Verfahren und Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von BrustkrebsMethod and kit for diagnosing or controlling breast cancer
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver- fahren und ein Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs bei einem Menschen.The present invention relates to a method and a kit for the diagnosis or treatment control of breast cancer in a human.
Bei der Krebsnachsorge ist es von Relevanz, ein Rezidiv maligner Tumore anhand des Auftretens metastasie- render Tumorzellen im Blut frühzeitig nachweisen zu können. Bei den derzeit angewandten Untersuchungsmethoden werden bei Krebspatienten sogenannte „Tumor- marker" auf Proteinebene (immunologisch bzw. enzyma- tisch) quantitativ im Blut oder in anderen Körper- flüssigkeiten ermittelt.In cancer follow-up, it is relevant to be able to detect a recurrence of malignant tumors at an early stage based on the appearance of metastatic tumor cells in the blood. In the examination methods currently used, so-called “tumor markers” at the protein level (immunologically or enzymatically) are determined quantitatively in the blood or in other body fluids in cancer patients.
Diese Nachweisverfahren sind für die Tumordiagnostik bzw. Behandlungskontrolle/Nachsorge nur bedingt geeignet, da erhöhte Tumormarkerwerte auch durch nicht- Tumorerkrankungen (z.B. Entzündungen des Magen-Darm-
Traktes, Leberzirrhose, Virusinfekte) , starkes Rauchen oder durch eine Schwangerschaft hervorgerufen werden können.These detection methods are only of limited suitability for tumor diagnostics or treatment control / aftercare, since increased tumor marker values are also caused by non-tumor diseases (e.g. inflammation of the gastrointestinal tract). Tracts, cirrhosis of the liver, viral infections), heavy smoking or can be caused by pregnancy.
Brustkrebs ist die häufigste Diagnose, wenn eine Tumorerkrankung bei Frauen festgestellt wird (26,4% aller Neuerkrankungen) . Trotz massiver Bemühungen, die in Früherkennung, Behandlung und Nachsorge aufgewendet werden, rangiert diese Erkrankung immer noch an erster Stelle krebsbedingter Todesursachen bei der Frau. Die Erkrankungszahlen in den westlichen Industrieländern nehmen in den vergangenen Jahren trotz verstärkter Bemühungen um die Früherkennung weiter zu. Problematisch ist die hohe Metastasierungsrate nach Erstbehandlung, die in der Mehrzahl der Fälle bereits nach 1-3 Jahren zum Tod der Patientin führt. Hauptgrund hierfür ist die Streuung von Tumorzellen in frühen Stadien der Tumorentwicklung. Neben der Ersterkennung eines Mammakarzinoms ist daher insbe- sondere der frühest mögliche Nachweis metastasieren- der Zellen für eine erfolgreiche Behandlung von entscheidender Bedeutung. Ebenso kann im klinischen Stadium I ein definitiver Negativnachweis hilfreich sein, wenn zu entscheiden ist, ob die Patientin mit einer Chemotherapie oder einer Operation belastet werden muß .Breast cancer is the most common diagnosis when cancer is diagnosed in women (26.4% of all new cases). Despite massive efforts in early detection, treatment, and follow-up care, this disease still ranks first among women in cancer-related causes. Disease numbers in western industrialized countries have continued to increase in recent years, despite increased efforts for early diagnosis. The problem is the high rate of metastasis after initial treatment, which in the majority of cases leads to the patient's death after only 1-3 years. The main reason for this is the spread of tumor cells in the early stages of tumor development. In addition to the first detection of breast cancer, the earliest possible detection of metastatic cells is of crucial importance for successful treatment. In clinical stage I, definitive negative evidence can also be helpful when deciding whether the patient needs chemotherapy or surgery.
Die derzeit verwendeten diagnostischen Methoden sind ungenau, wenn es um die Beurteilung der malignen Po- tenz von Resttumoren nach durchgeführter Chemotherapie in den metastasierenden Stadien geht. Einige klinische Studien weisen auf eine prognostische Bedeutung von disseminierten Tumorzellen hin. Dennoch sind zahlreiche methodische Aspekte kritisch und bisher nicht hinreichend standardisiert. Somit müssen weiterhin Nachweise für eine okkulte - oder restliche -
Metastasierung gefunden werden, die eine rechtzeitige Einordnung in die vielfältigen primär kurativen therapeutischen Optionen zulassen.The diagnostic methods currently used are inaccurate when it comes to assessing the malignancy of residual tumors after chemotherapy in the metastatic stages. Some clinical studies indicate the prognostic importance of disseminated tumor cells. Nevertheless, numerous methodological aspects are critical and so far not sufficiently standardized. Evidence of an occult - or remaining - Metastases can be found that allow timely classification into the diverse primarily curative therapeutic options.
Dem Bestreben nach Verbesserung der Heilungschancen wird heute einerseits über Suche und Verwendung neuer Tumormarker, andererseits über Sensitivitätssteige- rung bei den verwendeten Methoden nachgekommen.The efforts to improve the chances of a cure are met today on the one hand by searching for and using new tumor markers and on the other hand by increasing the sensitivity of the methods used.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Kit zur Verfügung zu stellen, mit dem auf einfache, sichere und wiederholbare Weise eine Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs möglich ist.The object of the present invention is to provide a method and a kit with which a diagnosis or treatment control of breast cancer is possible in a simple, safe and repeatable manner.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Patentanspruch 1 sowie das Kit nach Patentanspruch 30 und den Mikroarray nach Patentanspruch 50 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens, des Kits und des Mikroarrays werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.This object is achieved by the method according to claim 1 and the kit according to claim 30 and the microarray according to claim 50. Advantageous developments of the method, the kit and the microarray are given in the respective dependent claims.
Erfindungsgemäß wird mittels des erfindungsgemäßen Kits bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Blutprobe eines Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS der Tumormarkerproteine EGF-R, CEA, CK20, MAGE-3, GA733.2, MUC-1 £ GA15.3, Her-2/neu, Claudin-7, PDGF-ß und/oder Stanniocalcin erfaßt.According to the invention, the presence or absence of mRNA of the tumor marker proteins EGF-R, CEA, CK20, MAGE-3, GA733.2, MUC-1 £ GA15.3, Her- 2 / new, Claudin-7, PDGF-ß and / or Stanniocalcin recorded.
