WO2003044188A1 - Procede pour inhiber l'expression de genes - Google Patents

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WO2003044188A1
WO2003044188A1 PCT/JP2002/012183 JP0212183W WO03044188A1 WO 2003044188 A1 WO2003044188 A1 WO 2003044188A1 JP 0212183 W JP0212183 W JP 0212183W WO 03044188 A1 WO03044188 A1 WO 03044188A1
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rna
dna
target gene
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Kaoru Saigo
Kumiko Tei
Takahide Kaji
Ryu Ueda
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Mitsubishi Chemical Corporation
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    • C12N2310/50—Physical structure
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Definitions

  • the present invention relates to a target gene obtained by introducing a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA having substantially the same sequence as at least a part of the base sequence of a target gene into a cell, tissue or individual. And a method for inhibiting expression.
  • RNAi effect As a method of inhibiting the expression of a target gene in a cell, tissue or individual, introduction of double-stranded RNA into the cell, tissue or individual promotes degradation of mRNA having homology to the sequence.
  • RNAi method This effect has been used for plants (Waterhouse, PM, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 13959-13964 (1998)), and for birds and horses (Ngo, H. et al. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 14687-14692 (1998)), Hydra (Lohmann, JU, et al., Dev. Biol., 214, 211-214 (1999)), Planaria
  • the present invention relates to a method of introducing a double-stranded polynucleotide having increased stability by containing DNA into a cell, tissue, or individual, thereby obtaining a sequence substantially identical to the base sequence of the polynucleotide. It is an object of the present invention to provide a method for inhibiting the expression of a target gene.
  • the present inventors have made intensive efforts to solve the above problems, and as a result, in a hamster cultured cell CHO-KI, a hybrid of DNA and RNA having a partial nucleotide sequence of the luciferase gene was used.
  • a hybrid of DNA and RNA having a partial nucleotide sequence of the luciferase gene was used.
  • a certain double-stranded polynucleotide and a double-stranded polynucleotide that is a chimera of DNA and RNA were introduced, it was found that the expression of the luciferase gene was inhibited in the cells, and the present invention was completed.
  • the present invention was completed.
  • a target characterized in that a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA having a sequence substantially identical to at least a part of the base sequence of a target gene is introduced into a cell, tissue, or individual.
  • a method for inhibiting gene expression is characterized in that a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA having a sequence substantially identical to at least a part of the base sequence of a target gene is introduced into a cell, tissue, or individual.
  • the double-stranded polynucleotide is composed of 19 to 25 nucleotides, and is at least an upstream 1Z2 force S RNA among the polynucleotides.
  • (11) A method for imparting specific properties to a cell, tissue, or individual by inhibiting the expression of a target gene using the method according to any one of (1) to (9).
  • An agent for preventing, treating, or treating a disease involving a target gene comprising a substance obtained by the method described in (13) above as an active ingredient.
  • a method for producing an agent for preventing and / or treating a disease associated with a target gene which is characterized by formulating the substance selected by the method according to (13) above.
  • An agent for preventing and / or treating a disease associated with a target gene comprising at least the double-stranded polynucleotide according to (22).
  • FIG. 1 is a diagram showing the sequences of a sense single-stranded polynucleotide consisting of 21 nucleotides and an antisense single-stranded polynucleotide consisting of 21 nucleotides, which were used to prepare a double-stranded polynucleotide.
  • the left means the 5 'end and the right means the 3' end.
  • Bold letters indicate RNA and underline indicates DNA.
  • FIG. 2 shows a DNA-RNA hybrid double-stranded polynucleotide in CHOKI cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing inhibition of luc gene expression when was introduced.
  • FIG. 3 is a diagram showing inhibition of luc gene expression when a double-stranded polynucleotide having a sense strand of: NA and an antisense strand of DNA-RNA chimera was introduced into S2 cells.
  • Figure 4 shows the inhibition of luc gene expression when a double-stranded polynucleotide whose antisense strand is RNA and whose sense strand is a DNA-RNA chimera is introduced into HeLa cells and HEK293 cells. It is.
  • FIG. 5 is a diagram showing the inhibition of luc gene expression when a DNA-RNA chimera double-stranded polynucleotide is introduced into CHO-K1 cells.
  • Double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA for use in RNAi method provides a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA having a sequence substantially identical to at least a part of the base sequence of a target gene.
  • This is a method for inhibiting expression of a target gene, which comprises introducing a chain polynucleotide into a cell, tissue, or individual.
  • a target gene is a cell, tissue, or individual into which the gene is introduced.
  • transfectant Any mRNA, and optionally any protein that can be translated to produce a protein.
  • the object to be introduced may be intrinsic or exogenous. Further, it may be a gene existing on a chromosome or an extrachromosomal one. Examples of the exogenous one include those derived from a pathogen such as a virus, a bacterium, a fungus, or a protozoan capable of infecting a recipient. The function may be known or unknown, and may be known in cells of other organisms but unknown in the recipient.
  • a DNA having a sequence substantially identical to at least a part of the nucleotide sequence of these genes a double-stranded polynucleotide consisting of RNA (hereinafter sometimes referred to as “double-stranded polynucleotide j”); Is composed of a sequence substantially identical to a sequence of 20 nucleotides or more, which may be any part of the base sequence of the target gene. is there.
  • substantially the same means having homology of 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more with the sequence of the target gene.
  • the nucleotide chain length may be any length from 19 nucleotides to the entire length of the open reading frame (ORF) of the target gene, but those having a chain length of 19 to 500 nucleotides are preferably used.
  • ORF open reading frame
  • mammalian cells have a signal transduction system that activates in response to double-stranded RNA having a chain length of 30 nucleotides or more. This is called the interfacial reaction (Mareus, PI, et al., Interferon, 5, 115.180 (1983)).
  • PKR dsRNA-responsive protein kinase
  • Bass, BL, Nature, 411, 428-429 (2001) non-specifically inhibits the initiation of translation of many genes, and at the same time, 2 ', 5' oligoadenylate synthetase (Bass, B.IJ) , 411, 428-429 (2001)), RNaseL is activated, and nonspecific degradation of intracellular RNA is induced. These non-specific reactions mask the specific response of the target gene.
  • a mammal when a mammal, or a cell or tissue derived from the animal is used as a recipient, it is composed of 19 to 25, preferably 19 to 23, more preferably 19 to 21 nucleotides.
  • Single-stranded polynucleotides are used.
  • the double-stranded polynucleotide of the present invention does not need to be entirely double-stranded, and includes those having a partially protruding 5 ′ or 3 ′ end, and the protruding end has 1 to 5 nucleotides, preferably It is 1-3 nucleotides, more preferably 2 nucleotides.
  • the most preferable example is a polynucleotide having a structure in which the 3 ′ end of each polynucleotide chain is projected by 2 nucleotides.
  • the double-stranded polynucleotide means a polynucleotide having a double-stranded portion having complementarity, but may be a single-stranded polynucleotide having self-phase correction and self-annealed.
  • Single-stranded polynucleotides having self-phase correction include, for example, those having inverted repeat sequences.
  • a hybrid type of DNA and RNA chains for the mixing of DNA and RNA, a hybrid type of DNA and RNA chains, a chimeric type of DNA and RNA, and the like are used.
  • the hybrid of the DNA strand and the RNA strand may be any hybrid as long as it has an activity of inhibiting the expression of the target gene when introduced into the recipient, but is preferably The sense strand is DNA And the antisense strand is RNA.
  • any chimeric DNA and RNA may be used as long as they have an activity of inhibiting the expression of a target gene when introduced into a recipient.
  • the sequence required to inhibit the expression of the target gene is required to be RNA. It is desirable to appropriately determine the amount within the range in which expression inhibition occurs, while analyzing the degree of target gene expression inhibition described below. Thereby, the functional site of UNA in the RNAi method can be identified.
  • Preferred examples of the thus-determined chimeric type include, for example, those in which a part of the upstream side of the double-stranded polynucleotide is: NA.
  • the upstream side means the 5 'side of the sense strand or the 3' side of the antisense strand.
  • the upstream portion is preferably a portion of 9 to 13 nucleotides from the upstream end of the double-stranded polynucleotide.
  • the polynucleotides each have a length of 19 to 21 polynucleotides, and at least 1/2 of the upstream side of the polynucleotides is used.
  • RNA and double-stranded polynucleotides other than DNA are used.
  • the method for preparing the double-stranded polynucleotide is not particularly limited, but it is preferable to use a chemical synthesis method known per se.
  • chemical synthesis a single-stranded polynucleotide having complementarity can be separately synthesized, and can be converted into a double-stranded strand by associating them by an appropriate method.
  • the method of associating the synthesized single-stranded polynucleotide is preferably at least about a 3: 7 molar ratio, more preferably about a 4: 6 molar ratio, and most preferably essentially And the mixture is heated to a temperature at which the two chains dissociate, and then gradually cooled.
  • the associated double-stranded polynucleotide is purified, if necessary, by a commonly used method known per se.
  • a purification method for example, a method of confirming using an agarose gel or the like and removing any remaining single-stranded polynucleotide by decomposing it with an appropriate enzyme or the like can be used.
  • the polynucleotide is produced by a method such as chemical synthesis and then self-complemented in the same manner as described above. It is prepared by associating sexually active sequences.
  • the transfectant into which the double-stranded polynucleotide thus prepared is introduced may be any as long as the target gene can be transcribed into RNA or translated into protein in the cell.
  • the transfectant used in the present invention means a cell, a tissue, or an individual.
  • Examples of the cells used in the present invention include germline cells, somatic cells, totipotent cells, pluripotent cells, divided cells, non-divided cells, parenchymal cells, epithelial cells, immortalized cells, and transformed cells. May be used. Specific examples include undifferentiated cells such as stem cells, cells derived from organs or tissues, or differentiated cells thereof. Tissues include single-cell embryos or constitutive cells, or multi-cell embryos, fetal tissues, and the like.
  • Examples of the above differentiated cells include, for example, fat cells, fibroblasts, muscle cells, cardiomyocytes, endothelial cells, nerve cells, Darya, blood cells, megakaryocytes, lymphocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, Examples include basophils, mast cells, leukocytes, granulocytes, keratinocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoclasts, hepatocytes, and cells of the endocrine or exocrine glands.
  • Specific examples of such cells include CHO-KI cells (RIKEN Cell bank) and Drosophila S2 cells (Schneider, I., et al., J. Embryol. Exp.
  • the individual to be introduced in the present invention specifically includes a plant, an animal, a protozoan, a virus, a bacterium, or a fungal species.
  • the plant may be a monocotyledonous, dicotyledonous or gymnosperm, and the animal may be a vertebrate or invertebrate.
  • Preferred microorganisms as transfectants of the invention are those used in agriculture or by industry, and which are pathogenic to plants or animals.
  • Sexual. Fungi include organisms in both power and yeast forms.
  • vertebrates examples include mammals, including fish, sea lions, goats, pigs, sheep, hamsters, mice, rats, monkeys and humans, and invertebrates include nematodes and worms. Includes other reptiles, Drosophila, and other insects.
  • Methods for introducing a double-stranded polynucleotide into a recipient include, when the recipient is a cell or a tissue, a calcium phosphate method, an electroporation method, a lipofection method, a virus infection, or a double-stranded polynucleotide. Immersion in a polynucleotide solution or a transformation method is used. Examples of the method for introduction into the embryo include microinjection, electoral poration, and virus infection. When the recipient is a plant, a method of injecting or perfusing the plant into the body cavity or stromal cells, or spraying is used.
  • the double-stranded polynucleotide can be mixed directly with the food of the organism.
  • it can be administered, for example, by administration as an implanted long-term release preparation or the like, or by ingesting an introduced body into which a double-stranded polynucleotide has been introduced.
  • the amount of the double-stranded polynucleotide to be introduced can be appropriately selected depending on the transductant and the target gene, but it is preferable to introduce an amount sufficient to introduce at least one copy per cell. Specifically, for example, when the transfectant is a human cultured cell and the double-stranded polynucleotide is introduced by the calcium phosphate method, 0 to 1: L0000 nM is preferable. .
  • two or more kinds of double-stranded polynucleotides can be simultaneously introduced.
