EP1448792A1 - Diagnosis kit, dna chip, and methods for diagnosing or supervising the treatment of testicular cancer - Google Patents

Diagnosis kit, dna chip, and methods for diagnosing or supervising the treatment of testicular cancer

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Publication number
EP1448792A1
EP1448792A1 EP01274739A EP01274739A EP1448792A1 EP 1448792 A1 EP1448792 A1 EP 1448792A1 EP 01274739 A EP01274739 A EP 01274739A EP 01274739 A EP01274739 A EP 01274739A EP 1448792 A1 EP1448792 A1 EP 1448792A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cdna
diagnostic kit
cells
oligonucleotides
kit according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01274739A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Cengiz Tamak
Alf-Andreas Krehan
Pia Steffens
Stefanie WASCHÜTZA
Veit Zieglschmid
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Alere Diagnostics GmbH
Original Assignee
Adnagen GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Adnagen GmbH filed Critical Adnagen GmbH
Publication of EP1448792A1 publication Critical patent/EP1448792A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic kit, a DNA chip and a method for diagnosis or treatment control for testicular cancer.
  • I - In the context of cancer prevention and follow-up care, it is very important to be able to detect malignant testicular tumors or recurrent malignant testicular tumors early on using the appearance of metastatic tumor lines in the blood.
  • Testicular cancer is responsible for less than 2% of all malignant tumors in men. However, 20-30% of all cancers among men aged 40 are testicular cancer. The number of new cases each year in the Federal Republic of Germany, for example, is approximately 3600, with approximately 240 men dying from testicular cancer. The highest incidence is found between the ages of 25 and 40. By progress in oncology see therapy, over 90% of all those affected can be cured in the long term. The high survival rates are due to the pronounced effectiveness of cis-platinum-based chemotherapy.
  • tumor markers at the protein level are determined quantitatively in the blood or in other body fluids in cancer patients.
  • these detection methods are only of limited suitability for tumor diagnosis or treatment control / aftercare in testicular tumors, since increased tumor marker values in body fluids are also caused by non-tumor diseases, such as inflammation of the gastrointestinal tract, cirrhosis of the liver, viral infections or heavy smoking • can .
  • EP 0 520 794 B1 discloses such a method in which metastases in body tissues or liquids are detected. In doing so, nucleic acids are detected, for example by means of amplification by polymerase chain reaction. The method is now crucially based on the fact that the detected nucleic acid sequence is expressed in cells of the tissue of origin of a tumor, ie in tumor cells and, depending on the markec, also in the healthy cells of the tissue of origin. Another condition is that this sequence is not expressed in those cells whose tissue is being examined.
  • this method is ultimately based on the detection of cells that should not occur in the blood sample of ⁇ healthy individuals.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method, a diagnostic kit and a nucleic acid microarray with which tumor cells in testicular tumor diseases in peripheral blood can be detected.
  • This object is achieved by the diagnostic kit according to claim 1, the microarray according to claim 20 and the method according to claim 22 and their use according to claim 45.
  • Advantageous further developments of the diagnostic kit, microarrays, method or uses according to the invention are given in the respective dependent claims.
  • the present invention is essentially based on the fact that testicular tumor markers are not detected in the blood of patients at an immunological or enzymatic level, but that the mRNA (messenger ribonucleic acid) of testicular tumor markers is detected in a blood sample, the tumor markers being associated with a tumor Represent gene expression.
  • the placenta-specific alkaline phosphatase (PLAP) and the germline-specific alkaline phosphatase (GCAP), which are expressed in testicular tumors, the epithelial glycoprotein (GA733__2 or EGP40), the high-mobility group protein isoform IC (HMGI-C) and the gastrin releasing peptide receptor (GRPR) are detected.
  • the detection can be carried out for only one of the markers or for any number of these four testicular tumor markers in combination with one another, but at least the mRNA of the markers GA733.2 and / or GCAP / PLAP is detected.
  • the kit according to the invention can therefore Contain oligonucleotide pairs for only one or any selection or all of the four testicular tumor markers.
  • testicular tumor markers are also expressed in the original tissue and as a protein in the bloodstream. long.
  • only cells are detected that are on the one hand in the blood sample and on the other hand express the respective testicular tumor marker. Consequently, these are tumor cells that originate from their original testicular tumor tissue and have been carried over into the patient's blood. Since the mRNA of the markers examined is not expressed in the blood of a testicular tumor patient, there is a direct correlation between the occurrence of the associated mRNA and metastasis even in the early stage of the metastasis process.
  • testicular tumor marker not only is the mRNA of an individual testicular tumor marker detected, but a combination of markers is examined.
  • This makes it possible, for example, to detect all types of testicular cancer via their cells metastasizing in the blood.
  • seminous and non-seminous testicular cancer forms or mixed tumors with a semino fraction and thus 90-95% of all malignant tumors of the testis, namely all germ cell tumors, are detected.
  • tumor cells can also be recognized when the expression of a particular marker in a patient or in a disease stage is relatively low, which could otherwise lead to a supposedly negative result.
  • additional markers mostly comes up against limits because mononuclear blood cells express background expression
  • the specificity is a critical point due to the very high amplification rate.
  • the slightest contamination, such as from foreign RNA or atypical transcription, can falsify the result.
  • RNA isolated as a detection basis and the cDNA synthesized from it Central to the quality of the RNA isolated as a detection basis and the cDNA synthesized from it is the enrichment of the cell fraction used for this from the blood sample used. Various methods are available for this:
  • tumor cell detection rate from 1 tumor cell to 10 7 mononuclear blood cells.
  • the tumor cells are separated from mononuclear blood cells by means of specific antibodies or an antibody mixture.
  • the separation can be carried out by means of magnetic particles (Dynal) to which the antibodies are bound. This is described in more detail below.
  • Eukaryotic cells have a large number of different molecules on their cell surface.
  • the combination of the expressed surface molecules differs according to the origin and the function of the individual cell, so that cell-type-specific patterns arise.
  • For ' detection antibodies are used in this cell type-specific pattern.
  • Antibodies bind to their antigen with high specificity, here to selected surface molecules. This property is used to recognize and differentiate cells by means of specific antibody binding based on their cell type-specific patterns.
  • tumor cells of this cell type Since this special pattern of surface antigens in tumor cells also differs from the typical blood cell patterns, tumor cells can be differentiated in the blood. To identify tumor cells, antibodies that specifically recognize these special surface proteins are used as tools. The specific antibody binding is used for different analysis and separation methods.
  • Antibodies are coupled with fluorescent dyes for flow cytometric analysis. Scattered cells become constant
  • Laser light source
  • the fluorescent dyes bound to the antibodies are excited and emit light of specific wavelengths.
  • the emitted light is detected and the measured one
  • Digitized signal stored The light signal can be assigned to individual cells.
  • the antibody-labeled cell is thus recognized and can now be separated from other cells. For separation, the cells are made in the smallest
  • Such an enrichment can be done, for example, by FACS flow cytometry.
  • the mononuclear cells from the fraction enriched under b) are incubated with fluorescence-labeled mononuclear antibodies against tumor-specific surface proteins.
  • the labeled cells are washed twice with PBS and then 10 7 cells are resuspended in 1 ml PBS.
  • a FACS Vantage SE flow cytometer (Becton Dickinson) is used to isolate the tumor cells.
  • the CellQuest program is used for data acquisition, instrument control and data evaluation.
  • the sorted cells are transferred to a 1.5 l reaction vessel (filled with 1 ml PBS).
  • the RNA can then be isolated as described later.
  • antibodies are consequently covalently coupled to pseudomagnetic particles that have a defined number of chemically activated sites on their surface.
  • the specificity of the separation is determined via the specificity of the antibodies.
  • a blood sample containing tumor cells is mixed with antibody-coupled magnetic particles; then particles and blood are moved relative to each other, for example by “over-
  • tumor cells are detected in general, but with high specificity. This is due to the selective expression of certain surface proteins that differentiate cancer cells from other cells.
  • Antibody mixtures of this type show an increased sensitivity in comparison to the separately used antibodies in cell recognition and cell separation, regardless of the method used.
  • a blood sample is taken from a patient.
  • RNS processing from a milliliter of this whole blood is carried out using the QIAampRNA-Blood Mini Kit TM (from Qiagen, Hilden). Contamination with genomic DNA is avoided by an additional DNA digestion with the RNase-Free DNase Set TM (company Qiagen, Hilden) on the column.
  • RNA isolation As an alternative to the RNA isolation described above, it is also possible to take up the isolated fraction of mononuclear blood cells, as described above, in TRIzol reagent from Gibco BRL, NY, USA, to lyse them and to homogenize them using a pipette. The RNA-containing aqueous phase is then precipitated from a chloroform extraction in isopropanol at -80 ° C. After washing twice in 80% ethanol, the pellet is air-dried and then resuspended in RNase-free water.
  • RNA was then denatured in an appropriate volume of water together with oligo (dT) ⁇ 5 primers from Promega, Mannheim for 5 minutes at 65 ° C. and then incubated directly on ice. This was followed by cDNA synthesis at 37 ° C for one hour and a subsequent inactivation of the added reverse transcriptase for 5 minutes at 93 ° C and Cooling down on ice.
  • the entire reverse transcription was carried out using the Sensiscript TM reverse transcriptase kit from Qiagen, Hilden.