Da im Blut Gesunder die RNAs der beschriebenen Marker normalerweise nicht exprimiert vorliegen, zeigt sich eine direkte Korrelation zwischen einem positiven RT- PCR-Nachweis dieser Tumormarker und zirkulierenden Tumorzellen im Blut, die zu einer Metastasierung füh- ren können.
Da einzelne Marker in therapieabhängiger Weise unterschiedlich exprimiert werden können und Brustkrebs eine ausgeprägte Heterogenität im Expressionsmuster von Brustkrebszellen aufweist, ist es vorteilhaft, eine Kombination von Tumormarkern zu untersuchen, um alle im Blut zirkulierende Tumorzellen zu erfassen. Hierdurch lassen sich Tumorzellen auch dann erkennen, wenn die Expression eines bestimmten Markers bei ei- nem Patienten bzw. in einem Krankheitsstadium relativ gering ist, was sonst zu einem vermeintlich negativen Ergebnis führen könnte. Die Verwendung weiterer Marker stößt jedoch meist deswegen auf Grenzen, wenn mo- nonukleäre Blutzellen eine Hintergrundexpression ("illegitime Transkription") aufweisen, die eine exakte Analyse behindern.Since the RNAs of the markers described are normally not expressed in the blood of healthy people, there is a direct correlation between a positive RT-PCR detection of these tumor markers and circulating tumor cells in the blood, which can lead to metastasis. Since individual markers can be expressed differently in a therapy-dependent manner and breast cancer has a pronounced heterogeneity in the expression pattern of breast cancer cells, it is advantageous to investigate a combination of tumor markers in order to detect all tumor cells circulating in the blood. In this way, tumor cells can also be recognized when the expression of a particular marker in a patient or in a disease stage is relatively low, which could otherwise lead to a supposedly negative result. However, the use of further markers usually comes up against limits if mononuclear blood cells have a background expression ("illegitimate transcription") which hinder an exact analysis.
Für die Erkennung von Brustkrebszellen wird daher erfindungsgemäß die folgende Kombination aus Markern vorgeschlagen:The following combination of markers is therefore proposed according to the invention for the detection of breast cancer cells:
Zwei der Marker aus den folgenden GruppenTwo of the markers from the following groups
GA733.2 und MUCl; Her-2/neu und Claudin-7;GA733.2 and MUCl; Her-2 / new and Claudin-7;
CK20, MAGE-3 und MUC 1; bzw. Stanniocalcin, EGFR und CEACK20, MAGE-3 and MUC 1; or Stanniocalcin, EGFR and CEA
oderor
die folgenden Kombinationenthe following combinations
GA733.2, MUCl, Her-2/neu, Claudin-7;GA733.2, MUCl, Her-2 / new, Claudin-7;
GA733.2, PDGF-ß, Her-2/neu, Claudin-7; GA733.2, MUCl, CEA;GA733.2, PDGF-β, Her-2 / new, Claudin-7; GA733.2, MUCl, CEA;
GA733.2, PDGF-ß, Claudin-7; bzw.
GA733.2, MUCl und Claudin-7GA733.2, PDGF-β, Claudin-7; respectively. GA733.2, MUCl and Claudin-7
Für die Amplifikation von Abschnitten der Marker können die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Primer verwendet werden.The primers given in the table below can be used for the amplification of sections of the markers.
Marker für MammakarzinomMarker for breast cancer
Im folgenden werden die Bezeichnungen der Marker erläutert : The names of the markers are explained below:
Bei der Anwendung von RT-PCR-Systemen zum Nachweis von Tumorzellen ist aufgrund der sehr hohen Amplifi- kationsrate die Spezifität ein kritischer Punkt. Geringste Kontaminationen, etwa durch Fremd-RNA oder illegitime Transkription, können hierbei das Ergebnis verfälschen.Due to the very high amplification rate, specificity is a critical point when using RT-PCR systems for the detection of tumor cells. The slightest contamination, e.g. from foreign RNA or illegitimate transcription, can falsify the result.
Durch die Verwendung der Immunzytochemie mit monoklo- nalen Antikörpern gegen Tumorzellantigene kann eine Steigerung der Spezifität durch Anreicherung der Tumorzellen gegenüber Blutzellen und gleichzeitig eine Steigerung der Sensitivität des Tumorzell-Nachweises erzielt werden (Nachweisquote von 1 Tumorzelle auf 107 mononukleären Blutzellen) . Die Tumorzellen werden dabei mittels spezifischer Antikörper bzw. einer Antikörpermischung von mononukleären Blutzellen ge-
trennt. Die Trennung kann mittels Magnetpartikel (Dy- nal) , an die die Antikörper gebunden werden, erfolgen. Dies wird im folgenden detaillierter beschrieben.By using immunocytochemistry with monoclonal antibodies against tumor cell antigens, an increase in specificity can be achieved by enriching the tumor cells with respect to blood cells and at the same time an increase in the sensitivity of tumor cell detection (detection rate from 1 tumor cell to 10 7 mononuclear blood cells). The tumor cells are isolated using specific antibodies or an antibody mixture of mononuclear blood cells. separates. The separation can be carried out by means of magnetic particles (dynamic) to which the antibodies are bound. This is described in more detail below.
Eukaryontische Zellen tragen eine Vielzahl unterschiedlicher Moleküle an Ihrer Zelloberfläche. Entsprechend des Ursprungs und der Funktion der einzelnen Zelle unterscheidet sich die Kombination der ex- primierten Oberflächenmoleküle, so daß zelltyp- spezifische Muster entstehen. Zur Erkennung dieser zelltyp-spezifischen Muster werden Antikörper genutzt. Antikörper binden mit hoher Spezifität an ihr Antigen, hier an ausgewählte Oberflächenmoleküle. Diese Eigenschaft wird genutzt, um Zellen mittels spezifischer Antikörperbindung anhand ihrer Zelltyp- spezifischen Muster zu erkennen und voneinander zu unterscheiden .Eukaryotic cells have a large number of different molecules on their cell surface. The combination of the expressed surface molecules differs according to the origin and the function of the individual cell, so that cell type-specific patterns arise. Antibodies are used to recognize these cell type-specific patterns. Antibodies bind to their antigen with high specificity, here to selected surface molecules. This property is used to recognize and differentiate cells by means of specific antibody binding based on their cell type-specific patterns.