  • the expression of two or more target genes is expected to be inhibited in a cell, tissue, or individual to which the polynucleotide has been introduced (hereinafter, this may be referred to as an “introduced body”).
  • the expression inhibition of the target gene means not only the complete inhibition of the expression but also the inhibition of the expression level of m-RNA or protein by 20% or more.
  • the degree of target gene expression inhibition is determined by the accumulation of the target gene RNA or the target gene.
  • the output of the protein encoded by the gene can be measured by comparing the introduced and non-transduced double-stranded polynucleotides.
  • the amount of mRNA can be measured by a commonly used method known per se. Specifically, for example, Northern hybridization, quantitative reverse transfer PGR, or in situ hybridization can be used.
  • the amount of protein produced can be measured by Western blotting using an antibody that uses the protein encoded by the target gene as an antigen, or by measuring the enzyme activity of the protein encoded by the target gene. .
  • the function of the gene targeted by the introduced double-stranded polynucleotide is analyzed by analyzing the phenotypic change appearing in the transductant. Can be identified.
  • the function of the target gene may be known, or the function of the target gene in the recipient may be unknown.
  • the double-stranded polynucleotide corresponding to the target gene is as described above.
  • the phenotype for which the change should be analyzed in the transductant is not particularly limited. Movement or life-form behavior such as the life span of the introduced body. If the function of the target gene is known in other transfectants, it is preferable to analyze the phenotype associated with that function.
  • a means for analyzing a change in the phenotype when analyzing a change in the morphology of the transductant, a method of detecting with a microscope or a naked eye can be used.
  • the substance in the transfection body is, for example, mRNA
  • examples of the method for analyzing the amount include Northern hybridization, quantitative reverse transfer PCR, in situ hybridization, and the like.
  • methods for analyzing the amount include the ⁇ -stamping method using an antibody that uses the protein encoded by the target gene as an antigen, and the enzyme activity of the protein encoded by the target gene.
  • a measuring method and the like can be mentioned.
  • the phenotypic changes that appear only in the transfectants analyzed in this way are likely to inhibit the expression of the target gene. As a result, it can be identified as a function of the target gene.
  • the target gene By inhibiting the expression of a target gene using the double-stranded polynucleotide of the present invention, specific properties can be imparted to cells, tissues, or individuals. Specific properties refer to those that appear in the transductant as a result of inhibition of the expression of the target gene.
  • the target gene may be a gene whose inhibitory expression has a known effect on the transfectant, or may have a function or an unknown function in the transfectant.
  • a desired property is imparted to the introduced gene by introducing a double-stranded polynucleotide corresponding thereto and selecting a desired phenotype from the phenotype indicated by the introduced product. can do.
  • Desirable properties to be imparted to the recipient include, for example, intracellular production function, function to inhibit extracellular secretion, function to repair damage to cells and DNA, and function to resist specific diseases.
  • examples of the target gene include enzymes related to fruit ripening, plant structural proteins, and genes related to pathogenicity.
  • the target gene may be a gene encoding the protein, Examples include a gene encoding a protein having a function of controlling protein expression.
  • the target gene is a gene required for maintaining the oncogenic Z oncogenic phenotype, and the recipient is a cancerous cell or a tumor tissue.
  • a double-stranded polynucleotide against the target gene inhibits the expression of a protein encoded by the target gene, it can be used as a therapeutic or preventive agent for a disease associated with the target gene.
  • the polynucleotide can be used alone, but it should be used as a pharmaceutical composition by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier. Can also. At this time, the ratio of the active ingredient to the carrier can be varied between 1 and 90% by weight.
  • the drug can be administered in various forms.
  • Examples of the dosage form include oral administration of tablets, capsules, granules, powders, syrups, and the like, or injections, drops, ribosomes, Parenteral administration with suppositories and the like can be mentioned.
  • the dose can be appropriately selected depending on the condition, age, weight, and the like.
  • Introducers into which a double-stranded polynucleotide targeting such a gene has been introduced are selected according to the phenotype predicted to be associated with the inhibition of gene expression.
  • a specific genetic marker for example, a sequence encoding a fluorescent protein or the like is linked to the introduced double-stranded nucleotide
  • the expression inhibition degree of the fluorescent protein introduced together with the double-stranded polynucleotide into the recipient is It is also possible to make a selection based on Among them, for example, when a gene that functions to suppress cancer is the target gene, the characteristics of the cells to be selected include malignancy such as enhanced proliferation, decreased cell adhesion, and enhanced motor (metastasis) ability. Tumor traits and the like.
  • the trait of a cell to be selected includes a loss of a circadian rhythm specific to the cell.
  • the type of cells to be selected includes, for example, sensitivity to the mutagen.
  • the selected transductants can be established and obtained as a system by appropriate cloning techniques known per se. Specifically, when the transfectant is a cell, the transfectant should be established and obtained as a cell line by a standard dilution method, a method using a drug resistance marker, etc., which is a method for establishing a cell line in a normal cultured cell. Can be.
  • the transfectant obtained with the specific function obtained according to the present invention may be a cell line with an increased production or secretion efficiency of a useful substance, or a cell line that is highly sensitive to environmental factors that cause damage to cells or DNA. It shows traits associated with a disease and can be used as a model for disease treatment.
  • the target gene include a gene whose expression level is reduced or absent causes a disease.
  • a gene whose expression level is reduced or absent causes a disease.
  • XPA / XPDZXPF / XPG gene for xeroderma pigmentosum
  • DNA polymerase 7j gene for xeroderma pigmentosum
  • APC gene for colorectal cancer
  • BRCA1 / BRCA2 gene for breast cancer
  • INS / INSR gene for diabetes etc. No.
  • Human disease model cells By introducing a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA having substantially the same sequence as at least a part of the nucleotide sequence of these human genes into, for example, a human-derived culture cell, Human disease model cells can be obtained. Furthermore, by contacting a test substance with a cell, tissue, or individual to which this specific property has been imparted, and analyzing whether or not a symptom or a trait of a disease involving the gene appears to be altered, It is also possible to screen for a therapeutic agent for the above-mentioned diseases and a therapeutic or preventive agent.
  • a substance selected by such screening is used as an active ingredient of the above-mentioned drug
  • Such drugs can be administered in various forms, such as tablets, capsules, granules, powders, or syrups, orally, or injections, drops, ribosomes, etc. And parenteral administration with suppositories and the like. The dose can be appropriately selected depending on the condition, age, body weight, and the like.
  • the method described in the above (1) to (4) of the present invention employs at least one target gene in the recipient.
  • a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA having substantially the same sequence as the base sequence is introduced.
  • a DNA encoding the indicator protein is further added.
  • the primary screening of the transductant is performed using the signal amount emitted from the indicator protein as an index to analyze only the transductant in which the expression of the gene in the transfectant has been inhibited. And efficient analysis can be performed.
  • the transfectant is a cultured cell derived from a vertebrate and the indicator protein is a fluorescent protein.
  • An expression vector containing DNA encoding a fluorescent protein is introduced into cultured cells derived from a vertebrate and cultured, and cells having a specific intensity or higher of the fluorescence emitted from the indicator protein are selected.
  • a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA having a sequence substantially identical to at least a part of the nucleotide sequence of DNA encoding the indica protein is further introduced into the cells selected here and cultured. Then, the degree of inhibition of the indicator gene expression is analyzed based on the degree of attenuation of the amount of fluorescence emitted from the indicator protein.
  • the indicator protein needs to have a correlation between its protein mass and the amount of signal it emits.
  • a specific example of such a protein is luciferase protein.
  • the amount of protein encoded by the target gene can be calculated based on the expression level of the indicator protein.
  • Kits for performing the methods described in the above (1) to (5) include a double-stranded polynucleotide, a vector containing the DNA encoding the indicator protein, and at least a part of the indicator gene. Includes double-stranded polynucleotides consisting of DNA and RNA having substantially the same sequence as the base sequence, reagents such as enzymes and buffers, and reagents for introducing polynucleotides.
  • the kit of the present invention does not need to include all of these reagents and the like, and may be any combination of reagents and the like as long as the kit is used in the above-described method of the present invention.
  • Example 1 Inhibition of target gene expression by double-stranded DNA-RNA hybrid introduced into CHQ-KI cells
  • the firefly (Photimis pyralis) luciferase gene (R pyralis lc gene: accession number: U472926) was used as the target gene, and the pGL3-Ccmtrol vector (manufactured by Promega) was used as an expression vector containing this.
  • the P. pyralis luc gene fragment is sandwiched between the SV40 promoter and polyA signal in this vector.
  • the indicator gene used was the luc: iferase gene of Renilla reniformis, and pRL-TK was used as an expression vector containing this gene.
  • the sense strand consisting of 21 nucleotides used in the preparation of the double-stranded polynucleotide used in this example is represented by SEQ ID NO: 1 (DNA) or SEQ ID NO: 2 (RNA).
  • the antisense strand is represented by SEQ ID NO: 3 (DNA) or SEQ ID NO: 4 (RNA).
  • chimeric single-stranded polynucleotides of DNA or RNA were prepared as shown in FIG. The synthesis of these polynucleotides was outsourced to Genset Corporation through Hitachi Instrument Service Co., Ltd.
  • sequence of the sense strand polynucleotide corresponds to the 38th to 58th nucleotide of the Rpyralis luc gene (1,653 base pairs in total length) in the pGL3-Control vector, which is the target gene.
  • the double-stranded RNA, double-stranded DNA, and double-stranded DNA-RNA hybrids used to inhibit the expression of the P. pyralis luc gene were prepared using the sense strand FLsl (RNA) or DFLsl (DNA ) And the antisense strand FLa2 (RNA) or DFLa2 (DNA).
  • the association is performed by heating the sense single-stranded polynucleotide and the antisense single-stranded polynucleotide in a 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM NaCl reaction solution at 90 ° C for 2 minutes, and further at 37 ° C. This was carried out by incubating for 1 hour and then allowing the mixture to reach room temperature.
  • Double-stranded polynucleotide formation is assayed by electrophoresis on a 2% agarose gel in TBE buffer, under which conditions almost all of the single-stranded polynucleotide is associated with the double-stranded polynucleotide.
  • CHO-KI cells (RIKEN Cell bank) were used as the culture cells, and the medium was deprived of Dulbecco's modified Eagle's medium (manufactured by Gibco BRL). 10% fetal bovine blood (manufactured by Mitsubishi Kasei) and antibiotics penicillin (Meiji Co.) 1 0 units / ml, using a material obtained by adding streptomycin (Meiji Co.) 5 0 ⁇ g / ml, and cultured at 3 7 ° C, 5% C0 2 presence.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium manufactured by Gibco BRL
  • 10% fetal bovine blood manufactured by Mitsubishi Kasei
  • antibiotics penicillin Meiji Co.
  • the CHO-KI cells were plated at a concentration of 0.3 ⁇ 10 6 cells / ml in a 24-well plate, and one day later, the Ca-phosphate precipitation method (Cell Engineering Handbook, edited by Toshio Kuroki et al., Yodosha (1) 9 9 2)) with 1.0 ⁇ g pGL3-Control DNA, 0.5 ⁇ g pEL-TK DNA, and two each of 0.01, 0.1, 1, 10 and 10OnM A strand polynucleotide was introduced.
  • the Ca-phosphate precipitation method Cell Engineering Handbook, edited by Toshio Kuroki et al., Yodosha (1) 9 9 2
  • Example 1 (2) The cells prepared in Example 1 (2) above were collected after 20 hours, and two types of luciferase were analyzed using a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega).
  • the expression of the gene introduced into CHO-KI cells was inhibited by DNA-RNA and hybrid double-stranded polynucleotides (Fig. 2). All values indicate the inactivity of the target gene product with respect to the expression level of the indicator gene (luciferase enzyme activity). These data show the average of three experiments, and the vertical bar in the figure shows the standard deviation. Compared with the control group into which the double-stranded polynucleotide was not introduced, in the case of the group into which the double-stranded RNA had been introduced, 96%, 80% inhibition of target gene expression was observed in the double-stranded polynucleotide transfection group in which the DNA strand was DNA and the antisense strand was RNA.
  • the target gene used was the same as in Example 1; the luciferase gene of Photinus pyralis (P. pyralis luc 17s.-: accession number: U472976) was used.
  • the gene for luciferase of Renilla reniformis was used as the in- indicator gene. Further, the expression vector described in Example 1 was also used.
