WO2003043415A1 - Systeme d'expression de proteines exogenes dans un systeme aviaire - Google Patents

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WO2003043415A1
WO2003043415A1 PCT/FR2002/003992 FR0203992W WO03043415A1 WO 2003043415 A1 WO2003043415 A1 WO 2003043415A1 FR 0203992 W FR0203992 W FR 0203992W WO 03043415 A1 WO03043415 A1 WO 03043415A1
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cell
protein
avian
sequence
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PCT/FR2002/003992
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Bertrand Pain
Jacques Samarut
Isabelle Valarche
Patrick Champion-Arnaud
André SOBCZYK
Ryota Kunita
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Vivalis
Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Ens - Ecole Normale Superieure De Lyon
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Definitions

  • the present invention relates to the use of an avian cell for the production of an exogenous protein of interest in an animal belonging to the avian species, said cell being transformed by an expression vector comprising the gene coding for said protein, said cell being introduced either into the sub-germinal cavity of an embryo, the bloodstream of the embryo or serving as a nucleus source for nuclear transfer into an oocyte, whether or not enucleated, or whose chromosomes have been destroyed .
  • molecular expression systems such as proteins for therapeutic use, have been associated with an active biological component (bacteria, yeast, higher eukaryotic cell, etc.) and a genetic element that provides the support necessary for production.
  • active biological component bacteria, yeast, higher eukaryotic cell, etc.
  • the various genetic supports used are most often either simple expression vectors optimized for expression but whose integration remains random are viral or retroviral systems. They also do not allow you to control either the place or the level of expression.
  • These production methods are currently experiencing a new digital and qualitative revolution.
  • the number of molecules which have one or more therapeutic and medical potentials has significantly increased. For example, antibodies for therapeutic purposes already represent around 50% of these molecules.
  • the avian production system of the invention makes it possible to obtain higher quantities of active substances at lower cost since they can be easily isolated and purified.
  • a recombination process in a lymphoid cell line was made possible by a recombination process due to a particular mutation (the mutation affects the expression level of the Rad54 protein) (Kim et al ., 1990; Baba et al., 1988; Buerstedde et al., 1990; Buerstedde and Takeda, 1991; Bezzubova et al., 1993; Bezzubova et al., 1997).
  • the authors acknowledge that they have not been able to carry out homologous recombination with ES cells.
  • a targeted homologous recombination process allows expression of an exogenous molecule of interest in avian systems and that this same process can be controlled at the level experimental in different types of avian cells, including lines, primary cells and stem cells and embryonic stem cells.
  • the object of the invention is therefore: - homologous recombination vectors capable of targeting and substituting, totally or partially, the proteins of the egg and in particular those of the white with molecules of interest,
  • the whole of this invention therefore makes it possible to propose an original system for producing molecules of interest according to a perfectly predictable mode since it is controlled both spatially and temporally, providing the answers to the problems existing in the state of the art.
  • the invention relates to the use of an avian cell for the production of an exogenous protein of interest in an animal belonging to the avian species, characterized in that said cell is transformed by an expression vector comprising the gene coding for said protein, said cell being introduced either into the sub-germinal cavity of an embryo, the blood circulation of the embryo or serving as a nucleus source for nuclear transfer into an oocyte which is enucleated or not, or whose chromosomes have been destroyed.
  • avian cell By avian cell is meant a precursor cell, a somatic cell, a stem cell, an embryonic stem cell (ES), a pluripotent cell, a totipotent cell, a germ cell, a stem germ cell (EG), a primordial germ cell. (PGC), a cell clone of the above cells, a line established from the above cells or an embryoid coips obtained from the above cells.
  • ES embryonic stem cell
  • PDC primordial germ cell.
  • precursor cell is meant any cell of an adult or embryonic tissue partially differentiated and which is capable of dividing and giving differentiated cells.
  • - By somatic cell is meant any cell of an embryo or an adult, other than a germ cell.
  • ES embryonic stem cell
  • stem cell any cell having the capacity to divide in vitro in culture for infinite periods of time and capable of giving different specialized cell types.
  • pluripotent cell a single cell which has the capacity to differentiate into cells in the three embryonic layers.
  • totipotent cell a cell with an unlimited capacity for proliferation, a state limited to the egg cell.
  • germ cell - by germ cell is meant the spermatozoa and the oocyte, or their precursors capable of giving a spermatozoon and an oocyte. All other cells are somatic cells.
  • germinal stem cells we mean the cells found in a specific part of the embryo called the genital crests, becoming the gonads in the adult organism. These cells normally develop into mature gametes.
  • cell clone we mean any set of cells genetically identical to the cell from which they are derived by division.
  • embryoid bodies any aggregate of cells derived from embryonic stem cells maintained in culture. Embryoid bodies do not participate in the normal development of an embryo and are observed only in vitro.
  • - By line is meant any cell culture capable of proliferating indefinitely while retaining the same phenotypic characteristics.
  • I- Different vectors can be used for the transformation of said cells:
  • the vector used for this purpose whether it is a recombination vector or a simple expression vector, allows tissue-specific expression, in particular in the oviduct, liver, blood, marrow and lymphoid organs.
  • homologous recombination vector makes it possible to target an endogenous locus to express a gene of interest in place of this endogenous locus.
  • homologous recombination is a process which consists in partially or totally replacing a part of a gene by a construction which partially or completely takes up certain sequences identical to this same gene.
  • the identical parts make it possible to exchange the DNA brought into the endogenous locus and to introduce the modified parts into the environment considered and therefore respected by the targeted locus. This results in an insertion into the target locus of modifications made by certain parts of the construction.
  • the different parts of the construction allow to control the expression of the introduced cassettes. These tapes are either dependent of their own promoter, are dependent on the transcriptional activity of the targeted locus, when the cassette is placed under the dependence of the internal promoter.
  • the recombination reaction can be divided into three main stages:
  • the first step is the pairing of homologous regions, leading to a transient 'three strand' structure of DNA.
  • the second step is the realization of an independent double crossing over in the regions of homologies, leading to the formation of a hybrid molecule between the targeted chromosome and the vector introduced
  • Any element, present in the system or provided in a stable or transient manner which controls, modifies or influences these different mechanisms will have an essential contribution in the process of recombination and therefore in the efficiency of integration of the vector.
  • the recombination vector which makes it possible to produce the molecules in the avian system, in particular in the chicken is not a simple vector of destruction, but a vector of substitute replacement.
  • These complex vectors are the result of the orderly and successive association in a conventional cloning plasmid (pBSK, pUC, 7) of at least one of the following elements:
  • a cDNA or a part of the gene (s) of interest placed directly under the ATG dependence of the endogenous targeted gene. This association of the fragments is in most cases directly achieved by a fusion on the ATG of the targeted locus with the second amino acid of the protein.
  • a nucleotide sequence specifying a peptide signal should be placed upstream of the cDNA of interest and downstream of the target gene signals. It is either provided by the fragment of interest, or by an additional exogenous nucleotide sequence.
  • cDNA is meant all or part of a nucleic acid coding sequence for a protein of interest.
  • protein of interest is meant a protein, a fragment of a protein or a peptide which is of therapeutic interest for humans or animals, but also any protein form capable of providing humans or humans. animals benefit from their physical status, health, behavior or vitality, which notably includes a protein or peptide of endogenous interest and a protein or peptide of exogenous interest defined below:
  • protein of endogenous interest any protein present in the system, the egg in particular, present at variable levels but detectable in a normal physiological situation.
  • protein of exogenous interest any protein of exogenous origin in the system, not identified in the system, the egg in particular, in a normal physiological state. Its presence is the direct or indirect result of the genetic and / or biochemical modification induced by the vector in the system.
  • a resistance cassette (known as a selection cassette positive for an exogenous selection system) generally consisting of a promoter, a cDNA which provides resistance to exogenous selection and a poly A sequence allowing the stopping of transcription of this independent transcriptional element.
  • the promoter can be of different origins.
  • This fragment generally has a different size from the 5 ′ genomic DNA fragment.
  • This element constitutes the arm 3 '.
  • An additional so-called negative selection cassette can be incorporated into this vector. It is then generally integrated downstream of the 3 ′ genomic arm. Located 3 'from the 3' homology arm, this cassette does not persist in the genome of the target cell if integration takes place according to the correct scheme. Only events which are not correctly recombined are sensitive to this action.
  • At least one unique linearization site on the vector recommended by experience. This step seems necessary for the effective introduction of this vector into the genetic heritage of the targeted cell.
  • the main characteristics of a recombination vector as described to date in mammalian systems lie in the succession of different elements within the plasmid and in the positioning of the genomic arms (origin of DNA, size of homologous genomic elements , relative asymmetry ). In the majority of cases, the frequency of recombination observed in vitro is dependent on the target locus, therefore on the target clomatin environment (Ramirez-Solis et al., 1993; Hasty et al., 1995; Hasty et al., 1991) . This environment is closely linked to the physiology of the cell.
  • the sole composition at the base of a locus can strongly influence the recombination efficiencies, in particular by the strong presence of numerous CpG islets (Yanez and Porter, 2000).
  • Other cryptic elements can also modify the efficiency of the homologous recombination process (replication initiation sites, repeated sequences ).
  • the frequency of homologous recombination seems to be very dependent on the target cell, with special situations such as for the chicken DT40 lymphoid cell line, which exhibits impressive recombination rates (> 10%).
  • Rad54 or a protein of the rad family can be overexpressed in order to improve the efficiency of the recombination process.
  • the immunoglobulin loci seem very special in this respect. Homologous integration events of a vector exhibiting homology only in the 3 ′ arm have been observed (Berinstein et al., 1992). Furthermore, the recombinations in the immunoglobulin loci appear particular due to the activity of the sites recognized by the recombinases specific to these genes. Some interference with the equipment of these cells and the recombination process could be observed.
  • the vector is a homologous recombination vector having 5 ′ and 3 ′ arms of homology to the sequences of a given locus.
  • the targeted locus is selected, for example, from the locus of ovalbumin, ovomucoids, conalbumin and lysozyme.
  • the vector includes heterologous segments:
  • This approach is used in particular by introducing a specific site recognized by a meganuclease, in particular of the I-Scel or other type, in order to favor the recombination events (Sarig et al., 2000; Cohen-Tanoudji et al, 1998; Robine et al ., 1998; Jasin et aL, 1996).
  • the various elements currently present in the vectors are constitutively active once the homologous recombination event has taken place.
  • the expression of an exogenous protein in the egg can lead to possible toxicity both at the level of the tissue which will ensure production and possibly at the level of the egg, place of final accumulation. This accumulation must therefore be able to be induced and decided both at the temporal and spatial level.
  • One of the possible approaches is the use of inducible and conditional systems.
  • inducible system for example the system called Tet off / tet on.
  • the latter consists of two elements: the donor and the operator.
  • the donor system itself comprises a genetic construction derived from a tetracycline resistance system, identified in a bacterial transposon Tn10.
  • Tn10 bacterial transposon
  • TetR repressor protein expressed constitutively, blocks the transcription of the gene ensuring resistance to tetracycline.
  • the repressor does not can no longer bind to control sequences.
  • conditional system is meant, for example, systems implementing certain enzymes such as certain recombinases.
  • These enzymes recognize small particular and specific sequences (loxP sequences for the CRE enzyme, FLP sequence for FRT recombinase, etc.) which are then inserted into the construction to be checked.
  • the general mode of action is to carry out a deletion of the elements located between these sequences during the action of the recombinase.
  • the introduction of the recombinase is carried out by different routes (transient transfection, integrated stable expression, etc.) and its expression conditions the excision reaction at the level of the sequences introduced.
  • Basic elements of constructions The origin of basic elements of vectors is variable.
  • the skeletons of the main plasmids are of commercial origin. They allow an easy propagation of the constructions they carry in a well controlled bacterial environment, that of E. coli, even if different strains are used.
  • the plasmids pBSK, pMCS5, pCI ⁇ éo are used to be a general basis for many intermediate or terminal vectors
  • the positive selection cassettes consist of: a promoter from different origins, viral such as for example the CMN promoter (cyomegalovirus), the SV40 virus promoter, the RSN LTR or non-viral as promoters of ubiquitous genes (such as chicken b-actin promoter) or promoters of genes specifically expressed in certain stages of development or promoters of genes specifically expressed in certain tissues.
  • viral such as for example the CMN promoter (cyomegalovirus), the SV40 virus promoter, the RSN LTR or non-viral as promoters of ubiquitous genes (such as chicken b-actin promoter) or promoters of genes specifically expressed in certain stages of development or promoters of genes specifically expressed in certain tissues.
  • CMN promoter cyomegalovirus
  • SV40 virus promoter SV40 virus promoter
  • RSN LTR non-viral as promoters of ubiquitous genes (such as chicken b-actin promoter) or promoters of genes specifically expressed in certain stages of development or promoter
  • the negative selection cassettes consist of:
  • a gene ensuring the transformation of a substrate present in the culture medium into a substance toxic to the cell which expresses the gene.
  • DTA diphtheria toxin
  • HSV TK herpes virus thymidine kinase gene
  • the HPRT gene can also be used as negative selection by the addition in the medium of 6-thioguanine (6TG).
  • poly A transcription termination sequence of different origins the most classic of which are those derived from poly A of SV40 or a poly A of eukaryotic gene (growth hormone bovine, rabbit b-globin ).
  • a special case is the placing of the positive selection cassette under the direct dependence of the targeted endogenous locus. This approach requires functionality, therefore the transcriptional activation of the targeted locus to be able to be used and therefore to link the selection of clones after transfection to a particular differentiation or non-differentiation state. These examples are not limitative.
  • the homologous recombination vector comprises in a plasmid base a sequence of at least one element taken successively from h) a fragment of genomic DNA containing the 5 ′ homology arm of the targeted gene fused to, h) a secretion signal nucleotide sequence fused to, h) a short intronic nucleotide sequence fused to, h) the nucleotide coding sequence for the protein of interest fused to, h) a poly A transcription termination sequence fused to, h) a positive selection cassette comprising a promoter, a gene for resistance to a selection agent and a poly A transcription termination sequence, said cassette being able to be fused to, h) a fragment of genomic DNA containing the homology arm 3 'of the targeted gene, h) a negative selection cassette comprising a promoter, a gene ensuring the transformation of a substrate present in the culture medium into a substance toxic to the cell that expresses the gene and a polyA transcription termination
  • This vector can also comprise d) the coding sequence for the exogenous protein fused at its 5 ′ end with c) a short intronic sequence in particular comprising the sequence SEQ ID No. 1 itself fused with e) a peptide secretory signal sequence , in particular the coding sequence for the lysozyme signal peptide comprising the sequence SEQ ID No. 2.
  • the vector according to the invention can also comprise d) the coding sequence for the exogenous protein fused at its 3 ′ end with a poly A sequence.
  • the vector can also comprise at least one IRES sequence in fusion with at least two coding sequences for the exogenous protein of interest or at least one IRES sequence in fusion with at least two coding sequences for different chains constituting a protein of interest, in particular the heavy and light chains of an antibody of any nature whatsoever, in particular a monoclonal antibody, an fab fragment.
  • the group I or group II IRES are chosen, in particular the sequences V130 (US Patents 5,925,565; FR 95/00894), Idemfix and Zam (WO 99/29844), (Leblanc et al. 1997; 1999 ).
  • These vectors are characterized by the successive association of a promoter, of a cDNA or of part of a gene, of a poly A sequence, allowing the stopping of transcription. After transfection of these vectors into eukaryotic cells, these vectors have the advantage and the disadvantage of integrating at random in the genome. The efficiency is often good and a large number of integration sites can be obtained. However, the randomness of this insertion makes expression from the promoter carried by the vector dependent on the environment of the insertion site (methylation, imprinting, enhancer, silencer, etc.).
  • promoters which can be used in the context of the invention responding to these difficulties and which are used for the purpose of specific tissue expression, mention may be made in a non-exhaustive manner of the promoter of the lysozyme gene (from 2500 to 100 bp), but also the promoter of the ovalbumin gene, in long forms (from 5 to 1 kb) containing regions of positive and negative or short regulations (from 1000 to 100 bp), knowing that a minimum promoter of about 100 bp can be specifically activated by different hormones (Monroe and Sanders, 2000).
  • Example 1 illustrates the possibilities of obtaining stem cell clones with such simple expression vectors.
  • the vector useful in the context of the invention can therefore be an expression vector comprising the coding sequence for the protein of interest fused with at least one element taken from a) a promoter, in particular selected from the promoters of the genes of ovalbumin, ovomucoids, conalbumin and lysozyme, b) a signal peptide sequence c) a polyA nucleotide sequence for transcription termination.
  • This expression vector and the recombination vector can comprise an IRES sequence fused with at least two coding sequences for the same protein of interest or for different coding sequences.
  • the aforementioned vectors make it possible to transform an avian cell as defined above.
  • said cell is a primary embryonic avian cell, an embryonic stem avian cell, in particular embryonic stem cells resulting from the cultivation of blastoderms.
  • blastoderm is meant an avian embryo at a stage preceding gastrulation and comprising a simple cellular organization with at least two layers of cells separated by a cavity.
  • the avian embryonic cell of the invention has an alkaline phosphatase positive phenotype, in particular an alkaline phosphatase positive embryonic stem cell phenotype.
  • Avian embryonic cells, embryonic stem cells and embryonic germ cells are characterized in that they react specifically with at least one antibody selected from ECMA-7, SSEA-1, SSEA-3, TEC-01, EMA-1 and EMA-6.
  • the cell according to the invention can also be a primary avian cell of phenotype defined in particular for a primary fibroblast, an epithelial cell, an endothelial cell.
  • the cell is an avian cell derived from a primary embryonic cell and established spontaneously in culture or using various immortalizing agents, in particular cells derived from the embryonic stem cells induced to differentiate under the action of various inducing agents in particular retinoic acid, dimethylsulfoxide, TPA or specific culture conditions, in particular by the formation of embryoid bodies (see definition above).
  • various immortalizing agents in particular cells derived from the embryonic stem cells induced to differentiate under the action of various inducing agents in particular retinoic acid, dimethylsulfoxide, TPA or specific culture conditions, in particular by the formation of embryoid bodies (see definition above).
  • the cell is an avian cell established in line, in particular the LMH liver cells, the HD11 monocyte cells and the QT6 fibroblastic cells.
  • the invention relates to a process for obtaining an avian cell modified by one of the vectors defined above.
  • This method can comprise the following stages a) introduction of the vector defined according to one of the above claims into an avian embryonic cell by a transfection method, in particular using a liposome, a polycation or by electroporation b) selection of cells by the addition of a selection agent in the culture medium, in particular geneticin in a concentration range of 100 to 500 ⁇ g / ml c) screening of resistant clones and amplification.
  • this selection is carried out for at least approximately 2 to 10 days, in particular 2, 3, 4, 5 or 6 days.
  • the invention relates to a method for obtaining an avian cell modified by one of the vectors defined above comprising the following steps: a) introduction of the vector defined according to one of the above claims into a cell avian embryo by a transfection method, in particular using a liposome, a polycation or by electroporation b) selection of cells by the addition of a selection agent in the culture medium, in particular the geneticin in a concentration range from 100 to 500 ⁇ g / ml c) obtaining genetically stable recombinant clones having a morphology and characteristics similar to the parental cells (endogenous alkaline phosphatase level, reactivity to surface antibodies, and telomerase activity) d) screening of resistant clones and amplification of the resulting correctly recombinant resistant cells.
  • the recombination vector targets the lysozyme locus.
  • the invention also relates to a previously mentioned method characterized in that the culture supernatant of the recombinant clones contains the exogenous protein of interest, in particular after induction of the clone using different inducers, in particular retinoic acid , dimethylsulfoxide, TPA or specific culture conditions, in particular by the formation of embryoid bodies.
  • the two alleles of the targeted locus are preferably modified.
  • the cells are primary embryonic avian cells, embryonic stem avian cells, in particular embryonic stem cells resulting from the culture of blastoderms. These cells have an alkaline phosphatase positive phenotype, in particular an alkaline phosphatase positive embryonic stem cell phenotype.
  • the avian embryonic cells of the method are characterized in that they react specifically with at least one antibody selected from ECMA-7, SSEA-1, SSEA-3, TEC-01, EMA-1 and EMA-6.
  • ECMA-7 ECMA-7
  • SSEA-1 SSEA-1
  • SSEA-3 SSEA-3
  • TEC-01 TEC-01
  • EMA-1 EMA-6
  • EMA-6 EMA-6
  • the invention also relates to a method defined above in which the cells are avian cells derived from a primary embryonic cell and established in line using various immortalizing agents, in particular cells derived from embryonic stem cells induced to differentiate under the action of different inducing agents in particular retinoic acid, dimethylsulfoxide, TPA or specific culture conditions, in particular by the formation of embryoid bodies.
  • various immortalizing agents in particular cells derived from embryonic stem cells induced to differentiate under the action of different inducing agents in particular retinoic acid, dimethylsulfoxide, TPA or specific culture conditions, in particular by the formation of embryoid bodies.
  • the cells are avian cells established in line, in particular the LMH liver cells, the HD11 monocyte cells and the QT6 fibroblastic cells. Said cells defined above can be further transformed with an expression vector expressing a protein of the Rad family, in particular the Rad54 protein.
  • the medium used can comprise anti-retinoic acid antibodies (ARMA) and a cytokine chosen from the group consisting of LIF, IL-11, IL-6 and their various mixtures.
  • ARMA anti-retinoic acid antibodies
  • a cytokine chosen from the group consisting of LIF, IL-11, IL-6 and their various mixtures.
  • the medium used can also include various factors, in particular SCF, 1TGF-1, bFGF, CNTF and Oncostatin.
  • the invention relates to a process for obtaining an animal belonging to the avian species capable of expressing an exogenous protein of interest, characterized in that it comprises the following steps: a) obtaining avian cells modified by the process defined above, b) introduction of the cell obtained in step a) into the sub-germinal cavity of an embryo, into the bloodstream or by nuclear transfer of the nucleus of said cell in an enucleated or unenucleated oocyte, and c) incubation of the embryo obtained in step b).
  • nuclear transfer we mean the transfer of a nucleus of a cell into an egg or oocyte from which the nucleus has been removed, or not or in which the chromosomes have been destroyed or altered by gamma or UN irradiation or any other adapted means.
  • the vector used in step a) allows tissue-specific expression, in particular in the oviduct, the liver, the blood, the marrow and the lymphoid organs.
  • marrow By marrow is meant the tissue which fills the cavity of most bones and which contains hematopoietic stem cells, from which all red and white blood cells are derived.
  • the invention also relates to the aforementioned method for obtaining an animal belonging to the avian species exhibiting a tissue-specific expression of an exogenous protein of interest, characterized in that the vector is a homologous recombination vector having among different elements necessary for its operation of 5 ′ and 3 ′ arms of homology to the sequences of a given locus, in particular a locus selected from the locus of ovalbumin, ovovmucoids, conalbumin and lysozyme.
  • Such a vector can comprise the coding sequence for the exogenous protein fused with at least one element selected from an intronic sequence, a secretory signal peptide sequence, in particular the lysozyme signal peptide comprising the sequence SEQ ID No 2, a poly A sequence , an IRES and a promoter, in particular chosen from the promoters of the ovalbumin, ovomucoid, conalbumin and lysozyme genes.
  • Step b) of the method for obtaining an animal belonging to the avian species exhibiting a tissue-specific expression of an exogenous protein of interest may further comprise the transformation of avian cells with a vector expressing a protein of the Rad family , in particular Rad54.
  • the invention relates to a process for the production of a protein of interest comprising the extraction of the exogenous protein expressed in the tissues of an animal obtained from the process mentioned above.
  • the protein is preferably extracted from blood, yolk or egg white.
  • the process for producing a protein of interest can consist in the extraction of the exogenous protein expressed in the supernatant of the cells resulting from the process according to the invention.
  • the invention also relates to an animal belonging to the avian species capable of being obtained from the process described above, characterized in that it expresses an exogenous protein in a specific tissue, for example in the liver, blood, marrow, lymphoid organs or oviduct.
  • the invention relates to an egg capable of being obtained from an animal described above, characterized in that part of these components, in particular ovalbumin, ovomucoids, conalbumin and the lysozyme is partially or completely replaced by a protein of exogenous interest, selected in particular from peptides of therapeutic interest, interleukins, cytokines, hormones, and antibodies.
  • antibody By antibody is meant a protein having a specific affinity for an antigen comprising polyclonal, monoclonal antibodies and their Fab fragment.
  • the egg of the invention may contain a proportion of exogenous protein of between a few mg (1 to 10 mg) and 500 mg of dry matter in place of part or all of at least one endogenous protein, chosen in particular from ovalbumin, ovomucoids, conalbumin, lysozyme and avidin.
  • cDNA complementary DNA
  • CMV Cytomegalovirus
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • IGF-1 Insulin Growth factor 1
  • MCSF Macrophage Colony Stimulating Factor
  • NRE Negative Response
  • PR element Progesterone Receptor
  • RAR Retinoic Acid Receptor RNA: Ribonucleic Acid
  • RSV Rous Sarcoma Virus
  • RXR Retinoid X Receptor
  • SCF Stem cell Growth factor SDRE: Steroid Dépendent Regulatory Element
  • TPB Tryptose Broth Phosphate
  • TPA TriPhroboler
  • Example 1 The egg as a production system
  • the expression of a protein of interest in an physiological fluid of an animal, chicken for example, in particular in the egg and in particular in the egg white appears achievable with the help of various molecular tools including expression vectors.