  • the PCR synthesis was carried out in a 20 ⁇ l reaction mixture
  • the multiplex PCR was carried out under the conditions given in Table 5 and at the marker-specific annealing temperatures and number of cycles given in Table 6.
  • the annealing temperature is indicated by x, whereby the corresponding annealing temperature from table 6 was used in each case.
  • Lane 1 shows the result of a detection by means of electrophoresis using a DNA 500 chip (Agilent) and an Agilent Bioanalyzer 2100.
  • Lane 1 shows a 100 bp ladder
  • lane 2 shows a cDNA control without RNA in the approach
  • lane 3 one PCR control without cDNA in the approach
  • lane 4 a negative control for GCAP / PLAP with RNA from a healthy control person in the approach
  • lane 5 the sample from a diseased person.
  • control measurement of ⁇ -actin is only positive in the two real blood samples of lanes 4 and 5, while only lane 5 has the expected band for GCAP / PLAP as testicular tumor marker.
  • FIG. 2 Another result is shown in FIG. 2.
  • the detection was also carried out using an Agilent Bioanalyzer 2100 and a DNA 500 assay chip from Agilent.
  • Lanes 1 to 6 show a multiplex PCR of the cDNA from GCAP and GA733.2 and lanes 7 to 13 show a multiplex PCR of the cDNA from GCAP, GA733.2, GRPR and HMGI-C.
  • the designations cDNA- Control, PCR control and negative control refer to samples without RNA, without cDNA or with RNA from a healthy control person. It can be seen in lanes 5, 9 and 13, respectively, that only the testicular tumor samples in the detection of the cDNA and therefore the mRNA are positive for GCAP / PLAP, GA733.2, GRPR and HMGI-C.
  • agarose gel electrophoresis can of course also be used, in which, for example, 25 ⁇ l of the PCR product shown above are separated using a 2.5% agarose gel and the DNA bands are subsequently stained and visible with ethidium bromide be made.
  • the documentation can be carried out, for example, using the Inta DUO Store System.
  • a fragment analysis using the ABI Prism 310 Genetic Analyzer can also be used for evaluation.
  • a PCR with fluorescence-labeled primers is carried out and then, for example, 1 ⁇ l of the respective PCR product is used in a dilution of 1:50.
  • tumor marker detection can also be carried out using real-time PCR using DANN-intercalating fluorescent dyes (eg LightCycler TM and CybrGreen TM from Hoffmann-Röche). For this purpose, for example, quantification is carried out using fluorescence-based real-time PCR.
  • DANN-intercalating fluorescent dyes eg LightCycler TM and CybrGreen TM from Hoffmann-Röche.
  • quantification is carried out using fluorescence-based real-time PCR.
  • a sequence-specific fluorescence-labeled hybridization sample is added to the PCR approach, by means of which the product development, ie the amplification, can be followed after each cycle of the PCR by means of the fluorescence emitted by it.
  • Special standards can then be used to draw conclusions about the quantities of starting RNA.
  • This also makes it possible to quantify the testicular tumor-associated RNA present in the blood sample and, consequently, to make a direct statement about the response to a selected therapy method.
  • This method can be carried out, for example, with a Light-Cycler TM from Röche, Basel or a Taq-Man TM from PE Applied Bio-Systems, Wieterstadt, as is already well known from the literature.
  • the device according to the invention and the method according to the invention also make it possible to continue using the sorted and separated cells as described above as desired.
  • these can be inserted into a suitable cell culture medium and cultivated in situ.
  • the sorted cells are carrier applied. Additional surface markers can be detected chytochemically or using fluorescence microscopy. Genetic analyzes can also be carried out, such as chromosome analyzes using FISH (fluorescence in situ hybridization) or karyogram generation.
  • FISH fluorescence in situ hybridization

Abstract

The invention relates to a diagnosis kit, a DNA chip, and to methods for diagnosing or supervising the treatment of testicular cancer, which are of greatest importance, in particular, within the scope of cancer prevention and post-treatment. The invention is essentially characterized in that the mRNA of testicular tumor markers is detected in a blood sample, whereby the tumor markers depict a tumor-associated gene expression. To this end, particularly β-hCG, AFP, PLAP or GCAP come into question. The detection of the mRNA is carried out by reverse transcription in cDNA and by subsequently amplifying selected segments of the cDNA by means of polymerase chain reaction.

Description

Diagnose-Kit, DNS-Chip sowie Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle bei HodenkrebsDiagnostic kit, DNA chip and procedures for diagnosis or treatment control for testicular cancer
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit, einen DNS-Chip sowie ein Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle bei Hodenkrebs. I - Rahmen der Krebsvor- und -nachsorge ist es von großer Wichtigkeit, maligne Hodentu ore bzw. rezidive maligne Hodentumore anhand des Auftretens metastasierender Tumo Zeilen im Blut frühzeitig nachweisen zu können.The present invention relates to a diagnostic kit, a DNA chip and a method for diagnosis or treatment control for testicular cancer. I - In the context of cancer prevention and follow-up care, it is very important to be able to detect malignant testicular tumors or recurrent malignant testicular tumors early on using the appearance of metastatic tumor lines in the blood.
Hodenkrebs ist für weniger als 2% aller bösartigen Neubildungen von Tumoren beim Mann verantwortlich. Allerdings handelt es sich bei 20-30% aller Krebser- krankungen unter 40jähriger Männer um Hodenkrebs. Die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen beispielsweise in der Bundesrepublik Deutschland beträgt ca. 3600, wobei ca. 240 Männer an Hodenkrebs sterben. Die höchste Inzidenz findet man dabei zwischen dem 25. und 40. Lebensjahr. Durch den Fortschritt in der onkologi- sehen Therapie können heute über 90% aller Betroffenen langfristig geheilt werden. Die hohen Überlebens- raten begründen sich dabei in der ausgeprägten Wirksamkeit der cis-Platin-basierenden Chemotherapien.Testicular cancer is responsible for less than 2% of all malignant tumors in men. However, 20-30% of all cancers among men aged 40 are testicular cancer. The number of new cases each year in the Federal Republic of Germany, for example, is approximately 3600, with approximately 240 men dying from testicular cancer. The highest incidence is found between the ages of 25 and 40. By progress in oncology see therapy, over 90% of all those affected can be cured in the long term. The high survival rates are due to the pronounced effectiveness of cis-platinum-based chemotherapy.
Dabei gilt es, im klinischen Stadium 1 der Erkrankung zu entscheiden, ob der Patient mit einer Chemotherapie und/oder mit einer Operation belastet werden muß, um einen dauerhaften Heilungserfolg zu erzielen. Eine große Anzahl von Patienten wird dabei chemotherapeutisch behandelt, obwohl kein gesicherter Nachweis einer Metastasierung vorliegt. In den Konzepten, die auf einer reinen Überwachung aufbauen, kommt es jedoch in 25% der Fälle zu Rezidiven mit zum Teil töd- liehern Ausgang.It is important to decide in clinical stage 1 of the disease whether the patient has to undergo chemotherapy and / or surgery in order to achieve lasting healing success. A large number of patients are treated with chemotherapy, although there is no reliable evidence of metastasis. In the concepts based on pure monitoring, however, recurrences occur in 25% of cases, with the outcome sometimes fatal.
Bei den derzeit angewandten Untersuchungsmethoden werden bei Krebspatienten sogenannte Tumormarker auf Proteinebene (immunologisch bzw. enzymatisch) quanti- tativ im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten ermittelt. Diese Nachweisverfahren sind jedoch für die Tumordiagnostik bzw. Behandlungskontrolle/Nachsorge bei Hodentumor nur bedingt geeignet, da erhöhte Tu- mormarkerwerte in .Körperflüssigkeiten auch durch nichttumoröse Erkrankungen, wie beispielsweise Entzündungen des Magen-Darm-Traktes, Leberzirrhose, Virusinfekte oder starkes Rauchen hervorgerufen werden •können .In the examination methods currently used, so-called tumor markers at the protein level (immunologically or enzymatically) are determined quantitatively in the blood or in other body fluids in cancer patients. However, these detection methods are only of limited suitability for tumor diagnosis or treatment control / aftercare in testicular tumors, since increased tumor marker values in body fluids are also caused by non-tumor diseases, such as inflammation of the gastrointestinal tract, cirrhosis of the liver, viral infections or heavy smoking • can .
