WO2003037219A2 - Verwendung von chitosanmaterialien - Google Patents

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WO2003037219A2
WO2003037219A2 PCT/EP2002/012112 EP0212112W WO03037219A2 WO 2003037219 A2 WO2003037219 A2 WO 2003037219A2 EP 0212112 W EP0212112 W EP 0212112W WO 03037219 A2 WO03037219 A2 WO 03037219A2
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film
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matrix
acid
chitosan
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PCT/EP2002/012112
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Birger Hahnemann
Andrea Pahmeier
Philipp Sperling
Thomas LÖTZBEYER
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Alvito Biotechnologie Gmbh
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction

Definitions

  • the invention relates to the use of a biocompatible material based on chitosan and an acid, e.g. as a flexible film and / or porous matrix, as an agent in the field of neurosurgery, in particular as a nerve splint, and for repairing tendons and ligaments.
  • a biocompatible material based on chitosan and an acid e.g. as a flexible film and / or porous matrix
  • German patent application 199 48 1 20.2 discloses a method for producing a biocompatible three-dimensional matrix, in which an aqueous solution of a chitosan and an acid present in excess, in particular a hydroxycarboxylic acid, is frozen and the water is sublimed under reduced pressure, the excess acid before the freezing or after sublimation of the water is removed, in particular neutralized. Furthermore, a matrix obtainable by the method is disclosed which can be used for the production of implants.
  • German patent application 101 17 234.6 discloses biocompatible non-porous materials based on chitosan and an acid, in particular a hydroxycarboxylic acid. These materials can be in the form of a film, for example.
  • a first aspect of the present invention therefore relates to the use of a biocompatible material based on chitosan and an acid, in particular a hydroxycarboxylic acid, as an agent in the field of Neurosurgery, for example for extracorporeal or intracorporeal nerve reconstruction.
  • the material is in the form of a flexible, in particular non-porous, film.
  • the film has a thickness of preferably 1 ⁇ m-200 ⁇ m, particularly preferably 10 m-50 ⁇ m and is obtainable from:
  • Drying preferably by neutralization.
  • the film can be made in prefabricated strips with a width of e.g. 1 mm - 10 mm can be produced. Alternatively, the required pieces of film can also be used, e.g. during an operation.
  • a film with a "memory effect” i.e. used with a preferred winding direction. This means that the film tends to roll up or form windings under conditions of use.
  • the film with "memory effect” can be produced in a simple manner by removing the acid, e.g. the neutralization takes place from one side of the film body.
  • the film in particular the film with a "memory effect" is suitable as a nerve splint for wrapping nerves. It was found that Schwann cells in particular can grow well on the film.
  • the nerve splint can also be used, for example, in accident surgery for the primary care of severed nerve endings and in reconstructive surgery.
  • Another area of application for the film is the wrapping of tendons and ligaments, a rolled film advantageously being used. It has been found that the growing together of severed tendons and ligaments is promoted by tension-free wrapping with a film according to the invention.
  • the covering can adapt to the dimensions of the wrapped ligaments or tendons. Under these conditions tenocytes, for example also human tenocytes, show a clearly better reproduction than in other matrices.
  • the film can be used as a support for a porous three-dimensional matrix.
  • biocompatible composite materials can be provided which comprise at least one biocompatible film, as described above, and at least one biocompatible porous matrix.
  • the biocompatible porous matrix is preferably based on chitosan and an acid, in particular a hydroxycarboxylic acid.
  • other porous biocompatible matrices can also be used.
  • the biocompatible material based on chitosan and an acid is a porous matrix.
  • a biocompatible porous matrix according to German application 1 99 48 1 20.2 is particularly preferably used, which is obtainable by:
  • the porous matrix can be used, for example, as a swab or / and tamponade for medical or veterinary applications, for example as a neurological swab, as a matrix for growing together nerve endings and / or as a tamponade for abscess cavities. It has been found that the porous matrix is particularly well suited for the ingrowth of neurons. Another advantage of the porous matrix is its high swellability up to 10 times the original weight or more.
  • the porous matrix can be produced in prefabricated pieces with a volume of, for example, 1 -1 0 mm 3 .
  • the required pieces can be made as needed, for example during an operation.
  • the material can be a combination of a flexible film and a porous matrix.
  • the film and the matrix can be used as separate components, for example for the reconstruction of severed nerves.
  • FIG. 1A a cut is made between the ends (2, 4)
  • a porous matrix (6) is inserted into the nerve fiber.
  • a film (8) is wound in one or more turns around the nerve cord.
  • the film (8) can be fixed with a suitable adhesive, e.g. one
  • Fibrin glue or a tissue glue can be fixed.
  • 1B shows a cross section through the matrix (6) and the film (8), the film having a plurality of windings.
  • the film (8) has only one complete winding around the matrix (6).
  • Ligaments can also be anchored to bones.
