WO2003022881A2 - Phänotyp bestimmende virulenzgene von pseudomonas aeruginosa zur kolonisation und persistenz in mensch, tier und pflanze, verwendungen der gene und zugehörigen proteine - Google Patents

Phänotyp bestimmende virulenzgene von pseudomonas aeruginosa zur kolonisation und persistenz in mensch, tier und pflanze, verwendungen der gene und zugehörigen proteine Download PDF

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Claudia Kiewitz
Karen Larbig
Margit Ritzka
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the invention relates to newly identified sequences of the microorganism Pseudomonas aeruginosa, uses of these new and known sequences of the above. Microorganism and associated antibodies and vaccines.
  • the genus Pseudomonas contains rod-shaped, polar flagellated, gram-negative bacteria.
  • the taxonomic classification is based on L5 based on the 16S rRNA sequences.
  • P.aeruginosa is characterized by the production of various dyes that have given the bacterium its name.
  • P.aeruginosa makes very little demands on the habitat and is able to adapt to a wide range by selectively regulating its gene expression
  • the phenotype of the bacteria can vary between a mucoid and a non-mucoid variant, depending on the habitat requirements.
  • the bacterium In its non-mucous form, the bacterium is flagellated and has a diverse .0 surface, so that it can open up new habitats.
  • Mucous P.aeruginosa are unscathed and differ in many phenotypic features from the mobile variant. The most striking difference is the strong production of alginate. Presumably this glycocalyx becomes the stable one Adhesion of the bacteria to surfaces is imparted, thus securing the colony's hold against water currents or cilia movements of a populated epithelium. Furthermore, phagocytosis is made more difficult and the absorption of nutrients is facilitated (BOTZENHARDT & D ⁇ RING 1993; COSTERTON ET AL. 1987)
  • P.aeruginosa only affects people when their immune system is generally or locally weakened.
  • the most affected patient groups are premature babies and immunosuppressed people, as well as people suffering from diseases such as cystic fibrosis (CF), severe burns or malignancies.
  • CF cystic fibrosis
  • Due to its adaptability, its high antibiotic resistance and its low nutritional requirements, P.aeruginosa is also found in hospitals, where according to data from the National Nosocomial Infections Surveillance System (USA) it is one of the main causative agents of nosocomial diseases with a share of 10.1% (BRAVENY, KRUMP-SCHMIDT 1985; POLLAK 1985; HORAN 1986).
  • P.aeruginosa During tissue colonization and invasion into epithelial cells, P.aeruginosa produces a variety of virulence determinants. These include two toxic proteins, exotoxin A and exoenzyme S, which trigger cell death after being absorbed into eukaryotic cells.
  • Various proteases elastase, alkaline protease, LasA fragment
  • P.aeruginosa also secretes heat-stable cytotoxins with detergent-like properties, so-called rhamnolipids, which due to their chemical structure can neither be decomposed by host proteases nor induce an immune response.
  • Much of the expression of the pathogenicity factors of P.aeruginosa is regulated in a growth-dependent manner using quorum sensing (DEKIEVIT & IGLEWSKI 2000; STOREY ET AL. 1998).
  • the aim of an immunization must be an immune response that the bacteria cannot escape by changing their surface proteins, as they do, for example, in the formation of a biofilm or in the lungs of cystic fibrosis patients. If this is possible, the vaccination strategy would not make sense, since it would not lead to the elimination of the bacteria, but only to a selection of a certain group of bacteria.
  • bacteria are organisms that adapt to given environmental stimuli. The development of vaccines against bacteria is therefore very difficult, since it cannot be reliably demonstrated without a function prediction whether a special surface protein is indispensable for an infection or not.
  • the invention is based on the knowledge that different genes, which are very different from one another, are involved in the virulence potential of the Pseudomonas aeruginosa microorganisms via their gene products and are independent, but partially complementary and potentiating virulence factors.
  • Genes found within the scope of this invention partly have completely different functions and are also located at completely different locations in the genome of the microorganism. Their impact on virulence was unpredictable. On off- switch "one or more of these genes affects the virulence up to the complete harmlessness of the microorganism.
  • the invention therefore includes:
  • PA1441, PA1572, PA1992, PA2591, PA3344, PA4621, PA5040, PA5349 and / or PA5415 of the microorganism Pseudomonas aeruginosa designated according to the nomenclature of the Pseudomonas aeruginosa Community Anno-
  • Nucleic acid sequences according to Seq. ID 1, 2 or 3, or the respective associated Pseudomonas aeruginosa-e gene proteins which are all essential for the survivability of the microorganism in humans or animals, as targets for the development of diagnostics for identifying the virulence of a PseU-LO domonas aeruginosa strain , for the development of therapeutic agents against
  • PA1104 L5 and / or PA1452 can also be used.
  • Proteins which can be used also include proteins or protein fragments of the proteins and homologous variants which are homologous to these, in particular those with deletion, insertion or exchange of individual and / or several amino acids,
  • PA3344, PA4621, PA5040, PA5349 and PA5415 of the microorganism Pseudomonas aeruginosa designated according to the nomenclature of the Pseudomonas aeruginosa Community Annotation Project, or the nucleic acid sequences according to Seq. ID 1, 2 or 3 encoded protein or at least one functional fragment
  • one of the aforementioned proteins are directed for use in determining the virulence of Pseudomonas aeruginosa siamese. 5.
  • Vaccine containing at least one of the nucleic acid sequences PA0740, PA1104, PA1288, PA1322, PA1441, PA1452, PA1572, PA1992, PA2591, PA3344, PA4621, PA5040, PA5349 and PA5415 of the microorganism Pseudomonas aeruginosa, designated according to the nomenclature of Pseudomonas pseudomonas pseudomonas Community Annotation Project, or the nucleic acid sequences according to Seq. ID 1, 2 or 3 encoded protein or at least one functional fragment of one of the aforementioned proteins, or at least one fusion protein based on the protein or functional part of the protein and
  • L5 ID 1, 2 or 3 in modified modification readable in mammalian cells and in
  • the genes with the associated promoter can be ligated into a plasmid. Furthermore, customary additives and
  • adjuvants and in particular at least one adjuvant can be contained in the vaccine.
  • Seq. ID 1 Seq. ID 2 and Seq. ID 3 is the following newly identified gene sequences:
  • This DNA sequence is crucial for both intracellular survival and quorum sensing of P. aeruginosa. This sequence is not present in all but in most pathogenic P. aeruginosa isolates. Destruction of this sequence or of the gene product encoded by it leads to the quorum sensing being switched off and thus to a reduction in
  • This ORF codes for a protein that is essential for the function of the quorum sensor.
  • D8A6 The transposon insertion in D8A6 prevented the production and release of homoserine lactones (the messenger molecules of the quorum sensing). It is therefore no longer possible to express a pathogenic phenotype.
  • the high level of conservation of the proteins encoded by the D8A6 homologous sequences allows regulation of the expression of pathogenicity factors across species boundaries.
  • D8A6 / CB31 is one of the sequences necessary for stable co-colonization in the lungs of a CF patient (here between P. aeruginosa and Burkholderia cepacia). These stable, multiple colonizations very often lead to a rapid and fatal deterioration in the health of the affected patients.
  • PA1441 gene can be replaced or combined for the purposes of the invention with the use of the PA1452 and / or PA1104 genes, since these genes interact in their function (see PA1441).
  • P.aeruginosa mutants were examined for their survivability in neutrophilic granulocytes.
  • the genes identified are for P.aeruginosa is essential to survive contact with these cells. Bacteria that lack these genes can therefore be more easily killed by a cellular immune response.
  • some of the striking P.aeruginosa mutants also showed an increased sensitivity to the complement system of the blood serum.
  • Virulence is classified in the context of this invention in the following way:
  • these proteins can also serve as markers for an assessment of the pathogenic potential of a P. aeruginosa.
  • the genes according to the invention were identified with the aid of transposon mutagenesis. First, a mutant library was created and it was determined whether the respective mutants were still virulent or not.
  • transposon mutagenesis a transposon is introduced into a cell using a suitable vector system and integrated into the genome.
  • the genomic DNA sequence is cut with a single-strand overhang by means of a transposase and the transposon is integrated with smooth ends.
  • a DNA polymerase fills the resulting gaps so that the DNA sequence is duplicated to the left and right of the transposon insertion.
  • the insertion is sequence-independent with a sequence duplication of 9-12 bp. The insertion takes place in one
  • a gene is switched off and marked at the same time. If a phenotypic change occurs as a result of this loss, the mutant in question can be selected.
  • the surrounding DNA region can be sequenced on the basis of the known transposon sequence.
  • a mini Tn5 derivative in the vector pTnMod-OGm was used for irreversible transposon mutagenesis (DENNIS & ZYLSTRA 1998).
  • the origin of replication oriR PMB1 lies in the mini-transposon, so that after the genomic insertion, the remaining plasmid can no longer be replicated with the transposase.
  • pTnMod-OGm shown in Fig. 1.
  • a gene switched off in this way is responsible for the expression of a particular phenotype, this can be done by comparing the original strain and the transposon mutant in a suitable differentiation approach. If the parent strain can survive a certain selection condition but the mutant cannot, the gene that is switched off is essential for survival under these selected conditions.
  • the screening of the mutants can be facilitated using various known methods developed for this. These include the signature-tagged mutagenesis (STM) method, the "in vivo expression technology (IVET) and methods using DNA chip technology
  • the STM method is described in, for example
  • Hensel M Shea JE, Gleeson C, Jones MD, Dalton E, Holden DW. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection. (1995) Hensel M. Whole genome scan for habitat-specific genes by signature-tagged 25 mutagenesis. (1998)
  • EMT In Vivo expression technology
  • the use of DNA chip technology requires that the genome of the organism to be examined is completely sequenced. Under this condition, it is possible to construct a DNA chip on which the sequences of all putative ORFs are fixed. If this organism becomes the
  • an expression profile of the entire genome can be created under the selected growth conditions by hybridization with the DNA chip.
  • the respective promoter region of the identified gene was sequentially overlapped on both DNA strands. If additional sequence variants were found in the DNA sequence of the gene hit, which caused an amino acid exchange of the encoded protein, the gene was used
  • sequence variants contains the respective amino acid substitutions in the protein (the first letter stands for the PAO sequence, the second for the one found in P.aeruginosa TB) " * " Means that the gene was not fully sequenced due to its length. Further sequence variants in the DNA sequence of this gene are therefore possible. The number in brackets indicates the number of non-coding nucleotide substitutions, the specification after the abbreviation "P "stands for the mutations in the promotor area.
  • Viability in AB serum divided by viability in granulocytes. The value indicates by how much the corresponding transposon mutant survived better in the AB serum than phagocytized in granulocytes. P.aeruginosa - mutants whose intracellular survival is impaired thus receive values that are significantly greater than one. Bacteria that are serum sensitive, in
  • Quorum Sensing Enhances further properties Enhanced protease secretion
  • Lactonase function previously thought to be: ß-lactamase
  • PA0740 All genes in the vicinity of PA0740 are encoded on the other strand of DNA. PA0740 itself has a typical promoter and terminator structure. Cis effects can therefore be excluded.
  • PA0740 is not a ß-lactamase, but a homoserine lactonase, which is necessary for P aeruginosa to cultivate the homoserine lactones that occur when switching to the stationary growth phase. (A substrate from the class of ⁇ -lactams could not be found for PA0740.) If one takes into account the homology to the ⁇ -lactamases, whose function lies in the cleavage of the ring system of the ⁇ -lactam antibiotics, it can be assumed that PA0740 is a homoserine lactonase which catalyzes a first step in the degradation of the homoserine lactones by cleavage of their ring structure. Switching off this gene results in a significant increase in the concentration of homoserine lactones in the medium and thus an increased reaction of the bacteria to this signal, e.g. a significantly increased secretion of proteases.
  • Length: 1275 bp 425 ace.
  • the main stress that phagocytosed bacteria in granulocytes are exposed to is oxidative.
  • a corresponding transposon mutant 14C5 was spread on LB agar with different concentrations of hydrogen peroxide and incubated at 37 ° C. for 16 hours. The stress exerted on the bacteria therefore did not last over the entire incubation period, but only worked initially for a relatively short time. If the P.aeruginosa were not killed in this initial phase, they could subsequently grow undisturbed.
  • FadL transports long-chain fatty acids through the outer cell membrane.
  • a second enzyme fatty acid acyl-CoA synthetase (FACS)
  • FACS fatty acid acyl-CoA synthetase
  • FadL determines the specificity of the recording, FACS makes the recording process irreversible (DiRusso CC, BLACK PN.1999).
  • the structure of FadL corresponds to a ⁇ -barrel made of 20 antiparallel strands, the 5 amino acid sequence of which determine the specificity of the channel thus formed. FadL is primarily expressed during the stationary growth phase of E. coli.
  • FadL Bacteria in which FadL was switched off through mutation, show only a slight change in the protein composition in the transition from the logarithmic to stationary phase and survive only for a short time with limited-L o nutrients (FAREWELL A et al. 1996).
  • OmpP1 is a protein in the outer cell membrane of Haemophilus influenzae. (BOLDUC GR 2000). There are different variants of this L5 protein in H. influenzae. The protein is expressed during infection of a host organism and its expression is not downregulated even in the case of a specific immune response against its external epitopes. In principle, OmpP1 is suitable for immunization against H. influenzae.
  • PA1288 codes for a protein whose structure corresponds to that of a ⁇ -barrel.
  • the specificity of the channel formed in this way remains unknown, presumably the recognized substrate is hydrophobic (aliphatic or aromatic).
  • the orthologic genes described in the literature it can be assumed that the corresponding substrate within the bacterium is activated and metabolized with coenzyme A (e.g. ⁇ -oxidation).
  • FadL transports long-chain fatty acids in E.coli through the outer cell membrane. With external stress (high growth density or incubation at 42 ° C) the expression of this gene is significantly increased. Switching off fadL means that the bacteria can no longer switch from logarithmic growth to the stationary phase. Hunger phases are also poorly survived by these mutants. In Haemophilus influenzae an appropriate orthologic gene is necessary for the infection.
  • the knockout of PA1288 could thus block the synthesis of AHL in P. aeruginosa.
  • the transposon mutants were no longer able to respond appropriately to various types of external stress: intracellularly in granulocytes, the bacteria could not survive the oxidative stress, and when examining quorum sensing, increased production of homoserine lactones was the appropriate response to stress due to high growth density, no longer observable. This is comparable to the reaction of E.coli to switching off fadL
  • the switch to the conditions of the stationary phase also upregulates mechanisms to ward off external stress.
  • bacteria from this growth phase were transferred to the granulocytes. If the transposon mutants with an insertion in PA1288 did not change to the conditions of the stationary phase, which is indicated by the low production of pyoverdin and homoserine lactones, they were opposite Stress much more susceptible and could not survive in the granulocytes. This coincides with the finding that P.aeruginosa has much stronger defense mechanisms against a host's immune response in the stationary phase than in its logarithmic growth phase.
  • TonB is a secreted protein that binds iron from the surrounding medium with high affinity and delivers P.aeruginosa. If TonB is switched off in P.aeruginosa PAO, pyoverdin and pyochelin are no longer produced. In contrast to the wild type, P.aeruginosa PAO mutants with a defect in tonB are no longer able to lethally damage or even survive immunosuppressed mice. TonB-dependent iron absorption is therefore essential for P.aeruginosa to infect a host (TAKASE H ET AL. 2000)
  • Length 1284 bp 427 ace.
  • PA1452 flhA
  • PA1104 flil
  • flagella The structure of flagella was examined in detail using the example of S.typhimurium and E.coli. The genes necessary for the synthesis of the flagella are then arranged in three large neighboring operons. The next operon is only read after all proteins that are encoded in an operon have been completely synthesized and incorporated into the resulting flagellum according to their function.
  • fliK is the last gene of the second operon, with which the basal plate of the flagellum is completely built.
  • FliK has at least two functions in S.typhimurium. On the one hand, it specifies the specificity of the central channel of the basal plate and regulates whether proteins for the hook of the flagellum or the flagellin itself are exported (MACNAB 1992).
  • operon structure can also be found in P.aeruginosa.
  • the last gene of the second operon ⁇ fliK) is separated from the rest of the operon by an insertion of 372 kBp, which now ends with fliJ.
  • fliK itself lies directly in front of the 3rd operon for flagell synthesis, but is separated from it by a clear termination loop.
  • Flil and FlhA together with FliK are necessary components of the flagella export system.
  • FlhA is a structural component, while Flil enables the export of the respective proteins while using ATP (MINAMINO, MACNAB, 1999).
  • ATP MINAMINO, MACNAB, 1999.
  • the location of FliK, Flil and FlhA in the flagellum is shown in Fig. 2.
  • Figure 2 shows the secretion system of P aeruginosa. The affected genes are marked in dark gray in the figure. All three genes addressed here are necessary for the secretion of pathogenicity factors by the flagellum. All have been shown to be necessary for the intracellular survival of P aeruginosa.
  • the flagellins of fixed bacteria P.aeruginosa TB ⁇ , P.aeruginosa PA1441- knock out and E.coli DH5 ⁇ or DH5a with a specific anti-flagellin - Antibodies (against flagellin type b) detected.
  • FlhA mutants have no flagella, flil mutants have functional flagella in principle, but these are not firmly integrated in the membrane and are quickly lost together with the connected export system.
  • PA1441 is essential for the motility of P.aeruginosa. In contrast to E.coli and S.typhimurium, however, a shortened flagellum continues to build up when the gene is switched off. In P.aeruginosa, fliK is separated from the rest of the second operon for flagella synthesis by a large insertion. The decrease in intracellular survivability of P. aeruginosa by switching off genes PA1104, PA1441 and PA1452 suggests that the flagella export system is essential for the survival of the bacteria in phagocytes.
  • Quorum Sensing reduced production from Autoinducem further properties: reduced protease secretion
  • Length 1146 bp 382 ace.
  • Length 1694 bp 565 aces. Influence on neighboring genes
  • PA1992 is the last gene of a possible polycistronic gene cassette. This closes without a termination loop, but the genes on the opposite strand are encoded on the following 8 kB. An ice effect of transposon insertion is therefore unlikely.
  • PA1976 is a bit longer, but has some very homologous areas.
  • the second paralogic gene is PA3271. Both genes are functionally classified as 2-component sensors. No further information on the function of PA1992 or flhS is available in the databases.
  • the mutant 14B2 mostly showed a survival rate that was clearly above that of the average.
  • the results of the invasiveness tests with epithelial cells were particularly striking (Section 3.5.1.).