Die Expression spezieller Oberflächenproteine unterscheidet Tumorzellen von nichttransformierten Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzell-typischen Mustern unterscheidet, können Tu- morzellen im Blut unterschieden werden. Um TumorZellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für verschiedene Analyse- und Separations- Methoden nutzbar gemacht.The expression of special surface proteins distinguishes tumor cells from untransformed cells of this cell type. Since this special pattern of surface antigens in tumor cells also differs from the typical blood cell patterns, tumor cells in the blood can be distinguished. To identify tumor cells, antibodies that specifically recognize these special surface proteins are used as tools. The specific antibody binding is used for various analysis and separation methods.
Aufgrund der intensiven Bindung von speziell dafür selektionierten Immunglobulinen ist neben der Erkennung von Zellen über deren Oberflächenepitope auch eine Separierung der erkannten Zellen von nicht erkannten möglich.
1. Trennprinzip beruhend auf Flüssigphase; z.B. Durchflußzytometrie :Due to the intensive binding of specially selected immunoglobulins, apart from the recognition of cells via their surface epitopes, it is also possible to separate the recognized cells from unrecognized ones. 1. separation principle based on liquid phase; eg flow cytometry:
Für die durchflußzytometrische Analyse werden Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Vereinzelte Zellen werden in einem konstanten Flüssigkeitsstrom einzeln an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeleitet. Bei Beleuchtung der Zellen werden die an den Antikörpern gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und strahlen Licht bestimmter Wellenlängen ab. Das abgestrahlte Licht wird detektiert und das gemessene Signal digitalisiert gespeichert. Das Lichtsignal kann einzelnen Zellen zugeordnet werden. Die Antikörper-markierteAntibodies are coupled with fluorescent dyes for flow cytometric analysis. Scattered cells are individually guided past a light source (laser) in a constant liquid flow. When the cells are illuminated, the fluorescent dyes bound to the antibodies are excited and emit light of specific wavelengths. The emitted light is detected and the measured signal is stored digitally. The light signal can be assigned to individual cells. The antibody-labeled
Zelle wird so erkannt und kann nun von anderen Zellen getrennt werden. Zur Trennung werden die Zellen in kleinsten Tropfen vereinzelt. Nach Erkennung der Antikörper-markierten Zelle wird der entsprechende Tropfen in ein Auffangbehältnis gelenkt.Cell is recognized in this way and can now be separated from other cells. The cells are separated into tiny drops for separation. After detection of the antibody-labeled cell, the corresponding drop is directed into a collecting container.
2. Trennprinzip beruhend auf Festphase; z.B. magnetische Separation:2. separation principle based on solid phase; e.g. magnetic separation:
Für die magnetische Separation werden Antikörper an pseudomagnetische Partikel gekoppelt. Nach Einbringen der pseudomagnetischen Partikel in ein Magnetfeld wandern die Partikel im magnetischen Feld. Bei der Bewegung in diesem magnetischen Feld werden Zellen, an die diese gekoppelten Antikörper gebunden sind, mitgerissen und von anderen Zellen getrennt .Antibodies are coupled to pseudomagnetic particles for magnetic separation. After the pseudomagnetic particles have been introduced into a magnetic field, the particles migrate in the magnetic field. When moving in this magnetic field, cells to which these coupled antibodies are bound are entrained and separated from other cells.
Zur Tumorzellenerkennung mittels Magnetpartikel werden folglich an pseudomagnetische Partikel, die eine
definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, Antikörper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper-gekoppelte Magnetpartikel versetzt; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt. Jene (Tumor-) Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z.B. an die Wand des Trenngefäßes) . Das auf diese Weise Tumorzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verbleiben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen.For tumor cell detection using magnetic particles, pseudomagnetic particles are consequently attached to the one have a defined number of chemically activated sites on their surface, antibodies are covalently coupled. The specificity of the separation is determined via the specificity of the antibodies. A blood sample containing tumor cells is mixed with antibody-coupled magnetic particles; then particles and blood are moved relative to each other. Those (tumor) cells that are recognized by the solid-phase-bound antibodies and thus firmly bound follow the movement of the particles. This makes it possible, when a magnetic field is applied, to pull the particles with the cells attached to them out of the blood (eg on the wall of the separation vessel). The blood thus depleted of tumor cells can be exchanged for other solutions, the cells separated via magnetic particles remaining on site until the magnetic field is switched off / removed and are available for further applications.
Vorteilhafterweise können für die Erkennung der Tumorzellen spezifische Antikörper-Mischungen verwendet werden, die entweder allgemein auf Tumorzellen oder auch spezifisch für Brustkrebszellen-Erkennung optimiert sind. Beispielsweise eignet sich zur Erkennung von Tumorzellen im Blut eine Kombination der Antikörper MOC-31 (Fa. Novocastra) und Ber-EP-4 (Fa. DAKO) .Advantageously, specific antibody mixtures can be used for the detection of the tumor cells, which are either optimized generally for tumor cells or also specifically for breast cancer cell detection. For example, a combination of the antibodies MOC-31 (Novocastra) and Ber-EP-4 (DAKO) is suitable for the detection of tumor cells in the blood.
Eine Erkennung, die speziell auf Brustkresbzellen gerichtet ist, kann durch eine weiter optimierte Antikörpermischung gemäß der nachfolgenden Tabelle:A detection that is specifically aimed at breast cancer cells can be achieved by a further optimized antibody mixture according to the following table:
erzielt werden. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Brustkrebszellen von anderen Krebszellen unterscheidet. be achieved. This is based on the selective expression of certain surface proteins that distinguish breast cancer cells from other cancer cells.
Derartige Antikörpermischungen zeigen im Vergleich zu den jeweils separat eingesetzten Antikörpern bei der Zellerkennung und Zelltrennung unabhängig von der angewandten Methode eine erhöhte Sensitivität .Antibody mixtures of this type show an increased sensitivity in comparison to the separately used antibodies in cell recognition and cell separation, regardless of the method used.
Im folgenden sollen einige Beispiele erfindungsgemäßer Nachweise für Brustkrebszellen in Blutproben beschrieben werden.In the following, some examples of the detection according to the invention for breast cancer cells in blood samples are to be described.