  • the bone, into which a recess can be milled if necessary, is covered with a porous matrix covered, can grow into the tenocytes of the porous tendon or ligament, if necessary after wrapping with a rolled foil, whereby a stable anchoring is achieved on the bone.
  • the film relates to use as a biohybrid implant, e.g. as a capsule or tube structure, optionally in combination with the porous matrix for encapsulating cells, in particular electrostimulable cells.
  • the implant is a neuron microsensor.
  • the sheath is implanted in the body and can be used to regenerate nerves, e.g. peripheral nerves serve as a pain pump (Erb et al., Exp. Neurol. 1 24, (1 9-93), 372-376).
  • the film may also serve as a pain pump in combination with the matrix.
  • This pain pump is an implant that has a controllable release of endorphins / enkephalins in the cerebrospinal fluid space by means of external stimuli for the treatment of the most severe chronic pain conditions, as is the case for example with spinal and tumor diseases.
  • a kind of sack is sewn with the help of the film, in which the biohybrid implant is located.
  • the matrix can also serve as a carrier for the chromaffin cells, which later release pain-relieving peptides in response to electrostimuli.
  • the chitosan-based material in particular the film, can be used to cover tissue and organs, for example the brain after injuries and / or during surgical interventions.
  • the film and matrix can also be used as composite components, the film and matrix being alternately arranged in layers. Examples of such multilayer systems are shown in FIGS. 2A, 2B and 2C.
  • a non-porous film can also be arranged between two porous matrices.
  • the non-porous film according to the invention, the porous matrix or the composite system based thereon can also be used for the in vitro cultivation of neuronal cells.
  • the materials can include additional factors for cell growth, e.g. Cytokines.
  • the porous matrix can optionally have anisotropic structures, for example fibers or / and chambers aligned in parallel.
  • anisotropic matrix is available through:
  • Hydroxycarboxylic acid anisotropic freezing and drying of the solution, in particular by sublimation under reduced pressure and
  • the anisotropic freezing preferably comprises freezing using structured cooling elements, for example pipes in direct or indirect contact with the matrix during the freezing process.
  • the cooling elements can be elongated in order, for example, to obtain fibers or chambers in the matrix which are aligned in parallel.
  • curved structures for example reproductions of the organ to be shaped, can also be used as cooling elements.
  • the anisotropic porous matrix can be used in a biocompatible composite material system together with another material, for example with a biocompatible non-porous film.
  • the anisotropic matrix or the composite material system based thereon can be used for the in vitro cultivation of cells or as an implant without prior cell colonization, in accordance with the aforementioned applications.
  • the matrices and films according to the invention based on chitosan and acids are essentially produced by the process specified in German applications 199 48 120.2 and 101 17 234.6, unless stated otherwise.
  • an aqueous solution of a partially deacetylated chitosan and an acid present in excess is first prepared.
  • An excess is understood to mean that the pH of the aqueous solution is acidic, preferably below pH ⁇ 4.
  • the free amino groups of the chitosan are at least partially protonated, which increases the solubility in water.
  • the amount of acid is not critical. It only has to be chosen so that the chitosan goes into solution.
  • Amounts of acid which give a 0.05 to 1 N, preferably 0.1 to 0.5 N, in particular 0.1 to 0.3 N solution are favorable.
  • the amount of chitosan is preferably chosen so that a 0.01 to 0.5 M, preferably 0.1 to 0.3 M solution results.
  • the concentration of the chitosan solution can influence the structure of the matrix, in particular its pore size. In this way, the pore size of the matrix can be matched to the particular cell type with which the matrix is to be populated.
  • Chitosan does not have a uniform molecular weight due to its production from natural sources. Depending on the source and processing method, the molecular weight can range from 20 kDa to over 1,000 kDa.
  • the chitosan is not subject to any restrictions in terms of its molecular weight for the production of the three-dimensional matrix.
  • an acid is used, which is an inorganic acid or preferably an organic acid, particularly preferably an alkyl or aryl hydoxycarboxylic acid.
  • Particularly suitable are hydroxycarboxylic acids having 2 to 1 2 carbon atoms, it being possible for one or more hydroxyl groups and one or more carboxyl groups to be present in the molecule.
  • Specific examples are glycolic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid and mandelic acid. Lactic acid is particularly preferred.
  • the solution of chitosan and acid is first at least partially neutralized by adding base and then frozen or directly frozen without prior neutralization. Neutralization before freezing is preferred.
  • the pH after neutralization is generally 5.0 to 7.5, preferably 5.5 to 7.0 and in particular 6.0 to 7.0.
  • the water is sublimed under reduced pressure, for example in the pressure range from 0.001 to 3 hPa.
  • the solution is not frozen and sublimed, but is dried without freezing at an optionally elevated temperature and / or reduced pressure and is preferably neutralized after drying.
  • the resulting non-porous matrix is strong and stretchy when wet. Due to the large number of amino and hydroxy groups, the material can be modified as required.
  • ligands are covalently or non-covalently bound to the chitosan, preferably to the free amino groups of the chitosan.
