WO2003050273A1

WO2003050273A1 - Milieu de culture pour des cellules humaines et methode de culture

Info

Publication number: WO2003050273A1
Application number: PCT/JP2002/012581
Authority: WO
Inventors: Mutsumi Takagi; Toshiomi Yoshida; Shigeyuki Wakitani
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2001-12-13
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2003-06-19
Also published as: EP1464698A1; EP1464698A4; CA2470853A1; US20050019910A1

Description

明細書ヒ卜細胞の培養用培地および培養方法技術分野

この出願の発明は、組織再生等の再生医療分野において有用なヒト由来細胞を簡便、かつ、効率的に増殖させる培地と、この培地を用いたヒト由来細胞の増殖方法に関するものである。背景技術

近年、ヒト細胞を用いた組織再生に関する基礎的知見が多々発見され、その臨床応用に期待が寄せられている。しかし、一般的に細胞培養、特に細胞増殖を行う際には、アミノ酸類、ビタミン類、糖類、無機塩類からなる基礎培地に細胞増殖因子として 10〜20¾のゥシ血清、特にゥシ胎児血清を添加した培地が用いられる。なお、成牛血清に比べてゥシ胎児血清の細胞増殖促進活性は顕著に高いことが知られている。しかしながら、ゥシ血清は大量生産ができず、非常に高価である上に、その組成は個体差（ロット差）が大きい。 1 ロットの量が限られているため、ロットの変更のたび毎にロットのチェック、培養条件の調整や管理等の煩雑な操作が必要となる。さらに血清は、血液細胞や血管内皮細胞の産生した生理活性物質を含む混合物であり、未知のウィルスが混入していたり、マイコプラズマゥィルス感染の危険がある等の問題があり、培地の品質が安定して保持できなくなる。厳重な品質管理が必要とされる培地の製造においては、これらの点は非常に重大な問題である。さらには、最近では、特にゥシ由来のプリオン等のような未知の病原因子がゥシ臓器、組織や血清を介して混入する可能性が問題となっている。これらの理由により組織再生のためのヒト細胞の増殖培養には、ゥシをはじめとする異種動物血清を含有しない培地の開発が望まれている。しかしながら、無血清条件下における培養では血清添加時と同程度の細胞の増殖を得ることは困難である。また、血清の増殖促進作用を部分的に代替し得る添加物は種々開発されているが、上記のような品質管理の観点から、血清の作用を代替する添加成分はなるべく少なくした方がよいにも関わらず、少なくとも数種類から 10 数種類に及ぶ血清代替添加物の混合添加が必要であるのが現状である。また、再生組織が適用される患者と同種であり、上記の品質上の問題が極めて少ないヒト血清に関しては、胎児血清は倫理的および社会的観点から、このような目的に使用することは極めて困難であるとともに、成人血清は種々の因子を含有しているものの、十分な細胞増殖促進活性は示さず実用的でないのが現状である。また、組織適合性または拒絶反応の可能性といった臨床的な観点を考慮すると、成人血清の中でもヒト細胞と同じ個体から採取された血清（以下、自己血清という）が望ましい。しかしながら、血清の細胞に対する増殖促進活性は、ゥシ胎児血清の場合でも個体差（ロット差）が大きいため、複数のロットについて細胞に対する増殖促進活性を試験して最も高い血清を有する血清を用いるのが通常である。成体血清の場合、個体によっては増殖促進活性を全く示さないものもあるが、自己血清の場合は血清を採取する個体を選択できないため、自己血清ではまったく増殖できない場合も発生する。また、 1ロットのサイズが 100L前後であることが多いゥシ胎児血清の場合には、事実上その使用量の制限がないため、十分な増殖促進活性が得られない場合には、培地への添加濃度を上げて増殖促進を達成することも可能だが、ヒ卜血清の場合、特に自己血清の場合はその採取可能な量は、数 lOOmLに留まるため、十分な増殖促進活が得られない場合でも培地への添加濃度を上げることが困難である。

また、たとえば骨髄液や臍帯血等に由来する間葉系細胞の場合、骨髄液や臍帯血等の細胞懸濁液から通常フイコール溶液等を用いた密度勾配遠心分離法により分離した間葉系細胞を播種して増殖させる方法が一般的である。一方、このような分離ステップを経ずに骨髄液や臍帯血を直接培養器に播種して間葉系細胞を増殖させる方法も検討されている。この直接培養の方法の操作が簡便で実用的である半面、間葉系細胞以外の血液細胞等が多量に混入するため、間葉系細胞は極めて増殖しにくかった。