  • the general principle of the invention is to directly express in the egg an exogenous molecule of interest either without changing one or the other of the proteins already present in the egg, or in place of a molecule endogenous or a fraction of this endogenous molecule.
  • the egg is a medium particularly suitable for the expression of exogenous molecules.
  • Egg white is a complex medium whose biochemical composition is fairly well characterized (see Table 1 below).
  • Table 1 Average content (in g) for a 60g egg
  • the proteins of the white are all elaborated by the cells of the oviduct, at the level of the magnum. Different cell types are found and some specialization is observed between the cells responsible for secretion. Calciform epithelial cells (also called mucus cells) are specialized in the production of avidin and ovomucin, while the cells of the tubular glands preferentially secrete lysozyme and ovalbumin. The distribution of these different cell types is variable in the secretory epithelium of the magnum, but no regionalization is observed (Sauveur, 1988).
  • White protein synthesis is continuous at the cell level.
  • the components of yolk Egg yolk is essentially composed of an accumulation of lipids (Table 1 above) in the form of lipoproteins. It is the result of a close association of the two major proteins, vitelline and vitellenine, with phospholipids and triglycerides. The other components (cholesterol, vitamins and fat-soluble pigments) are in the minority. In contrast to white proteins, all proteins and components of the yolk are synthesized by the liver and transported via the blood circulation to accumulate in the yolk during the development of the follicles (Sauveur, 1988; Nau, 1987). There is also in the yolk a significant proportion of immunoglobulins which are accumulated directly during the development of this yolk.
  • the 100 kb ovalbumin locus belongs to the multigene family of serpins and contains 3 related genes, ova, ovaX and ovaY. They are all expressed in the oviduct of a laying hen (LeMeur et al., 1981; Baldacci et al., 1981). Structurally known since 1979 by electron microscopy studies (Gannon et al, 1979), the ovalbumin locus is located on chromosome 2 (Dominguez-Steglich et al., 1992). The first complete sequence which was published in 1978 is that of ovalbumin. Its pre-mRNA has a size of 7564 bp and includes 7 exons (McReynolds et al., 1978).
  • ovalbumin The spliced messenger made 1872 bp (Woo et al., 1981).
  • the transcription of the gene coding for ovalbumin (like that of conalbumin, by the way - see 2.3) is controlled by steroid hormones.
  • the addition of estrogens stimulates 20 times the production of ovalbumin and 2.5 times that of conalbumin (N'guyen et al. 1979).
  • ovalbumin transcripts are not detectable in oviduct cells, whereas they represent, in proportion to the dose of estrogen, more than 50% of the total transcripts of a cell after maximum stimulation. (Dean et al., 1983).
  • ovalbumin indicates that there are several sites for binding of estrogen receptors at the promoter level (Palmiter et al, 1981 ).
  • the nucleosomal structure of the ovalbumin and conalbumine genes changes during transcriptional activation.
  • the genomic fragments associate with the nuclear matrix and present four major regions of DNAse hypersensitivity, following the treatment of hormones (Ciejek et al., 1983).
  • An HS III region located between -3200 / -2800 bp with respect to the site of initiation of transcription comprises the major sites of regulation by estrogens.
  • the deletion of this region abolishes most of the HSIII response, mediated by four repeating sequences of half ERE, separated from each other by a hundred nucleotides. These elements cooperate with the TATA box site, located nearby. Each site weakly fixes a receptor, but the cooperation of the different sites ensures a strong inducible character, in an environment of minimum promoter or heterologous.
  • This same region shows elements that inhibit gene expression, elements active in non-producing cells, but in a situation outside the oviduct (Kato et al, 1992; Muramatsu et al., 1995).
  • the HS II region includes the SDRE (Steroid Dependent Regulatory Element), located between - 800 to -585 bp, relative to the site (+1), of transcription demarcation. This region has homologies with the promoter of the NF-kappa B gene, suggesting controls by common factors (Schweers and Sanders, 1991).
  • WH protein family Chirp-I, Chirp II, Chirp III (Chicken ovalbumin Induced Regulatory Protein I) proteins also bind to SDRE only in the presence of estrogen and glucocorticoids (Dean et al., 1996 ; Dean et al., 1998; Dean et al., 2001).
  • this SDRE region becomes dependent on these hormones, if it is associated with the HSI region.
  • This HS I region localized from -350 to -32, is the NRE (Negative Response Element) region which controls the main negative regulation of the promoter. NRE suppresses gene expression in the absence of steroid hormones. The presence of NRE alone or of SDRE alone is not enough to regulate an exogenous gene.
  • Domain I The region -239 to -220 is a sequence of silencer type. The three zones have affinity for protein complexes specific to oviduct cells, but the most important are regions -280 to -252 and -134 to - 88. This region has the motif CAR (COUP Adjacent repression).
  • NRE The region called NRE is actually more complex than initially described (Haecker et al., 1995).
  • a positive regulation site which fixes the delta factor EF1 (Estrogen responsive transcription factor) has also been identified.
  • the interaction sites (-197 to -95) of progesterone and estrogens partially overlap (Dean et al., 1983; Dean et al, 1984). Downstream of the position of - 95 bp, additional deletions dramatically drop the rates of the transcripts observed (Knoll et al., 1983).
  • the orphan COUP-TF receptor Chovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor
  • COUP-TFII or ARPI The modes of action of COUP-TF and of the various related receptors (COUP-TFII or ARPI) are complex (Kimura et al., 1993) in a positive or negative sense for the regulation of transcription according to the protein partners involved.
  • ear2 in a non-exhaustive manner (Pereira et al, 1995); N-CoR (Nuclear Repressor Coreceptor) and SMRT (Silencing Mediator for retinoic acid and Thyroid hormone Receptor), (Shibata et al., 1997).
  • the locus of lysozyme is a locus more restricted in size than that of ovalbumin. It is estimated at around 40 kb (Sippel et al., 1978; Short et al., 1996).
  • Two MAR (Matrix Attachment Region) units located at -11.1 kb / -8.85 kb and +1.3 kb at +5.0 kb, located in relation to the site (+1) of the initiation of transcription more precisely delimit this locus at 22 kb .
  • These MAR sequences are composed of several sites for attachment to the protein matrix of the nuclear membrane (Loc and Strâtling, 1988; Phi-van and Strâtling, 1996; Phi-van, 1996).
  • MAR sequences to heterologous genes increases their transcription (Stief et al., 1989; Phi-Van et al., 1990).
  • MARs there is at least one origin of DNA replication in the lysozyme locus, an origin which contains several replication initiation forks (Bonifer et al., 1997; Phi-van et al., 1998; Phi-van and Strâtling, 1999). This point also seems to make the lysozyme locus quite particular in terms of cloning, certain parts being quite difficult to subclone into cloning plasmids.
  • the lysozyme gene in chicken comprises 4 exons and has significant homology with the genes for human and murine lysozyme. Several secondary sites initiating transcription have been identified, generally located in repeated sequences distributed over the entire locus (Von Kries and Strâtling, 1988). Expression regulatory sequences have been identified from -14 kb to + 6 kb, ie over the entire locus.
  • the lysozyme gene is expressed constitutively in mature macrophages, cells in which lysozyme is used as a differentiation marker, while its expression is placed under the control of steroid hormones in oviduct cells (Short et al.
  • the main enhancers and silencers are the regions E-6.1kb, E-2.7kb, E-0.2kb and N-2.4kb, Nl.Okb and N-0.25kb respectively.
  • Some are specific for myeloid cells (E-6.1 kb, E-2.7kb, E-0.2kb for mature macrophages and N-2.4 kb in fibroblasts and immature macrophages), (Steiner et al., 1987; Huber et al ., 1995).
  • the element E -6.1 kb provides most of the specificity.
  • the enhancer E-2.7kb is composed of 4 regions (I to IV). Region I fixes the factor FEF (c-fes Expression Factor), region II contains a recognition site for factor PU.l, of the EST family and is specific for macrophages (Ahne and Strâtling, 1994). All these different regulatory elements partially overlap, at least in the chicken gene, but not at the level of the mouse gene, a species in which an ancestral duplication separated the gene and its regulatory elements.
  • FEF c-fes Expression Factor
  • HRE steroid hormones
  • PRE for progesterone, and GRE glucocorticoids steroid hormones
  • PRE for progesterone, and GRE glucocorticoids steroid hormones
  • initiation of transcription of the promoter Renkawitz et al, 1982; Renkawitz et al, 1984a; Renkawitz et al, 1984b; Hecht et al, 1988.
  • two sites between -220 and - 140 bp and between - 80 to - 50 bp provide most of the regulation (Altschmied et al., 1989; Dolle and Strâtling, 1990; Von der Ahe et al, 1986).
  • N-1. Okb and N-0.25 kb inhibit transcription, even of heterologous promoters (Baniahmad et al., 1987; Faust et al., 1999).
  • TR thyroid hormone receptor
  • v- erbA the regulator NePl (negative Protein 1) also called CTCF (CCCTC-binding factor, (Burcin et al, 1997; Darling et al, 1993; Kohne et al., 1993; Bhat et al., 1994).
  • NePl is fixed at the FI part of 50 bp of N-2.4 while the TR mainly on the part F2 of this element.
  • Homodimeric or heterodimeric associations with other nuclear receptors modulate the level of transcription of this gene (Baniahmad et al., 1990; Arnold et al., 1996).
  • TR receptor is also an important element.
  • HNF-I alpha factor Hepatic nuclear Factor-I which is expressed in oviduct cells has a role in regulating the lysozyme gene.
  • the gene promoter contains two regions recognized by this HNF-I protein. This regulation of g expression not lysozyme by the NHF-I appears to have been lost in the phylogenetic level between birds and mammals (Grajer et al., 1993).
  • the conalbumin gene also known as ovotransferrin, was first identified in humans. It spans at least 33.5 kbp and includes 17 exons. The chicken gene is also organized into 17 exons and 16 introns, but only on 10.5 kb.
  • the messenger is 2376 bp in size (Cochet et al., 1979; Jeltsch and Chambon, 1982; Jeltsch et al., 1987; Schaeffer et al., 1987). Very few studies on the regulation of the expression of this gene have been carried out. The regulation of the stability of the messenger is particular. The molecule which is related to the family of transferrins, fixes iron in ionic form and regulates the stability and the level of transcription of its own messenger. Although many studies have been carried out on human transferrin and its receptor (CD71), little documentation exists regarding avian forms.
  • Example 3 Facilitating external elements
  • homologous recombination is a natural event which occurs especially at the time of meiosis, in order to ensure, in a simplistic statement, a mixing of genes and alleles.
  • the role of homologous recombination is much more difficult to interpret during a mitotic division.
  • the phenomena of homologous and non-homologous recombination nevertheless seem crucial as soon as the genetic material is damaged.
  • Many situations in the life of a cell and an organism thus expose genetic material. For example, a sudden defect in replication, radical ionization linked to radiation, oxidative stress, the action of endonucleases or topoisomerases, mechanical stress linked to mitotic segregation, can induce accidental double strand breaks.
  • the yeast favors homologous repair mechanisms, the upper eukaryotic cell seems to favor non-homologous splicing of these cuts, even if homologous repair is also observed. But in all cases, as genetic completeness is a prerequisite for any division, to deal with this critical situation of damaged material, the cell turns on a whole set of genes, responsible for repairing these cuts.
  • the Rad genes rad51, rad52, rad53 and rad54
  • the action of Rad 54 is evaluated at the time of introduction of the homologous recombination vector.
  • the first consists in carrying out a co-transfection of an expression vector for one of the proteins of the Rad family, in particular Rad 54 with the homologous recombination vector.
  • the second consists in transfecting the cells with a conditional expression vector for one of the proteins of the Rad family, in particular Rad 54.
  • the cells are first selected, stabilized and established to be transfected again with a homologous recombination vector, then induced to express the protein of the Rad family as much as possible.
  • Table 4 The action of Rad54 tested in terms of transfection efficiency is presented in Table 4 below:
  • the expression plasmid pRad54 (expression plasmid of the RAD54 protein under control of the CMV promoter) is co-transfected in the presence of the plasmid pOvaRH, recombinant plasmid containing no cDNA of interest.
  • the total quantity of plasmid is 5 ⁇ g of pOvaRH, in the presence of variable quantities of pRad54.
  • the molar complement being provided by a carrier plasmid, pMCS5 of commercial origin, is roughly the same size as pCMV Rad54.
  • S86N stem cells are seeded with 1x10 cells per dish in proliferation medium in the presence of feeder inactivated by irradiation.
  • the transfection mixture is added and the selection with neomycin applied for approximately 7 days.
  • the clones are then counted after fixing with methanol and staining with Wright / Giemsa. In conclusion, the presence of Rad54 does not seem to significantly modify the efficiency of obtaining clones.
  • the substitution substitution strategy used in the context of the invention makes it useful to use an active system (but possibly passive for specific proteins which would have the capacity) for the accumulation of the exogenous protein in the white of the egg.
  • the coding phases are placed under the dependence of the endogenous promoter of the endogenous targeted gene and are fused with a reference peptide signal.
  • the function of the peptide signal is to ensure the translocation of the protein towards the exterior of the cell through the various constituent elements of the secretory apparatus of the cells (reticulum, Golgi, etc.).
  • the signal peptides are intended to be cleaved during the protein maturation process. This then accumulates in the physiological fluid and in the egg white in particular.
  • signal peptides of the endogenous proteins are used, or signal peptides of other molecules, sequences known to be correctly treated.
  • the signal peptide of lysozyme is preferentially chosen because its structure is well known and the first 18 amino acids are cleaved during the export of the protein mature in the white of the egg.
  • this signal peptide belongs to a protein naturally accumulated in the white of the egg.
  • signal peptides used include those of interleukins, those of certain membrane receptors, those of growth factors secreted by different cell types, those of other proteins known to be secreted in different biological systems. The list is not exhaustive.
  • the commercial plasmid pCI Neo (Promega, Madison, US) is opened by HindIII digestion and ligated on itself intra-molecular to give the plasmid pCI Neo ( ⁇ HindIII) which places the neomycin phosphotransferase gene under the direct dependence of the promoter CMV.
  • the original polyA is retained.
  • the cDNAs of interest are prepared by PCR amplification with an oligonucleotide Sma-3'incDNA S containing the SmaI site, the 3 ′ part of the artificial intron of the commercial vector pCINéo and the start of the specific sequence of the cDNA in 5 ′, by omitting the cDNA ATG, in order to directly connect the reading frame of the cDNA of interest in phase with that of ovalbumin or lysozyme.
  • cDNA-Smal AS oligonucleotide containing the Smal site and the 3 'region of the cDNA of interest optionally omitting an endogenous cDNA polyA and the 3' oligonucleotide containing the specific sequence of cDNA and the Smal site.
  • the amplified PCR fragment is hydrolyzed by SmaI (subject to the absence of this site in the cDNA) and cloned into SmaI in a vector pMCS5 (Mobitech, Germany) in which a 277 bp polyA sequence has been previously cloned in Xbal. / XhoI.
  • This polyA sequence is itself derived from a hydrolysis by Xbal / Xhol of the vector pIRESHygro (Clontech).
  • the orientation of the fragment is then controlled by simple digestion with the supplied map of the cDNA of interest.
  • the amplified PCR fragment is subjected to the action of T4 DNA polymerase to make the ends blunt and directly cloned into the vector pMCS5 opened in SmaI (end franc).
  • the genomic DNA of embryos of 6 to 9 days of different strains including the CNR strain (Red Naked Neck) and the S86N strain, is extracted either according to a conventional method with an SDS Proteinase K lysis buffer, followed by extractions with phenol and chlorofrom phenol, either using a preparation kit (Promega kit, or Quiagen for example).
  • the different protocols give yields and qualities of DNA compatible with their use respectively the preparation of a genomic DNA library and the obtaining of a PCR fragment by direct amplification.
  • the genomic DNA is partially digested by the enzyme Sau3AI and the generated ends filled with Klenow polymerase in the presence of two of the four nucleotides necessary for synthesis.
  • the inserts thus partially filled are inserted by ligation into the vector ⁇ -GEM-12.
  • the vectors resulting from this operation are packaged in capsids of phages. For example, 3 independent isolates were generated and their titer determined, each isolate titer at 3 ⁇ 10 6 pfu / ml approximately. The quality of the bank was verified by studying a few random inserts. With an ovalbumin probe, obtained by genomic PCR with oligonucleotides chosen from the published sequence (Table 3), the phage screening makes it possible to obtain inserts, under clones in pBS SK + plasmid vectors to give the plasmid # 72.
  • the oligonucleotides OvaL 2995 S and OvaL 80 AS located at - 2995 bp and at + 80 bp respectively relative to the ATG of the ovalbumin gene amplify a region of 3075 bp, which , subjected to hydrolysis by Ncol, releases a fragment of 2860 bp.
  • a fragment called lyso 1-18 - intron is prepared by PCR amplification on the lysozyme locus with the oligonucleotides Lyso 1-18 and GE-IN-AS.
  • the latter oligonucleotide contains the 30 bp of the artificial intron of the plasmid pCINéo.
  • the two fragments (Ova5 'and Lyso 1-18 intron) are hydrolysed independently by Ncol, purified then ligated together and the amplification on the ligation product with the oligonucleotides OvaL 2995 S and GE-IN-AS gives the fragment Ova5' Lyso 1-18 of 3050 bp.
  • This PCR product is ligated with EcoRI adapters, which make it possible to clone this set either in the vector pBSK at the EcoRI site or in the pMCS5 digested at the end with EcoRV.
  • the cut plasmid is subjected to the action of Klenov polymerase in order to make the ends blunt before being ligated with Ascl adapters and ligated intramolecularly. This results in a plasmid pOvaLyso, which contains a unique site upstream of the Ova5 'arm, which will allow linearization of the final vector.
  • the amplification of the downstream region located between positions + 1657 and +7707 relative to the ATG of the ovalbumin gene with the oligonucleotides OvaL 1657 S and OvaL7707 AS give a fragment with a size of 6050 bp. This fragment was cloned at the EcoRV site of pMCS5 to generate the plasmid pMCS5-Ova3 'sense and pMCS5-Ova3' antisense.
  • the proximal amplifications with the oligonucleotides lyso 1789 S and GE-IN-Ceu-AS made it possible to isolate a fragment and to subclone it directly after treatment with T4 DNA polymerase and phosphorylation by the polynucleotide kinase in the commercial vector pMCS5 open-ended at EcoRV.
  • This 5 'pLyso fragment contains the 2900 bp partially unpublished sequence of the proximal part of the lysozyme gene as well as the equivalent of the first 18 amino acids of exon 1 corresponding to the peptide signal of lysozyme.
  • This fragment therefore contains a splice donor site as well as the sequence of the small artificial intron, sequence added by the oligonucleotide AS as described previously with the 5 ′ arm of the pova5 ′ vector.
  • the distal amplifications with the oligonucleotides Lyso 2859 S and Lyso 3185 AS made it possible to isolate a fragment of 2150 bp 3 ′ of the gene.
  • These oligonucleotides carry at their ends Scel and M sites.
  • the hydrolysis of this plasmid by Aflll / Avril followed by the action of T4 DNA polymerase and an intramolecular ligation makes it possible to generate the plasmid pLyso3 '.
  • the final assembly of the RH vector by successive contributions of different cassettes is carried out according to different patterns.
  • a scheme is described without being exclusive, other possibilities existing depending on the restriction sites present in certain cDNAs of interest.
  • the plasmid pCMV NéoOva3 ' is constructed by ligation of the fragment Ova3' which results from the purification after cleavage by BamHI of the plasmid pOva3 ', with the purified and dephosphorylated fragment pCMV Néo polyA, obtained by hydrolysis BglII / BamHI of the plasmid pCINeo ( ⁇ -hind ⁇ II ).
  • Some modifications of the polylinker present downstream of the Ova5'lyso insert are also carried out before combining the two fragments Ova5'lyso and pCMV-Néo-Ova3 'in a vector pOvaRH (FIG. 3).
  • the Nar1 / NotI fragment present in pOvaLyso is replaced by a NotI adapter to give pOvaLyso-NotI, which makes it possible to conserve the NotI site as a unique cloning site for the cDNAs of interest by eliminating numerous sites.
  • the plasmid pOvaLyso-Notl is initially cut initially with Pacl, then treated with T4 DNA polymerase to make the DNA blunt.
  • the release of the OvaLyso-Notl insert is then obtained by a Notl cut.
  • the 3kb OvaLyso PacI F / NotI fragment is cloned at the Kspl sites subjected to the action of T4 DNA polymerase in order to make the blunt / NotI ends of pCMV-Neo Ova3 '.
  • This oriented cloning makes it possible to generate the final pOvaRH vector which has from 5 'to 3':
  • the vector pOva RH can then be used to insert the different cDNAs of interest.
  • the Lyso 3 ′ fragment, obtained by the hydrolysis with M of the plasmid pLyso3 ′ is ligated into the plasmid plyso5 ′, previously opened and dephosphorylated after hydrolysis by MM.
  • the latter under cloning is carried out to flank the selection cassette of the Notl site in 5 ′, in order to preserve this site for the cloning of cDNAs of interest.
  • the vector pLysoRH obtained successively contains from 5 ′ to 3 ′: the unique site Ascl, which allows the linearization of the vector before transfection of the genomic arm Lyso5 ′ with the signal peptide 1-18 - start intron, the unique site Notl unique cloning site cDNA, the neomycin selection cassette, the genomic arm Lyso3 '.
  • the plysoRH vector can then be used to insert the different cDNAs of interest ( Figure 4).
  • the cDNAs of different proteins of interest or model proteins are inserted into these vectors pOvaRH and pLyso RH.
  • the strategy consists in preparing the cDNA according to the scheme presented above and in inserting it into the open vector in NotI. Variations in the order of cloning of the different parts may be necessary. Partial or total sequencing is carried out in order to verify the correct sequence of the different elements inserted.
  • vectors have been constructed with the cDNAs of erythropoietin pOvaRH Epo, pLysoRH Epo, beta-galactosidase pOvaRH LacZ, pLysoRH LacZ, heliomycin (antibacterial peptide pOvaRH Hélio, ply Hélio)
  • Figure 5 illustrates the pOvaRH LacZ.
  • the cDNA of interleukin 11 is a nucleotide fragment of 1100 bp, subcloned in the vector pBS SK in the EcoRI sites. As it is therefore not necessary to merge the cDNA of interest with the signal peptide of lysozyme, the cDNA is inserted directly in phase at the level of the ATG of ovalbumin, leading to a fusion at the level of the second amino acid of interleukin 11.
  • the cDNA of IL-11 is subjected to the action of the Taq polymerase in a PCR reaction in the presence of two sense oligonucleotides and antisense which present the Hind III and Xbal sites.
  • This fragment is thus subjected to the HindlII / Xbal double hydrolysis and ligated into the vector pMCS5, itself prepared open in HindIII / Xbal, after double hydrolysis by these enzymes and dephosphorylation treatment at CIAP.
  • the result of this directional cloning is the plasmid pMCS5- II- 11.
  • Electroporation is a method which allows DNA of very variable size to enter a cell by creating a transient pore at the level of an electric shock. of the cell membrane.
  • the cell concentration from 1 to 10 x 10 6 cells
  • the signal conducting solution containing the DNA cell mixture PBS, medium without serum
  • the concentration of DNA in general linearized from 5 to 25 ⁇ g
  • the distance of the electrodes cuvettes or simple electrodes directly in the dish or the culture well
  • the amplitude of the signal depending on the capacitance from 10 to 1000 ⁇ F
  • the applied voltage from 5 to 100 mV for square signals and from 200 to 350 V for non-square signals
  • the number of electric shocks delivered and the form of this electric shock (s) applied is meant the way in which the same electrical charge is delivered, in particular according to a square, non-square, inverse exponential signal ...
  • Table 5 illustrates some of these parameters:
  • the electroporation of the linear pCINéo plasmid is carried out using a BioRad electroporator (Geneuterer II).
  • the dissociated stem cells washed in a serum-free medium and adjusted to a concentration of 5 ⁇ 10 cells in 0.8 ml are placed in an electroporation cuvette (4 mm chamber).
  • 5 to 20 ⁇ g of linearized plasmid, prepared in TE are added to the cells and the mixture is left 5-10 min at room temperature, then the electric shock is applied with a capacitance fixed at 560 uF.
  • the cells are then placed at 4 ° C. for approximately 10 min, then seeded in culture dishes with feeder under the culture conditions for these cells.
  • the equivalent of a cuvette i.e. 5 x 10 6 cells, are distributed in two 100 mm boxes.
  • the table presents 3 series carried out with 15 ⁇ g of plasmid at 270 V.
  • the clones are counted after selection with neomycin for 7 days (250 ⁇ g / ml), fixation with methanol and staining with Wright / Giemsa
  • liposomes any chemical molecule having, among other characteristics of lipid cations, alone or associated with other elements.
  • the effectiveness of different liposomes has been compared on different cell types. Since embryonic stem cells are fragile, the presence of serum during transfection is an important element. Different commercial materials have been tested. It appears that the efficacy and toxicity of these components are variable (Pain et al., 1999). In addition, the presence of serum helps reduce the relatively toxic effects of exposure of cells to lipofectants and thus preserve the chances of obtaining recombinant cells in a satisfactory physiological and morphological state.
  • One advantage among others of the use of liposomes is the low number of cells used per test. Table 6 below illustrates a relative efficiency of transfection with a simple expression vector:
  • the cells are seeded in their respective medium at a density of 5 ⁇ 10 5 to 10 5 cells per 100 mm dish for each cell type.
