WO2003071276A1 - Chaines colloidales irreversibles porteuses de sites de reconnaissance - Google Patents

Chaines colloidales irreversibles porteuses de sites de reconnaissance Download PDF

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WO2003071276A1
WO2003071276A1 PCT/FR2003/000557 FR0300557W WO03071276A1 WO 2003071276 A1 WO2003071276 A1 WO 2003071276A1 FR 0300557 W FR0300557 W FR 0300557W WO 03071276 A1 WO03071276 A1 WO 03071276A1
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particles
chains
colloidal
assembly
colloidal particles
Prior art date
Application number
PCT/FR2003/000557
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English (en)
Inventor
Jean-Louis Viovy
Jérôme Bibette
Cécile GOUBAULT
Marie Dutreix
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Institut Curie
Universite Pierre Et Marie Curie - Paris Vi
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Filing date
Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se

Definitions

  • the main object of the invention is magnetic colloidal particles organized in the form of permanent colloidal chains. It also relates to the use of these chains to detect and / or analyze specific species present in a fluid.
  • the biological ligands considered are deposited or synthesized in situ in predetermined “spots” on a surface.
  • Each spot has a typical surface of 100 microns by 100 microns or less, which makes it possible to have a large number of recognition sites on a limited surface, and therefore to perform a large number of molecular analyzes with a quantity of 'sample reduced and in a limited time.
  • Such systems, as well as means for preparing them, are described for example in US pat. 5,744,305 (Affymetrix), Schena et al., Science, 270, 467-470, 1995.
  • these chips have a sensitivity which remains insufficient for certain applications.
  • the second method considered consists in fixing the analytes to be tested, using a network of microspheres arranged on a surface. According to this technique, it is possible advantageously to prepare microspheres carrying different functionalities accessible on their surface. However, the active surface of a sphere remains, of course, of the same order of magnitude as that which it occupies on the surface of the test device. Consequently, this method does not therefore allow any significant gain in terms of sensitivity.
  • Magnetic microbeads have also been proposed for the analysis of oligonucleotides in a microfluidic channel. These microbeads are introduced into a channel, and retained in one place thereof by a localized magnetic field: This locally constitutes an area essentially composed of a compact stack of magnetic beads. The liquid containing the species to be analyzed is then circulated through this stack. The hybridization of these is detected by fluorescence. Thanks to the circulation of species, the kinetics are much faster than with traditional DNA “chips”. Furthermore, the system is recyclable, since by eliminating the magnetic field the balls regain their mobility. However, the concentrations of analytes used to demonstrate the principle of the method are significantly higher than those actually used in the chips, which suggests that the sensitivity is low. This can be explained in particular by the compact assembly of balls. The balls closest to the detector screen for the transmission of light to others, and it is therefore only the balls closest to the surface that effectively participate in detection.
  • microspheres are also used to identify or analyze species, and in particular biological species, in different arrangements of networks arranged on a surface or in a microfluidic channel.
  • magnetic sorting techniques, which can be implemented in an analytical or preparative manner.
  • a liquid containing the species to be analyzed (cells, DNA, proteins) is brought into contact with magnetic particles.
  • the current version of these magnetic systems consists in introducing into the initial solution magnetic beads carrying specific functions of the cells to be isolated. After fixing, the beads, and the species attached to them, are pelletized using a magnet while the supernatant is removed.
  • This method is currently proposed, essentially for the binary sorting of concentrated objects. It requires then an online analysis to generate information.
  • this magnetic method however has two important limitations: imperfect selectivity and a purely binary character which both require to repeat the procedures when pure species or species meeting several criteria are sought.
  • the lack of selectivity finds its origin first of all in the drainage of the supernatant during the "sedimentation" of the particles, the moving beads displacing with them a part of the fluid and therefore of the surrounding biological objects. It is then necessary to take into account the problems of non-specific adhesion, the force of magnetic pressure contributing to anchor strongly to the balls any object trapped in the base.
  • the present invention aims to propose a new tool for diagnosis and / or preparation, identification, analysis or dosage of species in a liquid sample, making it possible to give satisfaction both in terms of sensitivity , kinetics and reproducibility.
  • the first object of the present invention is an assembly of colloidal particles in the form of one or more chains, characterized in that said chains are organized in an irreversible manner and carry at least one recognition site for a species, said site being different from the ligands involved in the linear organization of said particles.
  • the term “chain of colloidal particles, or equally“ colloidal wire ”or“ colloidal chain ” means an essentially linear assembly of colloidal particles.
  • Different geometric organizations of such assemblies can be used in the context of the invention.
  • the colloidal chains according to the invention have an aspect ratio (ratio of length to the largest dimension of a section) significantly greater than 1, typically greater than 3, and preferably greater than 5. For many applications, significantly higher aspect ratios, of 10 or more, or even greater than 100, may however prove advantageous.
  • the colloidal chains according to the invention can be relatively rigid (essentially adopting the shape of a stick), semi-rigid (capable of having a radius of curvature comparable to their length), or flexible (capable of exhibiting a radius of curvature less than their length).
  • flexible chains the length in the description above is understood along the curvilinear abscissa of said chain. According to a preferred variant, they are semi-flexible or flexible.
  • the section of the colloidal chains according to the invention is essentially circular. However, it can also be of any other shape, insofar as the largest dimension of this section remains smaller than the longest length of the colloidal chain by a factor of at least 3.
  • colloidal particle means a compact three-dimensional object consisting of a multitude of atoms or molecules, and capable of being kept in suspension in a fluid.
  • the dimensions of a colloidal particle are typically between a few tens of nanometers and a few microns, more rarely a few tens of microns.
  • latex spheres, microgels or magnetic beads of micron or submicron size, nanocrystals or microcrystals constitute colloidal particles according to the invention.
  • such particles are kept in suspension by the Brownian movement.
  • particles giving rise to sedimentation can also be considered colloidal in the sense of the invention, provided that it is possible to resuspend them at the time of their use, for example by agitation or sonication.
  • the colloidal particles used to form the chains of colloidal particles according to the invention are preferably of essentially spherical shape.
  • colloidal particles can be organic, mineral or organomineral. According to a preferred variant, they are wholly or partly of an organic nature, and preferably of an organomineral nature, that is to say having both organic constituents and mineral constituents. Many types of organomineral particles are commercially available or known to those skilled in the art. They advantageously make it possible to combine properties originating from the organic part and properties originating from the mineral part, and therefore to construct colloidal chains according to the invention endowed with very diverse properties.
  • the mineral part (or of the whole of the particle if it is essentially mineral), it can also be very varied, and in particular comprise metallic grains such as micro or nanoparticles of gold or silver or titanium, semiconductor metal oxides, metal oxides, carbon particles, “quantum dots” with specific fluorescence or light absorption properties, and / or dielectric or conductive materials .
  • metallic grains such as micro or nanoparticles of gold or silver or titanium, semiconductor metal oxides, metal oxides, carbon particles, “quantum dots” with specific fluorescence or light absorption properties, and / or dielectric or conductive materials .
  • Magnetic materials such as superparamagnetic, ferrimagnetic, ferromagnetic or antiferromagnetic materials, or even conductive or semiconductor materials are very particularly suitable for the invention.
  • the particles essentially consisting of silicon oxide or silica or comprising a silica shell are particularly advantageous.
  • This mineral part can either be trapped in the heart of the colloidal particles constituting the colloidal chain, or present on their surface.
  • a metal layer on the surface of the particles.
  • this layer can be obtained by a process argentic type deposit, as is known to many in the art (see for example DNA-templated assembly and electrode attachment ofa conducting silver wire, E. Braun, Y. Eichen, U. Sivan, GY Ben-Yosph, Nature, 391, 775-778 (1998)).
  • organic part it can also be very diverse, and in particular comprise, by way of example, vegetable oils, of petroleum or synthetic origin, various polymers such as derivatives of acrylamide, polystyrene, polycarbonate, crosslinked or not, and more generally all the materials used to form latexes.
  • colloidal particles comprising an inorganic core, enveloped by an organic layer of polymer type such as, for example, polymers of polystyrene, polycarbonate, or derived from monomers of acrylic type such as N-isopropylacrylamide, Glycidyl acrylate or methacrylate, 2-hydroxyethylmethacrylate (HEMA), or ethylene dimethacrylate (EDMA). It can also be polymethylmethacrylate.
  • polymer type such as, for example, polymers of polystyrene, polycarbonate, or derived from monomers of acrylic type such as N-isopropylacrylamide, Glycidyl acrylate or methacrylate, 2-hydroxyethylmethacrylate (HEMA), or ethylene dimethacrylate (EDMA). It can also be polymethylmethacrylate.
  • HEMA 2-hydroxyethylmethacrylate
  • EDMA ethylene dimethacrylate
  • An organic envelope is particularly advantageous insofar as it offers, via the
  • reactive functions can be used as surface reactive functions. They may be, by way of example and without limitation, carboxylic, amine, alcohol, thiol functions, polymerizable functions such as double or triple bonds, in particular the allyl or acrylic functions, or alternatively polyols, hydrazines, epoxides. They can also be ligands of biological type, such as biotin, streptavidin, avidin, digoxygenin, antidigoxygenin, and more generally antibodies or antigens commonly used as grafting sites in biology or else strong binding sites for transition metals, such as "histidine cages" for nickel.
  • the assemblies of colloidal particles claimed are organized linearly so as to form an irreversible chain or a set of irreversible chains of colloidal particles
  • the term “irreversible” is intended to characterize the inability of the linear chains of the colloidal particles to loosen spontaneously and / or at short notice in the absence of an external field.
  • chains of particles whose linear organization requires the permanent maintenance of an external, magnetic or electric field are excluded from the field of the invention.
  • the cohesion between the particles can be in a preferred version, maintained by covalent links between said particles, if necessary resulting from a bridging using molecules or macromolecules.
  • This covalent bond can bring into play specific interactions either directly between said particles or between particles and molecules or macromolecules, via reactive functions present on the surface of these particles.
  • the reactive functions can be amine, carboxylic acid, alcohol, aldehyde, thiol, epoxide, hydrazine and / or halogen atoms.
  • the constitution and the maintenance of a linear organization between the colloidal particles can also bring into play electrostatic, hydrophobic or Van der Waals interactions. It is also possible, to associate the colloidal particles with one another, to bring into play specific interactions between said particles, different from those exerted with respect to the species to be analyzed or separate, either directly or through other molecules or macromolecules.
  • the claimed particle assembly carries at least one recognition site for a species, and preferably several recognition sites of at least one given type.
  • recognition site is meant a molecule, an ion, a surface element, or even a specific portion of a molecule or an ion, capable of giving rise to an attractive interaction or to a chemical reaction with a particular species. or a particular category of species.
  • recognition sites can be carried by the same chain or on separate chains in the case where a set of chains is implemented.
  • the number of types of sites can in particular be greater than 5 or 10, or even in certain applications such as for example DNA or protein "chips", from several hundreds to several tens of thousands.
  • the recognition sites characterizing the colloidal chains according to the invention can be chosen, in a privileged manner, from nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides), or their synthetic analogues (such as PNA, LNA, thiolated or methylated oligonucleotides), peptides , polypeptides, proteins, protein complexes, proteoglycans, polysaccharides. They can also be chosen from gene fragments, antibodies, antigens, enzymes or parts of enzymes, or parts of biologically active proteins, epitopes, haptens.
  • the type of recognition site considered for the detection and / or assay of a species is different from the specific ligands involved for their part in the permanent organization of colloidal particles in the form of chain (s ).
  • a chain of colloidal particles whose linear assembly would be ensured by the covalent coupling of a pair of ligands to the image for example of the biotin / avidin couple, and which would not otherwise be carrying at least one recognition site other than the specific ligands of the pair considered, namely in the example above biotin or avidin.
  • the recognition sites present on the claimed particle chains can also be chosen from chemical functions capable of specifically recognizing other chemical species, for example by binding to them (such as, for example, crown ethers capable of binding transition metals or vice versa), or by reacting with them (like, again by way of example, trypsins or alphachymotrypsins, capable of digesting proteins). They can also be constituted by specific ligands of metals, molecular fingerprints, catalytic sites, hydrophobic groups or more generally the functionalities used in chromatography to give columns a specific affinity for certain species.
  • the recognition sites present on the claimed particle chains can be chosen from compounds comprising aromatic or heterocyclic chemical functions, or sites capable of giving rise to hydrogen bonds.
  • the term “species” means molecules or macromolecules, particles, atoms, ions, objects of natural or artificial organic origin, such as nucleic acids, proteins, enzymes, antibodies, antigens, peptides, polypeptides, haptens, polysaccharides, proteoglycans, organelles, viruses, cells, sets of cells, microorganisms, colloids. It can also be nano- or micro-particles of natural or artificial origin, organic or organomineral molecules, drugs, drugs, pollutants.
  • a chain or a set of colloidal chains according to the invention carries at least two distinct types of recognition sites.
  • a completely unique advantage of the colloidal chains according to the invention is that, by their linear nature, they can carry, along their skeleton, different types of recognition sites. According to a preferred and very specific variant of the invention, these different types of sites are arranged in a predetermined order (or sequence) along the colloidal chain (s) considered. Given the variety of recognition sites accessible, the ability to distinguish colloidal chains carrying the same recognition sites in a different order allows a much richer combination than traditional colloidal particles, which cannot involve sequences.
  • the colloidal chains according to the invention have a better surface / volume ratio, for equal particle volume.
  • the colloidal chains by attaching the colloidal chains to a flat surface and / or within a channel, there is a larger active surface compared to recognition sites deposited on a surface, and this active surface can in particular extend over several tens of microns within said channel. This aspect of the invention is discussed in more detail in the description below.
  • the colloidal chains according to the invention also carry one or more identical or different markers, in particular useful for their detection.
  • markers of this type are known to those skilled in the art.
  • a particularly advantageous family is that of markers capable of interacting with electromagnetic radiation and, in particular, with visible, ultraviolet or infrared light, or else of emitting light under the action of a certain stimulus.
  • colloidal chains according to the invention carrying molecules capable of electrochemical reactions (such as, for example, hydroquinone and its derivatives), electroluminescent effects or chemiluminescence (electroactive compounds or chemoactive).
  • electrochemical reactions such as, for example, hydroquinone and its derivatives
  • electroluminescent effects or chemiluminescence (electroactive compounds or chemoactive).
  • a certain number of luminescent markers based on horseradish peroxidase are well known to those skilled in the art and can be used in the context of the invention.
  • the colloidal chains according to the invention in contrast to traditional colloidal particles, lend themselves to a fixation of one or more markers, identical or different.
  • the colloidal chains according to the invention may further carry on their surface molecules capable of avoiding non-specific adsorption phenomena.
  • Such molecules are well known to those skilled in the art. They may in particular be hydrophilic polymers such as polyxyethylene, polypropylene glycol, polysaccharides and in particular dextran or else polyacrylamide, or hydrophilic polymers of acrylamide, such as "Duramide", poly-N -acryloylamino-propanol, poly-N-acryloylaminoethanol, polyvinyl alcohol, polyvinyl-pyrrolidone, polydimethylacrylamide or copolymers of dimethylacrylamide and allyl-glycidyl ether.
  • Such polymers can be grafted onto the surface of the colloidal chains according to the invention either during the preparation of the initial particles, or after the formation of said chains, using reactive functions integrated into the surface of said particles, or by direct adsorption.
  • the sets of colloidal chains characterized in that they are distributed in several colloidal chains, each chain carrying a given type of recognition sites or reactive function and if necessary at least a given type of marker.
