( 05918)培地また は DMEM(D- 5796 )培地を用いて、 33°Cまたは 37°Cで 2週間培養した。 培養後、 実施例 13の （2) および （3) に示した方法を用いて、 PC1および PC2の発現量を検討した。 その結果、 シングルクロ一ン F-1においては、 DMEM(D- 5796 )培地で 37°Cで培養す ると、 同培地で 33°Cで培養した場合に比較して、 PC1の発現がさらに増加すること が明らかになった。 この結果は、 33°Cで培養していた細胞を、 37°Cで 2週間培養す ることにより、 上記ランゲルハンス氏島由来細胞株の分化形質を制御することが 可能な場合があることを示している。
[実施例 16] ランゲルハンス氏島由来細胞株を宿主とした活性ぺプチド発現系の 実施例 11で取得したラヅトのランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株 （シング ルクロ一ン F- 4、 F- 5、 および F-8) を、 RPMI1640(05918 )培地を用いて 33°Cで培養 後、 2〜5 x l04個の細胞を 96穴プレートの 1穴にまき、 33°Cで 1日間培養した。
培養後、 リボフヱクトァミン .プラス（ギブコ社製）を用いて、 実施例 9の （1) で作製したプレブロバソプレッシン発現プラスミド （pcDNA3. 1- VP) 、 実施例 9の ( 2 ) で作製したプレブ口コルチコ トロピン放出ホルモン発現プラスミ ド （ pcDNA3.1-CRF) 、 あるいはコントロールプラスミド [； pcMA3.1( + )〕 を細胞に導入 した。 遺伝子導入は、 プラスミド 0.2〃g、 リポフエクトァミン試薬 0.5〃1、 ブラ ス試薬 1〃1用い、 リボフヱクトァミン ·プラスに添付された説明書に準じて行つ ノ o
遺伝子導入した株を、 RPMI1640(05918)培地 IOO I中、 33°Cで 1日間培養した。 培養後、 ±咅地を血清を含まない RPMI1640( 05918)培地 100〃1に交換し、 33°Cでさら に 2日間培養した。 培養後、 培養上清を取得し、 該培養上清中のバソプレツシン活 性およびコルチコトロピン放出ホルモン活性を測定した。 バソプレツシン活性は、 下記実施例 21の （1) で構築したアツセィ細胞を用いて測定した。 コルチコトロピ ン放出ホルモン活性は、 実施例 21の （2) で構築したァヅセィ細胞を用いて測定し た。
プレブロバソプレツシン発現プラスミドを導入した細胞由来の培養上清中には バソプレツシン活性が、 プレプロコルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミ ド を導入した細胞由来の培養上清中にはコルチコトロピン放出ホルモン活性が検出 された。 コントロールプラスミドを導入した細胞由来の培養上清中にはいずれの 活性も検出されなかった。 上記において、 RPMI1640(05918)培地の代わりに、 DMEM(D- 5796)培地を用いても同様の結果が得られた。 以上の結果から、 ランゲル ハンス氏島由来の不死化細胞株 （シングルクローン F- 4、 F- 5、 および!1- 8) を宿主 として活性ぺプチドの前駆体遺伝子を発現させることにより、 活性べプチドを生 産できることが明らかになった。
[実施例 17] 膝臓ランゲルハンス氏島由来細胞株を宿主とした活性べプチドの発 現クロ一ニング系の構築
( 1 ) 活性ぺプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系の構築
実施例 16に記載した方法に準じて、 ランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株 （ シングルクローン F- 8) に、 下記 （i) 〜（iii)のプラスミドをそれそれ導入した。
( i)コントロールプラスミ ド 〔pcDNA3.；! (+)〕
( ii)プレブ口コルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミ ド（pcDNA3.卜 CRF)を pcMA3.1(+)で 1/10に希釈した混合プラスミド
(iii) pcDNA3. ;l- CRFを pcDNA3.1( + )で 1/100に希釈した混合プラスミド 導入後、 各細胞を、 DMEM (LG) 培地 100〃1中で 33°Cで 2日間培養した。 培養後、 培地を血清を含まない DMEM (LG) 培地 100〃1に交換し、 33°Cでさらに 2日間培養し o
得られた細胞上に、 下記実施例 21の （2) で構築したアツセィ細胞を重層後、 25蘭 ol/Lグルコース + 100 mol/L スルホニルゥレア （Tolbutamide) を添加した c 添加 6時間後に、 セレンテラジン h (モレキュラー 'プロ一ブズ社） （終濃度 250nmol/L) を添加し、 VIMカメラ （MGUS- 50/2Dルミノメ一夕/ MP：浜松ホトニク ス社製） を用い、 レポ一夕一 （ゥミシィ夕ケ 'ルシフエラーゼ） の活性を測定し た。 その結果、 いずれの希釈サンプルにおいても活性が検出され、 発現ベクター
〔pcDNA3.1( + )〕 のみを導入した場合は活性は検出されなかった。
1/10〜1/100まで希釈しても活性が検出できることより、 適当な滕臓ランゲルハ ンス氏島由来細胞株を宿主として選択して用いることにより、 多数 （例えば 10〜 100種の cDNA) を同時に宿主細胞に導入し、 該細胞の培養上清、 該細胞の細胞抽出 液、 該細胞の膜画分、 または該細胞自身を用いて、 目的の活性を測定することが できることが明らかになった。
(2) 活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング
実施例 23に記載した方法に準じて、 適当な発現べク夕一〔pcDNA3.1(+) (インビ トロジェン社製） 、 PAGal9- nd (下記実施例 18) または PAGal9- d (下記実施例 18) 〕 を用いて cDNAライプラリー （大腸菌） を構築した。
該 cDNAライプラリ一を 1〜100クローンずつのプールに分けて培養した後に、 そ れそれのプールからプラスミドを回収する。 96穴プレートを用いて、 該プラスミ ドを適当なランゲルハンス氏島由来細胞株に導入して発現させる。
3日後に実施例 21に記載の方法に準じて作製することのできるァヅセィ細胞を重 層し、 6時間後にレポ一夕一活性を測定する。 100クローンずつのプールを用いた 場合は、 96穴プレート 1枚で 9600クローンのスクリーニングを行うことができる。 活性が検出されたプールをさらに細か _いプールに分け、 同様の操作を行うことに より、 最終的に目的の活性べプチド前駆体遺伝子を単離することができる。
pAGal9- ndまたは pAGal9- dをぺクタ一として造成した cDNAライブラリーを用いる 時には、 該 cDNAライプラリーと共に、 GaWpの DNA結合領域と単純へルぺスウィル スの VP16の転写活性化領域 （ transact ivat ion domain) のキメラ蛋白質 〔Nature, 335, 563 ( 1988)〕 を発現するためのプラスミド 〔例えば PCR2.1/Gal4- VP16 (インビトロジェン社製） 、 pAMo- Gal4VP16 (下記参照） 、 pcMA3-Gal4VP16 (下 記参照） 〕 を同時に宿主細胞に導入する必要がある。
pAMo- Gal4VP16および pcDNA3- Gal4VP16の造成について以下に記載する。
pMCl 〔J. Mol. Biol. , 崖， 1 (1984)〕 を MBIで切断後、 Klenow処理し、 さら に £lで切断することにより VP16遺伝子の 3'末端側を含む BI (平滑末端） - ^I断片を取得した。 pCMVGal4 CEMBO J. , 8, 2337, (1989)〕 を giadlllと Iで 切断し、 Gal4遺伝子の 5'末端側配列を含む Hndin—^ I断片を取得した。 pAMo - ndを lで切断後、 Klenow処理し、 さらに Hindi 11で切断することによりアンピシ リン耐性遺伝子を含む l (平滑末端） - Sisdlll断片を取得した。 pMCl由来の BstB I (平滑末端） - l断片、 pCMVGal4由来の U dl 11 断片および pAMo- nd由来 の I (平滑末端） - fidlll断片を結合し、 Gal4-VP16キメラ遺伝子発現プラスミ ド pAMo-Gal4VP 16を造成した。
pAMo-Gal4VP16を Sindl 11と 1で切断し、 Gal4-VP16キメラ遺伝子を含む Hindlll- Kpnl断片を取得した。 pcMA3.1+ (インビトロジェン社製） を liadlllと lで切断し、 アンピシリン耐性遺伝子を含む Ekdin- l断片を取得した。 pAMo-Gal4VP16由来の Sindl I I-Kpnl断片および PcDM3.1+由来の giadl 11- Kml断片 を結合し、 pcDNA3- Gal4VP16を造成した。
活性べプチドの生産に適した各種細胞株を宿主として、 ランダムぺプチドをコ ードする遺伝子を発現させることにより、 多種のペプチドを効率よく生産するこ とができる。 例えば、 任意の活性ペプチド前駆体遺伝子の活性ペプチドをコード している遺伝子部分を、 ランダムぺプチドをコ一ドする遺伝子と置換することに よって、 ランダムぺプチドを発現する遺伝子を作製することができる。
[実施例 18]新規宿主 'ベクター系の構築 (1)
(1) Gal4- ER発現プラスミ ド pGERbsrR2の造成
pSV2bsr (科研製薬社製）を MIIと^ RIで切断後、 Klenow処理して 2.6kbの il (平滑末端） - (平滑末端） 断片を取得した。 Gal4- ERキメラ遺伝子 〔Cell, 543 199 (1988) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1657 (1993)〕 を含有する ER m in pM (東京大学の加藤茂明先生より分与） を Πと §1で切断後、 Klenow処理して、 Π (平滑末端） - 1 (平滑末端） 断片を取得した。 上記の pSV2bsr由来の Π (平滑末端） -E^RI (平滑末端） 断片、 および ER AF2 in pM 由来の il (平滑末端） - 1 (平滑末端） 断片を結合することにより、 プラス ミド pGERbsrR2を造成した。 pGERbsrR2は、 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 由 来の転写因子 Gal4pの DNA結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域の キメラ蛋白質 （Gal4- ER) を発現することができる。
(2) ホタルつレシフェラ一ゼの誘導発現プラスミドの造成
pcDNA3(インビトロジェン社）を Xholで切断後、 Klenow処理して、 1 (平滑末 端） 断片を取得した。 該断片を結合することにより、 Smi切断部位を消失させた
PCDNA3を造成した。
2^1切断部位を消失させた PCMA3を lで切断後、 Klenow処理して、 1 (平 滑末端） 断片を取得した。 該断片を結合することにより、 および I切断部 位を消失させた PCDNA3を造成した。 該プラスミドを Πで切断後、 Klenow処理し、 Π (平滑末端） 断片を取得した。 pAMoERC3Sc (特開平 05- 336963) を 1^1と lで切断後、 Klenow処理し、 oriP配列を含む 2.2kbの^ I (平滑末端） -Ml ( 平滑末端） 断片を取得した。 上記の 切断部位と l切断部位を消失させた PCDNA3由来の Π (平滑末端） 断片、 および pAMoERC3Sc由来の^ I (平滑末端 ) - sil (平滑末端） 断片を結合することにより、 プラスミド PCDNA3- oriPを造成 した。
pcDNA3-oriPを 1と Siadl 11で切断し、 1- idi 11断片を取得した。 pSE01uc2 (W098/14474) を lと 1で切断後、 Klenow処理して、 アンビシリン 耐性遺伝子を含む^ I (平滑末端） -1^1 (平滑末端） 断片を取得した。 該断片を 結合することにより、 プラスミド pASd卜 luclを造成した。
pASd luclを Iと Sindlllで切断後、 O. llkbの 1- 断片を取得した。 上記 PCDNA3- oriP由来の I-M dlll断片、 および pASdl- lucl由来の I- gisdl ll 断片を結合し、 プラスミド pcDNA3- oriP- Sdlを造成した。
PCDNA3- oriP- Sdlを 1と §E718で切断し、 ^1-^718断片を取得した。 配列 番号 87、 88、 89、 および 90で表される塩基配列を有する 4種の DNAを合成した。 該 合成 DNAは混合してァニールすることによりポリ A付加シグナルをもつ 2本鎖 DNAを 形成する。 該合成 DNAをそれそれ T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化後、 混合してァニールさせることにより、 二本鎖 MAとした。 該ニ本鎖 DNAと pcDNA3 - oriP- Sdl由来の I- 5£718断片を結合することにより、 プラスミド pcDNA3- oriP - ScH- pAを造成した。
pcDNA3- oriP- Sdl- pAを^ Iで切断後、 Klenow処理して、 1 (平滑末端） 断片 を取得した。 pFR- luc (ストラタジーン社製）を gifidlllと^ HIで切断、 Klenow処理 し、 0.14kbの Siidlll (平滑末端） - I (平滑末端） 断片を取得した。 上記の PCDNA3- oriP- Sdl- pA由来の^ I (平滑末端） 断片、 および pFR- luc由来の Bdlll - 断片を結合し、 プラスミ ド pAGalSdlを作製した。 pAGalSdlは、 Gal4p応答配 列 （UASG) を 5回繰り返した配列を有するプロモ一夕一を含有している。
pAGalSdlを ^RIで切断後、 Klenow処理し、 ^RI (平滑末端） 断片を取得した。 pSE01uc2 (W098/14474) を U dlllと^ Iで切断後、 Klenow処理することにより ホタル .ルシフヱラ一ゼ遺伝子を含む 1.7kbの gisdlll (平滑末端） - l (平滑末 端） 断片を取得した。 上記の pSE01uc2由来の aindlll (平滑末端） - ^1 (平滑末 端） 断片、 および pAGalSdl由来の^ EJ (平滑末端） 断片を結合することにより、 プラスミド pAGalSd卜 lucを造成した。
pAGalSdl- luc内に存在する二つの Hindi IIサイ卜のうち、 ホタルつレシフェラ一 ゼ遺伝子からより離れた Ikdlllサイトのみを Klenow処理により消失させることに より、 pAGalSd4-lucを造成した。
pAGalSd4- lucを A§£718で切断後、 で部分消化し pAGalSd4-luc由来の 9.5kbの E718- 1断片を取得した。 該 DNA断片を Klenow処理し、 自己結合させることに よりプラスミド pAGal9-lucを造成した。
(3) 誘導発現べク夕一 pAGal9- dおよび pAGal9- ndの造成
ェプス夕イン ·バ一 · ウィルスの oriPを有する発現プラスミ ド pAGal9- lucを aindlllと Iで切断し、 oriPを含む 6.9kbの Sindlll- l断片を取得した。 pAMo- d (特開 2001- 211885) を iHsdlllと Iで切断し、 テトラサイクリン耐性遺伝子 （ TcE) を含む S dlll- I断片を取得した。 上記の pAGal9- luc由来の dlll- I 断片、 および pAMo- d由来の aindlll- I断片を結合することにより、 pAGal9- luc 中のホ夕ル ·ルシフェラーゼ遺伝子部分を pAMo_dの Stuffer配列と置き換えたブラ スミド pAGal9- dを造成した。
pAGal9- icを aindlllと lでし 6.9kbの Si^dlll- ^1断片を取得した。 ρΑΜο - nd (特閧 2001- 211885) を g sdlllと Iで切断し、 テトラサイクリン耐性遺伝子を 含む Illidni- l断片を取得した。 上記の pAGal9- luc由来の幽 dill- ^1断片、 および pAMo-nd由来の Hindlll- Sad断片を結合することにより、 pAGal9-luc中のホ タル ·ルシフェラ一ゼ遺伝子部分を pAMo-ndの Stuff er配列と置き換えたプラスミ ド pAGal9- ndを造成した。
(4) Gal4- ER発現プラスミド pGERbsrR2を Namalwa KJM- 1細胞の染色体 DNAに組み込 んだ細胞株 KJMGER8の造成
Gal4-ERキメラ転写因子発現プラスミ ド pGERbsril2を、 l〃g/ zlになるように TE 緩衝液〔10 mmol/L Tris- HC1(PH8.0)、 1 nnnol/L エチレンジァミン 4酢酸〕 に溶解 した後、 エレクトロボレ一シヨン法 〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕 により、 該プラスミ ドを Na alwa KJM-1細胞 〔Cytotechnology, 1, 151 (1988)〕 に、 6 x 106細胞あたり 4/ ^導入し、 形質転換細胞を得た。 Namalwa KJM-1細胞は、 EBNA-1 遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株である。
該形質転換体を、 8mlの RPMI1640' ITPSG培地〔RPMI1640培地 （日水製薬社製） に、 1/40量の 7.5% NaHC03、 3% 200mmol/L L -グル夕ミン溶液（インビトロジェン社製 )、 0.5% ペニシリン ·ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン社製、
5, 000units/ml ペニシリン、 5，000 zg/ml ストレプトマイシン）、 10mmol/L N-2- ヒドロキシェチルピペラジン- N，- 2 -エタンスルホン酸 （N-2- hydroxyethylpiperazine-N' -2-hydroxypropane-3-sulfonic acid; HEPES)、 3 〃 g/ml インシュリン、 5 zg/ml トランスフェリン、 5 mmol/L ピルビン酸ナトリゥ ム、 125 nmol/L亜セレン酸ナトリウム、 1 mg/ml ガラクト一スを添加した培地〕 に懸濁し、 002ィンキュベー夕一中で 37°Cで 24時間培養した。
培養後、 ブラストサイジン S (Blastcidin S) (KK- 400：科研製薬社製） を 2.0 ； g/mlになるように添加し、 96穴プレートに分注 （500~2000細胞 Z穴） して培養 を行い、 pGERbsrR2が染色体 DNAに組み込まれた安定形質転換株 （シングルクロー ン） を多数取得した。 各形質転換株は、 2.0〃g/mlのブラストサイジン Sを含む RPMI1640. ITPSG培地で継代した。
下記に示す方法により上記安定形質転換株から、 誘導倍率が高く、 かつ非誘導 時のバックグラゥンドが低い優れた安定形質転換株 KJMGEH8細胞を選択した。
各形質転換株にホ夕ル ·ルシフヱラーゼの誘導発現プラスミ ド pAGalSdl- lucを エレクト口ポレーシヨン法により導入し、 2日間培養した。 培養後、 17 ? -ェスト ラジオール (E8875：シグマ社製） （終濃度 lOnmol/L) を添加し、 さらに 24時間培養 後、 ホタル レシフェラーゼ活性の測定を行った。 活性の測定は、 ルミノメ一夕 -LB953 (ベルトールド社製) を用い、 細胞溶解用緩衝液 〔1%トリ トン X- 100、 100 mmol/L KH2P04 (pH7.8)、 1 mmol/Lジチオスレィ トール〕 100〃1を、 上記培 養液に自動注入後、 基質溶液 〔25 mmol/L グリシルグリシン (pH7.8 ) 、 15 mmol/L MgS04N 5 mmol/L ATP、 0.33 mmol/L ルシフェリン〕 300〃1を自動注入し、 10秒間の発光量を測定し、 ルシフェラ一ゼ活性とした。 比較のために、 17 ?-エス トラジオール無添加条件下でのルシフヱラ一ゼ活性も測定した。
17 5 -エストラジオール添加条件下のルシフヱラーゼ活性と 17 ?-エストラジオ ール無添加条件下のルシフェラーゼ活性を比較することにより、 遺伝子発現の誘 導倍率を算出し、 該誘導倍率が高く、 且つ 17^-エストラジオール無添加条件下の ルシフェラーゼ活性が低いクローンとして、 KJMGER8細胞を選択した。
(5) KJMGER8を宿主としたホ夕ル .ルシフェラーゼ遺伝子の誘導発現
KJMGER8にホ夕ル -ルシフェラ一ゼの誘導発現プラスミド pAGal9- lucまたはコン トロールプラスミ ド （pAGal9- nd) を、 エレクトロボレ一シヨン法により、 1.6 X 106細胞あたり 4〃g導入し、 形質転換細胞 （KJMGER8/pAGal9- lucおよび KJMGER8Z pAGal9-nd) を取得した。