この出願の発明は、前記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであつて、新しい組成からなるヒト細胞の増殖用培地を提供することを課題としている。

.またこの出願の発明は、前記の新しい培地を用いたヒ卜細胞の増殖方法を提供することを課題としてもいる。発明の開示

この出願の発明者らは、前記の課題を解決するために鋭意検討した結果、どの個体から採取したヒト血清であっても、少量の血清に増殖因子をあわせて添加することにより、ヒト細胞の増殖を促進できることを見出して、この発明を完成させた。

すなわち、この出願は第 1の発明として、ヒト血清と増殖因子を含むことを特徴とするヒト細胞の増殖培地を提供する。

上記第 1の発明においては、ヒト細胞が、ヒト外胚葉系細胞、ヒト中胚葉系細胞、ヒト内胚葉系細胞、ヒト胚性幹細胞、ヒ卜体性幹細胞およびヒト受精卵からこれらの細胞へ分化する過程に含まれる細胞からなる群より少なくともいずれか一種類が選択されることを好ましい態様としている。ヒト外胚葉系細胞は、ヒト神経細胞であることを好ましいとしており、またヒト中胚葉系細胞は、ヒト血管細胞、ヒト造血系細胞およびヒト間葉系細胞のからなる群より少なくとも一種類が選択されることを好ましいとしており、さらにまたヒト内胚葉系細胞は、ヒト肝細胞、ヒト肝細胞およびヒト胆細胞からなる群より少なくとも一種類が選択されることを好ましいともしている。またこの第 1の発明においては、増殖因子が、神経細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、トロンポポェチン、幹細胞因子および繊維芽細胞増殖因子からなる群より少なくともいずれか一種類が選択されること、ヒト血清が、培養対象となるヒト細胞と同一の個体から採取した血清であることをそれぞれ好ましい態様としている。さらにこの出願の発明は、第 2の発明として、前記第 1の発明の培地に、ヒト細胞を播種して細胞を増殖させることを特徴とするヒト細胞の増殖方法を提供する。この第 2の発明の増殖方法においては、ヒ卜骨髄由来の間葉系細胞、またはヒト臍帯由来の間葉系細胞を増殖させることを好ましい態様としている。またさらに、この第 2の発明の方法においては、ヒト細胞を含む組織細胞を、分離操作を介さず、直接培地に播種してヒト細胞を増殖させることを別の好ましい態様としている。発明を実施するための最良の形態

第 1の発明の培地は、細胞の増殖および維持を支援すべく使用される成長因子および栄養素を含む標準培地に、少なくともヒト血清および増殖因子を添加したものである。

「標準培地」とは、通常動物細胞の培養で用いられるイスコフ培地、 RPMI 培地、ダルベッコ MEM培地、 MEM培地、 F12培地等の血清を含まない培地を用いることができる。また、公知文献等により、細胞の増殖や維持に有効であることが知られている血清以外の因子、たとえば脂質および脂肪酸源、コレステロール、ピルビン酸塩、ダルココルチコイド、 DNAおよび RNA 合成ヌクレオシド等を添加してもよい。

「ヒト血清」は、体のどの部位から採取したものも使用でき、たとえば末梢血、骨髄液、臍帯血等から採取した血液から分離した血清を用いることができる。血清を採取するヒト個体は、培養増殖したヒト細胞を移植される本人でも、本人以外でもよいが、血清の採取に際しては十分なインフオームドコンセント等の倫理的医療が必要であることはいうまでもない。また、血清を供給するドナーの健康状態にも科学的、倫理的に許容される範囲内で十分配慮がなされる必要もある。これらに関する留意事項の詳細については、関係法令による。また、培養したヒト細胞の移植、あるいはこのヒト細胞を用いて作製された再生組織の患者への移植に際しての組織適合性の観点から、血清は患者本人から採取した自己血清が望ましい。ただし、ヒト細胞に対する増殖促進活性に関しては、患者以外の血清と患者の血清のいずれでもよい。