Es zeigen:Show it:
Fig. 1 einen Nachweis von PCR-Produkten mit Elektrophorese;1 shows a detection of PCR products with electrophoresis;
Fign. 2A bis 2C einen Tumormarkernachweis mittels Light Cy- cler;FIGS. 2A to 2C a tumor marker detection using light cycler;
Fig. 3 den Nachweis einer Zelltrennung mittels An- tikörper-markierter Magnetpartikel;3 the detection of a cell separation by means of antibody-marked magnetic particles;
Fign. 4 bis 8 zeigen weitere Beispiele für den Nachweis von Mammakarzinomzellen mittels mehrerer Tumormarker.FIGS. 4 to 8 show further examples for the detection of breast cancer cells by means of several tumor markers.
In einem ersten Beispiel erfolgte eine RNA-Aufar- beitung aus 1 ml EDTA-Vollblut mit dem QIAamp RNA Blood Mini Kit (Fa. Qiagen, Hilden) . Kontaminationen mit genomischer DNA wurden durch einen zusätzlichen DNA-Verdau auf der Säule mittels RNase-free DNase
Set, Fa. Quiagen, Hilden) vermieden.In a first example, RNA processing was carried out from 1 ml of EDTA whole blood using the QIAamp RNA Blood Mini Kit (from Qiagen, Hilden). Contamination with genomic DNA was caused by an additional DNA digestion on the column using RNase-free DNase Set, from Quiagen, Hilden) avoided.
Die RNA-Aufarbeitung aus 1 ml EDTA-Vollblut wurde fotometrisch über den Quotienten 260 : 280 nm verifiziert. Zur Qualitäts- und Quantitätsbestimmung kann dabei 1 μl des Ansatzes durch elektrophoretische Trennung auf einem RNA 6000 Chip über den Agilent Bioanalyzer 2100 analysiert werden.The RNA processing from 1 ml of EDTA whole blood was verified photometrically using the quotient 260: 280 nm. To determine quality and quantity, 1 μl of the batch can be analyzed by electrophoretic separation on an RNA 6000 chip using the Agilent Bioanalyzer 2100.
Die isolierte RNA wurde in einem entsprechenden Volumen zusammen mit Oligo (dT) 15-Primern (Fa. Promega, Mannheim) für 5 Minuten bei 65 °C denaturiert und anschließend direkt auf Eis inkubiert. Die cDNA-Synthe- se erfolgte mittels des Sensiscript™ Reverse Trans- kriptase Kit, (Fa. Qiagen, Hilden) in einem 20 μl Reaktionsansatz gemäß Tabelle 1 bei 37 °C für 1 Stunde mit nachfolgender Inaktivierung der reversen Trans- kriptase für 5 Minuten bei 95 °C und anschließender Abkühlung auf Eis.The isolated RNA was denatured in an appropriate volume together with oligo (dT) 15 primers (from Promega, Mannheim) for 5 minutes at 65 ° C. and then incubated directly on ice. The cDNA synthesis was carried out using the Sensiscript ™ reverse transcriptase kit (from Qiagen, Hilden) in a 20 μl reaction mixture according to Table 1 at 37 ° C. for 1 hour with subsequent inactivation of the reverse transcriptase for 5 minutes at 95 ° C and then cooling on ice.
Tabelle 1 Komponenten der cDNA-SyntheseTable 1 Components of cDNA synthesis
Mit der so erzeugten cDNA wurde für jeden der gewählten Tumormarker Stanniocalcin, EGF-R, CEA sowie als interne Kontrolle für ß-Aktin eine Multiplex-PCR durchgeführt. Der PCR-Ansatz ist in der folgenden Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2 PCR-AnsatzWith the cDNA generated in this way, a multiplex PCR was carried out for each of the selected tumor markers stanniocalcin, EGF-R, CEA and as an internal control for β-actin. The PCR approach is shown in Table 2 below. Table 2 PCR approach
( *enthält 15 mM MgCl2;(* contains 15 mM MgCl 2 ;
**HotStarTaq™ DNA Polymerase; Fa. Qiagen, Hilden ***DMSO-Zusatz bei Stanniocalcin)** HotStarTaq ™ DNA Polymerase; Qiagen, Hilden *** DMSO addition at Stanniocalcin)
Für jeden Tumormarker wurde dabei ein Primerpaar eingesetzt, das aus der nachfolgenden Tabelle 3 hervorgeht .
A pair of primers was used for each tumor marker, as shown in Table 3 below.
Tabelle 3: Liste der PCR-PrimerTable 3: List of PCR primers
Die für die Tumormarkereinzelnachweise eingesetzten Primerkombinationen und -mengen sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt.
The primer combinations and amounts used for the individual tumor marker detection are listed in Table 4 below.
Tabelle 4: Auflistung der Primermengen und PrimerkombinationenTable 4: List of primer quantities and primer combinations
Die PCR wurde unter den in Tabelle 5 angegebenen PCR- Bedingungen und mit den in Tabelle 6 angegebenen Marker-spezifischen Schmelz-Temperaturen und Zyklenzahlen durchgeführt.The PCR was carried out under the PCR conditions given in Table 5 and with the marker-specific melting temperatures and number of cycles given in Table 6.
Tabelle 5: PCR-BedingungenTable 5: PCR conditions
Tabelle 6: Marker-spezifische Annealingtemperatur und Zyklenzahl Table 6: Marker-specific annealing temperature and number of cycles
1 μl des so erzeugten PCR-Produktes wurde in einem Agilent Bioanalyzer 2100 auf einem DNA-Chip (500) aufgetrennt und das Trennergebnis elektronisch dokumentiert. Die Ergebnisse zeigt die Figur 1. In dieser Figur zeigt Spur 1 eine 100 kb-Leiter sowie die Spuren 2-13 die Ergebnisse der entsprechenden Proben. Wie zu erkennen ist, zeigt Spur 5 ein PCR-Produkt für den Tumormarker Stanniocalcin, .Spur 9 ein PCR-Produkt für den Tumormarker EGF-R und Spur 13 ein PCR-Produkt für den Tumormarker CEA, während sämtliche Proben mit biologischem Material Spuren 4, 5, 8, 9, 12, 13 PCR- Produkte für die interne Kontrolle ß-Aktin enthalten.1 μl of the PCR product thus generated was separated in an Agilent Bioanalyzer 2100 on a DNA chip (500) and the separation result was documented electronically. The results are shown in FIG. 1. In this figure, track 1 shows a 100 kb conductor and tracks 2-13 the results of the corresponding samples. As can be seen, lane 5 shows a PCR product for the tumor marker stanniocalcin, lane 9 shows a PCR product for the tumor marker EGF-R and lane 13 shows a PCR product for the tumor marker CEA, while all samples with biological material show lanes 4 , 5, 8, 9, 12, 13 PCR products for the internal control contain β-actin.