Molekulargenetische Verfahren erscheinen hier für den Nachweis von Tumorzellen im peripheren Blut hilfreich, da am Beginn des Metastasierungsprozesses der Übertritt von Tumorzellen ins venöse Blut stehen kann. Die EP 0 520 794 Bl offenbart ein derartiges Verfahren, bei dem Metastasierungen in Körpergeweben oder Flüssigkeiten erfaßt werden. Dabei werden Nukleinsäuren erfaßt, beispielsweise mittels Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion. Das Verfahren beruht nun entscheidend darauf, daß die nachgewiesene Nu- kleinsäuresequenz in Zellen des Herkunftsgewebes eines Tumors exprimiert wird, d.h. in Tumorzellen und markec- abhängig auch in den gesunden Zellen des Her- kunftsgewebes. Weitere Bedingung ist, daß diese Sequenz jedoch nicht in denjenigen Zellen exprimiert wird, deren Gewebe untersucht wird. Wird also eine entsprechende Sequenz in der untersuchten Probe gefunden, so muß diese von verschleppten, d.h. metasta- sierenden Zellen eines ortsfremden Tumors herrühren. Damit beruht dieses Verfahren letztlich auf dem Nachweis von Zellen, die in der Blutprobe ~von gesunden Personen nicht vorkommen sollten.Molecular genetic methods appear to be helpful here for the detection of tumor cells in peripheral blood, since the transfer of tumor cells into the venous blood can be at the beginning of the metastasis process. EP 0 520 794 B1 discloses such a method in which metastases in body tissues or liquids are detected. In doing so, nucleic acids are detected, for example by means of amplification by polymerase chain reaction. The method is now crucially based on the fact that the detected nucleic acid sequence is expressed in cells of the tissue of origin of a tumor, ie in tumor cells and, depending on the markec, also in the healthy cells of the tissue of origin. Another condition is that this sequence is not expressed in those cells whose tissue is being examined. If a corresponding sequence is found in the investigated sample, it must originate from dragged-out, ie metastatic cells of a non-local tumor. Thus, this method is ultimately based on the detection of cells that should not occur in the blood sample of ~ healthy individuals.
Insgesamt ist festzustellen, daß die derzeit verwendeten diagnostischen Methoden zu ungenau sind, wenn es um die Beurteilung der malignen Potenz von Resttumoren nach durchgeführter Chemotherapie in den meta- stasierenden Stadien geht. Es gilt also weiterhin, Nachweise für eine okkulte bzw. restliche Metastasie- rung zu finden, die eine rechtzeitige Einordnung in die vielfältigen primär kurativen therapeutischen Optionen zulassen.Overall, it can be stated that the diagnostic methods currently used are too imprecise when it comes to assessing the malignant potency of residual tumors after chemotherapy in the metastatic stages. It is therefore still important to find evidence of an occult or residual metastasis that allows timely classification into the various primarily curative therapeutic options.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren, ein Diagnose-Kit sowie einen Nukleinsäure- Mikroarray zur Verfügung zu stellen, mit denen Tumorzellen bei Hodentumorerkrankungen im peripheren Blut nachgewiesen werden können. Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit nach Anspruch 1, den Mikroarray nach Anspruch 20 sowie das Verfahren nach Anspruch 22 und deren Verwendung nach Anspruch 45 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Diagnose-Kits, Mikroarrays, Verfahrens oder der Verwendungen werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.The object of the present invention is therefore to provide a method, a diagnostic kit and a nucleic acid microarray with which tumor cells in testicular tumor diseases in peripheral blood can be detected. This object is achieved by the diagnostic kit according to claim 1, the microarray according to claim 20 and the method according to claim 22 and their use according to claim 45. Advantageous further developments of the diagnostic kit, microarrays, method or uses according to the invention are given in the respective dependent claims.
Die vorliegende Erfindung beruht im wesentlichen dar- auf, daß nicht etwa auf immunologischer oder enzyma- tischer Ebene Hodentumormarker im Blut von Patienten nachgewiesen werden, sondern daß die mRNS (Messenger- Ribonukleinsäure) von Hodentumormarkern in einer Blutprobe nachgewiesen wird, wobei die Tumormarker eine tumorassoziierte Genexpression darstellen. Als Marker für Hodentumoren werden erfindungsgemäß die Plazenta-spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) und die Keimzeil-spezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , die bei Hodentumoren exprimiert werden, das epitheliale Glycoprotein (GA733__2 oder EGP40) , das high-mobility group protein Isoform I-C (HMGI-C) sowie der Gastrin freisetzendes Peptid-Rezeptor (GRPR) erfaßt. Der Nachweis kann dabei für nur einen der Marker oder auch für eine beliebige Anzahl dieser vier Hodentumorenmarker in Kombination miteinander durchgeführt werden, wobei jedoch zumindest ein Nachweis der mRNA der Marker GA733.2 und/oder GCAP/PLAP erfolgt.. Das erfindungsgemäße Kit kann daher Oligonu- kleotidpaare für nur einen oder eine beliebige Aus- wähl oder auch alle der vier Hodentumormarker enthalten.The present invention is essentially based on the fact that testicular tumor markers are not detected in the blood of patients at an immunological or enzymatic level, but that the mRNA (messenger ribonucleic acid) of testicular tumor markers is detected in a blood sample, the tumor markers being associated with a tumor Represent gene expression. According to the invention, the placenta-specific alkaline phosphatase (PLAP) and the germline-specific alkaline phosphatase (GCAP), which are expressed in testicular tumors, the epithelial glycoprotein (GA733__2 or EGP40), the high-mobility group protein isoform IC ( HMGI-C) and the gastrin releasing peptide receptor (GRPR) are detected. The detection can be carried out for only one of the markers or for any number of these four testicular tumor markers in combination with one another, but at least the mRNA of the markers GA733.2 and / or GCAP / PLAP is detected. The kit according to the invention can therefore Contain oligonucleotide pairs for only one or any selection or all of the four testicular tumor markers.
Dadurch werden alle diejenigen Fälle nicht erfaßt, bei denen beispielsweise aufgrund von anderen Krank- heiten ebenfalls die Hodentumormarker im Ursprungsgewebe exprimiert und als Protein in die Blutbahn ge- langen. Es werden folglich lediglich Zellen erfaßt, die zum einen sich selbst in der Blutprobe befinden und zum anderen den jeweiligen Hodentumormarker ex- primieren. Dabei handelt es sich folglich um Tumor- zellen, die aus ihrem ursprünglichen Hodentumorgewebe stammen und in das Blut der Patienten verschleppt wurden. Da im Blut nicht an einem Hodentumor Erkrankter die mRNA der untersuchten Marker nicht exprimiert wird, zeigt sich eine direkte Korrelation zwischen dem Auftreten der zugehörigen mRNA und einer Metasta- sierung schon im frühen Stadium im Metastasierungs- prozeß .As a result, all those cases are not covered in which, for example, due to other diseases, the testicular tumor markers are also expressed in the original tissue and as a protein in the bloodstream. long. As a result, only cells are detected that are on the one hand in the blood sample and on the other hand express the respective testicular tumor marker. Consequently, these are tumor cells that originate from their original testicular tumor tissue and have been carried over into the patient's blood. Since the mRNA of the markers examined is not expressed in the blood of a testicular tumor patient, there is a direct correlation between the occurrence of the associated mRNA and metastasis even in the early stage of the metastasis process.
Vorteilhafterweise wird nicht nur die mRNS eines ein- zelnen Hodentu ormarkers erfaßt sondern eine Kombination von Markern untersucht. Dadurch ist es möglich, beispielsweise alle Hodenkrebsformen über ihre im Blut metastasierenden Zellen erfassen zu können. Dies bedeutet, daß sowohl seminöse als auch nichtseminöse Hodenkrebsformen bzw. auch Mischtumore mit Anteilen eines Semino s und damit 90-95 % aller malignen Tumo- re des Hodens, nämlich sämtliche Keimzelltumoren, erfaßt werden.Advantageously, not only is the mRNA of an individual testicular tumor marker detected, but a combination of markers is examined. This makes it possible, for example, to detect all types of testicular cancer via their cells metastasizing in the blood. This means that both seminous and non-seminous testicular cancer forms or mixed tumors with a semino fraction and thus 90-95% of all malignant tumors of the testis, namely all germ cell tumors, are detected.
Da einzelne Marker in therapieabhängiger Weise unterschiedlich exprimiert werden, ist es vorteilhaft, eine Kombination von Tumormarkern zu untersuchen, um alle im Blut zirkulierenden Tumorzellen zu erfassen. Hierdurch lassen sich Tumorzellen auch dann erkenn- nen, wenn die Expression eines bestimmten Markers bei einem Patienten bzw. in einem Krankheitsstadium relativ gering ist, was sonst zu einem vermeintlich negativen Ergebnis führen könnte. Die Verwendung weiterer Marker stößt jedoch meist deswegen auf Grenzen, weil mononukleäre Blutzellen eine HintergrundexpressionSince individual markers are expressed differently in a therapy-dependent manner, it is advantageous to investigate a combination of tumor markers in order to detect all tumor cells circulating in the blood. In this way, tumor cells can also be recognized when the expression of a particular marker in a patient or in a disease stage is relatively low, which could otherwise lead to a supposedly negative result. However, the use of additional markers mostly comes up against limits because mononuclear blood cells express background expression
(„illegitime Transkription ) aufweisen, die eine ex- akte Analyse behindern.("Illegitimate transcription) that have an ex- hinder the file analysis.
Für die Erkennung von Hodenzellen wird daher erfindungsgemäß die folgende Kombination aus Markern vorgeschlagen:The following combination of markers is therefore proposed according to the invention for the detection of testicular cells:
- GA733.2- GA733.2
- GCAP/PLAP- GCAP / PLAP
- HMGI-C - GRPR,- HMGI-C - GRPR,
wobei GA733.2 und/oder GCAP/PLAP für eine sichere Erkennung von Hodentumorzellen obligatorisch erfaßt werden müssen.whereby GA733.2 and / or GCAP / PLAP must be recorded for a reliable detection of testicular tumor cells.