  • the colloidal chains in said assembly have a polydispersity in length of less than 1.5, and preferably less than 1.2. Polydispersities are understood as mass averages.
  • the length of the colloidal chains it is possible to use the length of the colloidal chains, as a criterion for differentiating between two subfamilies, and therefore to use, within a set of colloidal chains, several subfamilies of colloidal chains of different lengths, and essentially without overlapping of the size distribution between the different sub-families.
  • a correlation is established between the size of a colloidal chain and the type or types of recognition sites which it carries.
  • a second object of the invention is a process useful for preparing an assembly of colloidal particles as claimed, characterized in that it comprises at least:
  • this contact consists in migrating said agent in the vicinity of said objects.
  • the first step can be carried out by applying, temporarily or permanently, to the colloidal particles an electric or magnetic field.
  • the superparamagnetic particles are particularly advantageous.
  • the field used to align the colloidal particles is essentially uniform and perpendicular to said faces.
  • the field is parallel to the axis of the channel in which the alignment is carried out or perpendicular both to this axis and to the smallest dimension of its section, if it is a parallelepiped channel.
  • a first protocol consists in stabilizing colloidal superparamagnetic particles with a bridging agent of the polymer type, and in particular a polyelectrolyte, for example of the polyacrylic acid type.
  • a bridging agent of the polymer type and in particular a polyelectrolyte, for example of the polyacrylic acid type.
  • the particles exhibit short-range steric repulsion due to the polymer chains.
  • certain chains can cross this steric barrier, and come to effect a bridging between the particles, which make their association essentially irreversible or at least with a very long lifespan.
  • An advantage of 0 polyelectrolytes, in addition to their ability to interact strongly with particles of opposite charge, is that they can be brought into contact with the colloidal chains via an electric field.
  • a second protocol involves assembling the particles in columns using an external field within a cell having a semi-permeable wall and the diffusion, through this wall, of a chemical agent capable of crosslinking the particles between them. It is also possible to use particles which bind together irreversibly under the simple action of an external field, and without the need to involve adjuvant molecules. Examples of this embodiment are given in Examples 8 and 9. This cohesion is interpreted as the consequence of hydrophobic interactions between the particles, which can come into play after crossing a barrier of repulsive potential under the action of the external field.
  • the alignment of the particles can be made irreversible by using electrostatic interactions: we can, for example, organize in a magnetic field negatively charged magnetic particles (for example, carboxylated) into filaments, then put them in the presence of polycations (for example, using an electric field moving them in the opposite direction): polycations, such as, for example, poly-lysine or poly-histidine, bind to the particles and bridge them irreversibly, effecting a "Charge inversion" which transforms the anionic reversible chain into a cationic irreversible chain. Examples of such modes of implementation are given in Example 12. The process can be repeated with a polyanion, such as polyacrylic or polyglutamic acid, which performs a second charge reversal.
  • a polyanion such as polyacrylic or polyglutamic acid
  • this second charge inversion can be obtained with a nucleic acid, which will play the role of recognition site at the same time, and will therefore transform the simple irreversible colloidal chain into the colloidal chain according to the invention, that is to say carrying sites of recognition.
  • a nucleic acid which will play the role of recognition site at the same time, and will therefore transform the simple irreversible colloidal chain into the colloidal chain according to the invention, that is to say carrying sites of recognition.
  • the claimed method comprises at least:
  • a photochemical reaction can also be used indirectly.
  • a mixture of magnetic colloidal particles carrying carboxylic functions, polyamine chains in neutral form (for example, poly-lysine at a pH greater than 10.2), and orthonitrobenzyl or more generally may be constituted.
  • compounds comprising nitro or nitroso groups see for example H. Morrisson, The chemistry of the Nitro and Nitroso groups, Feuer H. Ed., Interscience, New York, 1969, part I, chapter 4, or R. Bressauer, JP , Paris, in Advances in Photochemistry, WA Noys, GS Hammond, JN Pitts binds, Interscience, New York, 1963, p. 275, or, RW Yip et al., J. Phys.
  • the claimed process can be implemented in a microfluidic cell comprising, in addition to a channel 1, in which the assembly of the colloidal particles or their functionalization takes place, one or more additional supply channels.
  • the organization of the colloidal particles in a chain can be carried out on particles previously carrying recognition sites and / or identical or different markers, as in Example 8 or, on the contrary, on non-functionalized particles, as in the examples 6 and 7.
  • the different particles carrying identical or different recognition sites and / or identical or different markers are organized to constitute said linear objects in a predetermined order.
  • the particles organized in linear chains are provided with recognition sites and possibly with markers after constitution of said objects.
  • colloidal particles used for the separation of the colloidal chains naturally have the specificities discussed above.
  • the third object of the invention is a surface element carrying a linear assembly of colloidal particles according to the invention.
  • the extension of these colloidal chains above the surface makes it possible to significantly increase, on the one hand, the specific surface for recognition and, on the other hand, the volume of supernatant solution brought into contact with the targets.
  • the active area of said colloidal chains is greater than the area of the surface element carrying said chains and, preferably, by a factor of at least 4.
  • the specific surface is 12 square micrometers per square micrometer of projected surface.
  • the colloidal chains are fixed to the surface by one of their ends.
  • This fixation can be obtained by creating a covalent bond between the chains and the surface, by bridging with molecules or macromolecules and / or by electrostatic, hydrophobic or Van der Waals interactions.
  • We can also envisage specific interactions, different from those between recognition sites and species.
  • a “colloidal brush” is formed.
  • An example of such a surface is given in Example 5.
  • This brush can be actively extended within the supernatant solution, for example by applying a magnetic field perpendicular to the surface of the "chip” if the chains have magnetic materials.
  • the surface comprises at least two distinct domains comprising colloidal chains carrying different recognition sites.
  • Various methods can be used to form load-bearing surfaces of a linear assembly according to the invention.
  • these methods must include the following steps: - grafting on colloid chains or on at least some of the particles constituting said chains, of recognition sites, and
  • the step of fixing the colloidal chains to the surface is done in the presence of an external field capable of aligning said chains.
  • an electric field could be used for this purpose.
  • they carry a magnetic dipole moment or a magnetic polarizability we can use a magnetic field.
  • said field has a multiplicity of local gradients, which direct the chains to predetermined locations on the surface.
  • these methods can also include a step of incorporating markers into said chains.
  • the grafting on the surface can be prior, simultaneous or posterior to the establishment of the recognition sites, posterior, simultaneous or prior to the establishment of the markers.
  • the placement of markers, if this option is chosen, may be later, simultaneous or earlier than that of the recognition sites.
  • the assembly of the colloidal particles into chains can be prior to or simultaneous with the grafting of these onto the surface.
  • the second option is preferred, as it decreases the number of steps required to obtain the final surface.
  • the invention also relates to a hybridization network comprising a surface element carrying colloidal chains according to the invention.
  • This network can be low density, medium density or high density.
  • These networks Hybridization deposited on a surface are generally designated by the name of "DNA chips”, “oligonucleotide chips” or “protein chips”.
  • the chains are grouped on the surface element considered in a multiplicity of distinct domains.
  • said domains occupy predetermined or identifiable positions on said surface.
  • at least two distinct domains comprise colloidal threads carrying different recognition sites.
  • the “chips” made from colloidal chains according to the invention have many advantages over traditional chips: on the one hand, their specific surface is increased, which increases the sensitivity, in particular in the event of competition with ligands not specific.
  • the sample volume, and therefore the number of species contained in the sample placed in the immediate vicinity of the recognition sites, is also considerably increased, which increases the kinetics and the sensitivity.
  • magnetic colloidal chains or more generally of colloidal chains sensitive to an external field it is possible to agitate these colloidal chains with respect to the surrounding medium, for example by subjecting them to an oscillating, magnetic or electric external field , which accelerates the kinetics of hybridization.
  • colloidal chains according to the invention of the type of those sensitive to an external field, also makes it possible to obtain more reproducible networks: in fact, the colloidal chains can be calibrated in length, and their physical properties of self -organization impose a regular and predefined distribution on the whole surface of the domain.
  • the grafting of the recognition sites onto the filaments being carried out in “batch”, it can be better controlled than in the case of deposition or Traditional "spotting”, and can be subject to quality control before depositing on the surface.
  • microfluidic cell is meant a device comprising a channel or a set of channels, one of the dimensions of which is between 100 nm and 1 mm, and which allows the transport of fluids.
  • said chains are organized within the channel into a multiplicity of distinct domains.
  • said chains are fixed to one of the faces of the channel.
  • the colloidal chains according to the invention can also be used in a chromatography, electrochromatography or affinity electrophoresis device in particular in order to act there as a separation matrix.
  • the analyzes contained in a sample are introduced into said device. These analyzes are transported there within a channel, by an appropriate field (pressure field for chromatography, electric field for electrophoresis or electrochromatography).
  • the different analytes interact differently with the recognition sites present on the colloidal chains, and are therefore retained or more or less delayed. It is then possible to detect, by means well known to those skilled in the art (such as fluorescence, UV absorption, refractometry, electrochemistry, etc.), the different analytes after or during their passage between the colloid chains.
  • the differences in passage time provide information on the different affinities of the analytes with the colloid chains and, if necessary, on their nature. This method is particularly well suited to microfluidic systems, because of the most common dimensions of the colloidal chains according to the invention, in the micronic range.
  • the colloid chains according to the invention can be used as "microreactors".
  • the recognition sites are catalytic sites, which make it possible to activate reactions with a very large surface / volume ratio.
  • the colloidal chains can for example be easily recovered by centrifugation or by magnetic sorting, and thus offer a good compromise between the dissolved catalysts, which offer a very good dispersion but are difficult to recover, and the solid catalysts , which are easy to recycle by washing but little dispersed.
  • An exemplary embodiment of a microreactor based on colloidal chains according to the invention is given in Example 13.
  • the claimed colloidal chains used as microreactors are attached to a surface, which makes it possible to exchange the reagents and to collect the reaction products as easily as with a solid catalyst, but with mobility and much greater dispersion of reconnaissance sites.
  • the colloid chains according to the invention are also advantageous for applications of combinatorial chemistry.
  • colloidal chains carrying enzymes as catalysts are particularly advantageous for combinatorial chemistry or diagnosis.
  • the subject of the invention is also a micro-container or molecular recognition device, comprising colloidal chains according to the invention or a surface carrying such colloidal chains.
  • the colloidal chains according to the invention prove to be particularly advantageous for a large number of applications, such as the analysis, isolation and / or preparation of species.
  • the present invention also relates to a method of diagnosis and / or analysis, separation, purification, assay or ex vivo identification of at least one species, using at least one particle assembly as claimed.
  • the species considered are those identified previously. These diagnostic and / or analysis methods can in particular be implemented according to the protocol comprising at least the steps consisting in: a) implementing an assembly of colloidal particles within a channel or a container; b) bringing said assembly into contact with at least one species to be detected, separated and / or measured; and c) implementing means for detecting the possible hybridization of the species considered with said assembly.
  • the process further comprises a washing step during which certain products contained in the sample and which have not hybridized with the chains are eliminated or during which the products which have reacted with said chains are recovered.
  • hybridization means any interaction in which a species specifically binds with a recognition site.
  • the chains of colloidal particles can be arranged in the form of distinct zones composed of several chains within a channel or a surface.
  • the zone containing said colloidal chains is generally crossed by a fluid containing at least one species to be analyzed.
  • the invention is particularly advantageous for this type of operation: in fact, during washing, the colloidal chains can lie down and thus offer very little resistance to flow, allowing easy and rapid washing. As soon as the flow stops, they can straighten (this straightening can optionally be activated by a magnetic field, if the colloidal chains are magnetic) and occupy a large volume again. It is thus possible to combine the ease of washing open tubes, with the density of sites obtained with gels, but without the high resistance to flow which these present.
  • step c it is preferable to use fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, light absorption, surface plasmon resonance, radioactivity. It is also possible to use a detection method involving a current measurement, for example in one or more circuits included in the molecular recognition device, in the vicinity of the colloidal chains. This latter variant is particularly suited to the case of colloidal chains conducting the current, or to those involving recognition sites capable of leading to products detectable by an electrochemical reaction or a cyclic amperometry method. One can also use one or more elements sensitive to the magnetic field or a change in magnetic field. This latter variant is particularly suitable for colloidal chains endowed with magnetic properties.
  • the detection can be carried out in situ, within the channel or the container in which the hybridization takes place or more generally the interaction between certain species contained in a fluid and the recognition sites carried by the colloidal chains according to the invention.
  • this detection can be carried out in another device, after the hybridization or interaction phase.
  • the hybridization networks in accordance with the invention can be used in a manner comparable to conventional “DNA chips” or “protein chips”, by first carrying out the hybridization in a hybridization chamber, then by performing detection in a chip reader.
  • these can be organized in relatively compact zones (typically circular) or "spots", or on the contrary in bands, within a channel or on a surface.
  • the colloidal chains according to the invention can be used for diagnosis; research and / or preparation of molecules or macromolecules, particles, atoms, ions, objects of natural or artificial organic origin, such as biologically active species such as nucleic acids, proteins, enzymes, antibodies, peptides, polypeptides, polysaccharides, proteoglycans, organelles, cancer cells, rare cells, epithelial cells, endothelial cells, cells for prenatal diagnosis, GMOs, pathogenic cells, viruses, antibodies, microorganisms; the search for chemical active ingredients such as toxic products, drugs, pollutants; recognition of plant animal varieties or microorganisms; detection of mutations; the search for allergies; genotyping; the search for genes involved in diseases; research and / or preparation of reaction products from combinatorial chemistry protocols.
  • biologically active species such as nucleic acids, proteins, enzymes, antibodies, peptides, polypeptides, polysaccharides, proteoglycans, organelles, cancer cells, rare cells, epithelial
  • Figure 1 a Example of colloidal chains of the flexible “pearl necklace” type bridged with polyacrylic acid, irreversibly from magnetic particles of average diameter 1, 3 micrometers plus or minus 0.3 micrometers, prepared according to the protocol described in example 1.
  • Figure 1b Example of rigid colloidal chains of the “column” type and semi-flexible colloidal chains of the “pearl necklace” type, bridged by polyacrylic acid, irreversibly from magnetic particles of diameter 1.3 micrometers plus or minus 0.3 micrometers, prepared according to the protocol described in Example 1.
  • Figure 1 c Example of semi-flexible colloidal chains of the monodisperse “pearl necklace” type 70 micrometers long, irreversibly organized, according to the protocol described in Example 2.
  • Figure 2a Example of colloidal chains bridged with poly-lysine, prepared according to Example 3.
  • Figure 2b Example of colloidal chains bridged by poly-lysine and attached to a surface by their ends, prepared according to Example 4.
  • Figure 3 Example of colloidal chains carrying DNA molecules: a / chains carrying a DNA molecule per chain on average, prepared according to Example 6; b: colloidal chain carrying a uniform cover of “Phi X 174” DNA, prepared according to Example 7.
  • FIG. 4 Colloidal chains carrying antibodies: a / colloidal chains carrying antibodies "anti-mouse", prepared according to Example 8; b / colloidal chains prepared from beads of 1 micrometer in diameter, carrying streptavidin, prepared according to Example 9a;
  • Figure 5 Protease enzymatic activity of an assembly of colloidal particles according to the invention, prepared according to Example 13 and carrying trypsin recognition sites.
  • FIG. 6 Capture of erythrocyte cells carrying a biotin site within a microchannel comprising a surface carrying assemblies of colloidal particles according to the invention carrying streptavidin recognition sites prepared according to Example 14.
