WO2003052103A1 - Synthetase de la prostaglandine e non specifique du glutathion, associee a la membrane - Google Patents

Synthetase de la prostaglandine e non specifique du glutathion, associee a la membrane Download PDF

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WO2003052103A1
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prostaglandin
protein
synthase
amino acid
dna
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Yoshihiro Ohmiya
Naomi Tanikawa
Kikuko Watanabe
Hiroaki Ohkubo
Seiji Ito
Katsuyuki Hashimoto
Sumio Sugano
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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Definitions

  • the present invention mainly relates to a protein having an inflatable daltathione # heterologous prostaglandin E synthase activity which is considered to be in mammals such as humans, monkeys and mice.
  • the present invention mainly relates to ⁇ ? Encoding the protein.
  • the present invention provides a means for diagnosing or treating a disease associated with prostaglandin II or daltathione non-specific prostaglandin II synthase. Background technology
  • Prostaglandin E is a bioactive substance that exerts physiological functions such as smooth muscle contraction, muscle regulation, surgical regulation, gastric acid secretion, and inhibition of the immune response. Attraction (KR Bley, JC Hunter, RM Eeglen, JAM Smith, Trends Pharmacol.Sci. (1998) 19, 141-147), Bone resorption in chronic joint rheumatism ⁇ (T Akatsu, N Takaashi, U Udagawa, K Imamura, A Yamaguchi, K Sato, N Nagata, TSuda, J. Bone Miner. Res. (1991) 6, 183-190);
  • Prostaglandin E is synthesized by isomerization of prostaglandin H by prostaglandin E synthase.
  • prostaglandin E synthase There are three types of prostaglandin E synthase: cytoplasmic dalhithion-specific enzyme, swelling-type dalhithion-specific enzyme, and ⁇ ⁇ -type dalhithion-specific enzyme.
  • the retrospective dal evening thione-specific prostaglandin E synthase is , A protein belonging to the daltathione S-transferase (GST) family (T Tanoka, Y Nakatani, ⁇ Se, yo, M Murakami, I Kudo, J. Biol. Chem. (2000), 275, 32775-32782).
  • GST daltathione S-transferase
  • E synthase is frequently found in »vessels (K Watanabe, K Kurihara, Y Tokunaga, 0 Hayaishi, Biochem. Biophys. Res. CoMiun. (1997), 1439, 406 -414.). This enzyme has been found by expressing ⁇ -type GST from Genebank in E. coli (PJ Jakobsson, S Thoren, R Moregenstern, B Samuelsson, Pro at l. Acad. Sci. USA (1999), 96, 7220-7225).
  • this enzyme differs from the other two prostaglandin E syntheses in that it is daltathione # different.
  • This enzyme has not been cloned, and the relationship between and its function has not yet been clarified. Disclosure of the invention
  • a mammalian cDNA library contains ⁇ ⁇ ' ⁇ g force j ⁇ T, a non-isolated daltathione non-specific prostaglandin E. Based on this information, based on this information, he played with the role of a protein that has a non-specific daryuthion prostaglandin E synthase. In addition, the protein encoded by the fiber was gathered to perform its function, and it was clarified that the protein had a dalgethione-like prostaglandin E synthase activity.
  • an antibody comprising the protein or a probe obtained from the protein can be usefully used for a disease, particularly for a disease, and after further study, the present invention has been completed. That is, the present invention relates to the TO of the present invention. 1.
  • Daltathione having an homology of 0% or more, and represented by an amino acid sequence having a sequence of Cys-XX-Cys and a sequence of S (where X represents an amino acid sequence of interest).
  • the amino acid sequence described in No. 5 is represented by T :, 1 or 1 amino acid m ⁇ , a deleted, substituted or substituted amino chain, and daltathione # aberrant prostaglandin E A protein that has synthase activity.
  • System I Ban No. 6 describes: »has a DNA sequence that hybridizes under stringent conditions with the DNA sequence represented by the @@ sequence or its complementary sequence, or these DNA sequences, and Daltathione # A gene that encodes a protein that has a unique prostaglandin E synthase activity.
  • N-terminal has 6 histidine residues, has an affinity amino acid sequence for affinity column, and has dalgethione non-specific prostaglandin E synthase activity Fusion evening protein.
  • one or more amino acids are represented by an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, and a non-specific daltathione prosthesis has a dalandin E synthase activity. Protein.
  • the residue encoding the protein described in any one of Items 1, 2, 3, 7, or 8 or the residue described in Section 4-6 is introduced into a vector, and the vector is used as the vector.
  • a method of promoting a protein that has dysphoric properties by purifying the protein obtained from ⁇ m by using the morphologically transformed protein.
  • Intended prostaglandin obtained by observing the protein or its partial peptide according to any of items 1, 2, 3, 7 or 8 as follows: Daltathione specially-promoted prostaglandin E Not a goto element, cormorant-type glutathione # An antibody specific for a heterologous prostaglandin E synthase.
  • the protein or its partial peptide according to any one of Items 1, 2, 3, 7 or 8 is obtained as a J « ⁇ -type daldinthione # ⁇ -type glutathione which is expressed in the cell by using an antibody specific to the inflatable daltathione fiber prostaglandin E-group, which is not supposed to be daltathione specially promoted prostaglandin E
  • a method for detecting an enzyme comprising a step of detecting prostaglandin E synthetic enzyme in ⁇ TO.
  • Protein or portion thereof according to item 1, 2, 3, 7 or 8 Swelling daltathione-like prostaglandin, which is obtained as a view of the peptide and forms ⁇ S with glutathione-specific prostaglandin E synthase, but not ⁇ -type dalgethione-specific prostaglandin E synthase Gin E Detection of diseases containing antibodies specific to goto-substances or pharmacophores.
  • a protein or its partial peptide according to any of Items 1, 2, 3, 7 or 8 is obtained as an antigen, and reacts with membrane-bound non-specific daltathione prostaglandin ⁇ synthase to bind to membrane.
  • Non-specific prostaglandin type dalhithion ⁇ A method for detecting or determining a disease comprising a step of examining deviation, presence or absence or amount of a synthase. 1 5.
  • a protein or its partial peptide in any of paragraphs 1, 2, 3, 7 or 8 is obtained as a thigh, and it is traced as « ⁇ -type daryuthione-excited prostaglandin ⁇ Glutathione specialty steel prostaglandin ⁇ ⁇ ⁇ Not traced to Adomoto ⁇ Supplied daryuthion-excited prostaglandin ⁇ Diffusion of glutathione in difficulties prepared from the heart of a sample using an antibody specific for a synthase ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . ⁇ .
  • a ⁇ -type dalbuthione-different prostaglandin E synthase-related probe consisting of a polynucleotide containing the sequence of SEQ ID NO: 8 or its complementary sequence.
  • a method of screening for a compound which has the following steps (a) to (c) and which inhibits daltathione and prostaglandin E synthase activity.
  • DNA sequence represented by the second row or its complement I ⁇ is a DNA sequence that hybridizes with these DNA sequences under stringent conditions.
  • An agent for diagnosing or treating a disease comprising a compound or a derivative thereof obtained by the screening method according to any one of Items 28 to 30 as an active ingredient.
  • a diagnostic or therapeutic agent for heart disease comprising a compound or a derivative thereof obtained by the screening method according to any one of Items 28 to 30 as an active ingredient.
  • a non-swelling-type dalbanthion non-specific prostaglandin E synthase activity promoter comprising, as an active ingredient, a compound or a derivative thereof obtained by the screening method according to any one of Items 28 to 30.
  • Prostaglandin E is known as vasodilator en ij and is raised by isomerizing prostaglandin H.
  • prostaglandin E Kidomoto is used as an isomerase.
  • Prostaglandin ⁇ ⁇ One of the synthases, dallathione-specific prostaglandin ⁇ synthesis ⁇ ⁇ , prostaglandin ⁇ Daltathione is required for synthesis ⁇ .
  • Daltathione-specific prostaglandin E synthase belongs to the GST family and has GST activity.
  • the associative daltathione non-specific prostaglandin E synthase of the present invention synthesizes prostaglandin E non-specifically with daltathione.
  • the swelling-type darubithion non-specific prostaglandin E synthase is an amino acid consisting of Cys-X-X-Cys, a sequence characteristic of the thioredoxin family. It has a partial sequence (where X represents an arbitrary amino acid system).
  • an amino acid sequence composed of Cys-X-X-Cys for example, an amino acid sequence composed of Cys-Pro-Phe-Cys is shown. For example, changing the first Cys protein to a Ser residue eliminates prostaglandin E synthase activity.
  • the thioredoxin having the sequence Cys-X-X-Cys has the sequence Cys-XX-Cys, which acts as a prostaglandin E synthase. Proteins do not necessarily have prostaglandin E synthase activity.
  • the present inventors have disclosed the above-mentioned protein having an amino sequence including a partial sequence consisting of Cys-XX-Cys and having prosidin dalandin E synthase activity. protein
  • the proteins of the present invention include the following.
  • the protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is a monkey-derived J « ⁇ -type daltathione variant prostaglandin E synthase.
  • the protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is a human-derived membrane-bound glutathione #heterologous prostaglandin E synthase.
  • the protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is a mouse-derived difficult dalban thione heterologous prostaglandin E synthase.
  • the homology (BLAST method) of the amino ⁇ SH ⁇ of the proteins represented by the sequences of SEQ ID NOs: 2, 5 and 7 is 82%, and And the protein represented by Rooster B ⁇ iJ described in 7 and 7 has a structure represented by amino ⁇ SH ⁇ J Cys-XX-Cys in common.
  • the protein of the present invention has an amino acid sequence of 80% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 5 or 7, and has an amino acid sequence having a part ffi ⁇ J consisting of Cys-XX-Cys. All proteins are included as long as they are proteins having the following characteristics and daltathione prostaglandin has a synthetic yeast decoction.
  • the origin is not particularly limited, and includes, for example, those derived from mushrooms such as sea lions, bushes, puppies, and rats.
  • the protein of the present invention is characterized in that, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 5 or 7, the amino acid sequence is represented by 1 or n iron amino acids, a deleted, substituted or substituted amino group, and Daltathione #Prostaglandin E Also includes proteins that cause sexuality.
  • the deletion, substitution or 3 ⁇ 4 ⁇ of one or more amino acids means the introduction of a mutation in the marrow that does not lose prostaglandin ⁇ synthase activity.
  • This mutation includes a mutation in the amino acid sequence of Cys-XX-X-Cys iffl ⁇ described in SEQ ID NO: 2, 5 or 7.
  • Such mutations include not only those occurring in nature but also artificial mutations.
  • As a means of inducing artificial mutation there is a powerful method such as the Hodori singular 3 ⁇ 43 ⁇ 4 mutation induction method (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982).
  • the number of mutated amino acids is generally within 20 amino acids, preferably within 15 amino acids, although the number is limited as long as the prostaglandin E synthetic enzyme does not lose its tongue properties. Preferably it is within 10 amino acids, most preferably within 5 amino acids.
  • the protein of the present invention has a DNA sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 4 or 6, or a complementary sequence thereof, or a DNAffi ⁇ O that hybridizes under stringent conditions with DNASB ⁇ J.
  • proteins that are coded and have dalgeon # -excited prostaglandin E synthase activity are also included.
  • Stringent conditions refer to conditions under which only specific hybridization is possible and non-specific I // hybridization is not possible. Such conditions are usually “lxSSC, 0.1% SDS, 37 ° C” 1 ⁇ , preferably 0.5xSS 0.13 ⁇ 4SDS, 42 ° CJ * M, more preferably 0.2% xSSC, 0.1% SDS, 65 ° C J.
  • the DNA obtained by Neubridization generally has high homology to the DNA represented by the sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4 or 6;
  • the high homology means a homology of 60%, preferably a homology of 75% or more, and more preferably a homology of 90% or more.
  • the protein of the present invention comprises, for example, a DNA sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 4 or 6, or a DNA sequence which hybridizes with these DNAffi ⁇ J under stringent conditions. This can be obtained, for example, by incorporating the residue into a vector and mixing it in an appropriate host cell.
  • the vector the vector i can be used with difficulty, such as Trc-HisA.
  • the host cell can also be used as a host cell, for example, ⁇ mBL2i or the like. Remains
  • the gene of the present invention has a DNA sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 4 or 6, or its complementary S ⁇ or DNAIB ⁇ that hybridizes with these DNAIB ⁇ under stringent conditions.
  • daltathione encodes a protein that has an abnormal prostaglandin E synthase activity.
  • the DNA sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is derived from monkeys.
  • the DNA sequence represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is a human-derived residue.
  • the DNA sequence represented by the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 6 is a mouse-derived DNA.
  • nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 4, and 6 have high homology as a whole, 100% homology around the active site, that is, the portion corresponding to the amino acid sequence Cys-X-X-Cys (BLAST method) ), With 86% homology in both the active and inactive fiber groups. In other words, it is stored at the active sound ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ level. On the other hand, ⁇ * 3 ⁇ 4 ⁇ 00 had 58% homology. In addition, Intron and Kusson's territory was also common.
  • the gene of the present invention can be obtained, for example, by preparing a DNA primer based on the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 4, and 6, and then cloning the DNA sequence using the polymerase chain. Wear. These procedures can be performed using a commercially available kit. Fusion protein
  • the present inventor has succeeded in preparing a fusion protein containing a histidine tag domain and efficiently obtaining a protein having daltathione-specific prostaglandin E synthase activity.
  • the fusion protein of the present invention includes the following proteins.
  • the amino acid sequence described in No. 3 # Introduce the DNA encoding the protein into a vector, culture the ass formed using the vector, collect the hard-to-reproduce bacteria, crush, centrifuge, and then centrifuge the supernatant Can be purified by affinity chromatography.
  • the fusion protein of the present invention it is possible to efficiently obtain a protein having a non-specific daltathione prostaglandin E synthase activity. Wear.
  • the sickleness may be inhibited and reduced by the tag portion.
  • those having the m value that is the same as the natural one may be separated. : It can be humiliated and has a form similar to heaven /, which can be tested as an enzyme by fusion.
  • the antibody of the present invention is obtained by using the protein of the present invention or a partial peptide thereof as an antibody.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, as long as they are antibodies that specifically mutate with non-specific prostaglandin E synthase of ⁇ type darubithion.
  • Monoclonal antibodies are difficult, for example, as follows. From the product transported with the protein of the present invention or a partial peptide thereof as 3 ⁇ 43 ⁇ 41, for example, a mouse, an impulsive motif with an antibody titer is added, and 2 to 5 days after the final medulla, the ⁇ or lymph nodes are repeated, and the The 41 antibody-producing spores contained are fused with the spores to prepare a monoclonal antibody; an hybridoma. 3 ⁇ 4 ⁇ By culturing hybridomas to produce antibodies, and 3 ⁇ 43 ⁇ 4.
  • the method can be performed according to the method of fusion operation, for example, the method of Kayla and Milstein (Nature, 256, 495, 1975) or a modification thereof. Polyethylene glycol (PEG), Sendai virus, etc. are used as fusion I thigh IJ.
  • the monoclonal antibody of the present invention may be used as a human H4 antibody.
  • a polyclonal antibody can be prepared, for example, as follows. Creates the protein itself or a complex with it and the carrier protein, similar to the monoclonal antibody method Perform a furnace on the object.
  • the antibody can be obtained by collecting an antibody-containing substance against the protein of the present invention from the product and isolating the antibody.
  • the type of animal used for S3 ⁇ 4i of the above antibody is not particularly limited. For example, it is possible to use egrets, mice, rats, and the like.
  • iax can detect the non-specific prostaglandin E synthase, which is a non-specific sigma-type daryuthion, which is translocated into the yeast.
  • a detection method for example,
  • the ELISA method can be performed using the antibody of the present invention to determine the amount of the escalating-type dalgar-excited prostaglandin E compound observed.
  • the ⁇ method was performed using the antibody of the present invention, and the detailed description was based on the immunological detection of the intestinal daluzin # differential prosthetic dalandin ⁇ synthase expressed in the insert. Wear.
  • the antibody of the present invention can be converted into 3 ⁇ 4a ⁇ J and used as a diagnostic agent or a disease marker.
  • the prostaglandin E synthase which is an inflatable bell-shaped quan in the cells of a person with difficulty or in the pendant, is detected using the antibody of the present invention, and the function of the enzyme is determined.
  • myoglobin also causes the onset of myocardial infarction it to fall off the shelf, and anti-myoglobin anti-myoglobin has been usually used for wisteria in myocardial infarction.
  • myoglobin weekly occurs about 1-hour after the onset of myocardial infarction and peaks at about 5 hours ⁇ T.
  • the detection using the antibody of the present invention can more accurately and appropriately determine the myocardial infarction sound, rather than using the myoglobin antibody.
  • the cause of the death was clarified by examining the heart tissue of the postmortem specimen.!] For example, when determining whether the cause of myocardial infarction was ⁇ E, the antibody of the present invention was used rather than using an anti-myoglobin antibody. It is possible to more accurately and appropriately determine the cause of death by investigating the cause of death. Probe
  • a polynucleotide having at least 15 ass and Z or a polynucleotide complementary thereto are used, It can also be a probe.
  • the pro-tag includes « ⁇ -type glutathione for Suijun Prostaglandin E synthase fiber, ⁇ -type dalyuthione, special prostaglandin E synthase specialty, and 3 ⁇ 4 ⁇ -type glutathione. It can be used for diagnostic purposes such as Lanzin E synthesis. ⁇ -type dal evening chemoactive prostaglandin E-synthesis Fujiseki's illness includes myocardial lining; L disease and stomach disease.
  • RNA or DNA RNA or DNA
  • wear As a method of viewing the numbers of the no-crossing and the hybridization, there are, for example, a Northern plot method, a FISH method, and the like.
  • the polynucleotide may be added with a detectable symbol to detect the ⁇ .
  • Detectable ⁇ ⁇ can be stored from what is known to be very difficult.
  • avidin and piotin, peroxidase, alkaline phosphatase, pendent isopentane eg, 32 l and 35 S, etc.
  • pendent isopentane eg, 32 l and 35 S, etc.
  • a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 8 is particularly preferable.
  • the sequence contained the following sequence: swelling 1; This ffi ⁇ J is based on ⁇ "evening; ⁇ has the lowest homology with other proteins. By using this region, » ⁇ -Type daltathione Escherichia coli prostaglandin E The ability to specifically detect a gene encoding a protein that activates Ito is a T ability.