Bei der Anwendung von RT-PCR-Syste en zum Nachweis von Tumorzellen ist aufgrund der sehr hohen Amplifi- kationsrate die Spezifität ein kritischer Punkt. Geringste Kontaminationen, etwa durch Fremd-RNA oder untypische Transkription, können hierbei das Ergebnis verfälschen.When using RT-PCR systems for the detection of tumor cells, the specificity is a critical point due to the very high amplification rate. The slightest contamination, such as from foreign RNA or atypical transcription, can falsify the result.
Zentral für die Qualität der als Nachweisbasis isolierten RNS und der daraus synthesitierten cDNS ist die Anreicherung der hierfür verwendeten Zellfraktion aus der verwendeten Blutprobe. Hierfür stehen verschiedene Methoden zur Verfügung:Central to the quality of the RNA isolated as a detection basis and the cDNA synthesized from it is the enrichment of the cell fraction used for this from the blood sample used. Various methods are available for this:
a) Anreicherung durch wiederholte Zentrifugation nach Erythrozytenlyse:a) Enrichment by repeated centrifugation after erythrocyte lysis:
1 ml EDTA-Blut werden nach Zugabe von 5 Volumina Erythrozyten-Lysepuffer („QIAmp Blood Kitλ , Qia- gen; Hilden) für 20 Minuten auf Eis lysiert. Nach Abnehmen des Plas as/Lysates von den pelletiertenAfter addition of 5 volumes of erythrocyte lysis buffer (“QIAmp Blood Kit λ , Qiagen; Hilden), 1 ml of EDTA blood is lysed on ice for 20 minutes. After removing the plas as / lysate from the pelleted
Zellen und Resuspension erfolgt eine erneute Zen- trifugation bei 3000 x g für 20 Minuten. Nach Abnehmen des Überstandes steht die pelletierte Leukozytenfraktion für die RNA-Präparation zur Verfügung.Cells and resuspension are re-zen centrifugation at 3000 xg for 20 minutes. After removing the supernatant, the pelleted leukocyte fraction is available for the RNA preparation.
b) Anreicherung durch Dichtegradienten- Zentrifugation:b) Enrichment by density gradient centrifugation:
Mittels eines über Zentrifugation erzeugten Dich- tegradienten lassen sich Zellen unterschiedlicher mittlerer Volumendichte voneinander trennen. Mononukleare Blutzellen werden mittels eines Ficoll- Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) separiert und anschließend zweifach mit PBS/1% FCS gewaschen.Using a density gradient generated by centrifugation, cells of different average volume density can be separated from one another. Mononuclear blood cells are separated using a Ficoll-Hypaque gradient (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and then washed twice with PBS / 1% FCS.
c) Anreicherung mittels Antikörpermarkierungc) Enrichment using antibody labeling
Durch die Verwendung der Immunzytochemie mit mono- klonalen Antikörpern gegen Tumorzellantigene kann eine Steigerung der Spezifität des Tumorzell- Nachweises erzielt werden (Nachweisquote von 1 Tumorzelle auf 107 mononukleären Blutzellen) . Die Tumorzellen werden dabei mittels spezifischer An- tikörper bzw. einer Antikörpermischung von mononukleären Blutzellen getrennt. Die Trennung kann mittels Magnetpartikel (Dynal), an die die Antikörper gebunden werden, erfolgen. Dies wird im folgenden detaillierter beschrieben.By using immunocytochemistry with monoclonal antibodies against tumor cell antigens, an increase in the specificity of tumor cell detection can be achieved (detection rate from 1 tumor cell to 10 7 mononuclear blood cells). The tumor cells are separated from mononuclear blood cells by means of specific antibodies or an antibody mixture. The separation can be carried out by means of magnetic particles (Dynal) to which the antibodies are bound. This is described in more detail below.
Eukaryontische Zellen tragen eine Vielzahl unterschiedlicher Moleküle an ihrer Zelloberfläche. Entsprechend des Ursprungs und der Funktion der einzelnen Zelle unterscheidet sich die Kombination der exprimierten Oberflächenmoleküle, so daß zell- typ-spezifische Muster entstehen. Zur' Erkennung dieser zelltyp-spezifischen Muster werden Antikörper genutzt. Antikörper binden mit hoher Spezifi- tät an ihr Antigen, hier an ausgewählte Oberflächenmoleküle. Diese Eigenschaft wird genutzt, um Zellen mittels spezifischer Antikörperbindung anhand ihrer Zelltyp-spezifischen Muster zu erkennen und voneinander zu unterscheiden.Eukaryotic cells have a large number of different molecules on their cell surface. The combination of the expressed surface molecules differs according to the origin and the function of the individual cell, so that cell-type-specific patterns arise. For ' detection antibodies are used in this cell type-specific pattern. Antibodies bind to their antigen with high specificity, here to selected surface molecules. This property is used to recognize and differentiate cells by means of specific antibody binding based on their cell type-specific patterns.
Die Expression spezieller Oberflächenproteine un- terscheidet Tumorzellen von nichttransfor iertenThe expression of special surface proteins distinguishes tumor cells from non-transformed ones
Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzeil-typischen Mustern unterscheidet, können Tumorzellen im Blut unter- schieden werden. Um Tumorzellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für verschiedene Analyse- und Separations-Methoden nutzbar gemacht.Cells of this cell type. Since this special pattern of surface antigens in tumor cells also differs from the typical blood cell patterns, tumor cells can be differentiated in the blood. To identify tumor cells, antibodies that specifically recognize these special surface proteins are used as tools. The specific antibody binding is used for different analysis and separation methods.
Aufgrund der intensiven Bindung von speziell dafür selektionierten Immunglobulinen ist neben der Erkennung von Zellen über deren Oberflächenepitope auch eine Separierung der erkannten Zellen von nicht erkannten möglich.Due to the intensive binding of specially selected immunoglobulins, apart from the recognition of cells via their surface epitopes, it is also possible to separate the recognized cells from unrecognized ones.
Verschiedene Trennprinzipien sind möglich:Different separation principles are possible:
1. Trennprinzip beruhend auf Flüssigphase; z. B.1. separation principle based on liquid phase; z. B.
Durchflußzytometrie :Flow cytometry:
Für die durchflußzytometrische Analyse werden Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Vereinzelte Zellen werden in einem konstantenAntibodies are coupled with fluorescent dyes for flow cytometric analysis. Scattered cells become constant
Flüssigkeitsstrom einzeln an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeleitet. Bei Beleuchtung der Zellen werden die an den Antikörpern gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und strahlen Licht bestimmter Wellenlängen ab. Das abge- strahlte Licht wird detektiert und das gemesseneLiquid flow individually at a light source (Laser) passed by. When the cells are illuminated, the fluorescent dyes bound to the antibodies are excited and emit light of specific wavelengths. The emitted light is detected and the measured one
Signal digitalisiert gespeichert. Das Lichtsignal kann einzelnen Zellen zugeordnet werden. Die Antikörper-markierte Zelle wird so erkannt und kann nun von anderen Zellen getrennt werden. Zur Trennung werden die Zellen in kleinstenDigitized signal stored. The light signal can be assigned to individual cells. The antibody-labeled cell is thus recognized and can now be separated from other cells. For separation, the cells are made in the smallest
Tropfen vereinzelt. Nach Erkennung der Antikörper-markierten Zelle wird der entsprechende Tropfen in ein Auffangbehältnis gelenkt.Drops isolated. After detection of the antibody-labeled cell, the corresponding drop is directed into a collecting container.
Eine derartige Anreicherung kann beispielsweise durch FACS-Durchflußzytometrie erfolgen. Dabei werden beispielsweise die mononukleären Zellen aus der unter b) angereicherten Fraktion mit fluoreszenzmarkierten- mononuklearen Antikörpern gegen tumorspezifische Oberflächenproteine inkubiert. Die markierten Zellen werden zweifach mit PBS gewaschen und im Anschluß werden 107 Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Für die Isolierung der Tumorzellen wird ein FACS Vantage SE- Durchflußzytometer (Becton Dickinson) verwendet.Such an enrichment can be done, for example, by FACS flow cytometry. For example, the mononuclear cells from the fraction enriched under b) are incubated with fluorescence-labeled mononuclear antibodies against tumor-specific surface proteins. The labeled cells are washed twice with PBS and then 10 7 cells are resuspended in 1 ml PBS. A FACS Vantage SE flow cytometer (Becton Dickinson) is used to isolate the tumor cells.
Über das CellQuest Programm erfolgen Datenaufnahme, Instrumentenkontrolle und Datenauswertung. Die sortierten Zellen werden in ein 1,5 l-Reaktionsgefäß (gefüllt mit 1 ml PBS) über- führt. Die RNS kann dann wie später beschrieben isoliert werden.The CellQuest program is used for data acquisition, instrument control and data evaluation. The sorted cells are transferred to a 1.5 l reaction vessel (filled with 1 ml PBS). The RNA can then be isolated as described later.
2. Trennprinzip beruhend auf Festphase; z. B. magnetische Separation: Für die magnetische Separation werden Antikörper mit pseudomagnetischen Partikeln gekoppelt. Nach Einbringen der pseudomagnetischen Partikel in ein Magnetfeld wandern die Partikel im magnetischen Feld. Bei der Bewegung in diesem magnetischen Feld werden Zellen, an die diese gekoppelten Antikörper gebunden sind, mitgerissen und von anderen Zellen getrennt.2. separation principle based on solid phase; z. B. Magnetic separation: For magnetic separation, antibodies are coupled with pseudomagnetic particles. After the pseudomagnetic particles have been introduced into a magnetic field, the particles migrate in the magnetic field. When moving in this magnetic field, cells to which these coupled antibodies are bound are entrained and separated from other cells.