該形質転換細胞を、 8mlの RPMI1640 ' ITPSG培地に懸濁し、 C02インキュべ一夕一 中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 プラストサイジン S (0.2 zg/ml) およびジ エネティシン （Geneticin；ギブコ社製） （0.5mg/ml) を添加し、 さらに 14日間培 養し、 安定形質転換株を取得した。 該安定形質転換株は、 プラストサイジン S ( 0.2 /g/ml) およびジエネティシン （ギブコ社製） （0.5mg/ml) を含む RPMI1640' ITPSG培地で継代した。
該安定形質転換株に 17^ -エストラジオール（E8875：シグマ社製） （終濃度 10nmol/L) を添加して 24時間培養後、 上記と同様にしてルシフヱラーゼ活性の測 定を行った。 比較のために、 17 5-ェストラジオ一ル無添加条件下でのルシフェラ ーゼ活性も測定した。
17^-エストラジオ一ル添加条件下のルシフェラ一ゼ活性と 17 ? -エストラジオ ール無添加条件下のルシフヱラーゼ活性を比較することにより、 遺伝子発現の誘 導倍率を算出した。 その結果、 KJMGER8/pAGal9- lucにおける遺伝子発現の誘導倍 率は、 約 1万倍であった。 17 ? -エストラジオール無添加条件下での KJMGER8Z pAGal9- luc中のルシフヱラーゼ活性は非常に低かった （約 60RLU/10秒） 。 この結 果は、 17 5 _ェストラジオ一ル無添加条件下ではほとんどルシフヱラーゼ遺伝子が 発現していないことを示している。
上記のように、 pAGal9- lucを誘導発現プラスミド、 KJMGER8を宿主として用いた 系においては、 非誘導時のルシフェラ一ゼ活性が非常に低く、 誘導時のルシフエ ラ一ゼ活性が非常に高かった。 pAGal9- lucの構造は、 pAGal9-ndまたは pAGal9-dに 誘導発現させるレポ一夕一遺伝子として、 ホ夕ルつレシフェラ一ゼ遺伝子を揷入 した構造である。 したがって、 KJMGER8を宿主、 pAGal9- ndまたは pAGa dを誘導発 現ベクターとして用いる系は、 非誘導時の遺伝子発現量が非常に低く、 かつ遺伝 子発現の誘導倍率が高い、 極めて優れた誘導発現系であることが判明した。
[実施例 19]新規宿主 ·ベクタ一系の開発 （2)
( 1 ) ホタル ·ルシフェラ一ゼをレポ一夕一とするレポ一夕一プラスミ ド pACREplucの造成
cAMP応答配列 （CRE) の制御下にホタル 'ルシフェラ一ゼ遺伝子を発現すること のできるレポ一夕一プラスミ ドである pACREplucを以下の方法で造成した。 pACREplucは、 ハイグロマイシン耐性遺伝子およびェプスタイン ·バー 'ウィルス の oriPを有している。
pAMo CJ.Biol.Chem. , 268, 22782 (1993)、 別名 pAMoPRC3Sc (特開平 05- 336963 ) 〕 を^ Iで部分消化し、 一力所切断された DNA断片を取得した。 該 DNA断片を llで部分消化し、 9.5kbの 断片を取得した。 pAGE248 〔J. Biol. Chem. , Μ, 14730 (1994)〕 を £klおよび Mi lで切断し、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を 含む 1.5kbの Mi l断片を取得した。 pAMo由来の^ I- ill断片、 および PAGE248由来の^ I- iiinl断片を結合し、 プラスミド pAMohを造成した。
pAMohを Iと Si dinで切断後、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む^ I - Sindlll断片を取得した。 pAGal9- lucを lと Sisdlllで切断し、 oriP、 Gal4UASを 含む I- Mfidni断片を取得した。 pAGal9- luc由来の I- Sildlll断片、 および 上記 pAMoh由来の 1- Skdlll断片を結合することにより、 プラスミド pAGal9hを 造成した。
pBluescriptll S+ (ストラ夕ジーン社製） を lおよび^ Mlで切断した後、 フ ォスファタ一ゼ (Alkaline Phosphatase E. coli C75、 宝酒造社製） を用いて脱リ ン酸化処理し、 アンピシリン耐性遺伝子を含む i- 1 断片を取得した。 配列 番号 91および 92で表される塩基配列を有す合成ォリゴヌクレオチドをァニールさ せることにより、 CRE配列を 2つ含む二本鎖 DNAを調製した。 該ニ本鎖 DNAと pBluescriptll KS+由来の上記 I— l 断片を結合し、 CRE配列を 2つ含むプラス ミド pBS-CREIを造成した。 pBS- CREIは、 該ニ本鎖 DNAが、 l切断部位および^ I 切断部位が再生する方向に組み込まれたプラスミドであり、 上記切断部位をそれ それ 1つ有している。
pBS-CREIを Sealおよび Xholで切断しファ一ジ flの o を含む Scal-Xhol断片を取 得した。 pBS-CREIを^ Iおよび lで切断し ColEl oriを含む^ I- I断片を取 得した。 pBS- CREI由来の^ I- I断片および^ 断片を結合し、 CUE配列を 4つ含む pBS- C IIを造成した。
PBS-CREIIを Sealおよび Xholで切断しファージ Πの oriを含む Seal- Xhol断片を取 得した。 pBS- CREI Iを Sealおよび Sal Iで切断し ColEl oriを含む^ I- I断片を取 得した。 pBS- CREII由来の l— kl断片および^ I- l断片を結合し、 CRE配列 を 8つ含む pBS- CREIVを造成した。
pBS- CREIVを Sealおよび Xholで切断しファ一ジ flの oriを含む Scal-Xhol断片を取 得した。 pBS- CREIVを^ Iおよび lで切断し ColEl oriを含む^ I- I断片を取 得した。 pBS- CREIV由来の I- l断片および I- l断片を結合し、 CRE配列 を 16含む pBS-CREVI 11を造成した。
pBS-CREVIIIを 1で切断後、 Klenow処理し、 さらに Sindlllで切断することに より、 16個の CREを含む lkdIII-^2l (平滑末端） 断片を取得した。 pAGalSdlを Mil!と Sifidlllで切断し、 1.4kbの ini- lindlll断片を取得した。 pAGal9hを 1で 切断後、 Klenow処理し、 さらに幽1で切断することにより^ I (平滑末端） - kl 断片を取得した。 pBS- CREVIII由来の gi dlll- I (平滑末端） 断片、 pAGalSdl由 来の Mini- lildlll断片、 および pAGal9h由来の I (平滑末端） - 1断片を結合 し、 プラスミド pACREhを作製した。
pAGal9- lucを と lで切断し、 ホ夕ル 'ルシフェラーゼ遺伝子を含む 2^1- MI断片を取得した。 pACREhを 1と Iで切断し、 CRE配列を含む 2^1- l断 片を取得した。 pAGal9- luc由来の I- Ml断片、 および pACREh由来の 21- 1 断片を結合することによりプラスミド pACRElucを作製した。
pACRElucを giiidinで切断後、 Klenow処理し、 さらに Iで切断することにより CREを含む Sindlll (平滑末端） -SIQI断片、 およびホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ遺伝子 を含む ίϋ ΠΙ (平滑末端） - l断片をそれぞれ取得した。 pACREluc由来の上記 2 種の Siadin (平滑末端） -Smi断片を結合することにより、 pACREluc中の CRE配列 上流の ndlllサイトが消失したプラスミド pACRElucHを作製した。
pGL3- Enhancer vector 〔プロメガ (Promega)社製〕 を Hindi IIと Hpalで切断し、 luc+遺伝子 （改変型のホ夕ル 'ルシフェラーゼ遺伝子） を含む gi dni- l断片 を取得した。 pACRElucHを lで切断後、 Klenow処理し、 さらに Sisdlllで切断す ることにより、 CREを含む Sindlll-Notl (平滑末端） 断片を取得した。 pGL3 - Enhancer vector由来の iisdlll-geil断片、 および pACRE lucH由来の Hind 111 -Not I (平滑末端） 断片を結合することによりプラスミド pACREplucを作製した。
(2) レポ一夕一プラスミド pACREplucを導入した Namalwa KJM- 1細胞の造成 レポ一夕一プラスミド pACREplucを、 l〃g/〃lになるように TE緩衝液に溶解した 後、 該プラスミ ドを、 エレクトロポレーシヨン法 〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕 により Namalwa KJM- 1細胞に、 6 x 106細胞あたり 4 zg導入し、 形質転換細 胞を得た。
該形質転換細胞を 8mlの E I1640' ITPSG培地に懸濁し、 （¾ィンキュ Λ、、-タ-中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 ハイグロマイシン B (Hygromycin B) (300^g/ml) を 添加し、 さらに 14日間培養して安定形質転換株を取得した。 該形質転換株は、 ノ、 ィグロマイシン B (300 zg/ml) を含む RPMI1640. ITPSG培地で継代した。
CREを介した遺伝子発現が起こるかどうかを確認するために、 該形質転換株を、 2a型のアデノシン受容体 (A2a) のァゴニストである 5' -N-ェチルカルボキサミ ド アデノシン （NECA：シグマ社製） 、 アデ二レ一トシクラーゼの活性剤であるフォ ルスコリン (シグマ社製)、 またはカルシウムィオノフォアである A23187〔リサ ーチ ' ノ ィオケミカル · イ ン夕一ナショナル ( Research Biochemicals International) 社製〕 を用いて、 下記条件で刺激した。
即ち、 上記安定形質転換株を 48穴プレート 1穴あたり l x lO5細胞ずつ分注し、 NECA (終濃度 100皿 ol/L) 、 フオルスコリン （終濃度 100〃mol/L) 、 または A23187 (終濃度 10〃mol/L) を添加後、 C02インキュべ一夕一中で 5時間培養し、 刺激した c 刺激後、 実施例 18の （4) に記載の方法を用いてホタル 'ルシフヱラーゼ活性測 定をおこなった。
その結果、 NECA刺激で約 7倍、 フオルスコリン刺激で約 10倍のホ夕ル ·ルシフエ ラーゼ活性の上昇がみられた。 一方、 A23187刺激ではホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ活 性はほとんど変化しなかった。
以上の結果から、 pACREplucを導入した Namalwa KJM- 1細胞においては、 CREから の転写を促す刺激により、 ルシフェラ一ゼ遺伝子が発現することが明らかになつ た。
即ち、 pACREplucを導入した Namalwa KJM-1細胞を用いることにより、 CREからの 転写を促す活性を有する物質を探索することが可能である。
pACREplucを導入した Namalwa KJM-1細胞を NECAで刺激し、 6、 24、 48、 72、 およ ぴ 96時間後にホタル ·ルシフヱラーゼ活性を測定した結果、 6時間で活性が最大と なり、 24時間でほぼ半減した。 従って、 該細胞を任意の物質で刺激する場合は、 刺激後 6時間目に活性を測定することが好ましいと考えられた。
(3) レポ一夕一プラスミド pACREplucを KJMGER8の染色体 DNAに組み込んだ安定形 質転換株の造成
pACREpluc中の oriP内に 1個所存在する制限酵素である He§I、 SpeK または Ball で切断した pACREplucを 1〃g/〃lになるように TE緩衝液に溶解した後、 エレクト口 ポレーシヨン法 〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕 により、 実施例 18で造成した KJMGER8に、 6 X 106細胞あたり 4〃g導入し、 形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を 8mlの BPMI1640 ' ITPSG培地に懸濁し、 C02ィンキュベ一夕一中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 ブラストサイジン S (2.0^g/ml) およびハイグ ロマイシン B (300 /g/ml) を添加し、 さらに 7日間培養した。 生細胞数を確認後、 プラストサイジン S (2.0 g/ml) およびハイグロ.マイシン B (300〃g/ml) および KJMGER8を 1 X 105細胞/ mlを含む RPMI1640' ITPSG培地で、 150細胞 Zmlになるように 希釈し、 96穴プレートに分注 （平均 30細胞/穴） して培養を行い、 実際に 1穴当た り 1コロニーを形成した穴を選択し、 420個の安定形質転換株 （シングルクローン ) を取得した。 各形質転換株は、 プラストサイジン S (2.0〃g/ml) およびハイグ ロマイシン B (m ig/ml) を含む RPMI1640. ITPSG培地で継代した。 ' (4)優れた性質を有する安定形質転換株 （シングルクローン） の選択
上記 （3) で取得した各クローンを 96穴プレートにまき 〜 2 X 104細胞/穴） 、 NECA (終濃度 100nmol/L) を添カ卩して C02インキュベータ一中で 6時間培養した。 培 養後、 実施例 18の （4) に記載の方法を用いて各穴のホ夕ル ·ルシフヱラ一ゼ活性 を測定した。 測定器としては Micro Lumat LB96P (ベルトールド社製） を使用した c 活性の高かつた 17クローンを選択した。
該 17クロ一ンを用い、 上記 （2) と同様の方法で NECA¾激し、 NECA刺激しない場 合と比較し、 ルシフヱラーゼ活性が 60倍以上上昇した 8クローンを選択した。 該 8 クローンをそれそれ GBC1〜GBC8と命名した。
該 8クローンに pAGal9-GPR12 〔構成活性型の G蛋白質共役型受容体である を 誘導発現するためのプラスミド ：下記実施例 22参照〕 を、 上記エレクト口ポレー シヨン法により、 6 X 106細胞あたり 4 /g導入し、 形質転換細胞を取得した。
該形質転換細胞を 8mlの RPMI1640 ' ITPSG培地に懸濁し、 （¾ィンキュベ一夕一中、 37°Cで 24時間培養した。培養後、 プラストサイジン S (2.0 zg/ml) 、 ハイグロマ イシン B (300 zg/ml) およびジエネティシン （500 zg/ml) を添加し、 さらに; 14日 間培養して安定形質転換株を取得した。 該形質転換株は、 ブラストサイジン S ( 2.0〃g/ml) 、 ハイグロマイシン B (300 i g/ml ) およびジエネティシン （500〃 g/ml) を含む RPMI1640' ITPSG培地で継代した。
各形質転換株に 17 3-エストラジオール （終濃度 10皿 ol/L) を添加して 24時間培 養後、 実施例 18の （4) と同様の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。 比較 のために、 17 ? -エストラジオ一ル無添加条件下でのルシフェラ一ゼ活性も測定し ノ
17^-エストラジオールを添加した際のルシフヱラーゼ活性の上昇率が高かった 3クローン （GBC5、 GBC6、 GBC7) を選択した。 GBC5、 GBC6、 GBC7における該上昇率 は、 それぞれ 56、 193、 および 364倍であった。
該 3クローンに、 上記と同様の方法で pAGal9- V2 〔2型バソプレヅシン受容体
(V2) を誘導発現するためのプラスミド：下記実施例 21の （1) 参照〕 を導入して 安定形質転換株を取得し、 17 ?-エストラジオール刺激により導入遺伝子 （V2遺伝 子） を誘導発現させた後に、 バソプレツシン刺激した際のルシフェラ一ゼ活性を 調べた。 同時に、 17 ?-エストラジオール 1刺激しない場合の活性、 およびバソプ レツシン刺激しない場合の活性を調べた。
以上の結果、 17^-エストラジオールで剌激した時にのみバソプレツシンに反応 して高いルシフェラ一ゼ活性 （599倍） を示した GBC7を優良株として選択した。
(5) ゥミシィ夕ケ ·ルシフェラ一ゼをレポ一夕一とするレポータープラスミ ド pACRERlucの造成
PRL-SV40 vector (プロメガ社製） を^ Iで切断し、 Klenow処理後、 さらに Eiadlllで切断し、 ゥミシィタケ 'ルシフェラーゼ遺伝子を含む fidll l- 1 (平 滑末端） 断片を取得した。 上記 （1 ) で構築した pACRElucHを lで切断後、 Klenow処理し、 さらに gindlllで切断することにより CREを含む Hfldlll-MI (平 滑末端） 断片を取得した。 pRL- SV40 vector由来の giiidl II- ¾¾1 (平滑末端） 断片、 および pACRElucH由来の aiidlll- l (平滑末端） 断片を結合することによりブラ スミド pACB lucを造成した。
(6) レポ一夕一プラスミ ド pACRERlucを KJMGER8の染色体 DMに組み込んだ安定形 質転換株の造成
上記 （3) で記載した方法に準じて、 pACRERlucを KJMGER8に導入し、 96個の安定 形質転換株 （シングルクロ一ン） を取得した。 各形質転換株は、 ブラストサイジ ン S (2.0〃g/ml)およびハイグロマイシン B (300 zg/ml) を含む RPMI 1640· ITPSG 培地で継代した。
(7) 優れた性質を有する安定形質転換株 (シングルクローン) の選択
ホ夕ル ·ルシフェラ—ゼの活性を測定する代わりにゥミシィ夕ケ ·ルシフヱラ ーゼの活性を測定する以外は、 上記 （4) に記載した方法に準じ、 上記 （6) で取 得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。
上記 （6) で取得した各クローンを 96穴プレートにまき 〜 2 x l04細胞ノ穴） 、 NECA (終濃度 100nmol/L) を添加して C02インキュベータ一中で 6時間培養した。 そ の後、 セレンテラジン h (モレキュラー ·プロ一ブズ社） （終濃度 250nmol/L) を 添加してゥミシィ夕ケ ·ルシフヱラーゼ活性を測定した。 活性測定には、 Wallac 1420 VOsx マルチラペルカウン夕 （ワラヅク 'ベルト一ルド ·ジャパン社製) を用いた。 活性の高かった 9クロ一ンを選択した。 該 9クロ一ンをそれぞれ GBCR丄〜 GBCR9と命名した。 該 9クローンについて、 NEC !]激し、 NECA刺激しない時と比較し、 ゥミシィタケ 'ルシフヱラーゼ活性が 18倍以上上昇した 2クローンを選択した。 該 2クローンを それぞれ GBCMおよび GBCR2と命名した。
該 2クローンに pAGal9- GPH12を導入し、 安定形質転換株を取得した。 該形質転換 株を 17/6 -エストラジオールで 24時間刺激後、 ゥミシィ夕ケ 'ルシフェラーゼ活性 を測定した。 比較のために、 17 ?-エストラジオール無添加条件下でのゥミシィ夕 ケ レシフェラ一ゼ活性も測定した。 17 ?-エストラジオールを添加した際のゥミ シィタケ 'ルシフェラ一ゼ活性の上昇率が高かった 1クローン （GBCR2) を優良株 として選択した。 該上昇率は 364倍であった。
GBCR2に pAGal9- V2を導入し、 安定形質転換株を取得した。 該形質転換株を、 17 5-エストラジオールで刺激し、 導入 V2遺伝子を誘導発現させた後に、 バソプレ ヅシンで刺激し、 刺激後のゥミシィタケ レシフヱラ一ゼ活性を測定した。 同時 に、 17 5 -エストラジオール刺激しない場合の活性、 およびバソプレツシン刺激し ない場合の活性を調べた。 結果を第 10図に示した。
GBCR2を宿主細胞とした場合、 17 ? -エストラジオ一ルで刺激した時にのみバソ プレヅシンに反応し、 GBCR1を用いた場合よりも、 高いゥミシィ夕ケ ·ルシフェラ ーゼ活性 （139倍） を示し、 この系において GBCR2が優れていることがわかった。
[実施例 20] 新規宿主 ·ベクタ一系の開発 （3)
(1) Go:s4の発現プラスミ ド pAMoh- Gs4の構築
