WO2003011355A1 - Endoprothese vasculaire recouverte d'un derive fonctionnalise de dextrane - Google Patents

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WO2003011355A1
WO2003011355A1 PCT/FR2002/002722 FR0202722W WO03011355A1 WO 2003011355 A1 WO2003011355 A1 WO 2003011355A1 FR 0202722 W FR0202722 W FR 0202722W WO 03011355 A1 WO03011355 A1 WO 03011355A1
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WO
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polysaccharide
units
metal substrate
compound
dextran
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/002722
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English (en)
Inventor
Olivier Lefranc
Thierry Avramoglou
Jacqueline Jozefonvicz
Thierry Darnis
Michel Therin
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Sofradim Production
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L33/00—Antithrombogenic treatment of surgical articles, e.g. sutures, catheters, prostheses, or of articles for the manipulation or conditioning of blood; Materials for such treatment
    • A61L33/06—Use of macromolecular materials
    • A61L33/08—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/04—Macromolecular materials
    • A61L31/042—Polysaccharides

Definitions

  • the present invention relates to the field of metal stents and more particularly to stents used in the treatment of stenosing diseases.
  • the different surface modifications can in certain cases improve the in vivo behavior of the stents but are not sufficient to date.
  • Metallic prostheses are known from EP-B-716836, including stents for angioplasty which are coated with a polymer film 30 allowing the in situ delivery, by biodegradation of the polymer, of pharmaceutical active ingredients.
  • WO-A-9746590 may also be cited, the immobilization of bioactive substances allowing the modification of the properties of polymers on the surface of which this immobilization is carried out, for example to give them antithrombotic properties and in addition to make their surface hydrophilic; these polymers are used for the manufacture of vascular prostheses, for example in expanded PTFE.
  • D represents a polysaccharide chain, constituted by sequences of ⁇ -D-glucopyranosic units linked together by ⁇ (1-6) bonds,
  • MC represents methylcarboxylate groups
  • B represents carboxymethylbenzylamide groups
  • Su represents sulphate groups
  • S represents sulphonate groups
  • dextran derivatives which include, statistically:
  • units B consisting of oside units A substituted by radicals having a carboxyl function corresponding to the structure -O- (CH 2 ) n -R-COO ⁇ in which R represents a single bond or a group -CO-NH- (CH 2 ) n , n being a number between 1 and 10 and n 'being between 1 and 7.
  • R2 represents an anion of a physiologically tolerable mineral or organic salt
  • Ri represents a single bond, a group -CH 2 - or a group:
  • dextran derivatives with a molecular weight greater than about 5000 g / mol, having a strong anti-complementary activity and a weak anti-coagulant activity, which comprise units A and C and at least 35% of units B, these units being as defined above in patent EP-A-0146455.
  • the presence of functionalized derivatives of dextran on the surface of the endoprosthesis makes it possible to develop on the surface of the latter specific interactions with the biological medium in which it is implanted; in particular, there is an inhibition of the proliferation of human smooth muscle cells and a proliferation of endothelial cells in contact with the endoprosthesis, a process which promotes the integration of the endoprosthesis in the biological environment.
  • the functionalized derivatives of dextran and the functionalized polysaccharides described above may exhibit anti-complementary and blood plasma substitute activities, an activity which modulates cell proliferation. smooth and endothelial muscles or anticoagulant properties or an action against platelets.
  • the aim of the present invention is therefore to confer on a metallic substrate, which can be used as a stent, for example a stent, biological properties of interest, taking into account the application or indication of said prosthesis, and this in a completely integrated manner.
  • the metallic and permanent substrate that is to say without modifying the intrinsic mechanical properties of said substrate on the one hand, and by permanently fixing on this substrate the active agents or compounds selected to exhibit the abovementioned biological properties, on the other hand.
  • a first object of the present invention therefore consists of a method of coating and bonding the surface of a metal substrate with a layer of a polysaccharide compound, characterized in that from the metal substrate:
  • a chemical modification agent is available on the surface of the metal substrate, for example in liquid form;
  • an intermediate covering agent is available, comprising a silane compound, in solution for example, comprising two reactive residues, one with the metal substrate, and the other, directly or indirectly with the polysaccharide compound;
  • a coating agent is available, comprising, in solution for example, the polysaccharide compound; and the following operations are carried out: (1) contacting the surface of the metal substrate with the chemical modifying agent to obtain a chemically modified surface;
  • the intermediate layer is brought into contact with the coating agent, to coat said intermediate layer with a coating comprising the polysaccharide compound covalently bonded, directly or indirectly, to the silane compound.
  • step (3) of bringing the intermediate layer into contact with the coating agent can be repeated to improve the thickness of the coating layer comprising the polysaccharide compound covalently bonded, directly or indirectly, to the silane compound.
  • the metal substrate obtained in step (2) of the method can be isolated, the method according to the invention thus consists of a method of coating and bonding the surface of a metal substrate with a layer of a intermediate covering agent comprising a silane compound, characterized in that, starting from the metal substrate: (a) an agent for chemical modification of the surface of the metal substrate is available, for example in liquid form; (b) an intermediate covering agent is available, comprising a silane compound, comprising at least one reactive residue with the metal substrate, and the following operations are carried out:
  • Another object of the present invention is a metallic object for medical or surgical use, of the prosthesis type, for example vascular endoprosthesis (called “stent”) for percutaneous transluminal coronary angioplasty, comprising a metal substrate whose surface is coated at least in part.
  • prosthesis for example vascular endoprosthesis (called "stent") for percutaneous transluminal coronary angioplasty, comprising a metal substrate whose surface is coated at least in part.
  • polysaccharide compound characterized in that the polysaccharide compound is covalently linked to the metal substrate, by means of grafting arms, each comprising at least one silane unit, linked on one side to the metal substrate by a metal bond - O-, and on the other side, directly or indirectly, by covalent bond -NH-, with the polysaccharide compound.
  • Another object of the invention is a metallic object for medical or surgical use, of the prosthesis type, for example vascular stent (called “stent”) for percutaneous transluminal coronary angioplasty, comprising a metal substrate whose surface is coated at least in part a covering agent comprising a silane compound, characterized in that the silane compound, is bonded to the metal substrate by a metal-O- bond.
  • vascular stent for percutaneous transluminal coronary angioplasty
  • the polysaccharide compounds lend themselves well to grafting onto a metal substrate, if an at least bifunctionalized silane compound is used, and the intrinsic biological properties of the polysaccharide compounds are not altered by the grafting.
  • the invention makes it possible to obtain a metallic object for medical or surgical use, of the prosthesis type, for example a stent (so-called "stent") for percutaneous transluminal coronary angioplasty, which has the advantage of retaining all its mechanical properties, which triggers a favorable biological response or, at a minimum, does not trigger an unfavorable biological response, in the recipient subject and therefore limits restenosis.
  • a stent for percutaneous transluminal coronary angioplasty
  • the method allows the conservation of the biological properties of the polysaccharide compound used by said method and the polysaccharide compound retains its intrinsic biological properties after deposition.
  • intrinsic biological properties is understood to mean the abovementioned biological activities and in particular anti-complementary and blood plasma substitute activities, an activity which modulates the proliferation of smooth and endothelial muscle cells or also anticoagulant properties or an action with regard to platelets.
  • Objects or stents subjected to the process according to the invention also have the characteristic that they do not cause the diffusion in the body of toxic products.
  • a metal substrate according to the invention is a support, the surface of which is intended to receive the coating according to the invention, made of metal or the surface of which is coated with a metal or an alloy such as stainless steels, alloys based on chromium and cobalt or even super alloys.
  • metal according to the invention is intended to mean any material consisting of a simple body which is a good conductor of heat and electricity, having a high reflecting power in the polished state, and giving oxides which react with water to give bases like iron, cobalt, chromium.
  • alloy means any homogeneous metallic product obtained by the association of several metals with a clear predominance of one of them, with a view to imparting to the latter specific characteristics.
  • silane compound means organic compounds chosen from silane derivatives having the general formula SinH 2 n +2, one or more hydrogen atoms of which have been substituted by conventional organic functions such as alkyl groups, alkoxy groups , amines or other organic functions.
  • derivative of a silane comprising one or more reactive functions means a compound comprising, one or more amino groups or derivatives of amines capable of entering into reaction with the hydroxyl groups of the sugar compounds, and comprising one or more hydroxyl groups or alkoxy capable of reacting, either directly or after hydrolysis with the metal constituting the metal substrate, for example the compounds chosen from the group consisting of aminopropylsilanes and aminobutylsilanes.
  • polysaccharide compound according to the invention is meant any polymer, natural or synthetic, comprising a polymer chain consisting of a multiplicity of osidic units, namely any polysaccharide, unmodified and / or nonfunctionalized, or any functionalized polysaccharide derivative.
  • polysaccharide compound means polysaccharide derivatives comprising osidic units comprising hydroxyl functions substituted by groups such as, for example, methylcarboxylate groups, carboxymethylbenzylamide groups, sulphate groups, sulphonate groups, or in which the hydroxyl functions have been substituted by chains comprising carboxyl functions, amide functions, benzyl groups alone or in combination.
  • polysaccharide compounds will be chosen from the compounds of general formula DMC a BbSu c Sd in which:
  • D represents a polysaccharide chain, constituted by sequences of ⁇ -D-glucopyranosic units linked together by ⁇ (1-6) bonds,
  • MC represents methylcarboxylate groups
  • Su represents sulphate groups
  • S represents sulphonate groups
  • a, b, ç and d represent the degree of substitution (ds), expressed relative to the number of free hydroxyl functions in a glucoside unit of dextran, respectively in MC groups
  • B, Su and S a being equal to 0 or> to 0.2
  • b being equal to 0 or ⁇ to 0.1
  • ç being equal to 0 or ⁇ to 0.1
  • polysaccharide compounds can be chosen from dextran derivatives which include, in a statistical manner:
  • units B consisting of oside units A substituted by radicals having a carboxyl function corresponding to the structure -0- (CH 2 ) n -R-COO " in which R represents a single bond or a group - CO-NH- (CH 2 ) n " , n being a number between 1 and 10 and n 'being between 1 and 7.