  • the transposon mutant showed a significantly higher adherence and a 10-20 times higher invasiveness in epithelial cells than the wild type.
  • PA1992 is a histidine kinase. This structural motif indicates a function as a regulator in a signal cascade. Switching off the PA1992 gene increased the adherence and invasiveness in epithelial cells by at least a factor of 10. The genomic environment does not allow for an ice effect. The phenotypic changes are therefore directly attributable to the switching off of the PA1992 gene.
  • PA2591 There is a possible termination loop behind PA2591. However, this structure is not particularly pronounced.
  • PA2590 and PA2589 both hypothetical ORFs may therefore also be transcribed by the RNA polymerase.
  • the identified gene PA2591 belongs to the family of LuxR regulators, e.g. also Vfr, a well-known regulator of quorum sensing. Heard of all gram negative bacteria whose quorum sensing has been studied so far
  • the function prediction obtained from the PAO database is: DNA replication, recombination, modification and repair further investigations
  • PA4621 There is no termination structure behind PA4621.
  • PA4620 (4-hydroxybenzoyl-CoA reductase)
  • PA4619 membrane-bound alcohol dehydrogenase cytochrome c subunit
  • PA4618 unknown function
  • the mutant with an insertion in PA4621 was characterized by a defect in the quorum sensing and a reduced survivability in AB serum, which made it stand out in the selection experiments with granulocytes. The latter is due to an increased sensitivity to oxidative stress in the phagosomes.
  • the information in the databases about the switched-off gene does not contain any information about a possible substrate or further test results for the encoded protein.
  • pilQ Function Possible oxidoreductase Structural features / homologies: Necessary to build up type IV
  • Influence on neighboring genes pilQ is the last gene of the polycistronic gene cassette pilMNOPQ. Immediately afterwards, other genes are encoded without obvious termination structures, which have a function in amino acid metabolism (aromatic amino acids) or in heme synthesis.
  • the mutant transposon in which the transposon was inserted into the pilQ gene (PA1322), has a significantly increased serum stability.
  • PilQ is a
  • the high survival rate of pilQ transposon mutants is primarily due to increased resistance to blood serum.
  • the genes for amino acid or heme synthesis that may be read together with pilQ from RNA polymerases have no decisive influence on the serum stability of bacteria. The observed changes in the phenotype are therefore due to the lack of the corresponding gene product. Switching off PilQ seems to compensate for an increased production of
  • PA5349 code for various enzymes of carbon catabolism.
  • PA5350 and PA5351 for two rubredoxin ORFs the gene following PA5349 (PA5348) codes for a possible DNA-binding protein, which (in the databases) is assigned a function in DNA replication, modification, recombination or repair , All of these genes (from PA5355 to 5347) are presumably read in one go by the RNA polymerase. Further information
  • Rubredoxin reductase is a flavoprotein oxidoreductase. It works together with rubredoxin and thus oxidizes aliphatic hydrocarbons with oxygen to the corresponding carboxylic acid, which can then be further metabolized by other enzymes. However, rubredoxin reductase also has another function: In some anaerobic bacteria, it also acts as a protection against oxidative stress (LUMPPIO HL ET AL., 2001). Rubredoxin and rubredoxin reductase can also be an important protection against oxidative stress in bacteria with an aerobic metabolism. So you can e.g. replace the superoxide dismutase in E.coli (PIANZZOLA MJ ET AL. 1996).
  • the mutant was also checked for its sensitivity to peroxides with a transposon insertion in PA5349. This mutant was also characterized by a significantly reduced resistance to oxidative stress.
  • the transposon mutant with an insertion in PA5349 showed a significantly reduced survivability in the incubation with granulocytes. Similar to other mutants with a defect in the helicase, this can be directly attributed to a reduced resistance to oxidative stress based on the results of the incubation on peroxide-containing medium. It is known that in P.aeruginosa resistance to hydrogen peroxide in the stationary phase involves at least two superoxide dismutases and one catalase (HASSETT DJ ET AL. 1999). Rubredoxin reductase, which is functionally very similar, could also be classified in this category. The detoxification of Oxygen is of crucial importance for P.aeruginosa.
  • the failure of one of the detoxification mechanisms may be the reason why the phagocytosed mutants with a defect in PA5349 can no longer survive intracellularly in granulocytes. Furthermore, the mutant produced no homoserine lactones when inserted in PA5349.
  • the rubredoxin reductase is presumably necessary in order to oxidize aliphatic hydrophobic compounds in such a way that they can be processed in the fatty acid metabolism.
  • the failure of this enzyme could influence the synthesis of aliphatic homoserine lactones, since no or only a few aliphatic side chains for AHL synthesis are present in the mutants due to the knockout (see also PA1288) PA5415 Phenotypic properties
  • Quorum Sensing no production of short-chain AHL, only very little production of long-chain AHL. further properties: protease secretion not switched off
  • PA5415 there are at least 4 different options behind PA5415 to form termination structures. It is possible that these are protein binding sites through which the transcription and translation of the following genes (sarcosine oxidase and proteins of the C metabolism) can be regulated.
  • S-adenosylmethionine is not only an internal reservoir for C1 metabolism, but also for the production of homoserine lactones. Switching off the serine hydroxymethyltransferase may lead to a reduction in the concentration of available S-adenosylmethionine and thus to a lack of homoserine to build up the autoinducers.
  • Seq. ID 1 S-adenosylmethionine is not only an internal reservoir for C1 metabolism, but also for the production of homoserine lactones. Switching off the serine hydroxymethyltransferase may lead to a reduction in the concentration of available S-adenosylmethionine and thus to a lack of homoserine to build up the autoinducers.
  • the unknown sequence is not clone-specific DNA from P.aeruginosa TB, since it also occurs in two isolates of clone C (P.aeruginosa SG17M and CSGB8).
  • a transposon insertion in this area which does not exist in P.aeruginosa PAO, completely switched off the quorum sensing of P.aeruginosa TB. This means that the quorum sensing in these bacteria is sometimes regulated differently.
  • the unknown DNA sequence at least in a subpopulation of P.aeruginosa - encodes additional decisive factors for the expression of the quorum sensing, which are not found in studies of the genetic reference strain PAO.
  • Seq. ID 1 Summary As with Seq. ID 1 is also this unknown sequence not a clone-specific DNA of P.aeruginosa TB, since it also occurs in other isolates. A transposon insertion in this area, which does not exist in P.aeruginosa PAO, completely switched off the quorum sensing of P.aeruginosa TB. This is a further indication that the quorum sensing of P.aeruginosa TB - and possibly also of other P.aeruginosa isolates - is regulated by additional factors that are unknown from the studies in PAO. Seq. ID 3
  • Seq. ID 3 shows an 80% identity at nucleotide level to Seq. ID 2, in contrast, represents the sequence of the complete gene. This is an example from a gene family that is present in more than 60% of all P. aeruginosa isolates and in many other gram-negative bacteria, but is missing in the sequenced strain PAO. The members of this gene family have a similarity of approx. 80% to each other at the nucleotide level, and usually much higher at the protein level.
  • the inventors examined more than 1000 transposon mutants for their intracellular survivability in granulocytes. Those P.aeruginosa mutants with the clearest phenotypic deviations were collected and examined again. The most striking of the bacteria thus confirmed in their phenotypic deviation was more precisely differentiated and quantified, to what extent the measured low survival rates can be attributed to low survivability in granulocytes and what proportion a sensitivity to blood serum has to the measured effect. Furthermore, the identified transposon mutants were examined for their invasiveness in epithelial cells. It was shown that the intracellular survivability in granulocytes and the invasiveness of a bacterium in epithelial cells are phenotypic properties that are not related to each other. The sequencing of the flanking DNA regions of the genomically inserted transposons showed that in most P.aeruginosa TB transposon mutants which had not survived the selection experiment, genes which also occur in the P.aeruginosa PAO genome were switched off.
  • mutant transposons whose sensitivity to blood serum was changed, the cause appears to be a modification in the composition of the extracellular matrix or the structure of the outer cell membrane.
  • the reasons for the reduced survivability in granulocytes can be traced back to defects in the defense against oxidative stress or the repair of oxidative damage to the DNA.
  • genes of the flagella export system were found, the switching off of which on the one hand interfered with the flagellar build-up, but on the other hand also greatly reduced the intracellular survivability in granulocytes and the invasiveness in epithelial cells. This is due to the dual function of this export system. In addition to its function for the orderly building of flagella, it is also required for the secretion of pathogenicity factors that enable P. aeruginosa to survive intracellularly.
  • the functionality of the quorum sensing was investigated by incubating the P.aeruginosa transposon mutants with an E. coli detector strain.
  • the latter carried a plasmid on which a luciferase was coded behind a promoter to which an RNA polymerase could only bind in the presence of homoserine lactones.
  • each individual mutant was examined separately in microtiter plates.
  • the identified transposon mutants with a clear defect in the production of long and short chain aliphatic homoserine lactones (AHL) were found on two newly developed selection media investigated their protease activity. As was to be expected, there was a clear connection between the production of AHL and the secretion of proteases.
  • a protein which has structural similarities to a ⁇ -lactamase and whose inactivation increases the amount of free homoserine lactones in the stationary growth phase and thus has the function of a homoserine lactonase.
  • transposon insertions were found in two further DNA sequences which are not known from the sequencing of P.aeruginosa PAO, but which are not clone-specific DNA of the TB strain, but were also found in other P. aeruginosa isolates. With one exception, all of the genes found had not previously been assigned to quorum sensing. This indicates that the existing regulatory model for the production of AHL is very incomplete.
  • DH5 F, ⁇ 80, m80 / acZ ⁇ M1S, A (lacYZA-argF) w ⁇ , recA1, endA1, hsdRU
  • HB101 P, leuB6, proA2, recA13, thi-1, ara-14, lacY1, galK2, xyl-5, mtl-1,
  • Pseudomonas aeruginosa TB serotype: 4
  • Phage lysotype F8, M4, PS2, PS24, PS31, 352, 46b / 2, 1214, Col21, F7, F10, PS21, PS73 A plasmid could not be detected.
  • the vector pTnMod-OGm was first described by DENNIS & ZYLSTRA (1998). It is a so-called plasposon with a mini-Th ⁇ (with a 30 gentamicin resistance) and an or / TRP4 for conjugative transfer. During the transposition, the transposase remains on the plasmid. In addition, the transposed sequence in pTnMod-OGm also includes the origin of replication of the plasmid. This means that the residual plasmid can no longer be replicated after transposition and is therefore lost. The replication used Origin oriR pMB1 can also be stably expressed in most E. coli strains, but not in P.aeruginosa.
  • Another advantage of this vector lies in the fact that a renewed mobilization of the flanking areas of the inserted mini-transposon is possible as a plasmid (plasmid rescue).
  • the plasmid is therefore suitable for generating mutants with specific signal sequences.
  • pRK2013 pRK2013 is a so-called helper plasmid. It codes for all genes that are necessary for conjugation (tra and mob). It can be used to mobilize other plasmids that have an RP4 oriT, even if the donor strain itself does not have the genes necessary for conjugation (FIGURSKI D & HELINSKI D 1979).
  • the most widely used culture medium for growing bacteria was Luria-Bertiani- (LB-)
  • LB agar with an appropriate antibiotic additive served as a storable culture or for selection.
  • a mobilizable plasmid is transferred from a donor strain which is itself not capable of conjugation to an acceptor strain with the aid of a helper strain which has the genes necessary for conjugation. It is only important here that the acceptor does not have a functioning restriction system.
  • P.aeruginosa TB was incubated for 5-7 days on blood agar at 42 ° C and inoculated daily.
  • Donor strain E.coli DH5 ⁇ (with pTnMod-OGm) and helper strain E.coli HB101 (with pRK2013) were streaked on the day before the conjugation on LB agar with appropriate antibiotic addition.
  • the bacteria were resuspended in 10 mM MgSO 4 and adjusted to a density of 1.0 OD. Suspensions of donor, helper and acceptor were mixed in a ratio of 10: 10: 1 and plated on an LB agar plate. After incubation at 37 ° C for several hours, the bacteria were resuspended and aliquots were plated onto M9 (glycerol) agar plates with gentamicin added. Positive transposon mutants were transferred to a new M9 (glycerol) agar plate with gentamicin after about 2 days of incubation (37 ° C.).
  • the plates were stored at 4 ° C for about 1 month before the P.aeruginosa mutants were subjected to further experiments or were frozen at -80 ° C. This storage was necessary in order to separate the transferred E. coli, which hardly grow with the carbon source glycerol, but can still survive, from the P.aeruginosa mutants. The E.coli were unable to survive such a long period of hunger.
  • P. aeruginosa genomic DNA was prepared using a method specially developed for Gram-negative bacteria (CHEN & Kuo 1993). The DNA processed in this way was used as a template in PCR or for the production of Southern blots. Investigation of the P.aeruginosa transposon mutants phagocytosis test
  • the generated P.aeruginosa TB - transposon mutants were tested for their intra-intranulocytic survivability.
  • granulocytes were freshly prepared from blood and incubated with P.aeruginosa transposon mutants.
  • the granulocytes were separated from the extracellular bacteria by washing and filtering and then lysed, so that the fraction of the intracellular, viable P. aeruginosa became available for further analyzes.
  • FIG. 3 shows the scheme of the selection method for determining the intracellular survivability in granulocytes of P.aeruginosa TB transposon mutants.
  • a control batch started in parallel, the bacteria grew without external selection 2 -10 8 bacteria in RPMI 1640. After the incubation period, the extracellular bacteria were separated from the intracellular bacteria by repeated washing, centrifuging and filtering. The granulocytes were lysed and the genomic DNA was prepared from the surviving bacteria after incubation on full medium for several hours. The DNA was prepared accordingly from an aliquot of the control batch.
  • the principle of the test method is to incubate the P.aeruginosa mutants together with an E. coli detector strain which has an episomally encoded luciferase which is only expressed in the presence of aliphatic homoserine lactones.
  • the transposon mutants were inoculated in microtiter plates and incubated at 37 ° C.
  • the detector strain carrying the sensor plasmid was in LB + Tetracy- clin up to a density of OD 0.3 - 0.4 and an equal volume of it was added to each P.aeruginosa transposon mutant.
  • the striking mutants found in this study were then checked again in a second experiment on LB agar (1) together with the detector stem as a cross.
  • the first steps for the quantitative determination of the invasiveness of P.aeruginosa strains are similar to those in the chapter above.
  • the treatment of the bacteria and epithelial cells corresponds to the above. Protocol.
  • the epithelial cells were incubated with a 100-fold excess of bacteria for a time to be determined experimentally.
  • the epithelial cells were washed three times with RPMI1640 to separate the bacteria in the supernatant and for 120 Incubated min with RPMI1640 +100 ⁇ g / ml polymyxin B (37 ° C, 5% CO 2 ) to kill the adherent extracellular bacteria.
  • the cells were then washed twice again with RPMI1640 and incubated with saponin solution (50 mg / ml) for 5-10 min to release the intracellular bacteria. Aliquots of this lysate and their dilutions were streaked on LB agar, incubated overnight at 37 ° C. and the number of live bacteria was determined.
  • the flagellin was detected in accordance with the Tropix protocol, which can generally be used for immunological detections.
  • a rabbit AK against flagellin type b (Montie T, Univ. Tennessee, Knoxville) was used as the primary antibody.
  • P.aeruginosa from a culture incubated overnight at 37 ° C. were killed by adding formaldehyde (final concentration 1%) and on a Fixed mica matrix.
  • the staining was done with 5 mM uranyl acetate (pH 7.0), which acted on the bacteria for 5 min. After washing twice with dist.
  • the preparation was dried with water and fixed on a copper support. (The electron microscopic examination was carried out at the GBF by Dr. M. Rohde)
  • the P.aeruginosa transposon mutants were inoculated separately in microtiter plates from frozen glycerol cultures and incubated at 37 ° C. overnight. 48 transposon mutants each with different signal sequences were combined and examined for their survivability in granulocytes in a phagocytosis test. Each group of 48 mutants was subjected to two independent experiments.
  • the bacteria selected and unselected samples were resuspended in 10 mM MgSO 4 and exposed to the selection conditions a second time. (The controls were accordingly only suspended in RPMI1640.) The bacteria spread on LB agar were incubated at 37 ° C. overnight. Only after this second selection was the genomic DNA of the surviving bacteria isolated.
  • the signal sequences of the transposons were then amplified from these DNA solutions using PCR.
  • the signal sequences thus obtained were digested with Hind ⁇ restriction and the specific 40 bp sequences were purified by gel filtration (Sephadex G-100).
  • the purified 40 bp sequences were analyzed using a
  • the signal sequences of the donor plasmids were amplified by means of PCR and fixed on membranes as dot blots.
  • the 3 'end-marked signal sequences from the phagocytosis test were hybridized to these prepared blots at 65 ° C. (16 h).
  • the frequency of the individual signal sequences was determined by a light reaction.
  • the X-ray films obtained were scanned and the blackening (od / mm 2 ) of the individual dots. The results were evaluated in MS Excel.
  • Plasmid rescue is a procedure to convert the flanking DNA of an inserted plasposon into episomally stable plasmids.
  • the genomic DNA of a transposon mutant was digested with a restriction endonuclease and the resulting fragments were converted into ring structures in a self-ligation. Only the genomic sequence in which the plasposon was integrated had an origin of replication and an antibiotic cassette and could be stably expressed on an appropriate selection medium after transformation into E. coli. These plasmids were then used to sequence the flanking genomic DNA sections of the inserted transposon.
  • the genomic P.aeruginosa DNA was digested with Pst ⁇ or ⁇ c / l / SamHI and the DNA was purified by phenol / chloroform extraction with subsequent ethanol precipitation.
  • the digested genomic DNA was incubated with T4 ligase.
  • the ligation batches were concentrated in a vacuum concentrator and transformed into E. coli.
  • the flanking DNA sequence of the transposon insertion was determined from the plasmids obtained in this way by sequencing.
  • HASSETT D., MA, J.F., ELKINS, J.G., Mc DERMOTT, T.R., OCHSNER, U.A., WEST, 5 S.E., HUANG, CT., FREDERICKS, J., BURNETT, S., STEWART, P.S., MCFETERS,

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Abstract

Es werden Gene des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa beschrieben, deren ausschalten eine Beeinträchtigung der Virulenz bis hin zur völligen Unschadlichmachung des Mirkoorganismus bewirkt. Die als virulenzbestimmend erkannten Gene werden als Targents für die Entwicklung von Arzneimitteln und Impfstoffen zur Blockierung oder Ausschaltung dieser Gene oder der zugehörigen Genprodukte in vivo, sowie für die Entwicklung von Diagnostika vorgeschlagen.