実施例 6に記載の方法に準じ、 Najnalwa KJM-1由来の全 RNA(5〃g)から一本鎖 cDM を調製した。 上記一本鎖 cDNA ( IO I ) に、 G s4遺伝子特異的プライマー （各 20pmol) 、 2.5顧 1/1 dNTP混合液を 4〃 1、 DMS0を 2.5 1、 5単位/〃 1 Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造社製） を 0.25〃1、 10 x反応緩衝液 （宝酒造社製） を 5〃 1添加し、 滅菌水を加えて全量を に調製した。 配列番号 93および 94に記載し た配列を有する合成 DNAを Gas4遺伝子特異的プライマ一として用いた。 これらブラ イマ一には、 それぞれ gi旦 di llサイトおよび ^£718サイ卜が導入されている。 サー マルサイクラ一 DNA Engine (MJ Research社製） を用い、 95°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒間、 65°Cで 1分間、 72°Cで 2分間からなる反応を 30サイクルの条件で PCR を行った。 PCRにより増幅された DNA断片をァガロースゲル電気泳動法により回収した。 該 増幅断片を akdlllおよび ^E718で切断し、 Ikdlll- ^718断片を取得した。 ブラ スミド pAMohを Si dlllおよび^ 718で切断後、 gisdlll- ^718断片を取得した。 PCR断片由来の Sindl 11- 718断片、 および pAMoh由来の Si I 11- ^£718断片を結 合することにより、 Gひ s4の発現プラスミド pAMoh-Gs4を造成した。
(2) プラスミド pAMoh- Gs- qの造成
上記 （1) で構築した pAMoh- Gs4を 1と^ £718で切断することにより oriPを含 む §£718断片を取得した。 また、 pAMoh-Gs4を^ Iで切断後、 Mlで部分消 化することにより、 C末端を欠失した Gひ s4をコードする I— l断片を取得した c 配列番号 95および 96で表される塩基配列を有する合成 DNAを T4ポリヌクレオチドキ ナーゼでリン酸化後、 ァニールさせることにより、 G qの C末端 5アミノ酸をコ一 ドする領域を含む二本鎖 DNAを取得した。 該ニ本鎖 DNA、 pAMoh- Gs4由来の^ I - ^718断片およひ ^1- il断片を結合することにより、 pAMoh- Gs- qを造成した。
(3) プラスミド pAMoh-Gs- iの造成
配列番号 97および 98で表される塩基配列を有する合成 DNAを T4ポリヌクレオチド キナーゼでリン酸化後、 ァニールさせることにより、 の C末端 5アミノ酸をコ ードする領域を含む二本鎖 DNAを取得した。 該ニ本鎖 DNA、 上記 （2) で取得した pAMoh- Gs4由来の I- ^p718断片、 および pAMoh- Gs4由来の 断片を結合 することにより、 pAMoh- Gs- iを造成した。
(4) プラスミド pAMopGs- qMoGs- iの造成
pACRElucを^ Iで切断後、 Klenow処理し、 さらに^ Iで切断することにより、 oriPおよび CRE-ホタル .ルシフヱラーゼ遺伝子部分を含む^ I-^kl (平滑末端） 断片を取得した。 AMoh-6s-iを BssHI Iおよび Cpo Iで切断し、 Ga:s-iをコードする ΗΠ- 断片を取得した。 PAGE248 〔J. Biol. Chem. 269, 14730 (1994)〕 を S^Iで切断後、 Klenow処理し、 さらに ΗΠで切断し、 モロニ一'マウス白血病 ウィルスの LTRプロモーター〔以下、 Moプロモーターと略する場合がある〕 配列の 一部を含む I (平滑末端） - ΗΠ断片を取得した。 pACREluc由来の Ι_ Ι
(平滑末端） 断片、 AMoh-Gs-i由来の BssHII- Cpol断片、 pAGE248由来の I I (平 滑末端） - ΗΠ断片を結合し、 プラスミド pACRElucMoGs- iを造成した。
pAMoh- Gs- qを および^ Iで切断し、 G as-qをコードする^ HII-£^I断片 を取得した。 pAMoh- Gs-i由来の ΗΠ- £ml断片、 および上記で取得した pACREluc 由来の Ι (平滑末端） 断片、 PAGE248由来の l (平滑末端） - ΗΠ断片 を結合し、 プラスミド pACRElucMoGs- qを造成した。
pACRElucMoGs-iを、 1および HI Iで切断し Moプロモー夕一を含む Nael - S^HII断片を、 ^1および ΗΠで切断し Go !をコードする^ I- 断片を、 それそれ取得した。 pACRElucMoGs-qを、 1および^ Iで切断し CRE-ホ夕ル ·ル シフェラ一ゼ遺伝子を含む 1- £^1断片を、 M Iおよび lで切断し Gひ s-qをコ —ドする I- l断片を、 それそれ取得した。 pACRElucMoGs- i由来の 1- ΗΠ断片および^ I- l^HII断片、 ならびに pACRE lucMoGs-g由来の Nhe I - Cpo I断 片および Nhel- Nael断片の 4断片を結合し、 プラスミド pACRElucMoGs- qMoGs- iを造 成した。
pACRElucMoGs- qMoGs-iブラスミ ドを lおよび lで消化後、 Klenow処理し、 Sail (平滑末端） -Ml (平滑末端） 断片を取得した。 該断片をセルフライゲーシ ヨンすることにより、 pACRElucMoGs-qMoGs-iから CREレポ一夕一ュニヅトを除去し たプラスミド pAMohGs- qMoGs- iを造成した。
pAMohGs-qMoGs- iを で切断後、 Klenow処理し、 さらに ^で切断することに より、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を含まない^ l(平滑末端化) -Asel断片を取得 した。 pPUR (クロンテック社製； Genbank Accession番号 U07648) を BamHIで切断 後、 Klenow処理し、 さらに lで切断することにより、 ピューロマイシン耐性遺 伝子を含む ¾Π (平滑末端） - 1断片を取得した。 PPUR由来の HI (平滑末端 ) - §1断片、 および上記 pAMohGs- qMoGs- i由来の 平滑末端化）- Asel断片を結 合し、 pAMohGs- qMoGs- i中のハイグロマイシン耐性遺伝子を、 ピューロマイシン耐 性遺伝子で置き換えた pAMopGs- qMoGs- iを造成した。
(5) プラスミド pAMopGs- qMoGs- iを GBC7の染色体 DMに組み込んだ安定形質転換株 の造成
pAMopGs-qMoGs-i中の oriP内に 1個所存在する制限酵素である lで切断した pAMopGs-qMoGs-iを 1〃 g/〃 1になるように TE緩衝液に溶解した後、 エレクトロボレ ーシヨン法 Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕 により上記実施例 19の （4) で造 成した GBC7に、 6 X 106細胞あたり 4〃g導入し、 形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を、 8mlの RPMI1640 ' ITPSG培地に懸濁し、 C02インキュベーター 中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 ブラストサイジン S (2.0 g/ l) 、 ハイグ ロマイシン B (300 zg/ml) 、 およびピュ一ロマイシン （puromycin;シグマ社製）
(0.2 zg/ml) を添加し、 さらに 7日間培養した。 培養後、 該形質転換株の生細胞 数を確認し、 ブラストサイジン S (2.0 zg/ml) 、 ハイグロマイシン B (300 g/ml ) 、 ピューロマイシン （0.2〃g/ml) 、 および KJMGER8 (1 x 106細胞/ ml) を含む RPMI1640.ITPSG培地で、 該形質転換株が 150細胞/ mlになるように希釈し、 96穴プ レートに分注 （30細胞/穴） して培養を行い、 93個の安定形質転換株 （シングルク ローン） を取得した。各形質転換株は、 ブラストサイジン S (2.0 zg/ml) 、 ノヽィ グロマイシン B (m j g/ l) 、 およびピュ一ロマイシン （0.2〃g/ml) を含む RPMI1640 · ITPSG培地で継代した。
(6) 優れた性質を有する安定形質転換株 （シングルクローン） の選択
上記 （5) で取得した 93クロ一ンを 96穴プレートにまき （I〜2xl04細胞/穴） 、 LiporfectAMINE 2000 (ギブコ社製）を用いて、 pAGal9- ATI 〔下記実施例 21の （3) 参照〕 を各クローンに導入し、 形質転換細胞を取得した。 遺伝子導入の具体的方 法はリポフエクトァミン 2000の説明書に従って行い、 1穴当たりプラスミドを 0.3 jug, リポフエクトァミン 2000を 0.8 1使用した。
該形質転換細胞を 1日培養した後に、 ハイグロマイシン B (300 g/ml) 、 ブラス トサイジン S (2.0 zg/ml) 、 ビュ一ロマイシン （0.2 g/ml) 、 およびジエネテ イシン （0.5mg/ml) を添加し、 37°Cで 7日間培養した。 各穴へ 17 ?-ェストラジオ —ル （終濃度 10皿 ol/L) を添カ卩し、 さらに 1日間培養した。 各穴へアンジォテンシ ン II (ペプチド研究所社製） （終濃度 100皿 ol/L) を添加し、 6時間培養後、 実施 例 19の （4) の方法を用いてホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ活性を測定した。 同時に、 ァ ンジォテンシン II刺激しない場合の活性を調べた。 以上の結果、 アンジォテンシ ン 11に反応して高いホ夕ル 'ルシフェラーゼ活性を示した 10クローンを選択した c 該 10クローンに、 pAGal9- ATIを上記エレクト口ポレーシヨン法により、 6xl06 細胞あたり 導入し、 形質転換細胞を取得した。
該形質転換細胞を 8mlの RPMI1640'ITPSG培地に懸濁し、 02ィンキュペータ一中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 ブラストサイジン S (2.0〃g/ml) 、 ハイグロマ イシン B (300 zg/ml) ヽ ピューロマイシン （0.2〃g/ml)、 およびジエネティシン
(500 zg/ml) を添加し、 さらに 14日間培養して安定形質転換株を取得した。 該形 質転換株は、 プラストサイジン S (2.0 ig/ml) 、 ハイグロマイシン B (300 g/ml ) 、 ピューロマイシン （0.2〃g/ml)、 およびジエネティシン （500〃g/ml) を含 む RPMI 1640 · ITPSG培地で継代した。
各形質転換株に 17 ?-ェストラジオ一ル （終濃度 10nmol/L) を添加して 24時間培 養後、 アンジォテンシン II (終濃度 100nmol/L) を添加し、 さらに 6時間培養後、 上記の方法を用いてホ夕ル 'ルシフェラーゼ活性を測定した。 同時に、 17 ?-エス トラジオール剌激しな 、場合の活性、 およびアンジォテンシン II刺激しない場合 の活性を測定した。 17 ?-ェストラジオ一ルで刺激した時にのみアンジォテンシン IIに反応して高いホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ活性 （85倍） を示した GBCC13を優良株 として選択した。
(7) プラスミ ド pAMopfc- qMoGs-iを GBCR2の染色体 DNAに組み込んだ安定形質転換 株の造成
上記 (5) で記載した方法を用いて、 pAMopGs- qMoGs- iを GBCR2に導入することに より、 94個の安定形質 ¾換株 （シングルクローン） を取得した。 各形質転換株は、 プラストサイジン S (2.0 g/ml) 、 ハイグロマイシン B (300〃g/ml) 、 およびピ ュ一ロマイシン （0.2 g/ml) を含む RPMI 1640· ITPSG培地で継代した。
(8) 優れた性質を有する安定形質転換株 （シングルクローン） の選択
上記 （7) で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行 つた。 ホタル レシフェラーゼの活性を測定する代わりにゥミシィ夕ケつレシフ エラ一ゼの活性を測定する以外は、 上記 （6) に記載した方法に準じた。 ゥミシィ タケ レシフェラ一ゼの活性は、 実施例 19の （7) に記載した方法に準じて測定し た。
上記 （7) で取得した各クローンに pAGal9- ATIを導入し、 形質転換細胞を取得し た。 各形質転換細胞を 17 ?-エストラジオールで処理後、 アンジォテンシン IIで刺 激してゥミシィタケつレシフェラ一ゼ活性を測定した。 同時に、 アンジォテンシ ン II刺激しない場合の活性を測定した。 アンジォテンシン IIに反応して高いゥミ シィタケ ·ルシフユラーゼ活性を示した 13クローンを選択した。
該 13クローンに pAGal9- ATIをエレクトロポレーシヨン法により導入し、 形質転 換細胞を取得した。 各形質転換細胞を 17/5-エストラジオールで処理後、 アンジォ テンシン IIで刺激してゥミシィ夕ケ 'ルシフェラ一ゼ活性を測定した。 同時に、 4840
17 ?-ェストラジオ一ル剌激しない場合の活性、 およびアンジォテンシン Π刺激し ない場合の活性を測定した。 17 ?-エストラジオ一ルで刺激した時にのみアンジォ テンシン IIに反応して高いゥミシィ夕ケ 'ルシフェラーゼ活性 （132倍） を示した GBCRC6を優良株として選択した。
[実施例 21 ] 任意の GPCRからのシグナルを検出するためのアツセィ細胞の構築と 利用
(1) 2型バソプレツシン受容体 (V2) からのシグナルを検出するためのアツセィ 細胞の構築と利用
錶型として、 ヒト腎臓由来の mRNA (l〃g；クロンテック社製） から調製した一 本鎖 cMAを、 V2遺伝子特異的プライマーとして、 配列番号 99および 100に記載した 配列を有する合成 MAを用い、 PCRにより V2遺伝子を取得した。 V2遺伝子特異的プ ライマーには、 それそれ gisdlllサイトおよび^ £718サイ卜が導入されている。 得られた V2遺伝子増幅断片を iiindl Πおよび で切断し、 Sl^dl 11-^718断 片を取得した。 プラスミ
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gindlll - £718断片を取得した。 上記 V2遺伝子増幅断片由来の Ikdin- 断片、 およ び pAGal9- d由来の glsdlll- §E718断片を結合することにより、 V2の誘導発現ブラ スミド pAGal9- V2を造成した。
PAGal9- V2を l〃g/〃lになるように TE緩衝液に溶解した後、 エレクトロポレーシ ヨン法 Cytotec nology, 3, 133 (1990)〕 により GBCRC6に、 1.6 x l06細胞あたり 導入し、 形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を 8mlの RPMI1640 ' ITPSG培地に懸濁し、 （¾2ィンキュベー夕一中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 ハイグロマイシン B (0.3mg/ml) 、 ブラストサイ ジン S (0.2 g/ml) 、 ピューロマイシン （0.2〃g/ml) 、 およびジヱネティシン
(0.5mg/ml) を添加し、 さらに 14日間培養して安定形質転換株を取得した。 該形 質転換株は、 ハイグロマイシン B (0.3mg/ml) 、 ブラストサイジン S (0.2 g/ml ) 、 ピューロマイシン （0.2〃g/ml) 、 およびジエネティシン （0.5mg/ml) を含む RPMI1640 · ITPSG培地で継代した。
17 ?-エストラジオール （終濃度 10nmol/L) で 24時間刺激後、 各種濃度のバソプ レヅシン (Arg8-Vasopressin； Peptide Institute社製) を添加し、 6時間後にゥ ミシィタケ ·ルシフェラ一ゼ活性を測定した。 結果を第 11図に示した。 本ァヅセィ系を用いることにより、 Gasに共役する V2からのシグナルを、 高感 度、 高シグナル/ノイズ比で検出できることが明らかになった。 本アツセィ系を 用いて、 V2のァゴニストまたはアン夕ゴニストを探索することができる。
(2) 1型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-1) からのシグナルを検出 するためのアツセィ細胞の構築と利用
ヒト視床下部由来の mRNA (ljug； クロンテック社製） から調製した一本鎖 cDNA を、 CEiffi- 1遺伝子特異的プライマ一として、 配列番号 101および 102に記載した配 列を有する合成 DNAを用い、 PCRにより (Mffi- 1遺伝子を取得した。 CBIffi- 1遺伝子特 異的プライマーには、 それそれ aidinサイ トおよび lサイトが導入されている。 得られた CRHR- 1遺伝子増幅断片を sdl 11および lで切断し、 Hidi 11- 断 片を取得した。 プラスミド pAGal9- dを Sidlllおよび lで切断し、 Skdin- I 断片を取得した。
Figure imgf000152_0001
ii- I断片、 および pAGal9- d由来の Bdin- l断片を結合することにより、 CRIffi- 1の誘導発現プラ スミ ド pAGal9- CBJffilを造成した。
上記 （1) に記載の方法に準じ、 pAGal9- CRHRlを GBCRC6に導入し、 安定形質転換 株を取得した。 該形質転換株を 175-エストラジオール （終濃度 10nmol/L) で 24時 間刺激後、 各種濃度のヒトコルチコトロピン放出ホルモン （ペプチド研究所社製 ) を添加し、 6時間後にゥミシィ夕ケ 'ルシフヱラ一ゼ活性を測定した。 結果を第 12図に示した。
本ァヅセィ系を用いることにより、 Gひ sに共役する CRHR- 1からのシグナルを、 高感度、 高シグナル/ノイズ比で検出できることが明らかになった。 本アツセィ 系を用いて、 CBffiHLのァゴニストまたはアン夕ゴニストを探索することができる。
(3) 1型アンジォテンシン II受容体 （ATI) からのシグナルを検出するためのアツ セィ細胞の構築と利用
プラスミ ド pMl.8 (Nature, 351, 230 (1991)〕 を幽 dillおよび Iで切断し、 ゥシ ATI遺伝子を含む Hindi 11 -Notl断片を取得した。 pAGal9- lucを Sindl IIおよび
Meiiで切断し、 ホ夕ル .ルシフェラーゼ遺伝子を含まない din- MI断片を取 得した。 pMl.8由来の gidin- 断片、 および pAGal9- luc由来の Siiidni- I 断片を結合し、 pAGal9- ATIを造成した。 上記 （1) に記載の方法に準じ、 pAGal9- ATIを GBCRC6に導入し、 安定形質転換株 を取得した。 該形質転換株を 17 ?-エストラジオール （終濃度 lOnmol/L) で 24時間 刺激後、 各種濃度のヒト ·アンジォテンシン II (human Angiotensin II ； BACHEM 社製） を添加し、 6時間後にゥミシィ夕ケ 'ルシフェラ一ゼ活性を測定した。 結果 を第 13図に示した。
本アツセィ系を用いることにより、 Gひ qまたは G に共役する ATIからのシグナ ルを、 高感度、 高シグナル Zノイズ比で検出できることが明らかになった。 本ァ ヅセィ系を用いて、 ATIのァゴニストまたはアン夕ゴニストを探索することができ る。
(4) 1型ブラジキニン受容体 （B1) からのシグナルを検出するためのァヅセィ細 胞の構築と利用
鎵型として、 ヒト染色体 DNA (40ng；クロンテック社製） を、 B1遺伝子特異的プ ライマ一としては、 配列番号 103および 104に記載した配列を有する合成 DNAを用い、 PCI こより B1遺伝子を取得した。 B1遺伝子特異的プライマーには、 それそれ Siadlllサイトおよび §£718サイトが導入されている。
得られた B1遺伝子増幅断片を gkdlllおよび で切断し、 SlBdlll- §E718断 片を取得した。 プラスミド pAGal9-dを gi dlllおよび 4§β718Ιで切断し、 HBdlll - 断片を取得した。 上記 B1遺伝子増幅断片由来の ίϋ2(1ΙΙΙ-^Ε718断片、 およ び pAGal9-d由来の 断片を結合することにより、 B1の誘導発現ブラ スミド pAGal9-Blを造成した。
上記 （1) に記載の方法に準じ、 pAGal9- B1を GBCRC6に導入し、 安定形質転換株 を取得した。 該形質転換株を 17 ?-エストラジオール （終濃度 10nmol/L) で 24時間 刺激後、 各種濃度の Des-Arg9 -ブラジキニン （ペプチド研究所社製） を添加し、 6 時間後にゥミシィ夕ケ ·ルシフヱラーゼ活性を測定した。 結果を第 14図に示した。 本アツセィ系を用いることにより、 G aqに共役する B1からのシグナルを、 高感 度、 高シグナル/ノイズ比で検出できることが明らかになった。 本アツセィ系を 用いて、 B1のァゴニストまたはアン夕ゴニストを探索することができる。