  • R2 represents an anion of a physiologically tolerable inorganic or organic salt
  • Ri represents a single bond, a group -CH 2 - or a group:
  • the polysaccharide compounds may be chosen from dextran derivatives, having a molecular weight greater than approximately 5000 g / mol, consisting statistically of units A, B and C, the units A being oside units of dextrans, the units B and C being as defined above, which comprise units A and C and at least 35% of units B.
  • the polysaccharide chain of the polysaccharide compound is that of a polysaccharide chosen from the group consisting of starch, glycogen, celluloses, dextrans, poly- ⁇ -1, 3-glucans, poly - ⁇ -1, 6-glucans, pullulans, chitin, chitosan, arabans, xylans, fucans, and pectins, when the polysaccharide chain of the polysaccharide compound is that of a dextran, it comprises a multiplicity of ⁇ -D-glucopyranosic units linked together by ⁇ (1-6) bonds.
  • the polysaccharide compound is a natural or synthetic polysaccharide, unmodified, in particular not functionalized.
  • the chemically modified surface is cleaned before being brought into contact with the intermediate covering agent, for example with a solution of acetone, or alcohol, and / or surfactants.
  • the metal substrate whose surface is coated with the intermediate covering agent is annealed, before being brought into contact with the coating agent, this annealing is carried out at a temperature of between 80 and 140 ° C. approximately, and / or for a period of between 1 and 30 minutes approximately.
  • This annealing allows the silane derivative molecule to be turned over, so that it has a free amine function capable of reacting with the compounds comprising the hydroxyl groups.
  • this reversal can be illustrated for the 3-aminopropyltriethoxysilane ( ⁇ -APS) molecule as follows:
  • the coated surfaces can be washed, in particular the surface coated with the intermediate layer is washed, before contacting with the coating agent, and the surface coated with the polysaccharide compound is washed.
  • operation (1) and / or (2) is carried out in the liquid or vapor phase and when operation (2) is carried out in the liquid phase, it is carried out at a pH understood between 2 and 9, and / or at a temperature of between 25 and 120 ° C approximately, and / or for a duration of between 1 and 120 minutes approximately.
  • operation (2) is carried out in the vapor phase it is carried out at a temperature above 120 ° C and at a pressure above 4 mbar.
  • the silane derivative molecule When operation (2) is thus carried out in the vapor phase, the silane derivative molecule has a free amine function capable of reacting with the compounds comprising the hydroxyl groups to form a covalent bond, the annealing step is therefore immediate and consecutive. grafting and will not require an additional process step.
  • the chemical agent for modifying the surface of the metal substrate, in liquid form comprises at least one strong mineral acid, for example sulfuric acid, or hydrochloric acid, or nitric acid in the proportion of between 5 and 100% (VV), and at minus a chromium oxide in the proportion between 1 and 40% (m / V); preferably the pH of this chemical modifying agent is between 1 and 6.
  • Chromium oxide has an average molar mass of between 50 and 500 g / mol, and is, for example, chosen from the group consisting of potassium dichromates and chromium IV oxides.
  • the intermediate covering agent in the liquid state, comprises at most 50%, for example between 1 and 30% (V / V) of the silane compound.
  • the silane compound has an average molar mass of between 50 and 500 g / mol, it is chosen from the group consisting of aminopropylsilanes and aminobutylsilanes.
  • the coating agent in the liquid state, comprises between 1 and 20% (m / V) of the polysaccharide compound, in solution, it comprises an unmodified or non-functionalized polysaccharide, for example a dextran, and / or a derivative functionalized polysaccharide, capable of being obtained from a polysaccharide, for example a dextran.
  • the polysaccharide is a dextran
  • its average molar mass is between 20,000 and 1,000,000 g / mol, for example its molar mass is equal to 40,000 or 70,000, or 460,000 g / mol.
  • the coating agent comprises at least one coupling agent, for example chosen from the group consisting of bio-sulfo (succinimide-suberate), abbreviated to BS3, dimethyladipimidate, abbreviated to DMA, epoxirane, bis-epoxirane , succinimides, epichlorydrine, carbodiimides, such as for example
  • the coupling agent is present, in the coating agent, in a proportion of 20 to 50 moles per 100 moles of the osidic motif of the polysaccharide chain.
  • the coating agent can comprise an additional polysaccharide, natural or synthetic, substituted by carboxylate and / or sulfate functions, said additional polysaccharide being different from said functionalized polysaccharide derivative.
  • the present invention also relates to the coated metal substrate, capable of being obtained by the method described above and a stent, of stent type, comprising this coated metal substrate, the constituent material of which is an alloy, for example a stainless steel. , or a superalloy, for example phynox.
  • FIG. 1 schematically shows the structure of a functionalized derivative of dextran substituted by the different chemical groups MC, B, Su and S fixed su the glucosidic units D; by way of example, the position of the substituent on the various carbons of the glucosidic units is presented on carbon 2;
  • FIG. 2 shows the curves of inhibition of the proliferation of smooth muscle cells from rat aorta, after 5 days of incubation, according to the different functionalized derivatives of dextran.
  • EXAMPLE 1 Preparation of models for stainless steel stents according to the present invention, cleaning, oxidation and amination of the surface.
  • the support used consists of polished 316L stainless steel pegs with a diameter of 8 mm and a thickness of 3 mm supplied by the company Sofradim.
  • pins serve as a model for the stents themselves made of 316L stainless steel.
  • 316L stainless steel is an austenitic steel type 18/12 (Chromium / Nickel content), with CFC structure meeting European standards NF S 90 401, NF S 90 402, NF S 90 403 and NF S 94 051.
  • Cleaning solutions are solutions of hot acetone and ethanol.
  • the oxidizing solution is a sulfochromic mixture.
  • the silane compound is ⁇ -APS (3-aminopropyl) triethoxysilane. This compound fixes on the hydroxyl functions of the surface and makes it possible to obtain the apparent amino functions.
  • the 316L stainless steel pieces are subjected to sonication in acetone for 10 min and then placed for 10 min in an ethanol solution at 70 ° C. This step allows the removal of surfactants for cleaning.
  • a solution of ⁇ -APS at 10% (V / v) in 95 ° ethanol is prepared and left stirring for 1 hour in order to hydrolyze the ethoxy functions and to allow grafting onto hydroxyl functions.
  • the oxidation solution is a 2.7% (M / V) sulfochromic solution of potassium dichromate in 80% sulfuric acid.
  • the cleaned steel pins are placed in the oxidation solution and left for 1 hour with gentle stirring.
  • the oxidized pions are then rinsed in double distilled water, 5 minutes under sonication.
  • the pions thus recovered are then placed in the ⁇ -APS solution and left for 1 hour with gentle stirring.
  • the pions subjected to ⁇ -APS are then annealed to allow the ⁇ -APS molecule to be turned over according to the reaction illustrated above.
  • the aqueous phase is carefully removed using a pipette without coming into contact with the steel pins, then the container containing the pins is placed
  • This annealing step allows the ⁇ -APS to be fixed to the surface of the pins.
  • the pawns are finally rinsed with double distilled water and stored at 50 ° C.
  • the support used consists of polished-mirror Phynox pawns with a diameter of 10 mm and a thickness of 4 mm supplied by the company Sofradim.
  • pins serve as a model for the stents themselves in phynox.
  • Phynox is a cobalt-based superalloy whose resistance to oxidation is much better than that of stainless steels. Phynox meets the requirements of standards ASTM F-91 and ISO 5832/7 and NF
  • Cleaning solutions are solutions of hot acetone and ethanol.
  • the oxidizing solution is a sulfochromic mixture.
  • the silane compound is ⁇ -APS (3 aminopropyltriethoxysilane). This compound fixes on the hydroxyl functions of the surface and makes it possible to obtain the apparent amino functions.
  • the phynox pions are subjected to sonication in acetone for 10 min and then placed for 10 min in an ethanol solution at 70 ° C. This step eliminates the surfactants used for cleaning.
  • a solution of 10% ⁇ -APS (V / V) in 95 ° ethanol is prepared and left stirring for 1 hour in order to hydrolyze the ethoxy functions and to allow grafting onto hydroxyl functions.
  • the oxidation solution is a 2.7% (m / V) sulfochromic solution of potassium dichromate in 80% sulfuric acid.
  • the cleaned steel pins are placed in the oxidation solution and left for 1 hour with gentle stirring.
  • the oxidized pions are then rinsed in double distilled water, 5 minutes under sonication.
  • the pions thus recovered are then placed in the ⁇ -APS solution and left for 1 hour with gentle stirring.
  • the pions subjected to ⁇ -APS are then annealed to allow the ⁇ -APS molecule to be turned over according to the reaction illustrated above.
  • aqueous phase is carefully removed using a pipette without coming into contact with the steel pins, then the container containing the pins is placed
  • This annealing step allows the ⁇ -APS to be fixed to the surface of the pins.
  • the pawns are then rinsed with double distilled water and stored at 50 ° C.
  • EXAMPLE 3 Preparation of metal objects for stents with amination of the surface in the vapor phase.
  • the system consists of two enclosures separated by a tap.
  • the enclosure intended to accommodate the ⁇ -APS is connected to a bulb with bromine.
  • the metallic objects previously subjected to an oxidation as described in the protocols of Examples 1 or 2, are placed in an enclosure under low pressure (8 mbar) and brought to 120 ° C. by a heating tape.
  • the ⁇ -APS in 10% V / V solution in pure ethanol is introduced into the dropping funnel, then injected into one of the two chambers previously brought to 140 ° C under a pressure of 8 mbar.
  • the ⁇ -APS is immediately vaporized.
  • the chambers are then brought into contact under a pressure of 8 mbar and the gaseous ⁇ -APS is then brought into contact with the metal object.
  • the grafting is immediate and this grafting is carried out covalently since the metal substrate is brought to a temperature of 120 ° C. the annealing step is immediate.
  • the analysis methods used are XPS (X-Photoelectron Spectroscopy) and AFM (Atomic Force Microscope).