  • the transfection mixture which can vary from 10.5 ⁇ g liposomes / 3.5 ⁇ g DNA to 15 ⁇ g liposomes / 5 ⁇ g DNA per 100 mm dish, is placed on the cells for 3 to 15 hours depending on the case.
  • the neomycin selection is applied at 250 ⁇ g / ml and the clones appear 5 to 10 days after transfection.
  • the clones are removed and analyzed by PCR in order to detect the recombination events.
  • a typical example of amplification consists of cloning a 24-well plate into a well, passing a 12-well plate into a well, then amplifying in a 60 mm or 100 mm dish.
  • the screening steps optimally implemented between the passage from the well of a 24-well plate to the well of a 12-well plate make it possible to limit the amplification to only clones detected positive by PCR.
  • Per well of a 6-well plate 5 ⁇ 10 5 to 10 6 cells are generally obtained. Thus, only viable clones screened positive by PCR are frozen in a viable manner.
  • the amplification for Southern blot analysis also concerns only a small number of clones.
  • the table brings together different examples obtained with cells of different natures and at different passages. It is necessary to note that the transfection and recombination efficiency appear to vary according to the vectors and for the same vector could be dependent on the physiology (age, state %) of the cells used.
  • the stable transfection efficiency is estimated by the number of clones obtained after selection by the drug which is detoxified by the gene present in the selection cassette.
  • neomycin was generally used.
  • Other drugs may be used depending on the presence of a different resistance gene in the transfected vector.
  • Other selection media can be used such as the addition of base analogs , classic selection media like HAT ...
  • the clones are counted at the end of the selection period corresponding to the disappearance of the cells in the control boxes of the experiment.
  • These controls are either non-transfected cells or cells transfected with a vector containing no gene for resistance to the antibiotic used.
  • Chicken Embryonic Fibroblasts are obtained from a culture of chicken embryos incubated for 9 to 13 days according to a well-established protocol known to the person of art. These primary cells are amplified and maintained in culture for a small number of passages (less than 30 in general) because the cells quickly present (generally from passages 15 to 20) a progressive phase of stopping proliferation and an entry in senescence characterized by a lower division rate, a spreading morphology less and less fibroblastic.
  • the transfections of the homologous recombination vectors are therefore carried out during the early passages (from 1 to 10), in order to optimize both the possibility of selecting and amplifying the clones resistant to selection but also to limit any possible karyotypic drift and rapid entry into senescence.
  • the clones obtained are isolable, but not or only slightly amplifiable. On the other hand, they can be considered as potential sources of modified nuclei for nuclear cloning experiments.
  • the LMH cell line is a chicken hepatocyte line, obtained by chemical carcinogenesis (Kawaguchi et al., 1987) This line has been characterized at the karyotypic level and exhibits significant polyploidy.
  • the cells are generally maintained in DMEM or HamF12, in the presence of 8% fetal calf serum, 2% chicken serum, 10%> TPB and antibiotics. These cells represent an interesting dendritic cell type, very different from monocyte cells, fibroblasts and stem cells and have a relative sensitivity to different steroid hormones. Transfections of pOvaRH recombination vectors, in particular in these cells, made it possible to obtain clones and recombination events. Table 6 illustrates the results of these transfections.
  • the HD11 cell line is a line of chicken monocytes immortalized by the presence of the v-myc oncogene provided by an avian retrovirus (Beug, et al., 1979). This line produces viruses, capable of propagating the oncogene. Certain clones could possibly be non-producers.
  • the cells are generally maintained in HamF12 medium, supplemented with 5% fetal calf serum, 2% chicken serum, 10% TPB.
  • activated macrophages produce quantities of endogenous lysozyme.
  • pLysoRH these cells can therefore serve as a production model for the molecule inserted into this vector. This produces a knock-in production strategy. Table 6 illustrates the results of these transfections above.
  • the chicken embryonic stem cells used in the examples are stem cells obtained in vitro by culturing chicken blastoderm cells (Pain et al., 1996; US 6,114,168; WO 96/12793) .
  • the cells are maintained, amplified in vitro and are above all capable of proliferating over long periods of time.
  • Proliferation profiles highlight phases of rapid and slower proliferation during the relative establishment of cells. This particularity of establishment from a primary isolate is quite unique for a cell of avian origin, without the external intervention of an immortalizing agent or a chemical transformation process. We can thus arbitrarily distinguish the early proliferation phases of these cells, which are observed during the first passages (from passage 1 to passage 20) and the later proliferation phases (passages> 20).
  • These stem cells are transfected with the various recombination vectors containing the cDNAs of interest.
  • Table 6 and Table 7 above illustrate the results obtained with different vectors. It appears that these stem cells can be modified in different loci by a homologous recombination approach.
  • Table 7 Transfection of CECs cells with different simple expression vectors 5 ⁇ g of vector pCINéo with 15 ⁇ g of Fugene 6 (Roche) is transfected in its circular form on 0.8 ⁇ 10 S86N16 cells at different passages. After applying the selection to neomycin by adding G418 (250 ⁇ g / ml) for 5 to 8 days, clones are obtained. The boxes are fixed with methanol (100%) and Giemsa staining makes it possible to quickly count the clones. This example demonstrates in independent tests that the cells are transfectable to stable with simple, selectable vectors and that the clones can be amplified. Nevertheless, the Expression levels of the transgenes are highly variable from one clone to another, as can be easily seen by evaluating the fluorescence intensity of the E-GFP marker for example.
  • physiological state By physiological state is meant the state of differentiation, transcription and activation of the cells used. Modified at the level of the loci targeted by the simple vectors and the homologous recombination vectors, the cells react at the physiological level. It therefore seems useful to monitor them according to their future use, the two main ones of which are:
  • the clones observed macroscopically and microscopically are removed and placed directly in a 24-well plate. It is important to collect the clones as soon as possible to limit the effects of mixing between clones.
  • the origin of the clones according to the different boxes is mentioned to control the level of independence of two positive clones for example.
  • the conditions for proliferation of the clones are roughly the same as those used for the parental cells.
  • the clones, once removed are observed daily and as soon as the cell density allows, the clones are dissociated and amplified for analysis.
  • a second PCR is carried out to detect a recombination event between an oligonucleotide external to the construction and a sequence common to all the vectors of the same family, for example the peptide signal sequence lyso 1-18.
  • This PCR is considered to discriminate for recombination events.
  • new series of PCRs are always carried out with the same external oligonucleotide but with another oligonucleotide specific for each cDNA so as to ensure its presence and the general non-modification of the inserted cDNA.
  • This PCR is considered to be discriminating and makes it possible to reinforce the observation of positive clones.
  • FIG. 6 illustrates this detection by PCR of clones. The majority of clones are detected negative, some detected positive recombined. This first sorting makes it possible to keep only a few clones which are amplified, frozen and analyzed by Southern blot.
  • the DNA is extracted with the Promega kit (Madison, WS).
  • the cell pellet of each clone is taken up in 300 ⁇ l of lysis buffer (Nuclei Lysis Solution, NLS), in the presence of 20 ⁇ g / ml of RNAse.
  • the lysate is homogenized, incubated
  • Protein precipitation buffer Protein Precipitation PPS solution
  • the whole is incubated at 4 ° C. after vigorous shaking.
  • the supernatant is removed after centrifugation and 400 ⁇ l of isopropanol added.
  • the pellet is washed with 70 ° C. efhanol, dried and taken up in 50 ⁇ l of TE (10.1).
  • the volumes can be used proportionally for extractions with more cells.
  • the quantity of DNA obtained is estimated by spectrophotometric assay.
  • the extraction of a pellet equivalent to one well from a 24-well plate gives approximately 0.5 to 2 ⁇ g of DNA depending on the density of the cells in the well.
  • the PCRs are carried out on approximately 100 to 500 ng.
  • a first PCR is carried out on 38 samples (Nos. 1 to 39) to detect the endogenous ovalbumin locus and ensure the quality of the extractions and DNA.
  • This reaction uses two oligonucleotides which gives an amplified band of size of 2950 bp (tracks 1 to 39 upper part of the gel).
  • a second PCR is carried out to detect a recombination event between an external oligonucleotide and the sequence common to all the vectors here, the peptide signal lyso 1-18 sequence.
  • the expected size in this case is 2900 bp (tracks 1 to 39, lower part of the frost).
  • Another PCR is carried out to determine by exclusion the sex of the positive clones with oligonucleotides specific for a repeated region of the chromosome W. Only the female clones (ZW) can be detected, the male clones (ZZ) will not be.
  • FIG. 7 illustrates this differential detection on a few clones.
  • the DNAs of different clones detected positive by PCR for a homologous recombination event are subjected to genomic PCR to determine the sex of the clones.
  • the oligonucleotides used are specific for the W chromosome of chicken. They can only detect female clones. In the figure, the clones are predominantly mal, like the cells used (S86N16), with the exception of clone A5-1, derived from early cells of another origin (S86N 48 cells).
  • Clones obtained with pOvaRH Hélio CIO, D21, C44, A5, A21, A5-1
  • the DNA of the clones is extracted according to a conventional method of Proteinase K-SDS, with phenolic extraction or using a commercial extraction kit (Qiagen, Promega).
  • Table 8 illustrates the detection of recombination events by Southem Blot according to the different probes used
  • Table 8 Detection of recombination events by Southern blot
  • the hydrolyzed DNAs are subjected to an electrophoretic migration which separates the fragments according to their size.
  • the classic Southern blot method is applied, with a transfer onto an N + hybond membrane (Amersham Pharmacia biotech, UK).
  • the probes used for hybridization are obtained either by PCR or by purification of a plasmid fragment containing the different genes of interest.
  • the lacZ (1159 bp) and Neo (354 bp) probes are obtained by PCR from plasmid matrix.
  • the 3 'ovalbumin probe is an intronic probe of 800 bp, obtained from genomic DNA.
  • the 5 'ovalbumin probe is an intronic probe of 870 bp. These probes are obtained by PCR.
  • the purified probes are labeled with alkaline phosphatase using the AlkPhos kit (Amersham Pharmacia Biotech, UK) and can be stored for several months at -20 ° C.
  • the membranes are prehybridized with stirring at a rate of 1 ml / cm 2 in a hybridization buffer and then hybridized at 55 ° C by addition of the labeled probe (5 ng / ml). The membranes are then washed at 65 ° C.
  • the primary buffer containing 2M urea 150 mM NaCl, 50 mM NaPhosphate, 1 mM MgCl 2, SDS 0.1 l% o and 0.2% blocking agent , supplied by the kit, then in the secondary buffer containing 50 mM TrisHCl pH 10.0, 100 mM NaCl at room temperature.
  • the ready-to-use chemiluminescence development system is added to the washed membrane (1 ml / cm2) and the intensity of the bands is revealed by autoradiography. The size of the detected bands is compared with the expected size.
  • the criterion for retaining the clones is a good match between the expected size and that observed. Complementary hybridizations are carried out (result not shown)
  • Figure 8 illustrates this analysis according to the expected sizes.
  • the different criteria used to characterize the parental cells are used to characterize the cloned cells.
  • the karyotype of the cells is analyzed on the metaphases of the cells obtained according to a conventional protocol after treatment with colcemide (takes a few hours with 0.05 to 0.15 ⁇ g / ml final, preferably 0.08 ⁇ g / ml) of the cells. proliferating cells.
  • the spread metaphases are observed under a microscope and the number of macrochromosomes counted. Counting the minichromosomes is feasible but more difficult and a more detailed evaluation by in situ hybridization can also be envisaged.
  • FISH in situ hybridization with a fluorescent probe
  • the first immunocytochemical test used is the detection of endogenous alkaline phosphatase activity. All the clones positive in PCR and validated by the Southem Blot analysis are studied compared to the parental cells.
  • the presence of the surface antigens specific for the stem cells is also sought in the recombinant clones obtained. Reactions with the antibodies SSEA-1, TEC-01 and EMA-1 are systematically carried out.
  • Telomerase activity appears to be one of the good criteria for judging the undifferentiated state of stem cells.
  • the telomerase activity of the various recombined clones is analyzed. During the passage of the clones for their amplification and freezing, a small aliquot of 5 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 5 cells is prepared in the form of a cell pellet and the telomerase activity of these cells is evaluated using the “Telo TAGGG Telomerase PCR Elisa” kit (Roche). The level of telomerase activity appears to be a good reflection of the quality of the clones, especially after the selection pressure applied by the drug.
  • the cells are seeded in wells of a 12-well plate with 10 cells per well on average.
  • the clones obtained and selected after the PCR and Southern blot analysis are a priori modified on a single allele (detection of the wild allele in Southem Blot analysis).
  • the two modified alleles can be obtained in vivo and in vitro.
  • animals homozygous for modification are obtained after crossing heterozygous animals, themselves descendants of chimeric animals, directly obtained after injection of the modified cells.
  • the allelic conversion of the second not yet modified allele is in particular possible by the application to the clones of a selection at high doses of the drug G418 (from 0.5 to 5 mg / ml). This approach makes it possible to obtain interesting quantities of proteins both in vitro and in vivo.
  • Example 7 In vitro test of the recombination vectors for the production of the proteins of interest.
  • the aim of the invention is to produce molecules in the physiological fluid of the animal, in particular blood and egg white.
  • the vectors in particular the homologous recombination vectors, are constructed according to the diagrams described above. These recombination vectors target different loci, mainly the ovalbumin and lysozyme locus.
  • An important point is the validation of these vectors by an in vitro approach. In particular, it is important to follow the folding of the protein to be produced, the post-translational modifications obtained in vitro in an avian system and the influence of the homozygous state of the modified locus on the expression of the molecule of interest. Secretion strategies are also studied via an in vitro model, with peptide signals and different splicing strategies depending on the constructs.
  • the in vitro differentiation of stem cell clones can be used to monitor the production of molecules in the supernatant of cultures.
  • the conditions of the media used call for the formation of embyroid bodies subjected to the presence of different agents such as inducers such as, for example, dimethylsulfoxide, retinoic acid, TPA, PMA, LPS, factors such as, for example, FGF, TGF ⁇ , MCSF, cMGF, hormones, such as hormones steroids, Poestradiaol, dexamethasone, progesterone or other families of hormones.
  • inducers such as, for example, dimethylsulfoxide, retinoic acid, TPA, PMA, LPS
  • factors such as, for example, FGF, TGF ⁇ , MCSF, cMGF
  • hormones such as hormones steroids, Poestradiaol, dexamethasone, progesterone or other families of hormones.
  • LMH cells are avian cells from a liver tumor. According to some examples taken from the literature, the ovalbumin gene seems to be activatable in the LMH line according to different hormonal stimulation conditions. In particular, a combination of insulin, estradiol and dexamethasone (steroid mimicking the action of glucocorticoids) allows a more or less significant induction of the ovalbumin gene. This stimulation can be used on recombinant clones of LMH cells. Co-transfections of the ER and COUTF nuclear receptors are also envisaged to increase the level of these receptors in the cells and thus allow better induction of the ovalbumin gene under the effect of the various inducers used. The vectors of the pOvaRH family are preferably used in this approach.
  • Table 10 illustrates this production of molecules of interest from HD11 cells recombined with one of the vectors of the pLysoRH family specifically under the action of inducer including LPS.
  • Table 10 Stimulation of HDll cells transfected with the vector pLyso RH Epo HD1 cells are transfected and recombinant clones obtained with the vector pLysoRH Epo. On the clones stimulated by LPS (5 ⁇ g / ml), two analyzes are carried out:
  • A an RT-PCR reaction to detect the messengers of endogenous lysozyme in induced non-transfected cells and the messengers of erythropoiety in clones of recombinant cells.
  • Example 8 Injection of the modified cells into recipient embryos and obtaining of animals.
  • modified stem cell clones are characterized like the parental cells using the various immunocytochemistry markers described above. At the end of these controls, certain clones are used to generate modified animals, intended to produce the molecule of interest. Among the different strategies used to produce these animals, we can distinguish:
  • the modified cells are injected into the blastodermal cavity of a recipient blastula stage embryo according to a protocol described previously (Pain et al., 1996. US Patents 6,114,168; WO 96/12793).
  • the embryos used in this approach are not incubated or just incubated.
  • the cells will participate in the colonization of the embryos.
  • Different complementary methods make it possible to evaluate the level of contribution of the injected cells, for example, one method is based on a phenotypic difference between a white unpigmented recipient strain and a colored donor strain (from which the cells used are derived). Another method is the monitoring of the presence of the transgene by genomic PCR using specific oligonucleotides.
  • FIG. 9 illustrates the phenotypic contribution of a clone modified with a simple expression vector.
  • Chimera obtained with cells modified by the simple vector pEGFP-SV40 Neo The eggs injected by the blastoderm route are opened at different stages and the embryos removed for analysis.
  • the extracted DNA is subjected to a genomic PCR reaction with different oligonucleotides to detect the presence of the transgene (here the E-GFP).
  • the upper part of the gel thus shows 21 samples analyzed, of which 11 detected positive out of the 15 injected embryos analyzed.
  • the lower part shows the analysis carried out with another pair of oligonucleotides, making it possible to validate the quality of the DNA and of the extraction.
  • embryonic cells modified by a simple expression vector can effectively contribute and colonize embryos.
  • Table 11 illustrates the production of chimeras with a recombinant clone.
  • Table 11 Different phenotypic chimeras obtained with a clone recombined by the vector pOvaRH Hélio, injected intra-blastodermally. The apparent rate of chimerism is variable.
  • the DNA of live chimeric animals was extracted from a feather biopsy and a PCR detection confirms the presence of the transgene in the samples (result not shown).
  • Intracardiac injection The modified cells are injected into the bloodstream via the intracardiac route of an embryo between 48 and 72 h of incubation. At this stage of development, the morphogenesis of the embryo allows significant accessibility to the developing cardiac cavity. Using fine capillaries the cells are injected directly. Development continues normally until hatching. Table 12 below illustrates the phenotypic contribution of clones modified in the tissues of embryos by intracardiac injection.
  • the cells of a clone modified with a simple vector in the example the clone 14A is obtained with the vector pVVS65 containing the pCMV E-GFP SV40 Neo) or a recombination vector are injected intracardiac directly into the circulation of a embryo incubated for a few hours (36 to 72 hours).
  • the tissues are removed from the embryos from 5 to 21 days depending on the case.
  • a genomic PCR makes it possible to detect the presence of the transgene, while another PCR on an endogenous gene validates the quality of the DNA analyzed.
  • Modified cells are sources of modified nuclei that can be used in nuclear transfer techniques in a recipient oocyte to reconstruct an embryo.
  • the modification made by the nucleus is directly carried by the animal in its genetic heritage and therefore transmitted to all its descendants.
  • Current techniques for fusing the cell and / or the single nucleus with the prepared oocyte make it possible to envisage such an approach.
  • the activation phases then allow efficient reprogramming of the donor nucleus in place of the haploid genetic material of the recipient oocyte.
  • Negative protein 1 which is required for function of the chicken lysozyme gene silencer in conjunction with hormone receptors, is identical to the multivalent zinc finger repressor CTCF. Mol Cell Biol 17: 1281-1288.
  • Hepatic nuclear factor 1 alpha (HNF-1 alpha) is expressed in the oviduct of hens and interacts with regulatory elements of the lysozyme gene. Biol Chem Hoppe Seyler 374: 319-326.
  • the DF-1 chicken fibroblast cell line transformation induced by diverse oncogenes and cell death resulting from infection by avian leukosis viruses.
  • a far upstream estrogen response element of the ovalbumin gene contains several half-palindromic 5'-TGACC-3 'motifs acting synergistically. Cell 68: 731-742.
  • quail Cotumix coturnix japonica
  • COUP-TF Chicken ovalbumin upstream promoter- transcription factor represses transcription from the promoter of the gene for omithine transcarbamylase in a mariner antagonistic to hepatocyte nuclear factor- 4 (HNF-4). J Biol Chem 268: 11125-11133.
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  • Palmiter, R. D., E. R. Mulvihill, et al. (nineteen eighty one). Steroid hormone regulation of ovalbumin and conalbumin gene transcription. A model based upon multiple regulatory sites and intermediary proteins. J Biol Chem 256: 7910-7916.
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  • Phivan, L., C. Sellke, et al. 1998. An initiation zone of chromosomal DNA replication at the chicken lysozyme gene locus. J Biol Chem 273: 18300-18307.
  • COUP-TF Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor
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  • COUP-TFI chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor I
  • N-CoR nuclear receptor-corepressor
  • SMRT retinoic acid receptor and thyroid hormone receptor
  • the lysozyme enhancer cell-specific activation of the chicken lysozyme gene by a far-upstream DNA element. Embo J 5: 719-724.
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  • Mrel l is essential for the maintenance of chromosomal DNA in vertebrate cells. Embo J 18: 6619-6629.

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'une cellule aviaire pour la production d'une protéine exogène d'intérêt dans un animal appartenant à l'espèce aviaire, ladite cellule étant transformée par un vecteur d'expression comprenant le gène codant pour ladite protéine, ladite cellule étant introduite soit dans la cavité sub-germinale d'un embryon, la circulation sanguine de l'embryon ou servant de source de noyau pour le transfert nucléaire dans un ovocyte énuclée ou non, ou dont les chromosomes ont été détruits.

Description

Système d'expression de protéines exogènes dans un système aviaire
La présente invention se rapporte à l'utilisation d'une cellule aviaire pour la production d'une protéine exogène d'intérêt dans un animal appartenant à l'espèce aviaire, ladite cellule étant transformée par un vecteur d'expression comprenant le gène codant pour ladite protéine, ladite cellule étant introduite soit dans la cavité sub-germinale d'un embryon, la circulation sanguine de l'embryon ou servant de source de noyau pour le transfert nucléaire dans un ovocyte énucléé ou non, ou dont les chromosomes ont été détruits.
Traditionnellement, les premiers principes pharmaceutiques étaient obtenus par extraction à partir de tissus de différentes origines tant végétales, animales que même humaines. Trois principaux facteurs ont contribué à la mise en place de substituts à cette technique d'extraction. La raréfaction des tissus en raison de l'augmentation de la demande, les risques inhérents aux dérivés animaux et humains ont augmenté, avec l'apparition ou l'identification de nouvelles pathologies, notamment virales et non conventionnelles. Enfin et surtout, la recherche et l'utilisation des découvertes des différentes branches de la biologie (biochimie, biologie moléculaire ...) ont permis de découvrir et donc de satisfaire la demande sans cesse croissante de nouvelles molécules.
Pour répondre à la demande en produit thérapeutique, les systèmes d'expression de molécules, comme les protéines à usage thérapeutique, ont été associés à une composante biologique active (bactérie, levure, cellule eucaryote supérieure...) et un élément génétique qui apporte le support nécessaire à la production. Les différents supports génétiques utilisés sont le plus souvent soient des vecteurs d'expression simples optimisés pour l'expression mais dont l'intégration demeure aléatoire soient des systèmes viraux ou rétroviraux. Ces derniers ne permettent pas non plus de contrôler ni le lieu et ni le niveau d'expression. Ces méthodes de production sont actuellement en train de vivre une nouvelle révolution tant numérique que qualitative. Ainsi, en l'espace de quelques années, grâce aux progrès constants, rapides de la génomique et de la biologie moléculaire, le nombre de molécules qui possède une ou plusieurs potentialités thérapeutiques et médicales a significativement augmenté. Par exemple, les anticorps à visée thérapeutique représentent déjà environ 50% de ces molécules. De plus, la complexité de ces molécules recombinantes s'est accentuée. Des simples peptides ou petites cytokines, produits facilement dans les bactéries, on arrive progressivement à des molécules complexes, avec une activité biologique strictement dépendante de leur structure secondaire, de leur repliement et de modifications post traductionnelles complexes. En conséquence, le simple moyen de production dans les bactéries ne suffit plus.
Des techniques plus sophistiquées ont alors émergé, parmi lesquelles on peut citer la culture in vitro de cellules eucaryotes, les levures et les cellules d'insecte. Plus récemment encore, les progrès réalisés en transgénèse végétale et animale ont été mis à profit pour produire ces molécules complexes soit dans des feuilles ou des graines d'espèces végétales (tabac, mais...) soit dans les liquides physiologiques des animaux comme le lait d'animaux (chèvre, vache, truie, lapin...). En outre, la corrélation entre l'efficacité de criblage d'un locus donné et son niveau de transcription, notamment au niveau des cellules ciblées par le vecteur dont les cellules souches n'est pas absolue. Ainsi, ces méthodes présentent toujours des problèmes tels que le coût de production, la quantité de produits obtenus et des difficultés techniques lorsqu'ils s'agit de produire des molécules complexes.
Pour résoudre ces problèmes, il est proposé dans le cadre de l'invention de produire des molécules thérapeutiques en ciblant l'expression dans des tissus spécifiques, notamment dans l'œuf et en particulier dans le blanc de l'œuf à l'aide d'animaux modifiés avec des cellules souches, elles même modifiées par des vecteurs de recombinaison. Les différentes étapes nécessaires à la mise en œuvre de l'invention impliquent d'abord la construction de vecteurs, qui permet le ciblage du locus choisi dans une cellule aviaire et en particulier une cellule souche, l'obtention de cellules recombinées qui intègre ce vecteur dans le locus choisi et la génération des animaux modifiés avec ces cellules.