(5) 5型ソマトス夕チン受容体 （sst5) からのシグナルを検出するためのァヅセ ィ細胞の構築と利用
上記 （1) に記載の方法に準じ、 プラスミド pAGal9- sst5 〔下記実施例 23の （2) 参照〕 を GBCHC6に導入し、 安定形質転換株を取得した。 該形質転換株を 17 ?-エス トラジオール （終濃度 10皿 ol/L) で 24時間刺激後、 各種濃度のヒト ·ソマトス夕 チン （ペプチド研究所社製） を添加し、 6時間後にゥミシィ夕ケ 'ルシフェラ一ゼ 活性を測定した。 結果を第 15図に示した。
本アツセィ系を用いることにより、 G c^に共役する sst5からのシグナルを、 高 感度、 高シグナル/ノイズ比で検出できることが明らかになった。 本アツセィ系 を用いて、 sst5のァゴニストまたはアン夕ゴニストを探索することができる。
上記方法により、 Go:s、 Gaq または G« iと共役する任意の GPCRからのシグナル を検出するための優れたアツセィ細胞を構築することができた。 該細胞を用いて、 特定の GPCRのァゴニストまたはアン夕ゴニストを探索することができる。
[実施例 22]新規宿主 ·ベクタ一系を用いた構成活性型 GPCRの同定と利用
(1) 各種 GPCRの誘導発現プラスミ ドの造成
踌型として、 各種ヒト臓器由来の m NA (クロンテック社製) から調製した一本 鎖 cMA (5 / 1) またはヒト染色体 DNA (lOOng；クロンテック社製) を、 各種 GPCR 遺伝子特異的ブライマ一として下記第 8-1表及び第 8-2表中に記載した配列番号の 配列を有する合成 DNAを用い、 PCI こより各種 GPCR遺伝子を取得した。 酵素として は、 TaKaRa ExTaq (宝酒造社製） 、 Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造社製） 、 KOD DNA Polymerase (TOYOBO社製） 、 PfuTurbo DNA Polymerase (stratagene社製 ) 、 Herculase Enhanced DNA Polymerase ( stratagene社製) ヽ または PLATINUM Pfx DNA Polymerase (ギブコ社製） を用いた。 PCRを行う際の緩衝液としては、 使 用する酵素に付加された 10倍濃度の緩衝液を使用した。 PCRは、 サ一マルサイクラ -DNA Engine (MJ Research社製） を用い、 95°Cで 5分間の処理後、 94°Cで 1分間、 ァニール温度 （55、 60 62、 または 65°C) で 1分間、 72°Cで 1分間からなる反応を 25〜35サイクル行った。
増幅された各種 GPCR遺伝子断片をそれそれのクロ一ニングに用いたプライマ一 上に設計された配列を切断する制限酵素 （たとえば a sdin- l) で切断した。 GPCR遺伝子を含む断片をァガロースゲル電気泳動法により回収した。 該切断断片 を、 プラスミド pAGal9- ndの対応する制限酵素サイト （たとえは l ndlll- 間 へ組み込むことにより、 誘導発現プラスミドを構築した。 下記実施例 23の （2) に 記載した方法に準じて、 プラスミドに組み込んだ DNA断片の配列を決定し、 目的の GPCRをコ一ドしていることを確認した。
0GR1に関しては、 PCRエラ一の結果、 221番目のセリンがァスパラギンに置換し た変異体 （0GR1S221Nと呼ぶ） も取得された。 0GR1S221Nのアミノ酸配列を配列番 号 187に示した。該変異体を発現するプラスミドを pAGal9-0GRlS221Nと呼ぶ。
(2) 構成活性型 GPCRの同定
(1) で造成した各種 GPCRの誘導発現プラスミドを用いて、 その GPCRの構成的活 性を、 下記 1〜5のいずれかの方法を用いて測定した。
下記第 8-1表および第 8-2表に、 構成活性型 GPCRであることが判明した GPCRに関 してのみ、 GPCR名、 該 GPCR遺伝子の配列情報源 （66!^&1^の (^6331011番号または 国際公開番号）、 PCR条件、 構築した GPCR誘導発現プラスミド名、 および構成活性 値を記載した。構成活性値は、 17^ -エストラジオールで刺激した際のレポ一夕一 活性の誘導倍率で表した。
〔方法 1〕
上記で構築した GPCR誘導発現プラスミドおよび pAGal9-nd (コントロールプラス ミド） を、 実施例 21の （1) に記載した方法に準じて、 それそれ GBCRC6に導入し、 安定形質転換細胞を得る。 該細胞を 96穴プレートに分注し （約 1 X 104個/穴） 、 37 °Cで 1日間培養した後、 各穴へ 17 ? -エストラジオール （終濃度 10nmol/L) を添カロ し、 さらに 1日間培養する。
培養後、 セレンテラジン h (モレキュラー 'プロ一ブズ社） （終濃度 250皿 ol/L ) を添加してゥミシィ夕ケ ·ルシフェラ一ゼ活性を測定する。 活性測定には、 Wal lac 1420 AEVOsxマルチラベルカウン夕 （ヮラック 'ベルトールド 'ジャパン 社製） または VIMカメラ （ARGUS- 50/2Dルミノメ一夕/ MP：浜松ホトニクス社製） を用いる。 また、 17 ? -ェストラジオ一ルを添加しないで同様の実験を行い、 ゥミ シィタケ 'ルシフェラーゼ活性を測定する。 17 ? -エストラジオールを添加した場 合の活性を添カ卩しない場合の活性で割った値を誘導倍率とする。
〔方法 2〕
上記で構築した GPCR誘導発現プラスミドおよび pAGal9- nd (コントロールプラス ミド） を、 実施例 21の （1) に記載した方法に準じて、 それぞれ GBCC13に導入し、 安定形質転換細胞を得る。 該細胞を 96穴プレートに分注し （約 l x lO4個/穴） 、 37 °Cで 1日間培養した後、 各穴へ 17^-エストラジオール （終濃度 10 ol/L) を添加 し、 さらに 1日間培養する。
培養後、 Steady Glo Luciferase Assay System (Promega社製） を添加して、 ホ 夕ル ·ルシフヱラ一ゼ活性を測定する。 活性測定には、 Auto Lumat LB953 (ベル ト一ルド社） またはトップカウント （Packard社） を用いる。 また、 17 ?-ェスト ラジオールを添加しないで同様の実験を行い、 ホタル ·ルシフェラーゼ活性を測 定する。 17 ?-エストラジオールを添カ卩した場合の活性を添加しない場合の活性で 割った値を誘導倍率とする。
〔方法 3〕
GBCR2を宿主として用い、 形質転換株の培養時にピューロマイシンを添加しない 以外は方法 1と同じ GPCRの構成的活性の測定法である。
〔方法 4〕
GBC7を宿主として用い、 形質転換株の培養時にピューロマイシンを添加しない 以外は方法 2と同じ GPCRの構成的活性の測定法である。
〔方法 5〕
上記で構築した誘導発現プラスミドまたは pAGal9- nd (コントロールプラスミド ) を、 実施例 19の （1) で構築したレポ一タープラスミド pACREplucと共に、 実施 例 21の （1) に記載した方法に準じて、 KJMGER8に導入し、 安定形質転換細胞を得 る。
形質転換細胞を培養する培地としては、 プラストサイジン S (0.2^g/ml) 、 ハ ィグロマイシン B (0.3mg/ml) およびジエネティシン （0.5mg/ml) を添カロした; 1640 •ITPSG培地を用いる。 培養した形質転換細胞を 96穴プレートに分注し （約 l x lO4 個/穴） 、 37°Cで 1日間培養した後、 各穴へ 17/5 -エストラジオール （終濃度 lOnmol/L) を添加し、 さらに 1日間培養する。
培養後、 ホ夕ル 'ルシフェラーゼ活性を測定する。 また、 17^-ェストラジオ一 ルを添加しないで同様の実験を行い、 ホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ活性を測定する。 17 3 -エストラジオールを添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割つた値 を誘導倍率とする。
各方法とも、 コントロールプラスミ ドを導入した細胞の誘導倍率は約 1である。 GPCR発現プラスミ ドを導入した細胞の誘導倍率が高いほど、 該 GPCRの構成的活性 は強いと判断できる。
寸
第 8-1表
GPCR ァニ-ル 錶型 発現 構成的活性
(配列情報源） 、)曰 酵素
(プライマ一） プラスミド (測定方法）
Brain corpos collosulm pAGal9- 6.5倍
60°C KOD
(配列番号 105, 106) GPR3 (方法 5)
Lung pAGal9- 40倍
60°C PfuTurbo
(配列番号 107， 108) GPR4 (方法 1)
GPR6 Brain pAGal9- 63倍
60°C ExTaq
(U18549) (配列番号 109, 110) GPR6 (方法 1)
Brain corpos collosulm pAGal9- 188倍
60。C KOD
(配列番号 111, 112) GPR12 (方法 3) human genome pAGal9- 4.8倍
65°C ExTaq
(配列番号 113, 114) GPE25 (方法 2)
GPR26 Brain pAGal9- 26倍
55°C PLATINUM Pfx
(AF208288) (配列番号 115, 116) GPR26 (方法 5)
GPR30 human genome pAGal9- 27倍
65°C Pyrobest
(AF027956) (配列番号 117， 118) GPR30 (方法 1 )
GPR35 human genome pAGal9- 25倍
60°C PfuTurbo
(NM_005301 ) (配列番号 119, 120) GPR35 (方法 1 )
GPR52 Caudate Nucleus pAGal9- 40倍
60。C PfuTurbo
(AF096784) (配列番号 121, 122) GPR52 (方法 4)
GPR61 human genome pAGal9- 12倍
65°C KOD
(AF317652) (配列番号 123, 124) GPR61 (方法 1)
GP 62 human genome pAGal9- 12倍
60°C PLATINUM Pfx
(AF317653) (配列番号 125, 126) GPR62 (方法 1 )
第 8- 2表
Figure imgf000158_0001
上記に示したように、 GPCRの構成的活性は方法 1〜5のいずれかの方法で測定可 能であり、 ここで取得された GPCRは構成活性型の GPCRであることが明白となった c 0GR1自身も構成活性型 GPCRであるが、 0GE1自身の構成的活性に比較して変異体 0GR1S221Nの構成的活性はさらに増加していた。 0GR1の 221番目のセリンは、 第 6膜 貫通領域中の高度に保存されたプロリン残基から数えて N末側に 22残基目のアミノ 酸である。 最近明らかになったロ ドプシンの結晶構造 〔Science, 289, 739 (2000)〕 に当てはめると、 この部位のアミノ酸は、 GPCR全体の高次構造、 活性化 に重要な残基であることが予想される。 0GR1以外の GPCRに関しても該アミノ酸残 基を異なるァミノ酸に置換することによつて構成活性型変異体または構成的活性 が増強した変異体を作製することができると考えられる。
上記の各形質転換細胞に 17 ? -エストラジオールを添加する前に、 任意の物質を 添加しておくことにより、 各 GPCRの構成的活性を阻害または増加させる物質 （例 えば、 インバースァゴニストまたはァゴニスト） を探索することができる。
[実施例 23]新規宿主 ·ベクター系を用いた GPCR遺伝子の発現クローニング ( 1) ヒト視床下部由来 cDNAライブラリ一の作製
ギブコ社製のキヅト （SUPERSCRIPT Choice System for cDNA Synthesis) を用 いて、 ヒト視床下部由来ポリ（A)+RNA (クロンテック社製) 5.0〃gから、 オリゴ dTを プライマ一として二本鎖 cDNAを合成した。 該ニ本鎖 cDNAの両末端にリン酸化した 組1リンカ一 （特開平 05- 336963) を付与した後、 ァガロースゲル電気泳動に供し、 1. Okb以上の DNA断片を回収した。
実施例 18の （3) で造成した pAGal9- nd (24 ig) を、 10羅 ol/L トリス- HC1
(pH7.5) 、 6漏 ol/L MgC12、 50腿 ol/L NaCl、 6醒 ol/L 2-メルカプトエタノールか らなる緩衝液 （以下、 Y- 50緩衝液と略記する） 590 1に溶解後、 80単位の
(宝酒造社製、 以下、 特に断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを用いた ) を加え、 37°Cで 16時間消化反応を行なった。 反応後、 ァガロースゲル電気泳動 法により該反応液より約 7. Okbの DNA断片を回収した。
ilリンカ一を付与した二本鎖 DNA ( 1. Okb以上） を T4リガ一ゼ緩衝液 250〃 1に 溶解後、 該溶解液に、 pAGal9- nd由来の約 7.0¾)の1)^断片2 ^、 および T4DNAリガ ーゼ 2000単位を加えて、 16°Cで； 16時間結合反応を行なった。 反応後、 該反応液に トランスファー A (tRNA) 5 gを添加し、 エタノール沈殿後、 TE緩衝液 20〃1に 溶解した。
該溶解液を用い、 エレクトロポレ一シヨン法 〔Nucleic Acids Res . , 16, 6127 ( 1988)〕 により大腸菌 MC1061 (モレキュラー 'クローニング第 3版） を形質転換し、 cDNAライブラリー （大腸菌） を構築した。 該 cDNAライプラリーよりアンピシリン 耐性を有する形質転換体 （クロ一ン） 約 3 X 107個が得られた。 該 cDNAライブラリー （大腸菌） を約 100クローンずつのプールに分けて 96穴プレ —ト （細胞培養用マルチプレート 96FII；住友べ一クライ ト社製） で培養後、 一部 を分取し、 グリセロール （最終濃度 25%) を添加して- 80°Cで凍結保存した。
残りの培養液から、 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (キアゲン社製） を用いて、 プラスミドを調製した。 該プラスミ ドは、 約0.1〃 /〃1になるょぅに1£緩衝液に 溶解した。
(2) コルチス夕チン （cortistatin) に反応する受容体をコードする cDNAの発現 クローニング
実施例 20で取得した GBCRC6に、 リボフェクトァミン 2000 (ギブコ社製）を用いて、 上記 （1) で調製した約 100クローン由来のプラスミ ドを各プールごとに該細胞に 導入した。 遺伝子導入の具体的方法はリボフェクトァミン 2000の説明書に従って 行い、 1穴あたりプラスミ ドを 0.3〃g、 リポフエクトァミン 2000を 0.8〃1使用した。
1日培養後に、 細胞を新たな 96穴プレートに 20分の 1量ずつ分注した。 ハイグロ マイシン B (0.3mg/ml) 、 プラストサイジン S ( O . j g D 、 ピュ一ロマイシン (0.2〃g/ml) 、 ジエネティシン (0.5mg/ml) を含む RPMI1640' ITPSG培地に培地を 交換し、 37°Cで 5日間培養して安定形質転換株を取得した。
各穴へ 17^-エストラジオール （終濃度 10nmol/L) を添加し、 さらに 1日間培養 した。 各穴へコルチス夕チン (ペプチド研究所社製） （終濃度 100nmol/L) を添加 し、 6時間培養後、 セレンテラジン h (モレキュラー ·プロ一ブズ社） （終濃度 250nmol/L) を添加して、 ゥミシィ夕ケ 'ルシフェラ一ゼ活性を測定した。 活性測 定には、 Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウン夕 （ヮラック 'ベルトールド · ジャパン社製） または VIMカメラ （ARGUS- 50 / 2Dルミノメ一夕/ MP：浜松ホトニ クス社製） を用いた。
高い活性を示した穴に対応するプール （100クローンの大腸菌） を、 1クローン ずつに分けて 96穴プレートで培養後、 一部を分取し、 グリセロール （最終濃度 25 ) を添加して- 80°Cで凍結保存した。 残りの培養液から、 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (キアゲン社製） を用いて、 プラスミ ドを調製した。 該プラスミ ド は、 約 0.1 1になるように TE緩衝液に溶解した。
該プラスミ ドを用いて、 上記と同様のアツセィを行うことにより、 コルチス夕 チンへの反応性を与えるプラスミドを同定した。 pAGal9- nd中の配列に特異的なプライマ一 （配列番号 149および 150に示した配列 を有する合成 MA) を用いて、 該 cDNAの 側および 3'側の配列を決定した。 決定さ れた配列に特異的な合成 DNAを調製し、 それをプライマーとして用い、 さらに先の 塩基配列を決定した。 該操作を繰り返すことにより、 該 cDNAの全塩基配列を決定 した。 塩基配列の決定には、 パーキン ·エルマ一社の DNAシークェンサ一377と反 応キヅ卜 (ABI PrisfflTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit:アプライ ド 'バイオシステムズ社） を使用した。 その結果、 該プラスミ ドが 含む cDNAは 5型ソマトス夕チン受容体 (sst5) をコ一ドしていることが判明した。 該プラスミドを pAGal9- sst5と命名した。
上記のように、 本系を用いてコルチス夕チン等任意の物質への反応性に影響を 与える遺伝子を取得できることが明らかになった。 また、 pAGal9-sst5を導入した GBCRC6とコルチス夕チンを用いて、 コルチス夕チンによる sst5の活性化を阻害す る物質を探索することができる。
(3) proadrenomedullin N-20 terminal peptide (PAMP)に反応する受容体をコー ドする cDNAの発現クロ一ニング
PAMPはァドレノメジュリンの前駆体蛋白質から切り出される 20アミノ酸からな るペプチドで、 その受容体はまだ明らかになつていない Frontiers in Neuroendocrinology, 19, 100 (1998)〕 。 そこで、 PAMP受容体遺伝子の発現クロ 一二ングを試みた。
コルチス夕チン （終濃度 100nmol/L) の代わりに、 ヒト PAMP- 12 (human PAMP [9- 20]；ぺプチド研究所社製） （終濃度 100nmol/L) を用い、 上記 （2) の方法に準じ て、 ヒト PAMP- 12への反応性に影響を与える遺伝子のスクリーニングを行った。 その結果、 PAMP- 12への反応性を与えるプラスミドを複数取得した。 これらのプ ラスミドが含む cDNAの塩基配列を決定した結果、 いずれも 1型メラノコルチン受容 体 （MC1R) をコードしていることが判明した。 該プラスミドの一つを pAGal9-MClR と命名した。 塩基配列は、 上記 （2) に記載した方法により決定した。
実施例 21の （1) に記載の方法に準じて、 pAGal9- MC1Rを GBCR2に導入し、 安定形 質転換株を取得した。 該形質転換株を 17 ?-エストラジオール （終濃度 10nmol/L) で 24時間剌激後、 各種濃度のヒト PAMP- 12またはヒト PAMP (human PAMP [1-20]；ぺ プチド研究所社製） を添加し、 6時間後にゥミシィタケ レシフェラ一ゼ活性を測 定した。 結果を第 16図に示した。
MC1Rは、 非常に低濃度のヒト PAMP- 12またはヒト PAMPに反応することが明らかに なった。 したがって、 PAMP- 12または PAMPは、 生体内において MC1Rのリガンドとし て作用していると考えられた。
本発明に基づき、 PAMP-12または PAMPが MC1Rのリガンドとして作用することを初 めて見出した。 本系は、 PAMP- 12または PAMPによる MC1R受容体の活性化を阻害する 物質 （例えばアン夕ゴニスト） の探索にも有用である。
(4) 構成活性型 GPCR (2型代謝性グルタミン酸受容体： mGlu2) 、 シグナル伝達分 子 （Gasl) 、 または転写因子 （DP2と ID4) をコードする cDNAの発現クローニング
GBCRC6を RPMI1640' ITPSG培地に懸濁後、 96穴プレ一トに分注し （約 1 X 104個/穴 )、 37°Cで 1日間培養した。 培養後、 上記 （2) に記載の方法に準じて、 上記 （1) で調製した各プール （約 100クローン） 由来のプラスミドを各プールごとに該細胞 に導入し、 安定形質転換株を取得した。
各穴へ 17 ?-エストラジオール （終濃度 10皿 ol/L) を添加し、 さらに 1日間培養 後、 セレンテラジン h (終濃度 250nmol/L) を添加してゥミシィ夕ケ ·ルシフェラ —ゼ活性を測定した。 活性測定は上記 （2) に記載の方法に準じて行った。