  • Protocol 2 Protocol The XPS device used is an Escalab 210, using as a monochromatic source the K ⁇ line of aluminum of energy 1486 eV under ultra-high vacuum. This device analyzes a surface of 3 mm 2 (3 mm.lmm) over a depth of 10 nm.
  • AFM is used in semi-contact mode on the surface of steel pins.
  • test used is an indirect measurement test based on the toxicity of the products diffused or "released" by the modified pions. This test follows the international standard ISO 10 993-5, concerning the biological evaluation of medical devices.
  • the supports used are 24-well cell culture plates sold by Corning Costar.
  • the cells used are immortalized human endothelial cells of the EAhy 926 line in the exponential growth phase seeded at 5000 cells / well.
  • the extraction vehicle as well as the negative control, is a culture medium at 10% (VA /) in fetal calf serum (SVF).
  • the positive control is a solution of DMSO at 1% (V / V) in culture medium.
  • the samples used are raw 316L stainless steel pins, oxidized and aminated by the methods described above.
  • Metal support, dextran and coupling agents used are identical to those described in Example 4.
  • the coupling agents used are EDAC and NHS, sold by Sigma-AIdrich.
  • the functionalized derivative of dextran used is DMC 0 , 8B 0 , 22Suo, ⁇ ; it meets the general formula DMC a B b Su c S d such as that previously described. Its preparation protocol is as described in the patent
  • EDAC is added at 13% (m ⁇ ) to the solution and left for 5 minutes with stirring.
  • the second NHS coupling agent is added at 6% (m / V) and left stirring for 30 minutes.
  • the steel pins are introduced into 1 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2, to which the solution described above is added.
  • the pH is reduced to 8.
  • the reaction continues for 24 hours then the pions are rinsed with double distilled water.
  • the pawns are then stored at 50 ° C in the vacuum oven.
  • EXAMPLE 7 Grafting of a functionalized derivative of dextran on an amino metal surface.
  • the support, the coupling agents and the protocol are identical to those described in Example 6.
  • the functionalized dextran derivative used is DMCo, 68Bn, 34 u 0 , i2; it corresponds to the general formula DMC a BbSu c Sd such as that previously described.
  • EXAMPLE 8 Grafting of a functionalized derivative of dextran on an amino metal surface.
  • the support, the coupling agents and the protocol are identical to those described in Example 6.
  • the functionalized dextran derivative used is DMC 0, 6BO, 45Su 0 65 average molar mass of 100 000 g / mol; it corresponds to the general formula DMC a BbSu c Sd such as that previously described.
  • EXAMPLE 9 Grafting of a functionalized derivative of dextran on an aminated metal surface.
  • the support, the coupling agents and the protocol are identical to those described in Example 6.
  • the functionalized dextran derivative used is the DMCO, 6iBn, 39Su 0, 2 3; it meets the general formula DMC a B b Su c S d such as that previously described.
  • This test is a direct measurement of the adhesion and the proliferation of endothelial cells of the EAhy 926 line, already described previously. This test complies with international standard ISO 10 993-5, concerning the biological evaluation of medical devices.
  • the supports used are 316L stainless steel pins on which surface modifications have been made.
  • control supports are wells from the 24-well cell culture plates sold by Corning Costar.
  • the culture medium used is culture medium at 10% (V / V) in fetal calf serum (SVF).
  • the pions used are crude, amino pions covered with the functionalized derivative of dextran (DMCO, 8Bo, 22Suo, n) previously described.
  • the DMCBSu is grafted onto 316 L stainless steel pins. 8 pins are prepared in order to carry out cell adhesion measurements and to assess their growth as a function of the support. 8 control pawns are added to the test as well as 8 blank wells of sterile 24 well plates from Corning Costar.
  • the grafted pions and the crude pions are sterilized at the bottom of the well for 40 min in 70 ° ethanol. They are then rinsed twice with sterile PBS and then passive with culture medium (10% FCS) for 3 days.
  • the cells are seeded at 25,000 cells per well per pawn.
  • Two pawns are removed and analyzed at 24 h, 48 h, 72 h and 7 days.
  • the analysis is carried out as previously, by detaching the adherent cells from the pawns and counting with a coulter.
  • the results of the test are given in Table 2. The results were reduced to the number of cells per cm 2 .
  • the surface of a pawn face of 316L stainless steel measures a quarter of that of a well bottom (2 cm 2 ). It was considered that the cells initially adhered twice as much to the pawn as on the well because they were deposited on the pawn then immersed in the medium.
  • the main agents of this biological test are identical to those of Example 10. Unlike Example 10, the functionalized derivative of dextran is DMCo, 68Bo, 34Su 0 , i2-
  • the cells were seeded at a density of 75,000 cells per well per pion. Only one measurement was made after 5 days of incubation.
  • the different intermediate pions have little influence on the adhesion of endothelial cells.
  • the functionalized derivative of dextran grafted on the surface of the pawn inhibits the adhesion of EAhy 926 cells.
  • the functionalized derivatives of dextran have effects on the activation of the complement and on the platelet activation which are the subject of measurements.
  • Example 10 The principal agents of this bioassay are identical to those of Example 10.
  • the functionalised dextran derivative is the DMCO, 6BO, 45Su 0, 65- Cells were seeded at a density 10,000 endothelial cells per well per pawn and 15,000 smooth muscle cells per well per pawn.
  • EXAMPLE 13 Preparation of stents according to the present invention, cleaning, oxidation, surface amination and grafting of functionalized derivatives of dextran.
  • the support used consists of stents, expandable by balloon, of 316L stainless steel supplied by the company Sofradim.
  • 316L stainless steel is an austenitic steel type 18/12 (Chromium / Nickel content), with CFC structure meeting European standards NF S 90 401, NF S 90 402, NF S 90 403 and NF S 94 051.
  • Cleaning solutions are solutions of hot acetone and ethanol.
  • the oxidizing solution is a sulfochromic mixture.
  • the silane derivative is ⁇ -APS (3-aminopropyltriethoxysilane). This compound fixes on the hydroxyl functions of the surface and makes it possible to obtain the apparent amino functions.
  • the functionalized derivatives of dextran used are:
  • the 316L stainless steel stents are subjected to sonication in acetone for 10 min and then placed for 10 min in an ethanol solution at 70 ° C. This This step removes traces of surfactants that could have remained on the surface after cleaning.
  • a solution of 10% ⁇ -APS (VA /) in 95 ° ethanol is prepared and left stirring for 1 hour in order to hydrolyze the ethoxy functions and to allow grafting onto hydroxyl functions.
  • the oxidation solution is a 2.7% o (m / V) sulfochromic solution of potassium dichromate in 80% sulfuric acid.
  • the cleaned steel stents are placed in the oxidation solution and left for 1 hour with gentle stirring.
  • the oxidized stents are then rinsed in double distilled water, 5 minutes under sonication.
  • the stents thus recovered are then placed in the solution of silane derivatives and left for 1 hour with gentle stirring.
  • the stents subjected to ⁇ -APS are then annealed to allow the ⁇ -APS molecule to be turned over according to the reaction illustrated above.
  • the aqueous phase is carefully removed using a pipette without coming into contact with the steel stents and then the container containing the stents is placed for 10 minutes at 120 ° C.
  • the stents are then rinsed with double distilled water.
  • DMCBSu solutions such as those described above, at 16% o (m / V) are prepared in a 0.01 M MES buffer, pH 3.5.
  • the EDAC coupling agent is added at 13%) (m / V) to the solution and left stirring for 5 minutes.
  • the second NHS coupling agent is added at 6% (m / V) and left stirring for 30 minutes.
  • the stents are introduced into 1 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2 to which the solution described above is added.
  • the pH is reduced to 8.
  • the reaction is left 24 hours then the stents are rinsed with double distilled water. The stents are then stored at 50 ° C. in the vacuum oven.
  • This grafting step can be carried out several times to improve the thickness of the active layer.
  • Scanning electronics have shown, on all surfaces, a homogeneous covering of ⁇ -APS with a thickness greater than 10 nm as well as the homogeneous presence of the chemical groups characteristic of the functionalized derivatives of dextran used.

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Abstract

Objet métallique ô usage médical ou chirurgical, du type prothèse, par exemple endoprothèse vasculaire (dite "stent") pour angioplastie coronarienne transluminale percutanée, comprenant un substrat métallique dont la surface est revêtue au moins en partie avec un composé polysaccharidique, caractérisé en ce que le composé polysaccharide est lié par covalence au substrat métallique, par l'intermédiaire d'une multiplicité de bras de greffage, comprenant chacun au moins un motif silanique, lié d'un côté au substrat métallique par une liaison métal-O-, et de l'autre côté, directement ou indirectement, par une liaison covalente -NH-, avec le composé polysaccharidique.

Description

ENDOPROTHESE VASCULAIRE RECOUVERTE D ' UN DERIVE FONCTIONNALISE DE DEXTRANE
La présente invention a trait au domaine des endoprohèses 5 métalliques et plus particulièrement aux stents utilisés dans le traitement des maladies sténosantes.
L'utilisation des stents s'est considérablement accrue depuis ces cinq dernières années et représente, aujourd'hui, la large majorité des angioplasties coronariennes transluminales percutanées. 10 Avant l'utilisation des stents, trois quarts ou plus, des patients ayant subi une angioplastie coronarienne transluminale percutanée étaient sujets à la resténose et nécessitaient une réintervention.
L'utilisation des stents a considérablement réduit ce pourcentage. Toutefois, un taux de resténose important (environ 30%) subsiste malgré 15 l'utilisation de tels implants.
Pour rendre ces endoprothèses métalliques plus efficaces et mieux tolérées, leur surface peut être modifiée, par le biais de traitements chimiques ou radioactifs, et/ou recouverte de substances d'origines biologiques (héparine, phosphorylcholine, ADN), de polymères (silicones, polyuréthannes, 20 polytétrafluoroéthylene expansé) ou des céramiques (Ti02, C...). D'autres endoprothèses sont constituées de carbone et même de matériaux biodégradables.