Un des avantages de l'ensemble de ce système est le caractère contrôlé de l'expression de la protéine d'intérêt. En effet, l'action de remplacement substitution d'un locus endogène aviaire par un gène ou un fragment de gène exogène d'intérêt permet d'obtenir une production de la protéine exogène introduite en lieu et place du locus endogène. Par exemple, en introduisant dans le locus de l'ovalbumine le gène à produire par l'ensemble du mécanisme décrit, le produit de ce gène sera produit selon le profil d'expression de l'ovalbumine, parfaitement connu. Ainsi, l'invention apporte une solution aux problèmes soulevés par l'intégration au hasard d'une séquence hétérologue dont l'expression pourrait dépendre de son environnement chromatinien.
En outre et contrairement aux méthodes évoquées ci-dessus, le système de production aviaire de l'invention permet d'obtenir des quantités supérieures de substances actives à moindre coût étant donné qu'elles peuvent être facilement isolées et purifiées.
Un processus de recombinaison dans une lignée de cellules lymphoïdes (la lignée DT40) a été rendu possible grâce à un processus de recombinaison en raison d'une mutation particulière (la mutation affecte le niveau d'expression de la protéine Rad54) (Kim et al., 1990 ; Baba et al., 1988; Buerstedde et al., 1990 ; Buerstedde and Takeda, 1991 ; Bezzubova et al., 1993; Bezzubova et al., 1997). Dans cette publication, les auteurs reconnaissent ne pas avoir été en mesure d'effectuer de la recombinaison homologue avec des cellules ES.
Contrairement à cet enseignement, le demandeur a démontré qu'un processus de recombinaison homologue ciblé permet une expression d'une molécule exogène d'intérêt dans des systèmes aviaires et que ce même processus est maîtrisable au niveau expérimental dans différents types de cellules aviaires, dont des lignées, des cellules primaires et des cellules souches et cellules souches embryonnaires.
L'objet de l'invention est donc : - des vecteurs de recombinaison homologue pemiettant de cibler et de substituer, totalement ou partiellement les protéines de l'œuf et en particulier celles du blanc par des molécules d'intérêt,
- l'obtention de cellules souches aviaires spécifiquement modifiées aux loci ciblés par lesdits vecteurs, - l'utilisation de cellules aviaires spécifiquement modifiées par ces vecteurs pour une expression in vitro des molécules d'intérêt,
- l'obtention et la production de forte quantité de molécules d'intérêt par les animaux obtenus avec ces cellules aviaires spécifiquement modifiées par lesdits vecteurs de recombinaison. - La production des molécules d'intérêt dans des organes ou tissus desdits animaux de l'espèce aviaire permettant une extraction, une isolation et une purification simple et économiquement avantageuse.
L'ensemble de cette invention permet donc de proposer un système original de production de molécules d'intérêt selon un mode parfaitement prédictible car contrôlé tant au niveau spatial que temporel, apportant les réponses aux problèmes existant dans l'état de la technique.
DESCRIPTION
Ainsi, dans un premier aspect, l'invention se rapporte à l'utilisation d'une cellule aviaire pour la production d'une protéine exogène d'intérêt dans un animal appartenant à l'espèce aviaire, caractérisée en ce que ladite cellule est transformée par un vecteur d'expression comprenant le gène codant pour ladite protéine, ladite cellule étant introduite soit dans la cavité sub-germinale d'un embryon, la circulation sanguine de l'embryon ou servant de source de noyau pour le transfert nucléaire dans un ovocyte énucléé ou non, ou dont les chromosomes ont été détruits.
Par cellule aviaire, on entend une cellule précurseur, une cellule somatique, une cellule souche, une cellule souche embryonnaire (ES), une cellule pluripotente, une cellule totipotente, une cellule germinale, une cellule germinale souche (EG), une cellule germinale primordiale (PGC), un clone cellulaire des cellules précitées, une lignée établie à partir des cellules précitées ou un coips embryoïde obtenu à partir des cellules précitées. Les différentes cellules visées précédemment sont davantage définies ci-après :
- Par cellule précurseur, on entend toute cellule d'un tissu adulte ou embryonnaire partiellement différenciée et qui est capable de se diviser et de donner des cellules différenciées. - Par cellule somatique, on entend toute cellule d'un embryon ou d'un adulte, autre qu'une cellule germinale.
- Par cellule souche embryonnaire (ES), on entend une cellule non différenciée dérivant d'un embryon et qui a les potentialités de donner une très large variété de cellules spécialisées. - Par cellule souche, on entend toute cellule présentant la capacité à se diviser in vitro en culture pendant des périodes de temps infinis et capables de donner différents types cellulaires spécialisés.
- par cellule pluripotente, on entend une unique cellule qui a la capacité à se différencier en cellules dans les trois feuillets embryonnaires. - Par cellule totipotente, on entend une cellule présentant une capacité illimitée de prolifération, état limité à la cellule oeuf.
- par cellule germinale, on entend les spermatozoïdes et l' ovocyte, ou leurs précurseurs capables de donner un spermatozoïde et un ovocyte. Toutes les autres cellules sont des cellules somatiques. - Par cellules germinales souches (EG) , on entend les cellules trouvées dans une partie spécifique de l'embryon appelées les crêtes génitales, devenant les gonades dans l'organisme adulte. Ces cellules se développent normalement en gamètes matures.
- Par clone cellulaire, on entend tout ensemble de cellules génétiquement identiques à la cellule de laquelle elles dérivent par division.
- Par corps embryoïdes, on entend tout agrégat de cellules dérivant des cellules souches embryonnaires maintenues en culture. Les corps embryoïde ne participent pas au développement normal d'un embryon et s'observent seulement in vitro.
- Par lignée, on entend toute culture cellulaire capable de proliférer indéfiniment en gardant les mêmes caractéristiques phénotypiques.
I- Différents vecteurs peuvent être mis en oeuvre pour la transformation desdites cellules :
Le vecteur utilisé à cet effet, qu'il soit un vecteur de recombinaison soit un vecteur d'expression simple, permet une expression tissu-spécifique, en particulier dans l'oviducte, le foie, le sang, la moelle et les organes lymphoïdes.
1.1 Vecteurs de recombinaison.
Le vecteur de recombinaison homologue permet de cibler un locus endogène pour exprimer un gène d'intérêt en lieu et place de ce locus endogène. Au niveau de la chromatine, la recombinaison homologue est un processus qui consiste à remplacer partiellement ou totalement une partie d'un gène par une construction qui reprend en partie ou en totalité certaines séquences à l'identique de ce même gène. Les parties identiques permettent de réaliser l'échange de l'ADN apporté dans le locus endogène et d'introduire les parties modifiées dans l'environnement considéré et donc respecté du locus ciblé. Il en résulte une insertion dans le locus ciblé de modifications apportées par certaines parties de la construction. Les parties différentes de la construction permettent de contrôler l'expression des cassettes introduites. Ces cassettes sont soient dépendantes de leur propre promoteur, soient dépendantes de l'activité transcriptionnelle du locus ciblé, quand la cassette est placée sous la dépendance du promoteur interne. La réaction de recombinaison peut être divisée en trois grandes étapes :
- La première étape est l'appariement des régions homologues, conduisant à une structure transitoire 'trois brins' du DNA.
- La seconde étape est la réalisation d'un double crossing over indépendants dans les régions d'homologies, conduisant à la formation d'une molécule hybride entre le chromosome ciblé et le vecteur introduit
- La troisième est l'intégration de ce vecteur comme élément génétique stable du chromosome ciblé, la modification étant alors propagée comme l'ensemble du matériel génétique avec les divisions cellulaires
Tout élément, présent dans le système ou apporté de façon stable ou transitoire qui contrôle, modifie ou influence ces différents mécanismes aura une contribution essentielle dans le processus de recombinaison et donc dans l'efficacité d'intégration du vecteur.
Dans le cadre de l'invention, le vecteur de recombinaison qui permet de produire les molécules dans le système aviaire, notamment chez le poulet n'est pas un simple vecteur de destruction, mais un vecteur de remplacement substitutif. Ces vecteurs complexes sont le résultat de l'association ordonnée et successive dans un plasmide de clonage classique (pBSK, pUC,...) d'au moins un des éléments suivants :
Un fragment d'ADN génomique, de taille variable, pris en amont de l'ATG (site de démarrage de la traduction) du gène ciblé. Cet élément constitue le bras 5'.
Un cDNA ou une partie du ou des gènes d'intérêt, placé directement sous la dépendance de l'ATG du gène ciblé endogène. Cette association des fragments est dans la plupart des cas directement réalisée par une fusion sur l'ATG du locus ciblé avec le deuxième acide aminé de la protéine. De plus, pour permettre l'exportation directement dans l'œuf de la protéine d'intérêt, une séquence nucléotidique spécifiant un peptide signal doit être placée en amont du cDNA d'intérêt et en aval des signaux du gène ciblé. Elle est soit apportée soit par le fragment d'intérêt, soit par une séquence nucléotidique exogène supplémentaire.
Par cDNA, on entend toute ou partie d'une séquence codante d'acide nucléique pour une protéine d'intérêt.
Par protéine d'intérêt, on entend une protéine, un fragment d'une protéine ou un peptide qui présente un intérêt thérapeutique pour l'homme ou l'animal, mais aussi toute forme protéique susceptible d'apporter à l'homme ou à l'animal un bienfait quant à son statut physique, sa santé, son comportement ou sa vitalité, ce qui comprend notamment une protéine ou un peptide d'intérêt endogène et une protéine ou un peptide d'intérêt exogène définie ci-dessous :
Par protéine d'intérêt endogène, on entend toute protéine présente dans le système, l'œuf en particulier, présente à des niveaux variables mais détectables dans une situation physiologique normale.
Par protéine d'intérêt exogène, on entend toute protéine d'origine exogène au système, non identifiée dans le système, l'œuf en particulier, dans un état physiologique normal. Sa présence est le résultat direct ou indirect de la modification génétique et /ou biochimique induite par le vecteur dans le système.
Une cassette de résistance (dite cassette de sélection positive à un système exogène de sélection) constituée généralement d'un promoteur, d'un cDNA qui apporte la résistance à la sélection exogène et d'une séquence poly A permettant l'arrêt de la transcription de cet élément transcriptionnel indépendant. Le promoteur peut être de différentes origines.
Un fragment d'ADN génomique, de taille variable, pris en aval de ces différents éléments et donc de l'ATG du gène ciblé. Ce fragment présente en général une taille différente du fragment d'ADN génomique situé en 5'. Cet élément constitue le bras 3'. Une cassette supplémentaire dite de sélection négative peut être incorporée dans ce vecteur. Elle est alors en général intégrée en aval du bras génomique 3'. Située en 3' du bras d'homologie 3', cette cassette ne persiste pas dans le génome de la cellule ciblée si l'intégration a lieu selon le schéma correct. Seuls les événements non recombinés correctement sont sensibles à cette action.
Au moins un site de linéarisation unique sur le vecteur, recommandé par l'expérience. Cette étape semble nécessaire pour l'introduction efficace de ce vecteur dans le patrimoine génétique de la cellule ciblée.
Différents éléments permettant notamment des modifications conditionnelles peuvent être insérés à différents endroits de la construction
Les principales caractéristiques d'un vecteur de recombinaison tel qu'ils sont décrits à ce jour dans les systèmes mammifères tiennent dans la succession des différents éléments au sein du plasmide et dans le positionnement des bras génomiques (origine du DNA, taille des éléments génomiques homologues, dissymétrie relative...). Dans la majorité des cas, la fréquence de recombinaison observée in vitro est dépendante du locus ciblé donc de l'environnement cl romatinien ciblé (Ramirez-Solis et al., 1993 ; Hasty et al., 1995 ; Hasty et al., 1991). Cet environnement est étroitement lié à la physiologie de la cellule. Il apparaît que la pression de sélection appliquée sur les cellules transfectées permet un nombre d'intégrations majoritairement non homologues par rapport au nombre d'intégrations homologues. Le processus de criblage, dont le principe et les exemples sont développés dans le texte permet de distinguer les deux types d'événements. Connaître, évaluer et maîtriser la proportion d'intégration homologue est essentielle pour une stratégie d'expression satisfaisante. La fidélité de la recombinaison entre les fragments apportés et ceux d'origine doit également être la meilleure possible. Cela semble être le cas au moins pour les cellules ES de souris et les fibroblastes humains (Zheng et al., 1991; Lederman et al., 2000 ; Templeton, 2000). Par ailleurs, la seule composition en base d'un locus peut fortement influencer les efficacités de recombinaison, notamment par la forte présence de nombreux îlots CpG (Yanez and Porter, 2000). D'autres éléments cryptiques (séquence poison) peuvent également modifier l'efficacité du processus de recombinaison homologue (sites d'initiation de réplication, séquences répétées...). De plus, la fréquence de recombinaison homologue semble très dépendante de la cellule cible, avec des situations particulières comme pour la lignée de cellules lymphoïdes DT40 de poulet, qui présente des taux de recombinaison impressionnants (> 10%). Cette spécificité est liée à une sur-expression de la molécule Rad54, sans doute liée à une mutation, non encore identifiée qui intervient dans le contrôle du niveau de régulation de ce gène (Bezzubova et al., 1993 ; Bezzubova et al., 1994 ; Bezzubova et al., 1997). Cette observation peut donner lieu à une augmentation de la fréquence de recombinaison .
Dans le cadre de l'invention, on a démontré l'efficacité de la recombinaison homologue dans des cellules embryonnaires aviaires et certaines autres cellules aviaires primaires qui ont été établies en lignée.
Dans un mode complémentaire de réalisation, on peut faire surexprimer Rad54 ou une protéine de la famille rad dans le but d'améliorer l'efficacité du processus de recombinaison.
Longueur des fragments homologues
Quelques études réalisées dans des cellules souches embryonnaires de souris sur différents loci indiquent qu'une longueur minimum des bras 5' et 3 ' d'homologie est nécessaire pour assurer une recombinaison au locus avec une fréquence satisfaisante (Hasty et al., 1991; Thompson et al., 1989 ; Thomas and Capecchi, 1987). Si une taille minimale de 250-500 bp semble être suffisante pour assurer un événement de recombinaison d'un des deux cotés, le paramètre clef serait plus la longueur totale d'homologie que la taille respective des bras d'homologie (Elliott et al, 2001 ; Philips and Calos, 1999 ; Fujitani et al., 1995). Cette limite serait de 5 à 6 kb au minimum. L'extrapolation des résultats à partir des données très complètes obtenues chez les bactéries, pourrait indiquer que le facteur limitant dans une efficacité de recombinaison ne serait pas au niveau de la recherche des homologies entre les fragments d'ADN donneurs apportés par le vecteur et les parties d'ADN receveurs du locus à cibler (Yancey- rona and Caerini-Otero, 1995), mais plutôt dans le système d'échange entre ces fragments qui succède à Fappariement. Néanmoins, une grande prudence reste de mise quant à l'interprétation de ces résultats et leur extrapolation dans le système eucaryote, éventuellement sensibles à la présence de points facilitants ('hot spot') la recombinaison dans des loci particuliers.
Les loci d'immunoglobulines semblent à cet égard très particuliers. Des événements d'intégration homologue d'un vecteur ne présentant une homologie que dans le bras en 3' ont été observés (Berinstein et al., 1992). Par ailleurs les recombinaisons dans les loci d'immunoglobulines apparaissent particulier en raison de l'activité des sites reconnus par les recombinases propres à ces gènes. Certaines interférences avec l'équipement de ces cellules et le processus de recombinaison pourraient être observées.
Ainsi, dans un aspect particulier, le vecteur est un vecteur de recombinaison homologue possédant des bras 5' et 3' d'homologie aux séquences d'un locus donné. Le locus ciblé est sélectionné par exemple parmi le locus de l'ovalbumine, des ovomucoïdes, de la conalbumine et du lysozyme.
A ce titre le vecteur comporte des segments hétérologues :
Cette présence d'une partie importante homologue est d'autant plus nécessaire que les segments hétérologues sont importants (Kumar and Simons, 1993). Ainsi, l'approche isogénique (Te Riele et al., 1992) est renforcée par l'observation de baisse de fréquence de recombinaison homologue en cas d'interruption de long fragment d'homologies par des 'stretchs' variables, liés à la présence de polymorphisme d'un locus (Lukacsovich and Waldman, 1999). Mais la présence symétrique de segments hétérologues, situés en amont des éléments d'homologies propres peut également renforcer les niveaux d'intégration homologue du vecteur. Cette présence protégerait les homologies des dégradations induites par des exonucléases. Induction d'une coupure ciblée
Toute induction ciblée (par une méganucléase par exemple) d'une coupure double brin, coupure spécifique et rare dans le DNA de la cellule ciblée accroît les fréquences de recombinaison. Il semblerait que cette induction déclenche le système de réparation et facilite l'incorporation du DNA exogène (Bibikova et al., 2001 ; Sargent et al., 2000 ; Donoho et al., 1998 ; Sargent et al., 1997; Brenneman et al., 1996 ; Hasty et al, 1992b). Cette approche est utilisée notamment en introduisant un site spécifique reconnu par une méganucléase, notamment de type I-Scel ou autre, afin de favoriser les événements de recombinaison (Sarig et al., 2000 ; Cohen-Tanoudji et al, 1998; Robine et al., 1998 ; Jasin et aL, 1996) .
Linéarisation d'un vecteur
Des tests comparatifs entre vecteurs linéaire et circulaire ont été réalisés. Dans le système murin, il semble que la linéarisation soit un préalable nécessaire pour accroître les fréquences. D'autres actions de délivrance ont parfois une influence (Yanez et Porter, 1999).
Structure conditionnelle des vecteurs d'expression
Les différents éléments présents actuellement dans les vecteurs sont actifs de façon constitutive une fois l'événement de recombinaison homologue réalisé. Or l'expression d'une protéine exogène dans l'œuf peut entraîner une éventuelle toxicité à la fois au niveau du tissu qui va assurer la production et éventuellement au niveau de l'œuf, lieu d'accumulation final. Cette accumulation doit donc pouvoir être induite et décidée tant au niveau temporel que spatial. Une des approches possible est l'utilisation de systèmes inductibles et conditionnels.
Par système inductible on entend par exemple le système appelé Tet off/tet on. Ce dernier est constitué de deux éléments : le donneur et l'opérateur. Le système donneur comprend lui même une construction génétique dérivée d'un système de résistance à la tétracycline, identifiée dans un transposon bactérien TnlO. En l'absence de tétracycline, la protéine répresseur TetR, exprimé constitutivement bloque la transcription du gène assurant la résistance à la tétracycline. En présence de la tétracycline, le répresseur ne peut plus se lier aux séquences de contrôle. Ce système a été mis à profit en fusionnant cette séquence tetR avec le domaine transactivateur de la protéine virale NP16 (Gossens and Bujard, 1992), brevet US Ν° 5, 589,362. Il en résulte les protéines tTA (pour Tétracycline controlled Trans Activator) pouvant agir sur le promoteur lui même modifié TetO (pour Tet Opérateur). Dans le cas des vecteurs décrits dans l'invention, un premier vecteur 'donneur' (vecteur simple ou ciblant par recombinaison un locus spécifique du tissu oviducte par exemple) est introduit dans la cellule souche et les éléments sensibles à l'action de la tétracycline sont placés au sein de la construction de recombinaison qui cible le locus de l'ovalbumine par exemple. Ces éléments sont insérés dans une région du promoteur ovalbumine pour contrôler au niveau transcriptionnel le niveau de protéine exprimé.
Parmi les autres systèmes inductibles on peut citer les fusions de ces différents acteurs (NP16, Gal4...) avec des séquences protéiques de contrôle comme certains récepteurs aux hormones nucléaires, plus ou moins modifiées pour répondre de façon spécifique à la présence d'analogue d'hormones (ER Muté liant le tamoxifène (Metzger et al., 1995 ; Indra et al., 1999), l'ecdysone Récepteur, le PR liant le RU486...).
Par système conditionnel on entend par exemple les systèmes mettant en œuvre certaines enzymes comme certaines recombinases. Ces enzymes reconnaissent des petites séquences particulières et spécifiques (séquences loxP pour l'enzyme CRE, séquence FLP pour la FRT recombinase...) qui sont alors insérées dans la construction à contrôler. Le mode d'action général est de procéder à une délétion des éléments situés entre ces séquences lors de l'action de la recombinase. L'introduction de la recombinase est effectuée par différentes voies (transfection transitoire, expression stable intégrée...) et son expression conditionne la réaction d'excision au niveau des séquences introduites.
En combinant la présence de ces recombinases avec les systèmes inductibles par les récepteurs des hormones nucléaires, on rend l'ensemble du système conditionnel inductible. Ainsi, on peut par exemple fusionner la CRE recombinase avec la forme mutée du ER, sensible au tamoxifène. Ce système a été mis à profit dans le système murin (Metzger and Chambon, 2001; Nallier et al., 2001). D'autres systèmes ont été décrits pour le système murin comme le FLT-EcDR (Sawicki et al., 1998).
Eléments de base des constructions L'origine des éléments de base des vecteurs est variable. Les squelettes des principaux plasmides sont d'origine commerciale. Ils permettent une propagation facile des constructions qu'ils portent dans un environnement bactérien bien maîtrisé, celui de E. coli, même si différentes souches sont utilisées. Ainsi, les plasmides pBSK, pMCS5, pCI Νéo sont utilisés pour être une base générale à beaucoup de vecteurs intermédiaires ou terminaux
Les cassettes de sélection positives sont constituées : d'un promoteur provenant de différentes origines, virales comme par exemple le promoteur CMN (cyomégalovirus), le promoteur du virus SV40, la LTR du RSN ou non virales comme des promoteurs de gènes ubiquitaires (comme le promoteur b-actine de poulet) ou des promoteurs de gènes spécifiquement exprimés à certaines phases de développement ou des promoteurs de gènes spécifiquement exprimés dans certains tissus. Un cas particulier est d'utiliser un promoteur spécifique de l'état de cellule souches. d'un gène codant pour une résistance 'positive' à un antibiotique comme par exemple le gène de résistance à la néomycine, à l'hygromycine, à la puromycine, à la phléomycine, à la zéomycine, à la blasticidine, à la viomycine mais aussi le gène DHFR (dihydrofolate reductase) assurant la résistance au methotrexate, le gène HPRT (Hypoxanthine phosphoribosyl transférase) assurant la transformation de bases spécifiques présentes dans le milieu de sélection HAT (aminoptérine, hypoxanthine, thymidine) ainsi que d'autres gènes assurant les détoxifications vis à vis de certaines drogues. Les cassettes de sélection négatives sont constituées :
- d'un promoteur comme précédemment décrit
- d'un gène assurant la transformation d'un substrat présent dans le milieu de culture en une substance toxique pour la cellule qui exprime le gène. Parmi ces molécules, on peut citer les gènes de détoxification de la toxine diphtérique (DTA) (Yagi et al, 1998; Yanagawa et al., 1999), le gène de la thymidine kinase du virus Herpès (HSV TK), sensible à la présence de gancyclovir ou de FIAU. Le gène HPRT peut également être utilisé comme sélection négative par addition dans le milieu de la 6-thioguanine (6TG).
- et pour l'ensemble des sélections positives et négatives, d'une séquence poly A de terminaison de transcription de différentes origines dont les plus classiques sont celles dérivées du poly A de SV40 ou d'un poly A de gène eucaryote (hormone de croissance bovine, b-globine de lapin...).
- Un cas particulier est la mise de la cassette de sélection positive sous la dépendance directe du locus endogène ciblé. Cette approche requiert la fonctionnalité, donc l'activation transcriptionnelle du locus ciblé pour pouvoir être utilisée et donc de lier la sélection des clones après transfection à un état de différenciation ou de non différenciation particulier. Ces exemples ne sont pas limitatifs.
Ainsi, le vecteur de recombinaison homologue selon l'invention comprend dans une base plasmidique un enchaînement de au moins un élément pris successivement parmi h) un fragment d'ADN génomique contenant le bras d'homologie 5' du gène ciblé fusionné à, h) une séquence nucléotidique signal de sécrétion fusionnée à, h) une courte séquence nucléotidique intronique fusionnée à, h) la séquence nucléotidique codante pour la protéine d'intérêt fusionnée à, h) une séquence poly A de terminaison de la transcription fusionnée à, h) une cassette de sélection positive comprenant un promoteur, un gène de résistance à un agent de sélection et une séquence poly A de terminaison de transcription, ladite cassette pouvant être fusionnée à, h) un fragment d'ADN génomique contenant le bras d'homologie 3' du gène ciblé, h) une cassette de sélection négative comprenant un promoteur, un gène assurant la transformation d'un substrat présent dans le milieu de culture en une substance toxique pour la cellule qui exprime le gène et une séquence polyA de terminaison de transcription. - Par promoteur, on entend toute séquence nucléotidique capable d'assurer et de diriger l'initiation de la transcription d'un gène placé en aval de cette séquence.
Ce vecteur peut également comprendre d) la séquence codante pour la protéine exogène fusionnée en son extrémité 5' avec c) une courte séquence intronique en particulier comprenant la séquence SEQ ID N° 1 elle-même fusionnée avec e) une séquence peptide signal de sécrétion, en particulier la séquence codante pour le peptide signal du lysozyme comprenant la séquence SEQ ID N° 2.
Le vecteur selon l'invention peut également comprendre d) la séquence codante pour la protéine exogène fusionnée en son extrémité 3' avec une séquence poly A. Le vecteur peut également comprendre au moins une séquence IRES en fusion avec au moins deux séquences codantes pour la protéine d'intérêt exogène ou au moins une séquence IRES en fusion avec au moins deux séquences codantes pour différentes chaînes constituant une protéine d'intérêt, en particulier les chaînes lourde et légère d'un anticorps de quelque nature que ce soit, en particulier un anticorps monoclonal, un fragment fab.