  • the length of the probe is not particularly limited to 5 arms, but is usually 15 to 1200 bases, preferably 25 to 1000 bases, and more preferably 40 to 80 bases.
  • the probe of the present invention can be used for detecting or determining disease, analyzing prognosis, and the like.
  • a probe of the present invention is brought into contact with a sample such as DNA or RNA prepared from a sample sample, and the presence or absence or the amount of a gene binding to the probe is measured. Judgment or diagnosis of a disease associated with prostaglandin E synthase, for example, heart disease can be performed.
  • a method of examining a residue bound to a probe for example, a Northern plot method and an in situ hybridization method can be mentioned. The conditions for binding and hybridization can be set, but it is preferable to carry out under stringent conditions.
  • the transgenic non-human animal according to the present invention refers to a human mammal prepared by introducing the i ⁇ of the iKSB ⁇ into any of SEQ ID NOs: 1, 4 and 6 11 means things.
  • Examples of human isolated LI include mice, egrets, and rats.
  • Methods for producing transgenic non-human animals include, for example, a method in which a micropipette is inserted directly into the nucleus of the progenitor under phase advancement (microinjection ⁇ 3 ⁇ 4), and a method using a stem cell (ES » The method can be performed by inserting a residue into a retrovirus vector or an adenovirus vector and fibrous the egg, or by a sperm vector method in which the residue is introduced into the egg through an eaves.
  • the introduction of the remains in the fertilized egg boat be carried out in such a way that all of the in-contact and somatic cells of the object are used.
  • the use of the gene of the present invention in the lunar fiber vesicles of the produced animal after the introduction of the genus means that the produced animal's offspring exerts a function on all of the vesicles.
  • the offspring of this type of animal that inherited the remains is? ⁇ 3 ⁇ 4: the remains of the invention in all of its ⁇ 3 ⁇ 4 and vesicles.
  • the transgenic non-human animal created as described above stably breeds the remains by mating.
  • the transgenic non-human animal of the present invention can be used for, for example, the use of ⁇ type daltathione non-specific prostaglandin E synthase. It can also be used for the development of disease model animals used for raw fiber. In addition, by administering a substance to transgenic non-human animals and observing the effects of neat substances on the transgenic animals, it is possible to screen for substances that are optimal for diagnosis and treatment of disease. You can do it too. Knockout non-human food
  • the knockout non-human mammal of the present invention refers to a daltathione #fiber prostaglandin having 12 rows described in any one of SEQ ID NOs: 1, 4, and 6. It has been assigned to lose its function.
  • Non-human threat L-animals include human mammals such as mice, egrets, and rats.
  • a knockout non-human animal can be affected by, for example, performing homologous fiber using ES cells and covering one of the male and female cells by using a ruptured embryonic stem cell. Specifically, for example, when a mouse is used as a non-human masticated animal, the embryo-derived stem cells obtained by manipulating the embryos and the embryo-derived cells and the embryo-derived embryos Obtain a chimeric mouse.
  • this chimeric mouse (a chimera is a single to «formed from somatic cells based on two 1 :), and a normal mouse, one of the paired iStfe? Able to embrace an aged mouse. Furthermore, homozygous mice (knockout mice) can be obtained by heterozygous mice with each other for 33 ⁇ 4e.
  • the knock-out non-human corn liposome of the present invention is daltathione non-specific prostaglandin E Prediction of action of protein having synthase activity, daltathione-like prostaglandin ⁇ protein or guruyuthione having goto-element activity ⁇ different prostaglandin ⁇ ⁇ Synthase is expected to be involved
  • the present invention can be effectively used for disease clarification, screening of pharmaceuticals for the prevention or treatment of diseases associated with the protein or the enzyme, and development of disease model animals used for bioassay. promoter
  • the DNA having the promoter activity of the present invention has the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 or the entire SIH sequence or ⁇ , and comprises the initial glutathione heterologous prostaglandin E synthesis. DNA that controls enzymes.
  • the present invention includes a recombinant DNA in which a DNA encoding the promoter activity and a gene encoding an intact daltathione-specific prostaglandin E synthesis II are inserted into a vector DNAfcl. It also includes a DNA having the promoter activity and a recombinant DNA having a reporter-encoding gene inserted into a vector DNA.
  • a recombinant DNA having the promoter encoding the swelling-linked daltathione non-specific prostaglandin E synthase into vector DNA into the genome of a host cell.
  • the hybrid glutathione prostaglandin E synthase can be activated.
  • the recombinant DNA is introduced into a host animal cell while the promoter and reporter enzyme encoding fi ⁇ are inserted into a vector DNA, and the promoter is introduced into the host animal cell. You have the power to control your life.
  • the promoter region is keyed upstream of the storm-binding daltathione non-specific prostaglandin E synthase translation region, and is cloned by PCR based on the upstream and downstream: 13 columns. Can be obtained.
  • the present inventor found that the results are as follows. It has been clarified that the region corresponding to the sequence 0 controls the expression of the gene encoding the swelling type glutathione # heterologous prostaglandin E synthase, that is, the promoter activity. .
  • the region denoted by ⁇ ffi ⁇ J described in the system symbol No. 10 is the sequence number
  • the region represented by No. 9 is sequentially deleted from the top, and the region with high promoter activity determined by measuring the promoter activity? is there.
  • the DNA having the promoter overnight activity of the present invention includes, in addition to those represented by SEQ ID NOS: 9 to 10, the ffl self DNA having a different sequence, a DNA comprising at least the sequence of 3 ⁇ 4 of the above sequence or a DNA containing at least the sequence of Lb and having the same leakage as the above promoter, for example, nucleotides 9 to 10
  • one of the following sequences has one missing or a missing or assassinated sequence, which has a residual promoter activity that encodes a fed-type glutathione-excited prostaglandin E complex. included.
  • the present invention includes a DNA having the promoter activity, a gene encoding a non-supplied daltathione non-specific pros darandin E synthase, and a gene encoding Z or a reporter protein. , Signal sequence, Janghan, etc. are inserted into the vector D ⁇ ⁇ , including recombinant D ⁇ ⁇ . Recombinant DNA can be combined according to the method of play. As the residue encoding the target prostaglandin E synthase, the residue of the above 3 * invention is suitably used.
  • the promoter In the host, the promoter, a residue encoding the non-specific prostaglandin E synthase of daltathione E, which is a type of kayagoi? If the recombinant DNA introduced into the DNA is introduced, for example, in the treatment, by controlling the promoter, it is possible to promote the age-related daltathione in the cells of interest.
  • the ability to control the expression of prostaglandin complex ⁇ For example, Promoter HI ⁇ ?, which calls the ⁇ S3 column of rooster No. 10, has a high level of tongue transfer, so
  • the recombinant D ⁇ ⁇ containing the expanded daltathione, which encodes an unusual prostaglandin E synthase is introduced into the host animal.
  • the power supply type Dal-Yu Zion non-special steel prostaglandin ⁇ It is important to be able to perform 4 times more efficiently than usual.
  • a plasmid or a recombinant DNA is prepared by aging a repo receptor to ⁇ , for example, luciferase 3 ⁇ 4 ⁇ , on DN ⁇ having the promoter activity of the present invention, and preparing the plasmid or plasmid.
  • the escalating type It can measure the transcription activity of dalandin E synthase and the measurement of ⁇ # that various compounds give to ⁇ .
  • upstream of the repo such as the firefly luciferase
  • the system number 9 to 10 DNA with or without the MS sequence and promoter activity
  • Plasmid is made by inserting DNA having sequence.
  • This plasmid is introduced into the spinach cell using the derivative ⁇ . After the introduction of the plasmid, the cells are cultured for 1 to 2 days to disrupt the cells, and by examining the activity, the daltathione type II prostaglandin and the Atoto fiber tongue can be established.
  • a plasmid prepared by introducing a plasmid having a reporter gene and DNA having promoter activity ⁇
  • a variety of compounds were converted, and the respective compounds were excreted.
  • the tongue properties it is also possible to measure the effect of the compound on the tongue properties of the J « ⁇ -type daryuthion steel prostadalandin E synthase.
  • the visit method it is also possible to efficiently screen a substance that is a prottaglandin E-synthase-enzyme-inhibited Ml or ⁇ or ⁇ ⁇ -type daltathione-enzyme-inhibiting enzyme, or a substance that prevents disease or reverses disease.
  • a compound that inhibits the activity of dalyu thione-stimulated prostaglandin E synthesis is considered to be a preventive agent for diseases associated with the enzyme or a mechanic in Jinlin. Screening for compounds that inhibit or inhibit daltathione non-specific prostaglandin ⁇ synthase activity can be performed, for example, by the following steps (a) to (c). .
  • the conversion rate from Pros Evening Dalandin H to Prostaglandin E is calculated from the following formula it can.
  • Another screening method is as follows.
  • a promoter and a vector containing a repo overnight HffiS? Linked to be able to be expressed by the promoter, is provided with a fiber substance, and the reporter HtiS Using the expression of?
  • the screening method including the step of measuring the effect on the control of the expression of the Nene's substance » ⁇ -type darubithion-prostaglandin E synthase gene can be performed.
  • the promoter for example, a promoter such as DNA described in SEQ ID NO: 9 or 10, which is referred to as "Twelve columns", is used for such purposes as DNA.
  • transgenic non-human mammal or trait transfected with the gene of the present invention.
  • a screening method including a step of administering a ninen substance to a knockout non-human animal of an invention and observing the effect of the ninen substance on an mx mm body.
  • transgenic non-human kneaded material knock-apart non-human mastication
  • Prostaglandin E is synthesized by prostaglandin H isomerism by swelling-linked daltathione non-specific prostaglandin E synthase.
  • Prostaglandin H is synthesized from prostaglandin G by C GX-1 enzyme or COX-2 enzyme.
  • the COX-1 and COX-2 enzymes are the top enzymes of the non-specific prostaglandin E synthase.
  • the inhibition of this COX-2 enzyme is marketed as arthritis treatment.
  • firewood j has been reported to be prone to heart attack and palpitations as a side effect (Dowj ones Newswires, 0ct 30, 001).
  • prostaglandin H synthesized by COX-2 enzyme, or prostaglandin E, D, or F synthesized via prostaglandin H has a significant function in the heart. That is done.
  • Prosthetic Daljin was responsible for the work of the heart.
  • the protein containing swelling-type dalhithion non-specific prosudaniesdin E synthase or J « ⁇ -type dalhithion fiber prostaglandin E kondo element can be used as a motivational ligament.
  • compounds that inhibit membrane-bound darubithion non-specific prostaglandin E synthase activity are considered to be orchids or diseases related to diseases, myocardial nervous system or muscle. It can be used as !!
  • the heart disease includes, for example, myocardial infarction, total, palpitations, cardiomyopathy and the like.
  • Prostaglandin E is a physiologically active substance that causes smooth muscle contraction and gastric acid secretion physiological effects. Jealous measurements of the stomach were carried out using the daltathione # -specific prostaglandin E synthetic antibody of the present invention. Non-specialized glutathione prostaglandin was used in the proper glands of the stomach and the like. This is a ⁇ # This shows that the possibility that the heterologous prostaglandin E synthase is involved in gastric digestion may be altered.
  • the protein bound to the membrane-bound dalhuthion non-specific prostaglandin E synthase or lin-supplementary dalhuathione different prostaglandin E synthase can be obtained by using a free fiber.
  • Diseases related to stomach elimination are likely to be effective diagnoses or cures for diseases involving smooth muscle.
  • swelling-linked darubithion non-specific prostaglandin E synthase activity inhibitory compounds also inhibit stomach quenching ability and are associated with smooth muscle-related diseases. To control the relaxation of the stomach muscles or to control the relaxation of the stomach muscles.
  • the diagnosis or cure of the present invention is based on the above-described ⁇ ⁇ ⁇ , protein, antibody, probe, and prostaglandin obtained by the screening method of the present invention.
  • the compound can be obtained by directly converting the compound derived from the compound.
  • the diseases which are diagnosed by the present invention and which can be used to treat Jinlin include the sounds in which the intestinal daltathione non-specific prostaglandin E Kidomoto is involved or involved, for example, heart, stomach, S liver, Teng Diseases such as the viscera, testis, ovary, and placenta are possible.
  • ethacrynic acid and 1-chloro-1,2,4-dinitrobenzene had non-specific daltathione prosidase. It has been found that it has an effect of inhibiting the gallness of dalandin E synthetic enzyme.
  • ethacrine X is 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, etc. It is suggested that it will be an effective substance.
  • the sickle of non-specific glusthiothion prostaglandin ⁇ synthesis ⁇ active compound that is, ⁇ supplemented dalluthione non-specific prostaglandin ⁇ Substances can also be expanded.
  • the compound obtained by the above screening method for example, ethaculin can be used to induce 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, etc.
  • it is suggested that disease, prevention or cure is developed.
  • the compound obtained by the screening method using the promoter of the present invention for example, interferona, etc., is a substance in the inhibition of membrane-aged glutathione-secretary prostaglandin E synthase reversal. Power 11 changed.
  • a compound having JK ⁇ -type dareletachi-awake prostaglandin E synthase activity i.e., ⁇ supplemented dalbanthione # is effective in promoting different prostaglandin E synthase ⁇ i substances can also be searched.
  • the compounds obtained by the above screening method for example, such as interferona and other Hi compounds, the swelling-type daryuthione-excited prostaglandin E Kido, which exerts a stronger transcriptional activation activity ⁇ It is also possible to open the door to prevent or cure diseases.
  • FIG. 1 shows a comparison of non-specific membrane-bound glutathione-derived prosidadarin from humans, monkeys and mice.
  • FIG. 2 is a diagram showing the formation of pTH-PGES and pTH-PGESAS, which are non-specific darubithion non-specific prostaglandin E synthase vectors for expression of E. coli.
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression of a non-specific prostaglandin ⁇ synthase and the elaboration of the Kyoai-Kaigo-type dalhithion.
  • FIG. 4 shows the elution curve of affinity chromatography of non-specific prostaglandin ⁇ synthase of dalyoshin type. Purified product elutes between fractions 50-58.
  • FIG. 1 shows the formation of pTH-PGES and pTH-PGESAS, which are non-specific darubithion non-specific prostaglandin E synthase vectors for expression of E. coli.
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression of a non-specific prostaglandin ⁇ synthase and the elaboration
  • FIG. 5 is a diagram showing the correlation between the amount of non-specific prostaglandin E synthase for daltathione and prostaglandin E synthetic fiber. The activity is reduced by using the Dal-Yu-Thion #, a different type of pros-glandin E synthase, and the enzyme activity is reduced by removing DTT.
  • FIG. 6 is a graph showing the p ′ property of the enzymatic activity of cormorant-bound dalhuthion non-specific prostaglandin E synthase.
  • FIG. 7 is a diagram showing the leakage of SH agents (DTT, GSH, mercaptoethanol) on the enzymatic activity of swelling-shaped darubithion non-specific prostaglandin E synthase.
  • FIG. 8 is a diagram showing a western plot image of ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4 recognition by a non-specifically linked daltathione non-specific prostaglandin E synthase antibody.
  • ⁇ in Fig. 8 is a negative control, which uses COS 7 cells.
  • C and 13 are positive controls.
  • Figure 9 shows the northern plot of the release of non-specific prostaglandin E-synthesis of membrane-type dal-u-thion at the peripheral level.
  • FIG. 4 is a drawing showing the result of performing a Western plot using an E synthase antibody.
  • FIG. 10 is a diagram showing the effect of ethacrynic acid on non-specific daltathione prostaglandin E synthase activity.
  • FIG. 11-1 is a drawing showing the results of examining the heart of a human subject by the histochemical technique using oven staining using the antibody of the present invention.
  • FIG. 11-2 is a drawing showing the results of analyzing the genetic expression of the present invention in the heart by Northern blotting using the probe of the present invention.
  • Fig. 12 shows the results of HE (Hematomatology) on human heart that died from myocardial infarction.
  • 1 is a drawing showing xylin-zeodin), and Yoshika, stained with an anti- # anti-myoglobin antibody, an anti-COX-1 enzyme antibody and an anti-COX-2 enzyme antibody of the present invention.
  • FIG. 13 shows the genome of the non-specific sculpture-type dalhithion non-specific prostaglandin E synthetic yeast Fiber;) 3 ⁇ 4i, cloned promoter region: ⁇ about 4.5 kb, and inserted reporter It is the remains of the remains.
  • Fig. 14 shows the regression rate of 4.5 kb inserted into the promoter ⁇ region, transfection into A543, HeLa, and Hek293 cells after inoculation of repo overnight HI.
  • FIG. FIG. 15 is a diagram showing a change in the conversion rate in an experiment in which the catabolite region in the threat L cell A543 was deleted from above.
  • FIG. 16 shows the change in transgenicity when administering interferoner to HeLa ⁇ cells produced using the repot overnight ( ⁇ ) into which 4.5 kb of the promoter territory had been inserted.
  • FIG. 17 is a drawing showing the expression of the residual ⁇ ? Vector used for preparing the transgenic mouse. Best mode to make invention
  • Glu-Arg-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu- is purified from the heart by purifying the non-specific prostaglandin E synthase supplied by the restaurant and using the amino acid sequencer. Ser- Leu- Ser- Ser- Arg- Leu- Asn- Leu- T r- Leu- Tyr-Asn-Tyr-Lys-Thr and system ij were determined. Based on this sequence, we discovered the human origin « ⁇ ⁇ ⁇ using the Genebank database as a key. In addition, cDNA libraries of monkeys and mice were also analyzed, and a residue derived from salile with high homology to AK024100 and a mouse ⁇ were found.
  • the protein encoded by the monkey-originated monkey was introduced into bacterial BL21 using pTrc-HisA vector (Invitrogen) and expressed.
  • the prostaglandin of the expressed protein (the following was used to examine the synthase activity).
  • the radioactivity of the prostaglandin E spot point and the other prostaglandin d'alange; ⁇ 1 spot points was measured to determine whether the prostaglandin H was transferred from the prostaglandin H to the prostaglandin E.
  • ⁇ 1 spot points was measured to determine whether the prostaglandin H was transferred from the prostaglandin H to the prostaglandin E.
  • the same measurement was performed in a system not containing the protein of the present invention.
  • prostaglandin E synthase activity (lmg (milligrams per minute) of prostaglandin H is converted from prostaglandin H to prostaglandin H from prostaglandin H to prostaglandin E.
  • the prostaglandin E synthase activity of the obtained protein was 500 nmole / min ⁇ mg in the presence of the SH agent and 2800 mnole / min ⁇ mg in the case of 0.5 mM (mmol) DTT. Was done.