Les différentes modifications de surface peuvent dans certains cas améliorer le comportement in vivo des stents mais ne suffisent pas à ce jour à
25 prévenir des complications telles que la resténose. Par ailleurs, un certain nombre d'entre elles peuvent conduire à une dégradation substantielle des propriétés mécaniques du stent sur lequel elles sont appliquées.
On connaît de EP-B-716836 des prothèses métalliques, dont des endoprothèses pour angioplastie qui sont enrobées d'un film de polymère 30 permettant la délivrance in-situ, par biodégradation du polymère, de principes actifs pharmaceutiques.
De FR-A-2785812 on connaît l'immobilisation sur une surface d'endoprothèse métallique, par dépôt par électropolymérisation, de polymères acryliques, qui permettrait ensuite la fixation et la diffusion de principes actifs.
35 Aucun exemple de fixation de principe actif et de diffusion en conservant les propriétés biologiques du principe actif n'est mentionné dans ce brevet. Dans ces deux brevets, outre le fait que les principes actifs pharmaceutiques seraient nécessairement libérés pour avoir une activité biologique, les polymères qui permettent leur fixation sont déposés en couches sur des surfaces métalliques, ces couches pouvant présenter, comme exposé précédemment, un risque de délamination. De plus du fait de la biodégradabilité du polymère et de la diffusion du principe actif, les effets biologiques sont nécessairement limités dans le temps.
On citera également de WO-A-9746590, l'immobilisation de substances bioactives permettant la modification des propriétés de polymères sur la surface desquels cette immobilisation est effectuée, par exemple pour leur conférer des propriétés antithrombotiques et en outre rendre leur surface hydrophile ; ces polymères sont utilisés pour la fabrication de prothèses vasculaires par exemple en PTFE expansé.
On connaît de WO 99/29734 ou de l'article • de D.
Logeart-Avramoglou et J. Jozefonvicz paru dans J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Biomater) 48, 578-590, 1999 des dérivés de dextrane fonctionnalisés qui répondent à la formule générale DMCaBbSucSd dans laquelle :
D représente une chaîne polysaccharidique, constituée par des enchaînements d'unités α-D-glucopyranosiques reliées entre elles par des liaisons α(1-6),
MC représente des groupes méthylcarboxylates, B représente des groupes carboxyméthylbenzylamides, Su représente des groupes sulfates, S représente des groupes sulfonates, et a, b. Ç st d représentent le degré de substitution (ds), exprimé par rapport au nombre de fonctions hydroxyles libres dans une unité glucosidique du dextrane, respectivement en groupements MC, B, Su et S, a étant égal à 0 ou > à 0,2, b étant égal à 0 ou ≥ à 0,1 , ç étant égal à 0 ou ≥ à 0,1 et d étant égal à 0 ou < à 0,15, à condition que lorsque d=0, a et/ou b soient ≠ 0.
On connaît également de EP-A-146455, des dérivés de dextrane qui comportent de manière statistique :
- au moins 35% environ de motifs B constitués de motifs osides A substitués par des radicaux possédant une fonction carboxyle répondant a la structure -O-(CH2)n-R-COO~ dans laquelle R représente une simple liaison ou un groupe -CO-NH-(CH2)n , n étant un nombre compris entre 1 et 10 et n' étant compris entre 1 et 7.
- au moins 3% environ de motifs D, c'est à dire de motifs osides A substitués par une chaîne comportant un groupe de structure :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle n est défini ci-dessus, R2 représente un anion d'un sel minéral ou organique physiologiquement tolérable, et Ri représente une simple liaison, un groupe -CH2- ou un groupe :
— CH — CH2
COO-
- éventuellement, des motifs osides A non substitués et/ou des motifs C constitués de motifs A substitués par des radicaux de structure suivante, dans laquelle Ri et n sont tels que définis ci-dessus :
Figure imgf000004_0002
On connaît également de EP-A-0428182, des dérivés de dextrane d'un poids moléculaire supérieur à environ 5000 g/mol, dotés d'une forte activité anti-complémentaire et d'une activité anti-coagulante faible, qui comprennent des motifs A et C et au moins 35% de motifs B, ces motifs étant tels que définis ci-dessus dans le brevet EP-A-0146455. La présence de dérivés fonctionnalisés de dextrane à la surface de l'endoprothèse permet de développer sur la surface de cette dernière des interactions spécifiques avec le milieu biologique dans lequel elle est implantée ; on observe notamment une inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses humaines et une prolifération des cellules endothéliales au contact de l'endoprothèse, processus qui favorise l'intégration de l'endoprothèse dans le milieu biologique.
En outre, en fonction de leurs degrés de substitution en différents groupements fonctionnalisés, les dérivés fonctionnalisés de dextrane et les polysaccharides fonctionnalisés décrits ci-dessus peuvent présenter des activités anti-complémentaires et de substitut de plasma sanguin, une activité modulatrice de la prolifération des cellules musculaires lisses et endothéliales ou encore des propriétés anticoagulantes ou une action vis-à-vis des plaquettes. Le but de la présente invention est donc de conférer à un substrat métallique, pouvant être utilisé comme endoprothèse, par exemple stent, des propriétés biologiques d'intérêt, compte tenu de l'application ou indication de ladite prothèse, et ce de manière complètement intégrée au substrat métallique et permanente, c'est à dire sans modifier les propriétés mécaniques intrinsèques dudit substrat d'une part, et en fixant définitivement sur ce substrat les agents ou composés actifs retenus pour exhiber les propriétés biologiques précitées, d'autre part.
Un premier objet de la présente invention consiste donc en un procédé de revêtement et liaison de la surface d'un substrat métallique avec une couche d'un composé polysaccharidique, caractérisé en ce que à partir du substrat métallique :
(a) on dispose d'un agent de modification chimique de la surface du substrat métallique, par exemple sous forme liquide ; (b) on dispose d'un agent de recouvrement intermédiaire, comprenant un composé silanique, en solution par exemple, comportant deux restes réactifs, l'un avec le substrat métallique, et l'autre, directement ou indirectement avec le composé polysaccharidique ; (c) on dispose d'un agent de revêtement, comprenant, en solution par exemple, le composé polysaccharidique ; et on effectue les opérations suivantes : (1 ) on met en contact la surface du substrat métallique, avec l'agent de modification chimique, pour obtenir une surface modifiée chimiquement ;
(2) on met en contact la surface modifiée chimiquement avec l'agent de recouvrement intermédiaire, pour obtenir une surface revêtue avec une couche intermédiaire comprenant le composé silanique, lié par covalence au substrat métallique ;
(3) on met en contact la couche intermédiaire avec l'agent de revêtement, pour revêtir ladite couche intermédiaire avec un revêtement comprenant le composé polysaccharidique lié par covalence, directement ou indirectement, au composé silanique.
Selon l'invention l'étape (3) de mise en contact de la couche intermédiaire avec l'agent de revêtement peut être répétée pour améliorer l'épaisseur de la couche de revêtement comprenant le composé polysaccharidique lié par covalence, directement ou indirectement, au composé silanique.
Selon l'invention le substrat métallique obtenu à l'étape (2) du procédé peut être isolé, le procédé selon l'invention consiste ainsi en un procédé de revêtement et liaison de la surface d'un substrat métallique avec une couche d'un agent de recouvrement intermédiaire comprenant un composé silanique, caractérisé en ce que à partir du substrat métallique : (a) on dispose d'un agent de modification chimique de la surface du substrat métallique, par exemple sous forme liquide ; (b) on dispose d'un agent de recouvrement intermédiaire, comprenant un composé silanique, comportant au moins un reste réactif avec le substrat métallique, et on effectue les opérations suivantes :
(1) on met en contact la surface du substrat métallique, avec l'agent de modification chimique, pour obtenir une surface modifiée chimiquement ;
(2) on met en contact la surface modifiée chimiquement avec l'agent de recouvrement intermédiaire, pour obtenir une surface revêtue avec une couche comprenant le composé silanique, lié par covalence au substrat métallique. Un autre objet de la présente invention est un objet métallique à usage médical ou chirurgical, du type prothèse, par exemple endoprothèse vasculaire (dite "stent") pour angioplastie coronarienne transluminale percutanée, comprenant un substrat métallique dont la surface est revêtue au moins en partie avec un composé polysaccharidique, caractérisé en ce que le composé polysaccharidique est lié par covalence au substrat métallique, par l'intermédiaire de bras de greffage, comprenant chacun au moins un motif silanique, lié d'un côté au substrat métallique par une liaison métal -O-, et de l'autre côté, directement ou indirectement, par liaison covalente -NH-, avec le composé polysaccharidique.
Un autre objet de l'invention est un objet métallique à usage médical ou chirurgical, du type prothèse, par exemple endoprothèse vasculaire (dite "stent") pour angioplastie coronarienne transluminale percutanée, comprenant un substrat métallique dont la surface est revêtue au moins en partie un agent de recouvrement comportant un composé silanique, caractérisé en ce que le composé silanique, est lié au substrat métallique par une liaison métal-O-.
Selon l'invention, les composés polysaccharidiques se prêtent bien à un greffage sur un substrat métallique, si l'on utilise un composé silanique au moins bifonctionnalisé, et les propriétés biologiques intrinsèques des composés polysaccharidiques ne sont pas altérées par le greffage. Ainsi l'invention permet d'obtenir un objet métallique à usage médical ou chirurgical, du type prothèse, par exemple endoprothèse vasculaire (dite "stent") pour angioplastie coronarienne transluminale percutanée, qui présente l'avantage, de conserver toutes ses propriétés mécaniques, qui déclenche une réponse biologique favorable ou, au minimum, ne déclenche pas de réponse biologique défavorable, chez le sujet receveur et donc limite la resténose.
Selon l'invention le procédé permet la conservation des propriétés biologiques du composé polysaccharidique mis en œuvre par ledit procédé et le composé polysaccharidique conserve ses propriétés biologiques intrinsèques après dépôt. On entend par propriétés biologiques intrinsèques les activités biologiques précitées et notamment des activités anti-complémentaires et de substitut de plasma sanguin, une activité modulatrice de la prolifération des cellules musculaires lisses et endothéliales ou encore des propriétés anticoagulantes ou une action vis-à-vis des plaquettes.