Die Spuren 2, 3, 6, 7, 10, 11 enthalten kein biologisches Material, so daß dort auch keine entsprechenden PCR-Produkte auftreten. Die sogenannte cDNA-Kontrolle ist ein Ansatz ganz ohne RNA, die sogenannte PCR- Kontrolle ist ein Ansatz ohne cDNA und die Negativ- Kontrolle ist ein Ansatz mit RNA einer gesunden Kontrollperson in Fig. 1. CEA steht für Carcinoembryonic Antigen, STC für Stanniocalcin und EGF-R für Epidermal Growth Factor Receptor in Fig. 1.Lanes 2, 3, 6, 7, 10, 11 contain no biological material, so that there are no corresponding PCR products. The so-called cDNA control is an approach without RNA, the so-called PCR control is an approach without cDNA and the negative control is an approach with RNA from a healthy control person in FIG. 1. CEA stands for carcinoembryonic antigen, STC for stanniocalcin and EGF-R for epidermal growth factor receptor in FIG. 1.
Fig. 2 zeigt die alternative Analyse mittels Fluores- , zens-basierender Echtzeit-PCR mittels interkallieren-
der Fluoreszenzfarbstoffe.2 shows the alternative analysis using fluorescence, zens-based real-time PCR using intercalating of fluorescent dyes.
Dieser Tumormarkernachweis kann alternativ zur Block- PCR auch mittels Light Cycler (Fa. Röche, Basel) erfolgen.As an alternative to block PCR, this tumor marker detection can also be carried out using a light cycler (from Röche, Basel).
Die reverse Transkription der mRNA erfolgt wie oben beschrieben. Anschliessend wurde die PCR mit dem Light Cycler-DNA Master Sybr Green I Kit (Fa. Röche, Basel) nach Herstellerangaben unter den für jeden Tu- mormarker optimierten Bedingungen durchgeführt. AlsThe reverse transcription of the mRNA is carried out as described above. The PCR was then carried out using the Light Cycler-DNA Master Sybr Green I Kit (Röche, Basel) according to the manufacturer's instructions under the conditions optimized for each tumor marker. As
Primer wurden dabei die in Tabelle 3 angegebenen Oli- gonukleotide verwendet. Tabelle 7 und Tabelle 8 zeigen den Ansatz für die PCR bzw. die PCR-Bedingungen im Light Cycler.
The oligonucleotides given in Table 3 were used as primers. Table 7 and Table 8 show the approach for the PCR and the PCR conditions in the light cycler.
Tabelle 7 PCR-Ansatz LightCyclerTable 7 PCR approach LightCycler
Tabelle 8 : PCR-Bedingungen LightCyclerTable 8: PCR conditions LightCycler
Das Ergebnis dieser PCR und Auswertung durch Light Cycler Technologie ist in den Figuren 2A bis 2C dar-
gestellt. In sämtlichen Figuren 2A bis 2C ist die Kontrollkurve mit 2 bezeichnet, während die Kurve, die für die Probe aufgenommen wurde, mit 1 bezeichnet ist .The result of this PCR and evaluation by light cycler technology is shown in FIGS. 2A to 2C. posed. In all of FIGS. 2A to 2C, the control curve is denoted by 2, while the curve which was recorded for the sample is denoted by 1.
Bei dieser Analyse wird die Schmelzkurve der PCR- Produkte durch Sybr Green I Detektion analysiert. Die jeweilige Graphik der Figuren 2A bis 2C stellt dabei die gemessene Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur dar. Die in den Kontrollansätzen auftretenden Fluoreszenzpeaks sind auf Primerdimere zurückzuführen.In this analysis, the melting curve of the PCR products is analyzed by Sybr Green I detection. The respective graph in FIGS. 2A to 2C represents the measured fluorescence as a function of the temperature. The fluorescence peaks occurring in the control batches are due to primer dimers.
Fig. 2A stellt dabei die Schmelzkurvenanalyse des Stanniocalcin-PCR-Produktes dar. Der Schmelzpunkt des Hauptproduktes liegt bei 89,2 °C und der Schmelzpunkt des Nebenproduktes bei 85,3 °C. Derartige Fluoreszenzpeaks sind bei der Kontrollprobe nicht zu erkennen.2A shows the melting curve analysis of the Stanniocalcin PCR product. The melting point of the main product is 89.2 ° C. and the melting point of the by-product is 85.3 ° C. Such fluorescence peaks cannot be seen in the control sample.
Fig. 2B zeigt die Schmelzkurvenanalyse des EGFR-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 84,6 °C.2B shows the melting curve analysis of the EGFR-PCR product with a melting point at 84.6 ° C.
Fig. 2C zeigt die Schmelzkurvenanalyse des CEA-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 89,06 °C zeigt.2C shows the melting curve analysis of the CEA-PCR product with a melting point at 89.06 ° C.
Alternativ zu den hier dargestellten Methoden können selbstverständlich auch herkömmliche Analysemethoden wie Agarose-Gelelektrophorese angewandt werden, bei denen beispielsweise 25 μl des oben dargestellten PCR-Produktes über ein 2,5 %iges Agarosegel aufgetrennt werden und die DNS-Banden anschliessend mit Ethidiumbromid angefärbt und sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation kann beispielsweise mit Hilfe des DUO Store Systems der Fa. Intas durchgeführt werden.