高い活性を示した穴に対応するプール （100クローンの大腸菌） を、 1クローン ずつに分けて 96穴プレート （細胞培養用マルチプレート 96FII、 住友べ一クライト 社） で培養後、 一部を分取し、 グリセロール （最終濃度 25%) を添加して- 80°Cで 凍結保存した。 残りの培養液から、 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (キアゲン社 製） を用いて、 プラスミ ドを調製した。 該プラスミ ドは、 約 l〃g/ z lになるよう に TE緩衝液に溶解した。
該プラスミドを用いて、 上記と同様のアツセィを行うことにより、 高い活性を 与えるプラスミド 4種を取得した。 これらプラスミドが含む cDNAの塩基配列を上記 (2) に記載した方法に準じて決定した結果、 これらプラスミドはそれそれ 2型の 代謝性グルタミン酸受容体 （mGlu2) 、 シグナル伝達分子 G«sl、 転写因子 DP2、 お よび転写因子 ID4をコードする遺伝子を含有していた。 該プラスミドをそれそれ pAGal9- mGlu2、 pAGal9- Gasl、 pAGal9- dP2、 および pAGal9- ID4と命名した。
本系を用いて、 構成活性型 GPCR (例えば mGlu2) 、 シグナル伝達分子 （例えば G ひ sl) および転写因子 （例えば DP2と ID4) を取得できることが実証された。 この結 果は、 本系を用いて、 構成活性型 GPCRの他に、 CREが関与する遺伝子の転写を直接 あるいは間接的に制御しうる分子を取得可能であることを示している。
目的に応じて他のレポ一夕一系を使用すれば、 該レポーターの活性を制御しう る様々な分子の遺伝子が取得可能なことが分かる。 例えば、 NF / Bの活性化を検出 するためのレポ一夕一系を用いることにより、 NF AT Bの活性化に関与する様々な分 子 （例えば、 受容体、 分泌蛋白質、 シグナル伝達分子、 転写因子など） の遺伝子 を本方法により取得することが可能である。
実施例 22に記載の方法に準じて、 上記で取得したペプチド （構成的活性を示す 受容体、 転写因子、 シグナル伝達分子、 酵素等） の活性を阻害または活性化する 物質を探索することができる。 即ち、 GBCRC6あるいは GBCC13に pAGal9- mGlu2を導 入した形質転換細胞に、 任意の物質を添加し、 その後に 17 ? -エストラジオールを 添加することにより、 mGlu2の構成的活性を阻害または増加させる物質 （例えば、 ィンバースァゴニストまたはァゴニスト） を探索することができる。
GBCRC6あるいは GBCC13に pAGal9- G a slを導入した形質転換細胞に、 任意の物質 を添加し、 その後に 17；5-エストラジオールを添加することにより、 Gひ slの関与す るシグナル伝達を阻害または増加させる物質を探索することができる。
GBCHC6あるいは GBCC13に pAGal9- dP2を導入した形質転換細胞に、 任意の物質を 添加し、 その後に 17 ? -エストラジオールを添加することにより、 DP2を介した CRE からの転写を阻害または増加させる物質を探索することができる。
さらに、 GBCRC6あるいは GBCC13に pAGal9- ID4を導入した形質転換細胞に、 任意 の物質を添加し、 その後に 17y5 -ェストラジオ一ルを添加することにより、 ID4を 介した CREからの転写を阻害または増加させる物質を探索することができる。
このように、 EBNA-1遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株を用いたレポ一夕 一系は、 汎用性および感度が非常に高い系であり、 発現クローニングゃ物質のス クリーニング等に、 非常に有用な系である。
[実施例 24]新規宿主 ·ベクタ一系を用いた構成活性型の変異 GPCRの造成 実施例 23に記載した発現クロ一ニングにおいて、 cDNAライブラリーの代わりに、 変異 GPCRのライブラリ一を使用することにより、 構成活性型の変異 GPCRを効率よ く造成することができる。 また、 特定の変異 GI>CI こついて、 実施例 22に記載の方 法に準じて一つずつ評価することにより、 構成活性型の変異 GPCRを造成すること もできる.。
(1) PGM0334の誘導発現プラスミド pAGal9- PGM0334の造成
構成活性型でない GPCRである PGM0334の発現プラスミ ド pAMo- PGM0334 (特閧 2001-211885) を gindlllおよび lで切断後、 PGM0334 cDNAを含む Hndlll- l 断片を取得した。 pAGal9-ndを hindlllおよび lで切断後、 約 1.4kbの liadlll - l断片を取得した。 pAMo- PGM0334由来の Siidlll- I断片、 および pAGal9- nd由 来の din- I断片を結合することにより、 PGM0334の誘導発現プラスミ ド pAGal9-PGM0334を造成した。
(2) 変異 GPCRラィブラリ一の造成
PGM0334ポリぺプチドの第 3膜貫通領域の後半から第 2細胞内領域の前半部分、 あ るいは第 3細胞内領域の後半から第 6膜貫通領域の前半部分に、 ランダム変異を導 入した多数の変異体を、 PCRを利用して以下のように造成した。
PGM0334ポリべプチドの第 3膜貫通領域の後半から第 2細胞内領域の前半部分 （ PGM0334ポリぺプチドの 132番目のアミノ酸から 141番目のアミノ酸） にランダムに 変異を導入するために、 配列番号 151〜160に記載の塩基配列を有する合成 DNAを作 製した。
PGM0334ポリぺプチドの第 3細胞内領域の後半から第 6膜貫通領域の前半部分 （ PGM0334ポリぺプチドの 256番目のアミノ酸から 265番目のアミノ酸） にランダムに 変異を導入するために、 配列番号 161〜170に記載の塩基配列を有する合成 DNAを作 製した。
pAGal9- PGM0334中の PGM0334 cDNAの 5'側および 3，側のベクター部分に対応する プライマ一として、 配列番号 171および 172に記載の塩基配列を有する合成 DNAを作 製した。
pAGal9-PGM0334 (lng) 、 配列番号 151〜160に記載の塩基配列を有する合成 DNA のいずれか一つ （20pmol ) 、 配列番号 172に記載の塩基配列を有する合成 DNA ( 20pmol) 、 ^画^ の ？混合液を丄 DMS0を l z l、 5単位/〃1の Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造社製） を 0. 1〃1、 10 x反応緩衝液を 2〃 1添加し、 滅菌水 を加えて全量を 20 1に調製した。 該調製液を用い下記条件で PCRを行った。 即ち、 サーマルサイクラ一 DNA Engine (MJ Research社製） を用い、 95°Cで 5分間処理後、 94°Cで 1分間、 50°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間からなる反応を 25サイクル行った。 該反応液より、 ァガ口一スゲル電気泳動法により増幅 DNA断片 （変異 DNA1) を回 収した。 該 DNA断片はそれぞれ PGM0334ポリぺプチドの 132〜141番目のアミノ酸の いずれか 1つにランダム変異が導入されたポリぺプチド （C末端側のポリぺプチド ) をコードする DNAである。
同様にして、 pAGal9- PGM0334を錄型、 配列番号 161〜170に記載の塩基配列を有 する合成 DNAのいずれか一つ、 および配列番号 171に記載の塩基配列を有する合成 MAをプライマ一として PCRを行うことにより、 PGM0334ポリべプチドの 256番目の アミノ酸から 265番目のアミノ酸のいずれか 1つにランダム変異が導入されたポリ ペプチド （N末端側のポリペプチド） をコードする DNA (変異 DNA2) を取得した。 取得した変異 DNA1の 25分の 1量および変異 DNA2の 25分の 1量、 2.5塑01/1の<11^)混 合液を 1.6〃 1、 DMS0を 1〃1、 5単位/ 1の Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造社製 ) を 0. 1〃1、 10 X反応緩衝液を 2〃 1添加し、 滅菌水を加えて全量を 20〃1に調製し た。 該調製液を用い、 下記条件で PCRを行った。 即ち、 サ一マルサイクラ一 DNA Engine (MJ Research社製） を用い、 98°Cで 5分間処理後、 98°Cで 15秒間、 50°Cで 20秒間、 72°Cで 30¾>間からなる反応を 6サイクル行った。
該反応液に、 配列番号 171に記載の塩基配列を有する合成 DNA (20pmol) 、 およ び配列番号 172に記載の塩基配列を有する合成 MA (20pmol) を加えた後、 サ一マ ルサイクラ一 DNA Engine (MJ Research社製） を用い、 95°Cで 2分間処理後、 95°C で 15秒間、 60°Cで 20秒間、 72°Cで 1分間からなる反応を 23サイクル行った。
該反応液より、 ァガロースゲル電気泳動法により増幅 DNA断片 （変異 DNA3) を回 収した。 変異 DNA3を lifidinおよび lで切断後、 プラスミ ド pAGal9-ndの iiadlll- l間へ組み込こむことにより、 PGM0334の変異体を誘導発現することの できる PGM0334変異体ライブラリ一を造成した。 ライブラリ一の造成は、 実施例 22 の （1) に記載した方法に準じて行った。 即ち、 大腸菌 MC1061 (モレキュラー .ク ローニング第 3版） を宿主として、 約 1 X 104値のアンビシリン耐性を有する形質転 換体を取得し、 PGM0334変異体ライプラリー （大腸菌） を構築した。
該 PGM0334変異体ライブラリー （大腸菌） を 10クローンずつのプールに分けて 96 穴プレート （細胞培養用マルチプレート 96FI I；住友べ一クライ ト社製） で培養後、 一部を分取し、 グリセロール （最終濃度 25%) を添加して- 80°Cで凍結保存した。 残りの培養液から、 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (Qiagen社製） を用いて、 プ ラスミ ドを調製した。 該プラスミ ドは、 約 0.1〃g/ zlになるように TE緩衝液に溶 解した。
(3) 構成活性型の変異 GPCRの取得
実施例 23の （2) に記載の方法にしたがって、 上記 （2) で調製した変異 GPCRラ イブラリーの 10クローン由来のプラスミドをそれそれ GBCRC6に導入し、 安定形質 転換株を取得した。 各穴へ 17 ?-エストラジオール （終濃度 10nmol/L) を添加し、 さらに 1日間培養後、 セレンテラジン h (終濃度 250imol/L) を添加してゥミシィ タケ レシフヱラ一ゼ活性を測定した。 活性測定ほ実施例 23の （2) に記載の方法 を用いた。
高い活性を示した穴に対応するプール （10クローンの大腸菌） を、 1クローンず つに分けて 96穴プレート （細胞培養用マルチプレート 96FII、 住友ベークライト社 ) で培養後、 一部を分取し、 グリセロール （最終濃度 25%) を添加して- 80°Cで凍 結保存した。 残りの培養液から、 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (キアゲン社製 ) を用いて、 プラスミドを調製した。 該プラスミ ドは、 約 になるよう に TE緩衝液に溶解した。
該プラスミドを用いて、 上記と同様のアツセィを行うことにより、 高い活性を 与えるプラスミドを同定した。 同定後、 該プラスミドが含む cDNAの塩基配列を実 施例 23の （2) に記載した方法に準じて決定した。
上記のスクリーニングの結果、 以下の 4種の構成活性型の変異体を取得した。
(i) PGM0334ポリぺプチドの 135番目のグルタミン酸をフエ二ルァラニンに置換 した変異体 （PGM0334E135Fと呼ぶ） ：実施例 22の （2) に記載の方法 （GBCRC6を宿 主として利用） で評価した結果、 約 3倍の誘導倍率を示し、 構成活性型 GPCRである ことが確認された。 アミノ酸配列を配列番号 193に示した。
(ii) PGM0334ポリぺプチドの 135番目のグル夕ミン酸をグル夕ミンに置換した 変異体 （PGM0334E135Qと呼ぶ） ：同様に評価した結果、 約 3倍の誘導倍率を示し、 構成活性型 GPCRであることが確認された。 ァミノ酸配列を配列番号 194に示した。
(iii) PGM0334ポリペプチドの 135番目のグルタミン酸をァラニンに置換した変 異体 （PGM0334E135Aと呼ぶ） ：同様に評価した結果、 約 14倍の誘導倍率を示し、 構成活性型 GPCRであることが確認された。 ァミノ酸配列を配列番号 195に示した。 ( iv) PGM0334ポリべプチドの 259番目のァスパラギン酸をセリンに置換した変 異体 （PGM0334D259Sと呼ぶ） ：同様に評価した結果、 約 5倍の誘導倍率を示し、 構 成活性型 GPCRであることが確認された。 ァミノ酸配列を配列番号 196に示した。 PGM0334の 259番目のァスパラギン酸は、 第 6膜貫通領域中の高度に保存されたプロ リン残基から数えて N末側に 20残基目のアミノ酸であり、 多くの GPCI こおいてグル 夕ミン酸もしくはァスパラギン酸が保存されている。 最近明らかになった口ドプ シンの結晶構造〔Science, 289. 739 (2000)〕 に当てはめると、 この部位のアミ ノ酸は、 下記 （4) に述べる D/ERYモチーフ内のァスパラギン酸もしくはグルタミ ン酸残基と立体構造上側鎖が向かい合うことになり、 GPCR全体の高次構造、 活性 化に重要な残基であることが予想される。 PGM0334以外の GPCRに関しても該ァミノ 酸残基を異なるァミノ酸に置換することによつて構成活性型変異体を作製するこ とができると考えられる。
また、 使用した転写因子応答配列 （例えば、 CREや NF B応答配列） からの転写 を直接または間接的に増加させる活性を有する分子 （例えば、 転写因子、 シグナ ル伝達分子、 または酵素等） に関しても、 上記と同様にしてランダム変異を導入 することにより、 構成活性型の変異体を取得することができる。
また、 上記分子にランダム変異を入れることによって、 構成的活性を示さなく なつた変異体やドミナントネガティブ変異体を取得することもできる。
(4) 他の構成活性型変異体の造成
GPCRの第 3膜貫通領域細胞内側には高度に保存された D/ERYモチーフが存在する。 該モチーフ内のァスパラギン酸もしくはグル夕ミン酸残基は、 他の膜貫通領域と の相互作用に重要な働きをになっていることが示唆されている 〔Science, 289, 739 (2000 ) ; EMBO J. , 12, 1693 ( 1993)〕 。 また、 ある GPCR (たとえば V2バソプ レヅシン受容体） においては該ァスパラギン酸もしくはグル夕ミン酸残基を別の ァミノ酸に置換することにより構成活性型変異体を作製できることが知られてい る 〔FEBS letter, 441, 470 ( 1998)〕 。 そこで、 多種のォ一ファン GPCRに関して、 以下のようにして該ァスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基をァラニンに変換 した変異体をコードする DNAの造成を行い、 該変異体の構成的活性を評価した。
GPCR遺伝子への目的とする変異導入は、 変異導入キッ ト QuikChange Site- Directed Mutagenesis Kit (ストラ夕ジーン社製） を用い、 該キットのプロトコ ールに準じて以下のようにして行った。
第 9表に示したォ一ファン GPCRの変異体の造成においては、 目的の変異を含み変 異導入部位周辺と同じ配列を持つ、 第 9表に示した、 35塩基程度の相補的な 2本の プライマ一を合成した。 該プライマ一を用いて GPCR発現プラスミ ドを鎢型とし、 PCRを行った。 該反応液に 2迎1 (メチル化 DNAを選択的に切断する制限酵素） を添 加し、 錶型プラスミ ドを選択的に切断した。 このようにして得られた DNA断片は、 目的の変異が導入された遺伝子とベクタ一部分を含んでいる。 取得された該 DNA断 片を大腸菌にトランスフォームすることにより、 目的の変異が導入された遺伝子 を含むプラスミドが得られた。
取得されたプラスミ ドに含まれる遺伝子がコ一ドする変異体 GPCRの構成的活性 は、 実施例 22の （2) に記載の方法 1を用いて測定した。
その結果、 構成的活性が増強したことが判明したォーファン GPCRの変異体を第 9 表に示した。
Figure imgf000168_0001
ポリぺプチドの N末端からの位置を表す。
Asp→-Al ァスパラギン酸がァラ二ンに置換されたことを表す 表 8-1表または第 8- 2表に示したように、 0GR1S221N、 RE2、 GPR35および GPCR25は もともと構成活性型 GPCRであるが、 上記の変異を導入することにより、 構成的活 性がさらに上昇することが明らかになった。 一方、 必ずしもこの変異により構成 活性型変異体が造成できる訳ではないことも明らかになった。 0GR1S221N/D118A、 RE2D124As GPIi35D113Aおよび GPCR25D 1Aのアミノ酸配列をそれそれ配列番号 189、 190、 191および 192にそれそれ示した。 また、 0GB1S221N/D118Aと同様に、 0GMの 118番目のァスパラギン酸をァラニンに置換した変異体 0GR1D 118A (ァミノ酸配列 を配列番号 188に示した） も同様に構成活性を示すと考えられる。
[実施例 25] 新規宿主■ベクター系を用いたォ一ファン GPCRのリガンドまたはァ ゴニス卜の探索
(1) GPM3の誘導発現プラスミ ド pAGal9-GPR43の造成
実施例 20の （1) に記載した方法に準じて、 PCRにより GPR43遺伝子を取得し、 該 遺伝子を発現ベクター pAGal9- dに組み込むことにより、 GPR43の誘導発現プラスミ ド pAGal9- GPR43を造成した。 鎵型としては、 ヒト染色体 DNA (lOOng ;クロンテツ ク社製） を用いた。 GPR43遺伝子特異的プライマ一としては、 配列番号 181および 182に記載した配列を有する合成 DNAを使用した。 上記プライマーには、 それぞれ Slsdinサイトおよび I Iサイトが導入されている。
PCR増幅断片を aisdinおよび Iで切断後、
Figure imgf000169_0001
プ ラスミド pAGal9- dを Hl dlllおよび lで切断後、 Sl dlll- l断片を取得した。 PCR断片由来の ai dlll-ii2 l断片、 および pAGal9- d由来の li dlll- ί Ι断片を結合 することにより、 GPR43の誘導発現プラスミド pAGal9-GPR43を造成した。
(2) GPM3のリガンドまたはァゴニストの探索
実施例 21の （1) に記載した方法に準じて、 pAGal9- GPR43を GBCRC6に導入し、 安 定形質転換株を取得した。 該形質転換株を 17 ? -エストラジオール （終濃度 10nmol/L) で 24時間刺激後、 100nmol/Lから 100 mol/Lの各種物質を添加し、 6時 間後にゥミシィタケ ·ルシフヱラーゼ活性を測定した。
その結果、 100 ^mol/Lの酢酸 （C¾C00H) 、 プロピオン酸 （C¾C¾C00H) 、 およ び酢酸塩 （CH3C00Na) が、 GPR43のァゴニストとして作用することが判明した （レ ポ—夕—の誘導倍率はそれぞれ 4倍、 5倍、 9倍） 。 したがって、 酢酸、 プロピオン 酸、 酢酸塩、 またほプロピオン酸塩をァゴニストとして用いて、 GPR43のアン夕ゴ 二ストの探索を行うことができる。 酢酸および酢酸塩は、 他の GPCRを導入したァ ッセィ細胞には作用しなかったことから、 GPR43特異的なァゴニスト活性を有する ことが判明した。 下記 （4) に示すように、 プロピオン酸は GPR41に対してもァゴ 二スト活性を示した
(3) GPM1の誘導発現プラスミ ド pAGal9-GPMlの造成 実施例 20の （1) に記載した方法に準じて、 PCRにより GPR41遺伝子を取得し、 該 遺伝子を発現べクタ一 pAGal9- dに組み込むことにより、 GPR41の誘導発現プラスミ ド pAGal9- GPM1を造成した。 錶型としては、 ヒト染色体 DNA (lOOng；クロンテツ ク社製） を用いた。 GPR41遺伝子特異的プライマーとしては、 配列番号 183および 184に記載した配列を有する合成 DNAを使用した。 上記プライマーには、 それぞれ gildlllサイトおよび lサイトが導入されている。
PCR増幅断片を giBdlllおよび Mlで切断後、 Skdlll- l断片を取得した。 プ ラスミド pAGal9-dを幽 dillおよび lで切断後、 ilfidin- l断片を取得した。
PCR断片由来の giBdlll- l断片、 および pAGal9- d由来の Si din- I断片を結合 することにより、 の誘導発現プラスミド pAGal9- GP 1を造成した。