  • Example 1
  • a / Magnetic beads are prepared consisting of an inverse ferrofluid emulsion based on Octane (Rhône Poulenc), stabilized in water with sodium dodecyl sulfate, according to the protocol described in "Emulsions: theory and practice ", Becher, P., Rheinhold, New York, 1965).
  • a particle size of 1.3 microns plus or minus 0.3 microns is selected by fractional crystallization, according to the protocol described in Bibette, J. Colloid Interface Sci., 147, 474. (1991).
  • commercially available magnetic particles can be used directly, such as those distributed by the companies Bangs Laboratoires, Estapor, Merck, Eurolab, Prolabo, Uptima or Polysciences.
  • the emulsion is washed several times (at least 5 times) with a solution of Nonyl Phenol Ethoxylate or NP10 (Sigma Aldrich) at 0.1%. Washing is conveniently carried out by collecting the magnetic drops at the bottom of the container with a magnet, replacing the supernatant with the washing solution, and shaking vigorously (it is possible to use sonication in the event of slight aggregation of the particles) after having removed the magnet. The operation is repeated as many times as necessary. At the end of the washing, an amount of NP10 solution is added in order to reach a particle concentration of the order of 0.1% by volume fraction.
  • NP10 Sigma Aldrich
  • step d instead of using a test tube, the solution is introduced into a channel of uniform thickness 100 micrometers, prepared by molding polydimethylsiloxane according to Xia, Y. Xia, GM Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 550 (1998), then a magnetic field of 50 mT is applied, perpendicular to the thickness of the channel. After removal of the magnetic field, semi-flexible chains of uniform length equal to the thickness of the channel (70 micrometers) are obtained (see FIG. 1c) (observation conditions identical to those of Example 1).
  • Example 3 Example 3:
  • a / Magnetic particles are prepared according to a / of Example 1.
  • Poly-L-lysine (0.1% w / v Sigma Aldrich solution) is introduced, by electrophoresis, into the channel.
  • poly-L-lysine is introduced so that its concentration in the channel is 0.05% wt.
  • two electrodes are placed in two reservoirs located at the ends of the channel.
  • the poly-lysine is introduced in the form of a solution into one of the reservoirs, and the electrode situated in this reservoir is brought to a positive potential with respect to that of the electrode situated in the other reservoir, so as to maintain within from the channel an electric field of a few V / cm.
  • Irreversible colloidal chains such as those observed in Figure 2a are obtained.
  • a / Magnetic particles are prepared or obtained as in step a of Example 1.
  • b / The emulsion is washed several times (at least 5 times) with a solution of Nonyl Phenol Ethoxylate or NP10 (Sigma Aldrich) at 0.1%. Washing is conveniently carried out by collecting the magnetic drops at the bottom of the container with a magnet, replacing the supernatant with the washing solution, and shaking vigorously (it is possible to use sonication in the event of slight aggregation of the particles) after having removed the magnet. The operation is repeated as many times as necessary. At the end of the washing, an amount of NP10 solution is added in order to reach a particle concentration of the order of 5% by volume fraction.
  • the continuous phase is replaced by a mixture consisting of NP10 0.1% wt, poly-L-lysine 0.89% wt.
  • the magnetic beads are collected at the bottom of the tube using a magnet and the supernatant is removed, which is replaced by the desired mixture.
  • the emulsion is introduced into a channel.
  • a magnetic field of 50 mT is applied, perpendicular to the thickness of the channel. After removing the magnetic field, a brush of calibrated chains is obtained attached to the bottom wall of the channel.
  • a / Magnetic particles are prepared or obtained as in step a of Example 1.
  • a channel of uniform thickness is prepared, by molding of polydimethylsiloxane according to Xia, Y. Xia, GM Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 550 (1998).
  • This channel is filled with a solution of polydimethylacrylamide at 0.15% by mass, and allowed to incubate for 40 min.
  • c / The channel is rinsed with a solution of Triton X405 at 2.1 g / L, then it is filled with the suspension of magnetic particles, prepared in a.
  • the channel is placed in the center of a coil, and after balancing the pressures at the ends of the channel in order to avoid parasitic flows, a sufficient magnetic field is applied to create the columns (of the order of one to a few tens of mT), perpendicular to the thickness of the channel. The field is maintained for one hour.
  • the colloid chains appear dark, and the DNAs are labeled with a fluorescent marker (YOYO-1, Molecular Probes; a YOYO molecule for ten base pairs) appear in clear (measurement carried out by epifluorescence on a Zeiss Axiovert 100 microscope equipped with a mercury lamp for excitation and a 100X objective).
  • a fluorescent marker YOYO-1, Molecular Probes; a YOYO molecule for ten base pairs
  • Example 6 The procedure is as in Example 6, but using a different nature and concentration of DNA for step c.
  • a mixture of short “PhiX 174” type DNAs ( ⁇ X 174 RF DNA / Hae III Fragments; Gibco BRL) is used.
  • the DNA concentration is 0.5 ⁇ g / mL, that of the poly-L-lysine is 0.002% wt.
  • the colloidal chains are then washed, pelletizing them in a tube using a magnet, and replacing the supernatant with a solution identical to that used in b of Example 6.
  • the conditions of observation are the same as for Example 6, and lead to colloidal chains uniformly covered with DNA (Fig. 3b)
  • a / A microfluidic device comprising a channel of uniform thickness, by molding of polydimethylsiloxane according to Xia, Y. Xia, G. M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 550 (1998).
  • Uptibeads anti-mouse beads (0.3 ⁇ m; Uptima), at the concentration of the original solution as sold by the manufacturer, are sonicated to undo the aggregates present in the initial sample, and introduced into the channel of the microfluidic device prepared in a.
  • This device is itself placed in the center of a coil so as to create within the channel a substantially uniform magnetic field oriented along its thickness.
  • the device surrounded by its coil is placed on an AXIOVERT 100 Zeiss microscopy, and viewed using a 100X, 1.3 immersion objective. and a Cohu CCD camera.
  • a magnetic field of 50 mTesIa is applied. When the magnetic field is eliminated, the particles remain grouped in the form of columns fixed to the lower surface of the channel by one of their ends, and which can rotate and orient themselves randomly around their fixing point (figure a).
  • HEMA-co-EDMA particles are prepared by emulsion polymerization, then activated with hydrazine, according to the protocol described in Horak et al., Biotechnol. Progr., 15 (1999).
  • the oxidase activity is measured using a test based on the oxidation of D-galactose, as described in Avidad et al., J. Biol. Chem., 237, 2736 (1962)).
  • the unreacted hydrazine groups are then blocked by incubating the particles in a 0.2 M acetaldehyde solution in 0.1 M acetate buffer, pH 5.5 for 24 h. Finally, the particles are balanced in a 0.1 M phosphate buffer solution, pH6, 2 mM CuSO4.
  • a solution of colloidal magnetic particles is prepared, for example HEMA-co-EDMA particles prepared according to Horak et al., Botechnol. Progr., 15 (1999), or Ademtech particles.
  • the unreacted hydrazine groups are then blocked by incubating the particles in a 0.2 M acetaldehyde solution in 0.1 M acetate buffer, pH 5.5 for 24 h. Finally, the colloid chains are balanced in a 0.1 M phosphate buffer solution, pH6, 2 mM CuSO4.
  • the oxidase activity is demonstrated by spectrophotometric measurement using a test based on the oxidation of D-galactose, as described in Avidad et al., J. Biol. Chem., 237, 2736 (1962).
  • Magnetic particle chains are prepared according to Example 1.
  • the chains are rinsed and then resuspended in a phosphate buffer pH 7.3, added with Nonyl Phenol in an amount of 1 mg of magnetic particles in 400 microliters of buffer (solution A).
  • the chains are sedimented delicately, keeping the magnet at least 2 cm from the tube.
  • the trypsin is then immobilized according to a protocol derived from that described in the work by Greg T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" 1996, Académie Press, London.
  • a solution B of 30 mg of ethylene carbodiimide (EDC) in 500 microliters of phosphate buffer pH 7.3 is also prepared.
  • a solution C of 5 mg of S-NHS (N-hydroxysuccinimide) in 400 microliters of phosphate buffer pH 7.3 is also prepared.
  • a solution D is prepared: 7.5 mg of TPCK trypsin is dissolved in 50 microliters of phosphate buffer pH7, add 5 microliters of a benzamidine solution at 16 micrograms per milliliter
  • Solution D is immediately added to solution A, without a magnetic field and with gentle agitation with a Gilson pipette, the tip of the cone of which has been cut to reduce shearing.
  • Solution B is then added, followed by solution C, still with gentle agitation. It is left to incubate for 3 hours, then the solution is washed by 2 or 3 exchanges of buffer with a phosphate buffer pH 7.3 Nonyl phenol identical to that of solution A. For sedimentation, the procedure is carried out as described for the preparation of the solution A.
  • the trypsin activity is measured using a colorimetric test according to the protocol described in H. F. Gaertner and A.J. Puigserver, Enzyme Micro. Technol. 14, 150 (1992) and P.S. Gravet et al. Int. Biochem. 23, 1085 (1991).
  • BAPNA benzoyl-arginine p-nitroaniline HCI
  • a brush of colloidal chains carrying streptavidin functions is prepared as described in Example 9.
  • b / human red blood cells are marked with biotin according to the following protocol:

Abstract

La présente invention a pour objet principal un assemblage de particules colloïdales sous la forme d'une ou plusieurs chaînes, caractérisé en ce que lesdites chaînes sont assemblées de manière irréversible et sont porteuses d'au moins un site de reconnaissance pour une espèce, ledit site étant différent des sites impliqués dans l'organisation linéaire desdites particules. Elle vise également un procédé de préparation d'un tel assemblage et l'utilisation de cet assemblage, notamment à des fins de détection et/ou de dosage d'au moins une espèce dans un fluide. L'invention concerne également un élément de surface fonctionnalisé à l'aide d'un assemblage de chaînes colloïdales et un réseau d'hybridation comportant un tel élément de surface.

Description

CHAINES COLLOÏDALES IRREVERSIBLES PORTEUGES DE SITES DE RECONNAISSANCE
L'invention a pour objet principal des particules colloïdales magnétiques organisées sous forme de chaînes colloïdales permanentes. Elle vise également l'utilisation de ces chaînes pour détecter et/ou analyser des espèces spécifiques présentes dans un fluide.
Des méthodes pour le tri et/ou l'analyse d'espèces contenues dans un échantillon liquide sont déjà connues. De manière générale, elles utilisent soit des réseaux d'hybridation disposés sur des surfaces à l'image des « puces » à ADN ou à protéines, soit des microbilles, soit une combinaison de ces deux approches. Toutefois, comme il ressort de l'analyse ci-après, ces techniques présentent des limitations.
Dans les « puces », les ligands biologiques considérés (ADN, oligonucléotides, protéines) sont déposés ou synthétisés in situ en des « spots » prédéterminés sur une surface. Chaque spot a une surface typique de 100 microns par 100 microns ou moins, ce qui permet de disposer d'un grand nombre de sites de reconnaissance sur une surface limitée, et donc d'effectuer un grand nombre d'analyses moléculaires avec une quantité d'échantillon réduite et en un temps limité. De tels systèmes, ainsi que des moyens pour les préparer, sont décrits par exemple dans US pat. 5,744,305 (Affymetrix), Schena et coll., Science, 270, 467-470, 1995. Toutefois, ces puces présentent une sensibilité qui demeure insuffisante pour certaines applications. Qui plus est, leur cinétique d'hybridation est significativement ralentie comparativement à une hybridation classique en solution. Enfin, elles présentent un défaut de reproductibilité. En l'occurrence, ces inconvénients reposent pour une large part sur des aspects physico-chimiques des puces et des mécanismes d'hybridation (voir p. ex. M. S. Shchepinov, S.C. Case-Green, E.M. Southern, Nucleic Acid Res. 25, 1155-61 (1997))
La seconde méthode considérée consiste à fixer les analytes à tester, en employant un réseau de microsphères disposées sur une surface. Selon cette technique, on peut préparer avantageusement des microsphères porteuses de différentes fonctionnalités accessibles à leur surface. Toutefois, la surface active d'une sphère demeure, bien entendu, du même ordre de grandeur que celle qu'elle occupe sur la surface du dispositif de test. En conséquence, cette méthode ne permet pas donc de gain significatif en termes de sensibilité.
Des microbilles magnétiques ont également été proposées pour l'analyse d'oligonucléotides dans un canal microfluidique. Ces microbilles sont introduites dans un canal, et retenues en un endroit de celui-ci par un champ magnétique localisé : On constitue ainsi localement une zone essentiellement composée par un empilement compact de billes magnétiques. On fait ensuite circuler au travers de cet empilement le liquide contenant les espèces à analyser. L'hybridation de celles-ci est détectée par fluorescence. Grâce à la circulation des espèces, la cinétique est nettement plus rapide qu'avec les « puces » à ADN traditionnelles. Par ailleurs, le système est recyclable, puisqu'en supprimant le champ magnétique les billes retrouvent leur mobilité. Toutefois, les concentrations d'analytes utilisés pour démontrer le principe de la méthode sont nettement supérieures à celles réellement utilisées dans les puces, ce qui suggère que la sensibilité est faible. Ceci peut notamment s'expliquer par l'assemblage compact de billes. Les billes les plus près du détecteur font écran pour la transmission de la lumière vers les autres, et ce sont donc seulement les billes les plus près de la surface qui participent efficacement à la détection.
Enfin, des microsphères sont également utilisées pour identifier ou analyser des espèces, et en particulier des espèces biologiques, dans des dispositions différentes de réseaux disposés sur un surface ou dans un canal microfluidique. Il s'agit en particulier des techniques dites de « tri magnétique », qui peuvent être mises en œuvre de façon analytique ou préparative. Dans une méthode très classique, on met en présence un liquide contenant les espèces à analyser (cellules, ADN, protéines) avec des particules magnétiques. La version actuelle de ces systèmes magnétiques consiste à introduire dans la solution initiale des billes magnétiques porteuses de fonctions spécifiques des cellules à isoler. Après fixation, les billes, et les espèces qui y sont attachées, sont culottées à l'aide d'un aimant tandis que le surnageant est prélevé. Cette méthode est proposée actuellement, essentiellement pour le tri binaire d'objets concentrés. Elle requiert ensuite une analyse en ligne pour produire de l'information. Simple à mettre en œuvre, cette méthode magnétique présente cependant deux limitations importantes : une sélectivité imparfaite et un caractère purement binaire qui imposent tous deux de réitérer les procédures lorsque des espèces pures ou répondant à plusieurs critères sont recherchées. Le défaut de sélectivité trouve tout d'abord son origine dans le drainage du surnageant lors de la « sédimentation » des particules, les billes en mouvement déplaçant avec elles une partie du fluide et donc des objets biologiques environnants. Il faut ensuite prendre en compte les problèmes d'adhésion non-spécifique, la force de pression magnétique contribuant à ancrer fortement aux billes tout objet prisonnier du culot.
Pour sa part, la présente invention vise à proposer un nouvel outil de diagnostic et/ou de préparation, d'identification, d'analyse ou de dosage d'espèces dans un échantillon liquide, permettant de donner satisfaction à la fois en termes de sensibilité, de cinétique et de reproductibilité.
Plus précisément, la présente invention a pour premier objet un assemblage de particules colloïdales sous la forme d'une ou plusieurs chaînes caractérisé en ce que lesdites chaînes sont organisées de manière irréversible et sont porteuses d'au moins un site de reconnaissance pour une espèce, ledit site étant différent des ligands impliqués dans l'organisation linéaire desdites particules.