Auch eine Fragmentanalyse mittels ABI Prism 310 Genetic Analyser (Fa. PE Applied Biosystems, Weiterstadt) kann zur Auswertung verwendet werden. Hierzu wird eine PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt und anschließend beispielsweise jeweils 1 μl des jeweiligen PCR-Produktes in einer Verdünnung von 1 : 50 eingesetzt.As an alternative to the methods presented here, conventional analysis methods such as agarose gel electrophoresis can of course also be used, in which, for example, 25 μl of the PCR product shown above are separated using a 2.5% agarose gel and the DNA bands are subsequently stained and visible with ethidium bromide be made. Documentation can be carried out, for example, with the help of the DUO Store System from Intas. A fragment analysis using the ABI Prism 310 Genetic Analyzer (from PE Applied Biosystems, Weiterstadt) can also be used for the evaluation. For this purpose, a PCR with fluorescence-labeled primers is carried out and then, for example, 1 μl of the respective PCR product is used in a dilution of 1:50.
Als weiterer Nachweis ist ein Nachweis mittels se- quenzspezifischer fluoreszenzmarkierter Hybridisie- rungsproben möglich, die nach jedem Zyklus der PCR die Produktentwicklung verfolgen lassen. Anhand spezieller Standards kann dann auch ein Rückschluß auf die Menge an Ausgangs-RNS gezogen werden.As a further proof, a proof by means of sequence-specific fluorescence-labeled hybridization samples is possible, which allows the product development to be followed after each cycle of the PCR. Special standards can then be used to draw conclusions about the amount of output RNA.
Zentral für die Qualität der als Nachweisbasis isolierten RNS und der daraus synthesisierten cDNS ist die Anreicherung der hierfür verwendeten Zellfraktion aus der verwendeten Blutprobe. Hierfür stehen vier verschiedene Methoden zur Verfügung:Central to the quality of the RNA isolated as a detection basis and the cDNA synthesized from it is the enrichment of the cell fraction used for this purpose from the blood sample used. Four different methods are available for this:
a) Anreicherung durch wiederholte Zentrifugation nach Erythrozytenlyse :a) Enrichment by repeated centrifugation after erythrocyte lysis:
1 ml EDTA-Blut werden nach Zugabe von 5 Volumina1 ml of EDTA blood are added after adding 5 volumes
Erythrozyten-Lysepuffer ("QIAmp Blood Kit", Qiagen; Hilden) für 20 Minuten auf Eis lysiert. Nach Abnehmen des Plasmas/Lysates von den pelletierten Zellen und Resuspension erfolgt eine erneute Zen- trifugation bei 3000 x g für 20 Minuten. Nach Abnehmen des Überstandes steht die pelletierte Leukozytenfraktion für die RNA-Präparation zur Verfügung.Erythrocyte lysis buffer ("QIAmp Blood Kit", Qiagen; Hilden) lysed on ice for 20 minutes. After removing the plasma / lysate from the pelleted cells and resuspension, centrifugation is carried out again at 3000 x g for 20 minutes. After removing the supernatant, the pelleted leukocyte fraction is available for the RNA preparation.
b) Anreicherung durch Dichtegradienten- Zentrifugation :
Mittels eines über Zentrifugation erzeugten Dichtegradienten lassen sich Zellen unterschiedlicher mittlerer Volumendichte voneinander trennen. Mono- nukleare Blutzellen werden mittels eines Ficoll-b) Enrichment by density gradient centrifugation: Using a density gradient generated by centrifugation, cells of different average volume density can be separated from one another. Mononuclear blood cells are measured using a Ficoll
Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) separiert und anschließend zweifach mit PBS/1% FCS gewaschen.Hypaque gradients (Pharmacia, Uppsala, Sweden) separated and then washed twice with PBS / 1% FCS.
Anreicherung von Tumorzellen durch FACS- Durchflußzytometrie :Enrichment of tumor cells by FACS flow cytometry:
Die mononukleären Zellen aus der unter b) angereicherten Fraktion werden mit fluoreszenzmarkierten mononuklearen Antikörpern gegen tumorspezifischeThe mononuclear cells from the fraction enriched under b) are labeled with fluorescence-labeled mononuclear antibodies against tumor-specific
Oberflächenproteine inkubiert. Die markierten Zellen werden zweifach mit PBS gewaschen und im Anschluß werden 107 Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Für die Isolierung der Tumorzellen wird ein FACS Vantage SE-Durchflußzytometer (Becton Dickin- son) verwendet. Über das CellQuest Programm erfolgen Datenaufnahme, Instrumentenkontrolle und Datenauswertung. Die sortierten Zellen werden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß (gefüllt mit 1 ml PBS) über- führt. Die RNS kann dann wie oben beschrieben isoliert werden.Surface proteins incubated. The labeled cells are washed twice with PBS and 10 7 cells are then resuspended in 1 ml PBS. A FACS Vantage SE flow cytometer (Becton Dickinson) is used to isolate the tumor cells. The CellQuest program is used for data acquisition, instrument control and data evaluation. The sorted cells are transferred to a 1.5 ml reaction vessel (filled with 1 ml PBS). The RNA can then be isolated as described above.
Alternativ kann auch die isolierte Fraktion der mononukleären Blutkörperchen, die nach einem der obigen Verfahren isoliert wurden, in Trizol-Alternatively, the isolated fraction of the mononuclear blood cells isolated by one of the above methods can also be isolated in trizole
Reagenz (Gibco BRL, NY, USA) lysiert und mittels Pipette homogenisiert werden. Nach Chloroformextraktion wird die RNA-haltige wäßrige Phase in Isopropanol bei -80 °C gefällt. Nach zweimaligem Waschen in 80 %igem Ethanol wird das Pellet an derReagent (Gibco BRL, NY, USA) are lysed and homogenized using a pipette. After chloroform extraction, the RNA-containing aqueous phase is precipitated in isopropanol at -80 ° C. After washing twice in 80% ethanol, the pellet is on the
Luft getrocknet und anschließend in RNase-freiem
Wasser resuspendiert.Air dried and then in RNase-free Water resuspended.
An diese Isolation der RNS schließt sich dann die reverse Transkription sowie der mRNA-Nachweis wie oben beschrieben an.This isolation of the RNA is then followed by reverse transcription and mRNA detection as described above.
d) Anreicherung von Tumorzellen durch immunomag- netische Separation.d) Enrichment of tumor cells by immunomagnetic separation.