  • growth substances, proteins, hormones, heparin, heparan sulfates, chondroite sulfates, dextran sulfates or a mixture of these substances can be used as ligands.
  • the ligands are preferably used to control and improve cell proliferation.
  • Cell growth on the matrix or film is further improved if the matrix is coated with autologous fibrin.
  • the three-dimensional matrix can be populated with both human and animal cells (for example from horses, dogs or sharks). Shark cells are particularly suitable because they do not trigger an essential immunological response in the recipient.
  • the materials, as described above, can be used in human medicine and veterinary medicine. Further areas of application are the use as single-use items, e.g. as a swab.
  • the materials are sterilized before use in cell culture to guarantee sterility.
  • the sterilization can be carried out by temperature treatment, e.g. by autoclaving, steam treatment etc. or / and by radiation, e.g. Gamma radiation treatment.
  • the sterilization is preferably carried out in a physiologically compatible buffered solution, e.g. in PBS to ensure complete wetting of the matrix or film with liquid and the absence of larger air pockets.
  • the material When the cells are cultivated, the material is broken down in a period of about 5-8 weeks or longer.
  • the dismantling times can be done via the Degree of deacetylation of the chitosan and the concentration of the material can be adjusted.
  • Figure 1 shows combinations of materials in which film and matrix are used as separate combinations.
  • Figure 2 shows alternative embodiments in Figures 2A, 2B and 2C.
  • Figure 3 Image A and B: Schwann cells (adult rats, 10% FCS), uncoated; Image C and D: PORN / Laminin, Image E and F: PLL; Focus level: culture dish (A, C, E); Foil * (B, D, E).
  • Figure 4 Spinal ganglion neuron cultures of the rat (P1), PORN-laminin coated plastic (left); uncoated film (right), 24 h in culture.
  • Figure 5 Spinal ganglion neurons (diss. P1, rat) under serum-free conditions (+ NGF), 3 days culture. Neurons partially detach during histological processing. from the matrix. Nevertheless, differentiated neurons with neurites are found in association with the matrix (see arrows in C, E, F).
  • Figure 6 Axonal regeneration (rat, adult, N. isch.) 8 weeks after implantation of a "wound" film interposition.
  • the wrapped film is built into the connective tissue.
  • the type of installation no cells in the
  • Figure 7 Axial regeneration (rat, adult, N. isch.) Of three test animals (A / B; C / D; E / F) 8 weeks after implantation of a "wound" film interposition.
  • Overview enlargements (4x, A, C, E) of the proximal nerve-foil transition, and enlargements of the distal nerve stump (10x) with regenerated axons (see arrow).
  • Example 1 Production of a non-porous film
  • a mixture of chitosan and lactic acid is prepared by the process described in Example 3 of DE 1 99 48 120.2.
  • the solution is poured into a Petri dish, dried at 50 ° C. and, after the formation of a crystal-clear film, neutralized to a pH of 7 with 1 M sodium hydroxide solution.
  • the resulting film is extremely resilient and stretchable when wet.
  • Schwann cells and spinal ganglion neurons were applied to the film or matrix and grown in vitro.
  • the film is particularly suitable for growing Schwann cells on it ( Figures 3 and 4)
  • Neurons are grown in the matrix particularly with pore diameters of around 10-20 ⁇ m ( Figure 5).
  • Example 3 Atraumatic nerve adaptation using a film with a memory effect
  • Two stumps of nerves are connected using the self-rolling chitosan film, the ends are fixed using standard fibrin glue.
  • the film is spread using tweezers, the nerve stumps are placed on it. After removing the tweezers, the film automatically rolls up (memory effect) and encloses the nerve endings.
  • microsurgical suture is required, i.e. the procedure can also be carried out easily by a physician who is inexperienced in microsurgery, including accident surgeons.
  • the spiral rolling up of the foil prevents pressure on the nerve endings: If the nerve stumps swell regularly after a nerve severation, the foil can easily adapt to the increased diameter without exerting any pressure on the nerve endings. This avoids a major disadvantage of artificial neural artifacts common today, namely secondary nerve damage due to circular structures with constant diameters.
  • Nerve splinting with a chitosan film with memory effect is possible. Nerve splinting also allows nerve adaptation if there is dehiscence between the nerve endings. This still requires the implantation of a nerve exhibit, e.g. from a skin nerve of the leg. The regeneration can be accelerated by coating with film with Schwann cells.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure, z.B. als flexible Folie oder/und poröse Matrix, als Mittel auf dem Gebiet der Neurochirurgie, insbesondere als Nervenschiene, und zur Reparatur von Sehnen und Bändern.

Description

Verwendung von Chitosanmaterialien
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure, z.B. als flexible Folie oder/und poröse Matrix, als Mittel auf dem Gebiet der Neurochirurgie, insbesondere als Nervenschiene, und zur Reparatur von Sehnen und Bändern.