Au sens de l'invention, on entend par « chaîne de particules colloïdales, ou indifféremment « fil colloïdal » ou « chaîne colloïdale », un assemblage essentiellement linéaire de particules colloïdales. Différentes organisations géométriques de tels assemblages peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention. En particulier, on peut utiliser un assemblage en « collier de perles », dans lequel la largeur de la chaîne est essentiellement celle d'une particule colloïdale ou un assemblage en « colonnes », dans lequel chaque section de la chaîne comporte plusieurs particules.
Les chaînes colloïdales selon l'invention présentent un rapport d'aspect (rapport de la longueur à la plus grande dimension d'une section) significativement supérieur à 1 , typiquement supérieur à 3, et de préférence supérieur à 5. Pour de nombreuses applications, des rapports d'aspects nettement plus élevés, de 10 ou plus, voire supérieur à 100, peuvent toutefois s'avérer avantageux.
Les chaînes colloïdales selon l'invention peuvent être relativement rigides (adoptant essentiellement la forme d'un bâtonnet), semi-rigides (capables de présenter un rayon de courbure comparable à leur longueur), ou flexibles (capables de présenter un rayon de courbure très inférieur à leur longueur). Dans le cas de chaînes flexibles, la longueur dans la description ci-dessus s'entend le long de l'abscisse curvilinéaire de ladite chaîne. Selon une variante privilégiée, elles sont semi-flexibles ou flexibles.
En général, la section des chaînes colloïdales selon l'invention est essentiellement circulaire. Toutefois, elle peut également être de toute autre forme, dans la mesure où la plus grande dimension de cette section reste plus petite que la plus grande longueur de la chaîne colloïdale d'un facteur au moins 3.
Pour certaines applications, il est possible d'utiliser une unique chaîne colloïdale d'un type donné, par analogie à ce qui se pratique déjà pour des molécules individuelles d'ADN, dans les techniques de « molécule unique ». Toutefois, il est généralement préférable d'utiliser un ensemble de chaînes colloïdales.
Au sens de l'invention, on entend par particule colloïdale un objet tridimensionnel compact constitué d'une multitude d'atomes ou de molécules, et susceptible d'être maintenu en suspension dans un fluide. Les dimensions d'une particule colloïdale sont typiquement comprises entre quelques dizaines de nanomètres et quelques microns, plus rarement quelques dizaines de microns. A titre d'exemple, des sphères de latex, des microgels ou des billes magnétiques de dimension micronique ou submicronique, des nanocristaux ou des microcristaux constituent des particules colloïdales selon l'invention. De préférence, de telles particules sont maintenues en suspension par le mouvement Brownien. Cependant, des particules donnant lieu à une sédimentation peuvent aussi être considérées comme colloïdales au sens de l'invention, pourvu qu'il soit possible de les remettre en suspension au moment de leur utilisation, par exemple par agitation ou sonication.
Les particules colloïdales mises en œuvre pour constituer les chaînes de particules colloïdales selon l'invention sont de préférence de forme essentiellement sphérique .
Ces particules colloïdales peuvent être organiques, minérales ou organominérales. Selon une variante préférée elles sont en tout ou partie de nature organique, et de préférence de nature organominérale, c'est à dire présentant à la fois des constituants organiques et des constituants minéraux. De nombreux types de particules organominérales sont disponibles dans le commerce ou connues de l'homme de l'art. Elles permettent avantageusement de combiner des propriétés issues de la partie organique et des propriétés issues de la partie minérale, et donc de construire des chaînes colloïdales selon l'invention dotées de propriétés très diverses. En ce qui concerne la nature chimique de la partie minérale (ou de l'ensemble de la particule si elle est essentiellement minérale), elle peut également être très variée, et comporter notamment des grains métalliques tels que des micro ou nanoparticules d'or ou d'argent ou de titane, des oxydes de métaux semiconducteurs, des oxydes métalliques, des particules de carbone, des « quantum dots » doués de propriétés spécifiques de fluorescence ou d'absorption de la lumière, et/ou des matériaux, diélectriques ou conducteurs. Les matériaux magnétiques, tels que les matériaux superparamagnétiques, ferrimagnetiques, ferromagnétiques ou antiferromagnétiques, ou encore les matériaux conducteurs ou semi-conducteurs conviennent tout particulièrement à l'invention.
Au titre d'oxydes de semi-conducteur, les particules essentiellement constituées d'oxyde de silicium ou de silice ou comportant une enveloppe de silice, sont particulièrement avantageuses.
Cette partie minérale peut être soit emprisonnée au cœur des particules colloïdales constituant la chaîne colloïdale, soit présente à leur surface. Par exemple, pour obtenir des propriétés de conduction, on pourra, selon une première variante privilégiée, disposer d'une couche métallique sur la surface des particules. De façon commode, cette couche peut être obtenue par un procédé de dépôt de type argentique, comme il en est connu de nombreux chez l'homme de l'art (voir par exemple DNA-templated assembly and électrode attachment ofa conducting silver wire, E. Braun, Y. Eichen, U. Sivan, G.Y. Ben-Yosph, Nature, 391 , 775-778 (1998)). Selon une autre variante privilégiée, on pourra inclure au sein de la chaîne colloïdale une fraction significative de grains métalliques ou semi-conducteurs.
Dans le cas particulier d'une partie minérale magnétique, on privilégiera la localisation de celle-ci au cœur des particules colloïdales.
En ce qui concerne la nature chimique de la partie organique, elle peut également être très diverse, et comporter en particulier, à titre d'exemple, des huiles végétales, d'origine pétrolière ou de synthèse, des polymères divers tels que les dérivés d'acrylamide, de polystyrène, de polycarbonate, réticulés ou non, et plus généralement tous les matériaux utilisés pour constituer des latex.
En particulier, conviennent à l'invention des particules colloïdales comportant un cœur minéral, enveloppé par une couche organique de type polymère tels que par exemple, des polymères de type polystyrène, polycarbonate, ou dérivant de monomères de type acrylique comme le N- isopropylacrylamide, I'acrylate ou méthacrylate de glycidyle, le 2- hydroxyethylméthacrylate (HEMA), ou l'éthylène diméthacrylate (EDMA). Il peut également s'agir de polymethylméthacrylate. Une enveloppe organique est particulièrement avantageuse dans la mesure où elle offre, via la présence de ses fonctions organiques de surface, des possibilités de greffage pour des sites de reconnaissance et/ou des composés annexes et des facilités pour l'organisation linéaire desdites particules. Toutes sortes de fonctions réactives, bien connues de l'homme de l'art, peuvent être utilisées en tant que fonctions réactives de surface. Il peut s'agir, à titre d'exemple et de façon non limitative, de fonctions carboxyliques, aminé, alcool, thiol, de fonctions polymérisables comme des doubles ou triples liaisons, en particulier les fonctions allyle ou acrylique, ou encore des polyols, des hydrazines, des époxydes. Il peut également s'agir de ligands de type biologique, tels que la biotine, la streptavidine, l'avidine, la digoxygénine, l'antidigoxygénine, et plus généralement des anticorps ou antigènes couramment utilisés comme sites de greffage en biologie ou encore des sites de liaison forts pour des métaux de transition, tels que les « cages histidines » pour le nickel.
Les assemblages de particules colloïdales revendiquées sont organisées linéairement de manière à former une chaîne irréversible ou un ensemble de chaînes irréversibles de particules colloïdales
Au sens de la présente invention, on entend caractériser par le terme irréversible l'inaptitude des chaînes linéaires des particules colloïdales à se défaire spontanément et/ou à bref délai en l'absence de champ externe. En l'occurrence, sont exclues du domaine de l'invention des chaînes de particules dont l'organisation linéaire requiert le maintien en permanence d'un champ externe, magnétique ou électrique.
Le caractère irréversible des assemblages de particules colloïdales selon l'invention s'entend par contre dans des conditions données de composition du fluide dans lequel elles sont suspendues. Ainsi, de tels assemblages seront considérés comme irréversibles, même s'il est possible de les dissoudre en les diluant dans un liquide de composition ou de pH significativement différent de celui du liquide dans lequel elles ont été formées.
Dans les chaînes colloïdales revendiquées, la cohésion entre les particules peut être dans une version privilégiée, maintenue par des liens covalents entre lesdites particules, le cas échéant résultant d'un pontage à l'aide de molécules ou de macromolécules.
Ce lien covalent peut mettre en jeu des interactions spécifiques soit directement entre lesdites particules soit entre les particules et des molécules ou macromolécules, via des fonctions réactives présentes à la surface de ces particules. Les fonctions réactives peuvent être des fonctions aminé, acide carboxylique, alcool, aldéhyde, thiol, époxyde, hydrazine et/ou des atomes d'halogène.
La constitution et le maintien d'une organisation linéaire entre les particules colloïdales peuvent également mettre en jeu des interactions électrostatiques, hydrophobes ou de Van der Waals. On peut également, pour associer entre elles les particules colloïdales, mettre en jeu des interactions spécifiques entre lesdites particules, différentes de celles exercées vis-à-vis des espèces à analyser ou à séparer, soit directement soit par l'intermédiaire d'autres molécules ou macromolécules.
L'assemblage de particules revendiqué est porteur d'au moins un site de reconnaissance pour une espèce, et de façon privilégiée de plusieurs sites de reconnaissance d'au moins un type donné..
Par site de reconnaissance, on entend une molécule, un ion, un élément de surface, ou encore une portion spécifique d'une molécule ou d'un ion, capable de donner lieu à une interaction attractive ou à une réaction chimique avec une espèce particulière ou une catégorie particulière d'espèces.
Plusieurs types distincts de sites de reconnaissance peuvent être portés par une même chaîne ou sur des chaînes distinctes dans le cas où l'on met en œuvre un ensemble de chaînes. Le nombre de types de sites peut notamment être supérieur à 5 ou à 10, voire dans certaines applications comme par exemple les « puces » à ADN ou à protéines, de plusieurs centaines à plusieurs dizaines de milliers.
Les sites de reconnaissance caractérisant les chaînes colloïdales selon l'invention peuvent être choisis, de façon privilégiée, parmi les acides nucléiques (ADN, ARN, oligonucléotides), ou leurs analogues synthétiques (comme PNA, LNA, oligonucléotides thiolés ou méthylés), les peptides, polypeptides, protéines, complexes protéiques, protéoglycanes, polysaccharides. Ils peuvent également être choisis parmi des fragments de gènes, des anticorps, des antigènes, des enzymes ou parties d'enzymes, ou des parties de protéines biologiquement actives, des épitopes, des haptènes. Toutefois, comme précisé précédemment, le type de site de reconnaissance considéré en vue de la détection et/ou dosage d'une espèce, est différent des ligands spécifiques impliqués pour leur part dans l'organisation permanente des particules colloïdales sous forme de chaîne(s). Est ainsi exclue du domaine de l'invention une chaîne de particules colloïdales dont l'assemblage linéaire serait assuré par le couplage covalent d'un couple de ligands à l'image par exemple du couple biotine/ avidine, et qui ne serait pas par ailleurs porteuse d'au moins un site de reconnaissance autre que les ligands spécifiques du couple considéré, à savoir dans l'exemple ci-dessus biotine ou avidine. Les sites de reconnaissance présents sur les chaînes de particules revendiquées peuvent également être choisis parmi des fonctions chimiques capables de reconnaître de façon spécifique d'autres espèces chimiques, par exemple en se liant à elles (comme, à titre d'exemple, des éthers couronnes capables de lier des métaux de transition ou réciproquement), ou en réagissant avec elles (comme, toujours à titre d'exemple, des trypsines ou alphachymotrypsines, capables de digérer des protéines). Ils peuvent également être constitués par des ligands spécifiques de métaux, des empreintes moléculaires, des sites catalytiques, des groupements hydrophobes ou plus généralement les fonctionnalités utilisées en chromatographie pour donner à des colonnes une affinité spécifique pour certaines espèces. En particulier, les sites de reconnaissance présents sur les chaînes de particules revendiquées peuvent être choisis parmi les composés comprenant des fonctions chimiques aromatiques ou hétérocycliques, ou des sites capables de donner lieu à des liaisons hydrogène.
Au sens de l'invention, on entend par espèces des molécules ou macromolécules, particules, atomes, ions, objets d'origine organique naturelle ou artificielle, tels que des acides nucléiques, des protéines, des enzymes, des anticorps, des antigènes, des peptides, des polypeptides, des haptènes, des polysaccharides, des protéoglycanes, des organelles, des virus, des cellules, des ensembles de cellules, des microorganismes, des colloïdes. Il peut également s'agir de nano- ou micro-particules d'origine naturelle ou artificielle, des molécules organiques ou organominérales, des drogues, des médicaments, des polluants.
Selon une variante privilégiée, une chaîne ou un ensemble de chaînes colloïdales selon l'invention est porteur d'au moins deux types distincts de sites de reconnaissance.
En l'occurrence, un avantage tout à fait unique des chaînes colloïdales selon l'invention est que, de par leur nature linéaire, elles peuvent porter, le long de leur squelette, différents types de sites de reconnaissance. Selon une variante privilégiée et très spécifique de l'invention, ces différents types de sites sont disposés dans un ordre prédéterminé (ou séquence) le long de la ou des chaîne(s) colloïdale(s) considérée(s). Etant donné la variété des sites de reconnaissance accessible, la capacité de distinguer des chaînes colloïdales portant les mêmes sites de reconnaissance dans un ordre différent autorise une combinatoire beaucoup plus riche que les particules colloïdales traditionnelles, qui ne peuvent pas faire intervenir de séquences.
De plus, par rapport à des particules sphériques, les chaînes colloïdales selon l'invention présentent un meilleur rapport surface/volume, à volume de particule égal. En l'occurrence, en attachant les chaînes colloïdales sur une surface plane et/ou au sein d'un canal, on dispose d'une surface active plus grande comparativement à des sites de reconnaissance déposés sur une surface, et cette surface active peut notamment s'étendre sur plusieurs dizaines de microns au sein dudit canal. Cet aspect de l'invention est discuté de manière plus détaillée dans la description ci-après.
Selon un mode préféré, les chaînes colloïdales selon l'invention sont porteuses également d'un ou plusieurs marqueurs identiques ou différents, notamment utiles pour leur détection.
De nombreux marqueurs de ce type sont connus de l'homme de l'art. Une famille particulièrement avantageuse est celle des marqueurs capables d'interagir avec un rayonnement électromagnétique et, en particulier, avec la lumière visible, ultraviolette ou infrarouge, ou encore d'émettre de la lumière sous l'action d'un certain stimulus.
Il peut s'agir de marqueurs capables d'absorber la lumière dans une certaine gamme de longueur d'onde, ou de marqueurs fluorescents ou phosphorescents, tels que des molécules, des complexes moléculaires ou des « quantum dots ». Il peut également être intéressant d'utiliser des chaînes colloïdales selon l'invention, porteuses de molécules capables de réactions électrochimiques (comme, à titre d'exemple, l'hydroquinone et ses dérivés), d'effets électroluminescents ou de chimiluminescence (composés électroactifs ou chimioactifs). A titre d'exemple, un certain nombre de marqueurs luminescents à base de peroxydase de raifort (horseradish peroxydase) sont bien connus de l'homme de l'art et peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Avantageusement, les chaînes colloïdales selon l'invention, par opposition aux particules colloïdales traditionnelles, se prêtent à une fixation de un ou plusieurs marqueurs, identiques ou différents.