Die Expression spezieller Oberflächenproteine unterscheidet Tumorzellen von nichttransformierten Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzeil-typischen Mustern unterscheidet, können Tu- morzellen im Blut unterschieden werden. Um Tumorzellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für das erfindungsgemäße Verfahren nutzbar ge- macht. An pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, werden Antikörper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper gekoppelteThe expression of special surface proteins distinguishes tumor cells from untransformed cells of this cell type. Since this special pattern of surface antigens in tumor cells also differs from the typical blood cell patterns, tumor cells in the blood can be distinguished. To identify tumor cells, antibodies that specifically recognize these special surface proteins are used as tools. The specific antibody binding is made usable for the method according to the invention. Antibodies are covalently coupled to pseudomagnetic particles that have a defined number of chemically activated sites on their surface. The specificity of the separation is determined via the specificity of the antibodies. A blood sample containing tumor cells is coupled with antibody
Magnetpartikel versetzt; als Antikörper werden in verschiedenen Beispielen zwei verschiedene Mischungen von Antikörpern verwendet; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt, beispielsweise durch "Über- Kopf-Rotierer" in einem geschlossenen Behälter befindlicher Proben oder durch Bewegung der Partikel aufgrund von wechselnden Magnetfeldern. Jene (Tumor- ) Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit
den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z. B. an die Wand des Trenngefäßes) . Das auf diese Weise Tumorzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verbleiben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen.Magnetic particles offset; two different mixtures of antibodies are used as antibodies in different examples; then particles and blood are moved relative to each other, for example by "overhead rotators" of samples in a closed container or by movement of the particles due to changing magnetic fields. Those (tumor) cells that are recognized by the solid-phase-bound antibodies and thus firmly bound follow the movement of the particles. This makes it possible to apply the particles when a magnetic field is applied pull the cells attached to it from the blood (e.g. to the wall of the separation vessel). The blood thus depleted of tumor cells can be exchanged for other solutions, the cells separated via magnetic particles remaining on site until the magnetic field is switched off / removed and are available for further applications.
Tabelle 9: Antikörper-Mischung 1Table 9: Antibody Mixture 1
Mittels der Antikörpermischung in Tabelle 9 werden ganz allgemein Tumorzellen jedoch mit hoher Spezifität erfaßt. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Krebszellen von anderen Zellen unterscheidet.Using the antibody mixture in Table 9, tumor cells are generally recorded with high specificity. This is due to the selective expression of certain surface proteins that differentiate cancer cells from other cells.
Durch den Einsatz der Antikörpermischung wird ganz grundsätzlich im Vergleich zu separat eingesetzten Antikörpern bei der Zelltrennung unabhängig von der angewendeten Methode eine erhöhte Sensitivität nachgewiesen. Dies zeigt sich in Fig. 3, bei der im Teilbild A mit dem Antikörper BER-EP4 belegte magnetische Partikel, in dem Teilbild B mit dem Antikörper MOC-31 belegte magnetische Partikel und in dem Teilbild C ein Mix aus Partikeln die jeweils separat mit einem Antikörper belegt sind, eingesetzt wurden.By using the antibody mixture, an increased sensitivity is fundamentally demonstrated in comparison to separately used antibodies in cell separation, regardless of the method used. This is shown in FIG. 3, in the magnetic particles coated with the antibody BER-EP4 in partial image A, in the partial image B with magnetic particles coated with the antibody MOC-31 and in partial image C a mix of particles each separately with Antibodies have been used.
Für jeden der Antikörper bzw. der Antikörpermischungen wurden insgesamt vier Messungen durchgeführt, bei denen 0, 10, 100 bzw. 1000 Karzinom-Zellen in 10 ml Blut inokuliert wurden. Die Spuren la bis 4a, 1b bis
4b bzw. lc bis 4c zeigen dann den Nachweis von RNA nach RNA-Präparation und RT-PCR mit Tumormarker- spezifischen Primern wie oben beschrieben für Proben von jeweils 1 μl Volumen. Die Fig. 3 wurde dabei mit- tels elektrophoretischer Trennung in einem Agilent™ Bioanalyser 2100 gemäß Herstellerangaben ermittelt.A total of four measurements were carried out for each of the antibodies or the antibody mixtures, in which 0, 10, 100 or 1000 carcinoma cells were inoculated in 10 ml of blood. The tracks la to 4a, 1b to 4b and 1c to 4c then show the detection of RNA after RNA preparation and RT-PCR with tumor marker-specific primers as described above for samples with a volume of 1 μl each. 3 was determined by means of electrophoretic separation in an Agilent ™ bioanalyser 2100 according to the manufacturer's instructions.
Bei Verwendung von lediglich mit einem Antikörper markierten magnetischen Partikeln wie in den Fign. 3A und 3B wurde lediglich bei einem Gehalt von 1000 Zellen ein Nachweis positiv möglich. Bei Verwendung einer Antikörpermischung wie in Fig. 3C wurde bereits ein Nachweis bei nur 100 Zellen und damit um den Faktor 10 sensitiver erbracht.When using magnetic particles labeled only with an antibody, as shown in FIGS. 3A and 3B, positive detection was only possible with a content of 1000 cells. When using an antibody mixture as in FIG. 3C, detection was already provided with only 100 cells and thus by a factor of 10 more sensitive.
Bei diesem Beispiel wurden experimentelle Ergebnisse gezeigt, die nicht die maximale mögliche Sensitivität darstellen, sondern beispielhaft die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichbare Sensitivitätserhö- hung demonstrieren sollen.In this example, experimental results were shown which do not represent the maximum possible sensitivity, but are intended to demonstrate, by way of example, the increase in sensitivity that can be achieved with the method according to the invention.