  • Figure 1 shows the results of amino acid sequences of proteins derived from humans, monkeys and mice.
  • the homology of amino acids E ⁇ J of these human, monkey, and mouse-derived proteins was 82% when determined by the BLAST method.
  • the 110th Cys3 ⁇ 4S is replaced with Ser3 ⁇ 4S.
  • prostaglandin E combined property was examined in the same manner as in ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , prostaglandin E was not synthesized.
  • changes in the sequence Cys-Pro-Phe-Cys affected prostaglandin E synthase activity.
  • Example 2 shows the results of amino acid sequences of proteins derived from humans, monkeys and mice.
  • the homology of amino acids E ⁇ J of these human, monkey, and mouse-derived proteins was 82% when determined by the BLAST method.
  • a QccE-16688 clone containing a monkey-originated 5 'clone from the monkey that has the same swelling as the AK024100 remains is extracted from the EcoRI / Ba U site and inserted into the pTrc-HisA vector to create pT-PGES. did. Next, it was excised at the Hindi II / BamHI site and inserted into pcDNA3.1 / HisC to create pcEHPGES. The PGES (prostaglandin E synthase) portion was cut out by PCR and inserted into the CR2.1-TOP0 vector to create pCR-PGES.
  • a vector pTH-PGES was cut out of the fiber at the BaII / EcoRI site, inserted into the pTrc-HisA vector, and expressed in Escherichia coli to express the full-length prostaglandin E synthase of monkey-supplied glutathione (Fig. 2 This is shown in Figure).
  • PCR was used to amplify the daryuthion # -excited prostaglandin E total return protein from which 87 amino acids were deleted, followed by pcDNA3.1 / HisC Into the pTrc-HisA vector and inserted into the pTrc-HisA vector to express the monkey-derived glutathione ⁇ excited prostaglandin E synthase in E. coli. PTH-PGESAS (Shown in Fig. 2).
  • the resulting two vectors (pTH-PGES and pTH-PGESAS) were introduced into M ⁇ BL21 to prepare a transformant and to detect the filamentous protein.
  • Protein expression conditions were as follows: first, in a small amount of LB medium, transfer the cells to a 150 ml (milliliter) LB medium at 37 ° C until the OD (600 nm) became 0.1 at 37 ° C. Then, IPTG was added so as to become ImM, and the cells were cultured for 14 hours. (Represented in Figure 3).
  • the precipitate was collected by centrifugation at 3000 xg for 20 minutes.
  • ® is a solution (30 mM (millimole) KPB, 1 M NaCl, 0.5 mM (mmol) DTT, ImM (mmol) peptat inA, l ⁇ (micro G) / ml (milliliter) PMSF, 50 g (microgram) / ml (milliliter) DNAse, suspended in 50 (microgram) / ml (milliliter) Rase, H 7.0), and 10 supersonic sounds for 15 seconds « Was applied. After centrifugation at 15000 xg for 30 minutes, the supernatant was recovered (shown in Fig. 3).
  • the supernatant was adjusted to 10 mM (mmol) imidazole, added to a Ni affinity column, and the protein with low fragility with the column was added with 10-140 mM (mmol) imidazole.
  • the eluate was used to elute the ⁇ ⁇ -type daryuthion unique prostaglandin E synthetic protein with 150 mM (mmol) imidazole (elution curve is shown in Fig. 4). The eluted protein was confirmed to be a single band.
  • the protein yield using pTH-PGESAS is lower than that using pTH-PGES, and 250-300 g (microgram) of purified protein is obtained from Linya in 150 ml (milliliter) LB medium. That was.
  • the purification of the obtained protein was compared with that of the protein obtained using pTH-PGESAS, the protein was easily purified by chromatography. It was insoluble in the protein obtained using «7] and could not be purified.
  • Prostaglandin E synthase activity was measured in the same manner as described in Example 1, and the enzyme activity value was determined from conversion of prostaglandin H to prostaglandin E (unit of enzyme activity value).
  • nmol (nanomol) / min ⁇ rag indicates the change in M CPGE «® per 1 mg protein per minute).
  • the obtained protein had prostaglandin E synthase activity, and the activity and the amount of protein had a window relationship (shown in FIG. 5A).
  • the pTH-PGESAS-derived non-promoted daltathione non-specific prostaglandin E synthase protein reduced the activity at protein level of O. lng (nanogram) to less than one-fifth by »9. (Represented in Figure 5 ⁇ ).
  • the enzyme activity was reduced to about 1/4 (represented in FIG. 5).
  • the pH was around 7 (shown in FIG. 6), and the Km value was about 28 ⁇ M (micromol). This was comparable to that of purified feeder-derived glutathione #heterologous prostaglandin II synthase.
  • the amount of prostaglandin E synthase under DTT, dallathione, and mercaptoethanol were determined.
  • the tongue correlation was examined. As a result, it was less apt to tongue under DTT than daltathione, and I was more receptive to the fact that the main body was excited by glutathione.
  • rice cake loaf was performed by Western blot.
  • prostaglandin E synthase tongue was measured in the presence of a fiber compound in the presence of 6 xg (microdum) of the protein obtained in Example 2, 5 mM (mmol) DTT, and prostaglandin H.
  • Prostaglandin E synthase activity was determined by measuring the conversion of prostaglandin H to prostaglandin E in the same manner as in Example 1.
  • the human heart was examined by the ffi i ⁇ method using DAB (diamide benzidine) staining.
  • DAB diamide benzidine
  • Prostaglandin ⁇ is a hormone involved in the contraction of smooth muscle, 3 ⁇ 4; ⁇ . From this, it can be seen that the intestinal dalgeon # dysprostaglandin ⁇ synthase is responsible for contracting the heart muscle. Have a strong relationship.
  • Example 6 The same details as in Example 6 were performed on a human heart that died of myocardial infarction (FIG. 12). Humans used for 1 hour and 21 minutes after death were used.
  • HE Hematoxylin-Eodine
  • Hematoxylin, and Jae-sin are the most important.
  • the intracellular pH is lowered and the tonicity is increased.
  • hematoma is early It does not turn into ⁇ ⁇ .
  • the nucleus disappears along with the ⁇ in the back of the boat, the cells become fiber-shaped, and the morphology is stained, and the stained image cannot be seen. Therefore, HE staining refers to the early stage following myocardial infarction.
  • the HE-stained heart was examined by a pairing ⁇ method using the Yakichiai dalyuthione #heterologous prostaglandin E synthase antibody of the present invention obtained in Cat Example 4. In the most common sounds, the thigh image was not remarkable due to the non-specific prostaglandin E synthase antibody.
  • BAC library which is a human genomic DNA library, using " ⁇ (ffi column number 8) of daltathione heterologous prostaglandin E synthetic enzyme fiber as probe, including daltathione non-specific prostaglandin E synthetic enzyme fiber Of the three clones (BAC 82 A17, BAC 198A3, BAC 395P17)
  • all the clones were analyzed by PCR using the daryuthion specific prostaglandin E synthase fiber ⁇ Therefore 3 ⁇ 4it endured.
  • a search of the Genebank database revealed that the long cDNA for daltathione-specific prostaglandin E synthase was contained in AK057049 and that the transcription start point was located at 531b upstream of the translation start point. Further, about 4. lkbp upstream thereof was identified (see FIG. 13; SEQ ID NO: 9). To clone this 4.5 kbp, using primer 1, PF1 (TCC ATT TCC TGG ACA CCC TAG GIT CA) PRl (CAG CCG GGT CCA TGT TCG CI), fAC PCR was performed using BAC 82A17 as a template. 4646 bp upstream of the translation start site was cloned.
  • the 4116th position from the upstream of this sequence was predicted to be the starting point of transcription. This was introduced into a commercially available relucifer fermenter, pGV-E2, to produce p GV-PGES2 (-4115). This pGV-PGES2 (-4115) was transfected into three types of suckling cranes (human lung-derived boat 549 cells, human uterine-derived IeLa cells, and human drug I®®-derived Iek293 cells). (See Fig. 14) Highly transgenic in 549 cells, showing approximately 6 times the activity compared to HeLa cells. From this, it was clarified that daltathione non-specific prostaglandin E synthase shows particularly high transcription efficiency in lung hearing cells.
  • the promoter region was deleted from pGV-PGES2-3131), pGV-PGES2 (- 1932), pGV-PGES2 (-792) and pGV-PGES2 (-7).
  • pGV-PGES2-7) showed the highest conversion (Fig. 15).
  • a sequence that most efficiently transcribes dalyu thione non-specific prostaglandin E synthase was included.
  • 201 showed an unusual morphology and were transplanted into eight lateral mice. After transplantation, 67 mice grew. After extracting genomic DNA from the genome and using PCR to determine whether or not daltathione was added to the genomic DNA, synthetic transgenic yeast cells were inserted into the genome. Furthermore, it was found that transgenic mice that express daltathione-excited prostaglandin ⁇ Aito Fiber ⁇ ? In a strange manner have the same behavior as normal mice and have reproductive ability. Possibility of using
  • a ship of an enzyme capable of non-specifically binding daltathione to prostaglandin E having an important physiological function or action as a local hormone in all mammalian organisms has been clarified.
  • the enzyme has an amino acid sequence IJ according to System I, 2, 5 or 7, or an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence, and a part consisting of Cys-XX-Cys. Obtain the amino acid sequence of the sequence. This is not in the plastaglandin ⁇ synthase that is specially recommended for dallastion; it is, and the findings obtained from this Nebula 1 can be usefully used to elucidate the functions of prostaglandins E and ⁇ . What you get.