Bien entendu, les modes de réalisation décrits ci-dessus peuvent également s'appliquer à des sites de reconnaissance différents ou à une combinaison de sites de reconnaissance et de marqueurs.
Pour certaines applications, en particulier pour l'analyse d'espèces ou de fluides biologiques, il peut être intéressant que les chaînes colloïdales selon l'invention portent en outre sur leur surface des molécules capables d'éviter des phénomènes d'adsorption non spécifiques. De telles molécules sont bien connues de l'homme de l'art. Il peut s'agir en particulier de polymères hydrophiles tels que le polyxyéthylène, le polypropylène glycol, les polysaccharides et en particulier le dextrane ou encore le polyacrylamide, ou des polymères hydrophiles d'acrylamide, tels que le « Duramide », le poly-N-acryloylamino-propanol, le poly- N-acryloylaminoéthanol, l'alcool polyvinylique, la polyvinyl-pyrrolidone, le polydimethylacrylamide ou les copolymères de dimethylacrylamide et d'allyl- glycidyl éther. De tels polymères peuvent être greffés sur la surface des chaînes colloïdales selon l'invention soit au cours de la préparation des particules initiales, soit après la formation desdites chaînes, en utilisant des fonctions réactives intégrées à la surface desdites particules, soit par adsorption directe.
Sont particulièrement intéressants, dans le cadre de l'invention, les ensembles de chaînes colloïdales caractérisés en ce qu'ils se répartissent en plusieurs chaînes colloïdales, chaque chaîne portant un type donné de sites de reconnaissance ou de fonction réactive et le cas échéant au moins un type donné de marqueur.
Selon les applications, on peut utiliser des ensembles de chaînes colloïdales présentant une longueur sensiblement identique ou, au contraire, des longueurs différentes. Selon une variante privilégiée, les chaînes colloïdales dans ledit ensemble présente une polydispersité en longueur inférieure à 1 ,5, et de préférence inférieure à 1 ,2. Les polydispersités s'entendent comme des moyennes en masse. Selon une autre variante privilégiée, on peut utiliser la longueur des chaînes colloïdales, comme critère de différenciation entre deux sous-familles, et donc utiliser, au sein d'un ensemble de chaînes colloïdales, plusieurs sous-familles de chaînes colloïdales de longueurs différentes, et essentiellement sans recouvrement de la distribution de tailles entre les différentes sous-familles. De façon privilégiée, dans cette variante, on établit une corrélation entre la taille d'une chaîne colloïdale et le ou les type(s) de sites de reconnaissances qu'elle porte.
L'invention a pour second objet un procédé utile pour préparer un assemblage de particules colloïdales tel que revendiqué, caractérisé en ce qu'il comprend au moins :
- l'assemblage de particules colloïdales sous forme d'un ou plusieurs objets linéaires, et - la mise en présence desdits objets avec au moins un agent capable de les ponter de façon irréversible.
Selon une variante préférée, cette mise en présence consiste à faire migrer ledit agent au voisinage desdits objets.
En l'occurrence, la première étape peut être réalisée en appliquant, de manière transitoire ou permanente, aux particules colloïdales un champ électrique ou magnétique.
Ainsi, il est possible de conférer à des particules colloïdales en suspension un moment dipolaire, par l'intermédiaire d'un champ externe : les dipôles s'orientent dans la direction du champ, s'attirent le long de l'axe du champ et se repoussent dans la direction perpendiculaire, constituant ainsi des colonnes ou des « colliers de perles ». Selon une variante, on peut utiliser un champ électrique continu ou alternatif, et des particules en suspension dans un milieu, et présentant une polarisabilité électrique différente de celle dudit milieu.
On peut également, selon une variante privilégiée, utiliser des particules magnétiques qu'on aligne dans un champ magnétique. Dans cette vaπante, les particules superparamagnétiques sont particulièrement avantageuses.
Il est particulièrement commode d'effectuer l'alignement des particules colloïdales pour constituer des chaînes colloïdales selon l'invention, au sein d'une cellule microfluidique, et de préférence au sein d'un canal ou d'une chambre présentant au moins deux faces essentiellement parallèles.
En ce qui concerne la direction du champ, différentes géométries sont possibles. Pour obtenir des chaînes colloïdales de longueur uniforme, il est 5. intéressant que le champ servant à aligner les particules colloïdales soit essentiellement uniforme et perpendiculaire auxdites faces. Pour obtenir des chaînes colloïdales de grande longueur, cependant, on peut préférer une configuration dans laquelle le champ est parallèle à une direction dans laquelle la cavité au sein de laquelle s'effectue l'alignement présente une grande dimension. 0 En particulier, il est dans ce cas intéressant que le champ soit parallèle à l'axe du canal dans lequel s'effectue l'alignement ou perpendiculaire à la fois à cet axe et à la plus petite dimension de sa section, s'il s'agit d'un canal parallélépipédique. Dans le cas où le champ est parallèle à l'axe du canal, il peut être intéressant d'ajuster la densité en particules colloïdales, de façon à ce qu'une section dudit 5 canal ne contienne en moyenne qu'un objet selon l'invention ou moins.
En ce qui concerne l'étape visant à rendre irréversible l'alignement de particules colloïdales, divers protocoles et/ou types de particules peuvent être considérés. 0 Un premier protocole consiste à stabiliser des particules colloïdales superparamagnétiques avec un agent de pontage de type polymère, et en particulier un polyélectrolyte, par exemple du type acide polyacrylique. En l'absence de champ magnétique, ou en présence d'un champ faible, les particules présentent à courte portée une répulsion stérique due aux chaînes de 5 polymère. Pour un champ magnétique supérieur à un champ seuil, les particules magnétiques sont pressées de plus en plus fortement les unes contre les autres : certaines chaînes peuvent franchir cette barrière stérique, et venir effectuer un pontage entre les particules, qui rendent leur association essentiellement irréversible ou au moins à très longue durée de vie. Un avantage des 0 polyélectrolytes, outre leur capacité à interagir de façon forte avec des particules de charge opposée, est qu'on peut les mettre en présence des chaînes colloïdales par l'intermédiaire d'un champ électrique. Un second protocole implique l'assemblage des particules en colonnes à l'aide d'un champ externe au sein d'une cellule présentant une paroi semi- perméable et la diffusion, à travers cette paroi, d'un agent chimique capable de réticuler les particules entre elles. II est également possible d'utiliser des particules qui se lient entre elles de façon irréversible sous la simple action d'un champ externe, et sans qu'il soit nécessaire de faire intervenir des molécules adjuvantes. Des exemples de ce mode de réalisation sont donnés dans les exemples 8 et 9. On interprète cette cohésion comme la conséquence d'interactions hydrophobes entre les particules, qui peuvent entrer en jeu après franchissement d'une barrière de potentiel répulsive sous l'action du champ externe.
Enfin, l'alignement des particules peut être rendu irréversible en utilisant des interactions électrostatiques : on peut, par exemple, organiser dans un champ magnétique des particules magnétiques négativement chargées (par exemple, carboxylées) en filaments, puis les mettre en présence de polycations (par exemple, en utilisant un champ électrique les mouvant en direction opposée) : les polycations, comme à titre d'exemple la poly-lysine ou la poly- histidine, se fixent sur les particules et pontent celles-ci de façon irréversible, effectuant une « inversion de charge » qui transforme la chaîne réversible anionique en une chaîne irréversible cationique. Des exemples de tels modes de mise en oeuvre sont donnés dans l'exemple 12. Le processus peut être répété avec un polyanion, comme l'acide polyacrylique ou polyglutamique, qui vient effectuer une seconde inversion de charge Selon une variante particulièrement privilégiée, cette seconde inversion de charge peut être obtenue avec un acide nucléique, qui jouera en même temps le rôle de site de reconnaissance, et transformera donc la simple chaîne colloïdale irréversible en chaîne colloïdale selon l'invention, c'est-à-dire porteuse de sites de reconnaissance. Un exemple d'un tel mode de mise en oeuvre est donné dans l'exemple 7.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé revendiqué comprend au moins :
- le mélange de particules colloïdales et/ou leur greffage avec au moins un agent de pontage ou un précurseur d'agent de pontage, - l'assemblage desdites particules colloïdales sous la forme d'un ou plusieurs objets linéaires et
- le déclenchement du pontage entre lesdites particules maintenues dans une organisation linéaire. En l'occurrence, on peut commencer par constituer une chaîne colloïdale, puis ponter les particules à l'aide d'un rayonnement électromagnétique, par exemple dans le cadre d'une réaction photochimique. On peut, par exemple, utiliser le chlorure de 5-azidonaphtalene-1-sulphonyle, l'acide 4, 4'- diazidostilbene-2,2'-disulfonique, ou plus généralement les agents de réticulation photoréactifs tels que ceux décrits dans le catalogue « Molecular Probes », chapitre 5.3.
On peut également utiliser une réaction photochimique de façon indirecte. Par exemple, on peut constituer un mélange de particules colloïdales magnétiques porteuses de fonctions carboxyliques, de chaînes de polyamine sous forme neutre (par exemple, de la poly-lysine à un pH supérieur à 10,2), et d'orthonitrobenzyle ou plus généralement de composés comportant des groupes nitro ou nitroso (voir par exemple H. Morrisson, The chemistry of the Nitro and Nitroso groups, Feuer H. Ed., Interscience, New York, 1969, partie I, chapitre 4, ou R. Bressauer, J.P, Paris, in Advances in Photochemistry, W.A. Noyés, G. S. Hammond, J.N. Pitts éditeurs, Interscience, New York, 1963, p. 275 , ou encore, R.W. Yip et coll., J. Phys. Chem., 95, p 6078, 1991) R53). Ces derniers composés, autrement connus comme « cages à protons », sont capables sous l'action d'un rayonnement ultraviolet, de s'isomériser et de libérer un proton, créant une augmentation de pH suffisante pour transformer la chaîne polyamine neutre en polycation. L'avantage de cette méthode est qu'elle permet d'éviter toute agrégation entre particules tant que le milieu n'est pas soumis à la lumière, et donc d'avoir le temps d'effectuer le mélange entre les différents constituants, et d'organiser les particules colloïdales en chaînes, avant de faire agir la lumière qui créera l'attraction entre les polymères et lesdites particules, et le pontage de ces dernières dans la configuration linéaire recherchée.
On peut également déclencher le pontage entre particules colloïdales par un changement de température et/ou une modification de pH. Enfin, on peut, si les particules initiales présentent spontanément un potentiel attractif à courte portée et un potentiel répulsif à longue portée, déclencher le pontage par une élévation du champ externe (champ magnétique pour des particules magnétiques, champ électrique pour des particules diélectriques).
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé revendiqué peut être mis en œuvre dans une cellule microfluidique comportant, outre un canal 1 , dans lequel s'effectue l'assemblage des particules colloïdales ou leur fonctionnalisation, un ou plusieurs canaux d'alimentation annexes.
L'organisation des particules colloïdales en chaîne peut être effectuée sur des particules préalablement porteuses de sites de reconnaissance et/ou de marqueurs identiques ou différents, comme dans l'exemple 8 ou, au contraire, sur des particules non fonctionnalisées, comme dans les exemples 6 et 7. Dans le premier cas, les différentes particules porteuses de sites de reconnaissance identiques ou différents et/ou de marqueurs identiques ou différents sont organisées pour constituer lesdits objets linéaires dans un ordre prédéterminé. Dans ce second cas, les particules organisées en chaînes linéaires sont dotées de sites de reconnaissance et éventuellement de marqueurs après constitution desdits objets.
On peut bien entendu combiner les deux variantes ci-dessus, c'est-à-dire assembler dans une première étape des particules colloïdales porteuses de certains sites de reconnaissance et/ou de marqueurs, et venir rajouter sur ces dernières, dans un ordre prédéterminé ou non, d'autres sites de reconnaissance et/ou marqueurs.
Quoiqu'il en soit, les particules colloïdales mises en œuvre pour la séparation des chaînes colloïdales possèdent bien entendu les spécificités discutées précédemment.
L'invention a pour troisième objet un élément de surface porteur d'un assemblage linéaire de particules colloïdales selon l'invention. En l'occurrence, il est particulièrement intéressant de disposer d'une surface présentant en des endroits prédéfinis des chaînes colloïdales selon l'invention assemblées de façon irréversible.
Avantageusement, l'extension de ces chaînes colloïdales au-dessus de la surface permet d'accroître significativement, d'une part la surface spécifique pour la reconnaissance et, d'autre part, le volume de solution surnageante mis au contact des cibles. En l'occurrence, la superficie active desdites chaînes colloïdales est supérieure à la superficie de l'élément de surface portant lesdites chaînes et, de préférence, d'un facteur d'au moins 4.
Par exemple, avec des chaînes colloïdales de 200 nanomètres de diamètre, équidistants de 1 micromètre et longs de 20 micromètres, la surface spécifique est de 12 micromètres carrés par micromètre carré de surface projetée.
De façon privilégiée, les chaînes colloïdales sont fixées sur la surface par une de leurs extrémités. Cette fixation peut être obtenue par création d'une liaison covalente entre les chaînes et la surface, par pontage avec des molécules ou des macromolécules et/ou par des interactions électrostatiques, hydrophobes ou de type Van der Waals. On peut également envisager des interactions spécifiques, différentes de celles exercées entre les sites de reconnaissance et les espèces.
En fixant les chaînes colloïdales sur la surface par une de leurs extrémités, on constitue une « brosse colloïdale ». Un exemple d'une telle surface est donné dans l'exemple 5. Cette brosse peut être étendue de façon active au sein de la solution surnageante, par exemple en appliquant un champ magnétique perpendiculaire à la surface de la « puce » si les chaînes comportent des matériaux magnétiques. Dans la majorité des applications, il est avantageux de rassembler les chaînes sur ladite surface en une multiplicité de domaines distincts, de préférence en des positions prédéterminées sur ladite surface. De préférence, la surface comprend au moins deux domaines distincts comportant des chaînes colloïdales porteuses de sites de reconnaissance différents. Divers procédés peuvent être utilisés pour constituer des surfaces porteuses d'un assemblage linéaire selon l'invention.
Typiquement, ces procédés doivent comporter les étapes suivantes : - greffage sur les chaînes colloïdales ou sur au moins certaines des particules constituant lesdites chaînes, de sites de reconnaissance, et
- fixation desdites chaînes colloïdales sur ladite surface.
De façon privilégiée, l'étape de fixation des chaînes colloïdales sur la surface se fait en présence d'un champ externe capable d'aligner lesdites chaînes. Par exemple, si les chaînes portent un moment dipolaire électrique ou une polarisabilité électrique, on pourra utiliser à cet effet un champ électrique. Si elles portent un moment dipolaire magnétique ou une polarisabilité magnétique, on pourra utiliser un champ magnétique. Selon une variante privilégiée, ledit champ présente une multiplicité de gradients locaux, qui dirigent les chaînes vers des endroits prédéterminés sur la surface.
Par l'intermédiaire de ces champs externes, on peut également obtenir des surfaces sur lesquelles les chaînes colloïdales sont orientées plutôt perpendiculairement ou plutôt parallèlement à la surface, selon que ledit champ est plutôt perpendiculaire ou plutôt parallèle à la surface.
Optionnellement, ces procédés peuvent en outre comporter une étape d'incorporation de marqueurs dans lesdites chaînes.