Les objets ou les endoprothèses soumis au procédé selon l'invention présentent également comme caractéristique qu'ils n'entraînent pas la diffusion dans l'organisme de produits toxiques.
La non toxicité de la diffusion de produits toxiques dans l'organisme est vérifiée par le test préconisé dans la norme internationale ISO 10 993-5, concernant l'évaluation biologique des dispositifs médicaux.
Un substrat métallique selon l'invention est un support, dont la surface est destinée à recevoir le revêtement selon l'invention, réalisé en métal ou dont la surface est revêtue d'un métal ou d'un alliage comme les aciers inoxydables, les alliages à base de chrome et de cobalt ou même les superailiages.
Par métal selon l'invention, on entend tout matériau constitué d'un corps simple bon conducteur de la chaleur et de l'électricité, ayant un grand pouvoir réflecteur à l'état poli, et donnant des oxydes qui réagissent avec l'eau pour donner des bases comme le fer, le cobalt, le chrome.
Par alliage, on entend tout produit métallique homogène obtenu par l'association de plusieurs métaux avec une nette prédominance de l'un d'entre eux, en vue de conférer à ce dernier des caractéristiques déterminées.
Par composé silanique on entend des composés organiques choisis parmi les dérivés des silanes ayant pour formule générale SinH2n+2, dont l'un ou plusieurs atomes d'hydrogène a été substitué par des fonctions organiques classiques comme les groupes alkyles, des groupes alcoxy, aminés ou autre fonctions organiques.
Par dérivé d'un silane comprenant une ou plusieurs fonctions réactives, on entend un composé comportant, un ou plusieurs groupes aminés ou dérivés d'aminés susceptibles d'entrer en réaction avec les groupes hydroxyles des composés osidiques, et comportant un ou plusieurs groupes hydroxyles ou alcoxy capables de réagir, soit directement, soit après hydrolyse avec le métal constitutif du substrat métallique, par exemple les composés choisis dans le groupe constitué par les aminopropylsilanes et les aminobutylsilanes. Par composé polysaccharidique selon l'invention on entend tout polymère, naturel ou synthétique, comprenant une chaîne polymère constituée d'une multiplicité de motifs osidiques, à savoir tout polysaccharide, non modifié et/ou non fonctionnalisé, ou tout dérivé polysaccharidique fonctionnalisé. Par composé polysaccharidique fonctionnalisé on entend des dérivés polysaccharidiques comportant des motifs osidiques comportant des fonctions hydroxyles substituées par des groupes comme par exemple des groupes méthylcarboxylates, des groupes carboxyméthylbenzylamide, des groupes sulfates, des groupes sulfonates, ou dont les fonctions hydroxyles ont été substituées par des chaînes comportant des fonctions carboxyles, des fonctions amides, des groupes benzyles seuls ou en combinaison.
Plus particulièrement les composés polysaccharidiques seront choisis parmi les composés de formule générale DMCaBbSucSd dans laquelle :
D représente une chaîne polysaccharidique, constituée par des enchaînements d'unités α-D-glucopyranosiques reliées entre elles par des liaisons α(1-6),
MC représente des groupes méthylcarboxylates,
B représente des groupes carboxyméthylbenzaylamides,
Su représente des groupes sulfates, S représente des groupes sulfonates, et a, b, ç et d représentent le degré de substitution (ds), exprimé par rapport au nombre de fonctions hydroxyles libres dans une unité glucosidique du dextrane, respectivement en groupements MC, B, Su et S, a étant égal à 0 ou > à 0,2, b étant égal à 0 ou ≥ à 0,1 , ç étant égal à 0 ou ≥ à 0,1 et d étant égal à 0 ou < à 0,15, à condition que lorsque d=0, a et/ou b soient ≠ 0.
Parmi ces dérivés fonctionnalisés du dextrane, on peut plus particulièrement utiliser ceux qui sont sélectionnés dans le groupe constitué par :
- Les dextranes fonctionnalisés dans lesquels a ≥ 0,7, 0,15 ≤ b < 0,3, 0 < c < 0,15 et d = 0 ou < 0,1 et dont la masse molaire moyenne en poids est comprise entre 5 000 et 200 000 g/mol,
- Les dextranes fonctionnalisés dans lesquels 0,4 < a ≤ 0,8, 0,3 < b ≤ 0,8, 0,1 ≤ c ≤ 0,9 et d = 0 ou < 0,1 et dont la masse molaire moyenne en poids est comprise entre 5 000 et 200 000 g/mol, - Les dextranes fonctionnalisés dans lesquels a ≥ 0,5, 0,3 ≤ b < 0,5, c = 0 ou < 0,1 et d = 0 ou < 0,1 et dont la masse molaire moyenne en poids est comprise entre 5 000 et 200 000 g/mol,
Dans un autre mode de réalisation les composés polysaccharidiques pourront être choisis parmi les dérivés de dextranes qui comportent de manière statistique :
- au moins 35% environ de motifs B constitués de motifs osides A substitués par des radicaux possédant une fonction carboxyle répondant à la structure -0-(CH2)n-R-COO" dans laquelle R représente une simple liaison ou un groupe -CO-NH-(CH2)n ", n étant un nombre compris entre 1 et 10 et n' étant compris entre 1 et 7.
- au moins 3% environ de motifs D, c'est à dire de motifs osides A substitués par une chaîne comportant un groupe de structure :
Figure imgf000010_0001
dans laquelle n'est défini ci-dessus, R2 représente un anion d'un sel minéral ou organique physiologiquement tolérable, et Ri représente une simple liaison, un groupe -CH2- ou un groupe :
— CH — CH2
COO-
- éventuellement, des motifs osides A non substitués et/ou des motifs C constitués de motifs A substitués par des radicaux de structure suivante, dans laquelle Ri et n sont tels que définis ci-dessus :
Figure imgf000010_0002
Dans un autre mode de réalisation les composés polysaccharidiques pourront être choisis parmi les dérivés de dextranes, possédant un poids moléculaire supérieur à environ 5000 g/mol, constitués de manière statistique de motifs A, B et C, les motifs A étant des motifs osides de dextranes, les motifs B et C étant tels que définis ci-dessus, qui comprennent des motifs A et C et au moins 35% de motifs B.
Dans un autre mode de réalisation la chaîne polyosidique du composé polysaccharidique est celle d'un polysaccharide choisi dans le groupe constitué par l'amidon, le glycogène, les celluloses, les dextranes, les poly-β-1 ,3-glucanes, les poly-β-1 ,6-glucanes, les pullulanes, la chitine, le chitosane, les arabanes, les xylanes, les fucanes, et les pectines, lorsque la chaîne polyosidique du composé polysaccharidique est celle d'un dextrane, elle comprend une multiplicité de motifs α-D-glucopyranosiques reliés entre eux par des liaisons α(1-6). Dans un autre mode de réalisation le composé polysaccharidique est un polysaccharide naturel ou synthétique, non modifié, en particulier non fonctionnalisé.
Dans le procédé selon l'invention la surface modifiée chimiquement est nettoyée avant mise en contact avec l'agent de recouvrement intermédiaire, par exemple avec une solution d'acétone, ou d'alcool, et/ou d'agents tensioactifs.
Dans le procédé selon l'invention le substrat métallique dont la surface est revêtue avec l'agent de recouvrement intermédiaire est recuite, avant mise en contact avec l'agent de revêtement, ce recuit est effectué à une température comprise entre 80 et 140°C environ, et/ou pendant une durée comprise entre 1 et 30 minutes environ.
Ce recuit permet le retournement de la molécule de dérivé de silane, pour qu'elle présente une fonction aminé libre susceptible de réagir avec les composés comportant les groupes hydroxyles. Par exemple ce retournement peut être illustré pour la molécule de 3-aminopropyltriéthoxysilane (γ-APS) comme suit :
OH HO-Si-OH 0H N.H2
I I I
(CH2)3 HO-Si-OH (CH2)3 I I I
NH2 (CH2)3 HO-Si-OH I I
OH NH3 +O" O
Avant recuit Après recuit
Dans le procédé selon l'invention les surfaces revêtues peuvent être lavées, notamment la surface revêtue de la couche intermédiaire est lavée, avant mise en contact avec l'agent de revêtement,, et la surface revêtue avec le composé polysaccharidique est lavée. Dans le procédé selon l'invention, l'opération (1 ) et/ou (2) est mise en oeuvre en phase liquide ou vapeur et lorsque l'opération (2) est effectuée en phase liquide, elle est réalisée à un pH compris entre 2 et 9, et/ou à une température comprise entre 25 et 120°C environ, et/ou pendant une durée comprise entre 1 et 120 minutes environ. Lorsque l'opération (2) est effectuée en phase vapeur elle est effectué à une température supérieur à 120 °C et à une pression supérieure à 4 mbar. Lorsque l'opération (2) est ainsi effectuée en phase vapeur la molécule de dérivé de silane présente un fonction aminé libre susceptible de réagir avec les composés comportant les groupes hydroxyles pour former une liaison covalente, l'étape de recuit est donc immédiate et consécutive au greffage et ne nécessitera pas une étape supplémentaire de procédé.
L'agent de modification chimique de la surface du substrat métallique, sous forme liquide, comprend au moins un acide minéral fort, par exemple acide sulfurique, ou chlorhydrique, ou nitrique dans la proportion comprise entre 5 et 100 % (V V), et au moins un oxyde de chrome dans la proportion comprise entre 1 et 40 % (m/V) ; de préférence le pH de cet agent de modification chimique est compris entre 1 et 6. L'oxyde de chrome a une masse molaire moyenne comprise entre 50 et 500 g/mol, et est, par exemple, choisi dans le groupe constitué par les bichromates de potassium et les oxydes de chrome IV.
L'agent de recouvrement intermédiaire, à l'état liquide, comprend au plus 50%, par exemple entre 1 et 30 % (V/V) du composé silanique.
Le composé silanique a une masse molaire moyenne comprise entre 50 et 500 g/mol, il est choisi dans le groupe constitué par les aminopropylsilanes, et les aminobutylsilanes.