Die Deutsche Patentanmeldung 199 48 1 20.2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer biokompatiblen dreidimensionalen Matrix, wobei eine wässrige Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, eingefroren wird und das Wasser bei vermindertem Druck absublimiert wird, wobei die überschüssige Säure vor dem Einfrieren oder nach dem Absublimieren des Wassers entfernt, insbesondere neutralisiert wird. Weiterhin wird eine durch das Verfahren erhältliche Matrix offenbart, die zur Herstellung von Implantaten verwendet werden kann.
Die Deutsche Patentanmeldung 101 17 234.6 offenbart biokompatible nichtporöse Materialien auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure. Diese Materialien können beispielsweise in Form einer Folie vorliegen.
Ausgehend von dieser Erkenntnis war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Anwendungen für Materialien auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, bereitzustellen.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, als Mittel auf dem Gebiet der Neurochirurgie, beispielsweise zur extrakorporalen oder intrakorporalen Nervenrekonstruktion.
In einer ersten Ausführungsform liegt das Material in Form einer flexiblen, insbesondere nichtporösen Folie vor. Die Folie hat eine Dicke von vorzugsweise 1 μm-200 μm, besonders bevorzugt von 10 m-50 μm und ist erhältlich durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im
Ü berschuss vorl iegenden Säure, insbesond ere ei ner Hydroxycarbonsäure,
Trocknen der Lösung ohne Einfrieren und
Entfernen von überschüssigen Säuren vor oder/und nach dem
Trocknen, vorzugsweise durch Neutralisation.
Die Folie kann in vorgefertigten Streifen mit einer Breite von z.B. 1 mm- 10 mm hergestellt werden. Alternativ können die benötigten Folienstücke auch nach Bedarf, z.B. während einer Operation, angefertigt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Folie mit "Memory-Effekt", d.h. mit einer bevorzugten Aufrollrichtung eingesetzt. Dies bedeutet, dass die Folie unter Anwendungsbedingungen zum Aufrollen bzw. zur Ausbildung von Wicklungen neigt. Die Folie mit "Memory-Effekt" kann auf einfache Weise dadurch hergestellt werden, dass die Entfernung der Säure, z.B. die Neutralisation, von einer Seite des Folienkörpers her erfolgt.
Die Folie, insbesondere die Folie mit "Memory-Effekt", eignet sich als Nervenschiene zum Umwickeln von Nerven. Es wurde gefunden, dass insbesondere Schwann'sche Zellen gut auf der Folie aufwachsen können. Die Nervenschiene kann z.B. auch in der Unfallchirurgie zur Erstversorgung von abgetrennten Nervenenden und in der Wiederherstellungschirurgie eingesetzt werden. Ein weiteres Anwendungsgebiet der Folie ist das Umwickeln von Sehnen und Bändern, wobei günstigerweise eine gerollte Folie verwendet wird. Es wurde gefunden, dass das Zusammenwachsen von durchtrennten Sehnen und Bändern durch spannungsfreies Umwickeln mit einer erfindungsgemäßen Folie gefördert wird. Die Umhüllung kann sich an die Ausmasse der umwickelten Bänder bzw. Sehnen anpassen. Unter diesen Bedingungen zeigen Tenocyten, z.B. auch humane Tenocyten eine deutlich bessere Vermehrung als in anderen Matrices.
Die Folie kann als Träger für eine poröse dreidimensionale Matrix verwendet werden. Somit können biokompatible Verbundmaterialien bereitgestellt werden, die mindestens eine biokompatible Folie, wie zuvor beschrieben, und mindestens eine biokompatible poröse Matrix umfassen. Die biokompatible poröse Matrix ist vorzugsweise auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure aufgebaut. Es können jedoch auch andere poröse biokompatible Matrices verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das biokompatible Material auf Basis von Chitosan und einer Säure eine poröse Matrix.
Besonders bevorzugt wird eine biokompatible poröse Matrix gemäß der deutschen Anmeldung 1 99 48 1 20.2 verwendet, die erhältlich ist durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im
Ü berschuss vorliegenden Säu re, insbesond ere einer Hydroxycarbonsäure,
Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimieren bei verringertem Druck und
Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren, insbesondere durch Neutralisation mit einer geeigneten Base, z.B. NaOH. Die poröse Matrix kann beispielsweise als Tupfer oder/und Tamponade für medizinische oder veterinärmedizinische Anwendungen, z.B. als neurologischer Tupfer, als Matrix zum Zusammenwachsen von Nervenenden und/oder als Tamponade für Abzesshöhlen, eingesetzt werden. Es wurde gefunden, dass die poröse Matrix besonders gut zum Einwachsen von Neuronen geeignet ist. Ein weiterer Vorteil der porösen Matrix ist die hohe Quellfähigkeit auf das 10fache des Ausgangsgewichts oder mehr.