Description

Phänotyp bestimmende Virulenzgene von Pseudomonas aeruginosa zur Kolonisation und Persistenz in Mensch, Tier und Pflanze, Verwendungen der Gene und zugehörigen Proteine
5 Die Erfindung betrifft neu identifizierte Sequenzen des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa, Verwendungen dieser neuen und bekannten Sequenzen des o.g. Mikroorganismus sowie zugehörige Antikörper und Vakzine.
In der Gattung Pseudomonas sind stäbchenförmige, polar begeißelte, gram- L O negative Bakterien zusammengefaßt. Bei der Art Pseudomonas aeruginosa (aerugo, lat. = Grünspan) handelt es sich um Bakterien der Länge 1 ,5 - 3 μm und des Durchmessers 0,5 - 0,8 μm, die der Gruppe der γ-Proteobakterien zugeordnet werden und um einen relativ häufig vorkommenden, gut untersuchten und vollständig sequenzierten Mikroorganismus. Die taxonomische Einteilung erfolgt auf L5 der Grundlage der 16S- rRNA Sequenzen. P.aeruginosa zeichnet sich durch die Produktion verschiedener Farbstoffe aus, die zu der Namensgebung des Bakteriums geführt haben.
P.aeruginosa stellt nur sehr geringe Anforderungen an den Lebensraum und ist .0 durch selektive Regulation seiner Genexpression in der Lage, sich an ein breites
Spektrum unterschiedlicher Umweltbedingungen anzupassen. Er wurde sogar in fast reinem Wasser (>71 kΩ und in einigen Desinfektionsmitteln nachgewiesen.
Diese große Anpassungsfähigkeit macht P.aeruginosa zu einem fast ubiquitären und teilweise gefährlichen Keim, der nur gegen Austrocknung sehr empfindlich ist. 25 Durch selektive Regulation der Genexpression kann der Phänotyp der Bakterien je nach Anforderungen des Habitates zwischen einer mukoiden und einer nicht- mukoiden Variante variieren.
In der nicht- mukösen Form ist das Bakterium begeißelt und mit einer vielfältigen .0 Oberfläche ausgestattet, so daß es neue Lebensräume erschließen kann. Muköse P.aeruginosa sind unbegeißelt und unterscheiden sich in vielen phänotypischen Merkmalen von der beweglichen Variante. Der auffälligste Unterschied ist dabei die starke Produktion an Alginat. Vermutlich wird durch diese Glykokalyx die stabile Anheftung der Bakterien an Oberflächen vermittelt und so der Halt der Kolonie gegen Gewässerströmungen oder Zilienbewegungen eines besiedelten Epithels gesichert. Weiterhin wird eine Phagozytose erschwert und die Nährstoffaufnahme erleichtert (BOTZENHARDT & DÖRING 1993; COSTERTON ET AL. 1987)
Genetische Untersuchungen haben gezeigt, daß die zu einer Stoffwechselkette gehörenden Gene in P.aeruginosa PAO meistens nicht in einer polycistronischen Genkassette liegen, von einem gemeinsamen Promotor reguliert und, wie z.B. bei Escherichia coli, als eine mRNA transkribiert werden, sondern trotz einer gemeinsamen Regulation an verschiedenen Stellen des Genoms kodiert sind. Die Untersuchung des PAO- Genoms zeigte eine schon von P.putida bekannte Zweiteilung: Essentielle und anabole Gene liegen meistens in der Nähe des Replikationsursprungs, katabole und nicht- essentielle zumeist in der anderen Hälfte. Diese Aufteilung ist vermutlich auf die Integration neuer genetischer Elemente, z.B. Plasmide, in ein ehemals kleineres Genom zurückzuführen. Im Jahre 2000 wurde die gesamte genomische Sequenz von P.aeruginosa PAO veröffentlicht und ist jetzt für weitere in silico- Untersuchungen zugänglich (www.pseudomonas.com).
Es besteht eine große genetische Ähnlichkeit von Stämmen aus sehr unterschiedlichen Habitaten, die entweder über eine evolutionär sehr junge Radiation oder eine im Prinzip vom Lebensraum unabhängig konservierte Genomorganisation zu erklären ist. Bei Untersuchung von Isolaten aus P.aeruginosa - infizierten CF- Patienten ließ sich neben einer Akquisition aus der Umwelt oft eine nosokomiale Infektion innerhalb einer Klinik oder eine Ansteckung von ebenfalls erkrankten Angehörigen nachweisen
P.aeruginosa befällt allerdings Menschen erst dann, wenn deren Immunsystem allgemein oder lokal geschwächt ist. Frühgeborene und Immunsupprimierte sowie Personen, die an Erkrankungen wie Zystische Fibröse (CF), schweren Verbrennungen oder Malignomen leiden, sind die am meisten befallenen Patientengruppen. Aufgrund seiner Anpassungsfähigkeit, seiner hohen Antibiotikaresistenz und seinen geringen Nährstoffanforderungen ist P.aeruginosa auch in Krankenhäusern zu finden, wo er nach Daten des National Nosocomial Infections Surveillance System (USA) mit einem Anteil von 10,1% einer der hauptsächlichen Erreger nosokomialer Erkrankungen ist (BRAVENY , KRUMP- SCHMIDT 1985; POLLAK 1985; HORAN 1986).
Während der Besiedelung des Gewebes und der Invasion in Epithelzellen produziert P.aeruginosa eine Vielzahl von Virulenzdeterminanten. Dazu gehören unter anderem zwei toxische Proteine, Exotoxin A und Exoenzym S, die nach Aufnahme in eukaryontische Zellen deren Zelltod auslösen. Verschiedene Proteasen (Elastase, alkalische Protease, LasA- Fragment) zerstören lokal die Gewebsstruktur im Wirt und hydrolysieren Immunglobuline, Komponenten des Komplementsystems und Rezeptoren der immunkompetenten Zellen. Zusätzlich sezerniert P.aeruginosa auch hitzestabile Cytotoxine mit Detergenz- ähnlichen Eigenschaften, sog. Rhamnolipide, die aufgrund ihrer chemischen Struktur weder von Proteasen des Wirtes zersetzt werden können noch eine Immunantwort induzieren. Ein Großteil der Expression der Pathogenitätsfaktoren von , P.aeruginosa wird wachstumsabhängig über das Quorum Sensing reguliert (DEKIEVIT & IGLEWSKI 2000; STOREY ET AL. 1998).
Im Gegensatz zu der oben beschriebenen akuten Infektion bleibt der chronische Pseudomonas- Befall bei CF- Patienten auf die Lunge beschränkt, ist dort aber ein entscheidender Faktor für den Krankheitsverlauf. Durch Alginat und Mucin können schließlich ganze Bereiche der Lunge verschlossen werden, wodurch es in den so entstehenden Atelektasen zu einem irreversiblen Umbau des Lungengewebes kommt. Die für Respiration zur Verfügung stehende Fläche wird dadurch zunehmend kleiner und die Patienen sterben an einer pulmonalen Insuffizienz (PIER 1985; H0IBY 1986).
Es besteht daher ein großes Bedürfnis, Therapeutika und Impfstoffe gegen pathogene Pseudomonas aeruginosa-Stämme zu gewinnen, sowie Diagnostika, mit denen die Pathogenität im Einzelnen festgestellt werden kann. Ziel einer Immunisierung muss eine Immunantwort sein, der die Bakterien nicht durch Veränderung ihrer Oberflächenproteine, wie sie es z.B. bei der Ausbildung eines Biofilms oder in der Lunge von Mukoviszidose-Patienten tun, entkommen können. Ist dies nämlich möglich, wäre die Impfstrategie nicht sinnvoll, da sie nicht 5 zur Eliminierung der Bakterien, sondern nur zu einer Selektion einer bestimmten Bakteriengruppe führen würde.
Für eine erfolgreiche Impfung muss daher sichergestellt sein, dass die in den Organismus eindringenden Pathogene auf das entsprechende Oberflächenprotein nicht
.0 einfach verzichten können, oder es während eines Teils ihres Entwicklungszyklus gar nicht exprimieren. Dieses Problem wurde bei den bisherigen Impfstoffen gegen Bakterien nicht immer zur völligen Zufriedenheit gelöst. Während die meisten Viren nicht zu starken Veränderungen in ihrer Proteinzusammensetzung fähig sind und Impfungen gegen eines oder mehrere ihrer Oberflächenproteine fast immer zu ei-
L5 nem ausreichenden Impfschutz führen, sind Bakterien Organismen, die sich an gegebene Umweltreize anpassen. Die Entwicklung von Impfstoffen gegen Bakterien ist daher sehr schwierig, da ohne Funktionsvorhersage nicht sicher nachweisbar ist, ob ein spezielles Oberflächenprotein für eine Infektion unverzichtbar ist oder nicht.
20 Eine Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, Mittel zur Verfügung zu stellen, um
Pseudomonas aeruginosa - Stämme hinsichtlich ihrer Virulenzfaktoren zu klassifizieren und in ihrem Gefahrenpotential beeinflussen zu können. Spezieller besteht die Aufgabe darin, eine Strategie gegen Pseudomonas aeruginosa Infektionen zu entwickeln und mögliche Targets für die Impfstoff-, Therapeutika- und Diagnostika- 25 Entwicklung zu finden.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass verschiedene untereinander sehr unterschiedliche Gene über ihre Genprodukte am Virulenzpotential der Pseudomonas aeruginosa Mikroorganismen beteiligt sind und voneinander unabhängige, sich 0 jedoch teilweise ergänzende und potenzierende Virulenzfaktoren darstellen. Die im
Rahmen dieser Erfindung gefundenen Gene haben zum Teil völlig unterschiedliche Funktionen und sind auch an völlig verschiedenen Stellen im Genom des Mikroorganismus lokalisiert. Ihr Einfluss auf die Virulenz war nicht voraussehbar. Ein „Aus- schalten" eines oder mehrerer dieser Gene bewirkt eine Beeinträchtigung der Virulenz bis hin zur völligen Unschädlichmachung des Mikroorganismus.
Die Lösung der Aufgabe dieser Erfindung umfasst:
5
- das Auffinden neuer virulenzbestimmender Gene in Pseudomonas aeruginosa;
- die Verwendung neuer und bekannter Gene, die als virulenzbestimmend erkannt wurden, als Targets für die Entwicklung von Arzneimitteln und Impfstoffen zur
.0 Blockierung oder Ausschaltung dieser Gene oder der zugehörigen Genprodukte in vivo, sowie für die Entwicklung von Diagnostika;
- die Verwendung der virulenzbestimmenden Gene für die Diagnostik virulenter Pseudomonas aeruginosa - Stämme.
L5
Im einzelnen umfasst die Erfindung daher:
1. Isolierte oder rekombinante Nukleinsäuren gemäß den Sequenzen zu Seq. ID 1 ,
20 Seq. ID 2 und Seq. ID 3 oder hierzu degenerierte oder modifizierte homologe
Sequenzen mit entsprechender Funktion, wobei die Modifikationen insbesondere Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren umfassen, insbesondere Punktmutationen, Verkürzungen, Verlängerungen und dergleichen, soweit diese die Funktion insgesamt bezüglich der Überlebensfähigkeit 5 des Mikroorganismus nicht wesentlich beeinträchtigen ;
2. Proteine, welche kodiert werden durch eine der vorgenannten Sequenzen oder hierzu homologe, im wesentlichen funktionsgleiche Proteine oder Peptide, insbesondere solche mit durch Deletion, Insertion oder Austausch einzelner 0 und/oder mehrerer Aminosäuren, sequenzverlängerndes Anfügen von einzelnen und/oder mehreren Aminosäuren und/oder chemischer Derivatisierung insbesondere der terminalen Aminosäuren verbundener Sequenz-Modifikation. 3. Verwendung der Nukleinsäuren oder Nukleotidsequenzen PA0740, PA1288, PA1322. PA1441 , PA1572, PA1992, PA2591 , PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und/oder PA5415 des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa Community Anno-
5 tation Project (s. "www.pseudomonas.com"), und/oder der Nukleinsäuren oder
Nukleinsäuresequenzen nach Seq. ID 1 , 2 oder 3, oder der jeweils zugehörigen Pseudomonas aeruginosa-e genen Proteine, die sämtlich für die Überlebensfähigkeit des Mikroorganismus in Mensch oder Tier wesentlich sind, als Targets für die Entwicklung von Diagnostika zur Identifizierung der Virulenz eines Pseu- LO domonas aeruginosa Stammes, für die Entwicklung von Therapeutika gegen
Pseudomonas aeruginosa Stämme sowie für die Entwicklung von Impfstoffen gegen Pseudomonas aeruginosa Stämme.
Anstelle von oder in Verbindung mit PA 1441 können auch die Sequenzen PA1104 L5 und/oder PA1452 verwendet werden.
Verwendbare Proteine umfassen auch zu diesen homologe Proteine oder Proteinbruchstücke der Proteine und homologen Varianten, insbesondere solche mit durch Deletion, Insertion oder Austausch einzelner und/oder mehrerer Aminosäuren, se-
20 quenzverlängerndes Anfügen von einzelnen und/oder mehreren Aminosäuren und/oder chemische Derivatisierung insbesondere der terminalen Aminosäuren verbundener Sequenz-Modifikation.
4. Antikörper, die gegen durch eines der Nukleinsäuresequenzen PA0740, 25 PA1104, PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992, PA2591 ,
PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und PA5415 des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa Community Annotation Project, oder der Nukleinsäuresequenzen gemäß Seq. ID 1 , 2 oder 3 kodiertes Protein oder wenigstens ein funktionelles Fragment
30 eines der vorgenannten Proteine gerichtet sind, für die Verwendung bei der Bestimmung der Virulenz von Pseudomonas aeruginosa-Siämmen. 5. Vakzine, enthaltend wenigstens ein durch eine der Nukleinsäuresequenzen PA0740, PA1104, PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992, PA2591 , PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und PA5415 des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas 5 aeruginosa Community Annotation Project, oder der Nukleinsäuresequenzen gemäß Seq. ID 1 , 2 oder 3 kodiertes Protein oder wenigstens ein funktionelles Fragment eines der vorgenannten Proteine, oder wenigstens ein auf dem Protein oder funktionellen Teil des Proteins basierendes Fusionsprotein sowie
LO Vakzine, enthaltend wenigstens eine der Nukleinsäuren gemäß Sequenzen
PA0740, PA1104, PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992, PA2591 , PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und PA5415 des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa Community Annotation Project, oder der Nukleinsäuren gemäß Seq.
L5 ID 1 , 2 oder 3, in modifizierter, in Säugetierzellen ablesbarer Modifikation und in
Zuordnung zu einem in Säugetierzellen ablesbaren Promotor.
In Weiterbildung der Erfindung können die Gene mit dem zugehörigen Promotor in ein Plasmid ligiert vorliegen. Weiterhin können vorzugsweise übliche Zusatz- und