  • the sense strand consisting of 21 nucleotides used in the preparation of the double-stranded polynucleotide used in this example is represented by SEQ ID NO: 1 (DNA) or SEQ ID NO: 2 (RNA).
  • the antisense strand is represented by SEQ ID NO: 3 (DNA) or SEQ ID NO: 4 (RNA).
  • chimeric single-stranded polynucleotides of DNA or RNA were prepared as shown in FIG. These polynucleotides were outsourced to Genset Inc. through Hitachi Instrument Service Co., Ltd.
  • the DNA-RNA chimeric double-stranded polynucleotide used to inhibit the expression of the P. pyralis luc gene is composed of the sense strand FLsl (single-stranded RNA) and the antisense strands FLa2-l and Fla2-2 shown in Figure 1. , Fla2.3, Fla2-4, Fla2-5, Fla2-6, Fla2-7, Fla2-8, FLa2-9, Fla2-10 (DNA-RNA chimeric single-stranded polynucleotide) This was made.
  • a sense single-stranded RNA and an antisense DNA-RNA chimeric single-stranded polynucleotide were reacted in the same manner as in Example 1. Double-stranded polynucleotide production was assayed by electrophoresis on a 2% agarose gel in TBE buffer.
  • the culture cells used were Sjojopapa S2 cells (Schneider, I., et al., J. Embryol. Exp. Morph., 27, 353-365 (1972)), and the medium was Schneider's Drosophila medium (Gibco 10% fetal bovine serum (Mitsubishi Kasei) and penicillin (Meiji) as an antibiotic 10 units / ml, streptomycin (Meiji) 50 / ig / The cells were added to the cells and cultured at 25 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the S2 cells were plated at a concentration of 1.0 ⁇ 10 6 cells / ml on a 24-well plate, and one day later, Ca-phosphate precipitation method (Cell Engineering Handbook, edited by Toshio Kuroki et al., Yodosha U
  • Example 2 (2) The cells prepared in the above Example 2 (2) were collected after 20 hours, and the expression levels of two types of noresiferase proteins were measured using a Dual-Luciferase Reporter Assay System (manufactured by Promega). The fluorescence was measured using a Lumat LB 9507 luminometer (EG & G Berthold).
  • the expression of the gene introduced into S2 cells was determined by immobilizing the sense side of the double strand on RNA and using the antisense side as a chimeric polynucleotide of DNA and RNA. Inhibited by double-stranded polynucleotide ( Figure 3). All values were determined as the specific activity of the target gene product with respect to the expression level of the indicator gene (luciferase activity), and were shown as the average of three experiments and the standard deviation. Among the double-stranded polynucleotides, those with the antisense side of FLa2, FLa2-2, FLa2-3, FLa2-8, and FLa2-9 were 9 times smaller than the control group into which the double-stranded polynucleotide was not introduced.
  • RNAi effect was also confirmed by introducing a double-stranded polynucleotide in which the portion containing this region on the antisense sequence was preserved as RNA and the other portion was replaced with DNA.
  • a region necessary and sufficient for the expression of the RNAi effect is identified or predicted, the portion containing this region is stored as RNA, and the other portion is stored as DNA.
  • a double-stranded polynucleotide composed of 21 nucleotides, each of which was prepared by substituting the above can inhibit the expression of the target gene by the RNAi effect.
  • Example 3 Inhibition of gene expression by DNA-RNA quinula-type double-stranded polynucleotide introduced into human HeLa cells and human HEK293 cells
  • the Rpyralisic gene was used as the target gene as in Example 1, and the pGL3-Control vector (manufactured by Promega) was used as the expression vector containing it.
  • the indicator gene was the luc gene of Renilla reniformis, and pRL-TK (Promega) was used as an expression vector containing the luc gene.
  • the sense strand consisting of 21 nucleotides used in the preparation of the double-stranded polynucleotide used in this example is represented by SEQ ID NO: 1 (DNA) or SEQ ID NO: 2 (RNA).
  • the antisense strand is represented by SEQ ID NO: 3 (DNA) or SEQ ID NO: 4 (RNA).
  • chimeric single-stranded polynucleotides of DNA or RNA were prepared as shown in FIG. The synthesis of these polynucleotides was outsourced to Genset Corporation through Hitachi Instrument Service Co., Ltd.
  • the nucleotide sequence of the sense strand polynucleotide is the 38th-58th nucleotide of the P. pyralis luc gene (1,653 base pairs in total length) in the target gene, pGL3-Control vector. Equivalent to tide. -
  • the DNA-RNA chimeric double-stranded polynucleotide used to inhibit the expression of the P. pyralis luc gene was composed of the sense strands FLsl-l and FLsl-2 (DNA-RNA chimeric single-stranded polynucleotides shown in Figure 1). Nucleotides) and the antisense strand FIa2 (single-stranded RNA).
  • a sense DNA-RNA chimeric single-stranded polynucleotide and an antisense single-stranded RNA were reacted in the same manner as in Example 1. Double-stranded polynucleotide production was assayed by electrophoresis on a 2% agarose gel in TBE buffer.
  • the recombinant expression vector for expressing the target gene used was pGL3-Control described in (1) above, and the expression vector for the indicator gene was pRL-TK described in (1) above.
  • Human HeLa cells (ATCC: CCL-2) and human HEK293 cells (ATCC: CRL-1573) were used as culture cells, and the culture medium was non-desorbed to Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco BRL). 10% fetal calf blood
  • HeLa cells and HEK293 cells were plated at a concentration of 0.5 ⁇ 10 6 cells / ml and 0.25 ⁇ 10 6 cells / ml, respectively, on a 24-well plate. 0 ⁇ g pGL3-Control DNA, 1.0 ug pRL-TK DNA, and 100 nM of each DNA-RNA chimeric double-stranded polynucleotide were introduced.
  • Example 1 the cells prepared in Example 3 (2) above were collected after 20 hours, and the expression levels of the two types of noresiferase proteins were measured using the Dual-Luciferase Reporter Assay System. did. The fluorescence was measured using a Lumat LB 9507 luminometer. The expression of the genes introduced into HeLa cells and HEK293 cells was determined by immobilizing the antisense side of the double-stranded DNA to RNA, and using the sense side as a chimeric polynucleotide of DNA and RNA. (Fig. 4). All values were determined as the specific activity of the target gene product relative to the expression level of the indicator gene (luciferase enzyme activity), and expressed as the average value of three experiments and the standard deviation.
  • FLsl-2 12 nucleotides at the 5 ′ side in the sequence are RNA, and nucleotides in other regions are DNA. Therefore, in this example using HeLa cells and HEK293 cells, when the antisense strand is RNA, the whole or a part of the 12 nucleotides on the sense side is necessary and sufficient for the expression of a strong RNAi effect. Area.
  • Example 4 Inhibition of gene expression by DNA-RNA chimeric double-stranded polynucleotide introduced into human CHO-K1
  • the Rpyralis luc gene was used as the target gene as in Example 1, and the pGL3-C (mtrol vector (Promega)) was used as the expression vector containing this gene, and the indicator gene was Renilla reniformis PRL-TK (Promega) was used as an expression vector containing the luc gene.
  • the sequence of the 21-nucleotide sense strand polynucleotide used for the production of the double-stranded polynucleotide used in this example was the P. pyralis luc gene (full length 1) in the pGL3-Control vector, which is the target gene. , 65 3 base pairs) of 8—2 8th (8—28), 38—58 8th (38—58), 1807—1107 (1107) 1 107).
  • each base sequence 8 to 28 sense strands are shown in SEQ ID NOS: 5 (DNA) and 6 (RNA), and antisense strands are shown in SEQ ID NOs: 7 (DNA) and 8 (RNA).
  • 5 8 sense strand is SEQ ID NO: 1 (DNA), 2 (RNA), antisense strand is SEQ ID NO: These are shown in 3 (DNA) and 4 (RNA).
  • the nucleotide sequence of the sense strand of 1087-117 is SEQ ID NO: 9 (DNA) and 10 (RNA)
  • the antisense strand is SEQ ID NO: 11 (DNA) and 12 (RNA). .
  • RNAs for both sense and antisense C.
  • D DNA
  • antisense RNA
  • RNA about half (10 to 13 nucleotides) upstream of the sense strand is RNA (E)
  • sense strand is UNA (F)
  • F is about half (10 to 13 nucleotides) of force S DNA upstream of the antisense strand was prepared.
  • a sense and antisense DNA-RNA chimeric single-stranded polynucleotide was reacted in the same manner as in Example 1. Double-stranded polynucleotide production was assayed by electrophoresis on a 2% agarose gel in TBE buffer.
  • the pGL3-Control described in (1) above was used as a recombinant expression vector for expressing the target gene, and the pRL-TK described in (1) was used as an expression vector for the indicator gene.
  • Human CHO-K1 cells (ATCC: CCL-61) were used as culture cells, and the medium was Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco BRL), non-deprived 10% fetal bovine serum (Mitsubishi Kasei) and antibiotics. substances as penicillin (manufactured by Meiji Co.) 10 units / mL strentomvcin. ( Meiji Co.) using a material obtained by adding 50 ⁇ g / nil, and cultured in C0 2 the presence 37 ° C, 5%.
  • CHO-K1 cells were plated at a concentration of 0.3 ⁇ 10 6 cells / ml in 24-well plates, and one day later, 1.0 ⁇ g of pRL-TK DNA, 1 OnM or 1.0 ⁇ g by Ca-phosphate precipitation.
  • Example 3 Measurement of gene expression in cultured cells As in Example 1, the cells prepared in Example 4 (2) above were collected after 20 hours, and the expression levels of the two types of noreciferase proteins were measured using the Dual-Luciferase Reporter Assay System. did. The fluorescence was measured using a Lumat LB 9507 luminometer.
  • FIG. 5 shows the structure of the double-stranded polynucleotide and the luciferase activity of the cells into which the polynucleotide was introduced relative to the luciferase activity of the control (cells into which the double-stranded polynucleotide had not been introduced).
  • open squares indicate RNA strands
  • black squares indicate DNA strands.
  • the expression of the gene introduced into the CHO-K1 cells in each of the polynucleotides consisting of any of the base sequences was from at least 21 nucleotides each with at least about half of the upstream RNA as the RNA. (Fig. 5 (A), (C) and (E);).
  • RNAi effect a region required and sufficient for the expression of the RNAi effect is identified or predicted, a portion containing this region is stored as RNA, and the other portion is stored in DNA. It is presumed that the double-stranded polynucleotides composed of 21 nucleotides, each produced by substitution, can inhibit the expression of the target gene by the RNAi effect.
  • RNAi effect is weak, cells expressing particularly high RNAi effect can be used for primary screening. This allows efficient analysis to be performed.
  • RNAi double-stranded RNA
  • RNase RNase-activated nucleic acid
  • the production cost is high. Is expensive.
  • the introduced polynucleotide is completely RNA. Therefore, the stability as a substance of a polynucleotide introduced by using a polynucleotide consisting of DNA and RNA, specifically, a hybrid polynucleotide consisting of a DNA strand and an RNA strand, or a DNA-RNA chimeric polynucleotide. And production costs can be reduced.
  • the introduced polynucleotide itself can be developed as a preparation for treating a disease.
  • DNA can be more easily modified in a variety of ways, such as fluorescent labeling, biotin labeling, amination, phosphorylation, and thiolation. Therefore, when used as a pharmaceutical or a reagent, a function according to the purpose can be added by performing such chemical modification.