. 「増殖因子」としては、たとえば塩基性繊維芽細胞成長因子、表皮成長因子、血小板由来成長因子、トランスフェリン、インタ一ロイキン一 1、ィンターロイキン一 2、インターロイキン一 3、ィンタ一ロイキン一 4、インターロイキン一 5、インタ一ロイキン一 6、インタ一ロイキン一 7、インターロイキン一 8、インターロイキン一 9、インタ一ロイキン一 10、インタ一口ィキン— 1 1、インタ一ロイキン一 12、インタ一ロイキン一 13、これらィンターロイキンの受容体、顆粒球ーコロニ一刺激因子、顆粒球一コロニー刺激因子受容体、エリスロポエチン、エリスロポエチン受容体、コロニー刺激因子— 1、マクロファージコロニー刺激因子、コロニー刺激因子一 1受容体、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、 F i t— 3 リガンド、トロンボポェチン、トロンポポェチン受容体、上皮増殖因子、上皮増殖因子受容体、トランスフォーミング増殖因子、トランスフォーミング増殖因子受容体、ジフテリア毒素受容体、ェピレダリン、ニューレグリン一 1、ニューレグリン一 2、ニューレグリン一 3、血小板由来増殖因子受容体、酸性繊維芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子受容体、インシュリン様増殖因子、インシュリン様増殖因子受容体、細胞分散因子、幹細胞増殖因子、幹細胞増殖因子受容体、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、神経成長因子、神経成長因子受容体、グリア細胞株由来神経栄養因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体、ミツドカイン、プレイオト口フィン、アンジォポェチン、ベ一夕ダリカン、エンドダリン、ァクチビン、ァクチビン受容体、インヒビン、骨形成因子、骨形成因子受容体、フォリス夕チン、ノギン、コーディン、スマッド、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、リンホトキシン、 Fas、 Fas リガンド、 CD40、 CD40リガンド、 CD30、 CD30リガンド、 CD27、 CD27リガンド、インターフェロン一 α、インタ一フエロン一 α受容体、インターフェロン一 ]3、インターフェロン一 j3受容体、インターフェロンーァ、インターフェロン—ァ受容体、血清アルブミンおよびインシュリン並びにコラーゲン、フイブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリックス成分が使用できる。塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF) は、脳下垂体、脳、網膜、黄体、副腎、腎、胎盤、前立腺、胸腺等の臓器から公知の手段で単離、精製されたもの、組換え DNA 技術等の遺伝子工学的手法で製造されたもの、さらにこれらの修飾体であって繊維芽細胞増殖因子として作用し得るものを含む。 bFGFの修飾体としては、たとえば臓器から単離、精製された bFGF または遺伝子工学的手法で得られた組換え bFGFのアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸残基が付加、欠失、または他のアミノ酸残基に置換されたもの等が挙げられる。また、遺伝子工学的手法によるタンパク質の製造では、形質転換細胞で発現したタンパク質が、翻訳された後、細胞内で各種修飾（翻訳後修飾）を受ける場合がある。たとえば、 N末端メチォニンの離脱、 N末端ァセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化等が挙げられる。したがって、このように修飾された bFGFもその修飾体の範囲に含まれる。さらに、上記増殖因子のうち、動物によって夕イブが異なる場合は、ヒト細胞の増殖促進活性が同等であっても、ヒト型の増殖因子が望ましい。

この出願の第 2の発明の方法は、前記第 1の発明の培地にヒト細胞を播種して細胞を増殖させることを特徴としている。

培養対象となる「ヒト細胞」は、ヒト由来の細胞または組織であれば、いかなるものでもよく、ヒト外胚葉系細胞、ヒト中胚葉系細胞、ヒト内胚葉系細胞、ヒト受精卵からこれらの細胞へ分化する過程に含まれる細胞、ヒト胚性幹細胞およびヒト体性幹細胞等が例示できる。

この出願の発明において「ヒト外胚葉系細胞」は、ニューロン細胞、ァスト口サイト細胞、オリゴデンドロサイト細胞やこれらの幹細胞であるヒト神経細胞等が例示でき、組織学的にいうところの外胚葉組織に含まれる細胞および幹細胞を指す。また「ヒ卜中胚葉系細胞」は、ヒト血管細胞、ヒト造血系細胞やヒト間葉系細胞等が例示でき、組織学的にいうところの中胚葉組織に含まれる細胞および幹細胞を指す。前記「造血系細胞」は、たとえば造血幹細胞、造血前駆細胞、赤血球細胞、リンパ球細胞、顆粒球細胞および血小板細胞等が挙げられる。また「間葉系細胞」は、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、腱細胞、脂肪細胞、毛乳頭細胞、歯髄細胞等の組織学的にいうところの結合組織の細胞およびこれらの細胞に分化する能力を有する細胞を指す。細胞形態としては、繊維芽細胞、脂肪細胞等がある。間葉系細胞の存在する組織としては、骨、軟骨、筋肉、心筋、腱、脂肪組織、毛乳頭、歯髄等を例として挙げる事ができる。またこれら以外の、血管、肝臓、膝臓等の実質臓器の内部や周囲にも存在し、さらに骨髄や臍帯にも存在する。骨髄中には、多くの結合組織細胞への多分化能を有した細胞（間葉系幹細胞）が存在し、この間葉系幹細胞の表面には