L'ordre dans lequel ces différentes étapes sont effectuées peut varier selon la commodité de réalisation. En particulier, le greffage sur la surface peut être antérieur, simultané ou postérieur à la mise en place des sites de reconnaissance, postérieur, simultané ou antérieur à la mise en place des marqueurs. La mise en place des marqueurs, dans le cas où cette option est choisie, peut quant à elle être postérieure, simultanée ou antérieure à celle des sites de reconnaissance.
Enfin, notons que l'assemblage des particules colloïdales en chaînes peut être antérieur ou simultané au greffage de celles-ci sur la surface. Quand cela est possible, la deuxième option est préférée, car elle diminue le nombre d'étapes nécessaires pour l'obtention de la surface finale.
L'invention a également pour objet un réseau d'hybridation comportant un élément de surface porteur de chaînes colloïdales selon l'invention. Ce réseau peut être à basse densité, à moyenne densité ou à haute densité. Ces réseaux d'hybridation déposés sur une surface sont généralement désignés sous le nom de « puces à ADN », « puces à oligonucléotides » ou « puces à protéines».
Dans ce type d'application, les chaînes sont groupées sur l'élément de surface considéré en une multiplicité de domaines distincts. De façon privilégiée, lesdits domaines occupent des positions prédéterminées ou repérables sur ladite surface. De façon privilégiée également, au moins deux domaines distincts comportent des fils colloïdaux porteurs de sites de reconnaissance différents. De préférence, on dispose d'une multiplicité de domaines distincts porteurs chacun d'un type de site de reconnaissance distinct. Dans certains cas, cependant, on peut souhaiter introduire une certaine redondance entre les domaines, à des fins de contrôle et ou de mesure de la reproductibilité.
Les « puces » constituées à partir de chaînes colloïdales selon l'invention présentent par rapport aux puces traditionnelles de nombreux avantages : d'une part, leur surface spécifique est augmentée, ce qui augmente la sensibilité, en particulier en cas de compétition avec des ligands non spécifiques. Le volume d'échantillon, et donc le nombre d'espèces contenues dans l'échantillon mis à proximité immédiate des sites de reconnaissance est également augmenté considérablement, ce qui accroît la cinétique et la sensibilité. Enfin, dans le cas de chaînes colloïdales magnétiques ou plus généralement de chaînes colloïdales sensibles à un champ externe, il est possible d'agiter ces chaînes colloïdales par rapport au milieu environnant, par exemple en les soumettant à un champ extérieur oscillant, magnétique ou électrique, ce qui permet d'accélérer la cinétique d'hybridation.
L'utilisation de chaînes colloïdales selon l'invention, du type de celles sensibles à un champ extérieur, permet également d'obtenir des réseaux plus reproductibles : en effet, les chaînes colloïdales peuvent être calibrées en longueur, et leurs propriétés physiques d'auto-organisation imposent une distribution régulière et prédéfinie sur toute la surface du domaine.
Par ailleurs, le greffage des sites de reconnaissance sur les filaments s'effectuant en « batch », il peut être mieux contrôlé que dans le cas du dépôt ou « spotting » traditionnel, et peut faire l'objet d'un contrôle-qualité avant le dépôt sur la surface.
L'invention a également pour objet un canal ou une cellule microfluidique ou un microrécipient contenant un assemblage de particules colloïdales selon l'invention. Par « cellule microfluidique », on entend un dispositif comprenant un canal ou un ensemble de canaux dont l'une des dimensions est comprise entre 100 nm et 1 mm, et permettant le transport de fluides.
Selon une variante privilégiée, lesdites chaînes sont organisées au sein du canal en une multiplicité de domaines distincts. Selon une autre variante privilégiée, non exclusive de la précédente, lesdites chaînes sont fixées sur une des faces du canal.
Enfin, les chaînes colloïdales selon l'invention peuvent également être utilisées dans un dispositif de chromatographie, d'électrochromatographie ou d'électrophorese d'affinité notamment afin d'y agir en tant que matrice de séparation. Dans ce cas, on introduit les analyses contenues dans un échantillon dans ledit dispositif. Ces analyses y sont transportées au sein d'un canal, par un champ approprié (champ de pression pour la chromatographie, champ électrique pour l'électrophorèse ou l'électrochromatographie). Les différents analytes interagissent différemment avec les sites de reconnaissance présents sur les chaînes colloïdales, et sont donc retenus ou plus ou moins retardés. On peut alors détecter, par des moyens bien connus de l'homme de l'art (tels que fluorescence, absorption UV, réfractométrie, électrochimie, etc.), les différents analytes après ou pendant leur passage entre les chaînes colloïdales. Les différences de temps de passage renseignent sur les différentes affinités des analytes avec les chaînes colloïdales et, le cas échéant, sur leur nature. Cette méthode est particulièrement bien adaptée aux systèmes microfluidiques, de par les dimensions les plus courantes des chaînes colloïdales selon l'invention, dans la gamme micronique.
Dans une autre série d'applications, les chaînes colloïdales selon l'invention peuvent être utilisées comme des « microréacteurs ». En l'occurrence, les sites de reconnaissance sont des sites catalytiques, qui permettent d'activer des réactions avec un très grand rapport surface/volume. Si les chaînes colloïdales sont utilisées en volume, elles peuvent par exemple être récupérées facilement par centrifugation ou par tri magnétique, et offrent ainsi un bon compromis entre les catalyseurs dissous, qui offrent une très bonne dispersion mais sont difficiles à récupérer, et les catalyseurs solides, qui sont faciles à recycler par lavage mais peu dispersés. Un exemple de réalisation de microréacteur à base de chaînes colloïdales selon l'invention est donné dans l'exemple 13.
Selon une autre variante particulièrement privilégiée, les chaînes colloïdales revendiquées utilisées comme microréacteurs sont attachées sur une surface, ce qui permet d'échanger les réactifs et de collecter les produits de réaction aussi facilement qu'avec un catalyseur solide, mais avec une mobilité et une dispersion beaucoup plus grande des sites de reconnaissance.
Les chaînes colloïdales selon l'invention sont également avantageuses pour des applications de chimie combinatoire. En l'espèce, des chaînes colloïdales porteuses d'enzymes à titre de catalyseurs sont particulièrement intéressantes pour la chimie combinatoire ou le diagnostic. Ainsi, on peut à titre d'exemple et de façon non limitative, greffer sur des particules colloïdales magnétiques de la chymotrypsine, ou de l'alphachymotrypsine selon le protocole décrit dans Bilkova J., Chromatogr. A, 852, 141-149 (1999). Ces particules sont ensuite assemblées par l'un des procédés décrits dans les exemples 1 à 8. On peut également procéder d'abord à l'assemblage des chaînes colloïdales à partir de microsphères de type poly(HEMA-co-EDMA), les fonctionnaliser à l'hydrazide, comme décrit dans Bilkova J., Chromatogr. A, 852, 141-149 (1999), puis les assembler en chaînes colloïdales selon l'un des protocoles décrits dans les exemples 1 à 8, et reprendre le protocole à l'étape 2.9 de Bilkova J., Chromatogr. A, 852, 141-149 (1999). pour fixer la chimotrypsine de façon orientée. On obtient ainsi des chaînes colloïdales capables de digérer les protéines.
L'invention a également pour objet un microrécipient ou dispositif de reconnaissance moléculaire, comportant des chaînes colloïdales selon l'invention ou une surface porteuse de telles chaînes colloïdales. En fait, de manière plus générale, les chaînes colloïdales selon l'invention s'avèrent particulièrement intéressantes pour un grand nombre d'applications, telles que l'analyse, isolation et/ou préparation d'espèces.
C'est ainsi que la présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic et/ou d'analyse, de séparation, de purification, de dosage ou d'identification ex vivo d'au moins une espèce, mettant en œuvre au moins un assemblage de particules tel que revendiqué.
Les espèces considérées sont celles identifiées précédemment. Ces méthodes de diagnostic et/ou d'analyse peuvent notamment être mises en œuvre selon le protocole comprenant au moins les étapes consistant à : a) mettre en oeuvre au sein d'un canal ou d'un récipient un assemblage de particules colloïdales ; b) mettre en contact ledit assemblage avec au moins une espèce à détecter, séparer et/ou doser ; et c) mettre en œuvre des moyens pour détecter l'hybridation éventuelle de l'espèce considérée avec ledit assemblage.
Optionnellement, dans les applications préparatives, il peut être également intéressant de récupérer les produits ayant interagi avec les chaînes colloïdales ou au contraire ceux n'ayant pas interagi.
Optionnellement également, le processus comprend en outre une étape de lavage au cours de laquelle certains produits contenus dans l'échantillon et n'ayant pas hybride avec les chaînes sont éliminés ou au cours de laquelle les produits ayant réagi avec lesdites chaînes sont récupérés.
Au titre de l'invention, on entend par "hybridation" toute interaction dans laquelle une espèce se lie de façon spécifique avec un site de reconnaissance.
Dans le cas de la méthode revendiquée, les chaînes de particules colloïdales peuvent être disposées sous la forme de zones distinctes composées de plusieurs chaînes au sein d'un canal ou d'une surface. Dans un tel cas, la zone contenant lesdites chaînes colloïdales est généralement traversée par un fluide contenant au moins une espèce à analyser. L'invention est particulièrement avantageuse pour ce type d'opération : en effet, au cours du lavage, les chaînes colloïdales peuvent se coucher et opposer ainsi très peu de résistance à l'écoulement, permettant un lavage aisé et rapide. Dès l'arrêt de l'écoulement, elles peuvent se redresser (ce redressement peut optionnellement être activé par un champ magnétique, si les chaînes colloïdales sont magnétiques) et occuper à nouveau un grand volume. On peut ainsi combiner la facilité de lavage des tubes ouverts, avec la densité de sites obtenue avec des gels, mais sans la forte résistance à l'écoulement que présentent ces derniers. Parmi les moyens mis en œuvre dans l'étape c), on peut de façon privilégiée utiliser la fluorescence, la phosphorescence, la chimiluminescence, l'absorption de lumière, la résonance plasmon de surface, la radioactivité. On peut également utiliser une méthode de détection mettant en jeu une mesure de courant, par exemple dans un ou plusieurs circuits inclus dans le dispositif de reconnaissance moléculaire, au voisinage des chaînes colloïdales. Cette dernière variante est particulièrement adaptée au cas de chaînes colloïdales conductrices du courant, ou à celles mettant en jeu des sites de reconnaissances capables de conduire à des produites détectables par une réaction électrochimique ou une méthode d'ampérométrie cyclique. On peut également utiliser un ou plusieurs éléments sensibles au champ magnétique ou un changement de champ magnétique. Cette dernière variante est particulièrement adaptée aux chaînes colloïdales dotées de propriétés magnétiques.
En ce qui concerne la détection, selon une première variante, la détection peut s'effectuer in situ, au sein du canal ou du récipient dans lequel s'effectue l'hybridation ou plus généralement l'interaction entre certaines espèces contenues dans un fluide et les sites de reconnaissance portés par les chaînes colloïdales selon l'invention. Selon une seconde variante, cette détection peut s'effectuer dans un autre appareil, après la phase d'hybridation ou d'interaction. En particulier, on peut utiliser les réseaux d'hybridation conformes à l'invention de façon comparable aux « puces à ADN » ou « puces à protéines » conventionnelles, en effectuant dans un premier temps l'hybridation dans une chambre à hybridation, puis en effectuant la détection dans un lecteur de puces. Quand on souhaite effectuer simultanément une recherche de reconnaissance moléculaire impliquant une multiplicité de types de chaînes colloïdales, celles-ci peuvent être organisées en zones relativement compactes (typiquement circulaires) ou « spots », ou au contraire en bandes, au sein d'un canal ou sur une surface.
A titre d'exemple et de façon non limitative, les chaînes colloïdales selon l'invention, et les différents composants et dispositifs mettant en œuvre ces chaînes colloïdales peuvent être utilisés pour le diagnostic ; la recherche et /ou préparation de molécules ou macromolécules, particules, atomes, ions, objets d'origine organique naturelle ou artificielle, tels que des espèces biologiquement actives comme des acides nucléiques, des protéines, des enzymes, des anticorps, des peptides, des polypeptides, des polysaccharides, des protéoglycanes, des organelles, des cellules cancéreuses, des cellules rares, des cellules épithéliales, de cellules endothéliales, des cellules pour le diagnostic prénatal, des OGM, des cellules pathogènes, des virus, des anticorps, des microorganismes ; la recherche de matières actives chimiques comme les produits toxiques, les drogues, les polluants; la reconnaissance de variétés animales végétales ou microorganismes ; la détection de mutations ; la recherche d'allergies ; le génotypage ; la recherche de gènes impliqués dans des maladies ; la recherche et /ou préparation de produits de réactions issus de protocoles de chimie combinatoire.
Les exemples et figures ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif du domaine de l'invention.
Figure 1 a : Exemple de chaînes colloïdales du type « collier de perles » flexibles pontées par de l'acide polyacrylique, de façon irréversible à partir de particules magnétiques de diamètre moyen 1 ,3 micromètres plus ou moins 0,3 micromètres, préparées selon le protocole décrit dans l'exemple 1.
Figure 1 b : Exemple de chaînes colloïdales rigides du type « colonnes » et de chaînes colloïdales semi-flexibles du type « collier de perles », pontées par de l'acide polyacrylique, de façon irréversible à partir de particules magnétiques de diamètre 1,3 micromètres plus ou moins 0,3 micromètres, préparées selon le protocole décrit dans l'exemple 1.
Figure 1 c : Exemple de chaînes colloïdales semi-flexibles du type « collier de perles » monodisperses de 70 micromètres de long organisées de façon irréversible, selon le protocole décrit dans l'exemple 2.
Figure 2a : Exemple de chaînes colloïdales pontées par de la poly-lysine, préparées selon l'exemple 3.
Figure 2b : Exemple de chaînes colloïdales pontées par de la poly-lysine et attachées sur une surface par leur extrémité, préparées selon l'exemple 4.
Figure 3 : Exemple de chaînes colloïdales porteuses de molécules d'ADN : a/ chaînes porteuses d'une molécule d'ADN par chaîne en moyenne, préparée selon l'exemple 6 ; b : chaîne colloïdale porteuse d'une couverture uniforme d'ADN « Phi X 174 », préparée selon l'exemple 7.
Figure 4 : Chaînes colloïdales porteuses d'anticorps : a/ chaînes colloïdales porteuses d'anticorps « anti-souris », préparées selon l'exemple 8 ; b/ chaînes colloïdales préparées à partir de billes de 1 micromètre de diamètre, porteuses de streptavidine, préparées selon l'exemple 9a ;
Figure 5 : Activité enzymatique protéase d'un assemblage de particules colloïdales selon l'invention, préparées selon l'exemple 13 et porteuses de sites de reconnaissance trypsine.