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Description

明 細 書 遺伝子発現阻害方法 技術分野
本発明は、 標的遺伝子の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有 する DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチドを、 細胞、 組織、 あるいは個 体に導入することによる標的遺伝子の発現阻害方法に関する。 背景技術
細胞、 組織、 あるいは個体内の標的遺伝子の発現阻害方法のひとつと して 2本 鎖 RNA を該細胞、 組織、 あるいは個体内に導入することによりその配列に相同 性を持つ mRNAの分解を促進し、 結果的に mRNAの鍚型となる遺伝子の発現を 阻害する （以下この効果を 「RNAi 効果」 と称することがある） 方法 （以下これ を「RNAi法」と称することがある）がある。この手法はこれまで植物（ Waterhouse, P. M., et al„ Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 13959- 13964 (1998))、 トリ/くノ ソ 一マ (Ngo, H. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 14687- 14692(1998))、 ヒ ドラ (Lohmann, J. U., et al.， Dev. Biol. ,214, 211-214(1999))、 プラナリア
(Sanchez Alvarado, et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA., 96, 5049-5054 (1999))、 線虫 （Fire, A., et al., Nature, 391, 806.811 (1998) )、 ショ ウジョ ウノ ェ
(Kannerdell, J. R., et al., Cell, 95, 1017- 1026 (1998)； Misquitta, L., et al,, Proc.Natl. Acad. Sci. USA., 96, 1451-1456(1999)) の個体で効果的であることが 報告されている。
また、 脊椎動物においてその効果は限定的であるとされていたが、 3 ' 末端に 2ベース突出したそれぞれ 1 9ヌクレオチドからなる 2本鎖 RNA を用いれば、 脊椎動物の培養細胞において、 RNAi 効果が見られることが報告されている (Elbashir, S ., et al., Nature, 411, 494-498(2001))。 後述する遺伝子機能の同定 や、 有用物質生産に適した細胞株等のスク リーニング方法において、 RNAi 法を 用いる優位性は明らかであるが、 RNAは特に 1本鎖の状態では RNA分解酵素に よって極めて容易に分解され、 かつ製造費用が高額であるという問題点がある。 従って、 RNAi 法に用い得る安定性の高いポリヌクレオチドの開発が望まれてい た。 発明の開示
本発明は、 DNAを含むことにより安定性の高まった 2本鎖ポリヌクレオチドを 細胞、 組織、 あるいは個体に導入することにより、 該ポリヌクレオチドが有する 塩基配列と実質的に一部が同一の配列を有する標的遣伝子の発現を阻害する方法 を提供すること等を課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意努力を重ねた結果、 ハムスター 培養細胞である CHO-KIにおいて、ルシフェラ一ゼ遺伝子の一部の塩基配列を有 する DNAと RNAのハイブリッ ドである 2本鎖ポリヌクレオチド、 および DNA と RNAのキメラである 2本鎖ポリヌクレオチドを導入したところ、 該細胞内に おいてルシフェラーゼ遺伝子の発現が阻害されることを見いだし、 本発明を完成 させるに至った。
即ち、 本発明によれば、 下記 （1) 〜 （24) に記載の発明が提供される。
( 1 ) 標的遺伝子の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチ ドを、 細胞、 組織、 あるいは個体に 導入することを特徴とする標的遺伝子の発現阻害方法。
(2) 2本鎖ポリヌクレオチドが、 自己相補性を有する 1本鎖からなることを特 徴とする上記 （1) に記載の方法。
(3) 2本鎖ポリヌクレオチドが、 DNA鎖と RNA鎖のハイプリ ッ ドであること を特徴とする上記 （1) または （2) に記載の方法。
(4) DNA鎖と RNA鎮のハイブリ ッ ドが、 センス鎖が DNAで、 アンチセンス 鎖が RNAであることを特徴とする上記 （3) に記載の方法。
( 5 ) 2本鎖ポリヌクレオチドが、 DNAと RNAのキメラであることを特徴とす る上記 （1) または （2) に記載の方法。
( 6 ) 2本鎖ポリヌクレオチドが、 該ポリヌクレオチドのうち、 少なく とも上流 側の一部が RNAであることを特徴とする上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載 の方法。
( 7 )上流側の一部が、 9〜1 3ヌクレオチドからなることを特徴とする上記（ 6 ) に記載の方法。
(8 ) 2本鎖ポリヌクレオチドが、 1 9〜 2 5ヌクレオチドからなり、 該ポリヌ クレオチドのうち、 少なく とも上流 1 Z 2力 S RNAであることを特徴とする上記
( 1 ) 〜 （6) のいずれかに記載の方法。
( 9) 標的遺伝子が、 複数であることを特徴とする上記 （ 1 ) 〜 （8) のいずれ かに記載の方法。
( 1 0) 上記 （ 1 ) 〜 （9) のいずれかに記載の方法による標的遺伝子の発現阻 害の結果、 該細胞、 組織、 あるいは個体に現れる表現型の変化を解析することを 特徴とする遺伝子の機能解析方法。
( 1 1 ) 上記 （ 1 ) 〜 （9) のいずれかに記載の方法を用いた標的遺伝子の発現 の阻害により、 細胞、 組織、 あるいは個体に特定の性質を付与する方法。
( 1 2) 上記 （ 1 1 ) に記載の方法により得られる細胞、 組織、 あるいは個体。
( 1 3) 上記 （ 1 2) に記載の細胞、 組織、 あるいは個体に被検物質を添加し、 該細胞、 組織、 あるいは個体に付与された性質の変化を解析することを特徴とす る、 檫的遺伝子が関与する疾病の予防、 及びノまたは治療剤のスク リーニング方 法。
( 1 4) 上記 （ 1 3) に記載の方法により得られた物質を有効成分とする標的遺 伝子が関与する疾患の予防、 及び Zまたは治療剤。
( 1 5) 上記 （ 1 3) に記載の方法により選抜された物質を製剤化することを特 徴とする標的遗伝子が関与する疾患の予防、 及び/または治療剤の製造方法。
( 1 6) 上記 （ 1) 〜 （9 ) のいずれかに記載の方法において、 細胞、 組織、 あ るいは個体にさらにインディケ一タータンパク質をコードする DNAを含む発現 ベクターを導入して、 該ィンディケ一タータンパク質から発せられる信号量が、 特定の強さ以上のものを選択して解析することを特徴とする方法。
( 1 7) 上記 （ 1 ) 〜 （9) のいずれかに記載の方法において、 細胞、 組織、 あ るいは個体にさらにィンディケ一タータンパク質をコードする DNAを含む発現 ベクタ一、 及ぴ該 DNAの少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列から なり、 かつ DNAを含む 2本鎖 RNAを細胞に導入して、 該ィンディケータータン パク質から発せられる信号量が減弱した細胞、 組織、 あるいは個体を選択して解 析することを特徴とする方法。
(18) インディケ一タ一タンパク質が、 タンパク質量とそれが発する信号量と が比例して変化していくものである上記 （1 6) または （1 7) に記載の方法。
(1 9) インディケータータンパク質が、 ルシフェラーゼである上記 （ 1 6 ) 〜 (1 8) のいずれかに記載の方法。
(20) (i) 標的遺伝子の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有 する 2本鎖ポリヌク レオチドであって DNAと RNAのキメラからなるものを作製 し、 （ii) 該 2本鎖ポリヌクレオチドを細胞、 組織、 あるいは個体に導入し、 （iii) 該細胞、 組織、 あるいは個体中の標的遺伝子の発現阻害度を測定し、 （iv) 標的遺 伝子の発現阻害に RNAであることが必要とされる配列を特定することを特徴と する RNAi法における RNAの機能部位の同定方法。
(2 1) 2本鎖ポリヌクレオチドが、 その 2本鎮のどちらか一方が RNA鎖であ ることを特徴とする上記 （20) に記載の方法。
(22) 上記 （ 1) 〜 （1 1)、 （1 3)、 (1 5) 〜 （21) のいずれかに記載の 方法に用いるための 2本鎖ポリヌクレオチド。
(23) 少なく とも上記 （22) に記載の 2本鎖ポリヌクレオチドを含む標的遺 伝子が関与する疾患の予防、 及び/または治療剤。
( 24)少なく とも上記（22)に記載の 2本鎖ポリヌクレオチドを含む上記（ 1 ) 〜 （1 1)、 （1 3)、 (15) 〜 （2 1 ) のいずれかに記載の方法を行うためのキ ッ 卜。 図面の簡単な説明
図 1は、 2本鎖ポリヌクレオチドの作製に使われた 21ヌクレオチドからなる センス 1本鎖ポリヌクレオチドならびに 2 1ヌクレオチドからなるアンチセンス 1本鎖ポリヌクレオチドの配列を示す図である。 いずれも左が 5 ' 末端、 右が 3 ' 末端を意味し、 太字が RNA、 下線が DNAからなることを示す。
図 2は、 CHOKI細胞に、 DNA-RNAハイブリツ ドの 2本鎖ポリヌクレオチド を導入した場合の luc遺伝子発現の阻害を示す図である。
図 3は、 S 2細胞に、 センス鎖が： NAで、 アンチセンス鎖が DNA-RNAキメ ラである 2本鎖ポリヌクレオチドを導入した場合の luc遺伝子発現の阻害を示す 図である。
図 4は、 HeLa細胞、 及ぴ HEK293細胞に、 アンチセンス鎖が RNAで、 セン ス鎖が DNA-RNAキメラである 2本鎖ポリヌクレオチドを導入した場合の luc遺 伝子発現の阻害を示す図である。
図 5は、 CHO— K1 細胞に、 DNA-RNA キメラである 2本鎮ポリヌクレオチド を導入した場合の luc遺伝子発現の阻害を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明についてさらに詳細に説明する。
( 1 ) RNAi法に用いるための DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチド 本発明は、 標的遺伝子の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有 する DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチドを、 細胞、 組織、 あるいは個 体に導入することを特徴とする標的遺伝子の発現阻害方法である。
本発明において、 標的遺伝子とは、 これを導入する細胞、 組織、 あるいは個体
(以下これを 「被導入体」 と称することがある） に : mRNA、 及ぴ任意にタンパク 質を産出するように翻訳され得るものであれば如何なるものであってもよい。 具 体的には、 導入する対象物の内在性のものでも、 また外来性のものでもよい。 ま た、 染色体上に存在する遺伝子でも、 染色体外のものでもよい。 外来性のものと しては、 例えば、 被導入体に感染可能なウィルス、 パクテリア、 真菌または原生 動物のような病原体由来のもの等が挙げられる。 その機能については、 既知のも のでも、 未知のものでもよく、 また、 他生物の細胞内では機能が既知であるが、 被導入体内では機能が未知のもの等でもよい。