  • Bound dalhithion non-specific swelling-type prostaglandin E synthase plays an important role in various sounds in the body such as the heart and stomach. Therefore, by conducting a study in which the gene, protein, anti-transgenic animal or promoter of the present invention are converted, a useful means for diagnosis and treatment of each disease involving the enzyme is provided. ⁇ shared.
  • the present invention further provides a method of screening for a compound that inhibits bowel-like glutathione ablation-type pros evening alandin-binding activity. By focusing on the compound obtained by the screening method or the derivative thereof or a similar compound, the ability to develop or diagnose various diseases or other diseases including diseases can be developed.
  • the present invention provides a new and useful means for treating or treating diseases involving plastaglandin E or the prostaglandin E synthase having an important function in vivo. Is what you do.

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Description

明 細 書
臌給型グルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素 技 術 分 野
本発明は、 ヒト、 サル及びマウス等の哺乳類に ると考えられる膨船型ダル タチオン # 異的プロスタグランジン E合成酵素活性を有するタンパク質に主に関する。 また該タンパク質をコードする遺 β?に主に関する。
本発明は、 プロスタグランジン Ε又はダルタチオン非特異的プロスタグランジン Ε 合成酵素に関 する疾患の診断又は治療のための^!な手段をま するものである。 背 景 技 術
特許; «、 を含む、 明細書に記載の全ての が、 参照とし て、 この出願に援用される （incorporated by references) 。 先行 ¾ϋを構成するどの も含ま lよい （no admission) 。 の中で述べられている議論は、 その 著者の考えを述べるものであり、 本願出 は、 の正確さと適切さについて意見 を述べる禱 Uを； る。 明細書中で多くの先行; «カ渗照されているが、 この参照はこ れらの: が を形^ fることを認めるものではない。
プロスタグランジン Eは、 平滑筋の収縮、 锾、 術显調節、 胃酸分泌、 免疫反応の 阻¾¾どの生理作用を する生衝舌性物質であって、 多様な生離性を持ち、 痛麵 の誘引 （KR Bley, JC Hunter, RM Eeglen, JAM Smi th, Trends Pharmacol. Sci. (1998) 19, 141-147) 、 慢性間接リウマ^ での骨吸収雄 (T Akatsu, N Taka ashi, U Udagawa, K Imamura, A Yamaguchi, K Sato, N Nagata, T Suda, J. Bone Miner. Res. (1991) 6, 183-190) などの;) ¾SIに関与する。
プロスタグランジン Eは、 プロスタグランジン E合成酵素により、 プロスタグラン ジン Hが異性化されて合成される。
プロスタグランジン E合成酵素には、 細胞質型ダル夕チオン特異的酵素、 膨結合型 ダル夕チオン隋異的酵素、 及ぴ臌给型ダル夕チオン特異的酵素の 3つのタイづ f る。
細顧型ダル夕チオン特異的プロスタグランジン E合成酵素は、 大脳の細顧画分 から発見され ダルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST) ファミリ一に属するタンパ クである (T Tan i oka, Y Nakatani, Ν Se腿 yo， M Murakami, I Kudo, J. Biol. Chem. (2000) , 275, 32775-32782 ) 。
膨結合型ダルタチオン特異的プロスタグランジン: E合成酵素は、 »器に多く雜 する (K Watanabe, K Kurihara, Y Tokunaga, 0 Hayaishi, Bioc em. Biophys. Res. CoMiun. (1997) , 1439, 406-414. ) 。 この酵素は、 ジーンバンクより ίΙ^された^^ 型 GST を大腸菌内で発現させることによって、 見出されている （PJ Jakobsson, S Thoren, R Moregenstern, B Samuelsson, Pro at l. Acad. Sci. USA (1999) , 96, 7220-7225) 。
一方、 膨結合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素は、 心臓、 子 宮、 脾臓に多く存在する （K Watanabe, K Kurihara, Y Tokunaga, 0 Hayaishi, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1997) , 1439, 406-414. ) 。 本酵素はジチオトレイ トール、 ダル夕チオン、 ）3-メルカプトエタノールなど SH剤を要 るが、 ダルタチ オン特異的ではない （K Watanabe, K Kurihara, T Suzuki, Biochii. Biophys. Acta (1999) , 1439, 406-414) 。
つまり、 この酵素はダルタチオン # 異的である点で、 他の 2者のプロスタグラン ジン E合成瞧と異なった'隨を有している。 本酵素〖妹だクローニングされておらず、 と機能との関係も未だ明らかとなっていなかった。 発 明 の 開 示
本発明者は、 貌纖討を重ねた結果、 哺乳類の c DNAライブラリーに、 離合型 ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合藤素に該当する遺 β^'髒 g力j^Tる ことを見出し、 この情報をもとに、 ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵 無性を るタンパク質の職を同 ることに戯した。 また、 纖 がコード するタンパク質を懇させて、 その機能 斤を行い、 該タンパク質が、 ダル夕チオン ,的プロスタグランジン E合成酵素活性を有することを、 明らかにした。
さらに、 該タンパク質を ί¾Ιとする抗体や、 該遺^から取得されるプローブが、 疾患、 特に 疾患の薩に有用に用い得ることを見出し、 更なる検討を重ねて、 本発明 を¾1"るに至った。 即ち、 本発明〖 の TOに関する。 1. 以下 （1 ) 〜 （4) のいずれかに記載されるタンパク質。
( 1 )配歹 I墦号 2記載のアミノ酸配列によって表されるタンパク質。
(2) 播号 2記載のアミノ麵列において、 1若しくはネ纖個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは働口されたアミノ麵列により表され 且つ、 ダルタチオン非特異的プロ ス夕ダランジン E合成酵素活性を有するタンパク質。
(3)
Figure imgf000005_0001
0 %以上の相同性を有し、 且つ、 Cys-X-X- Cysからなる部^ S己列（ここで Xは ί£意のアミノ膨連を表す。 ) を^ るアミノ酸配 列により表され ダルタチオン 励プロスタグランジン Ε合藤謙性を # "るタ ンパク質。
(4)配列番号 1記載の 列により表される DNA配列又はその相補配列又はこれ らの DNA配列とストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする DNA配列によりコ ードされ、 且つ、 ダルタチ才ン# ¾¾プロスタグランジン E合成酵素活性を有する夕 ンパク質。 2. 以下（5) 〜 （8) のいずれかに記載されるタンパク質。
(5)配^!播号 5記載のアミノ翻列によって表されるタンパク質。
(6) 号 5記載のアミノ觀列にぉレ T：、 1若しくはネ纖個のアミノ m^、欠失、 置換若しくは働口されたアミノ隱列により表され 且つ、 ダルタチオン # 異的プロ スタグランジン E合成酵素活性を るタンパク質。
(7)醇蹯号 5記載のアミノ菌列と約 8 0 %以上の相同性を有し、 且つ、 Cys-X-X- Cysからなる部 列 にこで Xは ffi のアミノ膨搞を表す。 ) を Τるアミノ« 列により表され ダル夕チオン 異的プロスタグランジン E合成酵無性を: る夕 ンパク質。
(8) 膨皤号 4記載の:^ SH列により表される DNASH ^又はその相補配列又はこれ らの DNA配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNA配列によりコ ードされ、 且つ、 ダルタチオン 励プロスタグランジン E合成酵謙 I生を^ Tる夕 ンパク質。
3. 以下 (9) 〜 （1 2) のいずれかに記載されるタンパク質。 ( 9 ) 配列番号 7記載のアミノ酸配列によって表されるタンパク質。
( 1 0) 配歹幡号 7記載のアミノ酸配列において、 1若しく〖ぉ嫩個のアミノ m^、欠失、 置換若しくは^！口されたアミノ醚己列より表され 且つ、 ダル夕チオン 励プロス タグランジン E合成酵素活性を^ Tるタンパク質。
( 1 1 )
Figure imgf000006_0001
0 %以上の相同性を有し、 且つ、 Cys-X- X - Cysからなる部 ^ffi^J にこで Xは任意のアミノ廠鐘を表す。 ) を るアミノ酸 配列により表される、 ダルタチオン 励プロスタグランジン E «¾¾性を^ T るタンパク質。
( 1 2) 配歹蹯号 6記載の: MB^Iにより表される DNA配列又はその相補膨仅はこ れらの DNA配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNA配列により コ一ドされ 且つ、 ダルタチオン非特異的プロス夕ダランジン E合成酵蒲舌性を ¾Tる タンパク質。
4. 配歹蹯号 1言 3¾の ^15列により表される DN Α配列又はその相補 ffi^U又はこ れらの DNA配列とストリンジェントな条件下で八イブリダィズする DNA配列を有し、 且つ、 ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合藤 性を るタンパク質を コードする遺 β¾
5. 配列番号 4記載の; ^SS列により表される DNAffi^J又はその相補 IB ^又はこ れらの DNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA@B?IJを有し、 且つ、 ダルタチオン非特異的プロス夕ダランジン E合藤 性を る夕ンパク質を コードする遺 。
6. 配歹 I潘号 6記載の: »@己列により表される DNA配列又はその相補配列又はこ れらの DNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA膨 ϋを有し、 且つ、 ダルタチオン # 異的プロスタグランジン E合成酵麵性を ^1 "るタンパク質を コードする遺伝子。
7. 配列番号 2、 5又ま 7のいずれかに記載のアミノ酸配列の N末端より 8 7 個のアミノ酸残基が削除され、 N末端に、 ヒスチジン残基 6つを有する、 ァフィ二 ティカラムに親和性のあるアミノ酸配列が 口された、 ダル夕チオン非特異的プロ スタグランジン E合成酵素活性を有する融合夕ンパク質。
8. 以下、 （1 3) 〜 （1 4) のいずれかに記載されるタンパク質。
(1 3) 配列番号 3記載のアミノ薩列によって表されるタンパク質。
( 1 4) 配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、 かつ、 ダルタチオン非 特異的プロス夕ダランジン E合成酵素活性を有する夕ンパク質。
9. 項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺 又 は項 4〜6のレ f lかに記載の遺 をべクタ一に導入し、 該ベクターを用いて形難 換させた形 ®¾体を機し、 ^m ら得られるタンパク質を精製することによって、 ダル夕チオン # 異的プロスタグランジン E合藤蒸舌性を^ るタンパク質を銷す る方法。
1 0. 項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載のタンパク質又はその部分べプチ ドを観として得られ 膨齢型グル夕チオン 励プロスタグランジン: E合藤素 と し、 型ダルタチオン特励プロスタグランジン E合藤素とは しない、 鵜齢型グル夕チオン # 異的プロスタグランジン E合成酵素に特異的な抗体。
1 1. 項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載のタンパク質又はその部分べプチ ドを として得られ J« ^型ダル夕チオン # 異的プロス夕ダランジン E合成酵素 と し、 騰給型ダルタチオン特勵プロスタグランジン E合藤素とは しない、 膨給型ダルタチオン 纖プロスタグランジン E合麵素に特異的な抗体を用いて、 細! 戠内に発現する鷉給型グルタチオン隱的プロスタグランジン E合成酵 素を^^ TOに検出する工程を る酵素の検出方法。
1 2. 項 1、 2、 3、 7又は 8のレ れかに記載のタンパク質又はその部分 ペプチドを観として得られ、 酶 型グルタチオン隋異的プロスタグランジン E合 成酵素と^ Sし、 ^^型ダル夕チオン特異的プロスタグランジン E合成酵素とは しない、 膨 型ダルタチオン瞧的プロスタグランジン E合藤素に特異的な抗体 を含衬る疾患の検出乃至藤薬。
1 3. 項 1、 2、 3、 7又は 8のい f lかに記載のタンパク質又はその部分べプチ ドを観として得られ、 » &型グルタチオン 励プロスタグランジン E合藤素 と し、 ^^型ダル夕チオン特纖プロスタグランジン E合藤素とは しない、 臌給型ダルタチオン 励プロス夕ダランジン Ε合藤素に特異的な抗体を含 る '[：疾患の検出乃至 薬。
1 4. 項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載のタンパク質又はその部分べ プチドを抗原として得られ、 膜結合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン Ε 合成酵素と反応し、 膜結合型ダルタチオン特異的プロスタグランジン Ε合成酵素と は反応しない、 歸合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン Ε合成酵素に特 異的な抗体を用いて、 検体から調製した試料における、 騰吉合型ダル夕チオン非特 異的プロスタグランジン Ε合成酵素の逸脱、 有無又は量を調べる工程を有する疾患 の検出乃至判定方法。 1 5. 項 1、 2、 3、 7又は 8のい かに言 Β¾のタンパク質又はその部分べプチ ドを腿として得られ « ^型ダル夕チオン 励プロスタグランジン Ε合藤素 と跡し、 型グルタチオン特鋼プロスタグランジン Ε合藤素とは跡しない、 臌給型ダル夕チオン 励プロスタグランジン Ε合成酵素に特異的な抗体を用いて、 検体の心臓から調製した難における、 型グルタチオン 異的プロス夕ダラン ジン Ε合成酵素の週兌、 有無又は量を調べる工程を^ Τる 疾患の検出乃至判 法。
1 6. 番号 1、 4又ま 6のいず に記載の ί §3列又はその相補 IB^jにおい て、 連^ "る少なくとも 1 5驢を^ "るポリヌクレオチド及び Z又はそれに相補的な ポリヌクレオチドからなる、 膜!^型グルタチオン # 異的プロスタグランジン E合成 酵素関連プローブ。
1 7. 配列番号 8記載の 列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドからな る、 ^^型ダル夕チオン 異的プロスタグランジン E合成酵素関連プローブ。
1 8. 検体試料から調製した試料に、 項 1 6又は 1 7のいずれかに記載のプロ ーブを接触させて、 プローブと結合する遺伝子の有無又は量を測定する工程を有す る疾患の検出乃至判定方法。 1 9. 検体試料の心糸纖から調製した試料に、 項 1 6又は 1 7のいずれかに記 載のプローブを させて、 プローブと結合する遺 の有無又は量を測定するェ 程を有する心疾患の検出乃至判定方法。
2 0. 項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに言織のタンパク質をコードする遺 又は項 4〜6のいずれかに記載 C¾tf5i力導入されたトランスジエニック非ヒト離 Lll 物。
2 1. 項 1、 2、 3、 7又は 8のレ f Lかに のタンパク質をコードする遺 又は項 4〜 6のいずれかに記載の遺 を欠損させたノックァゥト非ヒト哺 物。
2 2. 下記 （a) 〜 （c) の工程を有する、 ダルタチオン ,的プロスタグラン ジン E合成酵素活性を増弓奴は阻 §Τる化合物のスクリーニング方法。
(a)ィ鎌化合物の被下、 項 1、 2、 3、 7又は 8のレ fれかに記載のタンパク質及 びプロスタグランジン Hを共存させて、 プロス夕グランジン Hからプロス夕ダランジン Eへの ¾ ^を測 ¾Tる工程、
(b) 候補化合物の非存在下、 項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載のタンパ ク質及びプロスタグランジン Hを共存させて、 プロス夕ダランジン Hからプロス夕 グランジン Eへの変換率を測定する工程、
(c) (a) 及び (b) における変換率を比較する工程。 2 3. 酉 [1番号 9又は 1 0に記載の ^ffi^lの^^又は"^を有し、且つ、 膨^ 型ダル夕チオン隋異的プロスタグランジン E合成酵素プロモーター活性を る D N A。
2 4. (a) 配 勝号 9又は 1
Figure imgf000010_0001
且つ、 » ^型ダル夕チオン 励プロス夕ダランジン E合藤素プロモーター活性を る DNA、 及び (b)臌給型ダル夕チオン晴異的プロスタグランジン E合藤素を コードする遺 を含んでなる組み換え体 DNA。
2 5. (a) 配歹噃号 9又は 1 0に記載の^ gH列の 15又は を有し、 且つ、 臌給型グルタチオン # 異的プロスタグランジン E合藤素プロモータ一活性を る DNA、 及び（b)膨瞎号 1、 4又は 6言 3¾の Mffi^Jにより表される DNA配列 又はその相補 fi^又はこれらの DNA配列とストリンジェントな条件下で八イブリダイ ズする DNA配列を有し、 且つ、 ダルタチオン 麵プロスタグランジン E合鐘素 活性を衬るタンパク質をコードする遺 を含んでなる組み換え体 DNA。
2 6 · 項 2 4又は 2 5に記載の組み換え体 DNAを宿 胞のゲノム遺 中に導 入してなる形 (本。
2 7. 項 2 4又は 2 5に記載の組み換え体 DNAを宿主細胞のゲノム遺ィ 5?中に導 入してなる形 体を培地に髓し、 該形 生する 型グルタチオン 非特異的プロスタグランジン E合成酵素活性を有する蛋白質を^ Iする工程を含む蛋白
2 8. (a)配歹 I潘号 9又は 1 0に記載の; ΜΙΒ^Ιの^ ¾又は ~¾を有し、 且つ、 J ^^型ダルタチオン啭鋼プロス夕ダランジン E合成酵素プロモーター活性を る DNA、 及び (b) 該プロモータ一により，され得るよう連結されたレポ一夕一遺 を含むベクターを含む系に、 ネ嫩物質を、励 Πし、 レポ一夕 ィ 5?の離を と して、 ネ嫩物質が騰給型グルタチオン 異的プロスタグランジン E合成酵素活性を る蛋白質の発現の ί©ι 〖ぉ卬制に与える を測 ることを含む、 疾患の藤乃 至治療に な化合物のスクリ一二ング方法。 2 9. リ番号 1， 4又は 6に纖の ¾S@5列により表される 又はその 相補配列又はこれらの DNA嗣とストリンジェントな条件下で八イブリダィズする D N A配列を有する遺 を発現可能に導入したトランスジエニック非ヒ卜哺乳動物また は形 体にネ嫩物質を投与し、 誦物又は形 体に対して^!)質カ える影 響を測^ることを含む、 疾患の藤乃至治療に械な化^のスクリーニング方法。