20 Hilfsstoffe sowie insbesondere wenigstens ein Adjuvans in dem Impfstoff enthalten sein.
Bei den Sequenzen Seq. ID 1 , Seq. ID 2 und Seq. ID 3 handelt es sich um folgende neu identifizierte Gensequenzen:
25
Seq. ID 1
DNA- Sequenz:
30 CTGCAGGGCTACGCTGAGGGAGTTGTAGAGGAGGCCGATGACAACACCCTGC
GCATCCGGCTAGCCCATGGCCTTCGAGTCAAAGAAGCGTCTCCCGCCGCCGA TGACGTGGCCGACGTTCCGCGTACGCCGGGGGTTAAGAAGCCTTCGATACGT CTGCTCGGGCTGCTCCAGCTGCTGTGGTTAGAGGCTGGACTGGCCAACTGGT ACCCACTGATGGAAGGCAAGCGAACGCCCGCGAATGTTGCCTATTGGGTATCT 35 GAAGCCGCAAAGCGTATCCGGGCCAGCCGAATGACGGTGTTCGACGTCTTGC TGATGTCGGCCAAGAAGAACTCCCGCATGGCGAAGCGCAATGCTGAGGTCGT GGAGCTGGCGCAGGAGCATTCGCGCAGGCTCATTGCGGTGTCGCCGCTGGC
GTCCTTCAACTCGGAACGACGCAATCTCTTGACGCTTTCTGTCTCGGGACCCTT
CGGGATGCCGACGATGGACATTCGAGCGGA
5 Dieses DNA- Sequenz ist sowohl für das intrazelluläre Überleben als auch für das Quorum Sensing von P. aeruginosa von entscheidender Bedeutung. Diese Sequenz ist nicht in allen, aber in den meisten pathogenen Isolaten von P. aeruginosa vorhanden. Eine Zerstörung dieser Sequenz oder des davon kodierten Genprodukts führt zu einem Ausschalten des Quorum Sensings und so zu einer Verringerung der
L O Pathogenität
Seq. ID 2
L5 DNA- Sequenz:
TGCAGGATCTGGGTCAGGTTGTCGATCAGGTTCTGGGTCAGCGAATTCAGAGC TCTCATTCGTCCTGGCACTCCACTGCCGGTTGGTCTGGGAAATTAATTGGGAA GGGCGGCAGGCCGCGCGCCTTGTCGAGATCCGCTGCGACCTGCAAGGCCGC 20 CTCGAGCTCGTCGCAGCCGGTGGCTTGCATGATGTTGTAGCGCTGGTTCTTTT CTTCGTTTTCGGTCATGGCCAGGGCCAGGTAGAGACTCGGGGGAACCACACG GAAGAGGTACTCCTTGCCCTTGGCCAGGAGCACGCCCTCGGTGAATTTGCCG CTTTCCTTGCGGGCCGAGAGCATCATCGACTTCTGCGCCGGCGACAGCTCGC GGAACCTGGAGATCTTCTCTACCTCGTCTGGGGGCATGTTCAGGCACAACCAC
25 CACTCGATCATGTTCAGCATCGGCGCCCCGGAGGCTGGGATGTCGTCGATGTT
CTGGGTGGCGAGCCAGAACCAGGCGCCCAGTTTCCGCCACATCTTGGTGATC TTCATGGCGTAGGGCAGCAGCAGCGGGTGCTTGGTGATGATGTGTCCCTCATC GGTGATCTTGACGATGGGCCGGCCCTTGAATTGGTCGCGTTCGGCGATGTTGT TTACGGTGTTCAGCAGCGAGATGTAGGCGATCCCGAGCTGGGCGGCGTAGCC
30 TTCGCGCGCGTAAGTCGCGAAATCCACCACGGTGAGGTCGGCTTCAGGCCAG
GGCGTGCCTTTGCGATTGAACATCTCGCC
Seq. ID 3 5 DNA- Sequenz:
ATGCGTTGGAAACTCCCCTGGCCGAAGCTGGCCGCACCGAAGCTGGCCGCGT CCGGCGCTGGCGATGACGAGCAGCCGGACGGCTGGCAGCGCCACGTCGAGG CACTGCACCAGGCCGGCATCCCCGAACCCGGCACGGCGGTGCAAGGTCACA 0 GGCCGGCGACCATGGCAGACGAGCAGACGCTGTATGAGGTCGCGCCGTCGTT CGTGGAACTACTGCCCTGGGTGGAGTTCCTGCCGCAGTCGAAGGCCATGTTG CTGGAGGACGGGCAATCGGTGGCGGCCTTTTACGAGCTGGTGCCGCTGGGCA CCGAAGGCCGGGAACCCGGCTGGCTCGCGCAGGCCCGCGATGCCTTGGAGA ACGCGCTGCAGGACAGTTTCGATGAACTGGACGAAACTCCCTGGGTGTTGCAG CTCTACGCCCAGGACGAGCCCAGTTTTGACCAGTACATGCAGACCCTGCGCGA CTATGTGCAGCCGCGCGCCCGTGATACAGCGTTCAGCGAGTTCTACCTGCGCT TCTTCGGCCACCACCTGCGCGCGGTGGCCAAGCCGGGCGGCCTGTTCGAGG ACACTGTGGTCACACGGCTGCGCTGGCGCGGCCAGACCCGGCGCGTGCGCA TGGTGGTCTACCGCCGCGTGACCGGGCAAGGGCAAAACAGCCGTCGCGGGC AGACGCCCGAGCAGATGCTCAATATCGTCTGCGACCGCCTGTGCGGCGGACT GGCGAACGCCGGCATTCAGGCCCGGCGCATGGTCGCGGCAGATGTTCATGAC TGGTTGCTGCGCTGGTTCAACCCGCGCCCCACGTTGCTCGGGCCTGGGGCCG AAGACCGGGAGCGCTTCTATACATTGGCGCGCTATCCCGACAGTGCGGAGGA AGGCGAGGACGGCGAGATCGAGCTGGCGAGCGGACGGGATTTCAGCCAACG GCTGTTCTTCGGCCAGCCGCGTTCCGACGTGGCGCACGGCACCTGGCATTTC GACGGCATGCCGCACCGCGTGCTGATCACCGACCGCCTGCGCATGCCGCCAG GCACGGGACACCTGACCGGCGAGACGCGCAAGGGCGACGCCATCAACACGTT GTTCGACCAGATGCCCGAGGACACCATCCTTTGCCTGACGCTGGTCGCCACG CCGCAGGATGTTCTCGAAGCGGATCTCAATCATCTGGCGAAGAAGGCCGTGG GCGAAACCCTGGCATCCGAGCAGACGCTCAAGGACGTGCATGAAGCCCGCTC CCTGATCGGCAGCGCGCACAAGCTCTATCGTGGCACGCTGGCGTTCTACCTG CGCGGGCGCGACGAGGCGGAACTGGATCGGCGCGGCCTCGACCTGGCGAAC GTCATGCTCAACGCCGGTTTGCAGCCGGTTCGCGAAGACGACGAGGTGGCAC CGCTGAACAGCTACTTGCGCTGGCTGCCGTGCTGCTACAACCCCGGCCAGGA TCGGCGCAAGTGGTACACCCAACTGATGTTCGCCCAGCACGCGGCGAACCTC TCGCCCGTGTGGGGCCGCGCCCAAGGTACGGGGCACCCCGGCATCACGATG
TTCAACCGCGGCGGCGGGCCGATCACCTTCGACCCGCTCAACCGCCTGGATC GGCAGATGAATGCCCACCTGTTTCTGTTCGGCCCGACAGGTTCAGGCAAGTCG GCGACCCTCAACAACCTCTTGAATCAGGTCACGGCGATCTACCGTCCCCGCCT GTTCATTGTCGAGGCCGGCAACAGCTTCGGCTTGTTCAGCGACTTTGCCCGGC GCCTGGGCCTGACCGTGAATCGGGTCAAGCTCGCTCCGGGCTCGGGCGTTAC
CCTGGCGCCGTTCGCGGATGCGCGCCGGCTGATCGAGACGCCCAGCGACGT GCAGACGCTCGACGCCGATGCGCTGGATGAAGACCTGCCTCCCGATGCTGTG GCCATGGAGGCAGATGAGCAGCGCGACGTACTGGGTGAACTGGAGATCACCG CGAGGCTGATGATCACCGGCGGCGAAGATAAAGAAGAAGCCCGGATGACGCG AGCCGACCGCTCACTGATCCGTCAGTGCATCCTCGATGCCGCCGAGCACTGC
CACAGCAAGGATGGCGAGAAGCGAACCGTTCTCACGCGCGATGTGCGCAACG CGCTGCGCACGCGCAGCCAGGACCCGACGCTGCCGGAAATGCGGCGTGTGC GACTGCTGGAGATGGCCGACGCCATGGACATGTTCTGCCAAGGCACGGACGG CGAAATGTTCGACCGCGACGGTTCGCCGTGGCCCGAAGCCGACATCACCCTG GTGGATCTGGCGACCTATGCCCGCGAAGGCTACAACGCGCAGCTCTCTATTGC
CTACATCAGCCTGATCAGCACGGTGAACAACATTGCCGAGCGCGATCAGTACC TGGGCCGCCCGATCATCAACGTCACCGACGAAGGACACATCATCACCAAGAAC CCGCTGCTCGCACCCTACGTGGTGAAGATCACCAAGATGTGGCGCAAGCTGG GGGCCTGGTTCTGGCTCGCCACACAAAACATCGACGACTTGCCGCGCGCTGC AGAGCCCATGCTCAACATGATCGAGTGGTGGATCTGCCTGTCGATGCCGCCC GATGAGGTGGAGAAGATCGCGCGGTTCCGCGAACTCTCGCCTGCGCAGAAGG CGCTGATGCTTTCCGCGCGCAAGGAAGCCGGGAAGTTCACCGAGGGCGTCAT CCTCTCCAAGAGCCTGGAAGTGCTGTTTCGGGCCGTGCCACCGAGCCTCTATC TCGCGCTCGCGCAGACGGAACCCGAGGAGAAGGCCGAGCGTTACCAGCTCAT GCAGCAACACGGCATCAGCGAACTCGATGCGGCCTTCAAAGTGGCCGAGAGA ATCGACCAGGCGCGCGGCATCAAGTCGCCAGCCGTGGGCCTGCCGCAATAG
Die mit D8A6 beschriebene Sequenz (Seq. ID 2) ist zu einem Teil des mit CB31 (Seq. ID 3) beschriebenen ORFs (open reading frame = der Teil eines Gens, der in ein Protein übersetzt wird) homolog. Dieser ist Teil einer bisher nicht beschriebenen hoch homologen Genfamilie, die in den meisten P. aeruginosa- Stämmen und weiteren gram- negativen Bakterien (weitere Pseudomonas- Arten wie P. syringae, P. fluorescens und Gattungen wie Ralstonia, Burkholderia) im gleichen Habitat vor- kommt. Dieser ORF kodiert für ein Protein, das für die Funktion des Quorum Sen- sing essentiell ist. Durch die Transposoninsertion in D8A6 wurde die Produktion und Freisetzung von Homoserinlactonen (die Botenmoleküle des Quorum Sensings) unterbunden. Eine Ausprägung eines pathogenen Phänotyps ist daher nicht mehr möglich. Zusätzlich erlaubt die hohe Konservierung der von den D8A6- homologen Sequenzen codierten Proteine eine Regulation der Expression von Pathogenitäts- faktoren über die Speziesgrenzen hinweg. Somit ist z.B. D8A6/CB31 eine der notwendigen Sequenzen, damit stabile Co- Kolonisierungen in der Lunge eines CF- Patienten (hier zwischen P. aeruginosa und Burkholderia cepacia) möglich sind. Diese stabilen Mehrfach- Besiedelungen führen sehr oft zu einer schnellen und fa- talen Verschlechterung des Gesundheitszustandes der betroffenen Patienten.
Durch einen Eingriff in diese Regulationskette (durch Therapie oder Impfung) ist eine deutliche Verbesserung des Krankheitsbildes von Co- kolonisierten Patienten zu erwarten. In der Diagnostik bieten sich diese Gene an, um somit festzustellen, ob ein pathogener P aeruginosa in der Lage ist, im Patienten eine stabile Coexistenz mit anderen Bakterien aufzubauen, was seine Gefährlichkeit erhöhen würde.
Die Verwendung des Gens PA1441 kann für die erfindungsgemäßen Zwecke er- setzt oder kombiniert werden mit der Verwendung der Gene PA1452 und/oder PA1104, da diese Gene in ihrer Funktion zusammenwirken (s. PA1441 ).
Im Rahmen der Erfindung wurden P.aeruginosa- Mutanten auf ihre Überlebensfähigkeit in neutrophilen Granulozyten untersucht. Die identifizierten Gene sind für P.aeruginosa unbedingt erforderlich, um den Kontakt mit diesen Zellen zu überleben. Bakterien, denen diese Gene also fehlen, können daher leichter durch eine zelluläre Immunantwort abgetötet werden. Zusätzlich wiesen einige der auffälligen P.aeruginosa-Mutanten auch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Kom- 5 plementsystem des Blutserums auf.
Die Virulenz wird im Rahmen dieser Erfindung auf folgende Weise klassifiziert:
Zur Beurteilung wird das Quorum-Sensing und das Überleben solcher Pseudomo- .0 nas aerug/nosa-Mikroorganismen, bei denen ein Virulenzgen inaktiviert wurde, in Granulozyten herangezogen. Die Klassifizierung wird nachfolgend noch näher erläutert.
Durch Verwendung der hier gefundenen Virulenz-Gene, die für Oberflächenproteine
.5 kodieren, als Ziel einer Impfstrategie ist es nun möglich, für die Bakterien im geimpften Organismus eine Umgebung zu schaffen, an die sie sich nicht mehr anpassen können. Wenn sie ihre Oberflächenproteine behalten, sind sie von den Antikörpern angreifbar, verzichten die Bakterien dagegen auf sie, sind sie nicht länger in der Lage, sich gegen die neutrophilen Granulozyten zu verteidigen. o
Neben der Verwendung einiger Oberflächenproteine als Impfstoffe können diese Proteine auch als Marker für eine Abschätzung des pathogenen Potentials eines P.aeruginosa dienen. Zusätzlich sind für solche diagnostischen Untersuchungen auch intrazelluläre Proteine geeignet, die für die Pathogenität und Resistenz gegen-
25 über der Immunantwort eine hohe Bedeutung haben, selbst aber aufgrund ihrer Lage nicht für Antikörper zugänglich sind. Über Untersuchungen mit ELISA oder PCR, bei dem diese speziellen Gene adressiert werden, ist es möglich, Aussagen über das pathogene Verhalten eines Bakteriums zu machen (z.B. Resistenz gegen oxi- dativen Streß, Fähigkeit zum intrazellulären Überlegen, Ausbildung von Biofilmen, s o Motilität duch Flagellen oder Pili, Resistenzen gegen Antibiotika) und so z.B. die Antibiotikatherapie eines Patienten individuell auf die Fähigkeiten des ihn befallenen Bakteriums abzustimmen. Die hier identifizierten Gene stammen aus den Bereichen: Resistenz gegen oxidati- ven Streß, Fähigkeit zum intrazellulären Überleben, Ausbildung von Biofilmen und Motilität durch Flagellen oder Pili.
5 Genidentifizierung
Die Identifizierung der erfindungsgemäßen Gene erfolgte mit Hilfe der Transposon- mutagenese. Dabei wurde zunächst eine Mutanten-Bibliothek erstellt und festgestellt, ob die jeweiligen Mutanten noch virulent waren oder nicht.
L O
Für solche Mutanten, bei denen das Quorum sensing und/oder die intrazelluläre Persistenz modifiziert oder ausgeschaltet worden war, wurde eine Funktionsanalyse des jeweiligen Gens angeschlossen, soweit die Funktion nicht bekannt war.
L 5
Transposonmutagenese
Bei der Transposonmutagenese wird mit Hilfe eines geeigneten Vektorsystems ein Transposon in eine Zelle eingeführt und in das Genom integriert. Hierbei wird durch eine Transposase die genomische DNA- Sequenz mit einem Einzelstrang- 20 Überhang geschnitten und das Transposon mit glatten Enden integriert. Eine DNA- Polymerase füllt die entstandenen Lücken auf, so daß links und rechts der Transposoninsertion eine Duplikation der DNA- Sequenz stattfindet. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Transposon Tn5 erfolgt die Insertion sequenzunabhängig mit einer Sequenzduplikation von 9-12 Bp. Erfolgt die Insertion in einem
25 kodierenden Abschnitt, wird ein Gen ausgeschaltet und gleichzeitig markiert. Tritt durch diesen Verlust eine phänotypische Veränderung auf, so ist die betreffende Mutante selektierbar. Ausgehend von der bekannten Transposonsequenz kann eine Sequenzierung des umliegenden DNA- Bereichs erfolgen. Zur irreversiblen Transposonmutagenese wurde hier ein mini- Tn5- Derivat im Vek- o tor pTnMod-OGm verwendet (DENNIS & ZYLSTRA 1998). Bei pTnMod-OGm liegt der Replikationsursprung oriR PMB1 im mini- Transposon, so daß nach der genomischen Insertion das übrige Plasmid mit der Transposase nicht mehr replizierbar ist. pTnMod-OGm in Fig. 1 dargestellt.
Wird nun auf die vom Transposon vermittelte Resistenz selektiert, so werden alle Bakterien ohne Transposoninsertion abgetötet und nur die Mutanten können wachsen.
Soll überprüft werden, ob ein auf diese Weise ausgeschaltetes Gen für die Ausprägung eines bestimmten Phänotyps verantwortlich ist, kann dies durch den Vergleich von Originalstamm und Transposonmutante in einem geeigneten Differenzierungsansatz geschehen. Kann der Ausgangsstamm eine bestimmte Selektionsbedingung überleben, der Mutant dagegen nicht, so ist das ausgeschaltete Gen für das Überleben unter diesen ausgewählten Bedingungen essentiell.
.5
Das Screening der Mutanten kann mit Hilfe verschiedener hierfür entwickelter bekannter Verfahren erleichtert werden. Hierzu gehören u.a. das Signature-Tagged Mutagenese (STM)-Verfahren , die "in vivo Expressionstechnologie (IVET) und Verfahren unter Nutzung der DNA-Chiptechnologie
» 0
Das STM-Verfahren ist beispielsweise beschrieben in
Hensel M, Shea JE, Gleeson C, Jones MD, Dalton E, Holden DW. Simultaneous Identification ofbacterial virulence genes by negative selection. (1995) Hensel M. Whole genome scan for habitat-specific genes by signature-tagged 25 mutagenesis. (1998)
Chiang SL, Mekalanos JJ, Holden DW. In vivo genetic analysis ofbacterial virulence. (1999) Mecsas J. Use of signature-tagged mutagenesis in pathogenesis studies. (2002)
10 Die In Vivo Expressionstechnologie (IVET) ist ein Verfahren zur Identifikation aller Gene, die unter definierten Selektionsbedingungen verstärkt exprimiert werden (MAHAN ET AL. 1993; MAHAN ET AL. 1995; SLAUCH ET AL.1994;RAINEY ET AL.1997). Die Anwendung der DNA- Chiptechnologie setzt voraus, daß das Genom des zu untersuchenden Organismus vollständig sequenziert ist. Unter dieser Voraussetzung ist es möglich, einen DNA- Chip zu konstruieren, auf dem die Sequenzen aller putativen ORFs fixiert sind. Wird aus diesem Organismus die
5 gesamte mRNA gewonnen, mit Hilfe von Zufallssequenzen in cDNA- Fragmente umgeschrieben und entsprechend markiert, so kann durch Hybridisierung mit dem DNA- Chip ein Expressionsprofil des gesamten Genoms unter den gewählten Wachstumsbedingungen erstellt werden. Durch Vergleich der Expressionsprofile in verschiedenen Habitaten ist die Identifizierung aller Unterschiede im
.0 Expressionsmuster möglich (WEI ET AL. 2001).
Ergebnisse der Mutationsexperimente und Funktionszuweisung der ermittelten Gene
.5 Sequenzierungen
Die Sequenzierung der flankierenden Bereiche der mit Hilfe von Plasmiden eingeführten Transposoninsertionen wurde extern durchgeführt (industrielle Auftragssequenzierung). Die daraus erhaltenen Sequenzen wurden, mit BlastN auf Nukleotidebene und BlastX auf Proteinebene, auf ihr Vorkommen im bereits
20 sequenzierten PAO- Genom (www.pseudomonas.com) untersucht.
War die Sequenz bekannt, wurde der jeweilige Promotorbereich des identifizierten Gens auf beiden DNA- Strängen überlappend sequenziert. Wurden in der DNA- Sequenz des getroffenen Gens zusätzlich Sequenzvarianten gefunden, die einen Aminosäureaustausch des kodierten Proteins verursachten, wurde das Gen mit
25 PCR amplifiziert und erneut sequenziert (Qiagen). Nicht kodierende Sequenzvarianten wurden nicht weiter überprüft. Nur wenn die Ergebnisse aller Sequenzierungen übereinstimmten, wurde eine Nukleotidsubstitution als bestätigt akzeptiert.
J O Bei unbekannten Sequenzen wurde in der NCBI- Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov) mit BlastN und BlastX nach homologen Sequenzen gesucht. Die Ergebnisse der Sequenzierungen sollen hier nur kurz dargestellt werden. Die Sequenzen selbst sind -soweit nicht im PAO - Genom vorhanden- im Sequenzprotokoll dargestellt. Eine genaue Interpretation und Bewertung der Resultate erfolgt anschließend für jeden Transposonmutanten separat. Die angegebene Nummerierung der Gene, die Prozentangabe der Sequenzidentität und die Beschreibungen beziehen sich auf die Angaben in der PAO- Datenbank.