(4) GPM1のリガンドまたはァゴニス卜の探索
実施例 21の （1) に記載した方法に準じて、 pAGal9- を GBCRC6に導入し、 安 定形質転換株を取得した。 該形質転換株を 17 ? -エストラジオール （終濃度 lOnmol/L) で 24時間刺激後、 100nmol/Lから 1000皿 ol/Lの各種物質を添加し、 6時 間後にゥミシィ夕ケ ·ルシフェラ一ゼ活性を測定した。
その結果、 100〃mol/Lのプロピオン酸 （C¾C¾C00H) およびシクロプロパンカル ボン酸が、 GPM1のァゴニストとして作用することが判明した （レポ一夕一の誘導 倍率はそれそれ 21倍と 22倍） 。 したがって、 プロピオン酸またはシクロプロパン カルボン酸をァゴニストとして用いて、 GPM1のアン夕ゴニストの探索を行うこと ができる。 シクロプロパンカルボン酸は他の GPCRを導入したァヅセィ細胞には作 用しなかったことから、 GPR41特異的なァゴニスト活性を有することが判明した。 GPH43に対してァゴニスト活性を示した酢酸や酢酸塩は GP 1に対してはァゴニス ト活性を示さなかった。
(5) G10dの誘導発現プラスミ ド pAGal9- GlOdの造成
実施例 20の （1) に記載した方法に準じて、 PCRにより G10d遺伝子を取得し、 該 遺伝子を発現べクタ一 pAGal9-dに組み込むことにより、 G10dの誘導発現プラスミ ド pAGal9- Odを造成した。 铸型としては、 ヒト脾臓由来一本鎖 DNAを用いた。 G10d遺伝子特異的ブライマ一としては、 配列番号 185および 186に記載した配列を 有する合成 DNAを使用した。 上記プライマーには、 それそれ Ikdlllサイトおよび Mlサイトが導入されている。 PCR増幅断片を liBdinおよび Iで切断後、 ndin- MI断片を取得した。 プ ラスミ ド pAGal9-dを aindlllおよび lで切断後、 ΙΠ- Ml断片を取得した。
PCR断片由来の iiifldlll-MI断片、 および pAGal9- d由来の ii dlll- I断片を結合 することにより、 GlOdの誘導発現プラスミド pAGal9- GlOdを造成した。
(6) GlOdのリガンドまたはァゴニストの探索
実施例 21の （1) に記載した方法に準じて、 pAGal9-G10dを GBCRC6に導入し、 安 定形質転換株を取得した。 該形質転換株を 17 ? -エストラジオール （終濃度 lOnmol/L) で 24時間刺激後、 100nmol/Lまたは 1000nmol/Lの各種物質を添加し、 6 時間後にゥミシィ夕ケ ·ルシフェラーゼ活性を測定した。 その結果、 100nmol/Lの -メラノサイト刺激ホルモン （ひ- MSH) および 100nmol/Lの副腎皮質剌激ホルモ ン （ACTH) が GlOdのァゴニストとして作用することが判明した （レポ一夕一の誘 導倍率はそれそれ 10倍と 11倍） 。 ひ- MSHまたは ACTHはコントロールベクタ一 （ pAGal9-d) を導入した GBCRC6には作用しなかった。 - MSHまたは ACTHをァゴニス トとして用いて、 Odのアン夕ゴニストの探索を行うことができる。
[実施例 26] GPM3の構成活性型変異体の造成
実施例 24に記載した方法と同様にして、 GPR43の構成活性型変異体を造成した。
(1) GPR43変異体ライブラリーの造成
実施例 24 (2) に記載した方法と同様にして、 GPR43ポリペプチドの第 3S莫貫通領 域の後半から第 2細胞内領域の前半部分 （GPR43ポリべプチドの 103番目のアミノ酸 から 112番目のアミノ酸） 、 あるいは第 3細胞内領域の後半から第 6膜貫通領域の前 半部分 （GPR43ポリペプチドの 213番目のアミノ酸から 222番目のアミノ酸） に、 ラ ンダム変異を導入した GRP43変異体ライブラリーを、 造成した。 ランダム変異を導 入するための PCRの鍩型としては、 実施例 25の （1) で造成した、 GP 3の誘導発現 プラスミド pAGal 9-GPR43を用いた。
(2) 構成活性型の GPR43変異体の取得
実施例 24 (3) に記載した方法と同様にして、 上記 (1) で造成した GPM3変異体 ライプラリーを用いて、 構成活性型の GPR43変異体を選択した。 その結果、 GPR43 ポリべプチドの 217番目のアルギニンをプロリンに置換した変異体 （GPR43R217Pと 呼ぶ） は、 実施例 22の （2) に記載の方法 （GBCRC6を宿主として利用） で評価した 結果、 約 2倍の誘導倍率を示し、 構成活性型 GPCRであることが確認された。 GPR43R217Pのァミノ酸配列を配列番号 197に示した。
(3) GPR43H217Pポリぺプチドにさらに変異を導入した変異体の造成
実施例 24 (2) に記載したランダム変異の導入方法と同様にして、 GPR43R217Pポ リベプチドの D/ERYモチーフ中にある 106番目のグル夕ミン酸残基を他のアミノ酸 に置換した変異体をコードする DNAを造成した。 変異導入用の錶型としては、 上記
(2) で取得した、 GP 3R217Pの誘導発現プラスミド pAGal9- GPR43R217Pを用いた。 上記で造成した DNAがコードする変異体の構成活性を、 実施例 22の （2) に記載 の方法 （GBCRC6を宿主として利用） で評価することにより、 構成活性がさらに上 昇した変異体を選択した。 その結果、 GPM3R217Pポリペプチドの 106番目のグル夕 ミン酸をァスパラギン酸に置換した変異体 （GPR43R217PE106Dと呼ぶ） は、 約 17倍 の誘導倍率を示し、 GPR43R217Pポリべプチドに比較してさらに構成活性が増加し ていることが明らかになった。 GPE43E217PE106Dのアミノ酸配列を配列番号 198に 示した。
GP 3R217PE106Dをコ一ドする DNAは、 GPM3の誘導発現プラスミド pAGal9-GPR43 を錶型として、 変異導入キット QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (ス トラ夕ジーン社製） を用いて造成することもできる。 産業上の利用の可能性
本発明により、 哺乳動物の内分泌細胞由来の多様な細胞株、 該細胞株を宿主と して用いた、 活性べプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系および活性ぺプチ ドの生産法、 該細胞株を用いた、 該細胞に作用する物質の探索法や評価法、 該細 胞株を用いた有用遺伝子、 有用ペプチドの探索法および取得法、 上記の発現クロ —二ング系で使用する高感度で簡便な GPCRリガンドのァヅセィ系が提供される。 配列表フリ一テキスト
配列番号 発明者：佐々木克敏；三浦和美； 伯智
発明者：吉澤美佐子；岸本和也
発明者：國友博文；西達也；帯刀益夫
配列番号ト合成 MA 配列番号 2-合成 DNA 配列番号 3-合成 DNA 配列番号 4 -合成赚 配列番号 5-合成 DNA 配列番号 6-合成 MA 配列番号 7-合成 MA 配列番号 8-合成 DNA 配列番号 9-合成 DNA 配列番号 10-合成 DNA 配列番号 U-合成 DNA 配列番号 12 -合成 DNA 配列番号 13-合成 DNA 配列番号 14-合成舰 配列番号 15-合成 DNA 配列番号 16-合成 DNA 配列番号 17-合成赚 配列番号 18-合成 DNA 配列番号 19-合成 DNA 配列番号 20 -合成赚 配列番号 21-合成 MA 配列番号 22-合成 DNA ' 配列番号 23-合成 DNA 配列番号 24-合成 DNA 配列番号 25 -合成賺 配列番号 26-合成 DNA 配列番号 28-合成 DNA 配列番号 29-合成 DNA 配列番号 30-合成 DNA 配列番号 31-合成 DNA 配列番号 32-合成 DM 配列番号 -合成 DNA 配列番号 34-合成 DNA 配列番号 35-合成脆 配列番号 36-合成 DNA 配列番号 37-合成 DNA 配列番号 38-合成 DNA 配列番号 39-合成 DM 配列番号 40-合成 DNA 配列番号 41-合成 DNA 配列番号 42-合成 MA 配列番号 43-合成賺 配列番号 44-合成 DM 配列番号 45-合成 DNA 配列番号 46-合成 MA 配列番号 47-合成 DNA 配列番号 48-合成 DNA 配列番号 49-合成 DNA 配列番号 50-合成 DNA 配列番号 51-合成醒 配列番号 52-合成 DNA 配列番号 53-合成舰 配列番号 54-合成 MA 配列番号 55-合成 DNA 配列番号 56-合成 DNA 配列番号 57-合成 DNA 配列番号 58-合成 DNA 配列番号 59-合成 DNA 配列番号 60-合成 DNA 配列番号 61-合成 DNA 配列番号 62-合成 DM 配列番号 63-合成 MA 配列番号 64-合成 DM 配列番号 65-合成 DNA 配列番号 66 -合成 DNA 配列番号 67-合成 DNA 配列番号 68-合成 DNA 配列番号 69-合成 MA 配列番号 70-合成 DNA 配列番号 7卜合成 DNA 配列番号 72-合成 DNA 配列番号 73-合成 DNA 配列番号 74-合成 DNA 配列番号 75 -合成赚 配列番号 76-合成 DNA 配列番号 77-合成 DNA 配列番号 78-合成 DNA 配列番号 79-合成 DNA 配列番号 80-合成 DNA 配列番号 81-合成 DNA 配列番号 82-合成 DNA 配列番号 83-合成 A 配列番号 84-合成 DNA 配列番号 85-合成 MA 配列番号 86-合成 DNA 配列番号 87-合成 DNA 配列番号 88-合成 DNA 配列番号 89-合成 DNA 配列番号 90-合成 MA 配列番号 91-合成 DNA 配列番号 92-合成 DNA 配列番号 93- -合成 DNA 配列番号 94· -合成赚 配列番号 95· -合成 DNA 配列番号 96- -合成 DNA 配列番号 97· -合成匪 配列番号 98· -合成赚 配列番号 99· -合成賺 配列番号 100-合成 DNA 配列番号 10卜合成 DNA 配列番号 102 -合成 DM 配列番号 103-合成腿 配列番号 104-合成 DNA 配列番号 105-合成脆 配列番号 106-合成 MA 配列番号 107-合成 MA 配列番号 108-合成赚 配列番号 109-合成赚 配列番号 110-合成赚 配列番号 111 -合成靈 配列番号 112-合成 MA 配列番号 113-合成赚 配列番号 114 -合成靈 配列番号 115 -合成匪 配列番号 116-合成碰 配列番号 117-合成 DNA 配列番号 118-合成靈 配列番号 119 -合成 DM 配列番号 120 -合成腿 配列番号 m-合成 DNA 配列番号 122-合成 DNA 配列番号 123-合成 DNA 配列番号 124-合成 DNA
配列番号 125-合成 DNA
配列番号 126-合成 DNA
配列番号 127-合成 DM
配列番号 128-合成 MA
配列番号 129-合成 DNA
配列番号 130-合成 DNA
配列番号; 13ト合成 DNA
配列番号 132-合成 DNA
配列番号 133-合成 MA
配列番号 134-合成 DNA
配列番号 135-合成 DNA
配列番号 136-合成 DNA
配列番号; 137-合成 DNA
配列番号 138-合成 MA
配列番号 139-合成 DNA
配列番号 140-合成 MA
配列番号 141-合成 DNA
配列番号 142-合成
配列番号 133-合成 MA
配列番号 144-合成 DNA
配列番号 145-合成 DNA
配列番号 146 -合成赚
配列番号 147-合成 DNA
配列番号 148-合成 DM
配列番号 149-合成 DNA
配列番号 150-合成 DNA
配列番号 15ト合成赚
配列番号 151-nは a、 g、 cまたは t 配列番号 152-合成 MA 配列番号 152- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 153-合成 MA
配列番号 153- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 154-合成 DNA
配列番号 154- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 155-合成 MA
配列番号 155- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 156-合成 DNA
配列番号 156-nは a、 g、 cまたは t 配列番号 157-合成 MA
配列番号 157- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 158-合成 DNA
配列番号 158- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 159-合成 MA
配列番号 159-nは a、 g、 cまたは t 配列番号 160-合成 MA
配列番号 160-nは a、 g、 cまたは t 配列番号 161-合成 DNA
配列番号 161-11は a、 g、 cまたは t 配列番号 162-合成 MA
配列番号 162-nは a、 g、 cまたは t 配列番号 163-合成 DNA
配列番号 163-nは a、 g、 cまたは t 配列番号 164-合成 DNA
配列番号 164- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 165-合成 DNA
配列番号 165- IIは a、 s cまたは t 配列番号 166-合成 DNA
配列番号 166- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 167-合成 DNA 配列番号 167- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 168-合成 DNA
配列番号 168-nは a、 g、 cまたは t 配列番号 169-合成 DNA
配列番号 169- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 170-合成 DNA
配列番号 170- nは a、 g、 cまたは t 配列番号 17卜合成 MA
配列番号 172-合成 DNA
配列番号 173 -合成 DNA
配列番号 174-合成 DNA
配列番号 175-合成 DNA
配列番号 176 -合成賺
配列番号 177-合成 DNA
配列番号 178-合成 DNA
配列番号 179-合成赚 ' 配列番号 180-合成 DNA
配列番号 18ト合成 DNA
配列番号 182-合成 DNA
配列番号 183-合成 DNA
配列番号 184-合成腿
配列番号 185-合成 DNA
配列番号 186-合成醒
配列番号 187-0GIilS221N 配列番号 188- 0GR1D118A 配列番号 189- 0Gi S221N/M18A 配列番号 190- RE2D124A 配列番号 191-GPR35D113A 配列番号 192- GPCR25D111A 配列番号 193-PGM0334E135F 配列番号 194- PGM0334E135Q 配列番号 195- PGM0334E135A 配列番号 196- PGM0334D259S 配列番号 197- 配列番号 198-GPH43R217PE106D

Claims

請求の範囲
1. 下記 （1) 〜 （5) の工程を有する、 目的とする受容体のァゴニスト、 アン 夕ゴニストまたはィンバ一スァゴニストとして作用するぺプチドをコ一ドする DNA の取得方法。
( 1) 任意の cDNAまたは染色体由来の MAを内分泌細胞由来の細胞株に導入して形 質転換株を取得する
(2) 上記 （1) の形質転換株を培養し、 導入した DNAを発現させた後、 該形質転換 株の培養上清、 細胞抽出液、 膜画分、 または該形質転換株自身を、 目的とする受 容体を発現する細胞と接触させる
(3) 該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
(4) 該形質転換株の培養上清、 細胞抽出液、 膜画分、 または該形質転換株自身が 目的の活性を示した形質転換株を選択する
(5) 上記 （4) の形質転換株に導入した DNAを、 形質転換株に目的の活性を与える DNAとして同定する
2. 下記 （1) 〜 （7) の工程を有する、 目的とする受容体のァゴニスト、 アン 夕ゴニストまたはインバースァゴニストとして作用するペプチドをコードする DNA の取得方法。
( 1 ) 発現べクタ一を用 、て作製した cDNAラィブラリ一を：!〜 10000のクロ一ンずつ のプールに分ける
(2) 各プールに由来する cDNAクローンの混合物を内分泌細胞由来の細胞株に導入 して形質転換株を取得する
(3) 上記 （2) の形質転換株を各プールごとに培養して、 導入した cDNAを発現さ せた後、 該形質転換株の培養上清、 細胞抽出液、 膜画分、 または該形質転換株自 身を、 プールごとに目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
(4) 該受容体に基づく細胞の応答反応をプールごとに検出する
(5) 該形質転換株の培養上清、 細胞抽出液、 膜画分、 または該形質転換株自身が 目的の活性を示したプールを選択し、 選択したプ一ルを （1) よりも細かいプール に分ける
(6) (2) 〜 （5) の操作をプールが 1クローンごとになるまで繰り返す (7) 形質転換株に目的の活性を与える cDNAを同定する
3. 任意の cDNAまたは染色体由来の遺伝子が、 活性ペプチド前駆体をコードす る遺伝子である、 請求項 1または 2に記載の DNAの取得方法。
4. 受容体が G蛋白質共役型受容体である、 請求項ほたは 2に記載の DNAの取得 方 。
5. G蛋白質共役型受容体がォーファン G蛋白質共役型受容体である、 請求項 4に 記載の DNAの取得方法。
6. 内分泌細胞由来の細胞株が、 SV40のラージ T抗原遺伝子を発現する内分泌細 胞由来の細胞株である、 請求項 1または 2に記載の DNAの取得方法。
7. 内分泌細胞由来の細胞株が、 SV40の温度感受性変異株のラージ T抗原遺伝子 を発現する内分泌細胞由来の細胞株である、 請求項 1または 2に記載の DNAの取得方 法。
8. 内分泌細胞由来の細胞株が、 非ヒト · トランスジエニック動物細胞由来の 細胞株である、 請求項 1、 2、 6または 7に記載の DNAの取得方法。
9. 非ヒ卜 - トランスジエニック動物がトランスジェニヅクラットである請求 項 8に記載の MAの取得方法。
10. SV40の温度感受性変異株が SV40tsA58である請求項 7に記載の DNAの取得方 法。
11. 内分泌細胞由来の細胞株が、 視床下部またはランゲルハンス氏島由来の細 胞株である、 請求項 1、 2、 6、 7または 8に記載の DNAの取得方法。
12. 内分泌細胞由来の細胞株が、 レブチン受容体 （Ob- Rb) 遺伝子、 プレブ口 ニューロメディン U遺伝子、 RFamide- related peptide (RFRP) プレプロ蛋白質遺 伝子、 プレプロォレキシン遺伝子、 プレブ口才ピオメラノコルチン遺伝子、 プレ プロニユーロべプチド Y遺伝子、 プレプロニユーロぺプチド F F遺伝子、 プレプロ コルチコトロビン放出ホルモン遺伝子、 プレプロサイロトロピン放出ホルモン遺 伝子、 プレプログレリン遺伝子、 プレブ口メラニン凝集ホルモン遺伝子、 cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) 遺 to子、 2型ニュ一口 メディン U受容体 （NMU2R) 遺伝子、 RFRP受容体遺伝子、 4型メラノコルチン受容 体 （MC4R) 遺伝子、 1型ニューロペプチド Y受容体 （NPY1R) 遺伝子、 5型ニューロ ペプチド Y受容体 （NPY5R) 遺伝子、 2型ニューロペプチド F F受容体 （NPFF2) 遺 伝子、 1型コルチコトロピン放出ホルモン ^容体 （CRIffi- 1) 遺伝子、 2型コルチコ トロビン放出ホルモン受容体 (CRHR-2) 遺伝子、 グレリン受容体遺伝子、 1型メラ ニン凝集ホルモン受容体 （MCHR1) 遺伝子、 プレブロアグーチ関連ペプチド遺伝子、 スルホニルゥレア受容体遺伝子、 毛様体神経栄養因子 （CNTF) 受容体遺伝子、 1型 ニューロメディン U受容体 (NMU1R) 遺伝子、 1型ォレキシン受容体 （0X1R) 遺伝 子、 2型ォレキシン受容体 （0X2R) 遺伝子、 1型アンジォテンシン II受容体遺伝子、 ガラニン受容体、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体遺伝子、 およびグルカ ゴン様ペプチド- 2 (GLP-2) 受容体遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なく とも 1つの遺伝子を内因性に発現する視床下部由来細胞である、 請求項 1、 2、 6、 7または 8に記載の DNAの取得方法。