Zur Tumorzellenerkennung mittels Magnetpartikel werden folglich an pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, Anti- körper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper-gekoppelte Magnetpartikel versetzt; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt, beispielsweise durch „Über-For tumor cell detection by means of magnetic particles, antibodies are consequently covalently coupled to pseudomagnetic particles that have a defined number of chemically activated sites on their surface. The specificity of the separation is determined via the specificity of the antibodies. A blood sample containing tumor cells is mixed with antibody-coupled magnetic particles; then particles and blood are moved relative to each other, for example by “over-
Kopf-Rotieren in einem geschlossenen Behälter befindlicher Proben oder durch Bewegung der Partikel aufgrund wechselnder Magnetfelder. Jene (Tumor-) Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch 'ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z.B. an die Wand des Trenngefäßes) . Das auf diese Weise Tu- morzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verblei- ben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen. Vorteilhafterweise können für die Erkennung der Tumorzellen spezifische Antikörper-Mischungen verwendet werden, die entweder allgemein auf Tumorzellen oder auch spezifisch für Hodenzellen-Erkennung optimiert sind. Beispielsweise eignet sich zur Erkennung von Tumorzellen im Blut eine Kombination der Antikörper MOC-31 und Ber-EP4.Head rotation of samples in a closed container or by movement of the particles due to changing magnetic fields. Those (tumor) cells that are recognized by the solid-phase-bound antibodies and thus firmly bound follow the movement of the particles. In this way, 'it is possible, upon application of a magnetic field, the particles with the bound cells from the blood extract (for example, on the wall of the separation vessel). The blood depleted in this way can be exchanged for other solutions, the cells separated by magnetic particles remaining on site until the magnetic field is switched off / removed and are available for further applications. Advantageously, specific antibody mixtures can be used for the detection of the tumor cells, which are either optimized generally for tumor cells or also specifically for testicular cell detection. For example, a combination of the antibodies MOC-31 and Ber-EP4 is suitable for the detection of tumor cells in the blood.
Tabelle A: Antikörper-Mischung 1Table A: Antibody Mixture 1
Mittels der Antikörpermischung in der vorhergehenden Tabelle A werden ganz allgemein Tumorzellen, jedoch mit hoher Spezifität erfaßt. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Krebszellen von anderen Zellen unterscheidet.Using the antibody mixture in Table A above, tumor cells are detected in general, but with high specificity. This is due to the selective expression of certain surface proteins that differentiate cancer cells from other cells.
Derartige Antikörpermischungen zeigen im Vergleich zu den jeweils separat eingesetzten Antikörpern bei der Zellerkennung und Zelltrennung unabhängig von der angewandten Methode eine erhöhte Sensitivität .Antibody mixtures of this type show an increased sensitivity in comparison to the separately used antibodies in cell recognition and cell separation, regardless of the method used.
Im folgenden werden einige Beispiele erfindungsgemäßer Verfahren, hierzu verwendeter Diagnose-Kits und dergleichen beschrieben. Es zeigen :Some examples of methods according to the invention, diagnostic kits used for this and the like are described below. Show it :
Fig. 1 den, Nachweis von PCR-Produkten mittels1 shows the detection of PCR products by means of
Elektrophorese; undelectrophoresis; and
Fig. 2 einen weiteren Nachweis von PCR-Produkten mittels Elektrophorese.2 shows a further detection of PCR products by means of electrophoresis.
In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfah- rens wird einem Patienten eine Blutprobe entnommen. Aus einem Milliliter dieses Vollblutes (als EDTA- Vollblut) erfolgt eine RNS-Aufarbeitung mit dem QIAampRNA-Blood Mini Kit™ (Firma Qiagen, Hilden) . Kontaminationen mit genomischer DNS werden durch ei- nen zusätzlichen DNS-Verdau mit dem RNase-Free DNase Set™, (Firma Qiagen, Hilden) auf der Säule vermieden.In a first step of the method according to the invention, a blood sample is taken from a patient. RNS processing from a milliliter of this whole blood (as EDTA whole blood) is carried out using the QIAampRNA-Blood Mini Kit ™ (from Qiagen, Hilden). Contamination with genomic DNA is avoided by an additional DNA digestion with the RNase-Free DNase Set ™ (company Qiagen, Hilden) on the column.
Alternativ zur oben beschriebenen RNS-Isolierung ist es auch möglich, die isolierte Fraktion mononukleärer Blutkörpercen, wie sie oben beschrieben sind, in TRI- zol-Reagenz der Firma Gibco BRL, NY, USA aufzunehmen, zu lysieren und mittels Pipette zu homogenisieren. Anschließend wird die RNS-haltige wäßrige Phase aus einer Chloroform-Extraktion in Isopropanol bei -80°C gefällt. Nach zweimaligem Waschen in 80%igem Ethanol wird das Pellet an der Luft getrocknet und anschließend in RNase-freiem Wasser resuspendiert.As an alternative to the RNA isolation described above, it is also possible to take up the isolated fraction of mononuclear blood cells, as described above, in TRIzol reagent from Gibco BRL, NY, USA, to lyse them and to homogenize them using a pipette. The RNA-containing aqueous phase is then precipitated from a chloroform extraction in isopropanol at -80 ° C. After washing twice in 80% ethanol, the pellet is air-dried and then resuspended in RNase-free water.
Anschließend wurde die RNS in einem entsprechenden Volumen Wasser zusammen mit Oligo (dT) ι5-Primern der Firma Promega, Mannheim für 5 Minuten bei 65 °C denaturiert und anschließend direkt auf Eis inkubiert. Es folgte eine cDNS-Synthese bei 37 °C für eine Stunde und eine nachfolgende Inaktivieruήg der zugegebenen reversen Transkriptase für 5 Minuten bei 93 °C und Abkühlung auf Eis. Die gesamte reverse Transkription wurde mittels des Sensiskript™ Reverse Transkriptase Kit der Firma Qiagen, Hilden durchgeführt.The RNA was then denatured in an appropriate volume of water together with oligo (dT) ι5 primers from Promega, Mannheim for 5 minutes at 65 ° C. and then incubated directly on ice. This was followed by cDNA synthesis at 37 ° C for one hour and a subsequent inactivation of the added reverse transcriptase for 5 minutes at 93 ° C and Cooling down on ice. The entire reverse transcription was carried out using the Sensiscript ™ reverse transcriptase kit from Qiagen, Hilden.
Der Reaktionsansatz für 20 μl für die cDNS-Synthese ist in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.The reaction mixture for 20 μl for cDNA synthesis is given in Table 1 below.
Tabelle 1: Komponenten der cDNS-SyntheseTable 1: Components of cDNA synthesis
Im Anschluß an die reverse Transkription wurde eine Multiplex-PCR mit ß-Aktin als interner Kontrolle durchgeführt. Der entsprechende Reaktionsansatz geht aus Tabelle 2 im folgenden hervor. Following the reverse transcription, a multiplex PCR with β-actin as an internal control was carried out. The corresponding reaction batch is shown in Table 2 below.
Tabelle 2: PCR-AnsatzTable 2: PCR approach
Die PCR-Synthese erfolgte in einem 20 μl-ReaktionsansatzThe PCR synthesis was carried out in a 20 μl reaction mixture
* enthält 15 mM MgCl2 * contains 15 mM MgCl 2
** HotStar Taq™ DNA Polymerase, Fa. Qiagen, Hilden *** Q-Solution; Fa. Quiagen, Hilden;** HotStar Taq ™ DNA polymerase, from Qiagen, Hilden *** Q-Solution; Quiagen, Hilden;
(Der Zusatz von Q-Solution ist zum Nachweis von GCAP/PLAP notwendig) .(The addition of Q-Solution is necessary for the detection of GCAP / PLAP).
Als Primer wurden die in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßten PCR-Primer eingesetzt. The PCR primers summarized in Table 3 below were used as primers.
Tabelle 3: Liste der PCR-PrimerTable 3: List of PCR primers
Diese Primer wurden in den in Tabelle 4 aufgelisteten Mengen und Kombinationen eingesetzt, die dort spaltenweise aufgeführt sind. These primers were used in the amounts and combinations listed in Table 4, which are listed in columns.
Tabelle 4: Auflistung der Pri ermengen und Pri- merkominationenTable 4: List of primary quantities and primary combinations
Die Multiplex-PCR wurde unter den in Tabelle 5 angegebenen Bedingungen und bei den in Tabelle 6 angegebenen markerspezifischen Annealingtemperaturen und Zyklenzahlen durchgeführt. In Tabelle 5 ist die An- nealingtemperatur mit x angegeben, wobei dabei jeweils die entsprechende Annealingtemperatur aus Tabelle 6 verwendet wurde.The multiplex PCR was carried out under the conditions given in Table 5 and at the marker-specific annealing temperatures and number of cycles given in Table 6. In table 5 the annealing temperature is indicated by x, whereby the corresponding annealing temperature from table 6 was used in each case.