L'agent du revêtement, à l'état liquide, comprend entre 1 et 20 % (m/V) du composé polysaccharidique, en solution, il comprend un polysaccharide non modifié ou non fonctionnalisé, par exemple un dextrane, et/ou un dérivé polysaccharidique fonctionnalisé, susceptible d'être obtenu à partir d'un polysaccharide, par exemple un dextrane.
Lorsque le polysaccharide est un dextrane, sa masse molaire moyenne est comprise entre 20.000 et 1.000.000 g/mol, par exemple sa masse molaire est égale à 40.000 ou 70.000, ou 460.000 g/mol.
L'agent de revêtement comprend au moins un agent de couplage, par exemple choisi dans le groupe constitué par le bio-sulfo (succinimide-subérate), en abrégé BS3, le diméthyladipimidate , en abrégé DMA, l'époxirane, le bis-époxirane, les succinimides, l'épichlorydrine, les carbodiimides, comme par exemple le
1-éthyl-3-3-(diméthylaminopropyl)-carbodiimide, en abrégé EDAC OU EDC, ou le N-hydroxysuccinimide, en abrégé NHS. De façon préférentielle l'agent de couplage est présent, dans l'agent de revêtement, à proportion de 20 à 50 moles pour 100 moles du motif osidique de la chaîne polysaccharidique.
L'agent de revêtement peut comprendre un polysaccharide supplémentaire, naturel ou synthétique, substitué par des fonctions carboxylates et/ou sulfates, ledit polysaccharide supplémentaire étant différent dudit dérivé polysaccharidique fonctionnalisé. La présente invention a également pour objet le substrat métallique revêtu, susceptible d'être obtenu par le procédé précédemment décrit et une endoprothèse vasculaire, du type stent, comprenant ce substrat métallique revêtu, dont le matériau constitutif est un alliage, par exemple un acier inoxydable, ou un superalliage, par exemple le phynox. Différents objets de l'invention sont illustrés dans les exemples de mise en oeuvre du procédé et dans les figures 1 à 2 ci-dessous décrites : - La figure 1 représente schématiquement la structure d'un dérivé fonctionnalisé de dextrane substitué par les différents groupements chimiques MC, B, Su et S fixés su les unités glucosidiques D ; à titre d'exemple, la position du substituant sur les différents carbones des unités glucosidiques est présentée sur le carbone 2 ;
- La figure 2 représente les courbes d'inhibition de la prolifération de cellules musculaires lisses issues d'aorte de rat, au bout de 5 jours d'incubation, en fonction des différents dérives fonctionnalisés de dextrane.
EXEMPLE 1 : Préparation de modèles pour endoprothèses vasculaires en acier inoxydable selon la présente invention, nettoyage, oxydation et amination de la surface.
1) Support, solutions d'attaque et dérivés silaniques utilisés
Le support utilisé consiste en des pions d'acier inoxydable 316L polis de diamètre 8 mm et d'épaisseur 3 mm fournis par la société Sofradim.
Ces pions servent de modèle pour les endoprothèses vasculaires elles mêmes en acier inoxydable 316L.
L'acier inox 316L est un acier austénitique type 18/12 (teneur en Chrome/Nickel), à structure CFC répondant aux normes européennes NF S 90 401 , NF S 90 402, NF S 90 403 et NF S 94 051.
Les solutions de nettoyage sont des solutions d'acétone et d'éthanol chaud. La solution oxydante est un mélange sulfochromique.
Le composé silanique, est le γ-APS (3-aminopropyl)triéthoxysilane. Ce composé se fixe sur les fonctions hydroxyles de la surface et permet d'obtenir les fonctions aminés apparentes.
2) Protocole
Les pions d'acier inox 316L sont soumis à la sonication dans l'acétone 10 mn puis placés 10 mn dans une solution d'éthanol à 70°C. Cette étape permet l'élimination des éléments tensioactifs pour le nettoyage. Une solution de γ-APS à 10% (V/v) dans l'éthanol 95° est préparée et laissée 1 heure sous agitation afin d'hydrolyser les fonctions éthoxy et de permettre un greffage sur des fonctions hydroxyles.
La solution d'oxydation est une solution sulfochromique à 2,7% (M/V) en bichromate de potassium dans l'acide sulfurique à 80%. Dans le même temps, les pions d'acier nettoyés sont placés dans la solution d'oxydation et laissés 1 heure sous faible agitation.
Les pions oxydés sont ensuite rincés dans l'eau bidistillée, 5 minutes sous sonication. Les pions ainsi récupérés sont alors placés dans la solution de γ-APS et laissés 1 heure sous faible agitation.
On effectue ensuite un recuit des pions soumis au γ-APS pour permettre le retournement de la molécule de γ-APS selon la réaction illustrée précédemment. La phase aqueuse est soigneusement retirée à l'aide d'une pipette sans entrer en contact avec les pions d'acier puis le récipient contenant les pions est placé
10 minutes à 120°C.
Cette étape de recuit permet la fixation du γ-APS à la surface des pions.
Les pions sont finalement rincés à l'eau bidistillée et conservés à 50°C.
EXEMPLE 2 : Préparation de modèles pour endoprothèses vasculaires en phynox, nettoyage, oxydation et amination de la surface
1) Support, solutions d'attaque et composés silaniques utilisés Le support utilisé consiste en des pions de Phynox poli-miroir de diamètre 10 mm et d'épaisseur 4 mm fournis par la société Sofradim.
Ces pions servent de modèle pour les endoprothèses vasculaires elles-mêmes en phynox.
Le phynox est un superalliage à base de cobalt dont la résistance à l'oxydation est bien meilleure que celle des aciers inoxydables. Le phynox répond aux exigences des normes ASTM F-91 et ISO 5832/7 et NF
S 94-057 concernant les implants chirurgicaux.
Les solutions de nettoyage sont des solutions d'acétone et d'éthanol chaud.
La solution oxydante est un mélange sulfochromique.
Le composé silanique, est le γ-APS (3aminopropyltriéthoxysilane). Ce composé se fixe sur les fonctions hydroxyles de la surface et permet d'obtenir les fonctions aminés apparentes.
2) Protocole
Les pions de phynox sont soumis à la sonication dans l'acétone 10 mn puis placés 10 mn dans une solution d'éthanol a 70°C. Cette étape permet l'élimination des éléments tensioactifs utilisés pour le nettoyage.
Une solution de γ-APS à 10% (V/V) dans l'éthanol 95° est préparée et laissée 1 heure sous agitation afin d'hydrolyser les fonctions éthoxy et de permettre un greffage sur des fonctions hydroxyles.
La solution d'oxydation est une solution sulfochromique à 2,7% (m/V) en bichromate de potassium dans l'acide sulfurique 80%.
Dans le même temps, les pions d'acier nettoyés sont placés dans la solution d'oxydation et laissés 1 heure sous faible agitation. Les pions oxydés sont ensuite rincés dans l'eau bidistillée, 5 minutes sous sonication.
Les pions ainsi récupérés sont alors placés dans la solution de γ-APS et laissés 1 heure sous faible agitation.
On effectue ensuite un recuit des pions soumis au γ-APS pour permettre le retournement de la molécule de γ-APS selon la réaction illustrée précédemment.
La phase aqueuse est soigneusement retirée à l'aide d'une pipette sans entrer en contact avec les pions d'acier puis le récipient contenant les pions est placé
10 minutes à 120°C. Cette étape de recuit permet la fixation du γ-APS à la surface des pions.
Les pions sont alors rincés à l'eau bidistillée et conservés à 50°C.
EXEMPLE 3 : Préparation d'objets métalliques pour endoprothèses avec amination de la surface en phase vapeur. Le système est composé de deux enceintes séparées par un robinet. L'enceinte destinée à accueillir le γ-APS est reliée à une ampoule à brome.
Les objets métalliques préalablement soumis à une oxydation telle que décrite dans les protocoles des exemples 1 ou 2, sont placés dans une enceinte sous faible pression (8 mbar) et portés à 120 °C par un ruban chauffant.
Le γ-APS en solution à 10 % V/V dans de l'éthanol pur est introduit dans l'ampoule à brome, puis injecté dans une des deux enceintes prélablement portée à 140 °C sous une pression de 8 mbar. Le γ-APS est immédiatement vaporisé. Les enceintes sont ensuite mise en contact, sous une pression de 8 mbar et le γ-APS gazeux est alors mis en contact avec l'objet métallique.
Le greffage est immédiat et ce greffage est effectué de manière covalente car le substrat métallique étant porté à une température de 120 °C l'étape de recuit est immédiate.
Après réaction la pression est ramenée à la pression atmosphérique et l'objet métallique est rincé à l'eau.
Des analyses XPS effectuées sur les différents objets métalliques aminés en phase vapeur ont montré une couche aminée de faible épaisseur sur toute la surface desdits objets.
EXEMPLE 4 : Analyse de la surface des pions aminés.
1 ) Description des appareils
Afin de vérifier la présence d'un revêtement aminé à la surface des pions, ceux-ci sont observés et leurs surfaces sont caractérisées chimiquement.
Les méthodes d'analyse employées sont L'XPS (X-Photoelectron Spectroscopy) et l'AFM (Microscope à Force Atomique).
2) Protocole L'appareil XPS employé est un Escalab 210, utilisant comme source monochromatique la raie Kα de l'aluminium d'énergie 1486 eV sous ultravide. Cet appareil analyse une surface de 3 mm2 (3 mm.lmm) sur une profondeur de 10 nm.
L'AFM est utilisé en mode semi-contact sur la surface des pions d'acier.
3) Résultats
L'analyse XPS des pions d'acier inox 316L a montré une couche d'amination homogène sur toute la surface du pion et d'épaisseur supérieure à 10 nm. Cette épaisseur a été estimée à 30 nm. Les fonctions aminés libres sont apparentes et permettent ainsi un greffage ultérieur de dextrane et/ou de dérivés fonctionnalisés de dextrane. L'analyse à l'AFM a montré des amas de dérivés silaniques sur les pions si la silanisation n'a pas lieu dans l'éthanol 95° mais dans l'eau. Une analyse identique a montré une couche d'amination homogène sur la surface du pion analysé. EXEMPLE 5 : Test de cytotoxicité du revêtement par essai de «diffusion des extraits».