Die poröse Matrix kann in vorgefertigten Stücken mit einem Volumen von z.B. 1 -1 0 mm3 hergestellt werden. Alternativ können die benötigten Stücke nach Bedarf, z.B. während einer Operation, angefertigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Material als Kombination einer flexiblen Folie und einer porösen Matrix vorliegen. Die Folie und die Matrix können dabei als separate Komponenten eingesetzt werden, beispielsweise zur Rekonstruktion von durchtrennten Nerven. Ein Beispiel für eine derartige Kombination von Materialien, bei der Folie und Matrix als separate
Komponenten eingesetzt werden, ist in Figur 1 A, 1 B und 1 C gezeigt. Gemäß Figur 1 A wird zwischen den Enden (2, 4) einer durchtrennten
Nervenfaser eine poröse Matrix (6) eingefügt. Um den Nervenstrang wird eine Folie (8) in einer oder mehreren Windungen gewickelt. Die Folie (8) kann zur Fixierung am Nerv mit einem geeigneten Klebstoff, z.B. einem
Fibrinkleber oder einem Gewebekleber fixiert werden. In Figur 1 B ist ein Querschnitt durch die Matrix (6) und die Folie (8) gezeigt, wobei die Folie mehrere Wicklungen aufweist. In Figur 1 C weist die Folie (8) nur eine vollständige Wicklung um die Matrix (6) auf.
Auf analoge Weise wie in Figur 1 gezeigt, kann eine Reparatur von Sehnen und Bändern erfolgen. Darüber hinaus können durchtrennte Sehnen und
Bänder auch auf Knochen verankert werden. Hierzu wird der Knochen, in den ggf. eine Vertiefung eingefräst werden kann, mit einer porösen Matrix abgedeckt, in die Tenocyten der porösen Sehne oder des Bandes, ggf. nach Umwicklung mit einer gerollten Folie einwachsen können, wobei eine stabile Verankerung auf dem Knochen bewirkt wird.
Noch eine weitere bevorzugte Anwendung der Folie betrifft eine Verwendung als biohybrides Implantat, z.B. als Kapsel- oder Röhrenstruktur ggf. in Kombination mit der porösen Matrix zur Verkapselung von Zellen, insbesondere elektrostimulierbaren Zellen. In einer Ausführungsform ist das Implantat eine Neuronenmikrosonde. Dabei wird eine Hülle bestehend aus der Folie, z.B. in Form eines Sacks oder einer röhrenartigen Struktur, bereitgestellt, in die ggf. genetisch veränderte neuronale Zellen eingefüllt werden. Die Hülle wird in den Körper implantiert und kann ggf. nach Elektrostimulation zur Regeneration von Nerven, z.B. peripheren Nerven als Schmerzpumpe dienen (Erb et al., Exp. Neurol. 1 24, ( 1 9-93), 372-376).
Weiterhin kann die Folie ggf. in Kombination mit der Matrix auch als Schmerzpumpe dienen. Diese Schmerzpumpe ist ein Implantat, welches d u rch externe Sti muli eine steuerbare Freisetzung von Endorphinen/Enkephalinen im Hirn-Liquorraum zum Zweck der Behandlung schwerster chronischer Schmerzzustände hat, wie dies beispielsweise bei Wirbelsäulen- und Tumorerkrankungen der Fall ist.
Um gentechnisch veränderte Zellen und die Elektrostimulation zu erreichen, wird mit Hilfe der Folie eine Art Sack genäht, in welchem das biohybride Implantat sich befindet. Neben der Folie als äußerer Scheide kann zudem die Matrix als Träger für die chromaffinen Zellen dienen, die später auf Elektrostimuli hin schmerzstillende Peptide freisetzen.
Weiterhin kann das Material auf Chitosanbasis, insbesondere die Folie als Abdeckung von Gewebe und Organen, z.B. dem Gehirn nach Verletzungen und/oder während chirurgischer Eingriffe dienen. ln einer alternativen Ausführungsform können Folie und Matrix auch als Verbundkomponenten eingesetzt werden, wobei Folie und Matrix jeweils abwechselnd in Schichten angeordnet sind. Beispiele für derartige Mehrschichtsysteme sind in Figur 2A, 2B und 2C dargestellt. Alternativ kann eine nichtporöse Folie auch zwischen zwei porösen Matrices angeordnet sein.
Die erfindungsgemäße nichtporöse Folie, die poröse Matrix oder das darauf basierende Verbundsystem kann auch zur in vitro Kultivierung von neuronalen Zellen verwendet werden. Dabei können die Materialien zusätzliche Faktoren zum Zellwachstum, z.B. Zytokine, enthalten.
Die poröse Matrix kann gegebenenfalls anisotrope Strukturen, beispielsweise parallel ausgerichtete Faser oder/und Kammern aufweisen. Die anisotrope Matrix ist erhältlich durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im
Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer
Hydroxycarbonsäure, anisotropes Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimation bei verringertem Druck und
Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem
Einfrieren.