3 0. 配歹 (! 号 1 , 4又は 6記載の; Μ2列により表される DNA配列又はその相 補膨 I仅はこれらの DNA配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DN Α配列を る遺 を欠損させたノックァゥト非ヒト m»i物に搬物質を投与し、 該ノックァゥト非ヒト動物に対して獵物質が与える を ¾ι½ ることを含む、 疾患 の診断乃至治療に^！なィ匕合物のスクリーニング方法。
3 1. 項 1， 2， 3, 7又は 8のい lかに記載の夕ンパク質を^^^として含 ¾ る疾患の薩乃至治藤。
3 2. 項 2 8〜3 0のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られる 化合物又はその誘導体を有効成分とする疾患の診断乃至治療薬。
3 3. 項 2 8〜 3 0に記載のスクリ一二ング方法によって得られる化合物また はその誘導体を有効成分とする心疾患の診断乃至治療薬。
3 4. 項 2 8〜3 0に記載のスクリ一ニング方法によって得られる化合物又は その誘導体を有効成分とする膨結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン Ε 3 5 . 項 2 8〜 3 0に記載のスクリ一二ング方法によつて得られる化合物又は その誘導体を有効成分とする膨結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E 合成酵素活性促進剤。 以下、 本発明を講田に説明する.
プロスタグランジン Eは血管拡弓駭 ijとして有名で、 プロスタグランジン Hを異性化 することによって «される。 プロスタグランジン E合藤素は、 この際、 異性化酵素 として ί乍用する。
プロスタグランジン Ε合成酵素の 1種である、 ダル夕チオン特異的プロスタグラン ジン Ε合成^ ¾ま、 プロスタグランジン Ε合成に際し、 ダルタチオンを要^ Τる。 ダル タチオン特異的プロスタグランジン E合成酵素は、 GSTファミリ一に属し、 GST活性を 有している。
これに対し、 本発明の騰合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵 素は、 ダルタチオン非特異的にプロスタグランジン Eを合^ Tる。
この、 膨結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素は、 構造的に も、 ダルタチオン特異的プロスタグランジン E合成酵素と大きく異なっていることが明 らかとなつた。 '
本発明で構造が明らかにされた、 膨結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジ ン E合成酵素は、 チォレドキシンファミリーに特徴的な配列である、 Cys-X - X- Cysから なるアミノ酸の部分配列 （ここで Xは任意のアミノ酸歹鍾を表す。 ) を有している。
Cys-X-X-Cysからなるアミノ酸の部分配列としては、 例えば、 Cys-Pro-Phe-Cys から なるアミノ蒙列力 示される。 この配列の 例えば、 一番目の Cys藤を Ser残 基に変えるとプロスタグランジン E合成酵素活性がなくなる。
このことは、 膨锆合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素が、 ス トレス j¾タンパクであるチォレドキシンのファミリ一に属することを表している。 こ のような^ は、 の GSTファミリーに属するプロスタグランジン E合成酵素にはな い續である。
但し、 この Cys- X- X- Cys という配列を有するチォレドキシンが、 プロスタグランジ ン E合成酵蕭性を るというわけで〖 ぐ Cys-X-X-Cys という配列を: るタン ノ°ク質であれば、 必ずしもプロスタグランジン E合成酵素活性を ¾ るわけで い。 本発明者は、 上記、 Cys-X-X-Cysからなる部分配列を含むアミノ配列を有し、 且つ、 プロス夕ダランジン E合成酵素活性を有するタンパク質の衞告を明らかにした。 タンパク質
本発明のタンパク質には、 次のものが包含される。
• ·配列番号 2、 5又は 7に記載のアミノ隱列によって表されるタンパク質。
•配列番号 2、 5又は 7記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 藤若しくは働口されたァミノ Μ@^ϋにより表され 且つ、 ダルタチオン非 特異的プロスタグランジン E合成酵素活性を るタンパク質。
•配列番号 2、 5又は 7記載のアミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有し、 且つ、 Cys-X-X-Cysからなる部 列を るァミノ β ^により表され 且つ、 ダル夕チォ ン附異的プロス夕ダランジン £合成酵素活性を^ Τるタンパク質。
•配列番号 1、 4又は 6記載の塩基配列により表される D Ν Α配列又はその相補配 列又はこれらの DNAgB^jとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN A配 列によりコードされ 且つ、 ダル夕チオン 異的プロスタグランジン E合藤蕭性 を有-するタンパク質。
ここで、 配列番号 2記載のアミノ酸配列によって表されるタンパク質は、 サル由来 の J« ^型ダルタチオン 異的プロスタグランジン E合成酵素である。
配列番号 5記載のアミノ酸配列によって表されるタンパク質は、 ヒト由来の膜結合 型グル夕チオン # 異的プロスタグランジン E合成酵素である。
配列番号 7記載のアミノ酸配列によって表されるタンパク質は、 マウス由来の難 合型ダル夕チオン 異的プロスタグランジン E合成酵素である。
これらの配列番号 2、 5及び 7に記載の配列によって表されるタンパク質のアミノ ^SH ^の相同性（BLAST法） は 8 2 %禾號であって、 これらの配歹 1潘号 2、 5及び 7に 記載の酉 B^iJによって表されるタンパク質は、 共通して、 アミノ^ SH^J Cys- X- X- Cysで表 される構造を有している。
この配列の""^ 例えば、 配列番号 2に記載のタンパク質の 1 1 0番目の Cys薩 を Ser歹撥に変えると、 プロスタグランジン E合成瞧活性がなくなる。従って、 この 咅啦は、 ダル夕チオン酸異的プロスタグランジン E合藤離性における な職 と考えられる。
本発明のタンパク質には、 配列番号 2、 5又は 7記載のアミノ酸配列と 8 0 %以上 の相同性を有し、 且つ、 Cys-X-X-Cysからなる部分 ffi^Jを Τるアミノ翻己列を^ る タンパク質であって、 且つ、 ダルタチオン隋翻プロスタグランジン Ε合成酵煎舌性 を有するものであれば、 全てのタンパク質が包含される。 その由来は特に限定されるこ と«¾く、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ゥサギ、 ラットなどの嚼し類由来のもの等が包含され る。
また、 本発明のタンパク質には、 配列番号 2、 5又は 7記載のアミノ觀列において、 1若しくはネ鐵個のアミノ m^、欠失、 置換若しくは働口されたァミノ 列により表わ され 且つ、 ダルタチオン #励プロスタグランジン E合藤無性を ^ΓΤるタンパ ク質も含まれる。
ここで、 1若しくは複数個のアミノ酸の欠失、 置換若しくは ¾Πとは、 プロスタグ ランジン Ε合成酵素活性を失わない髓の変異の導入を意味する。 この変異には、配列 番号 2、 5又は 7記載のアミノ薩列における Cys- X-X-Cysという部 iffl ^における変 異は含ま ¾い。
このような変異は、 自然界において生じるほかに、 人為的な変異も含む。 人為的変 異を生じさせる手段としては、 細立特異 ¾¾異誘導法 (Nucleic Acids Res. 10, 6487- 6500, 1982) などを挙げること力 きるが、 これに P跪されるわけで い。変異した アミノ酸の数は、 プロスタグランジン E合成酵薪舌性を失わない限り、 そ «数は制限 さ ょいが、 通常は 2 0アミノ 内であり、 好ましくは 1 5ァミノ 内であり、 更 に好ましくは 1 0アミノ酸以内であり、 最も好ましくは 5ァミノ 内である。麟を 導入した夕ンパク質がプロスタグランジン E合成酵素活性を, しているかは、 その夕 ンパク質が、 プロスタグランジン Hをプロスタグランジン Eに異性化し得るカゝ否かを調 ベることによって半 11定できる。
また、 本発明のタンパク質には、 配列番号 1、 4又は 6記載の塩基配列により表わ される DNA配列又はその相補配列又はこれらの DNASB^Jとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズする DNAffi^Oによりコードされ 且つ、 ダル夕チォン# 励プ ロスタグランジン E合成酵素活性を有するタンパク質も含まれる。 「ストリンジェントな条件」 とは、 特異的なハイブリダィゼーシヨンのみが き、 非 特異的¾/、イブリダィゼ一ションが きないような条件をいう。 このような条件とは、 通常、 「lxSSC、 0. 1%SDS、 37°C」禾 1 ^あり、 好ましくは「0.5xSS 0. 1¾SDS, 42°CJ 禾 M ^あり、 更に好ましくは、 「0.2xSSC、 0. 1%SDS、 65°CJ禾號である。ノイブリダィ ゼーシヨンによって得られる DNAは、配列番号 1、 4又は 6記載の;^ IH列により表 わされる DNAと通常高い相同性を る。 ここで、 高い相同性とは、 60% の相同 性、 好ましくは 75%以上の相同性、 更に好ましくは 90%以上の相同性を ί¾Τ。
本発明のタンパク質は、 例えば、 配列番号 1、 4又は 6記載の塩基配列により表わ される DNA配列又はその相補膨仅はこれらの DNAffi^Jとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズする DN A配列を有する遺 ^をべクタ一に組み込み、 適当な宿主 細胞内で彌させる方法などによって得ることが きる。 ベクタ一としては、 i のものを難して用いること力 き、 例えば、 Trc-HisAなどを用いることが きる。 宿主細胞も、 のものを して用いること力 き、 例えば、≠ m BL2i どを用いることが きる。 遺
本発明の遺伝子は、 配列番号 1、 4又は 6記載の塩基配列により表される DNA配 列又はその相補 S ^又はこれらの DNAIB ^とストリンジェン卜な条件下でハイブリダ ィズする DNAIB ^を有し、 且つ、 ダルタチオン 異的プロスタグランジン E合成酵 素活性を^ Tるタンパク質をコードする遺 である。
配列番号 1記載の塩基配列により表される DN A配列は、 サル由来の遺 である。 配列番号 4記載の塩基配列により表される DN A配列は、 ヒト由来の遺 である。 そして、 配列番号 6記載の塩基配列により表される DNA配列は、 マウス由来の遺 ィ¾?である。
配列番号 1、 4及び 6に記載の塩基配列は、 全体でも高い相同性を るが、 活性 部位周辺、 つまりアミノ酸配列 Cys- X- X- Cys に相当する部分では 100 %の相同性 (BLAST法） を有しており、 活性瓿纖部 100纏及 刮生 凝 OO驢の双方で 86%の相同性を有している。 つまり、 活性音啦 ¾ ^レベルで保存されていることにな る。一方、 Ν*¾Π00 では 58%禾號の相同性であった。 また、 イントロン及びェ クソンの領域も共通していた。
本発明の遺伝子は、 例えば、 配列番号 1、 4及び 6に記載の塩基配列を基に、 DN Aプライマーを作成し、 ポリメラ一ゼ連 を利用して、 クロ一ンィ ることにより、 得ること力 きる。 これらの の操作は、 市販のキットを用いて行うことが きる。 融合タンパク質
雜合型グル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素を大量に難させて 取得することは、 ff¾を効率よく行うために、 必 とされる 術である。 しかし、 麵 物の精製の困謝生などから、 上言 性を る酵素を十分取得できない：^がある。 ま た、 ダル夕チオン 励プロスタグランジン E合藤謙性を "るタンパク質を多 くのステツフ 精製した場合にも、 活性は急激に減少する。 よって短時間に、 且つ少な ぃステツフ 精製する必 力ある。
本発明者は、 ヒスチジンタグドメインを^ る融合タンパク質を作成し、 ダルタチ オン 異的プロスタグランジン E合成酵素活性を有するタンパク質を効率よく取得す ることに成功した。
本発明の融合タンパク質には、 以下の夕ンパク質が包含される。
•配列番号 2、 5又は 7のいずれかに記載のアミノ酸配列の N末端より 8 7個の アミノ酸残基が削除され、 N末端に、 ヒスチジン残基 6つを有する、 ァフィ二ティ 力ラムに親和性のあるアミノ酸配列が付加された、 ダルタチオン非特異的プロス夕 ダランジン E合成酵素活性を有する融合タンパク質。
•配列番号 3記載のアミノ酸配列によって表されるタンパク質。
•配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは働口されたアミノ酸配列により表され、 かつ、 ダルタチオン非特異的 プロスタグランジン E合成酵素活性を有するタンパク質。
本発明の融合タンパク質を用いて、 ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合 成酵蕭舌性を るタンパク質を^ Tる方法としては、 例えば、 配歹瞎号 3に記載の アミノ薩列を # "るタンパク質をコ一ドする DNAをベクターに導入し、 該ベクター を用いて形 させた 驢を培養して、 培難の^昜菌を集菌.破砕し、 遠心した 後、 上清液をァフィ二ティクロマトカラムにより精製する方法などカ举げられる。 本発明の融合タンパク質を用いれば、 ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E 合成酵麵性を "るタンパク質を、効率よく に取得することが きる。 また、 ァ フィニティ力ラムにより精製を一段 p 行うこと力 きる。
ヒスチジン夕グドメインを有する融合夕ンパク質を作成した場合、 タグ部分により 酵鎌性が阻害され減少することがあるが、 本発明の融合タンパク質においては、 m 値が 然のものと同離のものが: ί又 ί辱でき、 しかも、 融合化による酵素としての験が なぐ 天 «/と近いフォームのものが得られる。 抗
本発明の抗体とは、 本発明のタンパク質又はその部分ペプチドを ί¾ として得られ るものである。 ¾ ^型ダル夕チオン 異的プロスタグランジン Ε合謹素と し、 ^^型ダルタチオン特異的プロスタグランジン Ε合成酵素とは反応しない。 このこと は、 ウェスタンプロット法などを用いて、 膨齢型ダル夕チオン啭励プロス夕ダラ ンジン Ε合藤素とは ίδΐ"るが、 膨齢型ダルタチオン特励プロスタグランジン Ε 合成酵素とは しないことを調べることによって、 確認すること力 ?きる。
本発明の抗体には、 ^^型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素 と特異的に MUTTる抗体であれば、 ポリクローナル抗体も、 モノクローナル抗体も包含 される。
モノクロ一ナル抗体は、 例えば、 次のように難される。 本発明の蛋白質又はその 部分ペプチドを¾¾1として搬された 物、 例えばマウスから、 抗体価の認められ る衝本を藤し、 最終髓の 2〜 5日後に麵またはリンパ節を 又し、 それらに含ま れる抗体産 41田胞を 田胞と融合させ、 モノクローナル抗体; イブリドーマを 調製する。 ¾Λイブリドーマを培養して、 抗体を産生し、 ¾¾、謹製を行うことによ つて、 モノクローナル抗体を得ること力 きる。 融合操作 の方法、 例えばケーラ 一とミルスタインの方法 (Nature, 256, 495, 1975) やその変法に従い、 きる。 融合ィ腿 IJとしてはポリエチレングリコール（P E G) やセンダイウィルス等が用いら れる。 また、 本発明のモノクローナル抗体をヒ H4¾体として用いてもよい。
ポリクローナル抗体は、 例えば、 次のように作成できる。 蛋白質 自体、 あるい はそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 モノクローナル抗体の 法と同様 に 物に爐を行う。 該^ ^物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採 取して、 抗体の分隱製を行うことにより、 得ることが きる。
上記抗体の S¾iに用いる^ J&動物の種類は特に P腕されないが、 例えば、 ゥサギ、 マウス、 ラットなどを用いること力 ?きる。
本発明の抗体を禾,すれば、 細 iaxは娜戠内に翻する臌吉合型ダル夕チオン非特 異的プロスタグランジン E合成酵素を、 嫩 ^こ検出すること力 きる。検出方法と しては、 例えば、
Figure imgf000018_0001
碰（R I A) 、 爐_§1^法、 麵田 «fe法などの膽應匕^ 法 (AB C ) 、 ウェスタンブロッテイング法、 ^ , 酵素^ i定法、 サンドイッチ E L I S A法などカ攀げられる。
例えば、 本発明の抗体を用いて E L I Z A法を行い、 觀中の騰給型ダル夕チォ ン 励プロスタグランジン E合麵素の量を決 ¾ ることなどが きる。 また、 本 発明の抗体を用いて ^^法を行い、 細叙は插戠内に発現する膨齢型ダル夕チォ ン # 異的プロス夕ダランジン Ε合成酵素を免疫学的に検出することなど力 きる。 また、 本発明の抗体を、 ¾a辦 J化し、 診断薬又は疾患マ一カーとして用いること もできる。 例えば、 難者およ の細胞または垂に^ Tる膨鈴型ク ォ ン晴励プロスタグランジン E合成酵素を、 本発明の抗体を用いて検出し、 該酵素の 機能 (^斤を行うことや、 該酵素の «を調べ、 m,(D m, 又は判定などを に行うことなどが きる。 具体的には、 本発明の抗体を用いて、 鷓纖における、 臌給型ダルタチオン # 纖プロスタグランジン Ε合藤素の離、 纖、 有«は 量を調べることによって、 心筋梗塞などの 疾患の ^ f^判定、 死因嚷明などを機 に行うこと力 きる。
心筋梗塞部位においては、 ミォグロビンが心筋梗塞発症 it も棚に逸脱すると考 えられており、 心筋梗截啦の藤には、 通常、 抗ミオグロビン抗 用いられてきた。 心筋梗塞の診断ガイドライン （J Ai Coll Cardiol 2000;36:959-969) によると、 ミオ グロビンの週兑が生じるのは心筋梗塞発症後 1- 時間程^、 5時間位にピークに^ T る。
しかし、 本発明者が、 本発明の抗体を用いて調べた結果、 ミオグロビンよりも、 膜 齢型グルタチオン隋異的プロスタグランジン E合成醜の方が、 心筋梗塞における 遷奴は消失が糊に起こることが明らかとなった。 また、 酵素の減少が显 あるこ とが明らかとなった。
従って、 ミオグロビン抗体を用いるよりも、 本発明の抗体を用いて検出を行う方が、 心筋梗塞音 M立の判定などをより正確に且つ適切に行うことが きる。
また、 死後の検体の心臓紙織を調べて宛因の解明、 !]えば^ E因が心筋梗塞であった かどうかの判断を行う際は、 抗ミオグロビン抗体を用いるよりも、 本発明の抗体を用い て調べる方が、 死因の解明をより IB確にかつ適切に行うことが、できる。 プローブ
本発明の配列番号 1、 4又は 6のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列にお いて、 連^ Tる少なくとも 1 5驢を るポリヌクレオチド及び Z又はそれに相補的 なポリヌクレオチドを用い、 プローブとすることもできる。 該プロ一フま、 « ^型グ ル夕チオン隋顯プロスタグランジン E合成酵纖出用、 ^^型ダル夕チオン 異的プロスタグランジン E合成酵素特飾、 ¾^型グル夕チオン 励プロスタグ ランジン E合成赚関魅患診断用などとして用いること力 きる。 ^^型ダル夕チ オン醒的プロスタグランジン E合成藤関魅患としては、 心筋纏などの; L疾患 や胃疾患などの各 @¾患力举げられる。
例えば、 ヒト等の検体から、 遺 (RNAまたは DNA) を調製し、 嫌3プ ローブと遺 ^¾抖とのハイプリダイゼーションの程度を t目』定することによって疾患の 藤などを行うことが きる。 ノ、イブリダイゼーシヨンの禾號を視 る方法としては、 例えば、 ノーザンプロット法、 F I SH法などカ举げられる。
また、 該ポリヌクレオチドに、検出可能な を付して、 該 Θを検出してもよい。 検出可能な^ ϋは、 当難に周知のものから蔵できる。 例えば、 アビジンおよびピオ チン、 ペルォキシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 方嫩性同ィ4¾素 （例えば、 32 Ρおよび35 S等） 、 を用いること力 きる。
プローブとして用いるポリヌクレオチドとしては、 特に配列番号 8で表される D N A配列を るものカ赞ましい。該配列には、 膨 1；給型グルタチオン瞧的プロス夕 グランジン E合成酵素の な配列を舰した。 この ffi^Jは、 ^"夕ベースを;^し 他の各種タンパク質との相同性が最も低レ ある。 この領域を用いることによって、 » ^型ダルタチオン 異的プロスタグランジン E合藤素素活性を るタンパク 質をコードする遺 を特異的に検出することが T能となる。