Parmi les IRES, on choisit les IRES de groupe I ou de groupe II, en particulier les séquences V130 (Brevets US 5,925,565 ; FR 95/00894), Idemfix et Zam (WO 99/29844), (Leblanc et al. 1997 ; 1999).
1.2 Vecteur d'expression simple
Ces vecteurs sont caractérisés par l'association successive d'un promoteur, d'un cDNA ou d'une partie d'un gène, d'une séquence poly A, permettant l'arrêt de la transcription. Après transfection de ces vecteurs dans des cellules eucaryotes, ces vecteurs présentent l'avantage et l'inconvénient de s'intégrer au hasard dans le génome. L'efficacité est souvent bonne et un grand nombre de sites d'intégration peuvent être obtenus. Cependant, le côté aléatoire de cette insertion rend l'expression à partir du promoteur porté par le vecteur dépendante de l'environnement du site d'insertion (méthylation, imprinting, enhancer, silencer...). Ainsi, parmi les promoteurs utilisables dans le cadre de l'invention répondant à ces difficultés et utilisés dans un but d'expression tissu spécifique, on peut mentionner de façon non exhaustive le promoteur du gène du lysozyme (de 2500 à 100 bp), mais aussi le promoteur du gène de l'ovalbumine, dans des formes longues (de 5 à 1 kb) contenant des régions de régulations positives et négatives ou courtes (de 1000 à 100 bp), sachant qu'un promoteur minimal de 100 bp environ peut être spécifiquement activé par différentes hormones (Monroe and Sanders, 2000).
L'exemple 1 ci-après illustre les possibilités d'obtention de clones de cellules souches avec de tels vecteurs simples d'expression.
Le vecteur utile dans le cadre de l'invention peut donc être un vecteur d'expression comprenant la séquence codante pour la protéine d'intérêt fusionnée avec au moins un élément pris parmi a) un promoteur, en particulier sélectionné parmi les promoteurs des gènes de l'ovalbumine, des ovomucoïdes, de la conalbumine et du lysozyme, b) une séquence peptide signal c) une séquence nucléotidique polyA de terminaison de transcription.
Ce vecteur d'expression et le vecteur de recombinaison peuvent comprendre une séquence IRES fusionnée avec au moins deux séquences codantes pour la même protéine d'intérêt ou pour des séquences codantes différentes.
Les vecteurs précités permettent de transformer une cellule aviaire telle que définie précédemment.
Avantageusement, ladite cellule est une cellule aviaire embryonnaire primaire, une cellule aviaire embryonnaire souche, en particulier les cellules embryonnaires souches issues de la mise en culture de blastodermes. - par blastoderme, on entend un embryon aviaire à un stade précédant la gastrulation et comportant une organisation cellulaire simple avec au moins deux couches de cellules séparées par une cavité.
La cellule embryonnaire aviaire de l'invention présente un phénotype alcaline phosphatase positive, en particulier un phénotype de cellule souche embryonnaire alcaline phosphatase positive.
Les cellules embryonnaires aviaires, les cellules souches embryonnaires et les cellules germinales embryonnaires se caractérisent en ce qu'elles réagissent spécifiquement avec au moins un anticorps sélectionné parmi ECMA-7, SSEA-1, SSEA-3, TEC-01, EMA-1 et EMA-6.
La cellule selon l'invention peut également être une cellule aviaire primaire de phénotype défini en particulier pour un fibroblaste primaire, une cellule épithéliale, une cellule endothéliale.
Dans un mode particulier de réalisation, la cellule est une cellule aviaire dérivée d'une cellule embryonnaire primaire et établie spontanément en culture ou à l'aide de différents agents immortalisants, en particulier les cellules dérivées des cellules souches embryonnaires induites à différencier sous l'action de différents agents inducteurs en particulier l'acide rétinoïque, le diméthylsulfoxide, le TPA ou de conditions de cultures spécifiques, en particulier par la formation de corps embryoïdes (voir définition ci- dessus).
Alternativement, la cellule est une cellule aviaire établie en lignée, en particulier les cellules hépatiques LMH, les cellules monocytes HD11 et les cellules fibroblastiques QT6.
Comme évoqué précédemment, ladite cellule peut être transformée avec un vecteur d'expression exprimant une protéine de la famille Rad, en particulier la protéine Rad54. Ainsi, dans un deuxième aspect, l'invention se rapporte à un procédé d'obtention d'une cellule aviaire modifiée par un des vecteurs définis ci-dessus. Ce procédé peut comprendre les étapes suivantes a) introduction du vecteur défini selon l'une des revendications ci-dessus dans une cellule embryonnaire aviaire par une méthode de transfection, en particulier à l'aide d'un liposome, d'un polycation ou par électroporation b) sélection des cellules par l'addition d'un agent de sélection dans le milieu de culture, en particulier la généticine dans une gamme de concentration de 100 à 500 μg/ml c) criblage des clones résistants et amplification.
De préférence, cette sélection est réalisée pendant au moins environ 2 à 10 jours, notamment 2, 3, 4, 5 ou 6 jours.
Avantageusement, l'invention se rapporte à un procédé d'obtention d'une cellule aviaire modifiée par un des vecteurs définis ci-dessus comprenant les étapes suivantes : a) introduction du vecteur défini selon l'une des revendications ci-dessus dans une cellule embryonnaire aviaire par une méthode de transfection, en particulier à l'aide d'un liposome, d'un polycation ou par électroporation b) sélection des cellules par l'addition d'un agent de sélection dans le milieu de culture, en particulier la généticine dans une gamme de concentration de 100 à 500 μg/ml c) obtention de clones recombinés génétiquement stables présentant une morphologie et des caractéristiques similaires aux cellules parentales (taux d'alcaline phosphatase endogène, réactivité à des anticorps de surface, et activité télomérase) d) criblage des clones résistants et amplification des cellules résistantes résultantes correctement recombinées.
Dans un aspect particulier, le vecteur de recombinaison cible le locus du lysozyme. L'invention a également trait à un procédé mentionné précédemment caractérisé en ce que le surnageant de culture des clones recombinés contient la protéine exogène d'intérêt, en particulier après induction du clone à l'aide de différents inducteurs,en particulier l'acide rétinoïque, le diméthylsulfoxide, le TPA ou de conditions de cultures spécifiques, en particulier par la formation de corps embryoïdes.
Dans ce procédé, les deux allèles du locus ciblé sont de préférence modifiés.
De plus, les cellules sont des cellules aviaires embryonnaires primaires, des cellules aviaires embryonnaires souches, en particulier les cellules embryonnaires souches issues de la mise en culture de blastodermes. Ces cellules présentent un phénotype alcaline phosphatase positive, en particulier un phénotype de cellule souche embryonnaire alcaline phosphatase positive.
Les cellules embryonnaires aviaires du procédé se caractérisent en ce qu'elles réagissent spécifiquement avec au moins un anticorps sélectionné parmi ECMA-7, SSEA-1, SSEA-3, TEC-01, EMA-1 et EMA-6. Parmi les cellules obtenues selon le procédé de l'invention, on peut citer en outre les cellules aviaires primaires de phénotype défini en particulier pour un fibroblaste primaire, une cellule épithéliale, ou une cellule endothéliale.
L'invention se rapporte également à un procédé défini ci-dessus dans lequel les cellules sont des cellules aviaires dérivées d'une cellule embryonnaire primaire et établie en lignée à l'aide de différents agents immortalisants, en particulier les cellules dérivées des cellules souches embryonnaires induites à différencier sous l'action de différents agents inducteurs en particulier l'acide rétinoïque, le diméthylsulfoxide, le TPA ou de conditions de cultures spécifiques, en particulier par la formation de corps embryoïdes.
Alternativement, les cellules sont des cellules aviaires établies en lignée, en particulier les cellules hépatiques LMH, les cellules monocytes HD11 et les cellules fibroblastiques QT6. Lesdites cellules définies ci-dessus peuvent être transformées en outre avec un vecteur d'expression exprimant une protéine de la famille Rad, en particulier la protéine Rad54.
Pour ce procédé, le milieu utilisé peut comprendre des anticorps anti-acide rétinoïque (ARMA) et une cytokine choisie dans le groupe constitué de LIF, IL-11, IL-6 et leurs différents mélanges.
Le milieu utilisé peut également comprendre différents facteurs en particulier le SCF, 1TGF-1, le bFGF, le CNTF et l'Oncostatine.
Dans un troisième aspect, l'invention se rapporte à un procédé d'obtention d'un animal appartenant à l'espèce aviaire capable d'exprimer une protéine exogène d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention de cellules aviaires modifiées par le procédé défini ci-dessus, b) introduction de la cellule obtenue à l'étape a) dans la cavité sub-germinale d'un embryon, dans la circulation sanguine ou par transfert nucléaire du noyau de ladite cellule dans un ovocyte énucléé ou non énuclée, et c) incubation de l'embryon obtenu à l'étape b).
- par transfert nucléaire, on entend le transfert d'un noyau d'une cellule dans un œuf ou ovocyte duquel le noyau a été retiré, ou non ou encore dans lequel les chromosomes ont été détruits ou altérés par irradiation gamma ou UN ou tout autre moyen adapté.
De préférence, le vecteur utilisé à l'étape a) permet une expression tissu-spécifique, en particulier dans l'oviducte, le foie, le sang, la moelle et les organes lymphoïdes.
- Par moelle, on entend le tissu qui rempli la cavité de la plupart des os et qui contient les cellules souches hématopoiétiques, à partir desquelles dérivent toutes les cellules rouges et blanches du sang.
L'invention porte également sur le procédé précité pour obtenir un animal appartenant à l'espèce aviaire présentant une expression tissu-spécifique d'une protéine exogène d'intérêt, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur de recombinaison homologue possédant parmi différents éléments constitutifs nécessaires à son fonctionnement des bras 5' et 3' d'homologie aux séquences d'un locus donné, notamment un locus sélectionné parmi le locus de l'ovalbumine, des ovovmucoïdes, de la conalbumine et du lysozyme.
Un tel vecteur peut comprendre la séquence codante pour la protéine exogène fusionnée avec au moins un élément sélectionné parmi une séquence intronique, une séquence peptide signal de sécrétion, en particulier le peptide signal du lysozyme comprenant la séquence SEQ ID No 2, une séquence poly A, un IRES et un promoteur, en particulier choisi parmi les promoteurs des gènes de l'ovalbumine, des ovomucoïdes, de la conalbumine et du lysozyme.
L'étape b) du procédé pour obtenir un animal appartenant à l'espèce aviaire présentant une expression tissu-spécifique d'une protéine exogène d'intérêt peut comprendre en outre la transformation des cellules aviaires avec un vecteur exprimant une protéine de la famille Rad, en particulier Rad54.
Dans un aspect supplémentaire, l'invention se rapporte à un procédé de production d'une protéine d'intérêt comprenant l'extraction de la protéine exogène exprimée dans les tissus d'un animal obtenu à partir du procédé évoqué ci-dessus. Dans ce procédé, la protéine est de préférence extraite du sang, du jaune ou du blanc d'œuf.
Alternativement, le procédé de production d'une protéine d'intérêt peut consister en l'extraction de la protéine exogène exprimée dans le surnageant des cellules issues du procédé selon l'invention.
L'invention a également trait à un animal appartenant à l'espèce aviaire susceptible d'être obtenu à partir du procédé décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine exogène dans un tissu spécifique, par exemple dans le foie, le sang, la moelle, les organes lymphoïdes ou l'oviducte. Dans un autre aspect, l'invention vise un oeuf susceptible d'être obtenu à partir d'un animal décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'une partie de ces composants, en particulier l'ovalbumine, les ovomucoïdes, la conalbumine et le lysozyme soit partiellement ou totalement remplacée par une protéine d'intérêt exogène, sélectionnée notamment parmi les peptides à intérêt thérapeutique, les interleukines, les cytokines, les hormones, et les anticorps.
- Par anticorps, on entend une protéine présentant une affinité spécifique pour un antigène comprenant les anticorps polyclonaux, monoclonaux et leur fragment Fab.
L'oeuf de l'invention peut comporter une proportion de protéine exogène comprise entre quelques mg (1 à 10 mg) et 500 mg de matières sèches en lieu et place d'une partie ou de la totalité d'au moins une protéine endogène, choisie notamment parmi l'ovalbumine, les ovomucoïdes, la conalbumine, le lysozyme et l'avidine.
Des exemples non limitatifs des modes de réalisations de l'invention sont donnés ci- après
Abbréviations cDNA : complementary DNA CMV : Cytomégalovirus
DNA : Desoxyribonucleic Acid
ER : Estrogene Receptor
FGF : Fibroblast Growth Factor
GFP : Green Fluorescent Protein GR : Glucocorticoïd Receptor
HRE : Hormone Responsive Elément
IGF-1 : Insulin Growth factor 1
LPS : Lipopolysaccharides
LTR : Long Terminal Repeat MAR : Matrix Attachment Région
MCSF : Macrophage Colony Stimulating Factor NRE : Négative Response Elément PR : Progestérone Receptor RAR : Retinoic Acid Receptor RNA : Ribonucleic Acid RSV : Rous Sarcoma Virus RXR : Retinoïd X Receptor SCF : Stem cell Growth factor SDRE : Steroid Dépendent Regulatory Elément TPB : Tryptose Broth Phosphate TPA : TriPhrobol Ester
TR : Thyroid hormone Receptor VDR : Vitamin D Receptor
Exemple 1 : L'oeuf comme système de production
L'expression d'une protéine d'intérêt dans un liquide physiologique d'un animal, le poulet par exemple, notamment dans l'œuf et en particulier dans le blanc d'œuf apparaît réalisable avec l'aide de différents outils moléculaires dont les vecteurs d'expression. Le principe général de l'invention est de faire exprimer directement dans l'œuf une molécule exogène d'intérêt soit sans changer l'une ou l'autre des protéines déjà présentes dans l'œuf, soit en lieu et place d'une molécule endogène ou d'une fraction de cette molécule endogène.
1.1 Les protéines du blanc L'œuf est un milieu particulièrement adapté pour l'expression de molécules exogènes. Le blanc d'œuf est un milieu complexe dont la composition biochimique est assez bien caractérisée (voir Tableau 1 ci-après).
Tableau 1 : Teneur moyenne (en g) pour un œuf de 60g
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D'après Sauveur, 1988 op cité
Pauvre en lipides (0,02%), en ions inorganiques et en glucides (0,5% dont du glucose libre), le blanc est composé principalement d'eau à 88 %, et de protéines en solution (11,5%). Les protéines du blanc d'œuf sont bien caractérisées dans leur ensemble, même si leur nombre exact est encore soumis à variation (Stevens, 1991; Li-Chan and Nakai, 1989; Sauveur, 1988). On s'accorde en général pour avoir identifié environ 40 protéines différentes. Parmi celles-ci, on distingue cinq protéines majoritaires (ovalbumine, conalbumine, ovomucoïde, ovomucine a and b et le lyzozyme) qui représentent à elles seules près de 83-84% des protéines du blanc. Au regard de cette composition et d'un poids moyen de matière sèche de 6-7 g environ, ces protéines majoritaires représentent donc l'équivalent de 4,8-5,6 g environ. Les protéines mineures, mais significativement détectables représentent de 5 à 6% des protéines totales. Parmi ces composants minoritaires, on peut citer l'avidine, très connue dans le monde du diagnostic pour sa très haute affinité et sa très grande spécificité vis à vis de la biotine. Les autres composantes sont identifiées dans des proportions faibles, variables d'une préparation à une autre et sont souvent mal caractérisées tant au niveau biochimique que moléculaire. Le nombre d'études les concernant est d'ailleurs peu important en accord avec leur faible représentativité. Les propriétés physicochimiques des protéines majoritaires du blanc d'œuf sont présentées (voir Tableau 2 ci-dessous).
Tableau 2 : Composition protéique du blanc d'œuf de poule
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D'après : Stevens (1991), Comp. Bioch. Physiol 100b 1-9 and Li-Chan and Nakai (1989), Critical review in Poultry Biology 2, 21-58.
Les protéines du blanc sont toutes élaborées par les cellules de l'oviducte, au niveau du magnum. Différents types cellulaires sont trouvés et une certaine spécialisation est observée entre les cellules, responsables de la sécrétion. Les cellules épithéliales calciformes (appelées également cellules à mucus) sont spécialisées dans la production de l'avidine et de l'ovomucine, tandis que les cellules des glandes tubulaires sécrètent préférentiellement le lysozyme et l'ovalbumine. La répartition de ces différents types cellulaires est variable dans l'épithélium sécrétoire du magnum, mais aucune régionalisation n'est observée (Sauveur, 1988).
La synthèse des protéines du blanc est continue au niveau des cellules. Les cellules épithéliales glandulaires et calciformes 'stockent' les protéines, qui sont déchargées autour du jaune lors du transit dans le magnum en quelques heures (environ 3h30). La déformation mécanique induit cette sécrétion et ce dépôt très rapide (Sauveur, 1988).
Ainsi, il apparaît essentiel pour le bon déroulement de la sécrétion des protéines exogènes dans le blanc de l'œuf de maintenir tous ces signaux de régulation, au niveau moléculaire et physique. Au niveau d'un animal chimérique, le préalable à toute production d'une molécule exogène d'intérêt est la présence de la modification génétique dans l'oviducte et dans les cellules du magnum en particulier. L'approche privilégiée de l'utilisation des cellules souches embryonnaires semble permettre ce mosaïcisme. Au niveau de l'établissement d'une lignée d'animaux, cette contribution est transmise de façon automatique à l'état hétérozygote puis homozygote par les croisements adéquats, car intégrée au niveau du génome.
1.2 Les composants du jaune Le jaune d'œuf est essentiellement composé d'une accumulation de lipides (Tableau 1 ci-dessus) sous forme de lipoprotéines. Il est le résultat d'une étroite association des deux protéines majoritaires, la vitelline et la vitellenine, avec des phospholipides et des triglycérides. Les autres composants (cholestérol, vitamines et pigments liposolubles) sont minoritaires. A contrario des protéines du blanc, toutes les protéines et les composants du jaune sont synthétisés par le foie et transportés via la circulation sanguine pour s'accumuler au niveau du jaune lors du développement des follicules (Sauveur, 1988 ; Nau, 1987). On trouve également dans le jaune une proportion non négligeable d'immunoglobulines qui sont accumulées directement au cours de l'élaboration de ce vitellus. La présence de ces immunoglobulines d'origine maternelles assure d'ailleurs une certaine protection immunitaire au cours des premiers jours, voir plus, de la vie du poussin. Le mécanisme de transport de ces immunoglobulines et leur accumulation dans l'œuf commence à être étudié. Le processus de purification de ces molécules IgY spécifiques de l'oiseau (équivalentes aux IgG des mammifères) est bien maîtrisé. Cette propriété peut être mise à profit pour obtenir des immunoglobulines aviaires en quantité relativement importante (parfois de l'ordre de 10 mg par œuf), voir d'en favoriser l'accumulation par une immunisation ciblée de l'animal en ponte. Il a été par ailleurs montré que les immunoglobulines humaines peuvent également s'accumuler dans le jaune, par un mécanisme similaire aux immunoglobulines endogènes (Mohammed et al., 1998). Dans cette optique de faire produire par la poule des immunoglobulines particulières, une stratégie d'expression spécifique peut être développée. Exemple 2 : Description des loci moléculaires et leur régulation transcriptionnelle
La plupart des gènes qui spécifient les protéines majoritaires du blanc d'œuf ont été étudiés au niveau moléculaire. Les phases codantes sont en général identifiées et la plupart des séquences des cDNAs correspondants se trouvent dans les banques de données. Au niveau génomique, les progrès ont été plus lents. La structure des loci de la plupart des molécules majoritaires a été publiée complètement ou partiellement. Néanmoins, les séquences publiées peuvent se révéler incomplètes (voir Tableau 3 ci- dessous).
Tableau 3 : Séquences identifiées des protéines du blanc d'œuf
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2.1 Locus de l'ovalbumine
Le locus de l'ovalbumine d'une taille de 100 kb appartient à la famille multigénique des serpines et contient 3 gènes apparentés, ova, ovaX et ovaY. Ils sont tous exprimés dans l'oviducte d'une poule en ponte (LeMeur et al., 1981; Baldacci et al., 1981). Connu structurellement depuis 1979 par des études de microscopie électronique (Gannon et al, 1979), le locus de l'ovalbumine est situé sur le chromosome 2 (Dominguez-Steglich et al., 1992). La première séquence complète qui a été publiée en 1978 est celle de l'ovalbumine. Son pré-mRNA a une taille de 7564 bp et comprend 7 exons (McReynolds et al., 1978). Le messager épissé fait 1872 bp (Woo et al., 1981). La transcription du gène codant pour l'ovalbumine (comme celui de la conalbumine d'ailleurs- cf2.3) est contrôlée par les hormones stéroïdiennes. Ainsi, l'addition d'estrogènes stimule de 20 fois la production d'ovalbumine et de 2,5 fois celle de conalbumine (N'guyen et al. 1979). Avant stimulation hormonale, les transcrits de l'ovalbumine ne sont pas détectables dans les cellules de l'oviducte, alors qu'ils représentent, proportionnellement à la dose d'estrogène, plus de 50% des transcrits totaux d'une cellule après stimulation maximale (Dean et al., 1983). Si le taux de transcription de la conalbumine est directement proportionnel à la quantité des récepteurs aux estrogènes dans le noyau, celui de l'ovalbumine indique qu'il existe plusieurs sites de fixation des récepteurs aux estrogènes au niveau du promoteur (Palmiter et al, 1981). La structure nucléosomique des gènes de l'ovalbumine et de la conalbumiune se modifie au cours de l'activation transcriptionnelle. Les fragments génomiques s'associent à la matrice nucléaire et présentent quatre régions majeures d'hypersensibilités à la DNAse, suite au traitement des hormones (Ciejek et al., 1983). Ces régions sont localisées dans la région 5' du promoteur et en 3' du dernier exon au niveau du site de polyadénylation (Bellard et al., 1982 ; Bellard et al., 1986) (Figure 1 : Eléments de régulations du gène de l'Ovalbumine). En association avec les estrogènes, différentes hormones stéroïdes (progestérone, glucocorticoïdes ou androgène) et différents facteurs (Insuline, IGF-1, cAMP, ...) sont également impliqués dans le contrôle transcriptionnel. L'ensemble de ces facteurs augmente surtout la demi vie du mRNA de l'ovalbumine, demi- vie qui passe de 6h à 24 h après addition de certains de ces facteurs (Arao et al., 1996; Kida et al, 1995; Evans and McKnight, 1984). Ces facteurs augmentent également le taux de traduction du messager (Skafar et al., 1985; Skoufos and Sanders, 1992).
Les résultats des nombreux travaux réalisés avec le promoteur de l'ovalbumine ont permis de dégager les différentes régions nucléotidiques cibles de l'action de ces hormones et facteurs (Sensenbaugh and Sanders, 1999). Des travaux de délétions successives au niveau du promoteur et des expériences de transfection de différentes constructions montrent que l'activation du promoteur est optimale dans les cellules primaires d'oviducte de poule, en présence ou non d'estrogènes. La présence d'activateurs et de répresseurs tissus spécifique est donc essentielle pour l'expression de ce gène (Dierich et al., 1987). La Figure 1 illustre les principaux sites de régulations identifiés. On trouve ainsi successivement une région HSIV vers -6000 bp par rapport au site d'initiation de la transcription qui ne présente pas d'éléments de réponse aux estrogènes. Une région HS III, localisée entre -3200/-2800 bp par rapport au site d'initiation de la transcription comprend les sites majeurs de régulations par les estrogènes. La délétion de cette région abolie la plus grande partie de la réponse HSIII, médiée par quatre séquences répétées de demi ERE, séparées les unes des autres par une centaine de nucléotides. Ces éléments coopèrent avec le site TATA box, situé à proximité. Chaque site fixe faiblement un récepteur, mais la coopération des différents sites assure un caractère inductible fort, dans un environnement de promoteur minimum ou hétérologue. Cette même région montre des éléments inhibiteurs de l'expression du gène, éléments actifs dans les cellules non productrices, mais dans une situation hors de l'oviducte (Kato et al, 1992; Muramatsu et al., 1995).