CD105抗原が特異的に発現していること等が報告されているが、これもこの発明方法における間葉系細胞の一つである。また骨髄液や臍帯血等に由来する間葉系細胞を増殖させる場合、骨髄液や臍帯血等の細胞懸濁液から定法に従ってフイコール溶液等を用いた密度勾配遠心分離法により分離した間葉系細胞を播種して増殖させてもよい。

「ヒト内胚葉系細胞」は、肝細胞、その幹細胞である肝細胞、膝外分泌細胞、塍内分泌細胞、その幹細胞の肝細胞、また胆細胞等が例示でき、また主に肝臓や膝臓等の臓器に分化する。組織学的にいうところの内胚葉組織に含まれる細胞および幹細胞を指す。また、この発明における「増殖」とは、培養中の細胞数の変化に関しており、増殖とは経時的に細胞数が増えることを示している。望ましくは、ある細胞集団全体の中の細胞数が 2 倍になるのに要する時間（平均世代時間）が 1時間〜 150時間の範囲である場合が好ましい。

実施例

以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳しく、かつ、具体的に説明するが、当然にこの発明は以下の例によって限定されるものではない。

(実施例 1 )

インフォ一ムドコンセントを経て 3人の健常人ボランティァの男女から

13mL づっ採取した骨髄液中の有核細胞数を定法に従いチュルク液を用いて計数し、表 1に示した 5種類の培地を用いて、それぞれ細胞濃度が 6. 0 x i0⁵ce l l/cm²となるように細胞培養用ディッシュ（住友べ一クライト社製、底面積 1. 8cm²、培養液量 lmL) に播種し、 37t 、 5%C0₂濃度のインキュベータ—内で静置培養した。培地成分は以下のとおりである。

• DMEM標準培地（ギブコ社製、型番号 31600-34)

• 塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF ;ギブコ社製、型番号 100-18B)、

10ng/mL

• 10%血清： .

—ゥシ胎児血清（ギブコ社製、型番号 26140— 079) ；または

—骨髄液ドナー自身のヒ卜末梢血由来の血清

培養開始 1 日後および 2 日後に培地交換をし、接着細胞以外の浮遊細胞（血液細胞等）を除去したところ、何れの培養でもディッシュ底面にわずかに接着細胞が認められた。その後、この接着細胞がコンフルェント近くまで増殖したのを顕微鏡で確認した 19 日後に、全てのディッシュの接着細胞をトリプシン処理により剥離し、トリパンブル一液を用いて接着していた生細胞の密度を計測した。

結果を表 1に示したとおりである。この表 1の細胞密度の数値は、 X 10⁴ce l l s/cni²である。この表 1の結果から明らかなとおり、何れのドナ一由来の間葉系細胞においても、無血清培地に bFGFを添加しても増殖効果はあるが、増殖した密度は低く、ゥシ胎児血清培地の 5分の 1程度に留まつている。一方、ヒト血清自体の増殖促進活性はゥシ胎児血清に比べて低いものの、無血清と比べると有意に高く、さらにヒト血清に bFGF を添加することによってゥシ胎児血清より強い増殖促進活性を示すことが確認された。

表― 1

(実施例 2 )

ヒト肝臓細胞株として、 HepG2.細胞、 Huh7 細胞およびヒト初代肝細胞 (旭テクノグラス社）を表 2に示した 5種類の培地を用いて、 HepG2細胞および Huh 7細胞の細胞濃度をそれぞれ 1. 0 X 10⁴とし、またヒト初代肝細胞の細胞濃度を 1. 0 x i 0⁵ce l l/cm²となるように細胞培養用ディッシュ（住友べ一クライト社製、底面積 21cm²、培養液量 5mL)に播種し、 37で、 5¾C0₂ 濃度のィンキュベータ一内で静置培養した。

培地成分は以下のとおりである。

• DMEM標準培地（ギブコ社製、型番号 31600— 34)

• L—プロリン： 30 ;ti g/mL インシュリン： 0. 5 t g/mL

Lーァスコルビン酸リン酸エステル： 0. 2mM

肝細胞増殖因子（HGF) ： 10ng/mL

上皮細胞増殖因子（EGF) ： 10ng/mL

10%血清：

—ゥシ胎児血清（ギブコ社製、型番号 26140— 079) ；または

ーヒ卜末梢血由来の血清

各接着細胞が増殖したのを顕微鏡で確認した後、 HepG2細胞おょぴ Huh7 においては 8 日後、また初代肝細胞においては 14 日後に、全てのデイツシュの接着細胞の密度を脱核染色法により計測した。