プロ一ブの長さは特に [5腕されないが、 通常 1 5〜1 2 0 0塩基、 好ましくは 2 5 〜1 0 0 0塩基、 更に好ましくは 4 0〜8 O
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本発明のプロ一ブは、 疾患の検出乃至判定、 予後の解析などに ¾¾に用いることが できる。
例えば、 検体試料から調製した DNA又は RNAなどの遺 試料に、 本発明の プローブを接触させて、 プローブと結合する遺伝子の有無又は量を測定することに より、 膨結合型グル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素が関与する疾 患、 例えば心疾患などの判定乃至診断などを行うことができる。 プローブに結合す る遺 ί¾ΐを調べる方法としては、 例えば、 ノーザンプロット法や in si teハイプリ ダイゼ一シヨン法が挙げられる。 結合やハイブリダィゼ一シヨンの条件は、 蒙設 定できるが、 ストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。 トランスジエニック非ヒト哺学 LSl物
本発明におけるトランスジエニック非ヒト動物とは、 配列番号 1、 4又は 6のいず れかに言 の iKSB ^を る遺 β?を導入させて、 遺 えにより作成されたヒ ト の哺学 11¾物のことをいう。 ヒト の離 LI¾物としては、 例えば、 マウス、 ゥサ ギ、 ラットなどカ举げられる。
トランスジエニック非ヒト動物を作成する方法としては、 例えば、 位相麵進下 で前 子の核に、 微小ピペットで遣 を直 ^入する方法 （マイクロインジェク シヨン ί¾) 、 性幹細胞 (E S» を棚する方毕、 レトロウイルスベクターまたは アデノウイルスベクタ一に遺 を挿入し、 卵子に纖させる方法、 または、 軒を介 して遺 を卵子に導入する精子ベクター法などカ攀げられる。
受精卵細艇殳階における遺 の導入は、 ¾f«物の接細胞および体細胞の全て に るように行うとよい。遺ィ¾?導入後の作出動物の月繊田胞において本発明遺伝 子カ^ ることは、 作出動物 孫が、 その 田胞の全てに、 を することを意味する。遺 is?を受け継いだこの種の動物の子孫はその κ¾田胞およ 田胞の全てに^ Φ:発明の遺 を； る。 上記のように作成したトランスジエニック非ヒト動物は、 交配により遺 を安定 にィ ¾#することを廳忍して、
Figure imgf000021_0001
とが きる。 さらに、 目 έ¾»ίδ を保: る雌隹の動物を 5¾己することにより、 導 Ait β?を相同 ¾fe体の両方に持つ雌佳の動物を取得し、 この雌隹の動物を効己することに よりすベての子孫力 遺 を^ τるように繁痼 代すること力 きる。
本発明のトランスジエニック非ヒト動物は、 ^型ダルタチオン非特異的プロス タグランジン E合成酵素の猶 斤などに利用すること力 きる。 また、 生纖に 用いる疾患モデル動物の開発などに利用することもできる。 また、 トランスジエニック 非ヒト動物に搬物質を投与し、 ネ厳物質が、 該トランスジエニック動物に対して与え る影響を視 ることにより、 疾患の診断至治療に ¾¾な物質のスクリーニングなどを 行うこともできる。 ノックアウト非ヒト嚼 物
本発明のノックアウト非ヒト哺乳動物とは、 配列番号 1、 4又は 6のいずれかに記 載の ¾12列を るダルタチオン # 纖プロスタグランジン E合藤素活性を るタンパク質をコードする遺ィ 5^の機能が失われるように讓されたものである。 非ヒ ト嚇 L¾物には、 マウス、 ゥサギ、 ラットなどのヒト の哺 ¾1¾物が含まれる。
該遺^の機能が失われたものであれば、 全身の該遺 の機能が 壊された全身 ノックァゥト非ヒト 物でも、 «異的に蘭 の機能カ徹壌された« 異 的ノックアウト非ヒト噼睡でもいずれでもよい。 ノックアウト非ヒト噼 物には、 例えば、 E S細胞を用レ r相同繊ぇを行い、 一方の対雄舒を蔽 '破壌した胚性 幹細胞を顧 Uすることにより、 ί懷することが きる。 具体的に、 例えば、 非ヒト嚼し 動物としてマウスを用いた には、 ¾1卵の や^!翻に遺 を操作した胚 性幹細胞を ¾Λして、 胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の « ざったキメラマウスを 得る。 このキメラマウス （キメラとは、 2個 1:の， Ρに基づいた体細胞で形成され る単 ~«をいう） と正常マウスを すると、 一方の対 iStfe?の全てが ¾ ·破壊 されたヘテロ齢体マウスを ί懷すること力 きる。 さらに、 ヘテロ齢体マウス同士 を 3¾eすることで、 ホモ^体マウス （ノックアウトマウス） を^することが、できる。 本発明のノックアウト非ヒト卩辭 Li¾物は、 ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素活性を^ る蛋白質の作用娜の予測、 ダルタチオン瞧的プロスタグラ ンジン Ε合藤素活性を る蛋白質又通給型グル夕チオン啭異的プロス夕ダラ ンジン Ε合成酵素が関与すると予想される疾患 明、 並びに該蛋白質又は酵素が関与 する疾患の予防乃至治療のための医薬品のスクリーニングや 生試験に用いる疾患モ デル動物の開発などのために、 有効に用いること力 ?きる。 プロモーター
本発明のプロモ一ター活性を る DNAは、 配列番号 9又は配列番号 1 0に記載 の: SIH列の全部又は^ ¾で表れる DNA配列を有し、 鼸始型グルタチオン 異的 プロスタグランジン E合成酵素 を制御する DNAである。本発明には、 該 プロモーター活性を る DNA、 膨齢型ダルタチオン晴異的プロスタグランジン E合成瞧をコ一ドする遺 をベクター DNAfcl?入した組み換え体 DNAが含まれ る。 また、 該プロモ一ター活性を る DNA、 レポーター隨をコードする遺 を ベクター DNAに揷入した組み換え体 DNAも含まれる。
該プロモーター、 膨結合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素を コードする遺 をべクタ一 DNAに揷入した組み換え体 DNAを、 宿 ΐ¾物細胞のゲ ノム遺 fe?中に導入することによって、 皿した配列のプロモーター活性に応じて« 合型グルタチオン 勺プロスタグランジン E合成酵素を^ fること力 きる。 ま た、 該プロモータ一、 レポ一タ一酵素をコードする遺 fi^をベクター DN Aに揷入した ま且み換え体 DNAを、 宿主動物細胞に導入 lば、 宿主動物細胞内における該プロモー ターの転 f生を御^ ること力 ?きる。
該プロモーター領域は、 嵐結合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成 酵麵訳領域の上流を鍵し、 上流と下流の:^ 13列をもとに PCR法によってクロ一ン 化することによつて得られる。
本発明者が、 上記難合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素を コードする遺 iS?の"^をプローブとして、 鋭 ¾ ^を行った結果、 配歹 I潘号 9乃至 1 0の配列を "る領域が、 膨齢型グルタチオン # 異的プロスタグランジン E合成酵 素をコードする遺^の発現を制御していること、 即ち、 プロモーター活性を るこ とが明らかとなった。特に、 配歹瞎号 1 0に記載の: ^ffi^Jで表される領域は、 配列番 号 9で表される領域を上 向より順次削除し、 プロモーター活性を測 ることによ つて決定したプロモーター活性の高い領¾1？ある。
本発明のプロモ一夕一活性を有する DNAには、 配列番号 9乃至 1 0に記載の配列 で表されるもののほか、 配^ 号 9乃至 1 0に示した «SB と"^分の ffl己列が異 なる DNA、 上記の 列の ~¾からなる DNAまた ½Lb記の 列を少なくとも 含んでいる DNAであって、 上記プロモーターと同等の漏 gを るもの、 例えば、 配 墦号 9乃至 1 0に «の配列において 1乃 個の驢が欠失、 口又は謹した配 列であって、 臌給型グルタチオン晴励プロスタグランジン E合 をコ一ドす る遺 のプロモーター活性を ¾ るものが含まれる。
本発明には、 上記プロモーター活性を る DNA、 臌給型ダルタチオン非特異 的プロス夕ダランジン E合成酵素をコ一ドする遺伝子及び Z又はレポータータンパク質 をコードする遺 、 また必要により夕一ミネ一夕一、 シグナル配列、 ェンハン ί·"遺 などをべクター D ΝΑに挿入した組み換え体 D Ν Α力含まれる。 組み換え体 D NA の纏は、 遊 の方法に従って行うこと力 きる。 膨齢型ダルタチオン非特異的 プロスタグランジン E合成酵素をコードする遺 としては、 上言3*発明の遺 が好 適に用いられる。
宿 物に、 該プロモーター、 廳吉合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素をコードする遺 β？をべク夕一 D Ν Αに揷入した組み換え体 D N Aを導入す れば、 例え 治療において、 該プロモー夕一を制御することで、 ί£意のI»細 胞において、 酶齢型ダルタチオン 励プロスタグランジン Ε合^^^の発現を制 御すること力 きる。例えば、 酉 番号 1 0に誘の^ S3列を "るプロモー夕 HI β?は高い転 舌性レベルを ることから、 配 播号 1 0
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—夕一に膨船型ダルタチオン 異的プロスタグランジン E合成酵素をコードする遺 舒をべクター D N Αί;^入した組み換え体 D Ν Αを宿 ΐ¾物内に導入 ば、 より高 ぃ転雜性により、 臌給型ダル夕チオン非特鋼プロスタグランジン Ε合藤素を通 常レベルより効率よく 4¾すること力河能となる。
また、 本発明のプロモータ一活性を る DN Αに、 レポ一夕 ~Μβ 、 例えば、 ホ夕ルルシフェラ一ゼ¾ ^を齢させて、 プラスミド又は袓み換え体 DNAを作成し、 該プラスミド又は袓み換え体 DNAを用いて、騰給型ダル夕チオン隋異的プロスタ ダランジン E合成酵素転写活性の測定や、 各種化合物が^^刮'生に与える^ #の測定な どを行うことが^きる。
具体的には、 次のように行う。 まず、 ホタルルシフェラ一ゼ遺ィ¾?などのレポ一夕 —遺 の上流に、 配歹噃号 9乃至 1 0で表される; MS己列の 又は 降有し、 か つプロモーター活性を有する DNA配列を有する DNAを揷入してプラスミドを作 る。 このプラスミドを、遺 導^を用いて、 輒類培蓁钿胞に導入する。 プラスミ ド導入後、 1日乃至 2日培養し 細胞を破砕し、 その 活性を彻 ることにより、 鼯 型ダルタチオン隋励プロスタグランジン Ε合藤纖 舌性を祖 ることが きる。
また、 レポ一ター遺伝子とプロモーター活性を有する DNAを有するプラスミドを 導入して作成した形 体の: ^夜中に、 種々の化合物を翻 Πして、 それぞれの化合 物を、励卩した^の転^?舌性を測 ることで、 J« ^型ダル夕チオン 鋼プロス タダランジン E合成酵素遺 舌性に及ぼす化合物の をW面することもできる。 訪法を用いることにより、 » ^型ダルタチオン 励プロスタグランジン E合成 酵素阻 Ml又はィ扁 或いは、 疾患の予防乃至治麟の翻となる物質のスクリ一 ニングを効率よく行うこともできる。 スクリーニング方法
ダル夕チオン 励プロスタグランジン E合成醇活性を増叙は阻 ¾Tる化合物 は、 該酵素が関与する疾患の予防乃至治麟における械戯となると考えられる。 ダルタチオン非特異的プロスタグランジン Ε合成酵素活性を阻害或いは鍾する化 合物のスクリーニングは、 例えば、 以下のような （a) 〜 （c) の工程を^ Tる方法に よって行うこと力 ?きる。
(a) i^ i化合物の存在下、 本発明のタンパク質及びプロスタグランジン Hを させて、 プロスタグランジン Hからプロスタグランジン Eへの変^^を測^ Tる工程、
(b) ί鎌化合物の 下、 本発明のタンパク質及びプロスタグランジン Ηを共 存させて、 プロスタグランジン Ηからプロスタグランジン Εへの変 »を測定する工程、
(c) (a)及び (b) における を比較する工程。
プロス夕ダランジン Hからプロスタグランジン Eへの変換率は、 以下の式から算出 できる。
変酵=
( [フ。ロスタゲランシ'、ン Eの量 (mt) ] / [プロスタグランシ "ン E のフ。ロスタグ、ランシ、'ン類の量 am) +フ°ロスタグラン ン Eの量（ ） ] ) ―
( [フ。ロス夕ゲランシ "ン Eの量 （コント口-ル） ] / [フ。 Πスタゲランシ'ン EJ^のフ。 Dスタク"ラン ン類の量
(コントロ-ル） +プロスタグランシ"ンの量（コント口-ル） ] )
=酵素 麦の [14C]PGE2部分の腿 * 全体の [14C]腿量
また他のスクリ一二ング方法としては、 次のような方法カ举げられる。
例えば、 本発明の遺ィ 5?、 プロモーター、 及び、 該プロモーターにより発現され得 るよう連結されたレポ一夕 HffiS?を含むベクターを含む系に、 纖物質を勵 Πし、 レ ポ一タ HtiS?の発現を指標として、 ネ嫩物質力 » ^型ダル夕チオン 働プロス タグランジン E合成酵素遺伝子の発現の 制に与える影響を測定する工程を含 む、 スクリーニング方鶴カ攀げられる。 プロモータ一としては、 上記に記載した、 配 列番号 9又は 1 0の «12列を "るプロモ一夕一活性を^ Tる DN Aなど力 に用 いられる。
また、 本発明の遺伝子を させたトランスジェニック非ヒト哺 ¾J¾物又は形質^
# 或い 発明のノックアウト非ヒト動物にネ嫩物質を投与し、 m x mm 体に対してネ嫩物質カ える影響を視 1 る工程を含むスクリーニング方體も挙げら れる。 上記のようなトランスジエニック非ヒト卩 物ゃノックァゥト非ヒト嚼瞧 を用いた には、 ¾^物質の 作用や作用 «なども測 ¾τること力 さる。
プロスタグランジン Eは、 膨結合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合 成酵素により、 プロスタグランジン Hの異性ィ によって合成される。 また、 プロス タグランジン Hは、 C〇X— 1酵素又は COX—2酵素により、 プロスタグランジン G から合成される。 つまり、 COX— 1酵素、 COX— 2酵素は、 型ダル夕チオン 非特異的プロスタグランジン E合成酵素の上位酵素にあたる。 この COX- 2酵素の阻 が、 関節炎治 とし Τϊΐϊ販されている。 しかしながら、 この薪 jは、 副作用とし て、 心臓発作や動悸が起こり易いことが報告されている （Dowj ones Newswires, 0ct 30, 001) 。 このことから、 COX - 2酵素により合成されるプロスタグランジン H、 或 いはプロスタグランジン Hを経て合成されるプロスタグランジン E、 D、 又は Fが、 心 臓において な働きを有していることが^ される。 しかし、 これまで、 どのプロス 夕ダランジンが、 心臓の働きに であるかは明らかになつていなかつた。
本発明者がノーザンプロットにより解斤したところ、 騸吉合型ダル夕チオン非特異 的プロスタグランジン E合成酵素は、 他のプロスタグランジン E合成酵素に比べて、 心 臓での発現が藤に多いことが明らかとなつた。
また、 本発明者が、 本発明の抗体を用いて、 ウェスタンプロット及び組 色 を行ったところ、 ^^型ダルタチオン # 纖プロスタグランジン Ε合成瞧は、 心 室心筋が最も るお、 ¾ ^立の上部外側により多く ることが明らかとなつた。 これらの結果は、 プロスタグランジン Εが心臓の機能に関し重要な役割を果たし、 « ^型ダル夕チオン 励プロスタグランジン Ε合趣素が心臓の機能に觀な役 割を^ Τる酵素であることを 袭するものである。 特に、 臌給型グルタチオン晴異 的プロスタグランジン E合成酵素が、 心筋の収縮 锾を制御する酵素である可能性を示 る。
このことから、 膨結合型ダル夕チオン非特異的プロス夕ダランジン E合成酵素又は J« ^型ダル夕チオン 纖プロスタグランジン E合藤素を ¾ る蛋白質は、 遊 醒匕して用いることにより、 心筋の収 と関^ Τる は 疾患に対する^! な^ if乃至治^^となること力^!変される。
また、 膜結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素活性を阻害乃 至 ί腿する化合物は、 疾患、 心筋の収镧編と関^ る疾 の蘭乃至治 或い は 、筋の を !!御する^などとして用い得ること力 俊される。
心 患としては、 例えば、 心筋梗塞、 全、 穆 動悸、 心筋症などが挙げら れる。
また、 プロスタグランジン Eは、 平滑筋の収縮や胃酸分泌の生理作用を惹起する生 理活性物質である。 本発明の謹給型ダルタチオン # 異的プロスタグランジン E合 成酵抗体を用いて、 胃編哉の嫉^]な測定を行ったところ、 胃では、 特に前胃の組 の平滑筋や、 後胃の固有腺などに、謹給型グルタチオン非特顯プロスタグ ランジン Ε合成,力 すること力 崔認、された。 このことは、 ^^型ダル夕チ才ン # 異的プロスタグランジン E合成酵素が、 胃の 消丫 能に関与している可能性 を示 H変するものである。
このことから、 膜結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素又は 麟給型ダル夕チオン 異的プロスタグランジン E合成酵素を^ Tる蛋白質は、 遊 纖 匕して用いることにより、 胃の^ ^消ィ «に関与する疾¾¾は平滑筋が関与す る疾患に対する有効な診断乃至治 ^となること力 俊される。
また、 膨結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素活性を阻害乃 至 ί»Τるィ匕合物も、 胃の 消ィ 能に関与する は平滑筋が関与する疾¾の ,乃至治 、 或いは胃の筋肉 «の«¾緩を制御する !J等として用い得ること 力％1俊される。
本発明の診断乃至治 は、 上記本発明の遺 βΐ、 蛋白質、 抗体、 プローブ、 また 発明のスクリーニング方法によって得られたプロスタグランジン Ε合成,舌性を 増弓奴は阻針る化^ #1又はその誘離ゃネ髓魏以化合物を、 そのまま又 化 することによつて得ること力 きる。
本発明の診断乃至治麟の文橡となる疾患としては、 膨齢型ダルタチオン非特異 的プロスタグランジン E合藤素の や関与が ¾¾ される音啦、 例えば、 心臓、 胃、 S 肝臓、 滕臓、 精巣、 卵巣、 胎盤などの疾患カ举げられる。
本発明者が、 上記のようなスクリーニング方法を行って、 複数の化合物を調べた結 果、 エタクリン酸、 及び、 1 _クロ口一 2, 4—ジニトロべ ifンが、 ダルタチオン非 特異的プロス夕ダランジン E合成酵^ g性を阻^る効果を有することが朋らかとなつ た。 このことは、 上記スクリーニング方法によって得られる化合物、 例えば、 エタクリ ン Xは 1—クロ口— 2， 4—ジニトロベンゼンなどは、 型グル夕チオン啭異 的プロス夕ダランジン £合«素阻^ !1の有効 物質となることが示唆される。 同様のスクリ一二ング方法により、 型グル夕チオン非特異的プロス夕グランジン Ε合成瞧活性を る化合物、 即ち臌給型ダル夕チオン非特異的プロスタグラン ジン Ε合成酵蒸 の^) の ί鎌物質も擴できる。更に、 上記スクリーニング 方法によって得られた化合物、 例えば、 エタクリン ¾Χは 1一クロロー 2, 4—ジニト 口ベンゼンなどの誘 や ^ (以化合物を検討することによって、 より強力な ί乍用を « "る J« ^型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン Ε合成酵素阻豁 ij、 {^ i 或いは、 疾害、予防乃至治纏が開発されることも示唆される。
また、 プロモーター活性を有する DN A及びレポーター遺伝子を用いたスクリ一二 ング方法を行って、 »：の化合物について検討した結果、 インターフェロンァが、 転写 活性を低下させることが明らかとなった。 このことから、 本発明のプロモータ一を用い たスクリーニング方法によって得られた化合物、 例えばインターフェロンァなどは、 膜 齢型グルタチオン隱的プロスタグランジン E合成酵素阻翻の織戯の碰物 質となること力 11変される。 同様のスクリーニング方法により、 JK^型ダリレタチ才ン 醒的プロスタグランジン E合成酵素活性を る化合物、 即ち臌給型ダル夕チ オン # 異的プロスタグランジン E合成酵素促 の有効^^の i^i物質も探索できる。 さらに、 上記スクリーニング方法によって得られた化合物、 例えばインターフェロンァ などの類 »や Hi以化合物を検討することによって、 より強力に転写活性作用を^ "る 膨 型ダル夕チオン 励プロスタグランジン E合藤素阻截、 i 或いは、 疾患予防乃至治 ^を開 することも可倉である。
麵の簡単な説明
図 1は、 ヒト、 サル及びマウス由来の膜結合型グル夕チオン非特異的プロス夕ダラ ンジン £合«素一^ iの比較を示すものである。
Figure imgf000028_0001