La région HS II comprend le SDRE (Steroid Dépendent Regulatory Elément), localisée entre - 800 à -585 bp, par rapport au site (+1), de démarcage de la transcription. Cette région présente des homologies avec le promoteur du gène NF-kappa B, suggérant des contrôles par des facteurs communs (Schweers et Sanders,, 1991). Plusieurs facteurs de la famille des protéines W-H, les protéines Chirp-I, Chirp II, Chirp III (Chicken ovalbumin Induced Regulatory Protein I) se fixent également sur le SDRE uniquement en présence d'estrogène et de glucocorticoïdes (Dean et al., 1996 ; Dean et al., 1998; Dean et al., 2001). A nouveau, comme pour montrer la complexité des régulations mises en jeu, la seule présence de cette région SDRE au sein d'un promoteur hétérologue ne conduit pas à une réponse dépendante des hormones stéroïdes. Toutefois, cette région devient dépendante de ces hormones, si elle est associée avec la région HSI. Cette région HS I, localisée de -350 à -32, est la région NRE (Négative Response Elément) qui contrôle la principale régulation négative du promoteur. NRE réprime l'expression du gène en absence d'hormones stéroïdiennes. La présence de NRE seul ou de SDRE seul ne suffit pas pour réguler un gène exogène. Ces séquences doivent coopérer pour 'induire la dérepression' (Hasty et al., 1994 ; Schweers et al., 1990; Sanders et McKnigth, 1988). Mais la vision est simpliste, car cette région HSI est en fait constituée d'une véritable mosaïque de sites assurant une régulation positive et négative de la transcription du gène. Trois domaines sont discernables quant à l'influence de leurs effets. Domaine I : La région -239 à -220 est une séquence de type silenceur. Les trois zones présentent de l'affinité pour des complexes protéiques spécifiques des cellules de l'oviducte mais les plus importantes sont les régions -280 à -252 et -134 à - 88. Cette région porte le motif CAR (COUP Adjacent repression). La région appelée NRE est en fait plus complexe qu'initialement décrite (Haecker et al., 1995). Un site de régulation positif qui fixe le facteur delta EF1 (Estrogen responsive transcription factor) a aussi été identifié. Ainsi, les sites d'interaction (-197 à -95) de la progestérone et des estrogènes se chevauchent partiellement (Dean et al ., 1983; Dean et al, 1984). En aval de la position de - 95 bp, des délétions supplémentaires font chuter dramatiquement les taux des transcrits observés (Knoll et al., 1983). Outre les récepteurs aux estrogènes, un des facteurs régulateurs important est le récepteur orphelin COUP-TF, (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor) (Sawaya et al., 1996 ; Robinson et al., 1999). Ce facteur est exprimé de façon ubiquitaire dans tous les tissus. Identifié par co-purification avec le récepteur aux Estrogènes, il présente de l'affinité avec une région située entre -90 et -70 bp (Wang et al., 1987; Hwung et al., 1988a, Hwung et al., 1988b; Monroe and Sanders, 2000). La formation de complexes récepteur-récepteur entre COUP-TF et les différents récepteurs aux hormones nucléaires (VDR, ER, TR, GR, PR, RXR, HNF-4...) au niveau des différents HRE, dont le ERE, favorise les fixations à ces éléments de régulations. COUP-TF régule l'action de ER par des contacts directs avec le DNA mais aussi via des interactions directes protéines - protéines entre récepteurs (Klinge et al., 1997). Les modes d'action de COUP-TF et des différents récepteurs apparentés (COUP-TFII ou ARPI) sont complexes (Kimura et al., 1993) dans un sens positif ou négatif pour la régulation de la transcription selon les partenaires protéiques enjeu. Parmi les protéines impliquées, on peut citer de façon non exhaustive ear2, (Pereira et al, 1995) ; N-CoR (Nuclear Repressor Coreceptor) et SMRT (Silencing Mediator for retinoic acid et Thyroid hormone Receptor), (Shibata et al., 1997).
2.2 Le locus du lysozyme Le locus du lysozyme est un locus plus restreint en taille que celui de l'ovalbumine. Il est estimé à environ 40 kb (Sippel et al., 1978 ; Short et al., 1996). Deux unités MAR (Matrix Attachment Région) situées à -11.1 kb / -8.85 kb et +1.3 kb à +5.0 kb, situées par rapport au site (+1) de l'initiation de la transcription délimitent plus précisément ce locus à 22 kb. Ces séquences MAR sont composées de plusieurs sites d'accrochage à la matrice protéique de la membrane nucléaire (Loc and Strâtling, 1988; Phi-van and Strâtling, 1996 ; Phi-van, 1996). L'ajout de séquences MAR, à des gènes hétérologues, augmente leur transcription (Stief et al., 1989; Phi-Van et al., 1990). En sus de la présence des MAR, il y au moins une origine de réplication du DNA dans le locus du lysozyme, origine qui contient plusieurs fourches d'intiation de la réplication (Bonifer et al., 1997; Phi-van et al., 1998 ; Phi-van and Strâtling, 1999). Ce point semble d'ailleurs rendre le locus du lysozyme tout à fait particulier en terme de clonage, certaines parties étant assez difficile à sous cloner dans des plasmides de clonage. Le gène du lysozyme chez le poulet comprend 4 exons et présente une homologie importante avec les gènes du lysozyme humain et murin. Plusieurs sites secondaires initiateurs de la transcription ont été mis en évidence, en général situés dans des séquences répétées réparties sur l'ensemble du locus (Von Kries et Strâtling, 1988). Des séquences régulatrices de l'expression ont été identifiées de -14 kb à + 6 kb, soit sur toute la totalité du locus. Le gène du lysozyme est exprimé de façon constitutive dans les macrophages matures, cellules dans lesquelles le lysozyme est utilisé comme marqueur de différenciation, alors que son expression est placée sous le contrôle des hormones stéroïdiennes dans les cellules de l'oviducte (Short et al., 1996 ; Fritton et al, 1987 ; Jantzen et al, 1986 ; Fritton et al., 1983). Ces spécificités d'expression sont dépendantes de différentes séquences dont les principaux sites sont portés sur la figure 2 : Eléments de régulations du gène du lyzosyme. On distingue deux catégories de séquences régulatrices : les séquences de régulation dites positives ou 'enhancers' et les séquences de régulations dites négatives ou 'silencers'. Ces séquences ont été identifiées comme les régions 'hypersensibles' suite à l'analyse des profils électrophorétiques du DNA, profils obtenus après traitement à la DNAse I .
Les principaux sites enhancers et silencers sont respectivement les régions E-6.1kb, E- 2.7kb, E-0.2kb et N-2.4kb, N-l.Okb et N-0.25kb. Certains sont spécifiques des cellules myéloïdes (E-6.1 kb, E-2.7kb, E-0.2kb pour les macrophages matures et N-2.4 kb dans les fibroblastes et les macrophages immatures), (Steiner et al ., 1987; Huber et al., 1995). Dans les cellules de l'oviducte actif l'élément E -6.1 kb assure l'essentiel de la spécificité. L'activation séquentielle de l'ensemble de ces différents sites est également un élément de régulation cellule et tissu spécifique (Regenhard et al., 2001 ; Kontaraki et al., 2000). Plus en détail, l'enhancer E-2.7kb est composé de 4 régions (I à IV). La région I fixe le facteur FEF (c-fes Expression Factor), la région II contient un site de reconnaissance du facteur PU.l, de la famille EST et est spécifique des macrophages (Ahne et Strâtling, 1994). Tous ces différents éléments de régulations se chevauchent partiellement, au moins dans le gène du poulet, mais pas au niveau du gène de la souris, espèce dans laquelle une duplication ancestrale a séparé le gène et ses éléments de régulation. D'autres éléments ont été localisés, notamment les sites de fixation de facteurs de transcription ubiquitaires comme NF-1, mais aussi API situé en - 0.2 kb et - 6.1 kb, site pour lequel une région de 157 bp assure la spécificité d'expression dans les macrophages (Goethe et al., 1994 ; Theisen et al., 1986; Grewal et al., 1992; Nowock et Sippel, 1982). De façon intéressante, l'oncogène v-myc (présent dans les cellules HD11 par exemple) et inhibiteur de la différentiation des monocytes en macrophages bloque la transcription en inhibant la fixation du facteur C EBP (Mink et al., 1996). Les éléments (HRE) assurant la sensibilité de la transcription aux hormones stéroïdiennes (PRE pour la progestérone, et GRE glucocorticoïdes) sont présents dans la région située à - 0.2 kb du site (+1), d'initiation de la transcription du promoteur (Renkawitz et al, 1982 ; Renkawitz et al, 1984a ; Renkawitz et al, 1984b; Hecht et al, 1988). Plus particulièrement, deux sites entre -220 et - 140 bp et entre - 80 à - 50 bp assurent l'essentiel de la régulation (Altschmied et al., 1989; Dolle and Strâtling, 1990; Von der Ahe et al, 1986).
Une part importante de la régulation est contrôlée par les 'silencers'. Deux d'entre eux (N-l.Okb et N-0.25 kb) inhibent la transcription, même de promoteurs hétérologues (Baniahmad et al., 1987 ; Faust et al., 1999). Le troisième (N-2.4 kb) est reconnu par les récepteurs aux hormones thyroïdiennes (TR) et par son homologue oncogénique v- erbA, ainsi que par le régulateur NePl (négative Protein 1) encore appelé CTCF (CCCTC-binding factor, (Burcin et al, 1997; Darling et al, 1993; Kohne et al., 1993 ; Bhat et al., 1994). NePl se fixe au niveau de la partie FI de 50 bp de N-2.4 alors que le TR principalement sur la partie F2 de cet élément. Les associations homodimèriques ou hétérodimèriques avec les autres récepteurs nucléaires (RAR, RXR) modulent le niveau de transcription de ce gène (Baniahmad et al., 1990; Arnold et al., 1996). L'état de phosphorylation du récepteur TR est également un élément important. Enfin, le facteur HNF-I alpha (Hepatic nuclear Factor-I) qui est exprimé dans les cellules de l'oviducte a un rôle dans la régulation du gène lysozyme. Le promoteur du gène contient deux régions reconnues par cette protéine HNF-I. Cette régulation de l'expression du gène du lysozyme par le NHF-I semble avoir été perdue au niveau phylogénétique entre les oiseaux et les mammifères (Grajer et al., 1993).
2.3 Le locus de la conalbumine
Le gène de la conalbumine, encore appelé ovotransferrine a été identifié d'abord chez l'homme. Il s'étend sur au moins 33.5 kbp et comprend 17 exons. Le gène poulet est également organisé en 17 exons et 16 introns mais sur 10,5 kb seulement. Le messager a une taille de 2376 bp (Cochet et al., 1979 ; Jeltsch and Chambon, 1982; Jeltsch et al., 1987; Schaeffer et al., 1987). Très peu d'études de la régulation de l'expression de ce gène ont été réalisées. La régulation de la stabilité du messager est particulière. La molécule qui s'apparente à la famille des transferrines, fixe le fer sous forme ionique et régule la stabilité et le niveau de transcription de son propre messager. Si beaucoup d'études ont été réalisées sur la transferrine humaine et son récepteur (CD71), peu de documentation existe quant aux formes aviaires. Exemple 3 : Eléments extérieurs facilitateurs
Chez les eucaryotes, la recombinaison homologue est un événement naturel qui se produit surtout au moment de la méiose, afin d'assurer, dans un énoncé simpliste, un brassage des gènes et des allèles. Le rôle de la recombinaison homologue est beaucoup plus délicat à interpréter lors d'une division mitotique. Les phénomènes de recombinaisons homologue et non homologue semblent néanmoins cruciaux dès que le matériel génétique est endommagé. De nombreuses situations dans la vie d'une cellule et d'un organisme expose ainsi le matériel génétique. Par exemple, un défaut soudain de réplication, une ionisation radicalaire liée à des radiations, un stress oxydatif, l'action d'endonucléases ou de topoisomérases, le stress mécanique lié à la ségrégation mitotique, peuvent induire des coupures double brins accidentelles. Si la levure privilégie les mécanismes de réparation homologues, la cellule eucaryote supérieure semble privilégier le raboutage non homologue de ces coupures, même si la réparation homologue est aussi observée. Mais dans tous les cas, comme l'intégralité génétique est un préalable à toute division, pour faire face à cette situation critique de matériel endommagé, la cellule met en route tout un ensemble de gènes, chargés de réparer ces coupures. Décrits initialement dans le système levure, les gènes Rad (rad51, rad52, rad53 et rad54) (Takata et al, 2000 ; Morrison and Takeda, 2000; Bell et al., 1999 ; Shinohara et al., 1997; Bezzubova et al., 1997; Ivanov and Haber, 1997; Porter et al., 1996) impliqués dans la réparation par recombinaison homologue ont été identifiés aussi dans les organismes supérieurs. Les homologues Rad51 et Rad54 de poulet ont été clones. L'ADN et la protéine présentent de fortes homologies avec les séquences de levure, souris et humain (Essers et al., 1997 ; Dronkert et al., 2000). Des similitudes d'action sont alors observées, mais aussi des différences, notamment en ce qui concerne l'action de Rad 51 (Bezzubova et al., 1993). De même, les homologues humains des gènes ku70 et ku86 de levure interviennent à la fois dans les réparations non homologues, et dans les phénomènes de recombinaison observés dans les réarrangements des loci d'immunoglobulines. Les relations entre ces différents acteurs commencent à être également approchées et mettent en évidence la formation de complexes protéiques dont les régulations sont elles mêmes complexes (Morrison et al., 2000 ; Morrison et al, 1999 ; Yamaguchi-Iwai et al., 1999 ; Takata et al, 1998; Yamaguchi-iwai et al., 1998). Ainsi, une liste non exhaustive de protéines facilitant la recombinaison (recombinase) peut être donnée, de la simple protéine bactérienne RecA (Shcherbakova et al., 2000), aux membres de la famille Rad, mais aussi à de protéines telles que BraCl (Moynahan et al, 1999).
Dans une approche qui faciliterait des événements de recombinaison homologue, l'action de Rad 54 est évaluée au moment de l'introduction du vecteur de recombinaison homologue. Ainsi, deux approches sont possibles. La première consiste à effectuer une co-transfection d'un vecteur d'expression d'une des protéines de la famille Rad, en particulier Rad 54 avec le vecteur de recombinaison homologue. La seconde consiste à transfecter les cellules avec un vecteur d'expression conditionnelle d'une des protéines de la famille Rad, en particulier Rad 54. Dans ce cas, les cellules sont d'abord sélectionnées, stabilisées et établies pour être à nouveau transfectées avec un vecteur de recombinaison homologue, puis induites pour exprimer au maximum la protéine de la famille Rad. L'action de Rad54 testée au niveau de l'efficacité de transfection est présentée dans le tableau 4 ci-dessous :
Tableau 4 : Influence de l'expression de Rad 54 sur le nombre de clones en transfection
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Afin de tester l'importance d'une des protéines de la famille Rad, le plasmide d'expression pRad54 (plasmide d'expression de la protéine RAD54 sous contrôle du promoteur CMV) est co-transfecté en présence du plasmide pOvaRH, plasmide de recombinaison ne contenant pas de cDNA d'intérêt. La quantité totale de plasmide est de 5ug de pOvaRH, en présence de quantités variables de pRad54. Le complément molaire étant apporté par un plasmide 'carrier', le pMCS5 d'origine commerciale, a peu près de même taille que le pCMV Rad54. Les cellules souches S86N sont ensemencées à 1x10 cellules par boite dans du milieu de prolifération en présence de feeder inactivé par irradiation. Le mélange de transfection est ajouté et la sélection à la néomycine appliquée pendant 7 jours environ. Les clones sont alors dénombrés après fixation au méthanol et coloration au Wright/Giemsa. En conclusion, la présence de Rad54 ne semble pas modifier sensiblement l'efficacité d'obtention de clones.
Exemple 4 : Choix du signal peptide
Une des approches choisies pour produire les protéines exogènes est leur accumulation dans l'œuf. La stratégie de substitution remplacement utilisée dans le cadre de l'invention rend utile l'utilisation d'un système actif (mais éventuellement passif pour des protéines spécifiques qui en auraient la capacité) d'accumulation de la protéine exogène dans le blanc de l'œuf. Ainsi, les phases codantes sont placées sous la dépendance du promoteur endogène du gène ciblé endogène et sont fusionnées avec un signal peptide de référence. La fonction du signal peptide est d'assurer la translocation de la protéine vers l'extérieur de la cellule à travers les différents éléments constitutifs de l'appareil sécrétoire de la cellules (réticulum, Golgi....). Les peptides signaux sont destinés à être clivés au cours du processus de maturation de la protéine. Celle ci s'accumule ensuite dans le liquide physiologique et dans le blanc d'œuf en particulier. On utilise soit les peptides signaux des protéines endogènes, soit des peptides signaux d'autres molécules, séquences connues pour être correctement traitées. Notamment, le peptide signal du lysozyme est choisi de façon préférentielle car sa structure est bien connue et les 18 premiers acides aminés sont clivés lors de l'exportation de la protéine mature dans le blanc de l'œuf. De plus, ce peptide signal appartient à une protéine naturellement accumulée dans le blanc de l'œuf.
Parmi les autres peptides signaux utilisés, on trouve ceux des interleukines, ceux de certains récepteurs membranaires, ceux de facteurs de croissance sécrétés par différents types cellulaires, ceux d'autres protéines connues pour être sécrétées dans différents systèmes biologiques. La liste n'est pas limitative.
Exemple 5 : Construction des vecteurs de recombinaison
5.1 Obtention des éléments intermédiaires
- cassette pCMV Néo polyA
Le plasmide commercial pCI Néo (Promega, Madison, US) est ouvert par digestion HindIII et ligaturé sur lui-même en intra moléculaire pour donner le plasmide pCI Néo (Δ HindIII) qui place le gène de la néomycine phosphotransférase sous la dépendance directe du promoteur CMV. Le polyA d'origine est conservé.
- Préparation des cDNAs d'intérêt
Les cDNAs d'intérêt sont préparés par amplification PCR avec un oligonucléotide Sma-3'incDNA S contenant le site Smal, la partie 3' de l'intron artificiel du vecteur commercial pCINéo et le début de la séquence spécifique du cDNA en 5', en ayant omis l'ATG du cDNA, afin de brancher directement le cadre de lecture du cDNA d'intérêt en phase avec celui de l'ovalbumine ou du lysozyme. - Un oligonucléotide cDNA-Smal AS contenant le site Smal et la région 3' du cDNA d'intérêt , en omettant éventuellement un polyA endogène cDNAet l' oligonucléotide 3' contenant la séquence spécifiques du cDNA et le site Smal.
Le fragment PCR amplifié est hydrolyse par Smal (sous réserve de l'absence de ce site dans le cDNA) et clone en Smal dans un vecteur pMCS5 (Mobitech, Allemagne) dans lequel une séquence polyA de 277 bp a été préalablement sous clonée en Xbal/Xhol. Cette séquence polyA est elle même issue d'une hydrolyse par Xbal/Xhol du vecteur pIRESHygro (Clontech). L'orientation du fragment est alors contrôlée par simple digestion avec la carte fournie du cDNA d'intérêt. En cas de présence d'un site de restriction Smal dans le cDNA d'intérêt, le fragment PCR amplifié est soumis à l'action de la T4 DNA polymérase pour rendre les extrémités franches et directement clone dans le vecteur pMCS5 ouvert en Smal (bout franc).
5.2 Obtention des fragments génomiques
L'ADN génomique d'embryons de 6 à 9 jours de différentes souches dont la souche CNR (Cou Nu Rouge) et la souche S86N, est extrait soit selon une méthode classique avec un tampon de lyse SDS Proteinase K, suivi d'extractions au phénol et phénol chlorofrome, soit à l'aide d'un kit de préparation (kit Promega, ou Quiagen par exemple). Les différents protocoles donnent des rendements et des qualités de DNA compatibles avec leur utilisation respectivement la préparation d'une banque d'ADN génomique et une obtention de fragment PCR par amplification directe. Dans le premier cas, l'ADN génomique est digéré partiellement par l'enzyme Sau3AI et les extrémités générées remplies par la polymérase Klenow en présence de deux des quatres nucléotides nécessaires à la synthèse. Il en résulte un remplissage partiel, afin de prévenir la formation d'inserts concatémaires. Les inserts ainsi partiellement remplis sont insérés par ligature dans le vecteur λ-GEM-12. Les vecteurs résultants de cette opération sont empaquettes dans des capsides de phages. A titre d'exemple, 3 isolats indépendants ont été générés et leur titre déterminé, chaque isolât titre à 3x 10 6 pfu/ml environ. La qualité de la banque a été vérifiée par l'étude de quelques inserts pris au hasard. Avec une sonde ovalbumine, obtenue par PCR génomique avec des oligonucléotides choisis à partir de la séquence publiée (Tableau 3), le criblage des phages permet d'obtenir des inserts, sous clones en vecteurs plasmidiques pBS SK+ pour donner le plasmide #72. Ces inserts soumis à une cartographie de restriction (dont EcoRI et BamHI) ont été ensuite séquences. Une comparaison entre le gène publié (réf J00895 et Tableau N°3 ) et les deux bras 5' et 3' du vecteur preRH ainsi que les fragments du clone #72 montrent que les homologies sont extrêmement élevées au niveau nucléotides. Seuls, deux segments localisés au niveau des introns 6 et introns 7 présentent de faibles variations réparties sur quelques dizaines de nucléotides (résultat non montré). Cette comparaison démontre la grande conservation de ce gène entre les souches analysées. Dans le deuxième cas, différents oligonucléotides obtenus à partir de la séquence publiée (Tableau 3 ci-dessus) sont utilisés pour obtenir par PCR génomique les fragments donnant les bras 5 'et 3' des vecteurs.
Pour le bras 5' du vecteur pOvaRH, les oligonucléotides OvaL 2995 S et OvaL 80 AS, situé respectivement à - 2995 bp et à + 80 bp par rapport à l'ATG du gène de l'ovalbumine amplifient une région de 3075 bp, qui, soumise à l'hydrolyse par Ncol, libère un fragment de 2860 bp. Parallèlement, à partir de la séquence qui spécifie le peptide signal du lysozyme, un fragment appelé lyso 1-18 - intron est préparé par amplification PCR sur le locus du lysozyme avec les oligonucléotides Lyso 1-18 et GE- IN-AS. Ce dernier oligonucléotide contient les 30 bp de l'intron artificiel du plasmide pCINéo. Les deux fragments (Ova5' et Lyso 1-18 intron) sont hydrolyses indépendamment par Ncol, purifiés puis ligaturés ensembles et l'amplification sur le produit de ligature avec les oligonucléotides OvaL 2995 S et GE-IN-AS donne le fragment Ova5' Lyso 1-18 de 3050 bp. Ce produit PCR est ligaturé avec des adaptateurs EcoRI, qui permettent de cloner cet ensemble soit dans le vecteur pBSK au site EcoRI soit dans le pMCS5 digéré en bout franc par EcoRV.
Une dernière hydrolyse de ce fragment Ova5'Lysol-18 par Bst981 e Ascl libère le plasmide coupé et un petit fragment de 220 bp en amont du fragment ova5'. Cette petite délétion permet de dessiner deux oligonucléotides Ova5'.lS et Ova5'.2S utilisés ultérieurement pour le criblage des événements de recombinaison.
Le plasmide coupé est soumis à l'action de la polymérase Klenov afin de rendre les bouts francs avant d'être ligaturé avec des adaptateurs Ascl et ligaturé de façon intramoléculaire. Il en résulte un plasmide pOvaLyso, qui contient en amont du bras Ova5' un site unique, qui permettra une linéarisation du vecteur final.
Pour le bras 3' du vecteur pOvaRH, l'amplification de la région avale située entre les positions + 1657 et +7707 par rapport à l'ATG du gène de l'ovalbumine avec les oligonucléotides OvaL 1657 S et OvaL7707 AS donne un fragment d'une taille de 6050 pb. Ce fragment a été sous clone au site EcoRV de pMCS5 pour générer le plasmide pMCS5-Ova3' sens et pMCS5-Ova3' antisens. A partir du plasmide pMCS5-Ova3' antisens une digestion par Hpal (bouts francs) et Narl (5' sortant) permet d'obtenir le fragment de 6kb, qui est sous clone dans pBS-SK aux sites Apal (rendu bout franc) et AccI (compatible avec Narl) pour donner le plasmide pBS-SK Ova3'.
Pour le bras 5' du vecteur pLyso RH, les amplifications proximales avec les oligonucléotides lyso 1789 S et GE-IN-Ceu-AS ont permis d'isoler un fragment et de le sous cloner directement après traitement à la T4 DNA polymérase et phosphorylation par la polynucléotide kinase dans le vecteur commercial pMCS5 ouvert en bout franc en EcoRV. Ce fragment pLyso 5' contient les 2900 bp séquence en partie non publiée de la partie proximale du gène du lysozyme ainsi que l'équivalent des 18 premiers acides aminés de l'exon 1 correspondant au signal peptide du lysozyme. Ce fragment contient donc un site donneur d'épissage ainsi que la séquence du petit intron artificiel, séquence ajoutée par l' oligonucléotide AS comme décrit précédemment avec le bras 5' du vecteur pova5'.
Pour le bras 3' du vecteur pLysoRH, les amplifications distales avec les oligonucléotides Lyso 2859 S et Lyso 3185 AS ont permis d'isoler un fragment de 2150 bp en 3' du gène. Ces oligonucléotides portent à leur extrémité des sites Scel et M . Ce fragment soumis au traitement de la T4 DNA polymérase, d'une phosphorylation par la polynucléotide kinase et directement ligaturé dans le plasmide pMCS5 ouvert en bout franc par EcoRV donne le plasmide plyso3'. L'hydrolyse de ce plasmide par Aflll/ Avril suivi de l'action de la T4 DNA polymérase et d'une ligature intramoléculaire permet de générer le plasmide pLyso3'.