これらの遺伝子の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を有する DNAと ： RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチド （以下、 これを 「2本鎖ポリヌク レオチド j と称することがある） とは、 標的遺伝子の塩基配列のうち、 いずれの 部分でもよい 2 0ヌクレオチド以上の配列と実質的に同一な配列からなるもので ある。 ここで、 実質的に同一とは、 標的遺伝子の配列と 5 0 %以上、 好ましくは 7 0 %以上、 さらに好ましくは 8 0 %以上の相同性を有することを意味する。 ヌ クレオチドの鎖長は 1 9ヌクレオチドから標的遺伝子のオープンリ一ディングフ レーム （ORF) の全長までの如何なる長さでもよいが、 1 9〜5 0 0ヌクレオチ ドの鎖長を有するものが好ましく用いられる。 ただし、 哺乳類動物由来の細胞に おいては、 3 0ヌクレオチド以上の鎖長を有する 2本鎖 RNA に反応して活性化 するシグナル伝達系の存在が知られている。 これはインターフエ口ン反応と呼ば れており （Mareus, P. I., et al.， Interferon, 5, 115.180(1983))、 該 2本鎖 RNA が細胞内に侵入すると、 PKR ( dsRNA-responsive protein kinase： Bass, B.L., Nature, 411, 428-429(2001)) を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻 害され、 それと同時に 2 '、 5 ' oligoadenylate synthetase (B ass, B.IJ., ! ature, 411, 428-429(2001)) を介して RNaseLの活性化が起こり、 細胞内の RNAの非 特異的な分解が惹起される。 これらの非特異的な反応のために、 標的遺伝子の特 異的反応が隠蔽されてしまう。 従って哺乳類動物、 または該動物由来の細胞、 あ るいは組織を被導入体として用いる場合には 1 9〜2 5、好ましくは 1 9〜2 3、 さらに好ましくは 1 9〜 2 1ヌクレオチドからなる 2本鎖ポリヌクレオチドが用 いられる。 本発明の 2本鎖ポリヌクレオチドは、 その全体が 2本鎖である必要は なく、 5 '、 または 3 ' 末端が一部突出したものも含み、 その突出末端は 1〜5ヌ クレオチド、 好ましくは 1〜 3ヌクレオチド、 さらに好ましくは 2ヌクレオチド である。 また、 最も好ましい例としては、 各ポリヌクレオチド鎖の 3 ' 末端が 2 ヌクレオチドずつ突出している構造を有するものが挙げられる。 2本鎖ポリヌク レオチドは、 相補性を有する部分が 2本鎖となっているポリヌクレオチドを意味 するが、 自己相補正を有する 1本鎖ポリヌクレオチドが自己ァニーリングしたも のでもよい。 自己相補正を有する 1本鎖ポリヌクレオチドとしては、 例えば、 逆 方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
さらに、 DNAと RNAの混合については、 DNA鎖と RNA鎖のハイブリ ッ ド型 や、 DNAと RNAのキメラ型等が用いられる。 DNA鎖と RNA鎖のハイプリ ッ ド は、 それを被導入体に導入した際に、 標的遺伝子の発現が阻害される活性を有す るものである限り如何なるものであってもよいが、好ましくは、 センス鎖が DNA であり、 アンチセンス鎖が RNAであるものが用いられる。 また、 DNA と RNA のキメラ型では、 それを被導入体に導入した際に、 標的遺伝子の発現が阻害され る活性を有するものである限り如何なるものであってもよい。 2本鎖ポリヌクレ ォチドの安定性を高めるためには DNAをできるだけ多く含むことが好ましいが、 本発明のキメラ型 2本鎖ポリヌクレオチドのうち、 RNAであることが標的遺伝子 の発現阻害に必要な配列については、 後述する標的遺伝子の発現阻害度の解析を 行いながら発現阻害の起こる範囲で適宜決定していく ことが望ましい。 これによ り、 RNAi法における UNAの機能部位を同定することもできる。 かく して決定さ れたキメラ型の好ましい例としては、 例えば、 2本鎖ポリヌクレオチドの上流側 の一部が ： NAであるものが挙げられる。 ここで、 上流側とは、 センス鎖の 5 ' 側おょぴアンチセンス鎖の 3 ' 側を意味する。 上流側の一部とは、 上記 2本鎖ポ リヌクレオチドの上流の末端から 9〜 1 3ヌクレオチドの部分が好ましく挙げら れる。 また、 このようなキメラ型 2本鎖ポリヌクレオチドとして好ましい例とし ては、ポリヌクレオチドの鎖長がそれぞれ 1 9〜 2 1ポリヌクレオチドからなり、 該ポリヌクレオチドのうち、少なく とも上流側 1 / 2が RNAで、それ以外が DNA である 2本鎖ポリヌクレオチドが挙げられる。 また、 このような 2本鎖ポリヌク レオチドにおいて、 アンチセンス鎖が全て RNA であると、 標的伝子の発現阻害 効果はさらに高い。
2本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては、 特に制限はないが、 それ自体既 知の化学合成方法を用いることが好ましい。 化学合成は、 相補性を有する 1本鎖 ポリヌクレオチドを別個に合成し、 これを適当な方法で会合させることにより 2 本鎖とすることができる。 会合の方法として具体的には、 例えば、 合成した 1本 鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なく とも約 3 ： 7のモル比で、 より好ましく は約 4 ： 6のモル比で、 そして最も好ましくは本質的に同モル量（すなわち約 5 ： 5のモル比） で混合し、 2本鎖が解離する温度にまで加熱し、 その後徐々に冷却 する方法等が挙げられる。 会合した 2本鎖ポリヌク レオチドは、 必要に応じてそ れ自体公知の通常用いられる方法により精製される。 精製方法としては、 例えば ァガロースゲル等を用いて確認し、 任意に残存する 1本鎖ポリヌクレオチドを適 当な酵素により分解する等して除去する方法を用いることができる。 また、 自己相補正を有する 1本鎖ポリヌクレオチドとして、 逆方向反復配列 を有するものを調製する場合には、 該ポリヌクレオチドを化学合成等の方法で作 製した後に上記と同様の方法で自己相補性を有する配列を会合させることにより 調製する。
( 2 ) 2本鎮ポリヌクレオチドの細胞、 組織、 あるいは個体への導入、 及ぴ標的 遺伝子の発現阻害
このようにして調製した 2本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、 標的遺伝子がその細胞内で RNA に転写、 またはタンパク質に翻訳され得るもの であれば如何なるものであってもよい。具体的には、本発明で用いる被導入体は、 細胞、 組織、 あるいは個体を意味する。
本発明に用いられる細胞としては、 生殖系列細胞、 体性細胞、 分化全能細胞、 多分化能細胞、 分割細胞、 非分割細胞、 実質組織細胞、 上皮細胞、 不滅化細胞、 または形質転換細胞等何れのものであってもよい。 具体的には、 例えば、 幹細胞 のような未分化細胞、 器官または組織由来の細胞あるいはその分化細胞等が挙げ られる。 組織としては、 単一細胞胚または構成性細胞、 または多重細胞胚、 胎児 組織等を含む。 また、 上記分化細胞としては、 例えば、 脂肪細胞、 繊維芽細胞、 筋細胞、 心筋細胞、 内皮細胞、 神経細胞、 ダリァ、 血液細胞、 巨核球、 リンパ球、 マクロファージ、 好中球、 好酸球、 好塩基球、 マス ト細胞、 白血球、 顆粒球、 ケ ラチン生成細胞、 軟骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 肝細胞および内分泌線または 外分泌腺の細胞等が挙げられる。 このよ うな細胞の具体例としては、 CHO-KI細 胞（RIKEN Cell bank) , ショ ウジョ ゥバエ S 2細胞 （Schneider, I., et al.， J. Embryol. Exp. Morph., 27, 353.365(1972))、 ヒ ト HeLa細胞 (ATCC： CCL- 2 )、 あるいはヒ ト HEK293細胞 （ATCC： CRL- 1 5 7 3 ) 等が好ましく用いられる。 さらに、 本発明で被導入体となる個体として、 具体的には、 植物、 動物、 原生 動物、 ウィルス、 パクテリア、 または真菌種に属するもの等が挙げられる。 植物 は単子葉植物、 双子葉植物または裸子植物であってよく、 動物は、 脊椎動物また は無脊椎動物であってよい。本発明の被導入体として好ましい微生物は、農業で、 または工業によって使用されるものであり、 そして植物または動物に対して病原 性のものである。 真菌には、 力ビ及ぴ酵母形態両方での生物体が含まれる。 脊椎 動物の例には、 魚類、 ゥシ、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 ハムスター、 マウス、 ラッ ト、 サル及ぴヒ トを含む哺乳動物が含まれ、 無脊椎動物には、 線虫類及ぴ他の虫類、 キイ口ショウジヨ ウバエ （Drosophila)、 および他の昆虫が含まれる。
被導入体への 2本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、 被導入体が細胞、 あ るいは組織の場合は、カルシウムフォスフエ一ト法、エレク トロポレーシヨン法、 リポフエクシヨン法、 ウィルス感染、 2本鎮ポリヌクレオチド溶液への浸漬、 あ るいは形質転換法等が用いられる。 また、 胚に導入する方法としては、 マイクロ インジェクショ ン、 エレク ト口ポレーシヨン法、 あるいはウイスル感染等が挙げ られる。 被導入体が植物の場合には、 植物体の体腔または間質細胞等への注入ま たは灌流、 あるいは噴霧による方法が用いられる。 また、 動物個体の場合には、 経口、 局所、 （皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、 経眼、 腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、 あるいはエレク ト口ポレー シヨン法やウィルス感染等が用いられる。 経口導入のための方法には、 2本鎖ポ リヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。 さらに、 個体に導入 する場合には、 例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、 2本鎮ポ リヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。 導入する 2本鎖ポリヌクレオチドの量は、 導入体や、 標的遺伝子によって適宜 選択することができるが、 細胞あたり少なく とも 1 コピー導入されるに充分量を 導入することが好ましい。 具体的には、 例えば、 被導入体がヒ ト培養細胞で、 力 ルシゥムフォスフエ ト法によ り 2本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、 0 · 1〜： L 0 0 0 nMが好ましい。
ここで、 2本鎖ポリヌクレオチドは、 2種類以上のものを同時に導入すること もできる。 この場合、 該ポリヌクレオチドの導入を受けた細胞、 組織、 あるいは 個体 （以下これを 「導入体」 と称することがある） においては、 2種類以上の標 的遺伝子の発現阻害が期待される。
本発明において、 標的遺伝子の発現阻害とは、 その発現を完全に阻害すること だけでなく、 ：m-RNA、 もしくはタンパク質の発現量として 2 0 %以上の阻害を意 味する。 標的遺伝子の発現阻害度は、 標的遺伝子の RNA の蓄積、 または標的遺 伝子によってコードされるタンパク質の産出量を、 2本鎖ポリヌクレオチドの導 入体と非導入体において比較することにより測定することができる。 mRNA量は、 それ自体既知の通常用いられる方法により測定することができる。 具体的には、 例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨン、 定量的リバース トランスフエレース PGR, あるいは In situ hybridization等を用いて行うことができる。 また、 タン パク質の産生量は、 標的遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体による ウェスタンプロッティング法や、 標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵 素活性を測定すること等により測定することができる。
( 3 ) 導入体内の遺伝子の発現阻害による遺伝子機能解析方法
本発明の 2本鎖ポリヌクレオチドによる導入体内の造伝子の発現阻害の結果、 該導入体に現れる表現型の変化を解析することにより導入した 2本鎖ポリヌクレ ォチドが標的とする遺伝子の機能を同定することができる。
ここで、 標的遺伝子はその機能が既知であっても、 被導入体内での機能が未知 のものであってもよい。 該標的遺伝子に対応する 2本鎖ポリヌクレオチドは上記
( 1 ) に記載のとおり調製され、 （2 ) に記載の被導入体に同様にして導入する。 導入体でその変化を解析すべき表現型は特に制限はされないが、 例えば導入体の 形態、 導入体内物質量、 導入体が分泌する物質量、 導入体内物質の動態、 導入体 間接着、 導入体の運動、 あるいは導入体の寿命等の生命体行動が挙げられる。 標 的遺伝子の機能が、 他の被導入体において既知の場合には、 その機能に連関する 表現型について解析することが好ましい。表現型の変化を解析する手段としては、 導入体の形態の変化を解析する場合には、 顕微鏡、 あるいは肉眼的に検出する方 法を用いることができる。 また、 導入体内の物質として、 例えば mRNA の場合 には、 その量の解析方法として、 ノーザンハイブリダィゼーシヨン、 定量的リパ ース トランスフエレース PCR、あるいは In situ hybridization等が挙げられる。 タンパク質の場合には、 その量の解析方法として、 標的遣伝子がコードするタン パク質を抗原とする抗体によるゥ-スタンプ口ッティング法や、 標的遺伝子がコ 一ドするタンパク質が有する酵素活性を測定する方法等が挙げられる。 このよう にして解析した、 導入体にのみ現れる表現型の変化は、 標的遣伝子の発現阻害の 結果生じているものであるので、 これを標的遺伝子の機能として同定することが できる。