スクで¾¾する。 図2は、' 昜菌発現用維合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵 素べクタ一 pTH-PGES及び pTH-PGESASの冓成を示す図である。 図3は、 廳吉合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン Ε合成酵素の発現及び 精難の廳を示す図である。 図 4は、 騰吉合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン Ε合成酵素のァフィ二 ティクロマトグラフィーの溶出曲線を示すものである。 フラクション 5 0— 5 8の間に 精製品が溶出している。 図 5は、 腿合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素量とプロス タグランジン E合纖の相関を示す図である。廳給型ダル夕チオン # 異的プロス夕 グランジン E合成酵素を することによって活性は低下、 また DTTを除くことで 酵素活性は減少する。 図 6は、 鵜結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素の酵素活性 の p '性を示す図である。 図 7は、 膨 型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素の酵素活性 に及ぼす SH剤 （DTT、 GSH、 メルカプトエタノール） の漏を示す図である。 図 8は、 観結合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素抗体によ る ί¾¾認識のウエスタンプロット像を示す図である。 図 8の Βはネガティブコントロー ルで、 COS 7細胞を用いている。 C及び 13は、 ポジティブコントロールである。 図 9は、 遺 レベルでの膜 型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合 成瞧の離をノーザンプロット «忍した HeLa細胞を用いて、 iWg^型ダル夕チ オン非特異的プロス夕ダランジン E合成酵素抗体によるウエスタンプロットを行つた結 果を示す図面である。 図 1 0は、 エタクリン酸が及ぼすダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成 酵素活性阻鶴果を示す図である。 図 1 1—1は、 本発明の抗体を用いて、 組織化学的手法による爐染色により、 心 臓を調べた結果を示す図面である。 図 1 1— 2は、 本発明のプローブを用いて、 ノ一ザ ンブロット法により心臓における本発明の遺伝^現を解析した結果を示す図面である。 図 1 2は、 心筋梗塞で死亡したヒト心臓について、 組 法を行い、 HE (へマト キシリン—ェォジン） 她、 並びに、 本発明の抗# 抗ミオグロビン抗体、 抗 COX - 1酵素抗体及び抗 C OX- 2酵素抗体による染色を行つた吉果を示す図面である。 図 1 3は、 雕合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵纖 の ゲノム;) ¾i、 クロ一ン化されたプロモーター領:^ 流約 4. 5 k b及び、 挿入したレポ一 ター遺^の である。 図 1 4は、 プロモータ^ 域上繊勺 4. 5 k bを挿入したレポ一夕 HI を喫し鏽田 胞 A543, HeLa、 Hek293に導入し、 48時間後の、 3つの培養細胞での転 醜率を表わ した図である。 図 1 5は、 嚇 L鎮钿胞 A543における転 性領域を上 向より削除した驗の転 ¾¾率の変化を表わした図である。 図 1 6は、 プロモ一ター領 海勺 4. 5 k bを挿入したレポ一夕 ΗΙβΐを用いて作 成した ^¾椒匕細胞 HeLaに、 インタ一フエロンァを投与した際の転^ g性の変化 を表わした図面である。 図 1 7は、 トランスジエニックマウスの作成に用いた遺 β?ベクターの を表わ した図面である。 発明を »するための最良の形態
以下、 本発明を、 例を挙げてさらに譜田に説明するが、 本発明はこれらに P腕さ れることはない。 難例 1
ゥシ心臓から廳給型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素を精製 し、 アミノ酸シ一クェンサによって、 そのアミノ酸藤を、 N—末端より Glu- Arg- Ser- Ala- Thr- Asn- Leu- Ser- Leu- Ser- Ser- Arg- Leu- Asn- Leu- T r- Leu- Tyr- Asn- Tyr- Lys- Thr と配歹 ij決定した。 この配列をもとに Genebankのデ 夕べ一 スを鍵し、 ヒト由 «βΐΑΚί^ ΟΟを発見した。 更に、 サル、 マウスの cDNAライブ ラリーについても を行い、 AK024100 と相同' I生の高いサリレ由来の遺 、 並びにマ ウス由来の遺 β?を発見した。
サル由来の遺ィ がコードするタンパク質を、 pTrc - HisAベクター （インビトロジェ を用い、 菌 BL21に導入して、 発現させた。
発現したタンパク質のプロスタグランジン Ε合成酵素活性を調べるために、 次のよ うな鵷を行った。
40 (マイクロモル） [1 - 14C]プロスタグランジン Η 0. 1M リン酸緩衝液（ρΗ6. 5)、 0. 5mM DTT並びに得られたタンパク質を含んだ職活性 ¾啶系 50 1 (マイクロリツ トル） を 24°Cで 1分間 させた。 次いで、 ジ工チルェ一テル/メタノール Zl Mクェ ン酸 (30/4/1) 0. 25 ml (ミリリットル） を加え、 を止めると同時にプロスタグラ ンジン類を有 » に抽出し、 薄層クロマ卜グラフィーを用いてベ fン/ジォキサ ン Z酢酸 (20/20/0. 1) 溶媒によって展開した。 プロスタグランジン Eのスポット点 とそれ以外のプロス夕ダランジ; ^1のスポット点をラジオアイソト一フ 測定すること により、 プロスタグランジン Hからプロスタグランジン Eへの »カ われるかを測定 した。 また、 ネガティブコント口一ルとして、 本発明のタンパク質を含まない系で同様 の測定を行った。
さらにプロスタグランジン Hの含 M¾びプロスタグランジン Hからプロス夕ダラン ジン Eへの を蘭し、 あたりに藤することで、 プロスタグランジン E合 成酵素活性 （1分間 lmg (ミリグラム） あたりのプロスタグランジン Hからプロス夕 グランジン Eへの変^ M( ol)) を算出した。
その結果、 得られたタンパク質のプロスタグランジン E合成酵素活性は、 SH剤 在下 500nmole/min · mgであって、 0. 5mM (ミリモル） DTT 下で 2800 mnole/min · mgであること力 鶴忍された。
図 1に、 ヒト、 サル、 マウス由来のタンパク質のアミノ酸配列の角晰結果を表わす。 これらの、 ヒト、 サル、 マウス由来タンパクのアミノ酸 E^Jの相同性を BLAST法で したところ、 82%であった。 また、 これらの 3つのタンパク質は、 Cys-Pro-Phe-Cys に 示される共通のアミノ ¾@H列音立を有していることが明らかとなった。 更に、 サル由来のタンパク質 （配列番号 2に記載のアミノ酸配列によって表される タンパク質） が る、 110番目からの、 Cys-Pro-P e-Cys という配列において、 110 番目の Cys ¾Sを Ser ¾Sに変え、 ±¾βと同様の方法でプロスタグランジン E合 j«性 を調べたところ、 プロスタグランジン Eが合成されなかった。 この結果、 Cys-Pro-Phe- Cys という配列の変化によって、 プロスタグランジン E合成酵素活性が影響を受けるこ と力 された。 例 2
AK024100遺 と相同な膨!』を るサル由来の遺ィ 5?を含む QccE-16688クロー ンを EcoRI/Ba Uサイトで¾1り出し、 pTrc- HisAベクタ一に揷入し、 pT-PGESを作成し た。次に、 Hindi II/BamHIサイトで切り出し、 pcDNA3. 1/HisCに挿入し、 pcEHPGESを作 成した。 PCR法で PGES (プロスタグランジン E合成酵素） 部分を切り出し、 CR2. 1- T0P0ベクターに挿入し、 pCR- PGESを作成した。 纖に Ba II/EcoRIサイトで切り出し、 pTrc-HisAベクタ一に挿入し、 サル由 給型グル夕チオン 異的プロスタグラン ジン E合成酵素全長を大腸菌で発現させるベクター pTH-PGES を作成した （図 2に表 す。 ) 。
一方、 QccE-16688クロ一ンより、 PCR法を用いて、 の 87個のアミノ膨遠を 削除したダル夕チオン # 励プロスタグランジン E合麵歸盼を増幅し、 次いで、 pcDNA3. 1/HisCに挿入し、 pcD"PGESASを作成した。 纖に BamHI/EcoRIサイトで切り 出し pTrc - HisAベクタ一に掙入し、 サル由 型グルタチオン ^励プロスタグ ランジン E合成酵素を大腸菌で発現させるベクター pTH-PGESASを作成した （図 2に表 す） 。
作成された 2つのべクタ一 （pTH- PGESと pTH-PGESAS) を、 M^ BL21に導入して、 形質転換体を作成し、 繊ぇ蛋白質を继した。蛋白質の発現条件は、 まず少量の LB 培地において 37°Cで一 培衝菱、 150ml (ミリリットル） の LB培地に移し、 37°Cで OD(600nm)が 0. 1になるま ¾¾し、 更に、 IPTGを ImMとなるように加え、 14時間培養 を行った。 （図 3に表す)。
培謝あ 3000 x gで 20分間遠心、 沈殿を回収した。 ®は溶液 (30mM (ミリモレ） KPB, 1M NaCl, 0. 5mM (ミリモル） DTT、 ImM (ミリモル） peptat inA, l ^ (マイクロ グラム） /ml (ミリリットル） PMSF、 50 g (マイクログラム） /ml (ミリリットル） DNAse、 50 (マイクログラム） /ml (ミリリットル） R ase、 H 7.0) に懸濁し、 15 秒間 10回の超音 «理を施した。 15000 x gで 30分間遠心し、 上澄¾を回収した (図 3に表す） 。
上澄¾^、 10 mM (ミリモル） イミダゾ一ルとなるようにした後、 N iァフィ二ティ カラムに加え、 カラムとの繊口性の低いタンパクを 10-140 mM (ミリモル） イミダゾー ルで冼い流し、 150 mM (ミリモル） イミダゾ一ルで « ^型ダル夕チオン隋異的プロ スタグランジン E合成 タンパク質を溶出させた （溶出曲線を図 4に表す） 。 溶出タ ンパクが 永動上シングルバンドであることを確認した。
pTH-PGESAS を用いたものは、 pTH-PGES を用いたものと比較してタンパク質の収率 が く、 150 ml (ミリリットル） LB培地の麟夜より精製タンパクが 250- 300 g (マ イクログラム）得ることが た。
昜菌での発現を比べると、 TH-PGESAS を用いたものは、 pTH-PGESを用いたもの と比較して 5. 5倍 蛋白質の発現量カ搞かった。
また、 得られた蛋白質の精製の »を比較したところ、 pTH-PGESASを用いて得られ たタンパク «ΖΚに可渐匕し、 クロマトグラフィ "^こよる精製力溶易であったが、 ρΤΗ- PGESを用いて得られたタンパク «7]に不溶で、 精製できなかった。
次いで、 TH-PGESAS由来の精 » ^型ダルタチオン # 猶プロスタグランジン E合成酵素量とプロスタグランジン E合成酵素活性との相関を調べた。
プロスタグランジン E合成酵素活性は、 ¾1例 1に記載の方法と同様の方法で測定 し、 プロスタグランジン Hからプロスタグランジン Eへの変 »から酵素活性値を求め た (酵素活性値の単位 nmol (ナノモル） /min · ragは、 1分間 1 mg夕ンパク質あたりの変 M CPGE «® を示す)。 その結果、 得られた蛋白質はプロスタグランジン E合成 酵素活性を有し、 活性と蛋白質量は、 窗泉関係にあった （図 5▲に表す）。 難例 3
雄例 2の pTH - PGESAS 由来の精謹給型ダルタチオン非特異的プロスタグラン ジン E合成酵素蛋白質を»9すると、 蛋白量 O. lng (ナノグラム） における 活 性は、 5分の 1以下に減少した （図 5♦に表す） 。 一方、 プロスタグランジン E合成酵素活性の測定において DTTを除くと、 該酵素活 性は钓 4分の 1となった (図 5睡こ表す)。 このタンパク質についての酵辦 I生を角晰し たところ、 pHは 7付近（図 6に表す） 、 Km値はおよそ 28 μΜ (マイクロモル)であ つた。 これは、 精製されたゥシ由来の騰給型グルタチオン # 異的プロスタグランジ ン Ε合成酵素と同程度であった。
また、 この蛋白質のプロスタグランジン Ε合成酵素活性が、 ダルタチオン非特異的 であることを廳忍するために、 DTT、 ダル夕チオン、 メルカプトエタノールの S下、 それらの量とプロスタグランジン E合成藤舌性の相関を調べた。 その結果、 ダルタチ オンより、 DTT被下で?舌性が く， 本赚がグル夕チオン 励であること力 «忍 された。
また、 0. 5m (ミリモル) DTT 下において、 最も高いプロスタグランジン E合成酵 素?舌' f生を示すことが、わかつた (図 7に表す)
¾力の強い DTTがより効 であることから、活性咅！^である Cys-X-X - Cysにおけ る S-S ^の開裂カ ½¾現に必須の要件であること力％P変される。
SH剤の濃度が必ずしもプロスタグランジン E合成酵素活性と比例関係にならないの は、 プロスタグランジン Hからプロスタグランジン Eへの異 ¾ί匕 こおレゝて、 m の DTTが、 活性部位以外にも還元力を持っためと推測される。 鎌例 4
趙例 2の pTH- PGES AS 由来の精 型ダルタチオン非特異的プロスタグラン ジン Ε合成酵素を観として、 ゥサギに滅し、 該滅したゥサギが ¾ ^する抗体を取 得した。
|¾¾体の特異性を確認、するために、 ウエスタンブロットによる餅斤を行った。
まず、 プロスタグランジン Ε合成活性があり、 ダル夕チオン特異的酵素が発現して いる C0S7細胞を調べたところ、 体が IS識するバンドは見ら よかった。 一方、 ポ ジティブコントロールとして用いた、 ^^型ダル夕チオン # 纖プロスタグランジ ン E合藤素 (PGES)^M昜菌及び PGES精製品で »Λンドカ 出された （図 8 ) 。 こ れにより、 «#^、 ダル夕チオン特異的プロスタグランジン Ε合成酵素 ず、 ^^型ダル夕チオン 異的プロスタグランジン Ε合成酵素を認識することが明らか になった。
更に、 実際に、 この抗体で、 細胞内のダルタチオン非特異的プロスタグランジン E 酵素が認識できるかを健忍するために、運好レベルでの » ^型ダル夕チオン 異 的プロスタグランジン E合成酵素の発現をノーザンブロットで確認した HeLa細胞を用 いて、 ウエスタンプロットを行ったところ、 戴働 識するバンド力 ¾出された （図 9) これから、 本発明の抗# 、 細胞内の鼸給型ダル夕チオン 励プロスタグ ランジン E合成酵素の認識に有用であること力 鶴忍できた。 難例 5
実施例 2で取得したタンパク質を用いて、 ダルタチオン非特異的プロスタグランジ ン E合成酵蒲舌性を増弓奴は阻 Τる化合物のスクリ一二ングを行つた。
まず、 纖化合物の存在下、 実施例 2で取得したタンパク質 6 xg (マイクロダラ ム） 、 5mM (ミリモル) DTT、 プロスタグランジン Hを共存させて、 プロスタグランジ ン E合成酵 舌性を測定した。 プロスタグランジン E合成酵素活性は、 例 1と同様 の方法で、 プロスタグランジン Hからプロスタグランジン Eへの変換を測定した。
次に、 翻化合物の賺下、 同様に、 タンパク質 6 g (マイクログラム） 、 5m M (ミリモル) DTT、 プロスタグランジン Hを共存させて、 プロスタグランジン Hからプ ロス夕ダランジン Eへの変 »を測定した。 ί赚化合物の 下及 下における、 プロス夕ダランジン Hからプロス夕ダランジン Eへの^^を比較した。
その結果、 エタクリン酸と、 CD B (1-クロ口- 2, 4-ジニトロベンゼン） を赌させた if ^に、 プロス夕ダランジン Hからプロス夕ダランジン Eへの変換率が低下し、 プロス タグランジン E合成酵蕭性が阻害されることがわかった。 また、 プロスタグランジン E合成酵素舌' I生の IS害は、 ？ 的であり、 ΙΟΟμΜ (マイクロモル)のエタクリン酸に よって約 30%阻害される。 エタクリン酸の結果を図 1 0に示す。 CDNBも阻^)果カ S見ら れたが、 エタクリン酸においてより显藤な？！^雄的な酵素活性低下の阻^)果が見ら た 難例 6
実施例 4で取得した抗グル夕チオン非特異的プログラス夕ジン E合成酵素抗体を用 いて、 DAB (ジアミドベンチジン） 染色により ffi i ^法を行い、 ヒト心臓を調べた。 ヒト心臓としては、 心臓内の左心室、 左心房、 右心室、 右心房、 m, 繊脈の各部 位を、 繊の内から外にかけて切片化して用いた。
その結果、 特に強い染色像が左心室心纖田胞、 中でも血液を全身に送り出す重要部 位である左心室の上音!^側の心觸田胞 ¾い^ 像力，認された。 しかし、 脈、 肺 動 管壁では染色されなかった （図 1 1— 1 ) 。
心臓では左心室心筋が棚して全身に血液を送り出すが、 この結果から、 鼸吉合型 ダルタチオン隋異的プロスタグランジン E合藤素が、 心室心筋が最も»Tるお、 鍾敝の上部外側により多く ΪΪΤることが明らかとなり、 酶齢型ダル夕チオン啭 異的プロスタグランジン Ε合成酵素が、 心筋の収縮に強く関与することが朋らかとなつ た。
プロスタグランジン Εは、 平滑筋の収縮、 ¾；锾に関与するホルモンであり、 このこ とからも、 膨齢型ダル夕チォン# 異的プロスタグランジン Ε合成酵素が、 心筋の収 縮に廳な関連を財ることが された。
一方、 ダルタチオン非特異的プログラス夕ジン Ε合成酵纖 をアイソトープで 方謝 tt«し、 胎児及び成人の 蔵 C¾te?li (クローンテック機：カタログ番号 7776-1, 7780-1、 7755-1) の mRN Aとのノ、イブリタイセ、一シヨンを行った。 その結果、 左心 S 、 ダル夕チオン # 異的プログラス夕ジン E合麵纖 β?が多いことを廳忍 した （図 1 1一 2) 。
この結果からも、 膨結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素が、 血液を送り出すなど激しい収縮 βを行う心觸齙で、 藤な機能を默していること 力観された。 難例 7
心筋梗塞で死亡したヒト心臓について、 実施例 6と同様の細 を行った （図 1 2) 。 ヒト «としては、 死後 1時間 2 1分のものを用いた。 また、 離液としては、 HE (へマトキシリン-ェォジン） を用いた。 へマトキシリン〖激を、 また、 ェォジン は細讓の敝を染める。細胞が心筋梗磐で «に至る過程においては、 細胞内の p Hが低下し鹏性が増力 ΠΤる。 細胞がダメージを受けた咅立では、 早い段階ではへマト キシン〖坡化せず、 ェォジンの ¾fe力 く見られる。 ί艇後〖辦間の βと共に、 核が 消失、 細胞が纖隹化し形態が 壌され染色像が見られなくなる。 よって、 HE染色され るのは、 心筋梗塞に伴う «後の早い段階をさす。
この HEで染色した心臓を、 猫例 4で取得した本発明の漏吉合型ダル夕チオン # 異的プロスタグランジン E合成酵素抗体を用いた組» ^法で調べたところ、 HE で魏が く見られる音啦では、 靈齢型グル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素抗体による腿像力 忍めら かった。
比較のために、 同 ffl戠を抗ミオグロビン抗体（DAKOPATTS棚 で馳した。その結 果、 HEで強く鹏が見られる音啦において、 聽像がわずかに見られ 心筋梗霸敝 において、 ミオグロビンの週兑は、 起こりつつあるが、 ではないことカ聰忍された。 このことから、 廳給型ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素は、 ミオグロビンと して、 心筋 立における消失の が騰であって、 ί»ί口 σ 型ダル夕チオン 鋼プロスタグランジン Ε合成酵素抗体を用いた: t船の; ¾^、 抗ミ オダロビン抗体を用いた齢よりも、 心筋梗戴啦を、 より雄に判 ¾ きることが明 らかになつた。
さらに比較として同組織を抗 C OX- 1酵素抗体、 抗 C OX- 2酵素抗体 (Santa Cruz Biotechnolog 棚 で染色し、 同様の測定を行った。 その結果、 HEで強く染 色が見られる音 |5{立において馳働 Sわずかに見られ 心筋梗¾ ^立において、 C0X-1酵 素、 C0X-2瞧の消失がおこりつつあるが、 には消失じていないことカ 忍された。 心筋梗 啦におレ T：、 プロスタグランジン H合成酵素である C0X - 1酵素、 C0X-2酵 素よりも、 プロスタグランジン E合成酵素がより早く消失することは、 プロスタグラン ジン E合成酵素が、 、 β倉と、 より密接に関連していることを示唆している。 麵例 8
ダルタチオン 異的プロスタグランジン E合成酵纖 の"^ (ffi列番号 8) を プロ一ブとして、 ヒトゲノム DNAライブラリーである BACライブラリーをスクリーニング 、 ダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵纖 が含まれる 3つ （BAC 82 A17, BAC 198A3, BAC 395P17) のクローンを した。 さらに、 いずれのクローンに もダル夕チオン 異的プロスタグランジン E合成酵纖 β?力 ることを PCR法に よって ¾it忍した。