Das anisotrope Einfrieren umfasst vorzugsweise ein Einfrieren unter Verwendung von strukturierten Kälteelementen, z.B. Rohren in direktem oder indirektem Kontakt mit der Matrix während des Einfrierprozesses. Die Kältelemente können langgestreckt sein, um beispielsweise parallel ausgerichtete Fasern oder Kammern in der Matrix zu erhalten. Es können jedoch auch gekrümmte Strukturen, z.B. Nachbildungen des zu formenden Organs, als Kälteelemente verwendet werden. Die anisotrope poröse Matrix kann in einem biokompatiblen Verbundmaterialsystem zusammen mit einem anderen Material, beispielsweise mit einer biokompatiblen nichtporösen Folie eingesetzt werden. Die anisotrope Matrix bzw. das darauf basierende Verbundmaterialsystem kann zur in vitro Kultivierung von Zellen oder als Implantat ohne vorherige Zellbesiedlung, entsprechend den zuvor genannten Anwendungen, eingesetzt werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Matrices und Folien auf Basis von Chitosan und Säuren erfolgt im Wesentlichen nach dem in den Deutschen Anmeldungen 199 48 120.2 und 101 17 234.6 angegebenen Verfahren, sofern nichts anderes angegeben ist. Vorzugsweise wird zunächst eine wässrige Lösung eines teilweise deacetylierten Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure hergestellt. Unter Überschuss wird dabei verstanden, dass der pH der wässrigen Lösung im Sauren liegt, vorzugsweise unterhalb von pH <4. Dadurch sind die freien Aminogruppen des Chitosans zumindest teilweise protoniert, wodurch die Löslichkeit in Wasser gesteigert wird. Die Säuremenge ist nicht kritisch. Sie muss lediglich so gewählt sein, dass das Chitosan in Lösung geht. Eine übermäßige Säurezugabe wird nach Möglichkeit vermieden, da überschüssige Säure wieder entfernt werden muss, und dadurch die Aufarbeitung bei großen Säuremengen erschwert wird. Günstig sind Säuremengen, die eine 0,05 bis 1 N, vorzugsweise 0, 1 bis 0,5 N, insbesondere 0, 1 bis 0,3 N Lösung ergeben. Die Chitosanmenge wird vorzugsweise so gewählt, dass sich eine 0,01 bis 0,5 M, vorzugsweise 0, 1 bis 0,3 M Lösung ergibt. Durch die Konzentration der Chitosanlösung kann Einfluss auf die Struktur der Matrix, insbesondere deren Porengröße genommen werden. Auf diese Weise lässt sich die Porengröße der Matrix auf den jeweiligen Zelltypus abstimmen, mit dem die Matrix besiedelt werden soll. Chitosan hat wegen seiner Herstellung aus natürlichen Quellen kein einheitliches Molekulargewicht. Je nach Quelle und Aufbereitungsverfahren kann das Molekulargewicht zwischen 20 kDa bis über 1 000 kDa betragen.
Für die Herstellung der dreidimensionalen Matrix ist das Chitosan hinsichtlich seines Molekulargewichts keinen Beschränkungen unterworfen. Für die Herstellung der wässrigen Chitosanlösung wird eine Säure verwendet, bei der es sich um eine anorganische Säure oder vorzugsweise um eine organische Säure, besonders bevorzugt um eine Alkyl- oder Aryl- Hyd roxycarbonsäure handelt. G eeig net sind i nsbesondere Hydroxycarbonsäuren mit 2 bis 1 2 Kohlenstoffatomen, wobei eine oder mehrere Hydroxylgruppen sowie eine oder mehrere Carboxylgruppen im Molekül vorhanden sein können. Spezifische Beispiele sind Glycolsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure und Mandelsäure. Besonders bevorzugt ist Milchsäure.
Bei Herstellung einer porösen Matrix wird die Lösung aus Chitosan und Säure zunächst durch Zugabe von Base zumindest teilweise neutralisiert und dann eingefroren oder ohne vorherige Neutralisation direkt eingefroren. Die Neutralisation vor dem Einfrieren ist bevorzugt. Der pH-Wert nach der Neutralisation beträgt im Allgemeinen 5,0 bis 7,5, vorzugsweise 5,5 bis 7,0 und insbesondere 6,0 bis 7,0.
Nach dem Einfrieren wird das Wasser unter vermindertem Druck absublimiert, beispielsweise im Druckbereich von 0,001 bis 3 hPa.
Zur Herstellung einer nichtporösen Folie wird die Lösung nicht gefroren und absublimiert, sondern ohne Einfrieren bei gegebenenfalls erhöhter Temperatur oder/und verringertem Druck getrocknet und vorzugsweise nach Trocknung neutralisiert. Die entstehende nichtporöse Matrix ist in feuchtem Zustand stark belastbar und dehnbar. Durch die große Anzahl von Amino- und Hydroxygruppen ist das Material beliebig modifizierbar. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind Liganden kovalent oder nicht kovalent an das Chitosan gebunden, vorzugsweise an die freien Aminogruppen des Chitosans. Als Liganden können z.B. Wachstumsstoffe, Proteine, Hormone, Heparin, Heparansulfate, Chondroitsulfate, Dextransulfate oder eine Mischung dieser Substanzen verwendet werden. Die Liganden dienen vorzugsweise zur Kontrolle und Verbesserung der Zellproliferation.