5.3 Construction du squelette pOvaRH
L'assemblage final du vecteur de RH par apports successifs de différentes cassettes (cassette de sélection, insertion du cDNA ou du gène d'intérêt...) est réalisé selon différents schémas. Un schéma est décrit sans qu'il soit exclusif, d'autres possibilités existant en fonction des sites de restriction présents dans certains cDNAs d'intérêt. Le plasmide pCMV NéoOva3' est construit par ligature du fragment Ova3' qui résulte de la purification après coupure par BamHI du plasmide pOva3', avec le fragment purifié et déphosphorylé pCMV Néo polyA, obtenu par hydrolyse BglII/BamHI du plasmide pCINeo(Δ-hindΙII). Quelques modifications du polylinker présent en aval de l' insert Ova5'lyso sont également effectuées avant de rassembler les deux fragments Ova5'lyso et pCMV-Néo-Ova3' dans un vecteur pOvaRH (figure 3). Le fragment Narl/Notl présent dans pOvaLyso est remplacé par un adaptateur Notl pour donner pOvaLyso-Notl ce qui permet de conserver le site Notl comme site unique de clonage des cDNA d'intérêt en éliminant de nombreux sites. Le plasmide pOvaLyso-Notl est initialement coupé initialement par Pacl, puis traité par la T4 DNA polymérase pour rendre l'ADN bout franc. La libération de l' insert OvaLyso-Notl est alors obtenue par une coupure Notl. Le fragment de 3kb OvaLyso PacIF/ Notl est clone aux sites Kspl soumis à l'action de la T4 DNA polymérase afin de rendre les bouts francs / Notl de pCMV-Neo Ova3'. Ce clonage orienté permet de générer le vecteur de pOvaRH final qui présente de 5' en 3' :
- le site unique Ascl, qui pennet la linéarisation du vecteur avant transfection
- le bras génomique Ova5 ' lyso (1-18)-debut intron, - le site unique Notl site unique de clonage des cDNA, la cassette de sélection à la néomycine le bras génomique Ova3 ' . Le vecteur pOva RH est alors utilisable pour insérer les différents cDNAs d'intérêt.
5.4 Construction du squelette pLysoRH
Le fragment Lyso 3', obtenu par l'hydrolyse par M du plasmide pLyso3' est ligaturé dans le plasmide plyso5', préalablement ouvert et déphosphorylé après hydrolyse par MM. Il en résulte le plasmide pLyso5'Lyso3' dans lequel le fragment purifié et déphosphorylé pCMV Néo polyA, obtenu par hydrolyse Notl/MluI du plasmide intermédiaire pMCS5 CMVNéoPolyA. Ce dernier sous clonage est réalisé pour flanquer la cassette de sélection du site Notl en 5', afin de préserver ce site pour les clonages des cDNAs d'intérêt. Il est obtenu par insertion du fragment BglII/BamHI du plasmide pCINeo(Δ-hindIII ) dans le pMCS5 ouvert et déphosphorylé en EcoRV. Le vecteur pLysoRH obtenu contient successivement de 5' en 3' : le site unique Ascl, qui permet la linéarisation du vecteur avant transfection le bras génomique Lyso5' avec le peptide signal 1-18 -début intron, le site unique Notl site unique de clonage des cDNA, la cassette de sélection à la néomycine le bras génomique Lyso3 ' . Le vecteur plysoRH est alors utilisable pour insérer les différents cDNAs d'intérêt (Figure 4).
5.5 Application à l'expression de différentes protéines
Les cDNAs de différentes protéines d'intérêt ou protéines modèles sont insérés dans ces vecteurs pOvaRH et pLyso RH. De façon non exhaustive, la stratégie consiste à préparer le cDNA selon le schéma présenté précédemment et à l'insérer dans le vecteur ouvert en Notl. Des variantes dans l'ordre des clonages des différentes parties peuvent être nécessaires. Des séquençages partiels ou en totalité sont réalisés afin de vérifier le bon enchaînement des différents éléments insérés. Ainsi, à titre d'exemples non exhaustifs, des vecteurs ont été construits avec les cDNAs de l'érythropoiétine pOvaRH Epo, pLysoRH Epo, de la beta-galactosidase pOvaRH LacZ, pLysoRH LacZ, de l'héliomycine (peptide antibactérien pOvaRH Hélio, plysoRH Hélio) La figure 5 illustre le pOvaRH LacZ.
Un cas particulier est l'application des vecteurs pOvaRH et pLyso RH à la production de molécules présentant leur propre signal peptide. La stratégie de construction utilisée diffère un peu de celles précédemment décrites. Par exemple, le cDNA de l'interleukine 11 est un fragment nucléotidique de 1100 bp, sous clone dans le vecteur pBS SK dans les sites EcoRI. Comme il n'est donc pas nécessaire de fusionner le cDNA d'intérêt avec le peptide signal du lysozyme, le cDNA est inséré directement en phase au niveau de l'ATG de l'ovalbumine, conduisant à une fusion au niveau du deuxième acide aminé de l'interleukine 11. Dans cette exemple, le cDNA de l'IL-l 1 est soumis à l'action de la polymérase Taq dans une réaction de PCR en présence de deux oligonucléotides sens et antisens qui présentent les sites Hind III et Xbal. Ce fragment est ainsi soumis à la double hydrolyse HindlII/Xbal et ligaturé dans le vecteur pMCS5, lui-même préparé ouvert en HindlII/Xbal, après double hydrolyse par ces enzymes et traitement de déphosphorylation à la CIAP. Il résulte de ce clonage directionnel le plasmide pMCS5- II- 11. Ce dernier est soumis à la digestion Hpal/Nsil, le fragment est purifié et ligaturé dans le plasmide pOva5' AS, lui-même ouvert en NcoI/PstI, réparé en bout franc par l'action de la polymérase Klenow. Il en résulte le plasmide pOva5' IL-11. Ce plasmide pOva5Tl-l l est soumis à la digestion par Notl, l'insert est purifié et ligaturé avec le plasmide pCMVNéoOva3', lui-même hydrolyse par Notl et déphosphorylé. Il en résulte le plasmide pOvaRH 11-11 composé de :
- le site Notl (linéarisation du vecteur avant transfection)
- le bras génomique Ova5'avec l'ATG de l'ovalbumine,
- le cDNA de l'IL-l 1 fusionné sur l'ATG et comportant un polyA
- la cassette de sélection contenant le gène de résistance à la néomycine sous la dépendance du promoteur CMV
- le bras génomique Ova3'
Une stratégie analogue permet d'obtenir le vecteur pLysoRH IL- 11 en présence du peptide signal endogène lysozyme et par délétion du peptide signal de 1TL-11 et inversement par délétion du peptide signal lysozyme endogène et apport du peptide signal de l'IL-l 1.
Exemple 6 : Transfection des vecteurs dans différentes cellules aviaires
6.1 Méthodes de transfections Deux méthodes générales de transfections sont utilisées : l' électroporation et la transfection par des liposomes. Il semble que dans le système souris, l' électroporation soit en général choisi afin d'accroître l'efficacité de recombinaison des vecteurs de recombinaison homologue. Néanmoins, peu d'études comparatives ont été faites.
- l'électroporation
L' électroporation est une méthode qui permet de faire rentrer un DNA de taille très variable dans une cellule en créant par un choc électrique un pore transitoire au niveau de la membrane cellulaire. Parmi les différents paramètres pouvant influencer l'efficacité de cette expérience, on peut citer la concentration cellulaire (de 1 à 10 x 106 cellules), la solution conductrice du signal contenant le mélange cellules DNA (PBS, milieu sans sérum ...), la concentration de DNA en général linéarisé (de 5 à 25 μg), la distance des électrodes (cuvettes ou électrodes simples directement dans la boite ou le puits de culture), l'amplitude du signal dépendant de la capacitance (de 10 à 1000 μF) et du voltage appliqués (de 5 à lOOmV pour les signaux carrés et de 200 à 350 V pour les signaux non carrés), le nombre de chocs électriques délivrés et la forme de ce(s) choc(s) électrique(s) appliqué(s). Par forme, on entend la façon dont une même charge électrique est délivrée, notamment selon un signal carré, non carré, exponentiel inverse... Le tableau 5 illustre quelques-uns de ces paramètres :
Tableau 5 : Efficacité d' électroporation du plasmide pCINéo dans les cellules souches
Figure imgf000047_0001
L' électroporation du plasmide pCINéo linéaire est réalisée à l'aide d'un électroporateur BioRad (Gène Puiser II). Les cellules souches dissociées, lavées dans un milieu sans sérum et ajustées à une concentration de 5 x 10 cellules dans 0,8 ml sont placées dans une cuvette d' électroporation (chambre de 4mm). 5 à 20 μg de plasmide linéarisé, préparé dans du TE sont ajoutés aux cellules et le mélange est laissé 5-10 min à température ambiante, puis le choc électrique est appliqué avec une capacitance fixée à 560 uF. Les cellules sont alors placées à 4°c environ 10 min, puis ensemencées dans des boites de culture avec feeder dans les conditions de culture de ces cellules. Classiquement, l'équivalent d'une cuvette soit 5x 10 6 cellules sont réparties dans deux boites de 100 mm.
Le tableau présente 3 séries réalisées avec 15 μg de plasmide à 270 V. Les clones sont dénombrés après sélection à la néomycine pendant 7 jours (250 μg/ml), fixation au méthanol et coloration au Wright/Giemsa
- les liposomes
- Par liposomes, on entend toute molécule chimique présentant entre autre des caractéristiques de cations lipidiques, seule ou associée à d'autres éléments L'efficacité de différents liposomes a été comparée sur différents types cellulaires. Les cellules souches embryonnaires étant fragiles, la présence de sérum lors de la transfection est un élément important. Différents matériels commerciaux ont été testés. Il ressort que l'efficacité et la toxicité de ces composants sont variables (Pain et al., 1999). De plus, la présence de sérum pennet de diminuer les effets relativement toxiques de l'exposition des cellules aux lipofectants et ainsi de préserver les chances d'obtenir des cellules recombinantes dans un état physiologique et morphologique satisfaisant. Un avantage parmi d'autres de l'utilisation des liposomes est le faible nombre de cellules utilisées par essai. Le tableau 6 ci-dessous illustre une efficacité relative de transfection avec un vecteur simple d'expression :
Tableau 6 : Transfection des vecteurs de recombinaison dans différents types cellulaires
Les cellules sont ensemencées dans leur milieu respectif à la densité de 5x 10 5 à 105 cellules par boite de 100mm pour chaque type cellulaire. Le mélangede transfection, pouvant varier de 10.5 μg liposomes/ 3.5 μg DNA à 15 μg liposomes/ 5 μg DNA par boitede 100 mm, est mis sur les cellules de 3 à 15 heures selon les cas. La sélection à la néomycine est appliquée à 250 μg/ml et les clones apparaissent de 5 à 10 jours après transfection. Les clones sont prélevés et analysés par PCR afin de détecter les événements de recombinaison. Un exemple typique d'amplification est constitué d'un clonage en puits d'une plaque de 24, d'un passage en puits d'une plaque de 12 puits, puis d'une amplification en boite de 60 mm ou de 100 mm. Les étapes de criblage mises en place de façon optimale entre le passage du puits d'une plaque de 24 puits au puits d'une plaque de 12 puits permettent de limiter l'amplification aux seuls clones détectés positifs par PCR. Par puits de plaque de 6 puits, on obtient en général 5x 105 à 106 cellules. Ainsi, ne sont congelés en viable que les clones criblés positifs par PCR. L'amplification pour analyse en Southern blot ne concerne également qu'un faible nombre de clones.
Le tableau rassemble différents exemples obtenus avec des cellules de différentes natures et à différents passages. Il est nécessaire de constater que les efficacités de transfection et d'efficacité de recombinaison semblent variables selon les vecteurs et pour un même vecteur pourraient être dépendantes de la physiologie (âge, état...) des cellules utilisées.
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Figure imgf000050_0001
6.2 Efficacité de transfection stable avec les vecteurs de recombinaison
L'efficacité de transfection stable est estimée par le nombre de clones obtenus après sélection par la drogue qui est détoxifiée par le gène présent dans la cassette de sélection. Dans les cas reportés, la néomycine a été généralement utilisée. D'autres drogues peuvent être utilisées en fonction de la présence d'un gène de résistance différent dans le vecteur transfecté. Parmi les drogues classiques, on trouve la néomycine, l'hygromycine, la puromycine, la phléomycine, la zéomycine, la blasticidine, la viomycine.... D'autres milieux de sélection peuvent être utilisés comme l'addition d'analogue des bases, les milieux de sélection classique comme le milieu HAT...
Les clones sont comptés en fin de période de sélection correspondant à la disparition des cellules dans les boites témoins de l'expérience. Ces témoins sont soit des cellules non transfectées soit des cellules transfectées avec un vecteur ne contenant pas de gène de résistance à l'antibiotique utilisé.
6.3 Cellules utilisées
6.3.1 Fibroblastes embryonnaires de poulet (CEFs) Les fibroblastes Embryonnaires de poulet (Chicken Embryonic Fibroblasts) sont obtenus à partir d'une mise en culture d'embryons de poulet incubés de 9 à 13 jours selon un protocole bien établi et connu de la persom e de l'art. Ces cellules primaires sont amplifiées et maintenues en culture pendant un nombre de passage peu important (inférieur à 30 en général) car les cellules présentent rapidement (en général à partir des passages 15 à 20) une phase progressive d'arrêt de prolifération et une entrée en sénescence caractérisée par un taux de divisions plus faible, une morphologie étalée de moins en moins fibroblastique. Cette phase de sénescence conduit à la disparition des cellules sauf dans de très rares cas où l'établissement spontané de cellules fibroblastiques aviaires et de poulet en particulier a été observé (lignée DF-1) (Himly et al., 1998 ; Kim et al., 2001).
Les transfections des vecteurs de recombinaison homologue sont donc réalisées lors des passages précoces (de 1 à 10), afin d'optimiser à la fois la possibilité de sélectionner et d'amplifier les clones résistants à la sélection mais aussi pour limiter une éventuelle dérive caryotypique et l'entrée rapide en sénescence. En général, les clones obtenus sont isolables, mais pas ou peu amplifîables. Par contre, ils peuvent être considérés comme des sources potentielles de noyaux modifiés pour des expériences de clonage nucléaire.
6.3.2 Lignée LMH
La lignée de cellules LMH est une lignée d'hépatocyte de poulet, obtenue par carcinogénèse chimique (Kawaguchi et al., 1987) Cette lignée a été caractérisée au niveau caryotypique et présente un polyploïdie importante. Les cellules sont en général maintenues en DMEM ou HamF12, en présence de 8 % de sérum de veau fœtal, de 2% de sérum de poulet, de 10%> de TPB et d'antibiotiques. Ces cellules représentent un type cellulaire dendritique intéressant, très différent des cellules monocytes, fibroblastes et des cellules souches et présentent une sensibilité relative à différentes hormones stéroïdiennes. Les transfections de vecteurs de recombinaison pOvaRH notamment dans ces cellules ont permis d'obtenir des clones et des événements de recombinaison. Le tableau 6 illustre les résultats de ces transfections.
6.3.3 Lignée HD11
La lignée de cellule HD11 est une lignée de monocytes de poulet immortalisés par la présence de l'oncogène v-myc apportée par un rétrovirus aviaire (Beug, et al., 1979). Cette lignée est productrice de virus, capables de propager l'oncogène. Certains clones pourraient être éventuellement non producteurs. Les cellules sont en général maintenues en milieu HamF12, complémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, de 2% de sérum de poulet, de 10% TPB. Comme précisé dans l'introduction, les macrophages activés produisent des quantités de lysozyme endogène. En les modifiant par les vecteurs de recombinaison pLysoRH, ces cellules peuvent donc servir de modèle de production à la molécule insérée dans ce vecteur. On réalise ainsi une stratégie knock in de production. Le tableau 6 illustre ci-dessus les résultats de ces transfections.
6.3.4 Cellules souches embryonnaires Les cellules souches embryonnaires de poulet utilisées dans les exemples sont des cellules souches obtenues in vitro par la mise en culture de cellules de blastodermes de poulet (Pain et al., 1996 ; US 6,114,168 ; WO 96/12793). Les cellules sont maintenues, amplifiées in vitro et sont surtout capables de proliférer sur des périodes de temps long. Les profils de prolifération mettent en évidence des phases de prolifération rapide et plus lente au cours de l'établissement relatif des cellules. Cette particularité d'établissement à partir d'un isolât primaire est tout à fait unique pour une cellule d'origine aviaire, sans l'intervention extérieure d'un agent immortalisant ou un processus de transformation chimique. On peut distinguer ainsi arbitrairement les phases de prolifération précoces de ces cellules, qui sont observées durant les premiers passages (du passage 1 au passage 20) et les phases de prolifération plus tardives (passages > 20). Ces cellules souches sont transfectées avec les différents vecteurs de recombinaison contenant les cDNAs d'intérêt.
Le tableau 6 et le tableau 7 ci-dessus illustrent les résultats obtenus avec différents vecteurs. Il apparaît que ces cellules souches sont modifiables dans différents loci par une approche de recombinaison homologue.
Tableau 7 : Transfection de cellules CECs avec différents vecteurs d'expression simple 5 μg de vecteur pCINéo avec 15 μg de Fugène 6 (Roche) est transfecté sous sa forme circulaire sur 0,8 xlO cellules S86N16 à différents passages. Après application de la sélection à la néomycine par addition de G418 (250ug/ml) pendant 5 à 8 jours, des clones sont obtenus. Les boites sont fixées au méthanol (100%) et une coloration au Giemsa permet de dénombrer rapidement les clones. Cet exemple démontre dans des essais indépendants que les cellules sont transfectables en stable avec des vecteurs simples, sélectionnables et que les clones peuvent être amplifiés. Néanmoins, les niveaux d'expression des transgènes sont très variables d'un clone à l'autre, comme on peut le visualiser facilement en évaluant l'intensité de fluorescence du marqueur E-GFP par exemple.
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6.4 Etat physiologique des cellules
Par état physiologique, on entend l'état de différenciation, de transcription et d'activation des cellules utilisées. Modifiées au niveau des loci ciblés par les vecteurs simples et les vecteurs de recombinaison homologue, les cellules réagissent au niveau physiologique. Il apparaît donc utile de les suivre en fonction de leur utilisation future dont les deux principales sont :
- l'injection des cellules modifiées dans des embryons receveurs pour suivre leur contribution dans les embryons et plus tard au niveau des poussins et animaux adultes - la production in vitro par les cellules modifiées des molécules d'intérêt apportées dans les vecteurs notamment mais de façon non exclusive dans le cas des cellules LMH et
HD11.
6.5 Clonage et détection des événements de recombinaison
6.5.1 Clonage
Les clones, observés macroscopiquement et microscopiquement sont prélevés et mis directement en plaque de 24 puits. Il est important de prélever les clones dès que possible pour limiter les effets de mélange entre clones. L'origine des clones selon les différentes boites est mentionnée pour contrôler le niveau d'indépendance de deux clones positifs par exemple. Les conditions de prolifération des clones sont à peu près les mêmes que celles utilisées pour les cellules parentales. Les clones, une fois prélevés sont observés quotidiennement et dés que la densité des cellules le permet, les clones sont dissociés et amplifiés pour analyse.
6.5.2 Criblage des clones par PCR Les cellules des clones en prolifération dans les puits sont lavées, dissociées et préparées pour être d'une part réensemencées pour une amplification et d'autre part pour être analysées. Le DNA est principalement extrait à l'aide de techniques classiques dont des kits commerciaux. Différentes détections sont lancées pour cribler les événements de recombinaison. Les mises au point des conditions de PCR sont réalisées pour chaque couple d'oligonucléotides avec du DNA extrait de cellules transfectées, sélectionnées et non clonées individuellement. Cette approche en 'pool' permet d'obtenir rapidement du matériel à tester. De façon générale, une première PCR est réalisée pour détecter le locus endogène ciblé afin de s'assurer de la qualité des extractions et des DNA. Une deuxième PCR est réalisée pour détecter un événement de recombinaison entre un oligonucléotide externe à la construction et une séquence commune à tous les vecteurs d'une même famille par exemple la séquence peptide signal lyso 1-18. Cette PCR est considérée comme discriminante pour les événements de recombinaison. Sur les clones positifs dans cette dernière PCR, de nouvelles séries de PCR sont réalisées toujours avec le même oligonucléotide externe mais avec un autre oligonucléotide spécifique de chaque cDNA de façon à s'assurer de sa présence et de la non modification générale du cDNA inséré. Cette PCR est considérée comme discriminante et permet de renforcer l'observation des clones positifs. La figure 6 illustre cette détection par PCR de clones. La majorité des clones est détectée négative, certains détectés positifs recombinés. Ce premier tri permet de ne garder que quelques clones qui sont amplifiés, congelés et analysés par Southern blot.
Légendes figure 6 : Détection par PCR des clones positifs recombinants
A titre d'exemple le DNA est extrait avec le kit Promega (Madison, WS). Le culot cellulaire de chaque clone est repris dans 300 μl de tampon de lyse (Nuclei Lysis Solution, NLS), en présence de 20 μg/ml de RNAse. Le lysat est homogénéisé, incubé
30 min à 37°c et 100 μl de tampon de précipitation de Protéines (Protein Précipitation solution PPS) ajouté. L'ensemble est incubé à 4°c après agitation forte. Le surnageant est prélevé après centrifugation et 400 μl d'isopropanol ajouté. Après précipitation et centrifugation, le culot est lavé en éfhanol 70°c, séché et repris dans 50 μl de TE (10.1). Les volumes peuvent être utilisés de façon proportionnelle pour des extractions avec plus de cellules. La quantité de DNA obtenue est estimée par dosage spectrophotométrique. L'extraction d'un culot équivalent à un puits d'une plaque de 24 puits donne approximativement de 0,5 à 2 μg de DNA selon la densité des cellules dans le puits. Les PCR sont réalisées sur 100 à 500 ng environ.
- Une première PCR est réalisée sur 38 échantillons (N° 1 à 39) pour détecter le locus ovalbumine endogène et s'assurer de la qualité des extractions et des DNA. Cette réaction utilise deux oligonucléotides qui donne une bande amplifiée de taille de 2950 bp (pistes 1 à 39 partie supérieure du gel). - Une deuxième PCR est réalisée pour détecter un événement de recombinaison entre un oligonucléotide externe et la séquence commune à tous les vecteurs ici, la séquence peptide signal lyso 1-18. La taille attendue dans ce cas est de 2900 bp (pistes 1 à 39, partie inféreieure du gel).
M : marqueur de taille,
C, contrôle DNA (obtenu d'un mélange de clones), - Cn, contrôle négatif de la PCR sans DNA
Une autre PCR est réalisée pour déterminer par exclusion le sexe des clones positifs avec des oligonucléotides spécifiques d'une région répétée du chromosome W. Seuls les clones Femelles (ZW) pourront être détectés, les clones maies (ZZ) ne le seront pas. La figure 7 illustre cette détection différentielle sur quelques clones.
Légende de la Figure 7 : Détection du sexe de différents clones identifiés positifs par PCR
Les DNA de différents clones détectés positifs par PCR pour un événement de recombinaison homologue sont soumis à une PCR génomique pour déterminer le sexe des clones. Les oligonucléotides utilisés sont spécifiques du chromosome W du poulet. Ils ne peuvent détecter que les clones femelles. Dans la figure, les clones sont majoritairement maies, comme les cellules utilisées (S86N16), à l'exception du clone A5-1, issu de cellules précoces d'une autre origine (cellules S86N 48).
Clones obtenus avec pOvaRH Hélio : CIO, D21, C44, A5, A21, A5-1 Clones obtenus avec pOvaRH lacZ : A 5-2, A25, A28, B28, B36 Cellules parentales : S86N 16 Control positif : DNA de sang de femelle Control négatif : DNA de sang de maie M : Marker
6.5.3 Southern blot
Afin de vérifier les résultats obtenus en PCR génomiques sur les clones positifs avec les deux PCR discriminantes pour la détection d'un événement de recombinaison, une analyse en Southem blot est réalisée avec du DNA extrait des clones. Cette analyse permet de vérifier que : les tailles du locus ciblé sont conservées et qu'il n'y a pas de délétion majeure un seul événement de recombinaison a eu lieu et que le génome ne contient pas d'autres intégrations aléatoires.
Le DNA des clones est extrait selon une méthode classique de Proteinase K-SDS, avec extraction phénolique ou à l'aide d'un kit commercial d'extraction (Qiagen, Promega).
Dans une approche classique de biologie moléculaire, une quantité variable de DNA est soumise à l'hydrolyse par différentes enzymes, afin de permettre de repérer les fragments dont la taille est différente en fonction de l'événement de recombinaison.
Le Tableau 8 illustre la détection des événements de recombinaison par Southem Blot en fonction des différentes sondes utilisées
Tableau 8 : Détection des événements de recombinaison par Southern blot Les DNA hydrolyses sont soumis à une migration électrophorétique qui sépare les fragments selon leur taille. Le procédé classique de Southern blot est appliqué, avec un transfert sur une membrane hybond N+ (Amersham Pharmacia biotech, UK). Les sondes utilisées pour l'hybridation sont obtenues soit par PCR, soit par purification d'un fragment plasmidique contenant les différents gènes d'intérêt. A titre d'exemple, les sondes lacZ (1159 bp) et Néo (354 bp) sont obtenues par PCR à partir de matrice plasmidique. La sonde ovalbumine 3' est une sonde intronique de 800 bp, obtenue à partir du DNA génomique. La sonde ovalbumine 5' est une sonde intronique de 870 bp. Ces sondes sont obtenues par PCR. Les sondes purifiées sont marquées avec l'alcaline phosphatase à l'aide du kit AlkPhos (Amersham Pharmacia Biotech, UK) et peuvent être gardées plusieurs mois à -20°c. Pour la détection les membranes sont pré hybridées sous agitation à raison de 1 ml/cm2 dans un tampon d'hybridation et ensuite hybridées à 55°C par addition de la sonde marquée (5 ng/ml). Les membranes sont alors lavées à 65°c dans le tampon primaire contenant de l'urée 2M, du NaCl 150 mM, du NaPhosphate 50mM, du MgC12 1 mM, SDS 0,l%o et du 'blocking agent' 0,2%, fourni par le kit, puis dans le tampon secondaire contenant TrisHCl 50 mM pH 10.0, NaCl 100 mM à température ambiante. Le système de révélation par chimiluminescence, prêt à l'emploi est ajouté sur la membrane lavée (1 ml/cm2) et l'intensité des bandes est révélée par autoradiographie. La taille des bandes détectées est comparée avec la taille attendue.