( 4 ) 2本鎖ポリヌクレオチドを用いた標的遺伝子発現阻害により細胞、 組織、 あるいは個体に特定の性質を付与する方法
本発明の 2本鎖ポリヌクレオチドを用いた標的遺伝子の発現阻害により、細胞、 組織、 あるいは個体に特定の性質を付与することができる。 特定の性質とは、 標 的遺伝子の発現阻害の結果、 該導入体に現れるものをさす。 ここでの標的造伝子 としては、 その発現の阻害が導入体に与える性質がすでに判明しているものでも よいし、 機能、 もしくは導入体内での機能が未知のものでもよい。 機能が未知の 標的遗伝子については、 これに対する 2本鎖ポリヌクレオチドを導入した後に、 該導入体が示す表現型のうち所望のものを選択することにより、 該導入体に所望 の性質を付与することができる。
被導入体に付与するべき所望の性質として、 具体的には、 例えば、 細胞内生産 機能、 細胞外分泌を阻害する機能、 細胞や DNA に対する障害の修復機能、 特定 の疾患に対する耐性機能等が举げられる。 具体的には、 被導入体が植物個体等の 場合、 標的遺伝子としては、 果実熟成に関連する酵素、 植物構造タンパク質、 若 しくは病原性に関連する遺伝子等が挙げられる。
標的遺伝子の発現阻害が、特定の疾患に対する耐性機能を有する場合としては、 特定のタンパク質の発現の上昇が特定の疾患の原因となる場合で、標的遺伝子は、 上記タンパク質をコードする遺伝子や、 上記タンパク質の発現を制御する機能を 有するタンパク質をコードする遣伝子等が挙げられる。 具体的例としては、 標的 遺伝子が癌化 Z腫瘍化表現型の保持に必要である遺伝子であり、 被導入体が癌性 細胞、 または腫瘍組織等である。
このような標的遺伝子に対する 2本鎖ポリヌクレオチドは、 標的遗伝子がコー ドするタンパク質の発現を阻害することから、 標的遺伝子が関連する疾患の治療 または予防薬として用いることができる。 2本鎖ポリヌクレオチドを上記薬剤の 有効成分として用いる場合には、 該ポリヌクレオチドを単独で用いることも可能 であるが、 薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いること もできる。 この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜9 0重量％の間で変動 され得る。 また、 かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、 それらの投与 形態としては、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 あるいはシロップ剤等による 経口投与、 または注射剤、 点滴剤、 リボソーム剤、 坐薬剤等による非経口投与を 挙げることができる。 また、 その投与量は、 症状、 年齢、 体重等によって適宜選 択することができる。
このような遺伝子を標的とする 2本鎖ポリヌクレオチドが導入された導入体は、 その遺伝子発現阻害に付随すると予測される表現型によって選択される。 また、 導入する 2本鎖ヌクレオチドにおいて、 特定の遺伝標識、 例えば蛍光タンパク質 等をコードする配列を連結しておけば、 被導入体に該 2本鎮ポリヌクレオチドと 共に導入した蛍光タンパク質の発現阻害度に基づいて選択することも可能である。 このうち、 例えばガン抑制に機能する遺伝子を標的遺伝子とした場合、 選択され るべき細胞の形質としては、 増殖能の亢進や、 細胞接着能の低下、 あるいは運動 (転移） 能の亢進等、 悪性腫瘍の形質等が挙げられる。 また、 生体リズムを調製 する遺伝子を標的遺伝子とした場合、 選択されるべき細胞の形質としては、 細胞 固有の慨日 リズムの消失等が挙げられる。 さらには、 環境変異原による DNA損 傷の修復等に関与する遺伝子を標的遺伝子とした場合、 選択されるべき細胞の形 質としては、 変異原に対して感受性を示すこと等が挙げられる。
選択された導入体は、 それぞれに適したそれ自体既知のクローン化技術により 系として樹立、 取得することができる。 具体的には、 被導入体が細胞である場合 には、 導入体は通常の培養細胞における細胞株樹立法である、 限界希釈法、 薬剤 耐性マーカーによる方法等により細胞株として樹立、 取得することができる。 本 発明で取得された特定の機能を付与された導入体は、 有用物質の産生あるいは分 泌効率が上昇した細胞株、 細胞あるいは DNA等に対する障害を与える環境要因 に対して高感受性を示す細胞株、 疾病に付随する形質を示し、 疾病治療のモデル として使用することができる。
このうち、 疾病治療のモデルとなる細胞株の取得方法を、 本発明のさらなる具 体的な適用例として説明する。 標的遺伝子としては、 その発現量の低下、 または 欠如が疾病の原因となる遺伝子が挙げられる。 具体的には、 アルツハイマー病に おける PS 1遺伝子、 色素性乾皮症の XPA/XPDZXPF/XPG 造伝子や DNA polymerase 7j遺伝子、 大腸ガンの APC遺伝子、 乳ガンの BRCA 1 /BRCA 2遺 伝子、 糖尿病の INS/INSR遺伝子等が挙げられる。
これらのヒ ト遺伝子等の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有 する DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチドを、例えばヒ ト由来の培養細 胞に導入することにより、 ヒ ト型の疾病モデル細胞を取得することができる。 さらにこの特定の性質を付与された細胞、 組織、 あるいは個体に被検物質を接 触させて、 その遺伝子が関与する疾病の症状、 あるいは形質に変化が現れるか否 かを解析することによれば、 上記疾病の治療剤、 及ぴノまたは予防剤のスクリー ユングを行うことも可能である。
このようなスクリ一二ングにより選択された物質を上記薬剤の有効成分として 用いる場合には、 該物質を単独で用いることも可能であるが、 薬学的に許容され 得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。 この時の有効成分 の担体に対する割合は、 1〜 9 0重量％の間で変動され得る。 また、 かかる薬剤 は種々の形態で投与することができ、 それらの投与形態としては、 錠剤、 カプセ ル剤、 顆粒剤、 散剤、 あるいはシロップ剤等による経口投与、 または注射剤、 点 滴剤、 リボソーム剤、 坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。 また、 その投与量は、 症状、 年齢、 体重等によって適宜選択することができる。
( 5 ) ィンディケーター遗伝子の発現阻害度を指標とした一次選択を用いる方法 本発明の上記 （ 1 ) 〜 （4 ) に記載した方法は、 被導入体に標的遺伝子の少な く とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する DNAと RNAからなる 2本 鎖ポリヌク レオチドを導入する方法であるが、 本発明の方法では、 さらに （a ) インディケ一タータンパク質をコードする DNAを含む発現ベクター、 （b ) 該ィ ンディケ一タータンパク質をコードする塩基配列の少なく とも一部の塩基配列と 実質的に同一の配列を有する DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチドを導 入し、 該ィンディケ一タータンパク質から発せられる信号量を指標として導入体 を一次スクリ一二ングすることにより、 導入体内での遺伝子の発現阻害がかかつ た導入体のみを解析することができ、 効率的な解析を行うことができる。 本発明のさらに具体的な例として、 被導入体を脊椎動物由来の培養細胞とし、 ィンディケータータンパク質を蛍光タンパク質とした場合を説明する。 脊椎動物 由来の培養細胞に蛍光タンパク質をコードする DNA を含む発現ベクターを導入 して培養し、 該インディケ一タータンパク質から発せられる蛍光量が、 特定の強 さ以上の細胞を選択する。 ここで選択された細胞に、 さらにィンディケ一タータ ンパク質をコードする DNA の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列 を有する DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチドを導入して培養して、ィ ンディケ一ター遺伝子の発現の阻害度を、 該インディケータータンパク質から発 せられる蛍光量の減弱度により解析する。
このような一次スク リ一二ングは、 いずれも被導入体への 2本鎖ポリヌクレオ チドの導入が行われたことや、 該導入体内で檫的遺伝子の発現阻害が起こってい ることを確認するものであるので、 インディケ一タータンパク質は、 そのタンパ ク質量とそれが発する信号量とが相関するものである必要がある。 このよ うなタ ンパク質の具体例としては、 ルシフェラ一ゼタンパク質が挙げられる。
さらには、 標的遺伝子発現の阻害度を測定する場合に、 インディケ一タータン パク質の発現量を基準として、 標的遺伝子がコードするタンパク質量を算出する こともできる。
( 6 ) 本発明に用いられるキッ ト
上記 （ 1 ) 〜 （5 ) に記載した方法を行うためのキッ トとしては、 2本鎖ポリ ヌクレオチド、ィンディケータータンパク質をコードする DNAを含むべクター、 ィンディケーター遺伝子の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有 する DNAと RNAからなる 2本鎮ポリヌクレオチド、 酵素、バッファー等の試薬 類、 ポリヌクレオチォド導入のための試薬類等が含まれる。 本発明のキッ トは、 これら全ての試薬類等を含む必要はなく、 上記した本発明の方法に用いられるキ ッ 卜であればいかなる試薬類等の組み合わせであってもよい。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 下記の実施例は本発 明についての具体的認識を得るための一助とみなすべきものであり、 本発明の範 囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。 実施例 1 CHQ -KI細胞内に導入した 2本鎖 DNA-RNAハィブリ ッ ドによる標的 遺伝子の発現阻害
( 1 ) DNA-RNAハイブリ ッ ド型 2本鎖ポリヌクレオチドの作成
標的遺伝子としてはホタル（Photimis pyralis)の luciferase遺伝子（R pyralis l c 遺伝子 ： accession number： U 4 7 2 9 6 ) を用い、 これを含む発現べクタ 一としては pGL3-Ccmtrolベクター （Promega社製） を用いた。 P. pyralis luc 遺伝子断片はこのベクター中で SV40のプロモーターとポリ Aシグナルで挟まれ た形になっている。 またインディケ一ター遺伝子はゥミ シィ タケ （Renilla reniformis)の luc:iferase遺伝子を用い、これを含む発現べクターとして pRL-TK
(Promega社製） を用いた。
本実施例に用いた 2本鎖ポリヌクレオチドの作製に使われた、 2 1ヌクレオチ ドからなるセンス鎖は配列番号 1 (DNA) または配列番号 2 (RNA) で示すもの である。 また、 アンチセンス鎖は、 配列番号 3 (DNA) または配列番号 4 (RNA) に示すものである。 これらの配列について、 DNAあるいは RNAのキメラ型 1本 鎖ポリヌクレオチドを図 1に示すとおりに作製した。 これらのポリヌクレオチド は日立計測器サービス株式会社を通じてジェンセッ ト株式会社に合成を委託した。 センス鎖ポリヌクレオチドの配列は、 標的遺伝子である pGL3-Controlベクター 中の Rpyralis luc遺伝子 （全長 1 , 6 5 3塩基対） の 3 8— 5 8番目のヌクレオ チドに相当する。
P.pyralis luc遺伝子の発現を阻害するために用いた 2本鎖 RNA、 2本鎖 DNA ならびに 2本鎖 DNA-RNAハイブリ ッ ドは、 図 1に示したセンス鎖 FLsl (RNA) または DFLsl(DNA)と、 アンチセンス鎖 FLa2 (RNA) または DFLa2 (DNA) とを会合させることで作製した。 会合は、 センス 1本鎖ポリヌク レオチ ド、 アン チセンス 1本鎖ポリヌクレオチドを 10mM Tris-HCl(pH7.5), 20mM NaCl反応液 中で 9 0 °C、 2分間加熱し、 更に 3 7 °C、 1時間インキュベー トし、 その後室温 になるまで放置することで行った。 これによりセンス鎖とアンチセンス鎖は会合 し 2本鎖ポリヌク レオチドが形成される。 2本鎖ポリヌクレオチドの形成は、 TBE緩衝液中での 2 %ァガロースゲルでの電気泳動で検定するが、上記条件では 殆どすベての 1本鎖ポリヌクレオチドが 2本鎖ポリヌクレオチドに会合していた。
( 2 ) 標的遺伝子、 インディケ一ター遺伝子、 及ぴ 2本鎖ポリヌクレオチドの培 養細胞への導入
培養細胞としては CHO-KI細胞 (RIKEN Cell bank)を用い、 培地は Dulbecco's modified Eagle's medium ( Gibco BRL 社製） に非慟化 1 0 %牛胎児血淸 (Mitsubishi Kasei社製）及ぴ抗生物質として penicillin (Meiji社製） 1 0 units /ml, streptomycin (Meiji社製） 5 0 μ g/mlを添加したものを用い、 3 7 °C、 5 % C02存在下で培養した。