Fig. 4 zeigt den Nachweis von Brustkrebszellen durch die gleichzeitige Erfassung der Tumorzellmarker GA733.2, MUCl, Her-2 und Claudin-7. Dabei wurden Brusttumorzellen in eine Probe inokuliert, wobei verschiedene Zeil-Linien, Zeil-Linie 1 und Zeil-Linie 2 eingebracht wurden. Vor der Bestimmung der Marker erfolgte eine Anreicherung der Tumorzellen mittels Antikörper-gekoppelter Magnetpartikel, wobei die Anti- körper BerEp4, HMTV.2, GP1.4 verwendet wurden. Fig. 4 zeigt nun, daß für beide Zeil-Linien durch eine derartige Kombination der zu erfassenden Tumormarker eine sicherer Erkennung bis herab zu zwei Zellen pro 5 ml nachgewiesen werden können. Eine unspezifische Re- aktion erfolgte dabei nicht. Im folgenden sind die Bedingungen für die PCR für die verschiedenen, in
Fig. 4 bis Fig. 8 dargestellten Polymerasekettenreak- tionen zum Nachweis von Tumormarkern aus Brustkrebszellen dargestellt.4 shows the detection of breast cancer cells by the simultaneous detection of the tumor cell markers GA733.2, MUCl, Her-2 and Claudin-7. Breast tumor cells were inoculated into a sample, various Zeil lines, Zeil line 1 and Zeil line 2 being introduced. Before the markers were determined, the tumor cells were enriched by means of antibody-coupled magnetic particles, the antibodies BerEp4, HMTV.2, GP1.4 being used. FIG. 4 shows that a reliable detection down to two cells per 5 ml can be detected for both cell lines by such a combination of the tumor markers to be detected. There was no unspecific reaction. The following are the conditions for the PCR for the different, in FIGS. 4 to 8 depict polymerase chain reactions for the detection of tumor markers from breast cancer cells.
Standard, Fig.Standard, Fig.
Zyklen: 35Cycles: 35
Multiplex 1, Fig. 5AMultiplex 1, Fig. 5A
Multiplex 2, Fig. 5BMultiplex 2, Fig. 5B
Zyklen: 35Cycles: 35
Multiplex 3, Fig. 6Multiplex 3, Fig. 6
Multiplex 4 , Fig . 7Multiplex 4, Fig. 7
Zyklen: 35Cycles: 35
Multiplex 5, Fig. 8AMultiplex 5, Fig. 8A
Zyklen: 40Cycles: 40
Fig. 5 zeigt ebenfalls den Nachweis von Brusttumorzellen, wobei hier die Kombinationen aus den Markern GA733.2, PDGF-ß, Her-2 und Claudin-7 (Fig. 5A) bzw.
GA733.2, MUCl und CEA erfaßt wurden. Wiederum erfolgt eine sehr sensitive Erfassung bis herab zu zwei Zellen pro 5 ml Probe, während in einer Kontroll- Blutprobe keine unspezifischen Nachweisreaktionen auftraten.FIG. 5 also shows the detection of breast tumor cells, the combinations of the markers GA733.2, PDGF-β, Her-2 and Claudin-7 (FIG. 5A) or GA733.2, MUCl and CEA were detected. Again, a very sensitive detection down to two cells per 5 ml sample takes place, while in a control blood sample no unspecific detection reactions occurred.
In Fig. 6 ist die Verwendung der Markerkombination GA733.2, PDGF-ß und Claudin-7 (Fig. 6A) bzw. GA733.2, PDGF-ß und Claudin-7 (Fig. 6B) für eine erste Zell- Linie (Fig. 6A) bzw. eine zweite Zell-Linie (Fig. 6B) dargestellt. Wiederum erfolgt ein hochspezifischer Nachweis ohne unspezifische Reaktionen, wobei hier die Zell-Linie 2 besser nachgewiesen werden kann als die Zell-Linie 1. In Fig. 7 ist wiederum ein Nachweis mittels der Kombination der Marker GA733.2, MUCl und Claudin-7 dargestellt. Es erfolgt ein hochspezifischer Nachweis für die Zell-Linie 2 bis herab zu zwei Zellen pro 5 ml für jeden einzelnen der Marker und insbesondere für die Kombination der Marker ohne un- spezifische Nachweisreaktionen.FIG. 6 shows the use of the marker combination GA733.2, PDGF-β and Claudin-7 (FIG. 6A) or GA733.2, PDGF-β and Claudin-7 (FIG. 6B) for a first cell line ( Fig. 6A) and a second cell line (Fig. 6B) shown. Again, a highly specific detection takes place without unspecific reactions, with cell line 2 being able to be detected better than cell line 1. FIG. 7 again shows detection using the combination of markers GA733.2, MUCl and Claudin-7 , There is highly specific detection for cell line 2 down to two cells per 5 ml for each of the markers and in particular for the combination of the markers without non-specific detection reactions.
Fig. 8 zeigt den Nachweis mittels der Markerkombination GA733.2, PDGF-ß und CEA für die Zell-Linie 2. Es erfolgt wiederum ein sehr spezifischer Nachweis bis herab zu zwei Zellen pro 5 ml Probe ohne unspezifische Nachweisreaktionen.8 shows the detection by means of the marker combination GA733.2, PDGF-β and CEA for the cell line 2. Again, a very specific detection down to two cells per 5 ml sample takes place without unspecific detection reactions.
Das erfindungsgemäße Diagnose-Kit und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es weiterhin, die sor- tierten und separierten Zellen anschließend beliebig weiter zu verwenden. Beispielsweise können diese in ein geeignetes Zellkulturmedium eingesetzt und in situ kultiviert werden.The diagnostic kit according to the invention and the method according to the invention also make it possible to subsequently continue to use the sorted and separated cells as desired. For example, these can be inserted into a suitable cell culture medium and cultivated in situ.
Da die Zellen nach der Trennung intakt sind, bleiben auch die Eigenschaften der Zellmembran und des Zeil-
kerns erhalten. Dies eröffnet die Möglichkeit, mikroskopisch die Expression weiterer Oberflächenmarker untersuchen oder auch Chromosomen-Analysen durchzuführen. Die sortierten Zellen werden dazu auf Objekt- träger aufgebracht. Der Nachweis weiterer Oberflächenmarker kann cytochemisch oder über Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Ebenso können genetische Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Chromosomenanalysen mittels FISH (Flurorescence in situ hybridi- sation) oder Karyogramm-Erstellung.
Since the cells are intact after separation, the properties of the cell membrane and cell preserved core. This opens up the possibility of microscopically examining the expression of further surface markers or of carrying out chromosome analyzes. The sorted cells are applied to slides. Additional surface markers can be detected cytochemically or using fluorescence microscopy. Genetic analyzes can also be carried out, such as chromosome analyzes using FISH (Flurorescence in situ hybridization) or karyogram preparation.