13. 内分泌細胞由来の細胞株が、 レブチン受容体 （Ob- ftb) 、 ニューロメディ ン U、 RF amide-related peptide (RFRP) 蛋白質、 ォレキシン、 ォピオメラノコル チン、 ニューロペプチド Y、 ニューロペプチド F F、 コルチコトロピン放出ホルモ ン、 サイ口トロピン放出ホルモン、 グレリン、 メラニン凝集ホルモン、 cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART)、 2型ニューロメディン U受容体
(NMU2 )、 RFRP受容体、 4型メラノコルチン受容体 （MC4R)、 1型ニューロぺプチ ド Y受容体 （NPY1R)、 5型ニューロペプチド Y受容体 （NPY5R)、 2型ニューロぺプ チド F F受容体 (NPFF2)、 1型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-1)、 2型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-2)、 グレリン受容体、 1型メラ ニン凝集ホルモン受容体 (MCHR1) 、 ァグ一チ関連ペプチド、 スルホニルウレァ受 容体、 毛様体神経栄養因子 （CNTF) 受容体、 1型ニューロメディン U受容体 （ NMU1R)、 1型ォレキシン受容体 （0X1R)、 2型ォレキシン受容体 （0X2R)、 1型ァ ンジォテンシン II受容体、 ガラニン受容体、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受 容体、 グルカゴン様ペプチド- 2 (GLP-2) 受容体、 およびエンドルフィンからなる 群より選ばれるぺプチドの少なくとも 1つのぺプチドを内因性に発現する視床下 部由来の細胞である、 請求項 1、 2、 6、 7または 8に記載の DNAの取得方法。
14. 内分泌細胞由来の細胞株の細胞が、 プレブ口インスリン遺伝子、 プレブ口 グルカゴン遺伝子、 プレブロソマトス夕チン遺伝子、 プレプロ滕ポリぺプチド遺 伝子、 プロホルモンコンペル夕一ゼ 1 (PC1) 遺伝子、 プロホルモンコンペルター ゼ 2 (PC2) 遺伝子、 グルカゴン様ペプチド- 1 ( GLP-1 ) 受容体遺伝子、 PDX1 ( pancreatic-duodenal homeobox 1 ) 遺伝子、 Pax4遺伝子、 Pax6遺伝子、 ニューロ ジェニン 3遺伝子、 ニューロ D遺伝子、 Nkx2.2遺伝子、 Nkx6.1遺伝子、 グルコキナ ーゼ遺伝子、 2型グルコーストランスポーター遺伝子、 ベー夕セルリン遺伝子、 ス ルホニルゥレア遺伝子、 受容体遺伝子、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受 容体遺伝子、 1型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 2型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 3型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 4型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 5型ソマトス 夕チン受容体遺伝子、 ィンスリン受容体遺伝子、 グルコーストランスポー夕一遺 伝子、 およびネスチン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも 1つの 遺伝子を内因性に発現するランゲルハンス氏島由来細胞である、 請求項 1、 、 6、 7または 8に記載の DNAの取得方法。
15. 受容体を発現する細胞が、 下記の （1)〜 （3) の少なくとも 1つが染色体 DNAに組み込まれた、 ェプスタイン .バー ·ウィルス （Epstain-Barr virus) の EBNA-1遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株である、 請求項 1または 2に記載の DNAの取得方法。
(1) 誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するための DNAコンストラクト
(2) 転写因子の応答配列を有するプロモー夕一の下流にレポ一夕一遺伝子を連結 した DNAコンストラクト
(3) Gひ蛋白質またはキメラ Gひ蛋白質を発現するための DNAコンストラクト
16. B細胞株が、 無血清馴化 Namalwa細胞である、 請求項 15に記載の DNAの取得 方法。
17. 無血清馴化 Namalwa細胞が、 Namalwa KJM- 1細胞である、 請求項 16に記載の DNAの取得方法。
18. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受 容体のリガンド結合領域のキヌラ蛋白質である、 請求項 15に記載の DNAの取得方法。
19. 転写因子の応答配列が、 cAMP応答配列（CRE)、 TPA応答配列（TRE)、 丽 (nuclear factor of activated T cells)応答配列、 または血清応答配列 (SRE)である、 請求項 15に記載の DNAの取得方法。
20. レポ一夕一遺伝子が、 ホタル .ルシフェラ一ゼ遗伝子、 ゥミシイタケ ·ル シフェラーゼ遺伝子、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラーゼ遺伝 子、 ? -ガラクトシダ一ゼ遺伝子、 ラク夕マーゼ遺伝子、 またはグリーン ·フ レオレツセント 'プロテイン遺伝子である、 請求項 15に記載の DNAの取得方法。
21. Go:蛋白質が、 Gひ 16、 G 15s GanS Gau、 Gひ s、 Gais Get。ヽ G zS Ga12S Ga13s Ga t Gat, および G 14からなる群より選ばれるの少なくとも 1つの Ga 蛋白質である、 請求項 15に記載の DNAの取得方法。
22. キメラ G 蛋白質が、 下記の （1) 〜 （20) からなる群より選ばれる少なく とも 1つのキメラ Gひ蛋白質である、 請求項 15に記載の DNAの取得方法。
(1) Gas©C末端 5アミノ酸を Ga:qの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(2) Ga:s©C末端 5アミノ酸を Ga^C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
(3) Gひ S®C末端 5アミノ酸を 。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
(4) Ga:s©C末端 5アミノ酸を Gひ 2の(末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
(5) Gひ 3の0末端 5アミノ酸を G 12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go;蛋白質
(6) Gas©C末端 5アミノ酸を Gひ 13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(7) Gas©C末端 5アミノ酸を GaGustの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
(8) G«sの C末端 5アミノ酸を Ga:tの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(9) Gひ S©C末端 5アミノ酸を Gcc14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
(10) G 3の0末端 5アミノ酸を G 16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G«蛋白質
(11) (^ の 末端 5アミノ酸を G S C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質
(12) G 9の(]末端 5ァミノ酸を Gひ iの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G a蛋白質
(13) Gひ qの C末端 5アミノ酸を G 。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(14) Gaqの C末端 5アミノ酸を Gひ 2の0末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
(15) Gaqの C末端 5アミノ酸を Ga12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
(16) Gaの C末端 5アミノ酸を Ga13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
(17) Gaqの C末端 5アミノ酸を Gひ の。末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白 質
(18) Gひ qの C末端 5アミノ酸を Gatの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
(19) Gひ q®C末端 5アミノ酸を Gひ 14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
(20) Gaqの C末端 5アミノ酸を Gai6の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
23. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受 容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプ 口モー夕—が、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモーターであり、 レポ一夕一遺伝 子が、 ホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ 'ルシフェラーゼ遺伝 子である、 請求項 15に記載の DNAの取得方法。
24. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受 容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプ 口モー夕—が、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモーターであり、 レポーター遺伝 子が、 ホ夕ル 'ルシフェラーゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ 'ルシフェラーゼ遺伝 子であり、 キメラ Gひ蛋白質が、 G o:s©C末端 5アミノ酸を Go:qの C末端 5アミノ酸に 置換したキメラ G a蛋白質または Gひ S C末端 5アミノ酸を Gひ 1の0末端 5アミノ酸に 置換したキメラ G 蛋白質である、 請求項 15に記載の MAの取得方法。
25. 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+ 上昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c- fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポーター遺伝子の発現量、 およびマーカ一遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 請求項 1または 2に記載の DNAの 取得方法。
26. 目的とする受容体を発現する細胞との接触が、 該細胞を形質転換株上に重 層することによる接触である、 請求項 1または 2に記載の DNAの取得方法。
27. レプチン受容体 (Ob-Rb) 遺伝子、 プレプロニユーロメディン U遺伝子、 RFamide-related peptide (RFRP) プレブ口蛋白質遺伝子、 プレプロォレキシン遺 伝子、 プレブ口才ピオメラノコルチン遺伝子、 プレプロニュ一口ペプチド Y遺伝子、 プレプロニュ一口ペプチド: F F遺伝子、 プレプロコルチコトロピン放出ホルモン 遺伝子、 プレプロサイロト口ピン放出ホルモン遺伝子、 プレプログレリン遺伝子、 プレプロメラニン凝集ホ レモン遺 K子、 cocaine- and amphetamine-regulated transcript (C T) 遺伝子、 2型ニューロメディン U受容体 （MU2R) 遺伝子、 RI1P受容体遺伝子、 4型メラノコルチン受容体 (MC4R) 遺伝子、 1型ニューロぺプ チド Y受容体 （NPY1R) 遺伝子、 5型ニューロペプチド Y受容体 （NPY5R) 遺伝子、 2 型ニューロペプチド: F F受容体 （NPFF2) 遺伝子、 1型コルチコトロピン放出ホル モン受容体 (CRHR-1) 遺伝子、 2型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CEHR-2 ) 遺伝子、 グレリン受容体遺伝子、 1型メラニン凝集ホルモン受容体 （MCHR1) 遺 伝子、 プレブロアグーチ関連ペプチド遺伝子、 スルホニルゥレア受容体遺伝子、 毛様体神経栄養因子 （CNTF) 受容体遺伝子、 1型ニューロメディン U受容体 （ NMU1R) 遺伝子、 1型ォレキシン受容体 （0X1R) 遺伝子、 2型ォレキシン受容体 （ 0X2R) 遺伝子、 1型アンジォテンシン II受容体遺伝子、 ガラニン受容体遺伝子、 グ ルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体遺伝子、 およびグルカゴン様ペプチド- 2 ( GLP-2) 受容体遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも 1つの遺伝子を 内因性に発現する視床下部由来の細胞株。
28. レプチン受容体 （ Ob-Rb ) 、 ニューロメディン U、 RFamide-related peptide (RFRP) 蛋白質、 ォレキシン、 ォピオメラノコルチン、 ニューロペプチド Y、 ニューロペプチド F F、 コルチコトロピン放出ホルモン、 サイロトロピン放出 ホルモン、 グレ リン、 メラニン凝集ホルモン、 cocaine- and amphetamine - regulated transcript (CART) 、 2型ニューロメディン U受容体 (NMU2R)、 RFRP 受容体、 4型メラノコルチン受容体 （MC4R) 、 1型ニューロペプチド Y受容体 （ NPY1R)、 5型ニューロペプチド Y受容体 (NPY5R)、 2型ニューロペプチド F F受容 体 （NPFF2)、 1型コルチコトロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-1)、 2型コルチコ トロピン放出ホルモン受容体 (CRHR-2) 、 グレリン受容体、 1型メラニン凝集ホル モン受容体 (MCHR1) 、 ァグーチ関連ペプチド、 スルホニルゥレア受容体、 毛様体 神経栄養因子 （CNTF) 受容体、 1型ニューロメディン U受容体 (NMUIR)、 1型ォレ キシン受容体 (0X1R)、 2型ォレキシン受容体 (0X2R)、 1型アンジォテンシン II 受容体、 ガラニン受容体、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体、 グルカゴン 様ペプチド- 2 (GLP-2) 受容体、 およびエンドルフィンからなる群より選ばれるぺ プチドの少なくとも 1つのべプチドを内因性に発現する視床下部由来の細胞株。
29. 細胞株が、 SV40のラージ T抗原遺伝子を発現する細胞株である、 請求項 27 または 28に記載の細胞株。
30. 細胞株が、 SV40の温度感受性変異株のラージ T抗原遺伝子を発現する細胞 株である、 請求項 27または 28に記載の細胞株。
31. 細胞株が、 非ヒト · トランスジエニック動物細胞由来の細胞株である、 請 求項 27〜30のいずれか 1項に記載の細胞株。
32. SV40の温度感受性変異株のラージ T抗原遺伝子を導入した非ヒト · トラン スジエニック動物の視床下部またはランゲルハンス氏島から得られる不死化した 細胞株。
33. ランゲルハンス氏島から得られる不死化した細胞株が、 プレブ口インスリ ン遺伝子、 プレブログルカゴン遺伝子、 プレプロソマトス夕チン遺伝子、 プレブ 口膝ポリペプチド遺伝子、 プロホルモンコンペル夕一ゼ 1 (PC1) 遺伝子、 プロホ ルモンコンベル夕ーゼ 2 (PC2) '遺伝子、 グルカゴン様ペプチド- 1 (GLP-1) 受容体 遺伝子、 PDXl (pancreatic-duodenal homeobo 1) 遺伝子、 Pax4遺伝子、 Pax6遺 伝子、 ニューロジヱニン 3遺伝子、 ニューロ D遺伝子、 Nkx2.2遺伝子、 Nkx6.1遺伝 子、 グルコキナーゼ遺伝子、 2型グルコーストランスポーター遺伝子、 ベ一夕セル リン遺伝子、 スルホニルゥレア遺伝子、 P2Yi受容体遺伝子、 グルカゴン様べプチ ド- 1 (GLP-1) 受容体遺伝子、 1型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 2型ソマトス夕チ ン受容体遺伝子、 3型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 4型ソマトス夕チン受容体遺 伝子、 5型ソマトス夕チン受容体遺伝子、 インスリン受容体遺伝子、 グルコ一スト ランスポ一夕一遺伝子、 およびネスチン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の 少なくとも 1つの 伝子を内因性に発現する細胞株である、 請求項 32に記載の細 胞株。
34. SV40の温度感受性変異株が SV40tsA58である請求項 30または 32に記載の細 胞株。
35. 非ヒト · トランスジエニック動物がトランスジエニックラヅトである請求 項 31または 32に記載の細胞株。
36. 下記 （1) および （2) の工程を有する、 ペプチドの製造方法。
(1) 請求項 27〜35のいずれか 1項に記載の細胞株を培養し、 該細胞株が内在的に 発現しているべプチドを培養物中に生成蓄積させる
(2) 上記 （1) で得られた培養物から該ペプチドを採取する
37. 下記 （1) 〜 （3) の工程を有する、 ペプチドの製造方法。
(1) 請求項 27〜35のいずれか 1項に記載の細胞株を宿主細胞として用い、 該宿主 細胞に目的とするペプチドをコードする MAを導入し、 形質転換株を取得する
(2) 該形質転換株を培養し、 培養物中にペプチドを生成蓄積させる
(3) 上記 （2) で得られた培養物から該ペプチドを採取する
38. 培養を、 SM0の温度感受性変異株のラージ T抗原の活性を抑制しない温度 で行うことを特徴とする、 請求項 36または 37に記載の製造法。
39. 製造において、 無血清培地、 2%以下の血清を含む培地、 または無血清培 地に N-サプリメントを添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴 とする、 請求項 36〜38のいずれか 1項に記載の製造法。
40. 製造において、 5〜30誦 ol/Lのグルコースを含有する培地を用いて培養を 行う工程を有することを特徴とする、 請求項 36〜39のいずれか 1項に記載の製造 法。
41. 製造において、 宿主細胞で発現されている、 受容体、 トランスポーターま たはチャネルの、 ァゴニストまたはアン夕ゴニストを添加した培地を用いて培養 を行う工程を有することを特徴とする、 請求項 36〜40のいずれか 1項に記載の製 造法。
42. 受容体が、 G蛋白質共役型受容体、 核内受容体、 増殖因子受容体、 スルホ ニルゥレア受容体、 ciliary neurotrophic factor受容体、 レプチン受容体、 サイ トカイン受容体、 またはスルホニルゥレア受容体であることを特徴とする、 請求 項 41に記載の製造法。
43. トランスポ一ターがグルコーストランスポー夕一であることを特徴とする、 請求項 41に記載の製造法。
44. チャネルが、 Caチャネル、 Kチャネル、 C 1チャネルまたは Naチャネルであ ることを特徴とする、 請求項 41に記載の製造法。
45. 製造において、 宿主細胞で発現されている受容体のシグナルを代替するこ とのできる物質を添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とす る、 請求項 36〜44のいずれか 1項に記載の製造法。
46. 受容体のシグナルを代替することのできる物質が、 アデニレ一トシクラ一 ゼ、 プロテインキナ一ゼ、 ホスホジエステラーゼ、 低分子量 G蛋白質、 細胞内 cA P または細胞内 Ca2+含量を変動する物質、 フォルスコリン、 8-ブロモ -サイクリック AMP (8-Br-cAMP) 、 ホルボール 12-ミリステート； 13 -アセテート （PMA) 、 ィオノマ ィシンおよび 3-ィソプチル- 1-メチルキサンチンよりなる群より選ばれる物質の少 なくとも 1つの物質である、 請求項 45に記載の製造法。 .