結果は表 2に示したとおりである。この表 2の細胞密度の数値は、 X 10⁴ce l l s/cm²である。この表 2から、 HepG2細胞おょぴ Huli7細胞においては、無血清培地に HGFおよび EGFを添加してもほとんど増殖効果はない。一方、ヒト血清自体の増殖促進活性はゥシ胎児血清に比べて低いが、無血清と比べると有意に高く、さらにヒト血清に HGFおよび EGFを添加することにより、何れの肝細胞においてもゥシ胎児血清より強い増殖促進活性が示された。

表 2

(実施例 3 )

ヒト神経ァストロサイト細胞（NHA； C lone t ics 社）およぴヒト神経前駆体細胞（NHMP； C lone t ics社）を、表 3に示した 5種類の培地を用い

10

差替え用紙（規那 26) て、前記それぞれの細胞濃度が 2, 0 X 10³cel i/cm²となるように細胞培養用ディッシュ（住友ベークライト社製、底面積 1. 8cni²、培養液量 2mL) に播種し、 37で、 5¾C0₂濃度のインキュベーター内で静置培養した。

培地成分は以下のとおりである。

- DMEM標準培地（ギブコ社製、型番号 31600— 34)

• 神経細胞増殖因子（NGF) ： lOOng/mL

• 10 血清：

ーゥシ胎児血清（ギブコ社製、型番号 26140— 079) ；またはーヒト末梢血由来の血清

細胞の増殖が顕微鏡で確認された 10 日後に、全てのディッシュの接着細胞をトリプシン処理にて剥離させ、トリパンブルー液を用いて接着していた生細胞の密度を計数した。

結果は表 3に示したとおりである。この表 3における接着細胞の密度の数値は、 X 10⁴cel ls/cm²である。表 3に示した結果から、何れの神経細胞においても、無血清培地に NGFを添加してもほとんど増殖効果は確認できなかった。一方、ヒト血清自体の増殖促進活性はゥシ胎児血清に比べて NHA細胞においてはわずかに低く、 NHMP細胞では 2分の 1程度に低いものの、無血清と比べると有意に高く、さらにはヒト血清に NGFを添加することによってゥシ胎児血清よりも強い増殖促進活性を示すことが確認された。

表 3

11

差替え用紙（規則 26》産業上の利用可能性

以上詳しく説明したとおり、この発明によって、ヒト血清を用いたヒト細胞の増殖培地と増殖方法が提供される。

Claims

請求の範囲

1 . ヒト血清と増殖因子を含むことを特徴とするヒト細胞の増殖用培地。

2 . ヒト細胞が、ヒト外胚葉系細胞、ヒト中胚葉系細胞、ヒト内胚葉系細胞、ヒト胚性幹細胞、ヒト体性幹細胞およびヒト受精卵からこれら前記の細胞へ分化する過程に含まれる細胞からなる群より少なくともいずれか一種類が選択される請求項 1の培地。

3. . ヒト外胚葉系細胞が、ヒト神経細胞である請求項 2の培地。

4 . ヒト中胚葉系細胞が、ヒト血管細胞、ヒト造血系細胞およびヒト間葉系細胞のからなる群より少なくとも一種類が選択される請求項 2の培地。

5 . ヒト内胚葉系細胞が、ヒト肝細胞、ヒト肝細胞およびヒト胆細胞からなる群より少なくとも一種類が選択される請求項 2の培地。

6 . 増殖因子が、神経細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、トロンポポェチン、幹細胞因子および繊維芽細胞増殖因子からなる群より少なくともいずれか一種類が選択される請求項 1から 5いずれかの培地。

7 . ヒト血清が、培養対象となるヒト細胞と同一の個体から採取した血清である請求項 1から 5いずれかの培地。

8 . 請求項 1から 7いずれかの培地に、ヒト細胞を播種して細胞を増殖させることを特徵とするヒト細胞の増殖方法。

9 . ヒト骨髄由来の間葉系細胞を増殖させる請求項 8の方法。

10. ヒト臍帯由来の間葉系細胞を増殖させる請求項 8の方法。

1 1. ヒト細胞を含む組織細胞を、分離操作を介さず、直接培地に播種してヒト細胞を増殖させる請求項 8から 1 0いずれかの方法。