Figure imgf000017_0001
L 0
Tabelle 3.13. Liste der Sequenzierergebnisse. Die Spalte „Sequenzvarianten" enthält die jeweiligen Aminosäuresubstitutionen im Protein (der erste Buchstabe steht für die PAO- Sequenz, der zweite für die in P.aeruginosa TB gefundene). Ein „* " bedeutet, daß das Gen aufgrund seiner Länge nicht vollständig sequenziert wurde. Weitere Sequenzvarianten in der DNA-Sequenz dieses Gens sind daher möglich. Die Zahl in Klammern gibt die Anzahl der nichtkodierenden Nukleotidsub- stitutionen an, die Angabe hinter dem Kürzel „P" steht für die Mutationen im Pro- 5 motorbereich.
Bis auf drei unbekannte Sequenzen ohne Homologien in den Datenbanken sind alle anderen 14 DNA- Sequenzen der PAO- Sequenzierung bekannt. Die Sequenzidentität beträgt durchschnittlich 99,6%.
.0
Zur Identifizierung der vorliegenden Gene wurde eine große Anzahl von Transposonmutanten auf ihre Überlebensfähigkeit in einem bestimmten Habitat untersucht. Als Ergebnis erhält man die Information, welche Gene essentiell für das Überleben unter den gewählten Selektionsbedingungen sind.
L5 Im folgenden sind die sequenzierten Transposonmutanten mit den jeweiligen Ergebnissen der in vitro- und in silico- Untersuchungen aufgelistet. Im Einzelfall wurden auf der Grundlage dieser Daten weitere Untersuchungen zur phänotypischen Charakterisierung der Mutanten durchgeführt. Diese Resultate sind ebenfalls vermerkt. Die phänotypischen Eigenschaften des jeweiligen Mutanten
20 werden näher beschrieben. Abschließend werden die vorhandenen Informationen zu jedem Transposonmutanten zusammenfassend diskutiert. Bei der Auflistung der phänotypischen Eigenschaften ist bei den Transposonmutanten, deren intrazelluläres Überleben in Granulozyten quantitativ bestimmt wurde, ein Quotient QAB aufgeführt. Dies ist der Quotient aus der
25 Überlebensfähigkeit in AB- Serum geteilt durch die Überlebensfähigkeit in Granulozyten. Der Wert gibt an, um wieviel der entsprechende Transposonmutant im AB- Serum besser überlebte als phagozytiert in Granulozyten. P.aeruginosa - Mutanten, deren intrazelluläres Überleben beeinträchtigt ist, erhalten somit Werte, die deutlich größer als Eins sind. Bakterien, die dagegen serumsensitiv sind, in
30 Granulozyten aber weiterhin gut persistieren können, weisen Werte kleiner/gleich Eins auf. PA0740
Phänotypische Eigenschaften
Quorum Sensing Verstärkt weitere Eigenschaften Verstärkte Proteasesekretion
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA0740
Bezeichnung yjcs
Funktion Lactonase, früher angenommen: ß- Lactamase
Strukturmerkmale / Homologien 62% Ähnlichkeit mit hypothetischem Protein YjcS aus E.coli Strukturmerkmale der Metallo- ß- Laktamase Superfamilie
Nukleotidsubstitutionen synonym: 452T - C; 545T - G; 551T - C; 893C - T; 908T - C; 950T
Länge 1977 Bp = 658 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
Alle Gene in der Umgebung von PA0740 werden auf dem anderen DNA- Strang kodiert. PA0740 selber hat eine typische Promotor- und Terminatorstruktur. Cis- Effekte sind somit auszuschließen.
weitere Untersuchungen
Eine Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) verschiedener ß- Lactam- Antibiotika zeigte keine gesteigerte Sensibilität des Transposonmutanten im Vergleich zum Wildtyp. Eine Untersuchung der Kulturüberstand zeigte, daß bei einem Mutanten mit einer Transposoninsertion in PA0740 die Homoserinlacton- Konzentration deutlich erhöht ist. Zusammenfassung
Bei PA0740 handelt es sich entgegen der Annotation im Genomprojekt nicht um eine ß- Lactamase, sondern um eine Homoserinlactonase, die für P aeruginosa notwendig ist, um die beim Umschalten in die stationäre Wachstumsphase anfallenden Homoserinlactone anzubauen. (Ein Substrat aus der Klasse der ß- Lactame konnte für PA0740 nicht gefunden werden.) Berücksichtigt man die Homologie zu den ß- Lactamasen, deren Funktion in der Spaltung des Ringsystems der ß- Lactamantibiotika liegt, so kann man vermuten, daß PA0740 eine Homoserinlactonase ist, die einen ersten Schritt im Abbau der Homoserinlactone durch Spaltung deren Ringstruktur katalysiert. Das Ausschalten dieses Gens hat einen deutlichen Anstieg der Konzentration an Homoserinlactonen im Medium und damit eine verstärkte Reaktion der Bakterien auf dieses Signal zur Folge, z.B. eine deutlich gesteigerte Sekretion von Proteasen.
PA1288
Phänotypische Eigenschaften
Überlebensfähigkeit in Granulozyten 0,07 in AB- Serum 0,8 Q AB 11
Quorum Sensing Ausgeschaltet weitere Eigenschaften keine Proteasesekretion, erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Peroxiden
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA1288 Funktion mögliches Transportprotein der äu ßeren Membran
Strukturmerkmale / Homologien 47% Ähnlichkeit zu fadL (Transporter für langkettige Fettsäuren in der äußeren Membran von E.coli) in der äußeren Membran von E.coli)
43% Ähnlichkeit zu ompP1 aus Haemophi- lus influenzae (möglicher Virulenzfaktor)
Nukleotidsubstitutionen synonym: 638C -T; 935C -T
Länge : 1275 Bp = 425 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
Hinter PA1288 befindet sich eine deutliche Terminationsschleife. Die nächsten drei Gene sind auf dem Gegenstrang kodiert. Ein direkter Einfluß der Transposoninsertion auf die umliegenden Gene ist daher sehr unwahrscheinlich.
weitere Untersuchungen
Der hauptsächliche Streß, dem die phagozytierten Bakterien in Granulozyten ausgesetzt sind, ist oxidativ. Zur Simulation dieser Bedingungen wurde ein entsprechender Transposonmutant 14C5 auf LB- Agar mit unterschiedlichen Konzentrationen an Wasserstoffperoxid ausgestrichen und bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Der auf die Bakterien ausgeübte Streß dauerte somit auch nicht über die ganze Inkubationszeit an, sondern wirkte nur initial für relativ kurze Zeit. Wurden die P.aeruginosa in dieser Anfangsphase nicht abgetötet, konnten sie anschließend unbehelligt wachsen.
Es ergab sich, daß die Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid bei den Transposonmutanten mit Insertionen in PA1288, PA3344, PA4621 und PA5349 im Vergleich zum Wildtyp deutlich eingeschränkt ist.
weitere Informationen
Zu PA1288 existieren im P.aeruginosa PAO - Genom zwei paraloge Gene (PA4589 und PA1764), die beide in der PAO- Datenbank als mögliche Membranproteine der äußeren Bakterienmembran geführt werden. Weitere Informationen waren in den Datenbanken nur zu fadL und ompP1 zu erhalten. fadL:
FadL transportiert langkettige Fettsäuren durch die äußere Zellmembran. Ein zweites Enzym (Fettsäure- Acyl- CoA Synthetase (FACS)) transportiert die Fettsäuren dann durch die innere Zellmembran und führt sie nach Aktivierung mit CoA der ß- Oxidation zu. FadL legt dabei die Spezifität der Aufnahme fest, FACS macht den Aufnahmeprozeß irreversibel (DiRusso CC, BLACK PN.1999). Die Struktur von FadL entspricht einem ß- Faß aus 20 antiparallelen Strängen, deren 5 Aminosäuresequenz die Spezifität des so gebildeten Kanals festlegen. FadL wird vor allem während der stationären Wachstumsphase von E.coli exprimiert. Bakterien, bei denen FadL durch Mutation ausgeschaltet wurde, zeigen nur eine geringe Veränderung in der Proteinzusammensetzung beim Übergang von der logarithmischen zur stationären Phase und überleben nur kurze Zeit bei limitiertem L o Nährstoffangebot (FAREWELL A ET AL. 1996).
ompPV.
OmpP1 ist ein Protein der äußeren Zellmembran von Haemophilus influenzae. (BOLDUC GR 2000). Es existieren in H. influenzae verschiedene Varianten dieses L5 Proteins. Während der Infektion eines Wirtsorganismus ist das Protein exprimiert und wird auch bei einer spezifischen Immunantwort gegen seine äußeren Epitope in seiner Expression nicht herunterreguliert. OmpP1 eignet sich daher prinzipiell zur Immunisierung gegen H. influenzae.
20 Zusammenfassung
PA1288 kodiert für ein Protein, daß von seiner Struktur her einem ß- Faß entspricht. Die Spezifität des so gebildeten Kanals bleibt unbekannt, vermutlich ist das erkannte Substrat hydrophob (aliphatisch oder aromatisch). Auf der Basis der in der Literatur beschriebenen orthologen Gene ist anzunehmen, daß das entsprechende 25 Substrat innerhalb des Bakteriums mit Coenzym A aktiviert und metabolisiert wird (z.B. ß- Oxidation).
Aus den durchgeführten Untersuchungen war bekannt, daß die Funktionsfähigkeit von PA1288 für die Produktion von aliphatischen Homoserinlactonen und das intrazelluläre Überleben in Granulozyten essentiell ist. Diese Beobachtungen
30 werden durch die in der Literatur beschriebenen Untersuchungsergebnisse in E.coli und H. influenzae bestätigt (s.o.). Die genaue Aufgabe dieses Proteins ist für P.aeruginosa nicht bekannt, das orthologe Protein FadL aus E.coli ist jedoch detailliert untersucht worden. In E.coli transportiert FadL langkettige Fettsäuren durch die äußere Zellmembran. Bei äußerem Streß (hohe Wachstumsdichte oder Inkubation bei 42°C) wird die Expression dieses Gens deutlich verstärkt. Ein Ausschalten von fadL führt dazu, daß die Bakterien nicht länger aus dem logarithmischen Wachstum in die stationäre Phase umschalten können. Ebenfalls werden Hungerphasen von diesen Mutanten nur schlecht überlebt. In Haemophilus influenzae ist ein entsprechendes orthologes Gen notwendig für die Infektion. Diese Befunde lassen den Schluß zu, daß auch in P.aeruginosa die Funktion des FadL- ähnlichen Proteins in irgendeiner Weise mit der Antwort auf äußere Streßfaktoren verbunden ist. Auf welche Weise PA1288 einen Einfluß auf die Produktion der Autoinducer oder die intrazelluläre Stabilität ausübt, kann nicht zweifelsfrei erklärt werden. Eine Hypothese wäre, daß PA1288 essentiell für die Aufnahme von langkettigen aliphatischen Verbindungen notwendig ist, die nach weiterer Prozessierung als Acyl- Seitenketten in der Produktion von aliphatischen Homoserinlactonen (AHL) notwendig sind. Dies würde auch erklären, warum das entsprechende Gen in E.coli in der stationären Phase hochreguliert wird. Unter diesen Bedingungen ist die Produktion an AHL am höchsten und somit auch der Bedarf an aliphatischen Verbindungen zum Aufbau der Seitenkette der Homoserinlactone. Der Knock-out von PA1288 könnte somit die Synthese von AHL in P.aeruginosa blockieren. Die Transposonmutanten waren nicht mehr in der Lage, auf verschiedene Arten von äußerem Streß angemessen zu reagieren: Intrazellulär in Granulozyten konnten die Bakterien den oxidativen Streß nicht überleben, und bei der Untersuchung des Quorum Sensing war eine verstärkte Produktion von Homoserinlactonen, die angemessene Reaktion auf Streß durch hohe Wachstumsdichte, nicht mehr zu beobachten. Dies ist vergleichbar mit der Reaktion von E.coli auf das Ausschalten von fadL
Im P.aeruginosa - Wildtyp werden durch die Umstellung auf die Bedingungen der stationären Phase ebenfalls Mechanismen zur Abwehr von äußerem Streß hochreguliert. Bei der Untersuchung der intrazellulären Überlebensfähigkeit wurden Bakterien aus dieser Wachstumsphase in die Granulozyten überführt. Fand in den Transposonmutanten mit einer Insertion in PA1288 aber keine Umstellung an die Bedingungen der stationären Phase statt, worauf die geringe Produktion an Pyoverdin und Homoserinlactonen hindeutet, so waren sie gegenüber äußerem Streß viel anfälliger und konnten so in den Granulozyten nicht überleben. Dies deckt sich mit dem Befund, daß P.aeruginosa in der stationären Phase viel stärkere Abwehrmechanismen gegen die Immunantwort eines Wirts hat als in seiner logarithmischen Wachstumsphase.
PA1322
Phänotypische Eigenschaften
Quorum Sensing Ausgeschaltet weitere Eigenschaften keine Proteasesekretion, erhöhte
Resistenz gegen Peroxid
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA1322
Bezeichnung pfuA
Funktion möglicher TonB- abhängiger Rezeptor
Strukturmerkmale / Homologien 44% Ähnlichkeit zu einem Fer- richrom- Eisenrezeptor (S.paratyphi) C-terminale TonB- Rezeptor- Kassette
Nukleotidsubstitutionen Synonym: 1559G-A; 1613G-A) Länge 2199 Bp = 732 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
Hinter pfuA liegt eine starke Terminationssequenz. Sogar bei der Sequenzierung traten in diesem Bereich große Probleme auf. Eine Auswirkung der Transposoninsertion auf die Transkription der nachfolgenden Gene ist somit auszuschließen.
weitere Untersuchungen
Eine Insertion in PA1322 führte zu einer erhöhten Resistenz gegenüber Peroxiden. weitere Informationen
TonB ist ein sezerniertes Protein, daß Eisen aus dem umgebenden Medium mit hoher Affinität bindet und P.aeruginosa zuführt. Wird TonB in P.aeruginosa PAO ausgeschaltet, so wird auch kein Pyoverdin und Pyochelin mehr produziert. Ebenfalls sind P.aeruginosa PAO- Mutanten mit einem Defekt in tonB im Gegensatz zum Wildtyp nicht mehr in der Lage, immunsupprimierte Mäuse letal zu schädigen oder auch nur zu überleben. Die TonB- abhängige Eisenaufnahme ist somit für P.aeruginosa essentiell, um einen Wirt zu infizieren (TAKASE H ET AL. 2000)
Zusammenfassung
In der aktuellen Literatur ist beschrieben, daß die Eisenaufnahme von P.aeruginosa über das Quorum Sensing reguliert wird. Bei dem hier gefundenen Transposonmutanten läuft die Regulation aber in der entgegengesetzten Richtung: Das Ausschalten eines TonB abhängigen Eisen- Rezeptors führt zum Ausschalten der Produktion von Homoserinlactonen. Ein solcher Regulationsmechanismus ist bisher in der Literatur nicht beschrieben. In anderem Zusammenhang wurde jedoch bei einer Inaktivierung von TonB gezeigt, daß dieser Mutant ebenfalls keine Pyoverdinproduktion mehr aufweist. Die Produktion dieser Siderophore ist aber direkt über das Quorum Sensing reguliert, so daß auch hier ein Zusammenhang zwischen der Eisenaufnahme und der Expression des Quorum Sensings nachgewiesen wurde. Die Ergebnisse der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit beweisen zweifelsfrei die Richtung der hier vorgefundenen Regulation, in der PfuA einen regulatorischen Einfluß auf das Quorum Sensing hat.
PA1441, (PA1452, PA1104) Phänotypische Eigenschaften
Überlebensfähigkeit : in Granulozyten 0,08 in AB- Serum 0,7 QAB 9 weitere Eigenschaften: In mikroskopischen Beobachtungen er scheint der Mutant unbeweglich, in Invasi vitätstests mit Epithelzellen zeigte er fast keine Invasivität. Auf elektronenmikroskopi sehen Aufnahmen sind verkürzte, strukturell veränderte Flagellen zu sehen.
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA1441 Funktion hypothetisches, unklassifiziertes
Protein
L O vermutlich Flagellenaufbau
Strukturmerkmale / Homologien 47% Ähnlichkeit mit fliK
(S.typhimurium)
Nukleotidsubstitutionen nicht-synonym: GCC GTC: A74V
GTC - GCC: V82A
L5 synonym: 164G - A; 776C - T
Promotor: -82C - G; -29G - A
Länge 1284 Bp = 427 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
20 An PA1441 schließt sich eine deutliche Terminationsstruktur an. Es ist daher nicht anzunehmen, daß andere Gene zusammen mit PA1441 transkribiert werden.
weitere Gene
Durch Ausschalten der Gene PA1452 (flhA) oder PA1104 (flil) konnten ebenfalls
25 Mutanten erzeugt werden, die eine verringerte Überlebensfähigkeit in Granulozyten aufweisen.
weitere Informationen
Der Aufbau von Flagellen wurde am Beispiel von S.typhimurium und E.coli detailliert 0 untersucht. Hiernach sind die zur Synthese der Flagellen notwendigen Gene in drei großen benachbarten Operons angeordnet. Erst nachdem alle Proteine, die in einem Operon kodiert sind, vollständig synthetisiert und entsprechend ihrer Funktion in das entstehende Flagellum eingebaut sind, wird das nächste Operon abgelesen. fliK ist dabei das letzte Gen des zweiten Operons, mit dem die Basalplatte des Flagellums vollständig aufgebaut ist. FliK hat dabei in S.typhimurium mindestens zwei Funktionen. Zum einen legt es die Spezifität des zentralen Kanals der Basalplatte fest und reguliert, ob Proteine für den Haken des Flagellums oder das Flagellin selber exportiert werden (MACNAB 1992). Zum anderen funktioniert es als Chaperon für die durch den Kanal geschleusten Proteine. Wird fliK in S.typhimurium ausgeschaltet, so sind die Mutanten unbeweglich und weisen entweder keine Flagellen auf oder haben anstelle korrekt zusammengesetzter Flagellen funktionslose verlängerte Flagellenhaken („Poly- Hooks"), die eine korkenzieherartige Struktur aufweisen.
Die o.g. Operonstruktur ist prinzipiell auch in P.aeruginosa zu finden. Allerdings ist das letzte Gen des zweiten Operons {fliK) durch eine Insertion von 372 kBp vom Rest des Operons getrennt, das nun mit fliJ endet. fliK selber liegt weiterhin direkt vor dem 3. Operon zur Flagellensynthese, wird von diesem aber durch eine deutliche Terminationsschleife getrennt.