Figure 6 : Capture de cellules érythrocytes porteurs de site biotine au sein d'un microcanal comportant une surface porteuse d'assemblages de particules colloïdales selon l'invention porteuses de sites de reconnaissance streptavidine préparés selon l'exemple 14. Exemple 1 ;
Préparation de chaînes colloïdales à partir de particules de diamètre 1 ,3 plus ou moins 0,3 micromètres , à l'aide de polyélectrolytes en présence d'un champ magnétique, dans un récipient macroscopique (tube à essais).
a/ On prépare des billes magnétiques constituées d'une émulsion inverse de ferrofluide à base d'Octane (Rhône Poulenc), stabilisée dans de l'eau par du dodécyl-sulfate de sodium, selon le protocole décrit dans "Emulsions: theory and practice", Bêcher, P., Rheinhold, New York, 1965). Une taille de particules de 1 ,3 micromètres plus ou moins 0,3 micromètres est sélectionnée par cristallisation fractionnée, selon le protocole décrit dans Bibette, J. Colloid Interface Sci., 147, 474. (1991). Selon une variante, on peut utiliser directement des particules magnétiques disponibles commercialement, comme celles distribuées par les sociétés Bangs Laboratoires, Estapor, Merck, Eurolab, Prolabo, Uptima ou Polysciences.
b/ On lave plusieurs fois (au moins 5 fois) l'émulsion avec une solution de Nonyl Phénol Ethoxylate ou NP10 (Sigma Aldrich) à 0.1 %,. Le lavage s'effectue commodément en rassemblant les gouttes magnétiques au fond du récipient avec un aimant, en remplaçant le surnageant par la solution de lavage, et en agitant vigoureusement (on peut éventuellement utiliser la sonication en cas d'agrégation légère des particules) après avoir retiré l'aimant. L'opération est répétée autant de fois que nécessaire. En fin de lavage, on ajoute une quantité de solution de NP10 afin d'atteindre une concentration en particules de l'ordre de 0.1 % en fraction volumique
c/ On ajoute une solution d'acide polyacrylique ou PAA (Sigma Aldrich, Mw=250 000) afin d'aboutir à une concentration en PAA de 0.1 %. Le pH doit être égal à 4. On laisse incuber sous agitation douce. d/ On place le tube à essais contenant l'échantillon dans une bobine, et on augmente progressivement le champ magnétique Des chaînes se forment, et on laisse incuber sous champ de l'ordre de 5 à 15 mn. Quand on a dépassé un champ seuil, de l'ordre de 10 mT, les chaînes restent assemblées irréversiblement après suppression du champ magnétique. On peut régler leur longueur moyenne et leur diamètre en jouant sur l'amplitude du champ magnétique et sur la concentration des particules magnétiques. A titre d'exemple, les chaînes présentées dans la figure 1a ont été obtenues avec un champ de 50 mT et une concentration de particules de 0.1 % en volume, (observation entre lame et lamelle, en l'absence de champ magnétique, dans un microscopie AXIOVERT 100 Zeiss, à l'aide d'un objectif à immersion 100X, 1.3. On obtient dans ces conditions une coexistence entre de chaînes de type « collier de perles » flexibles (fig. 1a), des chaînes de type « collier de perles » semi-flexibles (fig. 1 b, à gauche), et des chaînes de type « colonnes » rigides (fig. 1b, à droite). Pour des concentrations en particules plus faibles, on obtient essentiellement des colliers de perles, et pour des concentrations plus élevées essentiellement des colonnes. Ce procédé permet d'obtenir aisément de grandes quantités de chaînes colloïdales selon l' invention. Parc contre, celles ci sont assez polydisperses.
Exemple 2 :
Obtention de chaînes colloïdales de longueur calibrée et monodisperses.
On procède comme dans l'exemple 1 jusqu'à l'étape c.
Pour l'étape d, au lieu d'utiliser un tube à essais, on introduit la solution dans un canal d'épaisseur uniforme 100 micromètres, préparé par moulage de polydimethylsiloxane selon Xia, Y. Xia, G. M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 550 (1998), puis on applique un champ magnétique de 50 mT, perpendiculaire à l'épaisseur du canal. On obtient, après suppression du champ magnétique, des chaînes semi-flexibles de longueur uniforme égale à l'épaisseur du canal (70 micromètres) (voir figure 1c) (conditions d'observation identiques à celles de l'exemple 1 ). Exemple 3 :
Préparation de chaînes colloïdales pontées par de la polylysine.
a/ On prépare des particules magnétiques selon le a/ de l'exemple 1.
b/ Ces particules sont introduites dans un canal préparé comme dans l'exemple 2, par surpression ou capillarité, à une concentration pouvant varier selon les besoins entre 0,1 % et 20%. On applique un champ magnétique de l'ordre de 50 mT, perpendiculaire à l'épaisseur du canal. On obtient alors des chaînes colloïdales. Celles ci sont du type « collier de perles » si la concentration initiale de la suspension en billes magnétiques est faible (typiquement inférieure à 5%), et du type « colonnes » si cette concentration initiale est importante.
c/ On introduit, par électrophorèse, de la poly-L-lysine (solution 0.1%w/v Sigma Aldrich)dans le canal. (Pour une fraction volumique de billes de 2% , on introduit de la poly-L-lysine de telle sorte que sa concentration dans le canal soit de 0.05% wt).Pour cela, on dispose deux électrodes dans deux réservoirs situés aux extrémités du canal. La poly-lysine est introduite sous forme de solution dans un des réservoirs, et l'électrode située dans ce réservoir est porté à un potentiel positif par rapport à celui de l'électrode située dans l'autre réservoir, de façon à maintenir au sein du canal un champ électrique de quelques V/cm. Des chaînes colloïdales irréversibles telles que celles observées dans la figure 2a sont obtenues.
Exemple 4 :
Préparation de chaînes colloïdales attachées par une de leurs extrémités sur une surface, pontées par de la poly-lysine (fig. 2b)
a/ On prépare ou on se procure des particules magnétiques comme dans l'étape a de l'exemple 1. b/ On lave plusieurs fois (au moins 5 fois) l'émulsion avec une solution de Nonyl Phénol Ethoxylate ou NP10 (Sigma Aldrich) à 0.1 %,. Le lavage s'effectue commodément en rassemblant les gouttes magnétiques au fond du récipient avec un aimant, en remplaçant le surnageant par la solution de lavage, et en agitant vigoureusement (on peut éventuellement utiliser la sonication en cas d'agrégation légère des particules) après avoir retiré l'aimant. L'opération est répétée autant de fois que nécessaire. En fin de lavage, on ajoute une quantité de solution de NP10 afin d'atteindre une concentration en particules de l'ordre de 5 % en fraction volumique
c/ On remplace la phase continue par un mélange constitué de NP10 0.1 %wt, poly-L-lysine 0.89 %wt. Pour cela on rassemble les billes magnétiques au fond du tube à l'aide d'un aimant et on prélève le surnageant que l'on remplace par le mélange souhaité.
d/ On introduit l'émulsion dans un canal. On applique un champ magnétique de 50 mT, perpendiculaire à l'épaisseur du canal. Après suppression du champ magnétique, on obtient une brosse de chaînes calibrées attachées sur la paroi inférieure du canal.
Exemple 5 :
Préparation de chaînes colloïdales attachées par une de leurs extrémités sur une surface, couplées par du polydimethylacrylamide.
a/ On prépare ou on se procure des particules magnétiques comme dans l'étape a de l'exemple 1.
b/ on prépare un canal d'épaisseur uniforme, par moulage de polydimethylsiloxane selon Xia, Y. Xia, G. M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 550 (1998). On remplit ce canal par une solution de polydimethylacrylamide à 0,15% en masse, et on laisse incuber pendant 40 mn. c/ On rince le canal avec une solution de Triton X405 à 2.1 g/L, puis on le remplit avec la suspension de particules magnétiques, préparée en a.
d/ On place le canal au centre d'une bobine, et après équilibrage des pressions aux extrémités du canal afin d'éviter les écoulements parasites, on applique un champ magnétique suffisant pour créer les colonnes (de l'ordre de une à quelques dizaines de mT), perpendiculaire à l'épaisseur du canal. Le champ est maintenu pendant une heure.
e/ Après suppression du champ magnétique, on obtient une « brosse » de chaînes colloïdales, attachées sur la paroi inférieure du canal.
Exemple 6 :
Préparation de chaînes colloïdales selon l'invention, porteuses d'une molécule d'ADN de « phage lambda » par chaîne en moyenne.
a/ On prépare des chaînes colloïdales selon le protocole décrit dans l'exemple 1.
b/ On rajoute une solution de Poly-L-lysine (solution à 0.1 %w/v Sigma Aldrich) de façon à obtenir dans le mélange une concentration de poly-L-lysine de 0.002%w. On laisse incuber sous agitation douce à la température ambiante pendant 40 min
c/ En ajoutant de l'ADN à la suspension, celui-ci se fixe en certains points de la surface des chaînes colloïdales, selon un mécanisme vraisemblablement comparable à celui mis en œuvre sur des surfaces planes (voir par exemple "The world of Microarrays, J. Boguslavsky, Drug Discovery and Development, S5- S32(2001)). La concentration d'ADN sur les colonnes peut être variée grandement, en jouant sur la concentration de l'ADN ajouté à la solution, et sur sa taille. Dans la figure 3a, on a fixé environ une molécule d'ADN de grande taille (phage lambda, Amersham Pharmacia Biotech Inc) par chaîne colloïdale. Les chaînes colloïdales apparaissent en sombre, et les ADN marqués par un marqueur fluorescent (YOYO-1 , Molecular Probes ; une molécule de YOYO pour dix paires de bases) apparaissent en clair (mesure effectuée par épifluorescence sur un microscope Zeiss Axiovert 100 équipé d'une lampe à mercure pour l'excitation et d'un objectif 100X).
Exemple 7 :
Préparation de chaînes colloïdales selon l'invention, porteuses d'une couverture uniforme de molécules d'ADN de type « PhiX 174 » liées aux chaînes colloïdales par l'intermédiaire de poly-lysine.
On procède comme dans l'exemple 6, mais en utilisant une nature et une concentration d'ADN différentes pour l'étape c. On utilise un mélange d'ADN courts de type « PhiX 174 » (φX 174 RF DNA/Hae III Fragments ; Gibco BRL). Au final, la concentration de l'ADN est de 0.5μg/mL, celle de la poly-L-lysine est de 0.002%wt. On lave alors les chaînes colloïdales, en les culottant dans un tube à l'aide d'un aimant, et en remplaçant le surnageant par une solution identique à celle utilisée dans le b de l'exemple 6. Les conditions d'observation sont les mêmes que pour l'exemple 6, et conduisent à des chaînes colloïdales uniformément recouvertes d'ADN (Fig. 3b)
Exemple 8:
Fabrication de chaînes colloïdales selon l'invention, du type « colonnes », attachées sur une surface et porteuses de fonctions de reconnaissance « antisouris ».
a/ On prépare un dispositif microfluidique comportant un canal d'épaisseur uniforme, par moulage de polydimethylsiloxane selon Xia, Y. Xia, G. M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 550 (1998).
b/ Des billes Uptibeads anti-souris (0.3 μm ; Uptima), à la concentration de la solution d'origine telle que vendue par le fabricant, sont soniquées pour défaire les agrégats présents dans l'échantillon initial, et introduits dans le canal du dispositif microfluidique préparé en a. Ce dispositif est lui-même placé au centre d'une bobine de façon à créer au sein du canal un champ magnétique essentiellement uniforme et orienté selon son épaisseur. Pour l'observation, le dispositif entouré de sa bobine est placé sur un microscopie AXIOVERT 100 Zeiss, et visualisé à l'aide d'un objectif à immersion 100X, 1.3. et d'une caméra CCD Cohu. Un champ magnétique de 50 mTesIa est appliqué. A la suppression du champ magnétique, les particules restent groupées sous forme de colonnes fixées à la surface inférieure du canal par une de leurs extrémités, et qui peuvent tourner et s'orienter aléatoirement autour de leur point de fixation (figure a).
Exemple 9 :
Fabrication par pontage direct de chaînes colloïdales selon l'invention, du type « colonnes », porteuses de fonctions streptavidine.
Les billes Uptibeads Streptavidin (0.88 μm ), à la concentration de la solution d'origine telle que vendue par le fabricant, sont soniquées pour défaire les agrégats présents dans l'échantillon initial, et placées dans une cellule microfluidique comme décrit dans l'exemple 8. A la suppression du champ magnétique, les particules restent groupées sous forme de colonnes (figure 4b).
Exemple 10 :
Fabrication de chaînes colloïdales à partir de particules magnétiques préalablement fonctionnalisées avec de la galactose oxydase de façon orientée.
a/ Préparation des particules magnétiques Des particules de HEMA-co-EDMA sont préparées par polymérisation en émulsion, puis activées à l'hydrazine, selon le protocole décrit dans Horak et coll., Biotechnol. Progr., 15 (1999).
b/ Préparation de la galactose oxydase activée (oxydée) Une solution de galactose oxydase de Dactylium dendroides (350 IU) (Sigma- Aldrich) est dissoute dans 2.5 ml de tampon acétate pH 5.5 0.1 M, contenant 2 mM CuSO4 et
1 mM de D-Fucose (Acros Organics, Geel, Belgique). On ajoute 100 U. de catalase (Sigma-AIdrich). Après 10 min d'incubation à 37°C et 15 min à 4°C, 250 μL de NalO4 est ajoutée à la solution, et agitée pendant 30 min à 4°C, pour activer sélectivement les chaînes glycosides de la galactose oxydase. La réaction est stoppée par addition de 30 μL d'éthylène glycol,, et l'agitation est poursuivie pendant 10 min. Les composants de faible masse moléculaire sont éliminés par filtration sur une colonne Sephadex G-25.
c/ Fixation de la galactose oxydase oxydée et purifiée sur les particules magnétiques On rajoute à la solution purifiée de galactose oxydase , 1 ,5 ml de solution de particules magnétiques activées, préparées en a, de façon à ce que la galactose oxydase soit en excès par rapport à la surface de particules. On incube sous agitation, pendant 24 h à 4°C. Le support est ensuite lavé avec du tampon acétate O.1M, pH 4, NaCI 0.5M. On répète le lavage plusieurs fois avec un tampon 0.1 M phosphate pH 6, 2 mM CuSO4, jusqu'à ce que l'activité enzymatique de l'éluant ne soit plus décelable. (L'activité oxydase est mesurée à l'aide d'un test basé sur l'oxydation de la D-galactose, comme décrit dans Avidad et coll., J. Biol. Chem., 237, 2736 (1962)). On bloque alors les groupes hydrazine n'ayant pas réagi par incubation des particules dans une solution de 0.2 M acetaldehyde en tampon acétate 0.1 M , pH 5.5 pendant 24 h. Enfin, on équilibre les particules dans une solution de tampon phosphate 0.1 M, pH6, 2mM CuSO4.
d/ Constitution des chaînes colloïdales
On ajoute à un aliquot de la solution de particules préparées en c, de l'acide polyacrylique ou PAA (Sigma Aldrich, Mw=250 000) afin d'aboutir à une concentration en PAA de 0.1 %. Laisser incuber sous agitation douce. Placer le tube à essais contenant l'échantillon dans une bobine, et augmenter progressivement le champ magnétique (N.B. Si on dispose d'une bobine permettant d'appliquer un champ magnétique suffisant, on peut omettre d'ajouter le PAA, ce qui permet de laisser les fonctions galactose oxydase plus accessibles, et donc d'améliorer le rendement catalytique des chaînes colloïdales finales). Des chaînes se forment, et on laisse incuber sous champ de l'ordre de 15 min. On obtient après suppression du champ magnétique des chaînes colloïdales irréversibles porteuses d'une activité oxydase, démontrée par mesure spectrophotométrique à l'aide d'un test basé sur l'oxydation de la D-galactose, comme décrit dans Avidad et coll., J. Biol. Chem., 237, 2736 (1962).