1) Test, cellules, témoins et échantillons utilisés
Le test employé est un test de mesure indirecte basé sur la toxicité des produits diffusés ou "relargués" par les pions modifiés. Ce test suit la norme internationale ISO 10 993-5, concernant l'évaluation biologique des dispositifs médicaux.
Les supports utilisés sont des plaques de culture cellulaires 24 puits commercialisées par Corning Costar. Les cellules employées sont des cellules endothéliales humaines immortalisées de la lignée EAhy 926 en phase de croissance exponentielle ensemencées a 5 000 cellules/puits.
Le véhicule d'extraction, ainsi que le témoin négatif, est un milieu de culture a 10% (VA/) en sérum de veau foetal (SVF). Le témoin positif est une solution de DMSO a 1% (V/V) dans du milieu de culture.
Les échantillons utilisés sont des pions d'acier inox 316L bruts, oxydés et aminés par les méthodes décrites ci-dessus.
2) Protocole Les pions d'acier sont stérilisés à l'éthanol 70° durant 30 minutes puis lavés rapidement au tampon PBS stérile. Ils sont ensuite placés chacun au fond d'un puits de plaque de culture cellulaire et recouverts de 1 ,5 ml de milieu de culture a 10% de SVF. Les plaques sont ensuite placées pendant 72 heures dans un incubateur air/C02. Après 72 heures d'incubation, les extraits sont récupérés et mis au contact des cellules EAhy 926 en début de phase de croissance exponentielle. L'estimation de la densité cellulaire est réalisée au bout de 8 jours d'incubation à l'aide d'un compteur de cellules (coulter counter).
3) Résultats Le tableau 1 donne les différentes valeurs de nombre de cellules par puits au bout de huit jours d'incubation.
Figure imgf000018_0001
Aucun effet cytotoxique n'est observé. Quel que soit le traitement subit, les pions en acier 316L ne diffusent ou ne "relarguent" aucune substance toxique ou inhibitrice de la prolifération cellulaire.
EXEMPLE 6 : Greffage d'un dérivé fonctionnalisé du dextrane sur des pions d'acier aminés.
1) Support métallique, dextrane et agents de couplages utilisés Les supports métalliques utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 4. Les agents de couplages utilisés sont l'EDAC et le NHS, commercialisés par Sigma-AIdrich.
Le dérivé fonctionnalisé de dextrane utilisé, de masse molaire moyenne en poids 70 000 g/mol, est le DMC0,8B0,22Suo,ιι ; il répond à la formule générale DMCaBbSucSd telle que celle précédemment décrite. Son protocole de préparation est tel que décrit dans le brevet
Européen publié sous le numéro 0146455. Ce dérivé fonctionnalisé du dextrane inhibe la prolifération des cellules musculaires lisses, comme le montre la figure 2, mais inhibe aussi l'activation du complément (tests de CH50 réalisés) et stimule la prolifération des cellules endothéliales. 2) Protocole
Une solution de DMCBSu, tel que celui décrit ci-dessus, à 16%
(mΛ/) est préparée dans un tampon MES 0.01 M, pH 3.5. L'agent de couplage
EDAC est ajouté à 13% (mΛ ) à la solution et laissé 5 minutes sous agitation.
Le second agent de couplage NHS est ajouté à 6% (m/V) et laissé 30 minutes sous agitation.
Les pions d'aciers sont introduits dans 1 ml de tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2 auquel est ajoutée la solution décrite ci-dessus. Le pH est ramené à 8.
La réaction se poursuit pendant 24 heures puis les pions sont rincés à l'eau bidistillée. Les pions sont alors conservés à 50°C dans l'étuve à vide.
EXEMPLE 7 : Greffage d'un dérivé fonctionnalisé de dextrane sur une surface métallique aminée. Le support, les agents de couplage et le protocole sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 6. A la différence de l'exemple 6, le dérivé fonctionnalisé de dextrane utilisé est le DMCo,68Bn,34 u0,i2 ; il répond à la formule générale DMCaBbSucSd telle que celle précédemment décrite.
Son protocole de préparation est tel que décrit dans le brevet Européen publié sous le numéro 0146455. Ce dérivé fonctionnalisé de dextrane inhibe la prolifération des cellules endothéliales de la lignée EAhy 926.
EXEMPLE 8 : Greffage d'un dérivé fonctionnalisé de dextrane sur une surface métallique aminée.
Le support, les agents de couplage et le protocole sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 6.
A la différence de l'exemple 6, le dérivé fonctionnalisé de dextrane utilisé est le DMC0,6Bo,45Su0,65 de masse molaire moyenne en poids de 100 000 g/mol ; il répond à la formule générale DMCaBbSucSd telle que celle précédemment décrite.
Son protocole de préparation est tel que décrit dans le brevet Européen publié sous le numéro 0146455.
Son activité spécifique anticoagulante est de 4,3 Ul/mg par comparaison à l'héparine dont l'activité est de 173 Ul/mg. Ce composé est stérilisé par filtration et lyophilisation ; les tests de stérilité et d'apyrogènicité sont conformes.
EXEMPLE 9 : Greffage d'un dérivé fonctionnalisé de dextrane sur une surface métallique aminée.
Le support, les agents de couplage et le protocole sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 6.
A la différence de l'exemple 6, le dérivé fonctionnalisé de dextrane utilisé est le DMCo,6iBn,39Su0,23 ; il répond à la formule générale DMCaBbSucSd telle que celle précédemment décrite.
Son protocole de préparation est tel que décrit dans le brevet Européen publié sous le numéro 0146455.
Son activité spécifique anticoagulante est de 3,5 Ul/mg par comparaison à l'héparine dont l'activité est de 173 Ul/mg. Ce composé est stérilisé par filtration et lyophilisation ; les tests de stérilité et d'apyrogènicité sont conformes. EXEMPLE 10 : Test d'adhérence et de croissance des cellules endothéliales sur les pions d'acier inox 316 L modifiés. 1) Test, cellules, témoins et échantillons utilisés
Ce test est une mesure directe de l'adhérence et de la prolifération des cellules endothéliales de la lignée EAhy 926, déjà décrites précédemment. Ce test est conforme à la norme internationale ISO 10 993-5, concernant l'évaluation biologique des dispositifs médicaux. Les supports utilisés sont des pions d'acier inox 316L sur lesquels out été effectuées des modifications de surface.
Les supports témoins sont des puits des plaques de culture cellulaires 24 puits commercialisées par Corning Costar.
Le milieu de culture utilisé est du milieu de culture à 10% (V/V) en sérum de veau foetal (SVF).
Les pions utilisés sont des pions bruts, aminés et recouverts du dérivé fonctionnalisé de dextrane (DMCO,8Bo,22Suo,n) précédemment décrit.
2) Protocole
Le DMCBSu est greffé sur des pions d'acier inox 316 L. 8 pions sont préparés afin d'effectuer des mesures d'adhérence des cellules et d'évaluer leur croissance en fonction du support. 8 pions témoins sont ajoutés au test ainsi que 8 puits vierges de plaques 24 puits stériles de chez Corning Costar.
Les pions greffés et les pions bruts sont stérilisés en fond de puits 40 mn dans de l'Ethanol 70°. Ils sont ensuite rincés 2 fois au PBS stérile puis passives avec du milieu de culture (10% de SVF) durant 3 jours.
Les cellules sont ensemencées à 25 000 cellules par puits par pions.
Deux pions sont prélevés et analysés à 24 h, 48 h, 72 h et 7 jours. L'analyse est effectuée comme précédemment, par décollement des cellules adhérentes sur les pions et comptage au coulter.
3) Résultats
Les résultats du test sont donnés dans le tableau 2. Les résultats ont été ramenés en nombre de cellules par cm2. La surface d'une face de pion d'acier inox 316L mesure le quart de celle d'un fond de puits (2 cm2). Il a été considéré que les cellules adhéraient, au départ, deux fois plus sur le pion que sur le puits car elles ont été déposées sur le pion puis immergées dans le milieu.
Une meilleure adhérence des cellules a lieu sur les pions greffés que sur les pions bruts. Ces résultats indiquent une efficacité du greffage et une action du
DMCo,8Bo,22Su0,ιι bien qu'il soit immobilisé sur une surface.
On obtient des résultats identiques avec le composé DMCo,6Bo,45Su0,65 précédemment décrit.
Tableau 2 : Nombre de cellules par cm2 en fonction du temps et de la surface
Figure imgf000022_0001
EXEMPLE 11 : Exemple de test d'adhérence des cellules endothéliales sur les pions d'acier inox 316 L modifiés
Les principaux agents de ce test biologique sont identiques à ceux de l'exemple 10. A la différence de l'exemple 10, le dérivé fonctionnalisé du dextrane est le DMCo,68Bo,34Su0,i2-
Les cellules ont été ensemencées à une densité de 75 000 cellules par puits par pion. Une seule mesure a été effectuée au bout de 5 jours d'incubation.
Les résultats sont donnés dans le tableau 3.
Tableau 3 : Nombre de cellules par cm ,2 après 5 jours d'incubation sur les pions
Figure imgf000023_0001
Les différents pions intermédiaires n'influent que peu sur l'adhérence des cellules endothéliales. Cependant, le dérivé fonctionnalisé de dextrane greffé à la surface du pion inhibe l'adhérence des cellules EAhy 926.
Ces résultats confirment l'efficacité du greffage par la méthode décrite dans ce document.
De plus, les dérivés fonctionnalisés du dextrane ont des effets sur l'activation du complément et sur l'activation plaquettaire qui sont l'objet de mesures.
EXEMPLE 12 : Exemple de test d'adhérence des cellules endothéliales et de cellules musculaires lisses sur les pions d'acier inox 316 L modifiés
Les principaux agents de ce test biologique sont identiques à ceux de l'exemple 10. A la différence de l'exemple 10, le dérivé fonctionnalisé du dextrane est le DMCo,6Bo,45Su0,65- Les cellules ont été ensemencées à une densité de 10 000 cellules endothéliales par puits par pion et 15 000 cellules musculaires lisses par puits par pion.