Tabelle 5 PCR-BedingungenTable 5 PCR conditions
Vorabdenaturierung 95 ° C 15 minPre-denaturation 95 ° C 15 min
Zykluscycle
1 . Denaturierung 94 °c 1 min1 . Denaturation 94 ° c 1 min
2 . Annealing x °c 1 min ( s . Tab . 6)2nd Annealing x ° c 1 min (see table 6)
3 . Extension 72 °c 1 min3rd Extension 72 ° c 1 min
Finale Extension 72 °c 10 minFinal extension 72 ° c 10 min
4 °c Pause Tabelle 6: Marker-spezifische Annealingtemperatur und Zyklenzahl4 ° c break Table 6: Marker-specific annealing temperature and number of cycles
1 μl des so erzeugten PCR-Produktes wurde in einem Agilent Bioanalyzer 2100 auf einem DNA-Chip 500 aufgetrennt und das Trennergebnis elektrophoretisch dokumentiert.1 μl of the PCR product generated in this way was separated in an Agilent Bioanalyzer 2100 on a DNA chip 500 and the separation result was documented electrophoretically.
Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines Nachweises mittels Elektrophorese unter Einsatz eines DNA-500-Chip (Agilent) und eines Agilent Bioanalyzer 2100. Spur 1 zeigt eine 100 bp-Leiter, Spur 2 eine cDNA-Kontrolle ohne RNA im Ansatz, Spur 3 eine PCR-Kontrolle ohne cDNA im Ansatz, Spur 4 eine Negativkontrolle für GCAP/PLAP mit RNA einer gesunden Kontrollperson im Ansatz und Spur 5 die Probe einer erkrankten Person.1 shows the result of a detection by means of electrophoresis using a DNA 500 chip (Agilent) and an Agilent Bioanalyzer 2100. Lane 1 shows a 100 bp ladder, lane 2 shows a cDNA control without RNA in the approach, lane 3 one PCR control without cDNA in the approach, lane 4 a negative control for GCAP / PLAP with RNA from a healthy control person in the approach and lane 5 the sample from a diseased person.
Die Kontrollmessung von ß-Aktin ist lediglich bei den beiden realen Blutproben der Spuren 4 und 5 positiv, während lediglich Spur 5 die zu erwartende Bande für GCAP/PLAP als Hodentumormarker aufweist.The control measurement of β-actin is only positive in the two real blood samples of lanes 4 and 5, while only lane 5 has the expected band for GCAP / PLAP as testicular tumor marker.
Ein weiteres Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. Der Nachweis erfolgte dabei ebenfalls mittels eines Agilent Bioanalyzer 2100 und einem DNA-500 Assay-Chip von Agilent. Die Spuren 1 bis 6 zeigen dabei eine Multiplex-PCR der cDNA von GCAP und GA733.2 und die Spuren 7 bis 13 eine Multiplex-PCR der cDNA von GCAP, GA733.2, GRPR und HMGI-C. Die Bezeichnungen cDNA- Kontrolle, PCR-Kontrolle und Negativ-Kontrolle bezeichnen Proben ohne RNA, ohne cDNA bzw. mit RNA einer gesunden Kontrollperson. Es ist in den Spuren 5, 9 bzw. 13 zu erkennen, daß lediglich die Proben an Hodentumor erkrankter Personen im Nachweis der cDNA unddamit der mRNA für GCAP/PLAP, GA733.2, GRPR und HMGI-C positiv sind.Another result is shown in FIG. 2. The detection was also carried out using an Agilent Bioanalyzer 2100 and a DNA 500 assay chip from Agilent. Lanes 1 to 6 show a multiplex PCR of the cDNA from GCAP and GA733.2 and lanes 7 to 13 show a multiplex PCR of the cDNA from GCAP, GA733.2, GRPR and HMGI-C. The designations cDNA- Control, PCR control and negative control refer to samples without RNA, without cDNA or with RNA from a healthy control person. It can be seen in lanes 5, 9 and 13, respectively, that only the testicular tumor samples in the detection of the cDNA and therefore the mRNA are positive for GCAP / PLAP, GA733.2, GRPR and HMGI-C.
Damit ist gezeigt, daß die entsprechenden Hodentumor- marker wie beschrieben und beansprucht, nachgewiesen werden können.This shows that the corresponding testicular tumor markers can be detected as described and claimed.
Alternativ zu den hier dargestellten Methoden können selbstverständlich auch herkömmliche Analysemethoden wie Agarose-Gelelektrophorese angewandt werden, bei denen beispielsweise 25 μl des oben dargestellten PCR-Produktes über ein 2,5%iges Agarosegel aufgetrennt werden und die DNS-Banden anschließend mit Ethidiumbromid angefärbt und sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation kann beispielsweise mit Hilfe des DUO Store Systems der Fa. Inta durchgeführt werden.As an alternative to the methods presented here, conventional analysis methods such as agarose gel electrophoresis can of course also be used, in which, for example, 25 μl of the PCR product shown above are separated using a 2.5% agarose gel and the DNA bands are subsequently stained and visible with ethidium bromide be made. The documentation can be carried out, for example, using the Inta DUO Store System.
Auch eine Fragmentanalyse mittels ABI Prism 310 Gene- tic Analyzer (Fa. PE Applied Biosystems, Weiterstadt) kann zur Auswertung verwendet werden. Hierzu wird eine PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt und anschließend beispielsweise jeweils 1 μl des jeweiligen PCR-Produktes in einer Verdünnung von 1 : 50 eingesetzt.A fragment analysis using the ABI Prism 310 Genetic Analyzer (from PE Applied Biosystems, Weiterstadt) can also be used for evaluation. For this purpose, a PCR with fluorescence-labeled primers is carried out and then, for example, 1 μl of the respective PCR product is used in a dilution of 1:50.
Als weiterer Nachweis ist ein Nachweis mittels sequenzspezifischer fluoreszenzmarktierter Hybridisie- rungsproben möglich, die nach jedem Zyklus der PCR die Produktentwicklung verfolgen lassen. Anhand spe- zieller Standards kann dann auch ein Rückschluß auf die Menge an Ausgangs-RNS gezogen werden. Als Alter- native zur Block-PCR kann der Tumormarkernachweis auch mittels Echtzeit-PCR unter Verwendung DANN- interkallierender Fluoreszenzfarbstoffe erfolgen (z.B. LightCycler™ und CybrGreen™ der Fa. Hoffmann- Röche) .Dazu erfolgt beispielsweise eine Quantifizierung über fluoreszenzbasierte Echtzeit-PCR. Hierzu wird dem PCR-Ansatz eine sequenzspezifische fluoreszenzmarkierte Hybridisierungsprobe zugesetzt, durch die nach jedem Zyklus der PCR mittels der von ihr emittierten Fluoreszenz die Produktentwicklung, d.h. die Amplifikation, verfolgt werden kann. Anhand spezieller Standards können dann Rückschlüsse auf die Mengen an Ausgangs-RNS gezogen werden. Damit ist auch eine Quantifizierung der in der Blutprobe vorliegen- den Hodentumor-assoziierten RNS und folglich eine direkte Aussage über das Ansprechen auf eine gewählte Therapiemethode möglich. Dieses Verfahren kann beispielsweise mit einem Light-Cycler™ der Firma Röche, Basel oder einem Taq-Man™ der Firma PE Applied Bio- Systems, Wieterstadt, wie es bereits hinlänglich aus der Literatur bekannt ist, durchgeführt werden.As a further proof, a proof by means of sequence-specific fluorescence-marked hybridization samples is possible, which allow the product development to be followed after each cycle of the PCR. Special standards can then be used to draw conclusions about the amount of output RNA. As an age In addition to block PCR, tumor marker detection can also be carried out using real-time PCR using DANN-intercalating fluorescent dyes (eg LightCycler ™ and CybrGreen ™ from Hoffmann-Röche). For this purpose, for example, quantification is carried out using fluorescence-based real-time PCR. For this purpose, a sequence-specific fluorescence-labeled hybridization sample is added to the PCR approach, by means of which the product development, ie the amplification, can be followed after each cycle of the PCR by means of the fluorescence emitted by it. Special standards can then be used to draw conclusions about the quantities of starting RNA. This also makes it possible to quantify the testicular tumor-associated RNA present in the blood sample and, consequently, to make a direct statement about the response to a selected therapy method. This method can be carried out, for example, with a Light-Cycler ™ from Röche, Basel or a Taq-Man ™ from PE Applied Bio-Systems, Wieterstadt, as is already well known from the literature.
Abschließend sei darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Ver- fahren es weiterhin ermöglichen, die wie oben beschriebenen sortierten und separierten Zellen anschließend beliebig weiter zu verwenden. Beispielsweise können diese in ein geeignetes Zellkulturmedium eingesetzt und in situ kultiviert werden.Finally, it should be pointed out that the device according to the invention and the method according to the invention also make it possible to continue using the sorted and separated cells as described above as desired. For example, these can be inserted into a suitable cell culture medium and cultivated in situ.
Da die Zellen nach der Trennung intakt sind, bleiben auch die Eigenschaften der Zellmembran und des Zellkerns erhalten. Dies eröffnet die Möglichkeit, mikroskopisch die Expression weiterer Oberflächenmarker untersuchen oder auch Chromosomen-Analysen durchzuführen. Die sortierten Zellen werden dazu auf Objekt- träger aufgebracht. Der Nachweis weiterer Oberflä- chenmarker kann chytochemisch oder über Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Ebenso können genetische Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Chromosomenanalysen mittels FISH (Fluorescence in situ hybri- disation) oder Karyogramm-Erstellung. Since the cells are intact after separation, the properties of the cell membrane and the cell nucleus are also retained. This opens up the possibility of microscopically examining the expression of further surface markers or of carrying out chromosome analyzes. The sorted cells are carrier applied. Additional surface markers can be detected chytochemically or using fluorescence microscopy. Genetic analyzes can also be carried out, such as chromosome analyzes using FISH (fluorescence in situ hybridization) or karyogram generation.