Exemple 11 :
Fonctionnalisation de chaînes colloïdales avec de la galactose oxydase.
a/ Préparation des particules magnétiques
On prépare une solution de particules magnétiques colloïdales, par exemple des particules de HEMA-co-EDMA préparées selon Horak et coll., Botechnol. Progr., 15 (1999), ou des particules Ademtech. On ajoute alors de l'acide polyacrylique ou PAA (Sigma Aldrich, Mw=250 000) afin d'aboutir à une concentration en PAA de 0.1%. Laisser incuber sous agitation douce. Placer le tube à essais contenant l'échantillon dans une bobine, et augmenter progressivement le champ magnétique. Des chaînes se forment et on laisse incuber sous champ de l'ordre de 15 mn. On obtient après suppression du champ magnétique des chaînes colloïdales irréversibles. (N.B. Si on dispose d'une bobine permettant d'appliquer un champ magnétique suffisant, on peut omettre d'ajouter le PAA, ce qui permet de laisser les fonctions galactose oxydase plus accessibles, et donc d'améliorer le rendement catalytique des chaînes colloïdales finales). On active alors celles- ci à l'hydrazine, selon le protocole décrit dans Horak et coll., Biotechnol. Progr., 15 (1999).
b/ Préparation de la galactose oxydase activée (oxydée) Une solution de galactose oxydase de Dactylium dendroides (350 IU) (Sigma- AIdrich) est dissoute dans 2.5 ml de tampon acétate pH 5.5 0.1 M, contenant 2 mM CuSO4 et 1 mM de D-Fucose (Acros Organics, Geel, Belgique). On ajoute 100 I.U. de catalase (Sigma-AIdrich). Après 10 min d'incubation à 37°C et 15 min à 4°C, 250 μL de NalO4 sont ajoutés à la solution, et agités pendant 30 min à 4°C, pour activer sélectivement les chaînes glycosides de la galactose oxydase. La réaction est stoppée par addition de
30 μL d'éthylène glycol, et l'agitation est poursuivie pendant 10 min. Les composants de faible masse moléculaire sont éliminés par filtration sur une colonne Sephadex G-25.
c/ Fixation de la galactose oxydase oxydée et purifiée sur les chaînes colloïdales. On rajoute à la solution purifiée de galactose oxydase, 1 ,5 ml de solution de particules magnétiques activées, préparées en a, de façon à ce que la galactose oxydase soit en excès par rapport à la surface de particules. On incube sous agitation, pendant 24 h à 4°C. Le support est ensuite lavé avec du tampon acétate 0.1 M, pH 4, NaCI 0.5M. On répète le lavage plusieurs fois avec un tampon 0.1 M phosphate pH 6, 2 mM CuSO4, jusqu'à ce que l'activité enzymatique de l'éluant ne soit plus décelable. On bloque alors les groupes hydrazine n'ayant pas réagi par incubation des particules dans une solution de 0.2 M acetaldehyde en tampon acétate 0.1 M , pH 5.5 pendant 24 h. Enfin, on équilibre les chaînes colloïdales dans une solution de tampon phosphate 0.1 M, pH6, 2mM CuSO4. L'activité oxydase est démontrée par mesure spectrophotométrique à l'aide d'un test basé sur l'oxydation de la D-galactose, comme décrit dans Avidad et coll., J. Biol. Chem., 237, 2736 (1962).
Exemple 12
Préparation de colonnes irréversibles de particules magnétiques du type « microréacteur », porteuses de site de reconnaissance trypsine pour la digestion des protéines
On prépare des chaînes de particules magnétiques selon l'exemple 1. Les chaînes sont rincées puis resuspendues dans un tampon Phosphate pH 7,3, additionné de Nonyl Phénol à raison de 1 mg de particules magnétiques dans 400 microlitres de tampon (solution A). La sédimentation des chaînes est effectuée délicatement, en maintenant l'aimant à au moins 2 cm du tube. On immobilise ensuite la trypsine selon un protocole dérivé de celui décrit dans l'ouvrage de Greg T. Hermanson « Bioconjugate Techniques » 1996, Académie Press, London. On prépare par ailleurs une solution B de 30 mg de carbodiimide d'éthylène (EDC) dans 500 microlitres de tampon phosphate pH 7,3. On prépare également une solution C de 5 mg de S-NHS (N-hydroxysuccinimide) dans 400 microlitres de tampon phosphate pH 7,3
On prépare enfin une solution D : On dissout 7,5 mg de trypsine TPCK dans 50 microlitres de tampon phosphate pH7, rajouter 5 microlitres d'une solution de benzamidine à 16 microgrammes par millilitre
On ajoute immédiatement la solution D à la solution A, sans champ magnétique et en agitant doucement avec une pipette Gilson, dont le bout du cône a été coupé pour diminuer les cisaillements . On ajoute alors la solution B puis la solution C, toujours en agitant doucement. On laisse incuber pendant 3 heures, puis on lave la solution par 2 ou 3 échanges de tampon par un tampon phosphate pH 7,3 Nonyl phénol identique à celui de la solution A. Pour les sédimentations, on procède comme décrit pour la préparation de la solution A.
L'activité de la trypsine est mesurée à l'aide d'un test colorimétrique selon le protocole décrit dans H. F. Gaertner et A.J. Puigserver, Enzyme Micro. Technol. 14, 150 (1992) et P.S. Gravet et al. Int. Biochem. 23, 1085 (1991).
Une série de solutions de BAPNA (benzoyl-arginine p-nitroaniline HCI) à des concentrations molaires comprises entre 0.1 et 1 sont utilisées comme substrat, dans un tampon Tris. Les assemblages de particules porteuses de trypsine sont introduits dans la solution. Après incubation durant une heure, la quantité de p- nitroaniline produite par la réaction de digestion est mesurée par l'absorption de la solution à 410 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis (Shimadzu UV(160A)). La stabilité de l'activité au cours du temps est donnée dans la figure 5.
En variante, on peut également utiliser dans le même protocole des billes magnétiques à base de dioxyde de silicium (SiO2) (Kisker). On obtient alors des assemblages irréversibles de particules colloïdales selon l'invention essentiellement minérales. Selon cette variante, la fixation de site de reconnaissance de type trypsine ou streptavidine est effectuée par activation des particules à la gluraraldehyde.
Exemple 13
Préparation de chaînes colloïdales porteuses de fonctions streptavidine pour capturer des globules rouges marqués avec de la biotine.
a/ dans un canal, on prépare une brosse de chaînes colloïdales porteuses de fonctions streptavidine comme décrit dans l'exemple 9. b/ on marque des globules rouges humains avec de la biotine selon le protocole suivant :
• mettre 6μL de sang dans 1 mL de PBS 270 mOsmol
» laver 3 fois avec un tampon carbonate/bicarbonate 0,1 M pH= 8,5 (centrifugation à 3000 T/min pendant 1 min) prélever le culot et ajouter 500μL d'une solution de NHS-PEG 3400-biotin à 0,4 mg/mL
• incuber 30min
• centrifuger à 3000 tours/mn pendant 1 min afin d'enlever le surnageant et ajouter 500μL de PBS + BSA 0,5% c/ les globules sont ensuite introduits dans le canal et migrent à travers la brosse de chaînes grâce à un champ électrique comme décrit par exemple dans Doyle et al., Science, 295, (5563), 2237, (2002). Ils se fixent sur les colonnes de particules magnétiques, comme cela est démontré dans la figure 6

Claims

REVENDICATIONS
1. Assemblage de particules colloïdales sous la forme d'une ou plusieurs chaînes, caractérisé en ce que lesdites chaînes sont assemblées de manière irréversible et sont porteuses d'au moins un site de reconnaissance pour une espèce, ledit site étant différent des ligands impliqués dans l'organisation linéaire desdites particules.
2. Assemblage de particules colloïdales selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les particules colloïdales sont de forme essentiellement sphérique.
3. Assemblage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les dites chaînes sont flexibles ou semi-flexibles.
4. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite chaîne possède un rapport d'aspect supérieur à 1 et de préférence à 3.
5. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdites particules sont en tout ou partie de nature organique, et de préférence organominérale.
6. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdites particules sont essentiellement de nature minérale.
7. Assemblage selon la revendication 6, dans lequel les dites particules sont essentiellement constituées de silice ou comportent une enveloppe de silice.
8. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdites particules sont à base d'un matériau ferromagnétique, ferrimagnétique, antiferromagnétique, superparamagnétique, conducteur ou semi-conducteur.
9. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les particules colloïdales comportent un cœur minéral enveloppé d'une couche organique polymérique.
10. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la cohésion entre lesdites particules est maintenue par des liens covalents entre lesdites particules.
11. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la cohésion entre les particules résulte d'un pontage à l'aide de molécules ou de macromolécules.
12. Assemblage selon la revendication 10 ou 11 , caractérisé en ce que la cohésion entre les particules met en jeu des interactions spécifiques directement entre lesdites particules ou avec des molécules ou macromolécules, via des fonctions réactives présentes à la surface desdites particules.
13. Assemblage selon la revendication 12, caractérisé en ce que les fonctions réactives sont des fonctions aminé, acide carboxylique, alcool, aldéhyde, thiol, époxyde, hydrazine et/ou des atomes d'halogène.
14. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 9 ou 11 , caractérisé en ce que la cohésion entre lesdites particules met en jeu des interactions de type électrostatiquehydrophobe ou Van der Waals.
15. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le ou les sites de reconnaissance sont choisis parmi : des acides nucléiques ou leurs analogues de synthèse, des peptides, des polypeptides ou des protéines, des complexes protéiques, des protéoglycanes, des polysaccharides, des fragments de gènes, des anticorps, des antigènes, des enzymes, des épitopes, des haptènes, des fonctions chimiques capables de reconnaître de façon spécifique d'autres espèces chimiques des ligands spécifiques de métaux, des sites catalytiques, des empreintes moléculaires, des groupements hydrophobes, des enzymes ou parties d'enzymes.
16. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le ou les sites de reconnaissance sont des molécules, des ions, des éléments de surface, ou encore des portions spécifiques d'une molécule ou d'un ion capables de donner lieu à une interaction attractive ou à une réaction chimique avec une espèce particulière ou une catégorie particulière d'espèces.
17. Assemblage selon la revendication 16, caractérisé en ce que le ou les sites de reconnaissance sont choisis parmi les composés comprenant des fonctions chimiques aromatiques ou hétérocyliques ou des sites capables de donner lieu à des liaisons hydrogène.
18. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que lesdites particules sont organisées sous la forme d'une unique chaîne ou d'un ensemble de chaînes colloïdales porteur d'au moins deux types distincts de sites de reconnaissance.
19. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les différents types de sites de reconnaissance, ou de fonctions sont organisés dans un ordre prédéterminé le long de la ou des chaîne(s) considérée(s).
20. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que lesdites particules ou certaines d'entre elles sont porteuses d'un ou plusieurs marqueurs identiques ou différents.
21. Assemblage selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est constitué de plusieurs chaînes, chaque chaîne portant un type donné de sites de reconnaissance ou de fonctions réactives et, le cas échéant, au moins un type donné de marqueur.
22. Procédé utile pour préparer un assemblage de particules colloïdales selon l'une des revendications 1 à 21 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins : - l'assemblage de particules colloïdales sous forme d'un ou plusieurs objets linéaires et
- la mise en présence desdits objets avec au moins un agent capable de les ponter de façon irréversible.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'agent de pontage est choisi parmi les polymères et de préférence des polyélectrolytes.
24. Procédé selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que l'assemblage linéaire desdites particules est obtenu par action transitoire ou permanente d'un champ magnétique ou d'un champ électrique.
25. Procédé selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que l'organisation desdites particules est effectuée en cellule microfluidique ou au sein d'un canal ou d'une chambre présentant au moins deux faces essentiellement parallèles.
26. Procédé utile pour constituer un assemblage de particules colloïdales selon l'une des revendications 1 à 21 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins :
- le mélange de particules colloïdales et/ou leur greffage avec au moins un agent de pontage ou un précurseur d'agent de pontage, - l'assemblage desdites particules colloïdales sous la forme d'un ou plusieurs objets linéaires, et
- le déclenchement du pontage entre lesdites particules maintenues dans une organisation linéaire.
27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que la troisième étape implique une modification de température, une application d'un rayonnement électromagnétique, d'un champ électrique ou magnétique, un changement de pH et/ou une réaction photochimique.
28. Méthode de diagnostic et/ou d'analyse, de purification, d'identification, de séparation ou de dosage ex vivo d'au moins une espèce mettant en œuvre au moins un assemblage de particules colloïdales selon l'une des revendications 1 à 21.
29. Méthode selon la revendication 28, caractérisée en ce que les espèces sont choisies parmi les protéines, les acides nucléiques, les équivalents de synthèse d'acides nucléiques, des protéoglycanes, des haptènes, des enzymes, des anticorps, des antigènes, des macromolécules synthétiques, des polluants, des organelles, des cellules, des virus, des microorganismes, des nano- ou des micro-particules d'origine naturelle ou artificielle, des molécules organiques ou organominérales, des drogues et des médicaments.
30. Méthode selon la revendication 28 ou 29, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins :
- la mise en oeuvre, au sein d'un canal ou d'un récipient, d'un assemblage de particules colloïdales sous forme de chaînes irréversibles ;
- la mise en contact dudit assemblage avec au moins une espèce à séparer, détecter et/ou doser, et
- la mise en œuvre de moyens pour détecter l'hybridation éventuelle de l'espèce considérée avec ledit assemblage.
31. Méthode selon la revendication 30, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape de lavage au cours de laquelle les produits ne s'étant pas hybrides avec lesdites chaînes sont éliminés, ou au cours de laquelle les produits ayant réagi avec lesdites chaînes sont récupérés.
32. Méthode selon la revendication 30 ou 31 , caractérisée en ce que les chaînes de particules colloïdales sont disposées sous la forme de plusieurs zones distinctes, au sein d'un canal ou sur une surface.
33. Méthode selon la revendication 32, dans laquelle la zone contenant lesdites chaînes est traversée par le fluide contenant au moins une espèce à analyser.
34. Utilisation d'un assemblage de particules colloïdales selon l'une des revendications 1 à 21 dans un dispositif de chromatographie, d'électrophorese d'affinité ou d'électrochromatographie.
35. Utilisation d'un assemblage de particules colloïdales selon l'une des revendications 1 à 21 à titre de microréacteurs.
36. Utilisation d'un assemblage de particules colloïdales selon la revendication 35, caractérisé en ce que le site de reconnaissance fixé sur lesdites particules est un site catalytique.
37. Utilisation d'un assemblage de particules colloïdales selon l'une des revendications 1 à 21 en chimie combinatoire.
38. Elément de surface porteur d'un assemblage de particules colloïdales selon l'une des revendications 1 à 21.
39. Elément de surface selon la revendication 38, caractérisé en ce que la superficie active desdites chaînes colloïdales est supérieure à la superficie de l'élément de surface portant lesdites chaînes.
40. Elément de surface selon la revendication 38 ou 39, caractérisé en ce que lesdites chaînes sont liées à ladite surface par une de leurs extrémités.
41. Elément de surface selon l'une des revendications 38 à 40, caractérisé en ce que la fixation desdites chaînes sur ladite surface est obtenue par création de liaison covalente entre les chaînes et la surface, pontage à l'aide de molécules ou de macromolécules, et/ou par des interactions électrostatiques de type hydrophobe ou Van der Waals.
42. Elément de surface selon l'une des revendications 38 à 41 , caractérisé en ce que lesdites chaînes sont assemblées sur ladite surface en au moins deux domaines distincts comportant des chaînes colloïdales porteuses de sites de reconnaissance différents.
43. Réseau d'hybridation comportant un élément de surface selon l'une des revendications 38 à 42.
44. Canal ou cellule microfluidique comprenant un assemblage de particules colloïdales selon l'une des revendications 1 à 21.
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