47. 製造において、 ラミニンまたはゼラチンをコートしたディッシュ上で培養 を行う工程を有することを特徴とする、 請求項 36〜46のいずれか 1項に記載の製 造法。
48. スクシニル化コンカナバリン Aを添加した培地を用いて培養を行うことを 特徴とする、 請求項 36〜46のいずれか 1項に記載の製造法。
49. ァクチビン、 グルカゴン様ぺプチド- 1 (GLP-1) 、 フォリス夕チン、 グル コース、 肝細胞増殖因子 （hepatocyte growth factor ) 、 上皮増殖因子 （ epidermal growth factor) 、 ニコチンアミ ド、 ぺ一夕セルリン、 副甲状腺ホルモ ン関連ペプチド (parathyroid hormone-related peptide) 甲状腺刺激ホルモン 放出ホレモン (thyrotropin— releasing hormone) 血管内皮 ί曽殖因子 (vascular endothelial growth factor 、 islet neogenesis - associated protein、 血小板 由来増殖因子 （Platelet-derived growth factor) 、 インシュリン様増殖因子 I ( insulin-like growth factor I ) 、 繊維芽細胞増殖因子 (fibloblast growth factor) 、 神経成長因子 （nerve growth factor) および Reg蛋白質からなる群よ り選ばれる物質の少なくとも 1つの物質を添加した培地を用いて培養を行うこと を特徴とする、 請求項 36~48のいずれか 1項に記載の製造法。
50. 培養物中に活性べプチドを生成蓄積させた後に分泌刺激剤を添加すること を特徴とする、 請求項 36〜49のいずれか 1項に記載の製造法。
51. 分泌刺激剤が、 カリウム、 グルコース、 Tolbutamideまたは ATPである、 請 求項 50に記載の製造法。
52. 一種類以上のペプチドをコードする DNAを宿主細胞に導入し、 複数のぺプ チドを製造することを特徴とする、 請求項 37〜51のいずれか 1項に記載の製造法。
53. 下記 （1) 〜 （4) の工程を有する、 目的とする受容体のァゴニスト、 アン 夕ゴニストまたはィンバ一スァゴニストとして作用するぺプチドの検出または取 得方法。
(1) 請求項 1〜26のいずれか 1項に記載の方法で、 目的とする受容体のァゴニス ト、 アン夕ゴニストまたはィンバースァゴニストとして作用するぺプチドをコ一 ドする DNAを取得する ， '
(2) 該 DNAがコードするペプチドまたは部分ペプチドを、 目的とする受容体を発 現する細胞と接触させる
(3) 該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
(4) 上記 （3) で応答反応を与えることの示されたペプチドまたは部分ペプチド を同定する
54. 下記 （1) 〜 （4) の工程を有する、 目的とする受容体のァゴニスト、 アン 夕ゴニストまたはィンバースァゴニストとして作用するべプチドの検出または取 得方法。
(1) 請求項 36〜52のいずれか 1項に記載の製造方法でぺプチドを取得する
(2) 該ペプチドを、 目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
(3) 該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
(4) 上記 （3) で応答反応を与えることの示されたペプチドを同定する
55. 受容体が G蛋白質共役型受容体である、 請求項 53または 54に記載の検出ま たは取得方法。
56. G蛋白質共役型受容体がォーファン G蛋白質共役型受容体である、 請求項 55 に記載の検出または取得方法。
57. 受容体を発現する細胞が、 下記の （1) 〜 （3) の少なくとも 1つが染色体 DNAに組み込まれた、 ェプス夕イン ·バ一 · ウィルス （Epstain- Barr virus) の EBNA- 1遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株である、 請求項 53または 54に記載 の検出または取得方法。
(1) 誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するための DNAコンストラクト
(2) 転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結 した DNAコンストラクト
(3) Go:蛋白質またはキメラ Go:蛋白質を発現するための MAコンストラクト
58. B細胞株が、 無血清馴化 Namalwa細胞である、 請求項 57に記載の検出または 取得方法。
59. 無血清馴化 Namalwa細胞が、 Namalwa KJM- 1細胞である、 請求項 58に記載の 検出または取得方法。
60. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受 容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、 請求項 57に記載の検出または取 得方法。
61. 転写因子の応答配列が、 cAMP応答配列（CRE)、 TPA応答配列（TRE)、 NFAT(nuclear factor of activated T cells)応答配列、 または血清応答配列 ( SRE )である、 請求項 57に記載の検出または取得方法。
62. レポ一夕一遺伝子が、 ホタル 'ルシフヱラ一ゼ遺伝子、 ゥミシィタケ -ル シフェラーゼ遺伝子、 クロラムフエ二コール · ァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝 子、 ? -ガラクトシダ一ゼ遺伝子、 ? -ラク夕マ一ゼ遺伝子、 またはグリーン .フ ルォレツセント ·プロテイン遺伝子である、 請求項 57に記載の検出または取得方 法。
63. 6ひ蛋白質が、 Gひ 16、 Ga15s Gaq、 G lls GasS Gais G oS Go:z、 Ga12、 G 13S G aG 、 Gひ t、 および G 14からなる群より選ばれるの少なくとも 1つの G 蛋白質である、 請求項 57に記載の検出または取得方法。
64. キメラ 蛋白質が、 下記の （1) 〜 （20) からなる群より選ばれる少なく とも 1つのキメラ G 蛋白質である、 請求項 57に記載の検出または取得方法。
(1) Gひ S®C末端 5アミノ酸を Gc^の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(2) Gasの C末端 5ァミノ酸を Gひ 1の。末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(3) Gasの C末端 5アミノ酸を Gひ。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(4) Gasの C末端 5アミノ酸を Gaz C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(5) Gasの C末端 5アミノ酸を Ga12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質
(6) G sの C末端 5アミノ酸を Go: ί3の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(7) Gas©C末端 5ァミノ酸を (}ひ の(末端 5アミノ酸に置換したキヌラ Go:蛋白質
(8) 6 の 末端 5アミソ酸を Gatの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(9) 6ひ8の(]末端 5アミノ酸を Go:14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
(10) Gasの C末端 5アミノ酸を Gひ 16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質
(11) Gaqの C末端 5アミノ酸を & の末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
(12) Gひ qの C末端 5アミノ酸を Gひ i©C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(13) Gaqの C末端 5アミノ酸を 。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(14) Gひ qの C末端 5アミノ酸を Gひ 2の(末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
(15) Gaqの C末端 5アミノ酸を Ga12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
(16) Gaqの C末端 5アミノ酸を Gひ 13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
(17) G aqの C末端 5アミノ酸を Gagustの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白 質
(18) Gひ qの C末端 5ァ.ミノ酸を Gatの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
(19) Gaqの C末端 5アミノ酸を Ga14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
(20) Gひ qの C末端 5アミノ酸を G 16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
65. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受 容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプ ロモ一夕一が、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモ一夕一であり、 レポーター遺伝 子が、 ホ夕ル ·ルシフェラ一ゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ ·ルシフェラーゼ遺伝 子である、 請求項 57に記載の検出または取得方法。
66. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受 容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプ 口モーターが、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモー夕一であり、 レポ一夕一遺伝 子が、 ホ夕ル ·ルシフェラ一ゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ ·ルシフェラ一ゼ遺伝 子であり、 キメラ Gひ蛋白質が、 G as®C末端 5アミノ酸を Gaqの C末端 5アミノ酸に 置換したキメラ Gひ蛋白質または G as0C末端 5アミノ酸を G ；の。末端 5アミノ酸に 置換したキメラ 蛋白質である、 請求項 57に記載の検出または取得方法。
67. 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+ 上昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C- fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポ一夕一遺伝子の発現量、 およびマ一力一遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 請求項 53または 54に記載の検 出または取得方法。
68. 下記の （1 ) 〜 （3) の少なくとも 1つが染色体 DNAに組み込まれた、 ェプ スタイン -バ一 'ウィルス （Epstain-Barr virus) の EBNA- 1遺伝子を発現する無 血清馴化した B細胞株由来の細胞株。
(1) 誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するための DNAコンストラクト
(2) 転写因子の応答配列を有するプロモー夕一の下流にレポ一夕一遺伝子を連結 した DNAコンストラクト
(3) Ga蛋白質またはキメラ G 蛋白質を発現するための DNAコンストラクト
69. 細胞株が、 無血清馴化 Namalwa細胞である、 請求項 68に記載の細胞株。
70. 無血清馴化 Najnalwa細胞が、 Namalwa KJM- 1細胞である、 請求項 69に記載の 細胞株。
71. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受 容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、 請求項 68に記載の細胞株。
72. 転写因子の応答配列が、 cAMP応答配列（CRE)、 TPA応答配列（TM：)、 NFAT( nuclear factor of activated T cells)応答配列、 または血清応答配列 (SRE)である、 請求項 68に記載の細胞株。
73. レポ一夕一遺伝子が、 ホタル .ルシフヱラーゼ遺伝子、 ゥミシィタケ .ル シフェラ一ゼ遺伝子、 クロラムフエニコ一ル ·ァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝 子、 ^-ガラクトシダ一ゼ遺伝子、 ?-ラク夕マーゼ遺伝子、 またはグリーン -フ ルォレツセント ·プロテイン遺伝子である、 請求項 68に記載の細胞株。
74. Gひ蛋白質が、 G«16、 Ga15、 Go:qs G n Gasヽ G i G 0 Gazヽ G 12S G :13、 Ga^ Gat、 および Ga½からなる群より選ばれるの少なくとも 1つの 蛋白質である、 請求項 68に記載の細胞株。
75. キメラ Gひ蛋白質が、 下記の ひ） 〜 （20) からなる群より選ばれる少なく とも 1つのキメラ G 蛋白質である、 請求項 68に記載の細胞株。
1) Go:s©C末端 5アミノ酸を Ga:q©C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
2) Gひ 3の(末端 5アミノ酸を (} の C末端 5アミノ酸に置換したキヌラ Gひ蛋白質
3) Gasの C末端 5アミノ酸を Ga。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
4) Gひ S©C末端 5アミノ酸を Gひ Z©C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
5) Gasの C末端 5アミノ酸を G«12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
6) & 3の。末端 5アミノ酸を Go:13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
7) Go:s©C末端 5アミノ酸を Go: の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
8) G 3の(；末端 5アミノ酸を Gatの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
9) Gasの C末端 5アミノ酸を Ga14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
10) Gひ sの C末端 5アミノ酸を Ga16の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Ga蛋白質
11) Gひ qの C末端 5アミノ酸を (}ひ3の0末端 5アミノ酸に置換したキメラ Gひ蛋白質
12) Gaqの C末端 5アミノ酸を の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
13) Gaqの C末端 5アミノ酸を Gひ。の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
14) GcKqの C末端 5アミノ酸を 6 2の0末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
15) Gひ qの C末端 5アミノ酸を Ga12の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
16) Go:qの C末端 5アミノ酸を G 13の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ Go:蛋白質
17) Gひ q C末端 5アミノ酸を Go: の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白 S
(18) Gひ qの C末端 5アミノ酸を Gatの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質 (19) Gaqの C末端 5アミノ酸を Ga14の C末端 5アミノ酸に置換したキメラ G 蛋白質
(20) Gひ qの C末端 5アミノ酸を Galsの C末端 5アミノ酸に置換したキメラ 蛋白質
76. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとエストロジヱン受 容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプ 口モーターが、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモー夕一であり、 レポーター遺伝 子が、 ホタル 'ルシフヱラ一ゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ 'ルシフヱラーゼ遺伝 子である、 請求項 68に記載の細胞株。
77. 誘導発現系の構築に必要な転写因子が、 酵母の Gal4pとェストロジェン受 容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、 転写因子の応答配列を有するプ ロモ—夕一が、 cAMP応答配列（CRE)を有するプロモ一夕一であり、 レポ一夕一遺伝 子が、 ホ夕ル 'ルシフェラ一ゼ遺伝子またはゥミシィ夕ケ 'ルシフェラ一ゼ遺伝 子であり、 キメラ Gひ蛋白質が、 Go:s®C末端 5アミノ酸を Gひ qの C末端 5アミノ酸に 置換したキメラ Go:蛋白質または Gasの C末端 5アミノ酸を Gひ 1の0末端 5アミノ酸に 置換したキメラ G 蛋白質である、 請求項 68に記載の細胞株。
78. 下記 （1) 〜 （4) の工程を有する、 被検物質に反応するペプチドをコード する DNAの取得方法。
(1) 請求項 68〜77のいずれか 1項に記載の細胞株に、 任意の cDNAまたは染色体由 来の DNAを導入して形質転換株を取得する
(2) 導入した cDMまたは染色体 DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質 の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
(3) 導入した cDNAまたは染色体 DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質 の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
(4) 上記 （2) と （3) の応答反応を比較し、 異なる応答反応を示す形質転換株を 選択し、 該株に導入した DNAを同定する
79. 下記 （1) 〜 （7) の工程を有する、 被検物質に反応するペプチドをコード する DNAの取得方法。 . .
(1) 発現ベクターを用いて作製した cDNAライブラリーを 1〜； L0000のクローンずつ のプールに分ける。
(2) 各プールに由来する cDNAクローンの混合物を、 請求項 68〜77のいずれか 1項 に記載の細胞株に導入して形質転換株を取得する、 (3) 各プールごとに、 導入した cMAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質 の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
(4) 各プールごとに、 導入した cDNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質 の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
(5) 上記 （3) と （4) の応答反応を比較し、 異なる応答反応を示すプールを選択 し、 選択したプールを （1) よりも細かいプールに分ける。
(6) (2) 〜 （5) の操作をプールが 1クローンごとになるまで繰り返す。
(7) 被検物質の存在下と非存在下で異なる応答反応を示す形質転換株を同定し、 該株に導入した MAを同定する
80. 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+ 上昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C- fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポ一夕一遺伝子の発現量、 およびマーカ一遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 請求項 78または 79に記載の DNA の取得方法。
81. 被検物質が、 請求項 27〜35のいずれか 1項に記載の細胞株を培養すること により得られる被検物質である、 請求項 78または 79に記載の DNAの取得方法。
82. SV40の温度感受性変異株のラ一ジ T抗原の活性を抑制または消失させる温 度で培養を行うことを特徴とする、 請求項 78〜81のいずれか 1項に記載の DNAの取 得方法。
83. 下記 （1) 〜 （5) の工程を有する、 ペプチドをコードする DNAの取得方法。
(1) 請求項 68〜77のいずれか 1項に記載の細胞株から選ばれる、 乾写因子の応答 配列を有するプロモ一夕一の下流にレポー夕一遺伝子を連結した DNAコンストラク トが染色体 DNAに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
(2) 該宿主細胞に、 任意の cDNAまたは染色体由来の DNAを導入して形質転換株を 取得する
(3) 上記 （2) で取得された形質転換株において、 導入した cDNAまたは DNAを発現 させたときの、 レポーター遺伝子の発現量を測定する
(4) 宿主細胞における、 あるいは上記 （2) で取得された形質転換株において、 導入した cDNAまたは DNAを発現させていないときの、 レポ一夕一遺伝子の発現量を 測定する
(5) 上記 （3) と （4) のレポ一夕一遺伝子の発現量を比較し、 異なるレポ一夕一 遺伝子の発現量を示す形質転換株を選択し、 該株に導入した DNAを同定する
84. 下記 （1) 〜 （8) の工程を有する、 ペプチドをコードする DNAの取得方法 c
( 1 ) 誘導発現べクタ一を用いて作製した cDNAライブラリーを 1〜10000のクローン ずつのプールに分ける
(2)請求項 68〜77のいずれか 1項に記載の細胞株から選ばれる、 転写因子の応答 配列を有するプロモーターの下流にレポ一夕一遺伝子を連結した DNAコンストラク トが染色体 MAに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
(3) 上記 （1) で分けた、 各プールに由来する cDNAクローンの混合物を、 上記 (2) で取得した宿主細胞に導入して、 各プールごとに形質転換株を取得する
(4) 上記 （3) の各プールごとの形質転換株において、 導入した cDNAを発現させ たときの、 レポーター遺伝子の発現量を測定する
(5) 上記 （3) の各プールごとの形質転換株において、 導入した cDNAを発現させ ないときの、 レポ一夕一遺伝子の発現量を測定する
(6) 上記 （4) および （5) のレポ一夕一遺伝子の発現量をプールごとに比較し、 (4) のレポ一夕一遺伝子の発現量の多いプールの形質転換株を選択し、 選択した プールを （1) よりも細かいプールに分ける
(7) 上記 （2) 〜 （6) の操作をプールが 1クローンごとになるまで繰り返す
(8) 導入した cDNAを、 発現させないときよりも発現させたときのレポ一夕一遺伝 子の発現量の多い形質転換株を同定し、 該株に導入した DNAを同定する
85. ペプチドが、 受容体、 転写因子、 シグナル伝達分子、 または酵素である、 請求項 78、 79、 83または 84に記載の DNAの取得方法。
86. 受容体が G蛋白質共役型受容体である、 請求項 85に記載の DNAの取得方法。
87. 受容体が構成活性型の G蛋白質共役型受容体である、 請求項 85に記載の MA の取得方法。
88. G蛋白質共役型受容体がォ一ファン G蛋白質共役型受容体である、 請求項 86 または 87に記載の DNAの取得方法。
89. ペプチドが、 転写因子の応答配列を有するプロモーターの活性を増加させ る活性を有する転写因子、 シグナル伝達分子、 または酵素である、 請求項 78、 79、 83または 84に記載の MAの取得方法。
90. cDNAが変異 G蛋白質共役型受容体をコードするランダム変異導入 cDNA、 ぺ プチドが構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体あることを特徴とする、 請求項 78、 79、 83または 84に記載の DNAの取得方法。
91. ランダム変異を導入する部位が、 G蛋白質共役型受容体の第 3膜貫通領域の 後半から第 2細胞内領域の前半部分あるいは第 3細胞内領域の後半から第 莫貫通領 域の前半部分であることを特徴とする、 請求項 90に記載の DNAの取得方法。
92. ランダム変異を導入する部位が、 G蛋白質共役型受容体における保存アミ ノ酸残基の一つである第 6膜貫通領域中に存在するプロリン残基もしくは該プロリ ン残基に相応するアミノ酸残基より N末側に 20残基目または 22残基目のアミノ酸で あることを特徴とする、 請求項 90または 91に記載の DNAの取得方法。
93. 請求項 90〜92のいずれか 1項に記載の方法を用いて取得される構成活性型 変異 G蛋白質共役型受容体。
94. G蛋白質共役型受容体における保存アミノ酸残基の一つである第 6膜貫通領 域中に存在するプロリン残基もしくは該プロリン残基に相応するアミノ酸残基よ り N末側に 20残基目または 22残基目のアミノ酸に変異を有する構成活性型変異 G蛋 白質共役型受容体。
95. 0GR1の N末端より 221番目のセリンをァスパラギンに置換した構成活性型変 異 G蛋白質共役型受容体、 0(¾1の N末端より 118番目のァスパラギン酸をァラニンに 置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 0GR1の N末端より 118番目のァスパ ラギン酸をァラニンに、 かつ 221番目のセリンをァスパラギンに置換した構成活性 型変異 G蛋白質共役型受容体、 RE2の N末端より 124番目のァスパラギン酸をァラニ ンに置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 GPR35の N末端より 113番目の ァスパラギン酸をァラニンに置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 GPCR25の N末端より 111番目のァスパラギン酸をァラニンに置換した構成活性型変 異 G蛋白質共役型受容体、 PGM0334の N末端より 135番目のグル夕ミン酸をフェニル ァラニン、 グル夕ミンまたはァラニンに置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受 容体、 PGM0334の N末端より 259番目のァスパラギン酸をセリンに置換した構成活性 型変異 G蛋白質共役型受容体、 GPR43の N末端より 217番目のアルギニンをプロリン に置換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体、 および GP 3の N末端より 217番 目のアルギニンをプロリンに、 かつ 106番目のグル夕ミン酸をァスパラギン酸に置 換した構成活性型変異 G蛋白質共役型受容体からなる群より選ばれる構成活性型変 異 G蛋白質共役型受容体。
96. 1型メラノコルチン受容体 （MC1R) および、 proadrenomedullin N-20 terminal peptide (PAMP)または PAMPの N末端から 9〜20番目のアミノ酸残基からな るぺプチドを用いた、 アン夕ゴニストの探索法または取得法。
97. ォ一ファン G蛋白質共役型受容体 GPR43および、 酢酸、 プロピオン酸、 酢酸 塩、 またはプロピオン酸塩を用いた、 GPR43のアン夕ゴニストの探索法または取得 法。
98. ォ一ファン G蛋白質共役型受容体 GPR41および、 シクロプロパンカルボン酸、 プロピオン酸、 シクロプロパンカルボン酸塩、 またはプロピオン酸塩を用いた、 GPR41のァン夕ゴ二ストの探索法または取得法。
99. ォーファン G蛋白質共役型受容体 GlOdおよび、 ひ-メラノサイト刺激ホルモ ンまたは副腎皮質刺激ホルモンを用いた、 GlOdのアン夕ゴニストの探索法または 取得法。
100. 下記 （1) 〜 （4) の工程を有する、 G蛋白質共役型受容体のァゴニストの 取得法。
(1) 請求項 68〜77のいずれか 1項に記載の細胞株に、 任意の G蛋白質共役型受容 体をコ一ドする MA導入して形質転換株を取得する
(2) 導入した DMを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の存在下で該形質 転換株の応答反応を測定する
(3) 導入した DMを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の非存在下で該形 質転換株の応答反応を測定する
(4) 上記 （2) と （3) を比較し、 応答反応の変化を誘発する被検物質をァゴニス トとして取得する
101. 下記 （1) 〜 （4) の工程を有する、. G蛋 質共役型受容体のアン夕ゴニス トの取得法。
(1) 請求項 68〜77のいずれか 1項に記載の細胞株に、 任意の G蛋白質共役型受容 体をコードする DNA導入して形質転換株を取得する
(2) 導入した DNAを発現させた形質転換株を用いて、 該 G蛋白質共役型受容体のァ ゴニストの存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
(3) 導入した MAを発現させた形質転換株を用いて、 該 G蛋白質共役型受容体のァ ゴニストと被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
(4) ァゴニストに基づく該形質転換株の応答反応を消失させる被検物質をアン夕 ゴニストとして取得する
102. 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+ 上昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシト一ルリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c- fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポーター遺伝子の発現量、 およびマ一力一遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 請求項 100または 101に記載の G 蛋白質共役型受容体のァゴニストまたはアン夕ゴニストの取得法。
103. 下記 （1) 〜 （5) の工程を有する、 G蛋白質共役型受容体のアン夕ゴニス トまたはィンバースァゴニス卜の取得法。
(1) 請求項 68〜77のいずれか 1項に言 3載の細胞株から選ばれる、 転写因子の応答 配列を有するプロモ一夕一の下流にレポ一夕一遺伝子を連結した DNAコンストラク トが染色体 DNAに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
(2) 該宿主細胞に、 任意の構成活性型 G蛋白質共役型受容体をコードする DMを導 入して形質転換株を取得する
(3) 被検物質の非存在下、 導入した DNAを発現させた形質転換株でのレポ一夕一 遺伝子の発現量を測定する
(4) 被検物質の存在下、 導入した DMを発現させた形質転換株でのレポ一夕一遺 伝子の発現量を測定する
(5) 上記 （3) および （4) のレポ一夕一遺伝子の発現量を比較し、 レポ一夕一遺 伝子の発現量を低下させる被検物質を、 （2) の G蛋白質共役型受容体のアン夕ゴ 二ストまたはインバースァゴニストとして取得する
104. 下記 （1) 〜 （4) の工程を有する、 転写因子、 シグナル伝達分子および 酵素からなる群より選ばれるぺプチドの活性化剤または阻害剤の取得法。
(1) 請求項 68〜77のいずれか 1項に記載の細胞株に、 任意の転写因子、 シグナル 伝達分子および酵素からなる群より選ばれるペプチドをコードする MAを導入して 形質転換株を取得する (2) 導入した DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の非存在下で該形 質転換株の応答反応を測定する
(3) 導入した DNAを発現させた形質転換株を用いて、 被検物質の存在下で該形質 転換株の応答反応を測定する
(4) '上記 (2) と （3) を比較し、 応答反応を変動させる被検物質を、 該ペプチド の活性化剤または阻害剤として取得する
105. 細胞の応答反応が、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+ 上昇、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP減少、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C- fos活性化、 細胞内 pHの変動、 細胞増殖、 レポ一夕一遺伝子の発現量、 およびマーカー遺伝子の発現量からなる 群より選ばれる少なくとも 1つの応答反応である、 請求項 104に記載の取得法。
106. 宿主細胞として請求項 68〜77のいずれか 1項に記載の細胞株を、 ベクタ 一として任意のプロモ一夕一とェプス夕イン 'ノ、 '一 · ウィルス （Epstain-Barr virus) の oriPを有する発現ぺク夕一を用いることを特徴とする、 宿主 'ベクター 系。
107. 任意のプロモ一夕一が Gal4p応答性の誘導発現プロモー夕一である、 請求 項 106に記載の宿主 ·ベクター系。
108. 発現べクタ一が、 pAMo、 pAMo-nd, pAMo- d、 pAGal9-nds または pAGal9- d であることを特徴とする、 請求項 106または 107に記載の宿主 ·ベクター系。
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