Das Zellwachstum auf der Matrix bzw. der Folie wird weiter verbessert, wenn die Matrix mit autologem Fibrin beschichtet ist.
Die dreidimensionale Matrix kann sowohl mit humanen als auch mit animalischen Zellen (beispielsweise vom Pferd, Hund oder Hai) besiedelt werden. Besonders geeignet sind Haizellen, da diese beim Empfänger keine wesentliche immunologische Antwort auslösen.
Die Materialien, wie zuvor beschrieben, können im humanmedizinischen und im tiermedizinischen Bereich eingesetzt werden. Weitere Einsatzgebiete sind die Verwendung als Einmalartikel, z.B. als Tupfer.
Die Materialien werden vor Einsatz in der Zellkultur sterilisiert, um Keimfreiheit zu garantieren. Die Sterilisation kann durch Temperaturbehandlung, z.B. durch Autoklavieren, Dampfbehandlung etc. oder/und durch Bestrahlung, z.B. Gammastrahlenbehandlung, erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Sterilisation in einer physiologisch verträglichen gepufferten Lösung, z.B. in PBS, um eine vollständige Benetzung der Matrix bzw. der Folie mit Flüssigkeit und die Abwesenheit größerer Lufteinschlüsse sicherzustellen.
Bei Kultivierung der Zellen wird das Material in einem Zeitraum von ca. 5-8 Wochen oder länger abgebaut. Die Abbauzeiten können über den Deacetylierungsgrad des Chitosans und die Konzentration des Materials eingestellt werden.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert werden.
Erläuterung der Figuren:
Abbildung 1 zeigt in den Figuren 1 A, 1 B und 1 C Kombinationen von Materialien, bei denen Folie und Matrix als separate Kombinationen eingesetzt werden.
Abbildung 2 zeigt in den Figuren 2A, 2B und 2C alternative Ausführungsformen.
Abbildung 3: Bild A und B:Schwann-Zellen (Ratte adult, 10 % FCS), unbeschichtet; Bild C und D: PORN/Laminin , Bild E und F: PLL; Fokusebene: Kulturschale (A, C, E); Folie* (B, D, E).
Abbildung 4: Spinalganglionneuron-Kulturen der Ratte (P1 ), PORN-Laminin beschichtete Plastik (links); unbeschichtete Folie (rechts) , 24 h in Kultur.
Abbildung 5: Spinalganglionneurone (diss. P1 , Ratte) unter serumfreien Bedingungen ( + NGF), 3 Tage Kultur. Neurone lösen sich während der histologischen Aufarbeitung z.T. von der Matrix. Trotzdem werden differenzierte Neurone mit Neuriten in Assoziation mit der Matrix gefunden (siehe Pfeile in C, E, F).
Abbildung 6: Axonale Regeneration (Ratte, adult, N. isch.) 8 Wochen nach Implantation eines "gewickelten" Folieninterponats. Die gewickelte Folie ist bindegewebig eingebaut. Die Art des Einbaus (keine Zellen in den
Höhlungen) lässt darauf schließen, dass die "Auffaserung" an der Innenseite der Folie (A*, D*) nicht auf einen postoperativen enzymatischen Aufbau zurückzuführen ist. Regenierende Axone wachsen z.T. als große Faszikel in die einzelnen Lamellen ein (Proximaler Übergang, s. B).
Abbildung 7: Axionale Regeneration (Ratte, adult, N. isch.) dreier Versuchstiere (A/B; C/D; E/F) 8 Wochen nach Implantation eines "gewickelten" Folieninterponats. Übersichtsvergrößerungen (4x, A, C, E) des proximalen Übergangs Nerv-Folie, und Ausschnittvergrößerungen des distalen Nervenstumpfs ( 10x) mit regenerierten Axonen (s. Pfeil).
Beispiel 1 : Herstellung einer nichtporösen Folie
Nach dem in Beispiel 3 von DE 1 99 48 120.2 beschriebenen Verfahren wird eine Mischung aus Chitosan und Milchsäure hergestellt. Die Lösung wird in eine Petrischale gegossen, bei 50 °C getrocknet und nach Entstehen eines glasklaren Filmes mit 1 M Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert. Die entstehende Folie ist im feuchten Zustand stark belastbar und dehnbar.
Durch gezielte Zugabe der Natronlauge von einer Seite her kann eine Folie mit "Memory-Effekt" erzeugt werden.