Flil und FlhA bilden zusammen mit FliK notwendige Bestandteile des Flagellenexportsystems. FlhA ist dabei eine strukturelle Komponente, Flil ermöglicht unter ATP- Verbrauch den Export der jeweiligen Proteine (MINAMINO, MACNAB, 1999). Die Lage von FliK, Flil und FlhA im Flagellum ist in Fig. 2 dargestellt.
Figur 2 zeigt das Sekretionssystems von P aeruginosa. Die betroffenen Gene sind in der Abbildung dunkelgrau markiert. Alle drei hier adressierten Gene sind notwendig für die Sekretion von Pathogenitätsfaktoren durch das Flagellum. Von allen ist nachgewiesen, daß sie für das intrazelluläre Überleben von P aeruginosa notwendig sind.
weitere Untersuchungen
Bei den Untersuchungen zur Invasivität in Epithelzellen (Kap. 3.5.1.) zeigten Mutanten mit einer Transposoninsertion in fliK die geringste Invasivität. Ebenfalls fiel bei der Beobachtung im Mikroskop auf, daß sie vollständig unbeweglich waren. Zur genaueren Untersuchung wurden daher elektronenmikroskopische Aufnahmen ihrer Flagellen angefertigt. Auf diesen Aufnahmen war zu sehen, daß die Flagellen bei ca. 90% der PA1441 Transposonmutanten deutlich verkürzt sind, die restlichen verfügen über gar kein Flagellum. In S.typhimurium führt das Ausschalten von fliK zur Bildung verlängerter Hakenstrukturen. Um entscheiden zu können, ob die gesehenen Strukturen verkürzte Flagellen oder verlängerte Haken sind, wurden die Fla- gelline fixierter Bakterien (P.aeruginosa TB^, P.aeruginosa PA1441- knock out und E.coli DH5α oder DH5a mit einem spezifischen Anti- Flagellin- Antikörper (gegen Flagellin Typ b) detektiert.
FlhA- Mutanten besitzen keine Flagellen, flil- Mutanten verfügen zwar über prinzipiell funktioneile Flagellen, diese sind jedoch nicht fest in der Membran integriert und gehen schnell zusammen mit dem angeschlossenen Exportsystem verloren.
Zusammenfassung
Die Expression von PA1441 ist essentiell für die Motilität von P.aeruginosa. Allerdings wird im Gegensatz zu E.coli und S.typhimurium bei Ausschalten des Gens auch weiterhin ein verkürztes Flagellum aufgebaut. In P.aeruginosa ist fliK vom Rest des zweiten Operons zur Flagellensynthese durch eine große Insertion getrennt. Die Verringerung der intrazellulären Überlebensfähigkeit von P. aeruginosa durch Ausschalten der Gene PA1104, PA1441 und PA1452 legt nahe, daß das Flagellenexportsystem essentiell für das Überleben der Bakterien in Phagozyten ist. Dies entspricht den Erfahrungen aus Yersinia pseudotuberculosis, einem anderen intrazellulär überlebensfähigen Pathogen, bei dem durch das Flagellenexportsystem sezernierte Proteine essentiell für die intrazelluläre Persistenz sind (YOUNG ET AL., 1999). Da die Exportsysteme von Psudomonas und Yersinia hoch homolog sind, ist eine gleichartige Funktion zur Sekretion von Pathogenitätsfaktoren eine hinreichende Erklärung für die Notwendigkeit dieser Gene zum Überleben in Granulozyten. PA1572
Phänotypische Eigenschaften
Überlebensfähigkeit : in Granulozyten 0,06 in AB- Serum 1 ,2
Figure imgf000029_0001
Quorum Sensing: verringerte Produktion v. Autoinducem weitere Eigenschaften: verringerte Proteasesekretion
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA1572 Funktion Hypothetisches Protein, unklassifiziert
Strukturmerkmale / Homologien 56% Ähnlichkeit zu einem 377 As. langen hypothetischen Protein bei
Pyrococcus horikoshii.
Nukleotidsubstitutionen nicht- synonym: ACC - GCC: T354A synonyme: 1007C - G
Länge 1146 Bp = 382 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
Die letzten 20 Basen der kodierenden Sequenz von PA1572 bilden zusammen mit der nachfolgenden Sequenz eine typische Terminationsstruktur. Es ist daher nicht anzunehmen, daß weitere Gene zusammen mit PA1572 transkribiert werden.
weitere Untersuchungen
Es wurde gezeigt, daß die verringerte Sekretion von Proteasen und Homoserinlactonen durch Inkubation mit P.aeruginosa TB^ bis fast auf die Ausgangswerte des Wildtyps gesteigert werden konnte.
Zusammenfassung
Bei dem Transposonmutanten mit einer Insertion in PA1572 ist das ausgeschaltete Gen unklassifiziert, so daß weder Bindungspartner noch Substrate bekannt sind. Dennoch ist dies eines der interessantesten Gene, die in diesen Untersuchungen gefunden wurden. Während die Serumresistenz gegenüber dem Wildtyp unverändert, vielleicht sogar etwas erhöht ist, überleben fast keine PA1572- knock out Mutanten eine Phagozytose durch Granulozyten. Ebenfalls zeigen sie eine stark verringerte Produktion von Homoserinlactonen, aber keinen Totalausfall. Durch Zugabe von Autoinducern konnte in Mutanten mit einer Insertion in PA1572 die eigene Produktion dieser Moleküle induziert werden. Dies läßt den Schluß zu, daß durch die Transposoninsertion weder Aufnahme noch Erkennung oder Produktion von Homoserinlactonen, sondern deren Regulation beeinflußt worden ist.
PA1992
Phänotypische Eigenschaften
Überlebensfähigkeit : in Granulozyten 0,4 in AB- Serum 0,4
Figure imgf000030_0001
weitere Eigenschaften: deutlich erhöhte Invasivität in Epithelzellen und erhöhte Adhärenz
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA1992 Funktion möglicher 2-Komponenten -Sensor Strukturmerkmale / Homologien 56% Ähnlichkeit mit unveröffentlich tem flhS von Paracoccus denitrificans
(nur C-terminal 75% des ORF)
Strukturmotive einer Histidinkinase und eines Response- Regulator Re ceivers
Nukleotidsubstitutionen nicht- synonym: CTG - TTG: L326F im Promotor: -75 C - T
Länge 1694 Bp = 565 As. Einfluß auf benachbarte Gene
PA1992 ist das letzte Gen einer möglichen polycistronischen Genkassette. Diese schließt ohne Terminationsschleife, allerdings sind auf den folgenden 8 kB die Gene auf dem Gegenstrang kodiert. Ein eis- Effekt der Transposoninsertion ist somit unwahrscheinlich.
weitere Informationen
Im PAO- Genom existieren zwei paraloge Gene zu PA1992. PA1976 ist etwas länger, weist aber einige sehr homologe Bereiche auf. Das zweite paraloge Gen ist PA3271. Beide Gene sind funktionell als 2-Komponenten - Sensoren eingeordnet. In den Datenbanken ist keine weitere Information zur Funktion von PA1992 oder flhS zu erhalten.
weitere Untersuchungen Bei der Untersuchung des intrazellulären Überlebens in Granulozyten zeigte der Mutant 14B2 meistens eine Überlebensrate, die deutlich über der des Durchschnitts lag. Auffällig waren aber vor allem die Ergebnisse der Invasivitätstests mit Epithelzellen (Kap. 3.5.1.). Hierbei zeigte der Transposonmutant eine deutlich höhere Adhärenz und eine 10- 20 fach höhere Invasivität in Epithelzellen als der Wildtyp.
Zusammenfassung
Bei PA1992 handelt es sich um eine Histidinkinase. Dieses Strukturmotiv deutet auf eine Funktion als Regulator in einer Signalkaskade hin. Durch das Ausschalten des Gens PA1992 wurde die Adhärenz und Invasivität in Epithelzellen um mindestens den Faktor 10 gesteigert. Die genomische Umgebung läßt keinen eis - Effekt zu. Die phänotypischen Veränderungen sind somit dem Ausschalten des Gens PA1992 direkt zuzuordnen. PA2591
Phänotypische Eigenschaften
Quorum Sensing Ausgeschaltet weitere Eigenschaften : keine Proteasesekretion
5
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA2591 Funktion Transkriptionsregulator Strukturmerkmale / Homologien 46% Ähnlichkeit mit DMSO - Reduk- .0 tase - Regulatorprotein DorX (Rho- dobacter sphaeroides) Signatur der LuxR- Familie Länge 807 Bp = 268 As.
L5 Einfluß auf benachbarte Gene
Hinter PA2591 liegt eine mögliche Terminationsschleife. Diese Struktur ist allerdings nicht besonders stark ausgeprägt. Eventuell werden daher die nachfolgenden Gene PA2590 und PA2589 (beides hypothetische ORFs) von der RNA- Polymerase mittranskribiert.
20
Zusammenfassung
Das identifizierte Gen PA2591 gehört zur Familie der LuxR- Regulatoren, wie z.B. auch Vfr, einem bekannten Regulator des Quorum Sensings. Bei allen gramnegativen Bakterien, deren Quorum Sensing bisher untersucht wurde, gehört
25 mindestens ein LuxR- verwandtes Protein zum Regulationssystem des Quorum Sensings. In diesem Zusammenhang ist interessant, daß das Ausschalten von PA2591 zum vollständigen Ausfall des Quorum- Sensings in P.aeruginosa TB führte. Dies bedeutet, daß auch dieser Regulator in die Steuerung des Quorum Sensing eingreift. Bisher war als übergeordneter Regulator nur Vfr bekannt. Der
30 Funktion des gefundenen LuxR- Regulators war bisher unbekannt. Die Untersuchungsergebnisse zeigten, daß durch Transposoninsertion in dieses Gen weder kurzkettige noch langkettige aliphatische Homoserinlactone von dem Transposonmutanten produziert werden konnten. Dies bedeutet, daß dieser bisher funktionell uncharakterisierte Regulator in einer ähnlich zentralen Position in die Produktion der Autoinducer eingreift wie Vfr, bislang aber übersehen wurde.
PA3344
Phänotypische Eigenschaften
Überlebensfähigkeit : in Granulozyten 0,05 in AB- Serum 0,9
Figure imgf000033_0001
weitere Eigenschaften: erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Peroxi¬
L 0 den
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA3344 Bezeichnung recQ
L 5 Funktion ATP- abhängige DNA-Helicase Strukturmerkmale / Homologien DEAD- Box Unterfamilie der ATP- abhängigen Helicasen, für Helicasen typischer konservierter C- Terminus,
HRDC- Domäne
20 Nukleotidsubstitutionen synonym: 95A-C; 337A-G ; 382C-T Länge 2138 Bp = 713 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
25 4 weitere Gene unbekannter Funktion sind im Anschluß an recQ in gleicher Leserichtung auf dem PAO- Chromosom lokalisiert. Ein eis- Effekt wäre theoretisch denkbar, durch die Ergebnisse der weiterführenden Untersuchungen erscheint aber recQ tatsächlich für den beobachteten Phänotyp verantwortlich zu sein.
30 weitere Informationen
Die aus der PAO- Datenbank erhaltene Funktionsvorhersage lautet: DNA Replikation, -Rekombination, -Modifikation und -Reparatur weitere Untersuchungen
Unter normalen Wachstumsbedingungen oder bei Inkubation mit AB- Serum zeigt ein Transposonmutant mit einer Insertion in recQ keinen signifikant veränderten Phänotyp. Allerdings führt das Ausschalten von RecQ zu einer signifikanten 5 Verringerung der intrazellulären Überlebensfähigkeit in den Granulozyten und zu einer deutlich erhöhten Sensibilität gegenüber Peroxiden. Die Funktion dieses Proteins muß daher in der Reparatur der unter diesen Umständen induzierten DNA- Schäden liegen.
L O Zusammenfassung
AB- Serum schädigte die Mutanten nicht stärker als den Wildtyp. Nur die Fähigkeit zum intrazellulären Überleben nach der Phagozytose durch die Granulozyten war stark vermindert. Das Ausschalten von recQ erhöhte die Sensitivität gegenüber dem oxidativen Streß in den Granulozyten. Dies ist durch das fehlende Wachstum auf
L5 peroxidhaltigem Vollmedium bestätigt worden. Vermutlich ist recQ an der Reparatur von Schäden beteiligt, die durch oxidativen Streß an der DNA auftreten.
PA4621
Phänotypische Eigenschaften
20 Überlebensfähigkeit in Granulozyten 0,2 in AB- Serum 0,2
Figure imgf000034_0001
Quorum Sensing Ausgeschaltet weitere Eigenschaften keine Proteasesekretion, erhöhte
25 Empfindlichkeit gegenüber Peroxiden
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA4621 Funktion mögliche Oxidoreduktase
30 Strukturmerkmale / Homologien Motive einer Aldehydoxidase und Xanthindehydrogenase am C- Terminus, 2 Transmembranhelices vor- herge- sagt Nukleotidsubstitutionen : nicht- synonym: CTG - TTG: L326F im Promotor: -75 C - T Länge 2832 Bp = 944 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
Hinter PA4621 befindet sich keine Terminationsstruktur. Das Gen bildet zusammen mit den drei folgenden Genen PA4620 (4-Hydroxybenzoyl-CoA-Reduktase), PA4619 (membrangebundene Alkoholdehydrogenase Cytochrom c Untereinheit) und PA4618 (unbekannte Funktion) eine polycistronischen Genkassette.
Zusammenfassung
Der Mutant mit einer Insertion in PA4621 zeichnete sich durch einen Defekt im Quorum Sensing und eine verringerte Überlebensfähigkeit in AB- Serum aus, wodurch er in den Selektionsexperimenten mit Granulozyten auffiel. Letzteres ist auf eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem oxidativem Streß in den Phagosomen zurückzuführen. Die in den Datenbanken vorhandenen Informationen über das ausgeschaltete Gen enthalten keine Angaben über ein eventuelles Substrat oder weitere Untersuchungsergebnisse zu dem kodierten Protein.
PA5040
Phänotypische Eigenschaften
Überlebensfähigkeit : in Granulozyten 1 ,0 in AB- Serum 2,7
QAB 2,7 weitere Eigenschaften: Überlebte von allen untersuchtenTranspo- sonmutanten bei Inkubationen mit Granulozyten am besten.
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA5040
Bezeichnung pilQ Funktion: mögliche Oxidoreduktase Strukturmerkmale / Homologien : Notwendig zum Aufbau von TypIV-
Fimbrien. Bildet eine basale Komponente, durch die die Pili- Proteine ausgeschleust werden. Typ IV- Fimbrien sind notwendig für Motilität ("Twitching motility") und Kontakt zu Oberflächen (HOBBS & MATTICK 1993) Nukleotidsubstitutionen :synonym: 488C-T; 743C-T; 803T-C Länge : 2145 Bp = 714 As.
Einfluß auf benachbarte Gene pilQ ist das letzte Gen der polycistronischen Genkassette pilMNOPQ. Direkt im Anschluß sind ohne offensichtliche Terminationsstrukturen weitere Gene kodiert, die eine Funktion im Aminosäuremetabolismus (aromatische Aminosäuren) oder der Häm- Synthese haben.
Weitere Untersuchungen
Der Transposonmutant, bei dem das Transposon in das Gen pilQ (PA1322) inseriert wurde, weist eine deutlich erhöhte Serumstabilität auf. PilQ ist ein
Bestandteil der TypIV- Fimbrien von P.aeruginosa (MARTIN ET AL. 1993).
Zusammenfassung
Die hohe Überlebensrate von pilQ- Transposonmutanten läßt sich in erster Linie auf eine erhöhte Resistenz gegenüber dem Blutserum zurückführen. Die eventuell zusammen mit pilQ von RNA- Polymerasen abgelesenen Gene zur Aminosäureoder Häm- Synthese haben keinen entscheidenden Einfluß auf die Serumstabilität von Bakterien. Die beobachteten Veränderungen im Phänotyp sind daher auf das Fehlen des entsprechenden Genprodukts zurückzuführen. Durch das Ausschalten von PilQ scheint es kompensatorisch zu einer erhöhten Produktion von
Exopolysacchariden zu kommen, die die Bakterien gegen das Komplementsystem abschirmen. PA5349
Phänotypische Eigenschaften
Überlebensfähigkeit : in Granulozyten 0,05 in AB- Serum 0,4
Figure imgf000037_0001
Quorum Sensing Ausgeschaltet weitere Eigenschaften keine Proteasesekretion, erhöhte
Empfindlichkeit gegenüber Peroxiden
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA5349 Funktion mögliche Rubredoxin Reduktase Strukturmerkmale / Homologien 59% Ähnlichkeit mit Rubredoxin Reduktase von Acinetobacter calcoa ceticus partielle Signatur einer Aromaten-Hydroxylase (Flavopro- teinmonooxigenase), Strukturmerkmal einer Pyridinnukleo tid - Disulfidoxidoreduktase
Nukleotidsubstitutionen synonym: 893G - C; 1055T - C Länge 1155 Bp = 384 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
Die Gene vor PA5349 kodieren für verschiedene Enzyme des Kohlenstoffkatabolismus. PA5350 und PA5351 für zwei Rubredoxin- ORFs, das auf PA5349 folgende Gen (PA5348) kodiert für ein mögliches DNA- bindendes Protein, dem (in den Datenbanken) eine Funktion in der DNA- Replikation, - Modifikation, - Rekombination oder - Reparatur zugewiesen wird. Alle diese Gene (von PA5355 bis 5347) werden vermutlich in einem Zuge von der RNA- Polymerase abgelesen. weitere Informationen
Rubredoxin Reduktase ist eine Flavoproteinoxidoreduktase. Sie arbeitet zusammen mit Rubredoxin und oxidiert so aliphatische Kohlenwasserstoffe mit Sauerstoff zu der entsprechenden Carbonsäure, die dann von anderen Enzymen weiter metabolisiert werden kann. Rubredoxin Reduktase hat allerdings auch noch eine weitere Funktion: Sie wirkt in einigen anaeroben Bakterien zusätzlich als Schutz gegen oxidativen Streß (LUMPPIO HL ET AL., 2001 ). Auch bei Bakterien mit aerobem Stoffwechsel können Rubredoxin und Rubredoxin Reduktase ein wichtiger Schutz gegen oxidativen Streß sein. So können sie z.B. in E.coli die Superoxiddismutase ersetzen (PIANZZOLA MJ ET AL. 1996).