Claims

Patentansprücheclaims
1. Diagnose-Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Hodentumoren mit mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverse- primer, Forwardprimer) , wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymeraseket- tenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und wobei der gesuchte DNS-Abschnitt Teil der cDNS zu einem der Tumormarkerproteine plazentaspezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , kei - zell-spezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40) , high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide re- ceptor (GRPR) ist.1. Diagnostic kit for the diagnosis or treatment control of testicular tumors with at least one pair of oligonucleotides (reverse primer, forward primer), the two oligonucleotides of the pair being suitable as primers for amplification by means of polymerase chain reaction in each case one of the two complementary strands of a sought-after DNA section and where the DNA section searched is part of the cDNA for one of the tumor marker proteins placental-specific alkaline phosphatase (PLAP), cell-specific alkaline phosphatase (GCAP), epithelial glycoprotein 40 (GA 733.2 or EGP 40), high-mobility group protein isoform IC (HMGI-C) and / or gastrin-releasing peptide receptor (GRPR).
2. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei Paare Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) enthält, wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Poly- merasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener gesuchter2. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that it contains at least two pairs of oligonucleotides (reverse primer, forward primer), the two oligonucleotides of the respective pairs as primers for amplification by means of polymerase chain reaction in each case one of the two complementary strands of different sought
DNS-Abschnitte geeignet sind, und wobei die gesuchten DNS-Abschnitte jeweils Teil der c-DNS zu verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen plazen- ta-spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , kei zell-spezifische alkalische Phosphatase (GCAP), epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40), high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) sind.DNS sections are appropriate, and where the DNA sections sought are in each case part of the c-DNA relating to different tumor marker proteins selected from the tumor marker proteins site-specific alkaline phosphatase (PLAP), cell-specific alkaline phosphatase (GCAP), epithelial glycoprotein 40 (GA 733.2 or EGP 40 ), high-mobility group protein isoform IC (HMGI-C) and / or gastrin-releasing peptide receptor (GRPR).
3. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein weiteres Paar Oligonukleotide (Rever- seprimer, Forwardprimer) enthält, wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als3. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains at least one further pair of oligonucleotides (reverse primer, forward primer), the two oligonucleotides of the pair being
Primer zur Amplifikation mittels Polymeraseket- tenreaktion der Reaktionsprodukte einer Polyme- rasekettenreaktion mit einem der anderen Oligo- nukleotidpaare geeignet sind.Primers are suitable for amplification by means of polymerase chain reaction of the reaction products of a polymer chain reaction with one of the other oligonucleotide pairs.
4. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein weiteres Paar Oligonukleotide enthält, die jeweils als Primer zur Amplifikation zumindest eines Ab- Schnitts eines der beiden komplementären Stränge der cDNS zu dem Protein ß-Aktin als interne Kontrolle geeignet sind. 4. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains a further pair of oligonucleotides, each suitable as a primer for the amplification of at least one section of one of the two complementary strands of the cDNA to the protein β-actin as an internal control are.
. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonukleotide eines Paares paarweise die folgenden Sequenzen aufweisen:, Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that the two oligonucleotides of a pair have the following sequences in pairs:
GCCACGCAGCTCATCTCCAACATG und ATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGG; und/oderGCCACGCAGCTCATCTCCAACATG and ATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGG; and or
AATCGTCAATGCCAGTGTACTTCA und TAACGCGTTGTGATCTCCTTCTGA; und/oderAATCGTCAATGCCAGTGTACTTCA and TAACGCGTTGTGATCTCCTTCTGA; and or
AAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCC und CCAACTGCTGCTGAGGTAGAAATC; und/oderAAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCC and CCAACTGCTGCTGAGGTAGAAATC; and or
TCTCCCCGTGAACGATGACTGGTC und TGAAGACAGACACCCCAACAGAGG .TCTCCCCGTGAACGATGACTGGTC and TGAAGACAGACACCCCAACAGAGG.
6. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit Fluoropho- ren markiert ist.6. Diagnostic kit according to one of the two preceding claims, characterized in that at least one of the two oligonucleotides of a pair of oligonucleotides is labeled with fluorophores.
7. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide verschiedener Paare mit verschiedenen Fluoropho- ren markiert sind. 7. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that the oligonucleotides of different pairs are labeled with different fluorophores.
8. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Amplifikation der cDNS zu ß-Aktin ein Paar Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen enthält: CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT und ACAGGACTCCATGCCCAGGAAGGA.8. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains a pair of oligonucleotides with the following sequences for the amplification of the cDNA to β-actin: CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT and ACAGGACTCCATGCCCAGGAAGGA.
9. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide des Paares zur Amplifikation der cDNS zu ß-Aktin mit Fluoropho- ren markiert ist.9. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that at least one of the two oligonucleotides of the pair for the amplification of the cDNA to β-actin is labeled with fluorophores.
10. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit folgender Sequenz10. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that the oligonucleotide with the following sequence
CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT mit dem Fluorophor 4,7,2' ,4" ,5', 7' -Hexachloro-6-Carboxyfluorescein markiert ist.CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT is labeled with the fluorophore 4,7,2 ', 4 ", 5', 7 '-hexachloro-6-carboxyfluorescein.
11. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderlichen Substanzen enthält. 11. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains the substances required for carrying out a polymerase chain reaction.
12. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate sowie eine hitzestabile Polymerase enthält.12. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains a buffer solution, magnesium chloride, deoxynucleotide triphosphates and a heat-stable polymerase as the substances required for carrying out a polymerase chain reaction.
13. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile13. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that it is heat-stable
Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.Polymerase contains a polymerase from Thermus aquaticus (Taq polymerase).
14. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An- Sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS-Probe mit dem jeweils gesuchten DNS-Abschnitt enthält.14. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains, as a positive control, a DNA sample with the DNA section sought in each case.
15. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An- sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion und/oder eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.15. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains instructions for performing the polymerase chain reaction and / or instructions for performing a fragment analysis.
16. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält. 16. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains a scheme for evaluating the measurement results obtained.
17. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Array eine Anzahl voneinander getrennter Zellen (Felder) aufweist und in mindestens einer Zelle des Mikroarrays ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten DNS-Abschnitt hybridisiert.17. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains a microarray (DNA chip), the array having a number of separate cells (fields) and in at least one cell of the microarray an oligonucleotide is arranged, which hybridizes with the searched DNA section.
18. Diagnosekit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen18. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that a further oligonucleotide is arranged in at least one further cell of the microarray and the sequence of the oligonucleotide which is in the at least one
Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unterscheidet.Cell is arranged, differs from the sequence of the other oligonucleotide.
19. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen- den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die. in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridi- sieren.19. Diagnostic kit according to one of the two preceding claims, characterized in that in each case an oligonucleotide is arranged in at least two cells, the. hybridize oligonucleotides arranged in different cells with different sought DNA segments.
20. Mikroarray zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Hodentumoren, beispielsweise DNS- Chip, mit einer Anordnung von mehreren, von- einander getrennten Zellen, dadurch gekennzeich- net, daß in mindestens einer Zelle ein Oligonu- kleotid angeordnet ist, das mit einem DNS- Abschnitt hybridisiert, der Teil der cDNS zu einem der Tumormarkerproteine, plazenta- spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , keimzellspezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40) , high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide re- ceptor (GRPR) ist.20. Microarray for the diagnosis or treatment control of testicular tumors, for example a DNA chip, with an arrangement of a plurality of cells which are separate from one another, characterized in that net that an oligonucleotide is arranged in at least one cell, which hybridizes with a DNA section that part of the cDNA to one of the tumor marker proteins, placental-specific alkaline phosphatase (PLAP), germ cell-specific alkaline phosphatase (GCAP), epithelial glycoprotein 40 (GA 733.2 or EGP 40), high-mobility group protein isoform IC (HMGI-C) and / or gastrin-releasing peptide receptor (GRPR).
21. Mikroarray nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß in zwei bis vier Zellen jeweils verschiedene Oligonukleotide angeordnet sind, die mit jeweils zwei bis vier verschiedenen DNS-21. Microarray according to claim 20, characterized in that different oligonucleotides are arranged in two to four cells, each with two to four different DNA
Abschnitten, die Teil der cDNS von jeweils verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen plazenta-spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , keimzell- spezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40), high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) sind, hybridisieren.Sections that are part of the cDNA of different tumor marker proteins selected from the tumor marker proteins placenta-specific alkaline phosphatase (PLAP), germ cell-specific alkaline phosphatase (GCAP), epithelial glycoprotein 40 (GA 733.2 or EGP 40), high-mobility group protein isoform IC (HMGI-C) and / or gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) are hybridizing.
22. Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskon- trolle von Hodentumoren bei einem Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS erfaßt wird, die für mindestens eines der Tumormarkerproteine plazenta-spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , keimzell-spezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40), high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) kodiert und daraus auf das Vorhandensein von Tumorzellen in der Blutprobe und damit auf mögliche Metasta- sierung geschlossen wird.22. A method for the diagnosis or treatment control of testicular tumors in a human being, characterized in that the presence or absence of mRNA is detected in a human blood sample which is placental-specific alkaline for at least one of the tumor marker proteins Phosphatase (PLAP), germ cell-specific alkaline phosphatase (GCAP), epithelial glycoprotein 40 (GA 733.2 or EGP 40), high-mobility group protein isoform IC (HMGI-C) and / or gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) and concludes from this the presence of tumor cells in the blood sample and thus possible metastasis.
23. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, -dadurch gekennzeichnet, daß die mRNS in herkömmlicher Weise unmittelbar aus der Vollblutprobe isoliert wird.23. The method according to the preceding claim, characterized in that the mRNA is isolated in a conventional manner directly from the whole blood sample.
24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an' die Isolation der mRNS ein DNS-Verdau durchgeführt wird.24. Method according to the preceding claim, characterized in that subsequent to 'the isolation of mRNA a DNS digestion is carried out.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Bestandteile der Blutprobe zuerst aufkonzentriert werden und anschließend diese Fraktion untersucht wird.25. The method according to any one of claims 22 to 24, characterized in that the RNA-containing components of the blood sample are first concentrated and then this fraction is examined.
26. Verfahren' nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auf konzentration der RNS-haltigen Bestandteile mindestens eine Zentrifugation der Blutprobe zur Pelletierung der in ihr enthaltenen Leukozyten durchgeführt wird.26. The method 'according to the preceding claim, characterized in that for on the RNS containing components of at least one concentration-centrifugation of the blood sample to pellet of the leukocytes it contains.
27. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der RNS-haltigen Bestandteile eine Lyse darin enthaltener Erythrozyten durchgeführt und anschließend die nichtlysierten Leukozyten als Fraktion pelletiert und für die weitere Dia- gnose gewonnen werden.27. The method according to any one of the two preceding claims, characterized in that for the concentration of the RNA-containing constituents, a lysis of erythrocytes contained therein is carried out and then the non-lysed leukocytes are pelleted as a fraction and obtained for further diagnosis.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der RNS-haltigen Bestandteile mindestens eine Dichtegradienten-Zentrifugation der Blutprobe zur Abseparierung und Gewinnung der in ihr enthaltenen mononuklearen Blutzellen durchgeführt wird.28. The method according to any one of claims 25 to 27, characterized in that at least one density gradient centrifugation of the blood sample for separating and obtaining the mononuclear blood cells contained in it is carried out to concentrate the RNA-containing components.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß zur Separation von Hodentumorzellen die Zellen mit gegen Tumorzellen oder Hodentumorzellen gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert und mittels fluoreszenzassoziierter- Zellsortierung (FACS) von der Probe abgetrennt und gewonnen werden.29. The method according to any one of claims 22 to 28, characterized in that for the separation of testicular tumor cells, the cells are labeled with fluorescence-labeled antibodies directed against tumor cells or testicular tumor cells and are separated from the sample and obtained by means of fluorescence-associated cell sorting (FACS).
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß zur Separation von Tumorzellen oder Hodentumorzellen die Zellen mit magnetischen Partikeln in Kontakt gebracht werden, auf derenOberfläche gegen Tumorzellen oder Hodentumorzellen gerichtete Antikörper immobilisiert sind und die magnetischen Partikel an- schließend abgetrennt werden.30. The method according to any one of claims 22 to 29, characterized in that the cells with for the separation of tumor cells or testicular tumor cells magnetic particles are brought into contact, on the surface of which antibodies directed against tumor cells or testicular tumor cells are immobilized and the magnetic particles are subsequently separated off.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die mononuklearen Zellen der gewonnenen Fraktion lysiert und die mRNS abgetrennt wird.31. The method according to any one of claims 26 to 30, characterized in that the mononuclear cells of the fraction obtained are lysed and the mRNA is separated.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene mRNS in cDNS revers transkribiert wird und anschlie- ßend das Vorhandensein oder Fehlen der cDNS erfaßt wird, die dem Tumormarkerprotein zugeordnet ist.32. The method according to any one of claims 23 to 31, characterized in that the mRNA obtained is reversely transcribed in cDNA and then the presence or absence of the cDNA which is assigned to the tumor marker protein is detected.
33. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß zumindest ein vorbestimmter Abschnitte der cDNS durch Polymerase- Kettenreaktion ("PCR") bzw. verschachtelte Polymerase-Kettenreaktion ("nested33. The method according to the preceding claim, characterized in that at least a predetermined section of the cDNA by polymerase chain reaction ("PCR") or nested polymerase chain reaction ("nested"
PCR") vervielfältigt wird.PCR ") is reproduced.
34. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS eines oder mehrere Oligonukleotid-Paare verwendet werden, die die folgenden Sequenzen aufweisen: GCCACGCAGCTCATCTCCAACATG und ATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGG; und/oder34. The method according to the preceding claim, characterized in that one or more pairs of oligonucleotides are used to reproduce the cDNA, which have the following sequences: GCCACGCAGCTCATCTCCAACATG and ATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGG; and or
AATCGTCAATGCCAGTGTACTTCA und TAACGCGTTGTGATCTCCTTCTGA; und/oderAATCGTCAATGCCAGTGTACTTCA and TAACGCGTTGTGATCTCCTTCTGA; and or
AAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCC und CCAACTGCTGCTGAGGTAGAAATC; und/oderAAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCC and CCAACTGCTGCTGAGGTAGAAATC; and or
TCTCCCCGTGAACGATGACTGGTC und TGAAGACAGACACCCCAACAGAGG.TCTCCCCGTGAACGATGACTGGTC and TGAAGACAGACACCCCAACAGAGG.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß als interne Kontrolle die mRNS des Proteins ß-Aktin bestimmt wird.35. The method according to any one of claims 22 to 34, characterized in that the mRNA of the protein ß-actin is determined as an internal control.
36. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß die mRNS für ß-Aktin in cDNS revers transkribiert und ein Abschnitt der cDNS mittels Polymerasekettenreaktion vervielfältigt wird.36. The method according to the preceding claim, characterized in that the mRNA for β-actin is reverse transcribed in cDNA and a section of the cDNA is reproduced by means of the polymerase chain reaction.
37. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS des ß-Aktin ein Oligonukleotid-Paar verwendet wird, wobei die Oligonukleotide des Paares die folgenden Sequenzen aufweisen: CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT und ACAGGACTCCATGCCCAGGAAGGA.37. The method according to the preceding claim, characterized in that an oligonucleotide pair is used to amplify the cDNA of the β-actin, the oligonucleotides of the pair having the following sequences: CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT and ACAGGACTCCATGCCCAGGAAGGA.
38. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz38. The method according to the preceding claim, characterized in that the oligonucleotide with the sequence
CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT mit dem Fluorophor 4, 7, 2 ' , 4 ' , 5 ' , 7 ' -Hexachloro-β- Carboxyfluorescein markiert ist.CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT is labeled with the fluorophore 4, 7, 2 ', 4', 5 ', 7' -hexachloro-β-carboxyfluorescein.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß der vervielfältigte cDNS-Abschnitt durch geeignete Restriktionsenzyme verdaut und anhand der erzeugten cDNS- Bruchstücke das Vorhandensein oder Fehlen der mRNS eines Tu ormarkerproteins bestimmt wird.39. The method according to any one of claims 33 to 38, characterized in that the duplicated cDNA section is digested by suitable restriction enzymes and the presence or absence of the mRNA of a tumor marker protein is determined on the basis of the cDNA fragments generated.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS- bschnitte eine Gelelektrophorese der PCR-Produkte durchgeführt wird.40. The method according to any one of claims 33 to 38, characterized in that a gel electrophoresis of the PCR products is carried out to detect the amplified cDNA sections.
41.' Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS-Abschnitte eine Fragmentanalyse durchgeführt wird. 41. ' Method according to one of claims 33 to 38, characterized in that a fragment analysis is carried out to detect the amplified cDNA sections.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß während des Verlaufs der Polymerasekettenreaktion die von den Produk- ten erzeugte Fluoreszenz erfaßt und die Produktentwicklung erfaßt wird (fluoreszenzbasierte Echtzeit-PCR) .42. The method according to any one of claims 33 to 38, characterized in that during the course of the polymerase chain reaction, the fluorescence generated by the products is detected and the product development is detected (fluorescence-based real-time PCR).
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der mRNS oder cDNS ein Nukleotid-Mikroarray nach einem der Ansprüche 20 oder 21 verwendet wird.43. The method according to any one of claims 23 to 38, characterized in that a nucleotide microarray according to one of claims 20 or 21 is used to detect the mRNA or cDNA.
44. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS das PCR-Produkt auf ein Nukleotid-Mikroarray nach einem der Ansprüche 20 oder 21 aufgetragen wird.44. The method according to the preceding claim, characterized in that, for the detection of the amplified cDNA, the PCR product is applied to a nucleotide microarray according to one of claims 20 or 21.
45. Verwendung eines Diagnose-Kits, eines Mikroarrays und/oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Diagnose von Erkrankungen oder Metastasierung oder zur Behandlungskontrolle bei Hodentumor. 45. Use of a diagnostic kit, a microarray and / or a method according to any one of the preceding claims for the diagnosis of diseases or metastasis or for treatment control in testicular tumor.
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