また、 Genebankのデータベースを検索した結果、 ダルタチオン晴異的プロスタグ ランジン E合成酵素の 長 cDNAが AK057049に含まれ翻訳開始点上流の 531bに転写開 始点があること力湖らかとなつた。 さらにその上流約 4. lkbpを特定した （図 1 3；配列 番号 9参照）。 この 4. 5kbpをクローン化するため、 プライマ一, PF1 (TCC ATT TCC T GG ACA CCC TAG GIT CA) PRl (CAG CCG GGT CCA TGT TCG CI)を用いて 、 BAC 82A17をテンプレートとし f PCR法によって、 翻訳開始点上流 4646bpをクローン 化した。 この配列の上流より 4116番目が 写開始点と予想された。 これを市販のレポ一 ター解斤用ホ夕ルルシフェラ一ゼ ^クター pGV- E2に揷入し、 p GV-PGES2 (-4115) を作成した。 この pGV- PGES2 (-4115)を 3種の哺乳鶴猶田胞（ヒト肺鹏由艇 549細 胞、 ヒト子宮鹏由 ¾IeLa細胞、 ヒト劑 I®®由 ¾Iek293細 に遺 導入した。そ の結果、 ®¾由 田胞 ¾い転 性が示されることが明らかとなった （図 1 4参照） 。 特【 549細胞で高い転¾性が示され HeLa細胞に比べて約 6倍の活性を示した。 こ れから、 肺聽細胞においてダルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素が特 に高い転写効率を示すことが明らかとなつた。
さらに、 プロモータ一領域中で、 最も転 舌性に寄与する領域を見つけるため、 プ 口モーター領域を、 上^^ら約 1000 - 500bpを削除し、 pGV- PGES2 - 3131)、 pGV-PGES2 (-1932) , pGV-PGES2 (-792) , pGV-PGES2 ( - 7)を作成した。 これらを A549細胞に導入し た結果、 pGV- PGES2 - 7)を導入した細胞において、 最も高い転 性を示した （図 1 5 ) これらのことから、 翻訳開始点より上流側約 500塩基の間に、 ダル夕チオン非特異 的プロスタグランジン E合成酵素を最も効率良く転写 i©tする配列が含まれていること が明らかとなった。
次に転^?舌性に及ぼす翻 Jの影響を検討した。 まず、 pGV- PGES2 (-4115)を HeLa細胞 に導入し、 ¾¾¾翻田胞を作成した。該培養細胞に、 凝 ijとしてインターフェロンァ (IFN-r) 、 イン夕一ロイキン 1 )3 (IL-1 |3) 、 リポポリサッカライド ¾JS) を加え て、 転^?舌性 （プロモーター活† に及ぼす影響を調べた。 IL- 1 /3や LPSではプロモー ター活性に変化は見ら池かったが、 IFN -ァではプロモータ一活性カ¾少した （図 1 6
) C 難例 9
ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵纖 の翻訳開始付近 から ポリ A尾部まで付着する付近部分までの遺伝子を、 制限酵¾¾位 (Sailと Xhol) を付 カロさせた 2つのプフイマ一 wcg cgt cga caa cat ggc ccc ggc tac gcg) (ccg etc aag cag gcg cca caa acc ttt cc)を用いて、 PCR法によって増幅した。得られたフラ グメントは約 1. 5 k b pであった。 これを PCRフラグメント揷 Afflの市販べクタ一 PGEM T-easyに挿入し配列を確認した （pGEM-PGES) 。 心 異的にタンパク質が発現するミ オシン重鎖タンパク質プロモータ一領域が挿入された PMHCベクターと pGEM- PGESの Sailと Xholを切断し、 ミオシン翻タンパク質プロモ一夕一の下流にダルタチオン非 特異的プロスタグランジン E合成酵素遺ィ を挿入したプラスミド pMHC-PGESを作成し た （図 1 7) 。 図中の Not lと Xholで^]断することでミオシン誦タンパク質プロモ一 夕一の下流にダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵纖 を配置した DNAフラグメントを取り出した。 DNAフラグメントはマイクロインジェクション法によ りマウス （系統； C57BL/6J) の 卵に導入した。 ¾λΕ数 241個のうち 201個が ΊΕ 常な形態を示したので、 側复マウス 8匹に移植した。 移植後、 67匹のマウスが诞生し た。 ゝらゲノム DNAを抽出、 PCR法によって、 ダルタチオン醒的プロス夕ダラ ンジン Ε合成酵薩 がゲノム中に挿入されているかを廳忍した結果,メス 3匹のト ランスジエニックマウスカ權忍された。 更に、 ダルタチオン 励プロスタグランジ ン Ε合藤纖 β?を心 異的に高発現しているトランスジエニックマウスが、 正常 マウスと同様な行動をとり、 繁殖能力も備わっていることもわかった。 の利用の可能性
本発明によって、 哺乳類生物全般の局所ホルモンとして重要な生理機能乃至作用を 持つプロスタグランジン Eをダルタチオン非特異的に合^ Tる酵素の艦が明らかとな つた。該酵素は、 配歹 I播号 2、 5又は 7記載のアミノ酸膨 IJ又は該ァミノ麵列と高い 相同性を^ るアミノ匿列を有し、 且つ、 Cys-X-X-Cysからなる部 ί^Ξ列を^ るァ ミノ酸配列を ¾ る。 これは、 ダル夕チオン特励なプラスタグランジン Ε合成酵素に はない; itであって、 このネ¾1から得られる知見は、 プロスタグランジン E及ぴ，素 の機能の解明に有用に利用し得るものである。 結合型ダル夕チオン非特異的膨結合型プロスタグランジン E合成酵素は、 心臓や 胃など生体内の種々の音啦に擁し、 な猶を担っている。 従って、 本発明の遺伝 子、 蛋白質、 抗依 トランスジエニック動物又はプロモーターなどを禾翻した検討を行 うことによって、 該酵素が関与する各 患の診 8 ^治療のために有用な手段が提 ί共さ れる。本発明におレては、 更に、 膨 型グル夕チオン 勺酶 型プロス夕ダラ ンジン Ε合 性を増弓 は阻害する化合物のスクリーニング方法も提供される。 該スクリーニング法によって得られた化合物又はその誘 f本や; 類似化合物を中心に することによって、 、疾患をはじめとする各 @¾患の な診断乃至治 «の開発 力河能となる。
このように、 本発明は、 生体内で重要な機能を有しているプラスタグランジン E又 は該プロスタグランジン E合成酵素が関きる疾患の 乃至治療に、 新規かつ有用な 手段を提 ί共するものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下ひ） 〜 （4) のいずれかに記載されるタンパク質。
( 1)配列番号 2記載のアミノ酸配列によって表されるタンパク質。
(2)配列番号 2記載のアミノ薩列において、 1若しくはネ鐵個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは働卩されたアミノ麵列により表され 且つ、 ダルタチオン非特異的プロ スタグランジン E合成酵素活性を^ Tるタンパク質。
(3)配歹噃号 2記載のアミノ麵列と約 8 0 %以上の相同性を有し、 且つ、 Cys-X-X- Cysからなる部:^己列にこで Xは 意のアミノ膨搞を表す。 ) を衬るァミノ翻己 列により表され ダル夕チオン 励プロスタグランジン E合成酵薪舌性を る夕 ンパク質。
(4)酉 番号 1記載の: MIH列により表される DNA膨仅はその相補配列又はこれ らの D N A配列とストリンジェン卜な条件下で八ィプリダイズ、する D N A配列によりコ ードされ 且つ、 ダル夕チオン 難プロスタグランジン E合藤薪舌性を る夕 ンパク質。
2. 以下 (5) 〜 （8) のいずれかに記載されるタンパク質。
( 5 )配歹噃号 5記載のアミ
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(6)
Figure imgf000041_0002
1若しく 個のアミノ 欠失、 置換若しくは働卩されたアミノ薩列により表され且つ、 ダルタチォ 異的プロ スタグランジン E合成酵素活性を ¾ るタンパク質。
(7) »墦号 5記載のアミノ薩列と約 8 0 %以上の相同性を有し、 且つ、 Cys-X-X- Cysからなる部;^ IJ にこで Xは 意のアミノ膨進を表す。 ) を 1 "るアミノ麵 列により表され ダルタチオン 鋼プロスタグランジン E合成酵蒲舌性を; る夕 ンパク質。
(8)配列番号 4記載の: MSB列により表される DNAE^又はその相補配列又はこれ らの DNA配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNA配列によりコ ードされ 且つ、 ダル夕チオン 鋼プロスタグランジン E合成酵蒸舌性を^ Tる夕 ンパク質。
3. 以下（9) 〜 （1 2) のいずれかに記載されるタンパク質。
( 9 ) 配列番号 7記載のアミノ酸配列によって表される夕ンパク質。
( 1 0)配歹噃号 7記載のアミノ酸配列において、 1若しくはネ纖個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは働口されたアミノ隱列より表され 且つ、 ダル夕チオン晴励プロス 夕ダランジン E合成酵素活性を るタンパク質。
( 1 1 )配歹噃号 7記載のアミノ隱列と約 8 0 % の相同性を有し、 且つ、 Cys-X- X- Cysからなる部颁列 にこで Xは伍意のアミノ膨幾を表す。 ) を "るアミノ酸 配列により表される、 ダル夕チオン啭励プロスタグランジン E合 j¾ ^活性を ¾ るタンパク質。
( 1 2)配歹噃号 6言 の删 H?Uにより表される DNA配列又はその相補膨 IJ又はこ れらの DNA配列とストリンジェントな条件下で八イブリダイズする DNA配列により コードされ、 且つ、 ダルタチオン 異的プロスタグランジン E合成酵麵性を^ Tる タンパク質。 4. 配歹噃号 1記載の MSB^Jにより表される DNA配列又はその相補膨 IJ又はこ れらの DNA配列とストリンジェントな条件下で八イブリダイズする DNA嗣を有し、 且つ、 ダル夕チオン非特異的プロス夕ダランジン E合藤麵性を る夕ンパク質を コー卜 遺 i r *。 5. 膨噃号 4記載の: 列により表される DNA膨仅はその相補膨仅はこ れらの DNA配列とストリンジ工ントな条件下でハイプリダイズする DNA膨 ijを有し、 且つ、 ダルタチオン隋異的プロスタグランジン E合藤蒸舌性を; るタンパク質を コードする遺伝子。 6.
Figure imgf000042_0001
れらの DNA配列とストリンジェントな条件下で八ィプリダイズする DNA膨 IJを有し、 且つ、 ダル夕チォン啭異的プロスタグランジン E合成酵蒸舌性を^ Tるタンパク質を コードする遺 。
7. 配列番号 2、 5又は 7のいずれかに記載のアミノ酸配列の N末端より 8 7 個のアミノ酸残基が削除され、 N末端に、 ヒスチジン残基 6つを有する、 ァフィ二 ティカラムに親和性のあるアミノ酸配列が付加された、 ダル夕チオン非特異的プロ スタグランジン E合成酵素活性を有する融合夕ンパク質。
8. 以下、 （1 3) 〜 （1 4) のいずれかに記載されるタンパク質。
(1 3) 配歹 I潘号 3記載のアミノ麵列によって表されるタンパク質。
( 1 4) 配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、 かつ、 ダル夕チオン非 特異的プロス夕ダランジン E合成酵素活性を有するタンパク質。
9. 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のレ fれかに記載のタンパク質をコードする遺伝 子又 «H求項 4〜 6のい t lかに記載の遺 をベクターに導入し、 該ベクタ一を用い て形 させた形 ¾体を し、 培截¾0ゝら得られるタンパク質を精製すること によって、 ダル夕チオン # 異的プロスタグランジン Ε合成瞧活性を ¾ るタンパク 質を继する方法。
1 0. 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のレ lかに記載のタンパク質又はその部分べ プチドを碰として得られ、 騰給型ダルタチオン 励プロスタグランジン E合成 酵素と跡し、 ^^型ダルタチオン特異的プロスタグランジン E合 j¾ ^とは跡し ない、 膨 型ダル夕チオン 異的プロスタグランジン E合^^に特励な抗
1 1. 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のい t¾lかに記載の夕ンパク質又はその部分べ プチドを腿として得られ 職給型グルタチオン 纖プロスタグランジン E合成 酵素と し、 ¾ ^型ダル夕チオン特鋼プロスタグランジン E合藤素とは し ない、 膨 型ダル夕チオン附異的プロスタグランジン E合成酵素に特異的な抗体を 用レ τ、 細 【ぉ纖内に発現する藤給型グルタチオン 異的プロスタグランジン Ε合成酵素を^^!に検出する工程を Τる酵素の検出方法。
1 2. 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載のタンパク質又はその部分 ペプチドを として得られ 膨齢型グルタチオン晴異的プロスタグランジン E合 成酵素と し、 臌給型ダルタチオン特異的プロスタグランジン E合成酵素とは しない、 驟船型ダル夕チオン 励プロスタグランジン E合成酵素に特励な抗体 を含 る魏の検出乃至診断薬。
1 3. 請求項 1、 2、 3、 7又は 8の かに記載の夕ンパク質又はその部分べ プチドを観として得られ、 ^^型ダルタチオン啭励プロスタグランジン E合成 酵素と し、 型ダル夕チオン特励プロスタグランジン E合藤素とは し ない、 膨齢型ダルタチオン # 異的プロスタグランジン E合成赫に特異的な抗体を 含衬る 德の検出乃至藤
1 4. 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載のタンパク質又はその部 分べプチドを抗原として得られ、 膨結合型ダルタチオン非特異的プロス夕ダランジ ン E合成酵素と反応し、 膜結合型グルタチオン特異的プロスタグランジン E合成酵 素とは反応しない、 膜結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素 に特異的な抗体を用いて、 検体から調製した試料における、 騰合型ダルタチオン 非特異的プロスタグランジン E合成酵素の逸脱、 有無又は量を調べる工程を有する 疾患の検出乃至判定方法。
1 5. 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のい t lかに記載のタンパク質又はその部分べ プチドを ί¾Ιとして得られ 膨 型グルタチオン # 顯プロスタグランジン Ε合成 酵素と し、 Jffi^型ダルタチオン特顯プロスタグランジン Ε合成酵素とは し ない、 臌給型グルタチオン非特異的プロスタグランジン E合成酵素に特異的な抗体を 用レて、検体の心臓から調製した讓における、 膨^ Γ型グル夕チオン # 顯プロス タグランジン E合成^ ¾の週兑、 有無 は量を調べる工程を "る 疾患の検出乃至判 法。
1 6. 配列番号 1、 4又は 6のいず に記載の 列又はその相補配列におい て、 連^ Tる少なくとも 1 5墜を るポリヌクレオチド及び/又はそれに相補的な ポリヌクレオチドからなる、 膨給型グル夕チオン晴異的プロスタグランジン E合成 酵素関連プローブ。
1 7. 配列番号 8記載の Ml己列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドからな る、 廳給型グル夕チオン # 異的プロスタグランジン E合成酵素関連プローブ。
1 8 . 検体試料から調製した試料に、 請求項 1 6又は 1 7のいずれかに記載の プローブを接触させて、 プローブと結合する遺伝子の有無又は量を測定する工程を 有する疾患の検出乃至判定方法。
1 9 . 検体試料の心¾戠から調製した試料に、 請求項 1 6又は 1 7のいずれか に記載のプローブを接触させて、 プローブと結合する遺伝子の有無又は量を測定す る工程を有する心疾患の検出乃至判定方法。
2 0. 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のい lかに記載のタンパク質をコードする遺 β？又 求項 4〜 6のレ かに記載 が導入されたトランスジェニック非ヒ 卜哺孚瞧。
2 1 . 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺 β?又 求項 4〜 6のレ f lかに言 の遺 を欠損させたノックァゥト非ヒト哺乳 動物。
2 2. 下記（a) 〜 （c) の工程を有する、 ダルタチオン非特異的プロスタグラン ジン E合成酵素活性を増弓 は阻害する化合物のスクリーニング方法。
(a) ί鎌化合物の被下、 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のレ fれかに記載のタンパク 質及びプロスタグランジン Hを共存させて、 プロスタグランジン Hからプロスタグラン ジン £への変 $を測^ Tる工程、
(b) 候補化合物の非存在下、 請求項 1、 2、 3、 7又は 8のいずれかに記載の夕 ンパク質及びプロスタグランジン Hを共存させて、 プロスタグランジン Hからプロ ス夕グランジン Eへの変換率を測定する工程、
(c) (a) 及び（b) における変醇を比^ Tる工程。
2 3. 配 墦号 9又は 1 0に記載の MIS^Iの^^又は を有し、 且つ、 型ダルタチオン 異的プロスタグランジン Ε合成酵プロモーター活性を^ Τる D Ν A。
2 4. (a)膨 ij 号 9又は 1 0に記載の: ^ffi^の^ ¾又は 15を有し、 且つ、 膨齢型グル夕チオン 励プロスタグランジン E合藤素プロモータ一活性を る DNA、 及び（b) « ^型ダル夕チオン醒的プロスタグランジン E合藤素を コ一ドする遺 を含んでなる組み換え体 DNA。
2 5. (a)配歹蹯号 9又は 1 0に纖の 列の^ ¾又は ^^を有し、 且つ、 膨齢型グルタチオン # 顯プロスタグランジン Ε合麵素プロモータ一活性を ¾ る DNA、 及び（b)配歹 1潘号 1、 4又は 6記載の: MSB^Uにより表される DNA配列 又はその相補配列又はこれらの DNAIB ^とストリンジェン卜な条件下で八イブリダイ ズする DNASB^Iを有し、 且つ、 ダルタチオン 励プロスタグランジン E合成酵素 活性を るタンパク質をコードする遺 を含んでなる組み換え体 DNA。
2 6. 請求項 2 4又は 2 5に記載の組み換え体 DNAを宿主細胞のゲノム遺 中 に導人してなる形 体。
2 7. 請求項 2 4又は 2 5に記載の組み換え体 DN Aを宿主細胞のゲノム遺 中 に導入してなる形 ¾ ^体を培地に縫し、 該形 する臌給型ダルタチ オン 異的プロスタグランジン E合成酵素活性を有する蛋白質を¾¾する工程を含む
2 8. (a)配歹噃号 9又は 1 0に記載の: ^SB列の全部又は一部を有し、 且つ、 膜!^型ダル夕チオン # 勵プロス夕ダランジン E合薦素プロモータ一活性を^ る DNA、 及び (b) 該プロモーターにより発現され得るよう連結されたレポ一夕 »を含むベクターを含む系に、 被検物質を ¾¾0し、 レポーター遺 の，を 票と して、 ネ嫩物質が臌給型ダル夕チオン醒的プロスタグランジン Ε合成酵素活性を ¾ る蛋白質の繊の i©t 〖ぉ卬制に与える^を測^ることを含む、 疾患の蘭乃 至治療に な化合物のスクリーニング方法。
2 9. 配歹 I潘号 1， 4又は 6に言 の^ 13^により表される DNA配列又はその 相補配列又はこれらの DNA配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D N A配列を する遺 を発現可能に導入したトランスジエニック非ヒト哺 ¾J¾物また は形 体にネ嫩物質を投与し、 画物又は形 »ί本に対して搬物質力 える影 響を視 y定することを含む、 疾患の診断乃至治療に な化 物のスクリーニング方法。
3 0. 配歹 IJ 号 1， 4又は 6記載の: 列により表される DNA配列又はその相 補配列又はこれらの DNA膨 IJとストリンジェントな条件下で八ィプリダイズする DN A@2^を^ Tる遺 を欠損させたノックァゥト非ヒト嚇睡に！^質を投与し、 該ノックァゥト非ヒト動物に対して搬物質力 える を ι½Τることを含む、 疾患 の診断乃至治療に^ ¾な化合物のスクリ一二ング方法。
3 1. 請求項 1 , 2 , 3, 7又は 8のレ f lかに記載の夕ンパク質を^))^とし て含 Tる疾患の蘭乃至治麟。
3 2. 請求項 2 8〜 3 0のいずれかに記載のスクリ一二ング方法によって得ら れる化合物又はその誘導体を有効成分とする疾患の診断乃至治療薬。
3 3. 請求項 2 8〜 3 0に記載のスクリ一ニング方法によって得られる化合物 またはその誘導体を有効成分とする心疾患の診断乃至治療薬。
3 4. 請求項 2 8〜3 0に記載のスクリーニング方法によって得られる化合物 又はその誘導体を有効成分とする隐結合型ダル夕チオン非特異的プロスタグランジ ン E合成酵素阻害剤。
3 5 . 請求項 2 8〜3 0に記載のスクリーニング方法によって得られる化合物 又はその誘導体を有効成分とする膜結合型ダルタチオン非特異的プロスタグランジ ン E合成酵素活性促進剤。
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