Beispiel 2: In vitro Kultivierung von Schwann'schen Zellen und Neuronen
Es wurden Schwannzellen und Spinalganglion-Neurone auf die Folie bzw. auf die Matrix aufgebracht und in vitro angezüchtet. Die Folie ist insbesondere geeignet, um auf ihr Schwannzellen anzuzüchten (Abbildung 3 und 4)
Die Anzüchung von Neuronen gelingt in der Matrix insbesondere bei Porendurchmessern von etwa 10-20 μm (Abbildung 5). Beispiel 3: Atraumatische Nervenadaption mittels einer Folie mit Memory- Effekt
Prinzip und Operationsverfahren:
Zwei Nervenstümpfe werden mittels der sich selbst aufrollenden Chitosan- Folie verbunden, die Enden werden mittels handelsüblichen Fibrinkleber fixiert. Die Folie wird mittels einer Pinzette gespreizt, die Nervenstümpfe werden auf ihr plaziert. Nach Entfernen der Pinzette rollt sich die Folie selbständig auf (Memory Effekt) und umschließt die Nervendenden.
Vorteile des Verfahrens:
Es ist keine mikrochirurgische Naht erforderlich, d.h. der Eingriff kann auch von einem mikrochirurgisch unerfahrenen Arzt, also auch von Unfallchirurgen, einfach durchgeführt werden.
Durch die spiralige Aufrollung der Folie wird ein Durck auf die Nervenenden vermieden: Bei der regelmäßig nach einer Nervendurchtrennung auftretenden Schwellung der Nervenstümpfe kann sich die Folie leicht an den erhöhten Durchmesser anpassen, ohne eine Druckwirkung auf die Nervenenden auszuüben. Damit wird ein wesentlicher Nachteil heute üblicher künstlicher Nerveninterponate, nämlich die sekundäre Nervenschädigung durch zirkuläre, im Durchmesser konstante, Strukturen vermieden.
Resultate:
Es wurden insgesamt 10 Nerven nach achtwöchiger Implantation im Rattenmodell untersucht (Abbildungen 6 und 7). Ergebnisse: 1 . Bei allen untersuchten Tieren kam es zu einem Einwachsen regenerierender Nervenfasern in die Interponate. Die Fasern wuchsen zwischen den Lamellen der spiralig aufgerollten Folie.
2. Die Breite der Interponate führte zu einer mehrfachen spiralien Einrollung. Ideal wäre eine einmalige Aufrollung, so dass letztlich eine Röhre mit nur einem Schlitz zustande kommt.
3. Bei allen untersuchten Tieren wurde der distale Nervenstumpf erreicht.
Schlussfolgerungen aus den in vivo Experimenten:
Eine Nervenschienung mittels einer Chitosan-Folie mit Memory Effekt ist möglich. Die Nervenschienung erlaubt auch die Nervenadaption bei Vorliegen einer Dehiszenz zwischen den Nervenenden. Dies verlangt heute noch die Implantation eines Nerveninterponates, z.B. aus einem Hautnerven des Beines. Durch Beschichtung mit Folie mit Schwannzellen kann eine Beschleunigung der Regeneration erreicht werden.

Claims

Ansprüche
1 . Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure als Mittel auf dem Gebiet der Neurochirurgie.
2. Verwendung nach Anspruch 1 zur extrakorporalen oder intrakorporalen Nervenrekonstruktion.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Material in Form einer flexiblen, insbesondere nichtporösen, Folie vorliegt.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Folie mit einer bevorzugten Aufrollvorrichtung eingesetzt wird.
5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4 als Nervenschiene zum Umwickeln von Nerven.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5 zum Aufwachsen von Schwann'schen Zellen auf der Folie.
7. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Material in Form einer porösen Matrix vorliegt.
8. Verwendung nach Anspruch 7 als neurologischer Tupfer.
. Verwendung nach Anspruch 7 als Matrix zum Zusammenwachsen von Nervenenden.
0. Verwendung nach Anspruch 9 zum Einwachsen von Neuronen in die poröse Matrix.
1 . Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Material als Kombination einer flexiblen Folie und einer porösen Matrix vorliegt.
2. Verwendung nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Folie und Matrix als separate Komponenten eingesetzt werden.
3. Verwendung nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Folie und Matrix als Verbundkomponente eingesetzt werden.
4. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Neuronenmikrosonde.
5. Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure als Mittel zur Reparatur von Sehnen und Bändern.
6. Verwendung nach Anspruch 1 5 zur Verankerung von Sehnen oder Bändern an Knochen.
7. Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure als Tupfer oder Tamponade für Abzesshöhlen.
1 8. Verwendung eines biokompatiblen Materials auf Basis von Chitosan und einer Säure zur Abdeckung von Gewebe und Organen nach Verletzungen und/oder während chirurgischer Eingriffe.
1 9. Biokompatibles Material auf Basis von Chitosan und einer Säure, dass Folie und Matrix als Verbundkomponente eingesetzt werden. dadurch gekennzeichnet, dass es als Folie mit einer bevorzugten Aufrollrichtung vorliegt.
20. Folie nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Dicke im Bereich von 1 μm bis 100 μm aufweist.
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