In P.aeruginosa wird die Expression zweier Superoxiddismutasen und einer Katalase direkt über das LasR/LasI- System reguliert. Das Quorum Sensing ist somit auch in diesem Bakterium notwendig zur Kontrolle von oxidativem Streß. Mutanten mit einem Defekt in einem der beiden Regulationssysteme zeigen eine verringerte Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid (HASSETT DJ ET AL. 1999), wie es auch hier beim Ausschalten der Rubredoxin- Rediktase zu beobachten war.
weitere Untersuchungen
Entsprechend den Untersuchungen bei anderen wurde auch der Mutant mit einer Transposoninsertion in PA5349 auf seine Sensibilität gegenüber Peroxiden überprüft. Auch dieser Mutant zeichnete sich durch eine deutlich verringerte Resistenz gegenüber oxidativem Streß aus.
Zusammenfassung Der Transposonmutant mit einer Insertion in PA5349 zeigte in der Inkubation mit Granulozyten eine deutlich verringerte Überlebensfähigkeit. Dies kann - ähnlich wie bei anderen Mutanten mit dem Defekt in der Helikase - auf Grundlage der Ergebnisse der Inkubation auf peroxidhaltigem Vollmedium, direkt auf eine verringerte Resistenz gegenüber oxidativem Streß zurückgeführt werden. Es ist bekannt, daß in P.aeruginosa an der Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid in der stationären Phase mindestens zwei Superoxiddismutasen und eine Katalase beteiligt sind (HASSETT DJ ET AL. 1999). In diese Kategorie könnte auch die funktioneil sehr ähnliche Rubredoxinreductase einzuordnen sein. Die Entgiftung von Sauerstoff hat für P.aeruginosa eine entscheidende Bedeutung. Der Ausfall eines der Entgiftungsmechanismen kann eventuell die Ursache dafür sein, daß die phagozytierten Mutanten mit einem Defekt in PA5349 nicht mehr intrazellulär in Granulozyten überleben können. Weiterhin produzierte der Mutant mit der Insertion in PA5349 keine Homoserinlactone. Vermutlich ist die Rubredoxin Reduktase notwendig, um aliphatische hydrophobe Verbindungen so zu oxidieren, daß sie im Fettsäuremetabolismus verarbeitet werden können. Der Ausfall dieses Enzyms könnte die Synthese von aliphatischen Homoserinlactonen beeinflussen, da durch den Knock- out keine oder nur wenige aliphatischen Seitenketten für die AHL- Synthese in den Mutanten vorhanden sind, (siehe auch PA1288) PA5415 Phänotypische Eigenschaften
Quorum Sensing: keine Produktion von kurzkettigen AHL, nur sehr geringe Produktion von langkettigen AHL. weitere Eigenschaften: Proteasesekretion nicht ausgeschaltet
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer PA5415 Funktion Serinhydroxymethyltransferase
(Aminosäurebiosynthese und -metabolismus: Gly-, Ser-, Thr- Metabolismus, Lys- Synthese, CH4- Metabolismus und C Reservoir) Strukturmerkmale / Homologien : 82% Ähnlichkeit mit Serinhydroxymethyltransferase aus E.coli. Strukturmotive einer Aminotransfer- ase Klasse II und eine Bindungsstelle für Pyridoxalphosphat. Nukleotidsubstitutionen : nicht-synonym:CGG - CAG : R76Q
GGG - GCC : G304A synonym: 161C - T; 228G - A ; 251T - C; 287G - A; 308A - G; 416A - C; 770T - C; 935T - C Länge 1254 Bp = 417 As.
Einfluß auf benachbarte Gene
Hinter PA5415 existieren mindestens 4 verschiedene Möglichkeiten, um Terminationsstrukturen auszubilden. Möglicherweise handelt es sich dabei um Proteinbindungsstellen, durch die die Transkription und Translation der folgenden Gene (Sarkosin- Oxidase und Proteine des C Metabolismus) reguliert werden können.
Zusammenfassung
Eine inhaltliche Verbindung der Serinhydroxymethyltransferase zum Quorum Sensing ist der aktuellen Literatur nicht zu entnehmen. Es existieren allerdings Ergebnisse aus E.coli, wonach diese Bakterien unter Streß ihr Expressionsmuster ändern. Die Serinhydroxymethyltransferase wird in diesem Fall zusammen mit dem Protein FadL und dem Acly- Carrier- Protein deutlich verstärkt produziert (OHBA ET AL. 1997). Ein Mutant mit der Transposoninsertion in einem FadL entsprechenden Protein wurde im Zuge der Untersuchungen gefunden - PA1288. Auch dieser Mutant zeigt einen Defekt im Quorum Sensing und in der Reaktion auf Streßfaktoren. Der einzige bekannte funktioneile Zusammenhang besteht darin, daß die Serinhydroxymethyltransferase eine Funktion im C1- Metabolismus hat. S- Adenosylmethionin ist sowohl ein internes Reservoir für den C1- Metabolismus, andererseits aber auch für die Produktion von Homoserinlactonen notwendig. Eventuell kommt es durch das Ausschalten der Serinhydroxymethyltransferase zu einer Verringerung der Konzentration an verfügbarem S-Adenosylmethionin und so zu einem Mangel an Homoserin zum Aufbau der Autoinducer. Seq. ID 1
Phänotypische Eigenschaften
Überlebensfähigkeit in Granulozyten 0,3 in AB- Serum 0,15
Figure imgf000041_0001
Quorum Sensing : Ausgeschaltet weitere Eigenschaften keine Proteasesekretion
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer: Nicht im PAO- Genom vorhanden
weitere Informationen Auf Proteinebene existiert eine geringe Ähnlichkeit (2- e *19) zwischen der sequenzierten Region und einem hypothetischen ORF von Salmonella typhi. Auf Nukleotidebene gab es keine Homologien.
weitere Untersuchungen In einer Southern- Hybridisierung wurde die mit Psfl- verdaute genomische DNA verschiedener P.aeruginosa - Isolate mit der flankierenden Sequenz der Transposoninsertion hybridisiert. Die Seq. ID1 ist nicht nur in P.aeruginosa TB sondern auch in den beiden untersuchten Isolaten P.aeruginosa CSGB8 und SG17M vorhanden. Mit P.aeruginosa PAO zeigte sich erwartungsgemäß kein Signal.
Zusammenfassung
Die unbekannte Sequenz ist keine klonspezifische DNA von P.aeruginosa TB, da sie auch in zwei Isolaten des Klons C (P.aeruginosa SG17M und CSGB8) vorkommt. Eine Transposoninsertion in diesem Bereich, der in P.aeruginosa PAO nicht existiert, schaltete das Quorum Sensing von P.aeruginosa TB vollständig aus. Dies bedeutet, daß das Quorum Sensing in diesen Bakterien teilweise anders reguliert wird. Außerdem werden in der unbekannten DNA- Sequenz - zumindest in einer Subpopulation von P.aeruginosa - zusätzliche entscheidende Faktoren für die Expression des Quorum Sensings kodiert, die bei Untersuchungen des genetischen Referenzstammes PAO nicht gefunden werden.
Seq.lD 2
Phänotypische Eigenschaften
Quorum Sensing Ausgeschaltet weitere Eigenschaften keine Proteasesekretion
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genom projekt)
Gen- Nummer : Nicht im PAO- Genom vorhanden
weitere Untersuchungen: Wie bei dem Mutanten mit einer Insertion in Seq. ID 1 wurde auch hier in einer Southern- Hybridisierung die mit Psfl- verdaute genomische DNA verschiedener P.aeruginosa - Isolate mit der flankierenden Sequenz der Transposoninsertion hybridisiert. Die unbekannte DNA- Sequenz ist nicht nur in P.aeruginosa TB sondern auch in den meisten untersuchten P.aeruginosa Isolaten vorhanden. Mit P.aeruginosa PAO zeigte sich erwartungsgemäß kein Signal. Bei einem Sequenzabieich mit Hilfe von BLASTN zeigte sich eine Sequenzidentität von ca. 80% zu Seq. ID 3.
Zusammenfassung Wie bei Seq. ID 1 ist auch diese unbekannte Sequenz keine klonspezifische DNA von P.aeruginosa TB, da sie auch in anderen Isolaten vorkommt. Eine Transposoninsertion in diesem Bereich, der in P.aeruginosa PAO nicht existiert, schaltete das Quorum Sensing von P.aeruginosa TB vollständig aus. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, daß das Quorum Sensing von P.aeruginosa TB - und eventuell auch von anderen P.aeruginosa- Isolaten - durch zusätzliche Faktoren reguliert wird, die von den Untersuchungen bei PAO unbekannt sind. Seq. ID 3
Ausgeschaltetes Gen (It. P.aeruginosa Genomprojekt)
Gen- Nummer Nicht im PAO- Genom vorhanden
Zusammenfassung:
Seq. ID 3 zeigt eine 80% ige Identität auf Nukleotidebene zu Seq. ID 2, repräsentiert aber im Gegensatz dazu die Sequenz des vollständigen Gens. Dies ist ein Beispiel aus einer Genfamilie, die in mehr als 60% aller P. aeruginosa Isolate und in vielen anderen gram- negativen Bakterien vorhanden ist, im sequenzierten Stamm PAO aber fehlt. Die Mitglieder dieser Genfamilie haben untereinander auf Nukleotidebene eine Ähnlichkeit von ca. 80%, auf Proteinebene meist noch deutlich höher.
L5
Zusammenfassung der Ergebnisse Intrazelluläre Überlebensfähigkeit in Granulozyten
Von den Erfindern wurden mehr als 1000 Transposonmutanten auf ihre intrazellulä- 20 re Überlebensfähigkeit in Granulozyten untersucht. Diejenigen P.aeruginosa- Mutanten mit den deutlichsten phänotypischen Abweichungen wurden gesammelt und erneut untersucht. Bei den auffälligsten der so in ihrer phänotypischen Abweichung bestätigten Bakterien wurde genauer differenziert und quantifiziert, zu welchen Teilen die gemessenen geringen Überlebensraten auf eine geringe Überle- 5 bensfähigkeit in Granulozyten zurückzuführen sind und welchen Anteil eine Sensibilität gegen Blutserum an dem gemessenen Effekt hat. Weiterhin wurden die identifizierten Transposonmutanten auf ihre Invasivität in Epithelzellen untersucht. Hierbei zeigte sich, daß die intrazelluläre Überlebensfähigkeit in Granulozyten und die Invasivität eine Bakteriums in Epithelzellen nicht miteinander verbundene phänotypische 0 Eigenschaften sind. Die Sequenzierungen der flankierenden DNA- Bereiche der genomisch inserierten Transposons zeigten, daß in den meisten P.aeruginosa TB-Transposonmutanten, die das Selektionsexperiment nicht überlebt hatten, Gene ausgeschaltet wurden, die auch im P.aeruginosa PAO- Genom vorkommen.
Bei Transposonmutanten, deren Sensitivität gegenüber Blutserum verändert war, scheint die Ursache eine Modifikation in der Zusammensetzung der Extrazellularmatrix oder des Aufbaus der äußeren Zellmembran zu sein. Die Ursachen für die verminderte Überlebensfähigkeit in Granulozyten lassen sich zum einen auf Defekte in der Abwehr von oxidativem Streß oder der Reparatur von oxidativen Schäden an der DNA zurückführen. Zum anderen wurden Gene des Flagellenexportsystems gefunden, deren Ausschalten einerseits den Flagellenaufbau störte, andererseits aber auch die intrazelluläre Überlebensfähigkeit in Granulozyten und die Invasivität in Epithelzellen stark verminderte. Dies liegt in einer doppelten Funktion dieses Exportsystems begründet. Neben seiner Funktion für den geordneten Flagellenaufbau wird es ebenfalls zu Sekretion von Pathogenitätsfaktoren benötigt, die P. aeruginosa das intrazelluläre Überleben ermöglichen.
Quorum sensing
Die Untersuchung auf die Funktionstüchtigkeit des Quorum Sensing erfolgte durch Inkubation der P.aeruginosa- Transposonmutanten mit einem E.coli - Detektorstamm. Dieser trug ein Plasmid, auf dem eine Luciferase hinter einem Promotor kodiert war, an den nur bei Anwesenheit von Homoserinlactonen eine RNA- Polymerase binden konnte. Hierfür wurde jeder einzelne Mutant in Mikrotiterplatten separat untersucht . Die so identifizierten Transposonmutanten mit einem deutlichen Defekt in der Produktion von lang- und kurzkettigen aliphatischen Homoserinlactonen (AHL) wurden auf zwei neu entwickelten Selektionsmedien auf ihre Proteaseaktivität untersucht. Wie zu erwarten war, zeigte sich ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Produktion von AHL und der Sekretion von Proteasen.
Die gefundenen Gene kodieren für eine Vielzahl verschiedener Proteine, in der Majorität jedoch für Regulatoren mit zumeist bisher unbekannter Funktion. Eine zweite Gruppe von Genen ist mit dem Fettsäuremetabolismus assoziiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß diese Genprodukte für die Synthese der aliphatischen Seitenketten der Homoserinlactone essentiell sind. Weiterhin wurde ein TonB- abhängiger Eisenrezeptor gefunden, dessen Inaktivierung zu einem Totalausfall des Quorum Sensing führte. Bisher war nur bekannt, daß das Quorum Sensing die Eisenaufnahme reguliert, der umgekehrte Mechanismus war bisher noch nicht beschrieben worden. Weiterhin wurde ein Protein identifiziert, das strukturelle Ähnlichkeiten mit einer ß- Lactamase aufweist und dessen Inaktivierung die Menge der freien Homoserinlactone in der stationären Wachstumsphase erhöht und somit die Funktion einer Homoserinlactonase hat. Zusätzlich wurden Transposoninsertionen in zwei weiteren DNA- Sequenzen gefunden, die nicht aus der Sequenzierung von P.aeruginosa PAO bekannt sind, aber keine klonspezifische DNA des Stammes TB sind, sondern auch bei anderen P. aeruginosa Isolaten gefunden wurden. Mit einer Ausnahme waren alle gefundenen Gene bisher nicht dem Quorum Sensing zugeordnet worden. Dies deutet darauf hin, daß das bisher existierende Regulationsmodell für die Produktion von AHL sehr lückenhaft ist. Das Fehlen zweier DNA- Sequenzen in P.aeruginosa PAO, deren Inaktivierung zu einem Defekt im Quorum Sensing des untersuchten Transposonmutanten führte, war ein überraschender Befund und deutet darauf hin, daß die AHL- Produktion verschiedener P.aeruginosa - Stämme unterschiedlich reguliert sein kann. In PAO fehlen DNA- Sequenzen, die bei mehreren anderen P.aeruginosa- Stämmen vorkommen und dort eine essentielle Funktion für die Regulation und Produktion der Homoserinlactone haben. Die aus der Untersuchung von P.aeruginosa PAO erhaltenen Informationen werden somit das Quorum Sensing in anderen P.aeruginosa- Stämmen nur lückenhaft beschreiben können. Experimentalteil
Erzeugung der Transposonmutanten
5 Bakterienstämme
Escherichia coli
DH5: F ,φ80, m80/acZΔM1S, A(lacYZA-argF)w∞, recA1, endA1, hsdRU
L O (rκ " ; mκ +), supE44, λ, thϊ, gyrA, relA1
Verwendung: Lagerung von pTnMod-OGm und Donorstamm in triparentaler Konjugation
HB101 : P, leuB6, proA2, recA13, thi-1, ara-14, lacY1, galK2, xyl-5, mtl-1,
L5 rpsL20, supE44, hsdS20 (rB ; mB ")
Verwendung:Als Träger des Plasmides pRK2013; Helferstamm in triparentaler Konjugation
Pseudomonas aeruginosa TB: Serotyp: 4
20 Pyocintyp: 1 h
Phagenlysotypie: F8, M4, PS2, PS24, PS31 , 352, 46b/2, 1214, Col21 ,F7, F10, PS21 , PS73 Ein Plasmid konnte nicht nachgewiesen werden.
25
Vektoren pTnMod-OGm
Der Vektor pTnMod-OGm wurde von DENNIS & ZYLSTRA (1998) erstmalig beschrieben. Es handelt sich hierbei um ein sog. Plasposon mit einem mini-Thδ (mit einer 30 Gentamicinresistenz) und einem or/TRP4 zum konjugativen Transfer. Bei der Transposition verbleibt die Transposase auf dem Plasmid. Zusätzlich umfaßt die transponierte Sequenz bei pTnMod-OGm auch den Replikationsursprung des Plasmides. Dies bedeutet, daß das Restplasmid nach erfolgter Transposition nicht mehr repliziert werden kann und somit verloren geht. Der verwendete Replikations- Ursprung oriR pMB1 ist zudem zwar in den meisten E.coli - Stämmen, nicht aber nicht in P.aeruginosa stabil exprimierbar. Ein weiterer Vorteil dieses Vektors liegt darin, daß somit eine erneute Mobilisierung der flankierenden Bereiche des inserierten mini- Transposons als Plasmid möglich wird (Plasmid rescue). In diesem Plasmid wurde eine optimierte Signalsequenz (V40; V=A,G,C) flankierend zum Replikationsursprung in die Kpn\- Schnittstelle des pTnMod-OGm ligiert. Das Plasmid eignet sich somit zur Generierung von Mutanten mit spezifischen Signalsequenzen.
pRK2013 pRK2013 ist ein sog. Helferplasmid. Es kodiert für sämtliche Gene, die für eine Konjugation notwendig sind (tra und mob). Mit seiner Hilfe sind andere Plasmide, die einen RP4- oriT besitzen, mobilisierbar, auch wenn der Donor- Stamm selbst nicht über die zur Konjugation notwendigen Gene verfügt (FIGURSKI D & HELINSKI D 1979).
Anzucht von Bakterien
Das meistverwendete Kulturmedium zur Bakterienanzucht war Luria- Bertiani- (LB-)
Medium. Zumeist erfolgte die Anzucht der Bakterien aus Einzelkolonien in 5 ml LB (37°C, 250 rpm, 12- 16 h). Als lagerfähige Kultur oder zur Selektion diente LB- Agar mit einem entsprechenden Antibiotika- Zusatz.