この CHO-KI細胞は 0. 3 X 1 0 6 cells/mlの濃度で 2 4穴プレー卜にまき、 1 日後に Ca-phosphate沈殿法 （細胞工学ハンドプック、 黒木登志夫ら編、 羊土 社 （ 1 9 9 2 )) で 1 . 0 μ g pGL3- Control DNA、 0. 5 μ g pEL-TK DNA、 及ぴ 0. 0 1、 0 . 1、 1、 1 0、 1 0 O nM の各 2本鎖ポリヌクレオチドを導 入した。
( 3 ) 培養細胞内の遺伝子発現の測定
上記実施例 1 ( 2 ) で調製した細胞は 2 0時間後に回収し、 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega 社製） を用いて、 2種類のルシフェラーゼ
(Photinus pyralis luc及び Renilla reniformis luc) タンパク質の発現量 （ルシ フェラーゼ活性） を測定した。 蛍光の測定は Lumat LB 9 5 0 7 luminometer
(EG&G Berthold) を用いて行った。
CHO-KI細胞に導入した遺伝子の発現は、 DNA-RNAノ、イブリ ッ ド型 2本鎖ポ リヌクレオチドによって阻害された （図 2)。 値はいずれも、 インディケ一ター遺 伝子の発現量 （ルシフェラーゼ酵素活性） に対する標的遺伝子産物の非活性を示 す。 またこれらは 3回の実験の平均値を示しており、 図中の縦棒は標準偏差を示 す。 2本鎖ポリヌクレオチ ドを導入していない対照群に比べ、 2本鎖 RNA導入 群の場合には 2本鎖ポリヌクレオチドを 1 0 O nM 添加したとき、 9 6 %、 セン ス鎖が DNA でアンチセンス鎖が RNA の 2本鎖ポリヌクレオチド導入群では 8 0 %の標的遺伝子発現の阻害が観察された。 即ち、 2本鎖ポリヌクレオチドのセ ンス側が DNAであったとしてもアンチセンス側が RNAであれば、 2本鎖 RNA に比べて効果が弱いながら、 CHO-KI細胞での遺伝子発現を阻害し得ることが証 明された。 実施例 2 ショ ウジヨ ウバエ S 2細胞内に導入した DNA-RNA キメラ型 2本鎖 ポリヌクレオチドによる遣伝子の発現阻害
( 1 ) DNA-ENAキメラ型 2本鎖ポリヌクレオチドの作製
標的遺伝子としては実施例 1 と同様の; Photinus pyralisの luciferase遺伝子（P. pyralis luc l7s.- ： accession number : U 4 7 2 9 6 ) を用いた。 またインアイ ケーター遺伝子は Renilla reniformisの luciferase遣伝子を用いた。 さらに発現 ベクターも実施例 1に記載のものを用いた。
本実施例に用いた 2本鎖ポリヌクレオチドの作製に使われた、 2 1ヌクレオチ ドからなるセンス鎖は配列番号 1 (DNA) または配列番号 2 (RNA) で示すもの である。 また、 アンチセンス鎖は、 配列番号 3 (DNA) または配列番号 4 (RNA) に示すものである。 これらの配列について、 DNAあるいは RNAのキメラ型 1本 鎖ポリヌクレオチドを図 1に示すとおりに作製した。 これらのポリヌクレオチド は日立計測器サービス株式会社を通じてジェンセッ 卜株式会社に合成を委託した。
P. pyralis luc遺伝子の発現を阻害するために用いる DNA-RNAキメラ型 2本 鎖ポリヌクレオチドは、 図 1に示したセンス鎖 FLsl( l本鎖 RNA)とアンチセン ス鎖 FLa2-l、 Fla2-2、 Fla2.3、 Fla2-4、 Fla2-5、 Fla2-6、 Fla2-7、 Fla2-8、 FLa2-9、 Fla2-10 (DNA-RNA キメラ型 1本鎖ポリヌクレオチド） とをそれぞれ会合させ る こ とで作製した。 会合の方法と してはセンス 1本鎖 RNA、 アンチセンス DNA-RNAキメラ型 1本鎖ポリヌクレオチドを実施例 1 と同様にして反応させた。 2本鎖ポリヌクレオチドの産生は TBE 緩衝液中での 2 %ァガロースゲルでの電 気泳動で検定した。
( 2 ) 標的遺伝子、 インディケ一ター遣伝子、 及ぴ DNA-RNAキメラ型 2本鎖ポ リヌク レオチドの培養細胞への導入 '
培養細胞と してはショ ウジョ ゥパェ S 2細胞 （Schneider, I., et al., J. Embryol. Exp. Morph., 27, 353-365(1972) ) を用い、 培地は Schneider's Drosophila medium (Gibco BRL社製） に非慟化 1 0 %牛胎児血清 (Mitsubishi Kasei 社製） 及ぴ抗生物質と して penicillin (Meiji 社製） 1 0 unitsノ ml、 streptomycin (Meiji社製） 5 0 /i g/ml を添加したものを用い、 2 5°C、 5 % C02存在下で培養した。
この S 2細胞は 1. 0 X 1 0 6cells/mlの濃度で 2 4穴プレートにまき、 1 日 後に Ca-phosphate沈殿法 （細胞工学ハンドブック、 黒木登志夫ら編、 羊土社 U
9 9 2 )) で 1. 0 pGL-3 Control DNA、 0. 0 5 μ g pRL-TK DNA、 及び
1 0 OnMの各 2本鎖ポリヌクレオチドを導入した。
( 3 ) 培養細胞内の遺伝子発現の測定
上記実施例 2 ( 2 ) で調製した細胞は 2 0時間後に回収し、 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega社製） を用いて、 2種類のノレシフェラーゼタ ンパク質の発現量を測定した。 蛍光の測定は Lumat LB 9 5 0 7 luminometer (EG&G Berthold) を用いて行った。
S2細胞に導入した遺伝子の発現は、 2本鎖のうちのセンス側を RNAに固定し、 アンチセンス側を DNAと RNAのキメラ型ポリヌクレオチドにして作製した 2 1 ヌクレオチドからなる DNA-RNA キメラ型 2本鎖ポリヌクレオチドによって阻 害された （図 3 )。 値はいずれも、 インディケ一ター遺伝子の発現量 （ルシフェラ ーゼ活性） に対する標的遺伝子産物の比活性として求め、 3回の実験の平均値、 及ぴ標準偏差で示した。 2本鎖ポリヌクレオチドの内、アンチセンス側が FLa2、 FLa2-2 FLa2-3、 FLa2-8、 FLa2-9であるものは、 2本鎖ポリヌクレオチドを導 入していない対照群に比べ、 それぞれ 9 6 %、 9 2 %、 9 4 %、 9 1 %、 9 6 % と、 ほぼ同等に強く遺伝子発現を阻害した。 アンチセンス側が FLa2-5であるも のは、 7 3 %と比較的強い阻害効果を示した。アンチセンス側が FLa2-l、FLa2-4、 FLa2-6、 FLa2-7、 FLa2-10 であるものは、 全く阻害効果がないか、 あるいは 阻害が認められても極めて弱い効果であった。 強い効果を示した 2本鎖ポリヌク レオチドに共通する特徴の一つは、アンチセンス鎖の配列上、 5 '末端から 1 3、 1 4番目の 2ヌクレオチドが RNA(UA)であることである。 一方、 効果の弱かつ た 2本鎖ポリヌクレオチドにおいては、 いずれもアンチセンス鎖配列上の同 2ヌ クレオチドが DNA(TA)であった。従って、 S 2細胞を用いた本実施例においては、 この 2ヌクレオチドが、 強い RNAi効果の発現にとつて必要かつ十分の領域であ ることが示唆される。
本実施例においては、 アンチセンス配列上のこの領域を含む部分を RNA とし て保存し、 その他の部分を DNA に置換した 2本鎖ポリヌクレオチドの導入によ つても RNAi効果が認められた。 本実施例で用いたような方法ならびにその他の 手法によって、 RNAi 効果の発現に必要かつ十分とされる領域を特定あるいは予 測し、 この領域を含む部分を RNAとして保存し、 その他の部分を DNAに置換し て作製したそれぞれ 2 1 ヌク レオチドからなる 2本鎖ポリ ヌ ク レオチドは、 RNAi効果によって標的遺伝子の発現を阻害できると推測される。 実施例 3 ヒ ト HeLa細胞、 及ぴヒ ト HEK293細胞に導入した DNA-RNA キヌ ラ型 2本鎖ポリヌクレオチドによる遺伝子の発現阻害
( 1 ) DNA-RNAキメラ型 2本鎮ポリヌクレオチドの作製
標的遺伝子と しては実施例 1 と同様に Rpyralis hic遗伝子を用い、 これを含む 発現ベクターと しては、 pGL3-Controlベクター （Promega社製） を用いた。 ま たィンディケータ一遺伝子は R enilla reniformisの luc遺伝子を用い、 これを含 む発現ベクターとして pRL-TK (Promega社製） を用いた。
本実施例に用いた 2本鎖ポリヌクレオチドの作製に使われた、 2 1ヌクレオチ ドからなるセンス鎖は配列番号 1 (DNA) または配列番号 2 (RNA) で示すもの である。 また、 アンチセンス鎖は、 配列番号 3 (DNA) または配列番号 4 (RNA) に示すものである。 これらの配列について、 DNAあるいは RNAのキメラ型 1本 鎖ポリヌクレオチドを図 1に示すとおりに作製した。 これらのポリヌクレオチド は日立計測器サービス株式会社を通じてジェンセッ ト株式会社に合成を委託した。 センス鎖ポリヌクレオチドの配列は、 標的遺伝子である pGL3-Controlベクター 中の P.pyralis luc遺伝子 （全長 1 , 6 5 3塩基対） の 3 8 - 5 8番目のヌクレオ チドに相当する。 -
P.pyralis luc遺伝子の発現を阻害するために用いた DNA-RNAキメラ型 2本鎖 ポリヌクレオチドは、 図 1に示したセンス鎖 FLsl-l、 FLsl-2(DNA-RNAキメラ 型 1本鎖ポリヌ クレオチド）とアンチセンス鎖 FIa2 ( 1本鎖 RNA) とをそれぞれ 会合させることで作製した。 会合の方法としてはセンス DNA-RNAキメラ型 1本 鎖ポリヌクレオチド、 アンチセンス 1本鎖 RNA を実施例 1 と同様にして反応さ せた。 2本鎖ポリヌクレオチドの産生は TBE 緩衝液中での 2 %ァガロースゲル での電気泳動で検定した。
( 2 ) 標的遺伝子、 インディケータ一遺伝子、 及び DNA-RNAキメラ型 2本鎖ポ リヌクレオチドの培養細胞への導入
標的遺伝子を発現するための組換え発現ベクターは、 上記 （1 ) に記載の pGL3- Controlを用い、 インディケ一ター遺伝子の発現ベクターは、 上記 （ 1 ) に記載の pRL-TKを用いた。 培養細胞としてはヒ ト HeLa細胞 (ATCC ： CCL- 2 )、 及びヒ ト HEK293細胞 （ATCC： CRL- 1 5 7 3 ) を用い、培地は Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco BRL社製） に非慟化 1 0 %牛胎児血淸
(Mitsubishi Kasei社製）及び抗生物質として penicillin (Meiji社製） 1 0 units /ml、 streptomycin (Meiji社製） 5 0 g/mlを添加したものを用い、 3 7 °C、 5 % C02存在下で培養した。
HeLa細胞、 HEK293 細胞はそれぞれ 0 . 5 X 1 0 6 cells/ml, 0 . 2 5 X 1 0 6 cells/mlの濃度で 2 4穴プレートにまき、 1 日後に Ca-phosphate沈殿法で 1 . 0 μ g pGL3-Control DNA、 1 . 0 u g pRL-TK DNA、 及び 1 0 0 nMの各 DNA-RNAキメラ型 2本鎖ポリヌクレオチドを導入した。
( 3 ) 培養細胞内の遺伝子発現の測定
実施例 1 と同様に、上記実施例 3 ( 2 )で調製した細胞は 2 0時間後に回収し、 Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて、 2種類のノレシフェラーゼタ ンパク質の発現量を測定した。 蛍光の測定は Lumat LB 9 5 0 7 luminometer を用いて行った。 HeLa細胞ならびに HEK293細胞に導入した遺伝子の発現は、 2本鎖のアンチ センス側を RNAに固定し、 センス側を DNAと RNAのキメラボリヌクレオチド にして作製した 2 1ヌクレオチドからなる 2本鎖ボリヌクレオチドによって阻害 された （図 4 )。 値はいずれも、 インディケ一ター遺伝子の発現量 （ルシフェラー ゼ酵素活性） に対する標的遺伝産物の比活性として求め、 3回の実験の平均値、 及び標準偏差で示した。 2本鎖ポリヌクレオチドの內、 センス側が FLsl-2 であ るものを導入した群は、 2本鎮ポリヌクレオチドを導入していない対照群に比べ、 9 0 % (HeLa細胞）、 9 5 % (HEK293 細胞） と、 2本鎖 RNA(FLsl/FLa2)導 入群と同等の強い阻害効果を示した。 FLsl-2は配列上 5 '側の 1 2ヌクレオチド が RNAであり、 その他の領域のヌクレオチドが DNAである。 従って、 HeLa細 胞ならびに HEK293細胞を用いた本実施例においては、 アンチセンス鎖を RNA とした場合、 センス側の該 1 2ヌクレオチドの全体あるいはその一部が、 強い RNAi効果の発現にとって必要かつ十分の領域であることが示唆される。 実施例 4 ヒ ト CHO-K1 に導入した DNA-RNAキメラ型 2本鎖ポリヌクレオチ ドによる遺伝子の発現阻害