Le critère pour retenir les clones est une bonne adéquation entre la taille attendue et celle observée. Des hybridations complémentaires sont réalisées (résultat non montré)
Figure imgf000057_0001
La figure 8 illustre cette analyse en fonction des tailles attendues. 6.6 Caractérisation des clones
Les différents critères utilisés pour caractériser les cellules parentales sont utilisés pour caractériser les cellules clonées.
6.6.1 Vérification du caryotype
Le caryotype des cellules est analysé sur les métaphases des cellules obtenues selon un protocole classique après un traitement à la colcémide (puise de quelques heures avec 0,05 à 0,15 μg/ml final, de préférence 0,08 μg/ml) des cellules en prolifération. Les métaphases étalées sont observées sous microscope et le nombre de macrochromosomes compté. Le comptage des minichromosomes est réalisable mais plus délicat et une évaluation plus en détail par hybridation in situ peut également être envisagée. Par ailleurs, la vérification par FISH (hybridation in situ avec une sonde fluorescente) de la présence du transgène renforce les observations réalisées par Southem blot quant à l'unicité de l'événement.
6.6.2 Activité Alcaline phosphatase endogène
Le premier test immunocytochimique utilisé est la détection de l'activité alcaline phosphatase endogène. Tous les clones positifs en PCR et validés par l'analyse en Southem Blot sont étudiés comparativement aux cellules parentales.
6.6.3 Anticorps de surface
Comme les cellules parentales sont positives, la présence des antigènes de surface spécifiques des cellules souches est également recherchée au niveau des clones recombinés obtenus. Les réactions avec les anticorps SSEA-1, TEC-01 et EMA-1 sont systématiquement réalisées.
6.6.4 Activité télomérase
L'activité télomérase apparaît être un des bons critères pour juger de l'état indifférencié de cellules souches. Aussi, comme pour les cellules parentales, l'activité télomérase des différents clones recombinés est analysée. Lors du passage des clones pour leur amplification et congélation, un petit aliquot de 5 x 103 à 5x 105 cellules est préparé sous forme de culot cellulaire et l'activité télomérase de ces cellules est évaluée à l'aide du kit 'Telo TAGGGTélomerase PCR Elisa' (Roche). Le niveau de l'activité télomérase apparaît être un bon reflet de la qualité des clones notamment après la pression de sélection appliquée par la drogue.
Le tableau 9 ci-dessous illustre quelques-unes de ces caractéristiques sur des clones recombinés :
Tableau 9 : Caractérisation de clones pOvaRH Hélio issus du criblage par PCR
Figure imgf000059_0001
Les cellules sont ensemencées dans des puits d'une plaque de 12 puits à 10 cellules par puit en moyenne. Les différentes caractérisations sont effectuées après fixation dans le cas de la détection AP et anticorps et sur culot sec qui est lysé selon le protocole établi dans le kit Roche dans le cas de l'activité télomérase (NT = Non Testé). Conclusion : les clones sont dans leur ensemble semblables aux cellules parentales *(S86N16) quant aux différents marqueurs utilisés pour caractériser l'état des cellules.
6.7 Conversion allélique Les clones obtenus et sélectionnés après l'analyse en PCR et en Southern blot sont a priori modifiés sur un seul allèle (détection de l'allèle sauvage en analyse Southem Blot). L'obtention des deux allèles modifiés peut se réaliser in vivo et in vitro. In vivo, les animaux homozygotes pour la modification sont obtenus après croisement des animaux hétérozygotes, eux mêmes descendants des animaux chimères, directement obtenus après injection des cellules modifiées. In vitro, la conversion allélique du deuxième allèle non encore modifié est notamment possible par l'application sur les clones d'une sélection à de fortes doses de la drogue G418 (de 0,5 à 5 mg/ml). Cette approche permet d'obtenir des quantités intéressantes de protéines à la fois in vitro et in vivo.
Exemple 7 : Test in vitro des vecteurs de recombinaison pour la production des protéines d'intérêt.
Le but de l'invention est de produire les molécules dans le liquide physiologique de l'animal, notamment le sang et le blanc d'œuf. Pour réaliser cette approche les vecteurs, notamment les vecteurs de recombinaison homologue sont construits selon les schémas décrits précédemment. Ces vecteurs de recombinaison ciblent différents loci dont principalement le locus de l'ovalbumine et celui du lysozyme. Un point important est la validation de ces vecteurs par une approche in vitro. Notamment il est important de suivre le repliement de la protéine à produire, les modifications post traductionnelles obtenues in vitro dans un système aviaire et l'influence de l'état homozygote du locus modifié sur l'expression de la molécule d'intérêt. Les stratégies de sécrétion sont également étudiées via un modèle in vitro, avec des signaux peptides et des stratégies d'épissage différents selon les constructions.
Deux systèmes complémentaires sont développés pour étudier chacune des principales classes de vecteurs.
7.1 Différenciation in vitro des clones recombinés Dans une première approche la différenciation in vitro des clones de cellules souches peut être mise à profit pour suivre la production des molécules dans le surnageant des cultures. Les conditions de milieux utilisés font appel à la formation de corps embyroïdes soumis à la présence de différents agents tels que des inducteurs comme par exemple le diméthylsulfoxide, l'acide rétinoïque, le TPA, le PMA, le LPS, des facteurs comme par exemple le FGF, TGFβ, MCSF, cMGF, des hormones, comme les hormones stéroïdes, Poestradiaol, la dexaméthasone, la progestérone ou d'autres familles d'hormones.
7.2 Stimulation des cellules en lignée recombinées
7.2.1 Validation des vecteurs pOvaRH
Les cellules LMH sont des cellules aviaires issues d'une tumeur hépatique. D'après quelques exemples pris dans la littérature, le gène de l'ovalbumine semble être activable dans la lignée LMH selon différentes conditions de stimulations hormonales. Notamment, une combinatoire d'insuline, d'oestradiol et de dexaméthasone (stéroïde mimant l'action des glucocorticoïdes) permet une induction plus ou moins importante du gène de l'ovalbumine. Cette stimulation peut être utilisée sur les clones recombinés des cellules LMH. Des co-transfections des récepteurs nucléaires ER et COUTF sont également envisagées pour accroître le niveau de ces récepteurs dans les cellules et ainsi permettre une meilleure induction du gène de l'ovalbumine sous l'effet des différents inducteurs utilisés. Les vecteurs de la famille pOvaRH sont préférentiellement utilisés dans cette approche.
7.2.2 Validation des vecteurs pLyso RH II apparaît possible d'induire la différenciation des cellules HDl l, lignée de monocytes de poulet en cellules macrophages par différents traitements, dont une action par les lipopolysaccharides (Goethe et al., 1994 ; Goethe and Phi-Van, 1998). Dans une approche de stimulation par ces substances, le surnageant des clones recombinés, notamment avec les vecteurs de la famille pLysoRH est étudié et permet d'obtenir des quantités importantes de protéines d'intérêt.
Le Tableau 10 ci-dessous illustre cette production de molécules d'intérêt à partir des cellules HDll recombinées avec un des vecteurs de la famille pLysoRH spécifiquement sous l'action d'inducteur dont les LPS.
Tableau 10 : Stimulation des cellules HDll transfectées avec le vecteur pLyso RH Epo Les cellules HDl l sont transfectées et des clones recombinés obtenus avec le vecteur pLysoRH Epo. Sur les clones stimulés par le LPS (5 μg/ml), deux analyses sont effectuées :
A : une réaction de RT-PCR pour détecter les messagers du lysozyme endogène dans les cellules non trasnfectées induites et les messagers de l'érythropoiétme dans les clones de cellules recombinées.
B : Une détection par réaction Elisa (kit Roche ) du surnageant des clones stimulés ou non stimulés permet de titrer la présence d'érythropoïétine
Figure imgf000062_0001
Conclusion : le clone 1 produit de grandes quantités d'érythropoïétine dans le surnageant de culture.
Exemple 8 : Injection des cellules modifiées dans des embryons receveurs et obtention d'animaux.
Les clones de cellules souches modifiées sont caractérisés comme les cellules parentales à l'aide des différents marqueurs d'immunocytochimie décrits précédemment. A l'issue de ces contrôles, certains clones sont utilisés pour générer des animaux modifiés, destinés à produire la molécule d'intérêt. Parmi les différentes stratégies utilisées pour produire ces animaux, on peut distinguer :
8.1 Injection intrablastodermique.
Les cellules modifiées sont injectées dans la cavité blastodermique d'un embryon receveur de stade blastula selon un protocole décrit précédemment (Pain et al., 1996 . Brevets US 6,114,168 ; WO 96/12793). Les embryons utilisés dans cette approche sont non incubés ou juste incubés. Les cellules vont participer à la colonisation des embryons. Différentes méthodes complémentaires permettent d'évaluer le niveau de contribution des cellules injectées, par exemple, une méthode est basée sur une différence phénotypique entre une souche receveur non pigmentée blanche et une souche donneur colorée (dont sont issues les cellules utilisées). Une autre méthode est le suivi de la présence du transgène par PCR génomique à l'aide d' oligonucléotides spécifiques.
La figure 9 illustre la contribution phénotypique d'un clone modifié avec un vecteur d'expression simple.
Légende de la figure 9 : Obtention de chimères avec les clones modifiés
Chimères obtenues avec des cellules modifiées par le vecteur simple pEGFP- SV40 Néo Les œufs injectés par voie blastodermique sont ouverts à différents stades et les embryons prélevés pour être analysés. Le DNA extrait est soumis à une réaction de PCR génomique avec différents oligonucléotides pour détecter la présence du transgène (ici la E-GFP). La partie supérieure du gel montre ainsi 21 échantillons analysés dont 11 détectés positifs sur les 15 embryons injectés analysés. La partie inférieure montre l'analyse réalisée avec une autre paire d' oligonucléotides, permettant de valider la qualité du DNA et de l'extraction.
Conclusion : les cellules embryonnaires modifiées par un vecteur d'expression simple peuvent contribuer et coloniser les embryons de façon efficace.
Le tableau 11 ci-dessous illustre l'obtention de chimères avec un clone recombiné.
Tableau 11 : Différentes chimères phénotypiques obtenues avec un clone recombiné par le vecteur pOvaRH Hélio, injecté par voie intra-blastodermique. Le taux apparent de chimérisme est variable.
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
* Cellules non modifiées en contrôle
** 6 autres animaux chimériques ont été obtenus à l'état embryonnaire
Le DNA des animaux chimères vivants a été extrait à partir d'une biopsie de plume et une détection PCR confirme la présence du transgène dans les échantillons (résultat non montré).
8.2 Injection intracardiaque Les cellules modifiées sont injectées dans la circulation sanguine via la voie intracardiaque d'un embryon de 48 à 72 h d'incubation. A ce stade de développement, la morphogénèse de l'embryon permet une accessibilité importante de la cavité cardiaque en formation. A l'aide de fins capillaires les cellules sont injectées directement. Le développement se poursuit normalement jusqu'à l'éclosion. Le Tableau 12 ci-dessous illustre la contribution phénotypique de clones modifiés dans les tissus d'embryons par injection intracardiaque
Tableau 12 : Obtention de chimères phénotypiques par injection intracardiaque
Les cellules d'un clone modifié avec un vecteur simple (dans l'exemple le clone 14A est obtenu avec le vecteur pVVS65 contenant le pCMV E-GFP SV40 Néo) ou un vecteur de recombinaison sont injectées en intracardiaque directement dans la circulation d'un embryon incubé quelques heures (de 36 à 72 heures). Dans l'exemple les tissus sont prélevés sur les embryons de 5 à 21 jours selon les cas. Une PCR génomique permet de détecter la présence du transgène, tandis qu'une autre PCR sur un gène endogène valide la qualité du DNA analysé.
Figure imgf000064_0002
Figure imgf000065_0001
* différents tissus sont prélevés sur des poussins à l'éclosion et analysés. Les détections PCR sont positives en général sur plusieurs tissus différents.
8.3 Utilisation des noyaux modifiés comme source de noyaux dans un processus de transfert nucléaire.
Les cellules modifiées sont des sources de noyaux modifiés qui peuvent être utilisés dans des techniques de transfert nucléaire dans un ovocyte receveur afin de reconstituer un embryon. Dans ce cas, la modification apportée par le noyau est directement portée par l'animal dans son patrimoine génétique et donc transmis à tous ses descendants. Les techniques actuelles de fusion de la cellule et /ou du seul noyau avec l' ovocyte préparé permettent d'envisager une telle approche. Les phases d'activation permettant alors une reprogrammation efficace du noyau donneur en lieu et place du matériel génétique haploïde de l' ovocyte receveur.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une cellule aviaire pour la production d'une protéine exogène d'intérêt dans un animal appartenant à l'espèce aviaire, caractérisée en ce que ladite cellule est transfoimée par un vecteur d'expression comprenant le gène codant pour ladite protéine, ladite cellule étant introduite soit dans la cavité sub-germinale d'un embryon, la circulation sanguine de l'embryon ou servant de source de noyau pour le transfert nucléaire dans un ovocyte énucléé ou non, ou dont les chromosomes ont été détruits.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le vecteur permet une expression tissu-spécifique, en particulier dans l'oviducte, le foie, le sang, la moelle et les organes lymphoïdes.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce que le vecteur est un vecteur de recombinaison homologue possédant des bras 5' et 3' d'homologie aux séquences d'un locus donné.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le locus ciblé est sélectionné parmi le locus de l'ovalbumine, des ovomucoïdes, de la conalbumine et du lysozyme.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que le vecteur de recombinaison homologue comprend dans une base plasmidique un enchaînement de au moins un élément pris successivement parmi a) un fragment d'ADN génomique contenant le bras d'homologie 5' du gène ciblé fusionné à, b) une séquence nucléotidique signal de sécrétion fusionnée à, c) une courte séquence nucléotidique intronique fusionnée à, d) la séquence nucléotidique codante pour la protéine d'intérêt fusionnée à, e) une séquence poly A de terminaison de la transcription fusionnée à, f) une cassette de sélection positive comprenant un promoteur, un gène de résistance à un agent de sélection et une séquence poly A de terminaison de transcription, ladite cassette pouvant être fusionnée à, g) un fragment d'ADN génomique contenant le bras d'homologie 3' du gène ciblé, h) une cassette de sélection négative comprenant un promoteur, un gène assurant la transformation d'un substrat présent dans le milieu de culture en une substance toxique pour la cellule qui exprime le gène et une séquence polyA de terminaison de transcription.
6. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le vecteur comprend d) la séquence codante pour la protéine exogène fusionnée en son extrémité 5' avec c) une courte séquence intronique en particulier comprenant la séquence SEQ ID N° 1 elle même fusionnée avec e) une séquence peptide signal de sécrétion, en particulier la séquence codante pour le peptide signal du lysozyme comprenant la séquence SEQ ID N° 2.
7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le vecteur comprend d) la séquence codante pour la protéine exogène fusionnée en son extrémité 3' avec une séquence poly A.
8. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le vecteur comprend au moins une séquence IRES en fusion avec au moins deux séquences codantes pour la protéine d'intérêt exogène.
9. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le vecteur comprend au moins une séquence IRES en fusion avec au moins deux séquences codantes pour différentes chaînes constituant une protéine d'intérêt, en particulier les chaîne lourde et légère d'un anticorps de quelque nature que ce soit, en particulier un anticorps monoclonal, un fragment fab.
10. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la séquence IRES est prise dans le groupe des séquences IRES de groupe I ou de groupe
11. en particulier les séquences V130, Idemfix, Zam,
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce que le vecteur est un vecteur d'expression comprenant la séquence codante pour la protéine d'intérêt fusionnée avec au moins un élément pris parmi a) un promoteur, en particulier sélectionné parmi les promoteurs des gènes de l'ovalbumine, des ovomucoïdes, de la conalbumine et du lysozyme, b) une séquence peptide signal c) une séquence nucléotidique polyA de terminaison de transcription.
12. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le vecteur d'expression comprend une séquence IRES fusionnée avec au moins deux séquences codantes pour la même protéine d'intérêt ou pour des séquences codantes différentes
13. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la cellule est une cellule aviaire embryonnaire primaire.
14. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la cellule est une cellule aviaire embryonnaire souche,en particulier les cellules embryonnaires souches issues de la mise en culture de blastodermes.
15. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la cellule embryonnaire aviaire présente un phénotype alcaline phosphatase positive, en particulier un phénotype de cellule souche embryonnaire alcaline phosphatase positive.
16. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la cellule embryonnaire aviaire réagit spécifiquement avec au moins un anticorps sélectionné parmi ECMA-7, SSEA-1, SSEA-3, TEC-01, EMA-1 et EMA-6, en particulier une cellule souche embryonnaire, une cellule germinale embryonnaire.
17. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la cellule est une cellule aviaire primaire de phénotype défini en particulier pour un fibroblaste primaire, une cellule épithéliale, une cellule endothéliale.
18. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la cellule est une cellule aviaire dérivée d'une cellule embryonnaire primaire et établie spontanément en culture ou à l'aide de différents agents immortalisants, en particulier les cellules dérivées des cellules souches embryonnaires induites à différencier sous l'action de différents agents inducteurs en particulier l'acide rétinoïque, le diméthylsulfoxide, le TPA ou de conditions de cultures spécifiques, en particulier par la formation de corps embryoïdes
19. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que la cellule est une cellule aviaire établie en lignée, en particulier les cellules hépatiques LMH, les cellules monocytes HDll, les cellules fibroblastiques QT6.
20. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 19 caractérisée en ce que ladite cellule est transformée avec un vecteur d'expression exprimant une protéine de la famille Rad, en particulier la protéine Rad54.
21. Procédé d'obtention d'une cellule aviaire modifiée par un des vecteurs défini selon l'une des revendications 5 à 11.
22. Procédé d'obtention d'une cellule aviaire modifiée selon la revendication 21 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) introduction du vecteur défini selon l'une des revendications 5 à 11 dans une cellule embryonnaire aviaire par une méthode de transfection, en particulier à l'aide d'un liposome, d'un polycation ou par électroporation b) sélection des cellules par l'addition d'un agent de sélection dans le milieu de culture, en particulier la généticine dans une gamme de concentration de 100 à 500 ug/ml c) criblage des clones résistants et amplification.
23. Procédé selon l'une des revendications 21 et 22 caractérisé en ce que le vecteur de recombinaison cible le locus du lysozyme.
24. Procédé selon la revendication 21 à 23 caractérisé en ce que le surnageant de culture des clones recombinés contient la protéine exogène d'intérêt, en particulier après induction du clone à l'aide de différents inducteurs,en particulier l'acide rétinoïque, le diméthylsulfoxide, le TPA ou de conditions de cultures spécifiques, en particulier par la formation de corps embryoïdes.
25. Procédé selon la revendication selon l'une des revendications 21 à 24 caractérisé en ce que les deux allèles du locus ciblé sont modifiés.
26. Procédé selon l'une des revendications 21 à 25 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules aviaires embryonnaires primaires.
27. Procédé selon l'une des revendications 21 à 25 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules aviaires embryonnaires souches, en particulier les cellules embryonnaires souches issues de la mise en culture de blastodermes.
28. Procédé selon l'une des revendications 21 à 27 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules présentant un phénotype alcaline phosphatase positive, en particulier un phénotype de cellule souche embryonnaire alcaline phosphatase positive.
29. Procédé selon l'une des revendications 21 à 25 caractérisé en ce que les cellules embryonnaires aviaires réagissent spécifiquement avec au moins un anticorps sélectionné parmi ECMA-7, SSEA-1, SSEA-3, TEC-01, EMA-1 et EMA-6.
30. Procédé selon l'une des revendications 21 à 25 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules aviaires primaires de phénotype défini en particulier pour un fibroblaste primaire, une cellule épithéliale, ou une cellule endothéliale.
31. Procédé selon l'une des revendications 21 à 25 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules aviaires dérivées d'une cellule embryonnaire primaire et établie en lignée à l'aide de différents agents immortalisants, en particulier les cellules dérivées des cellules souches embryonnaires induites à différencier sous l'action de différents agents inducteurs en particulier l'acide rétinoïque, le diméthylsulfoxide, le TPA ou de conditions de cultures spécifiques, en particulier par la formation de corps embryoïdes.
32. Procédé selon l'une des revendications 21 à 25 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules aviaires établies en lignée, en particulier les cellules hépatiques LMH, les cellules monocytes HD11, les cellules fibroblastiques QT6.
33. Procédé selon l'une des revendications 21 à 32 caractérisé en ce que lesdites cellules sont transformées avec un vecteur d'expression exprimant une protéine de la famille Rad, en particulier la protéine Rad54.
34. Procédé selon l'une des revendications 21 à 33 caractérisé en ce que le milieu utilisé comprend des anticorps anti-acide rétinoïque (ARMA).
35. Procédé selon l'une des revendications 21 à 34 caractérisé en ce que le milieu utilisé comprend une cytokine choisie dans le groupe constitué de LIF, IL-11, IL-6 et leurs différents mélanges.
36. Procédé selon l'une des revendications 21 à 35 caractérisé en ce que le milieu utilisé comprend différents facteurs en particulier le SCF, 1TGF-1, le bFGF, le CNTF et l'Oncostatine.
37. Procédé d'obtention d'un animal appartenant à l'espèce aviaire capable d'exprimer une protéine exogène d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention de cellules aviaires modifiées par le procédé défini selon l'une des revendications 21 à 36, b) introduction de la cellule obtenue à l'étape a) dans la cavité sub-germinale d'un embryon, dans la circulation sanguine ou par transfert nucléaire du noyau de ladite cellule dans un ovocyte énucléé ou non énuclée, et c) incubation de l'embryon obtenu à l'étape c).
38. Procédé selon la revendication 37 caractérisé en ce que le vecteur utilisé à l'étape a) permet une expression tissu-spécifique, en particulier dans l'oviducte, le foie, le sang, la moelle et les organes lymphoïdes.
39. Procédé selon l'une des revendications 37 et 38 pour obtenir un animal appartenant à l'espèce aviaire présentant une expression tissu-spécifique d'une protéine exogène d'intérêt, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur de recombinaison homologue possédant parmi différents éléments constitutifs nécessaires à son fonctionnement des bras 5' et 3' d'homologie aux séquences d'un locus donné, notamment un locus sélectionné parmi le locus de l'ovalbumine, des ovovmucoïdes, de la conalbumine et du lysozyme.
40. Procédé selon l'une des revendications 37 à 39, caractérisé en ce que le vecteur comprend la séquence codante pour la protéine exogène fusionnée avec au moins un élément sélectionné parmi une séquence intronique, une séquence peptide signal de sécrétion, en particulier le peptide signal du lysozyme comprenant la séquence SEQ ID No 2, une séquence poly A, un IRES et un promoteur, en particulier choisi parmi les promoteurs des gènes de l'ovalbumine, des ovomucoïdes, de la conalbumine et du lysozyme.
41. Procédé selon l'une des revendications 37 à 40, caractérisé en ce que l'étape b) comprend en outre la transformation des cellules aviaires avec un vecteur exprimant une protéine de la famille Rad, en particulier Rad54.
42. Procédé de production d'une protéine d'intérêt comprenant l'extraction de la protéine exogène exprimée dans les tissus d'un animal obtenu à partir du procédé selon l'une des revendications 37 à 41.
43. Procédé de production d'une protéine d'intérêt comprenant l'extraction de la protéine exogène exprimée dans le surnageant des cellules issues du procédé selon l'une des revendications 21 à 36.
44. Procédé selon la revendication 42 caractérisé en ce que la protéine est extraite du sang, du jaune ou du blanc d'œuf.
45. Animal appartenant à l'espèce aviaire susceptible d'être obtenu à partir du procédé selon l'une des revendications 37 à 41, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine exogène dans un tissu spécifique.
46. Animal selon la revendication 45, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine exogène dans le foie, le sang, la moelle, les organes lymphoïdes ou l'oviducte.
47. Œuf susceptible d'être obtenu à partir d'un animal selon l'une des revendications 45 et 46, caractérisé en ce qu'une partie de ces composants, en particulier l'ovalbumine, les ovomucoïdes, la conalbumine et le lysozyme soit partiellement ou totalement remplacée par une protéine d'intérêt exogène, sélectionnée notamment parmi les peptides à intérêt thérapeutique, les interleukines, les cytokines, les hormones, et les anticorps.
48. Œuf susceptible d'être obtenu à partir d'un animal selon la revendication 47, caractérisé en ce qu'il comprend une proportion de protéine exogène comprise entre quelques mg (1 à 10 mg) et 500 mg de matières sèches en lieu et place d'une partie ou de la totalité d'au moins une protéine endogène, choisie notamment parmi l'ovalbumine, les ovomucoïdes, la conalbumine, le lysozyme et l'avidine.
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