Selektionsmedien:
E.coli DH5α pTnMod-OGm LB + 25 μg/ml Gentamicin
E.coli HB101 pRK2013 LB + 50 μg/ml Kanamycin P.aeruginosa LB + 50μg/ml Gentamicin und
M9(Glycerol) + 50μg/ml Gentamicin
Triparentale Konjugation
Bei diesem Verfahren wird ein mobilisierbares Plasmid mit Hilfe eines Helferstammes, der über die zur Konjugation notwendigen Gene verfügt, von einem selbst nicht zur Konjugation fähigen Donorstamm auf einen Akzeptorstamm übertragen. Wichtig ist hierbei nur, daß der Akzeptor über kein funktionierendes Restriktionssystem verfügt. Donor- Stamm E.coli DH5α
Vektor pTnMod-OGm
Helfer- Stamm E.CO// HB101 mit pRK2013 Akzeptor- Stämme P.aeruginosa TB
P.aeruginosa TB wurde über 5-7 Tage auf Blutagar bei 42°C inkubiert und dabei täglich überimpft. Donorstamm E.coli DH5α (mit pTnMod-OGm) und Helferstamm E.coli HB101 (mit pRK2013) wurden am Vortag der Konjugation auf LB- Agar mit entsprechendem Antibiotikazusatz ausgestrichen.
Die Bakterien wurden in 10 mM MgSO4 resuspendiert und auf eine Dichte von 1 ,0 OD eingestellt. Suspensionen von Donor, Helfer und Akzeptor wurden im Verhältnis 10:10:1 gemischt und auf einer LB-Agar Platte ausplattiert. Nach einer mehrstündi- gen Inkubation bei 37°C wurden die Bakterien resuspendiert und Aliquote auf M9 (Glycerol)- Agarplatten mit Gentamicinzusatz ausplattiert. Positive Transposonmutanten wurden nach ca. 2 Tagen Inkubation (37°C) auf eine neue M9(Glycerol)- Agarplatte mit Gentamicin überführt. Nach einer 16- stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Platten für ca. 1 Monat bei 4°C gelagert, bevor die P.aeruginosa Mutanten weiteren Experi-menten zugeführt oder bei -80°C eingefroren wurden. Diese Lagerung war notwen-dig, um die mittransferierten E.coli, die zwar mit der Kohlenstoffquelle Glycerol fast nicht wachsen, aber dennoch überleben können, von den P.aeruginosa Mutanten abzutrennen. Die E.coli waren nicht in der Lage, eine derart lange Hungerperiode zu überleben.
Präparation genomischer DNA von Gram- negativen Bakterien
Die Präparation genomischer DNA aus P.aeruginosa erfolgte nach einem speziell für Gram- negative Bakterien entwickelten Methode (CHEN & Kuo 1993). Die so aufgearbeitete DNA wurde als Matrize in der PCR oder zur Herstellung von Southern Blots eingesetzt. Untersuchung der P.aeruginosa- Transposonmutanten Phagozytosetest
Die generierten P.aeruginosa TB - Transposonmutanten wurden auf ihre intragra- nulozytäre Überlebensfähigkeit getestet. Hierzu wurden Granulozyten frisch aus Blut präpariert und mit P.aeruginosa Transposonmutanten inkubiert. Die Granulozyten wurden durch Waschen und Filtrieren von den extrazellulären Bakterien separiert und anschließend lysiert, so daß die Fraktion der intrazellulären, lebensfähigen P.aeruginosa weiteren Analysen zugänglich wurde.
Pro Selektionsansatz wurden 107 frisch präparierte Granulozyten mit 2-108 cfu P.aeruginosa- Transposonmutanten in RPMI1640 (mit 10% humanem AB- Serum) für 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
Fig. 3 zeigt das Schema des Selektionsverfahrens zur Bestimmung der intrazellulä- ren Überlebensfähigkeit in Granulozyten von P.aeruginosa TB- Transposonmutanten.
In einem parallel begonnenen Kontrollansatz wuchsen die Bakterien ohne äußere Selektion 2 -108 Bakterien in RPMI 1640. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die extrazellulären Bakterien von den intrazellulären durch mehrfaches Waschen, Zentrifugieren und Filtrieren abgetrennt. Die Granulozyten wurden lysiert und aus den überlebenden Bakterien nach mehrstündiger Inkubation auf Vollmedium die genomische DNA präpariert. Aus einem Aliquot des Kontrollansatzes wurde entsprechend die DNA präpariert.
Untersuchung des Quorum Sensing
Das Prinzip des Untersuchungsverfahrens besteht darin, die P.aeruginosa - Mutanten zusammen mit einem E.coli - Detektorstamm zu inkubieren, der über eine episomal kodierte, nur bei Anwesenheit von aliphatischen Homoserinlactonen ex- primierte Luziferase verfügt.
Hierzu wurden die Transposonmutanten in Mikrotiterplatten angeimpft und bei 37°C inkubiert. Der das Sensorplasmid tragende Detektorstamm wurde in LB + Tetracy- clin bis zu einer Dichte von OD 0,3 - 0,4 herangezogen und ein gleiches Volumen davon zu jedem P.aeruginosa- Transposonmutanten zugegeben. Nach 4 h Inkubation (37°C) wurde die Luziferaseaktivität mit einer Photonenkamera gemessen. Die in dieser Untersuchung gefundenen auffälligen Mutanten wurden dann in einem zweiten Experiment auf LB- Agar(1) zusammen mit dem Detektorstamm als Kreuzstrich erneut überprüft.
Bestimmung der Invasivität von P.aeruginosa- Mutanten in Epithelzellen Zellkultur eukaryontischer Epithelzellen (Chang- Zellen) Aus der Ausgangskultur (50 ml, 37°C, 5% CO2) mit präkonfluent gewachsenen Zellen wurde das Medium (RPMI1640 mit 5% FCS) abgenommen und die Zellen mit Trypsinlösung für 5-10 min bei 37°C inkubiert. Sobald sich die Zellen von der Oberfläche gelöst hatten wurde RPM 11640 mit 5% FCS zugesetzt und die Zellzahl mit einem Mikroskop in einer Neubauer- Zählkammer bestimmt. Aus dieser Zellsuspen- sion wurden Aliquote für die folgenden Experimente entnommen.
Mikroskopische Untersuchung der Invasivität
Die schnellste Möglichkeit zur Bestimmung der Invasivität unterschiedlicher P.aeruginosa Mutanten besteht in der mikroskopischen Untersuchung von adhä- renten Epithelzellen, die mit den jeweiligen P.aeruginosa inkubiert worden waren. Zur besseren Sichtbarkeit wurden die Zellen mit nach 1 stündiger Inkubation mit Bakterien (im Verhältnis Zellen: Bakterien = 1 : 100) mit Formaldehyd fixiert und mit Kristallviolett angefärbt. Die Auszählung erfolgte unter dem Mikroskop bei 1000x Vergrößerung.
Quantifizierung der Invasivität von P.aeruginosa
Die ersten Arbeitsschritte zur quantitativen Bestimmung der Invasivität von P.aeruginosa - Stämmen ähneln denen im obigen Kapitel. Die Behandlung der Bakterien und der Epithelzellen entspricht den o.g. Protokoll. Auch in diesem Expe- riment wurden die Epithelzellen für eine experimentell zu bestimmende Zeit mit einem 100-fachen Überschuß an Bakterien inkubiert.
Nach Ablauf der Inkubation (37°C, 5% CO2) wurden die Epithelzellen zur Abtrennung der Bakterien im Überstand dreimal mit RPMI1640 gewaschen und für 120 min mit RPMI1640 +100 μg/ml Polymyxin B inkubiert (37°C, 5% CO2), um die adhä- renten extrazellulären Bakterien abzutöten. Danach wurden die Zellen erneut zweimal mit RPMI1640 gewaschen und zur Freisetzung der intrazellulären Bakterien 5- 10 min mit Saponinlösung (50 mg/ml) inkubiert. Aliqoute dieses Lysats sowie deren Verdünnungen wurden auf LB- Agar ausgestrichen, über Nacht bei 37°C inkubiert und die Lebendkeimzahl bestimmt.
Zur Bestimmung der Adhärenz der Bakterien an die Epithelzellen wurde ein vergleichbares Experiment durchgeführt, jedoch entfiel die Inkubation mit Polymyxin B. Die Epithelzellen wurden nur viermal mit RPMI1640 gewaschen, bevor sie lysiert wurden.
Flagellinnachweis bei P.aeruginosa
Bei einigen Transposonmutanten wurde bei der Untersuchung der intrazellulären Überlebensfähigkeit ein Zusammenhang mit der Regulation des Flagellenaufbaus gefunden. Zur näheren Charakterisierung wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt.
Immunologische Untersuchung der Flagellenmutanten Die zu untersuchenden Bakterien wurden über Nacht in 5 ml LB-Medium herangezogen und je 3 ml Bakteriensuspension für die weiteren Untersuchungen abgenommen. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurden 4-1010 Bakterien abzentrifugiert und in 1 ml PBS resuspendiert. Aliquote von 108 und 107 Bakterien (aus einer 1 :10 Verdünnung) wurden auf eine Nitrocellulosemembran (Protran BA85, 0,45 μm) auf- getragen und bei 37°C getrocknet.
Die Detektion des Flagellins erfolgte nach dem Protokoll der Firma Tropix, das generell für immunologische Detektionen eingesetzt werden kann. Als primärer Antikörper wurde ein Kaninchen-AK gegen Flagellin Typ b (Montie T, Univ. Tennessee, Knoxville) eingesetzt.
Färbung von Flagellen zur elektronenmikroskopischen Untersuchung
P.aeruginosa aus einer über Nacht bei 37°C inkubierten Kultur wurden durch Zugabe von Formaldehyd (Endkonzentration 1 %) abgetötet und auf einer Glimmermatrix fixiert. Die Färbung geschah mit 5 mM Uranylacetat (pH 7,0), das für 5 min auf die Bakterien einwirkte. Nach zweimaligem Waschen mit dest. Wasser wurde das Präparat getrocknet und auf einem Kupfer- Träger fixiert. (Die elektronenmikroskopische Untersuchung erfolgte an der GBF durch Dr. M. Rohde)
Selektion von STM- Mutanten
Die P.aeruginosa- Transposonmutanten wurden separat in Mikrotiterplatten aus eingefrorenen Glycerol- Kulturen angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Je 48 Transposonmutanten mit verschiedenen Signalsequenzen wurden vereinigt und in einem Phagozytosetest auf ihre Überlebensfähigkeit in Granulozyten untersucht. Hierbei wurde jede Gruppe von 48 Mutanten je zwei unabhängigen Experimenten unterzogen.
Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Bakterien (selektierte und unselektierte Proben) in 10 mM MgSO4 resuspendiert und ein zweites Mal den Selektionsbedingungen ausgesetzt. (Die Kontrollen wurden entsprechend nur in RPMI1640 suspendiert.) Die auf LB-Agar ausgestrichenen Bakterien wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Erst nach dieser zweiten Selektion wurde die genomische DNA der überlebenden Bakterien isoliert.
Aus diesen DNA- Lösungen wurden dann mit PCR die Signalsequenzen der Trans- posons amplifiziert. Die so erhaltenen Signalsequenzen wurden mit Hind\\\ restrikti- onsverdaut und die spezifische 40 Bp- Sequenzen über eine Gelfiltration (Sephadex G-100) aufgereinigt. Die aufgereinigten 40 Bp- Sequenzen wurden mit Hilfe einer
Terminalen Transferase am 3'- Ende mit DIG- ddUTP markiert.
Die Signalsequenzen der Donor-Plasmide wurden mit Hilfe der PCR amplifiziert und als Dot- Blots auf Membranen fixiert. Auf diese vorbereiteten Blots wurden die 3'-endmarkierten Signalsequenzen aus dem Phagozytosetest bei 65°C (16h) hybridisiert. Die Häufigkeit der einzelnen Signalsequenzen wurde durch eine Lichtreaktion bestimmt. Die erhaltenen Röntgenfilme wurden gescannt und die Schwärzung (od/mm2) der einzelnen Dots ermittelt. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte in MS- Excel.
Plasmid- rescue Das Plasmid- rescue (AUSUBEL ET AL. 1987-95) ist ein Verfahren, um die flankierende DNA eines inserierten Plasposons in episomal stabile Plasmide zu überführen. Hierzu wurde die genomische DNA eines Transposonmutanten mit einer Restriktionsendonuklease verdaut und die entstehenden Fragmente in einer Selbstligation zu Ringstrukturen überführt. Nur die genomische Sequenz, in die das Plasposon integriert war, besaß einen Replikationsursprung und eine Antibiotikakassette und konnte nach Transformation in E.coli auf einem entsprechenden Selektionsmedium stabil exprimiert werden. Diese Plasmide wurden dann zur Sequenzierung der flankierenden genomischen DNA- Abschnitte des inserierten Transposons verwendet. Die genomische P.aeruginosa- DNA wurde mit Pst\ oder ßc/l / SamHI verdaut und die DNA über eine Phenol /Chloroform-Extraktion mit einer anschließenden Ethanolfällung aufgereinigt. Zur Reaktion wurde die verdaute genomische DNA mit T4- Ligase inkubiert. Die Ligationsansätze wurden in einem Vakuumkonzentrator eingeengt und in E. coli transformiert. Aus den hierbei erhaltenen Plasmiden wurde durch Sequenzierung die flankierende DNA- Sequenz der Transposoninsertion bestimmt.
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Claims

Patentansprüche:
1. Isolierte oder rekombinante Nukleinsäure, gekennzeichnet durch eine der Se- quenzen gemäß Seq. ID 1 , Seq. ID 2 oder Seq. ID 3 oder eine hierzu degenerierte oder modifizierte homologe Sequenz mit entsprechender Funktion, wobei die Modifikationen Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren umfassen, insbesondere Punktmutationen.
2. Protein, welches kodiert wird durch eine Sequenz gemäß Anspruch 1 oder ein hierzu homologes, im wesentlichen funktionsgleiches Protein oder Peptid, insbesondere ein solches mit durch Deletion, Insertion oder Austausch einzelner und/oder mehrerer Aminosäuren, sequenzverlängerndes Anfügen von einzelnen und/oder mehreren Aminosäuren und/oder chemischer Derivatisierung insbe- sondere der terminalen Aminosäuren verbundener Sequenz-Modifikation.
3. Verwendung der Nukleinsäuren oder Nukleotidsequenzen PA0740, PA1104, PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992, PA2591 , PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und/oder PA5415 des Mikroorganismus Pseudomo- nas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa
Community Annotation Project, und/oder der Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen gemäß Anspruch 1 , oder von Fragmenten oder modifizierten Sequenzen der vorstehenden Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen mit entsprechender Funktion, oder der jeweils zugehörigen Pseudomonas aeruginosa- eigenen Proteine, die sämtlich für die Überlebensfähigkeit des Mikroorganismus in Mensch oder Tier wesentlich sind, als Targets für die Entwicklung von Diagnostika zur Identifizierung der Virulenz eines Pseudomonas aeruginosa Stammes.
4. Verwendung der Nukleinsäuren oder Nukleotidsequenzen PA0740, PA1104,
PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992, PA2591 , PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und/oder PA5415 des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa Community Annotation Project, und/oder der Nukleinsäuren oder Nukleinsäure- Sequenzen gemäß Anspruch 1 , oder von Fragmenten oder modifizierten Sequenzen der vorstehenden Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen mit entsprechender Funktion, oder der jeweils zugehörigen Pseudomonas aeruginosa- eigenen Proteine, die sämtlich für die Überlebensfähigkeit des Mikroorganismus 5 in Mensch oder Tier wesentlich sind, als Targets für die Entwicklung von Thera- peutika gegen Pseudomonas aeruginosa Stämme.
5. Verwendung der Nukleinsäuren oder Nukleotidsequenzen PA0740, PA1104, PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992, PA2591 , PA3344,
LO PA4621 , PA5040, PA5349 und/oder PA5415 des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa Community Annotation Project, und/oder der Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen gemäß Anspruch 1 , oder von Fragmenten oder modifizierten Sequenzen der vorstehenden Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen mit ent-
L5 sprechender Funktion, oder der jeweils zugehörigen Pseudomonas aeruginosa- eigenen Proteine, die sämtlich für die Überlebensfähigkeit des Mikroorganismus in Mensch oder Tier wesentlich sind, als Targets für die Entwicklung von Impfstoffen gegen Pseudomonas aeruginosa Stämme.
20
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass anstelle von oder in Verbindung mit PA 1441 die Sequenzen PA1104 und/oder PA1452 verwendet werden.
25 7. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass anstelle der Proteine zu diesen homologe Proteine oder Proteinbruchstücke der Proteine und homologen Varianten verwendet werden, insbesondere solche mit durch Deletion, Insertion oder Austausch einzelner und/oder mehrerer Aminosäuren, sequenzverlängerndes Anfügen von einzelnen und/oder mehreren
3 o Aminosäuren und/oder chemischer Derivatisierung insbesondere der terminalen
Aminosäuren verbundener Sequenz-Modifikation.
8. Antikörper, die gegen durch eine der Nukleinsäuresequenzen PA0740, PA1104, PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992, PA2591 , PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und PA5415 des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa
5 Community Annotation Project, oder gegen Fragmente oder modifizierte Sequenzen der vorstehenden Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen mit entsprechender Funktion, oder gegen ein durch eine der Nukleinsäuresequenzen gemäß Anspruch 1 oder der vorstehenden Sequenzen kodiertes Protein oder wenigstens ein funktionelles Fragment eines solchen Proteins gerichtet sind, L O insbesondere für die Verwendung bei der Bestimmung der Virulenz von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen.
9. Vakzine, enthaltend wenigstens ein durch eine der Nukleinsäuresequenzen PA0740, PA1 104, PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992,
L5 PA2591 , PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und PA5415 des Mikroorganismus
Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa Community Annotation Project, oder der Nukleinsäuresequenzen gemäß Anspruch 1 kodiertes Protein oder wenigstens ein funktionelles Fragment eines der vorgenannten Proteine, oder wenigstens ein auf dem Protein oder
20 funktioneilen Teil des Proteins basierendes Fusionsprotein.
10. Vakzine, enthaltend wenigstens eine der Nukleinsäuren gemäß Sequenzen PA0740, PA1 104, PA1288, PA1322, PA1441 , PA1452, PA1572, PA1992, PA2591 , PA3344, PA4621 , PA5040, PA5349 und PA5415 des Mikroorganismus 5 Pseudomonas aeruginosa, bezeichnet gemäß Nomenklatur des Pseudomonas aeruginosa Community Annotation Project, oder von Fragmenten oder modifizierten Sequenzen der vorstehenden Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen mit entsprechender Funktion, oder der Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 , in modifizierter, in Säugetierzellen ablesbarer Modifikation und in Zuordnung zu ei- 0 nem in Säugetierzellen ablesbaren Promotor.
11. Vakzine gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Gen mit dem zugehörigen Promotor in ein Plasmid ligiert vorliegt.
12. Vakzine gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 , zusätzlich übliche Zusatz- und Hilfsstoffe sowie vorzugsweise wenigstens ein Adjuvans enthaltend.
ML
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