( 1 ) DNA-RNAキメラ型 2本鎖ポリヌクレオチドの作製
標的遺伝子としては実施例 1 と同様に Rpyralis luc遺伝子を用い、 これを含む 発現ベクターと しては、 pGL3-C(mtrolベクター （Promega社製） を用いた。 ま たインディケーター遺伝子は R enilla reniformisの luc遺伝子を用い、 これを含 む発現ベクターとして pRL-TK (Promega社製） を用いた。
本実施例に用いた 2本鎖ポリヌクレオチドの作製に使われた、 2 1ヌクレオチ ドからなるセンス鎖ポリヌクレオチドの配列は、標的遺伝子である pGL3-Control ベクター中の P.pyralis luc遺伝子 （全長 1 , 6 5 3塩基対） の 8— 2 8番目 （8 — 2 8 )、 3 8— 5 8番目 （3 8— 5 8 )、 1 0 8 7— 1 1 0 7番目 （ 1 0 8 7— 1 1 0 7 ) のポリヌクレオチドに相当する。
それぞれの塩基配列は、 8— 2 8のセンス鎖が配列番号 5 (DNA)、 6 (RNA)、 アンチセンス鎖が配列番号 7 (DNA)、 8 (RNA) に示すものであり、 3 8— 5 8のセンス鎖が配列番号 1 (DNA)、 2 (RNA) で、 アンチセンス鎖が配列番号 3 (DNA)、 4 (RNA) に示すものである。 また 1 087— 1 1 07のセンス鎖 の塩基配列は配列番号 9 (DNA)、 1 0 (RNA) で、 アンチセンス鎖が配列番号 1 1 (DNA) , 1 2 (RNA) で示すものである。
これらの配列について、上流側の約半分（1 0〜 1 3ヌクレオチド）がセンス、 アンチセンス共に RNAであるもの （C)、 上流側の約半分 （10〜1 3ヌクレオ チド） がセンス、 アンチセンス共に DNAであるもの （D) であるもの、 アンチ センスが ； RNAであり、 センス鎖の上流の約半分 （1 0〜 1 3ヌクレオチド） が RNAであるもの （E)、 センス鎖が UNAであり、 アンチセンス鎖の上流の約半 分 （10〜 1 3ヌクレオチド） 力 S DNAであるもの （F) を作製した。 これらの ポリヌクレオチドは日立計測器サービス株式会社を通じてジヱンセッ ト株式会社 に合成を委託して、 キメラ型ポリヌクレオチドとした後にそれぞれ会合させて作 製した。 会合方法としてはセンス、 アンチセンス DNA-RNAキメラ型 1本鎖ポリ ヌクレオチドを実施例 1 と同様にして反応させた。 2本鎖ポリヌクレオチドの産 生は TBE緩衝液中での 2 %ァガロースゲルでの電気泳動で検定した。
( 2 ) 標的遺伝子、 インディケータ一遺伝子、 及び DNA-RNAキメラ型 2本鎮ポ リヌクレオチドの培養細胞への導入
標的遺伝子を発現するための組換え発現ベクターは、 上記 （1 ) に記載の pGL3-Controlを用い、 インディケ一ター遺伝子の発現ベクターは、 上記 （1) に記載の pRL-TKを用いた。 培養細胞としてはヒ ト CHO-K1細胞 （ATCC： CCL-61) を用い、 培地は Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco BRL社 製） に非慟化 1 0%牛胎児血清 （Mitsubishi Kasei社製） 及び抗生物質として penicillin (Meiji社製) 10 units/ mL strentomvcin. (Meiji社製) 50 μ g/ nilを添加したものを用い、 37°C、 5%C02存在下で培養した。
CHO-K1細胞はそれぞれ 0. 3 X 1 06 cells/mlの濃度で 24穴プレー卜にま き、 1 日後に Ca-phosphate沈殿法で 1. 0 μ g pRL-TK DNA, 1 OnMまたは
1 0 OnMの各 DNA-RNAキメラ型 2本鎖ポリヌクレオチドを導入した。
(3) 培養細胞内の遺伝子発現の測定 実施例 1 と同様に、上記実施例 4 ( 2 )で調製した細胞は 2 0時間後に回収し、 Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて、 2種類のノレシフェラーゼタ ンパク質の発現量を測定した。 蛍光の測定は Lumat LB 9 5 0 7 luminometer を用いて行った。
2本鎮ポリヌクレオチドの構造およぴコン トロ一ル （ 2本鎖ポリヌク レオチド を導入していない細胞） のルシフェラーゼ活性に対する該ポリヌクレオチドを導 入した細胞のルシフェラーゼ活性を図 5に示した。 図中、 白抜きの四角は RNA 鎖を示し、 黒い四角は DNA鎖を示す。 図から明らかなように、 いずれの塩基配 列からなるポリヌクレオチドにおいても、 CHO-K1細胞に導入した遺伝子の発現 は、 少なく ともポリヌクレオチドの上流約半分を RNA としたそれぞれが 2 1ヌ クレオチドからなる 2本鎮ポリヌク レオチドによって阻害された（図 5 (A)、 ( C) および （E)；)。
本実施例で用いたような方法ならびにその他の手法によって、 RNAi 効果の発 現に必要かつ十分とされる領域を特定あるいは予測し、 この領域を含む部分を RNAとして保存し、 その他の部分を DNAに置換して作製したそれぞれが 2 1ヌ クレオチドからなる 2本鎖ポリヌクレオチドは、 RNAi 効果によって標的遗伝子 の発現を阻害できると推測される。 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、 本発明の精神と範 囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にと つて明らかである。
本出願は、 2001年 11月 21 日出願の日本特許出願 （特願 2001— 355896) に基 づく ものであり、 その内容はここに参照として取り込まれる。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 培養細胞、 組織、 個体において、 ヒ トならびにその他の生物 種の遺伝子が生体内でどのような機能を有するかを直接的に解析する手段が提供 される。 また、 インディケ一ターを用いる方法によれば、 RNAi 効果の発現が弱 い細胞であっても、 特に RNAi効果の高く発現している細胞を一次スク リ一ニン グすることができるため、 効率のよい解析を行うことができる。
同目的に供される従来の発明技術としては、 2本鎖 RNA の導入による ： RNAi 法が挙げられるが、 RNAは特に 1本鎖の状態では RNA分解酵素によって極めて 容易に分解され、 かつ製造費用が高額であるという問題点がある。 本発明では、 導入するポリヌクレオチドが完全に RNAであることを限定しなレ、。従って、 DNA と RNAからなるポリヌクレオチド、 具体的には DNA鎖と RNA鎖からなるハイ ブリ ッ ドボリヌクレオチド、 又は DNA-RNAキメラボリヌクレオチドを用いるこ とによって導入するポリヌクレオチドの物質としての安定性を高め、 製造費用を 低滅することが可能である。 このことから、 本発明によれば、 導入するポリヌク レオチド自体を疾患治療を目的とした製剤として開発することができる。 また、 DNAは RNAと比較して蛍光標識、 ピオチン標識、 アミン化、 リン酸化、 チォー ル化等の修飾をより多種にわたり容易に行うことができる。 従って、 医薬品ある いは試薬として使用する場合に、 このような化学的修飾を行うことによって目的 に応じた機能を付加することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 標的遺伝子の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチドを、 細胞、 組織、 あるいは個体に 導入することを特徴とする標的遺伝子の発現阻害方法。
2 . 2本鎖ポリヌクレオチドが、 自己相補性を有する 1本鎖からなることを特 徴とする請求項 1に記載の方法。
3 . 2本鎖ポリヌクレオチドが、 DNA鎖と RNA鎖のハイブリ ッ ドであること を特徴とする請求項 1または 2に記載の方法。
4 . DNA鎖と ： NA鎖のハイブリ ッ ドが、 センス鎖が DNAで、 アンチセンス 鎖が RNAであることを特徴とする請求項 3に記載の方法。
5 . 2本鎖ポリヌクレオチドが、 DNAと RNAのキメラであることを特徴とす る請求項 1または 2に記載の方法。
6 . 2本鎖ポリヌクレオチドが、 該ポリヌクレオチドのうち、 少なく とも上流 側の一部が RNAであることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれかに記載の方法。
7 . 上流側の一部が、 9〜 1 3ヌクレオチドからなることを特徴とする請求項 6に記載の方法。
8 . 2本鎖ポリヌクレオチドが、 1 9〜 2 5ヌク レオチドからなり、 該ポリヌ クレオチドのうち、 少なく とも上流 1 / 2力 S RNA であることを特徴とする請求 項 1〜 6のいずれかに記載の方法。
9 . 標的遺伝子が、 複数であることを特徴とする請求項 1〜8のいずれかに記 載の方法。
1 0 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の方法による標的遺伝子の発現阻害の結 果、 該細胞、 組織、 あるいは個体に現れる表現型の変化を解析することを特徴と する遺伝子の機能解析方法。
1 1 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の方法を用いた標的遺伝子の発現の阻害 により、 細胞、 組織、 あるいは個体に特定の性質を付与する方法。
1 2 . 請求項 1 1に記載の方法により得られる細胞、 組織、 あるいは個体。
1 3 . 請求項 1 2に記載の細胞、 組織、 あるいは個体に被検物質を添加し、 該 細胞、組織、あるいは個体に付与された性質の変化を解析することを特徴とする、 標的遺伝子が関与する疾病の予防、 及び/または治療剤のスクリーユング方法。
1 4 . 請求項 1 3に記載の方法により得られた物質を有効成分とする標的遺伝 子が関与する疾患の予防、 及び/または治療剤。
1 5 . 請求項 1 3に記載の方法により選抜された物質を製剤化することを特徴 とする標的造伝子が関与する疾患の予防、 及び/または治療剤の製造方法。
1 6 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の方法において、 細胞、 組織、 あるいは 個体にさらにィンディケータータンパク質をコードする DNA を含む発現べクタ 一を導入して、 該インディケ一タータンパク質から発せられる信号量が、 特定の 強さ以上のものを選択して解析することを特徴とする方法。
1 7 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の方法において、 細胞、 組織、 あるいは 個体にさらにインディケ一タータンパク質をコードする DNA を含む発現べクタ 一、 及ぴ該 DNA の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列からなり、 かつ DNAを含む 2本鎖 RNAを細胞に導入して、該ィンディケータータンパク質 から発せられる信号量が減弱した細胞、 組織、 あるいは個体を選択して解析する ことを特徴とする方法。
1 8 . インディケ一タータンパク質が、 タンパク質量とそれが発する信号量と が比例して変化していく ものである請求項 1 6または 1 7に記載の方法。
1 9 . インディケ一タータンパク質が、 ルシフェラーゼである請求項 1 6〜1 8のいずれかに記載の方法。
2 0 . (i) 標的遺伝子の少なく とも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有 する 2本鎖ポリヌクレオチドであって DNAと RNAのキメラからなるものを作製 し、 （ii) 該 2本鎖ポリヌクレオチドを細胞、 組織、 あるいは個体に導入し、 （iii) 該細胞、 組織、 あるいは個体中の標的遺伝子の発現阻害度を測定し、 （iv) 標的遣 伝子の発現阻害に RNA であることが必要とされる配列を特定することを特徴と する RNAi法における RNAの機能部位の同定方法。
2 1 . 2本鎖ポリヌク レオチドが、 その 2本鎖のどちらか一方が RNA鎖であ ることを特徴とする請求項 2 0に記載の方法。
2 2 . 請求項 1〜 1 1、 1 3、 1 5〜 2 1のいずれかに記載の方法に用いるた めの 2本鎖ポリヌクレオチド。
2 3. 少なく とも請求項 2 2に記載の 2本鎮ポリヌクレオチドを含む標的遺伝 子が関与する疾患の予防、 及び/または治療剤。
24. 少なく とも請求項 2 2に記載の 2本鎖ポリヌクレオチドを含む請求項 1 〜 1 1、 1 3、 1 5〜 2 1のいずれかに記載の方法を行うためのキッ ト。
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