Une seule mesure a été effectuée au bout de 5 jours d'incubation.
Les résultats sont donnés dans le tableau 4. Tableau 4 : Nombre de cellules après 5 jours d'incubation sur les pions
Figure imgf000024_0001
Une stimulation de la croissance des cellules endothéliales et une inhibition de la croissance des cellules musculaires lisses sont observées. Ces résultats sont obtenus à la fois sur les pions aminés et sur les pions greffés, le revêtement aminé a donc également un effet en tant que tel.
EXEMPLE 13 : Préparation d'endoprothèses vasculaires selon la présente invention, nettoyage, oxydation, amination de la surface et greffage de dérivés fonctionnalisés du dextrane.
Le support utilisé consiste en des stents, expansibles par ballonnet, d'acier inoxydable 316L fournis par la société Sofradim. L'acier inox 316L est un acier austénitique type 18/12 (teneur en Chrome/Nickel), à structure CFC répondant aux normes européennes NF S 90 401 , NF S 90 402, NF S 90 403 et NF S 94 051.
Les solutions de nettoyage sont des solutions d'acétone et d'éthanol chaud.
La solution oxydante est un mélange sulfochromique.
Le dérivé silanique, est le γ-APS (3-aminopropyltriéthoxysilane). Ce composé se fixe sur les fonctions hydroxyles de la surface et permet d'obtenir les fonctions aminés apparentes.
Les dérivés fonctionnalisés du dextrane utilisés sont :
DMCo,8Bθ,22SUfj,11 , DMCo,6Bo,45SUo,65 , DMCo,68Bθ,34SUo,12 , DMCo,6lBo,39SUo,23 , décrits précédemment.
2) Protocole.
Les stents d'acier inox 316L sont soumis à la sonication dans l'acétone 10 mn puis placés 10 mn dans une solution d'éthanol à 70°C. Cette étape permet l'élimination des traces d'éléments tensioactifs qui pourraient être restés à la surface suite au nettoyage.
Une solution de γ-APS à 10% (VA/) dans l'éthanol 95° est préparée et laissée 1 heure sous agitation afin d'hydrolyser les fonctions éthoxy et de permettre un greffage sur des fonctions hydroxyles.
La solution d'oxydation est une solution sulfochromique à 2,7%o (m/V) en bichromate de potassium dans l'acide sulfurique 80%.
Dans le même temps, les stents d'acier nettoyés sont placés dans la solution d'oxydation et laissés 1 heure sous faible agitation. Les stents oxydés sont ensuite rincés dans l'eau bidistillée, 5 minutes sous sonication.
Les stents ainsi récupérés sont alors placés dans la solution de dérivés silanique et laissés 1 heure sous faible agitation.
On effectue ensuite un recuit des stents soumis au γ-APS pour permettre le retournement de la molécule de γ-APS selon la réaction illustrée précédemment. La phase aqueuse est soigneusement retirée à l'aide d'une pipette sans entrer en contact avec les stents d'acier puis le récipient contenant les stents est placé 10 minutes à 120°C. Les stents sont alors rincés à l'eau bidistillée.
Des solutions de DMCBSu, tels que ceux décrits ci-dessus, à 16%o (m/V) sont préparées dans un tampon MES 0.01 M, pH 3.5. L'agent de couplage EDAC est ajouté à 13%) (m/V) à la solution et laissé 5 minutes sous agitation. Le second agent de couplage NHS est ajouté à 6% (m/V) et laissé 30 minutes sous agitation.
Les stents sont introduits dans 1 mL de tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2 auquel est ajoutée la solution décrite ci-dessus.
Le pH est ramené à 8
La réaction est laissée 24 heures puis les stents sont rincés à l'eau bidistillée. Les stents sont alors conservés à 50°C dans l'étuve à vide.
Cette étape de greffage peut être effectuée plusieurs fois pour améliorer l'épaisseur de la couche active.
Des analyses XPS des surfaces et des observations au Microscope
Electronique à Balayage (MEB) ont montré, sur toute les surfaces, un recouvrement homogène de γ-APS d'épaisseur supérieure à 10 nm ainsi que la présence homogène des groupements chimiques caractéristiques des dérivés fonctionnalisés du dextrane utilisés.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de revêtement et liaison de la surface d'un substrat métallique avec une couche d'un composé polysaccharidique, caractérisé en ce que, à partir du substrat métallique :
(a) on dispose d'un agent de modification chimique de la surface du substrat métallique, par exemple sous forme liquide ;
(b) on dispose d'un agent de recouvrement intermédiaire, comprenant un composé silanique, en solution par exemple, comportant deux restes réactifs, l'un avec le substrat métallique, et l'autre, directement ou indirectement, avec le composé polysaccharidique ;
(c) on dispose d'un agent de revêtement, comprenant, en solution par exemple, le composé polysaccharidique ; et on effectue les opérations suivantes : (1 ) on met en contact la surface du substrat métallique, avec l'agent de modification chimique, pour obtenir une surface modifiée chimiquement ;
(2) on met en contact la surface modifiée chimiquement avec l'agent de recouvrement intermédiaire, pour obtenir une surface revêtue avec une couche intermédiaire comprenant le composé silanique, lié par covalence au substrat métallique ;
(3) on met en contact la couche intermédiaire avec l'agent de revêtement, pour revêtir ladite couche intermédiaire avec un revêtement comprenant le composé polysaccharidique lié par covalence, directement ou indirectement, au composé silanique.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la surface modifiée chimiquement est nettoyée avant mise en contact avec l'agent de recouvrement intermédiaire, par exemple avec une solution d'acétone, ou d'alcool, et/ou d'agents tensioactifs.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat métallique dont la surface est revêtue avec la couche intermédiaire est recuite, avant mise en contact avec l'agent de revêtement.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le recuit est effectué à une température comprise entre 80 et 140°C environ, et/ou pendant une durée comprise entre 1 et 30 minutes environ.
5. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la surface revêtue de la couche intermédiaire est lavée, avant mise en contact avec l'agent de revêtement.
6. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la surface revêtue avec le composé polysaccharidique est lavée.
7. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'opération (1) et/ou (2) est mise en oeuvre en phase liquide ou vapeur.
8. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'opération (2) est effectuée en phase liquide, à un pH compris entre 2 et 9, et/ou à une température comprise entre 25 et 120°C, et/ou pendant une durée comprise entre 1 et 120 minutes.
9. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'opération (2) est effectuée en phase vapeur, à une température supérieure à 120 °C et à une pression supérieur à 4 mbar.
10. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'agent de modification chimique, sous forme liquide, comprend au moins un acide minéral fort, par exemple acide sulfurique, ou chlorhydrique, ou nitrique, et au moins un oxyde de chrome.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acide minéral fort est présent dans l'agent de modification chimique, sous forme liquide, dans la proportion comprise entre 5 et 100 % (V/V)
12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le ou les oxydes de chrome sont présents dans l'agent de modification chimique, sous forme liquide, dans la proportion comprise entre 1 et 40 % (m/V).
13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'oxyde de chrome a une masse molaire moyenne comprise entre 50 et 500 g/mol, et est par exemple choisi dans le groupe constitué par les bichromates de potassium et les oxydes de chrome IV.
14. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le pH de l'agent de modification chimique, sous forme liquide, est compris entre 1 et 6.
15. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'agent de recouvrement intermédiaire, à l'état liquide, comprend au plus 50%, et de préférence entre 1 et 30 % (V/V) du composé silanique.
16. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le composé silanique a une masse molaire moyenne comprise entre 50 et 500 g/mol.
17. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le composé silanique est choisi dans la groupe constitué par les aminopropylsilanes, et les aminobutylsilanes.
18. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que que l'agent du revêtement, à l'état liquide, comprend entre 1 et 20 % (m/V) du composé polysaccharidique, en solution.
19. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'agent de revêtement comprend un polysaccharide non modifié ou non fonctionnalisé, par exemple un dextrane, et/ou un dérivé polysaccharidique fonctionnalisé, susceptible d'être obtenu à partir d'un polysaccharide, par exemple un dextrane.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le polysaccharide est un dextrane ayant une masse molaire moyenne comprise entre 20.000 et 1.000.000 g/mol, par exemple ayant une masse molaire égale à 40.000 ou 70.000, ou 460.000 g/mol.
21. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'agent de revêtement comprend au moins un agent de couplage, par exemple choisi dans le groupe constitué par le bis-sulfo (succinimide-subérate) en abrégé BS3, le diméthyladipimidate en abrégé DMA, l'époxirane, le bis- époxirane, les succinimides, l'épichlorydrine, les carbodiimides.
22. Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce que l'agent de couplage est le 1-éthyl-3-3-(diméthylaminipropyl)-carbodiimide, en abrégé EDAC, ou le N-hydroxysuccinimide, en abrégé NHS.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'agent de couplage est présent, dans l'agent de revêtement, à proportion de 20 à 50 moles pour 100 moles du motif osidique de la chaîne polysaccharidique.
24. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'agent de revêtement comprend un polysaccharide supplémentaire, naturel ou synthétique, substitué par des fonctions carboxylates et/ou sulfates, ledit polysaccharide supplémentaire étant différent dudit dérivé polysaccharidique fonctionnalisé.
25. Substrat métallique revêtu, susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 24.
26. Endoprothèse vasculaire, du type stent, comprenant un substrat métallique revêtu selon la revendication 25.
27. Endoprothèse vasculaire selon la revendication 26, caractérisée en ce que le substrat métallique est un alliage, par exemple un acier inoxydable, ou un superalliage, par exemple le phynox.
28. Objet métallique à usage médical ou chirurgical, du type prothèse, par exemple endoprothèse vasculaire (dite "stent") pour angioplastie coronarienne transluminale percutanée, comprenant un substrat métallique dont la surface est revêtue au moins en partie avec un composé polysaccharidique, caractérisé en ce que le composé polysaccharidique est lié par covalence au substrat métallique, par l'intermédiaire de bras de greffage, comprenant chacun au moins un motif silanique, lié d'un côté au substrat métallique par une liaison métal-O-, et de l'autre côté, directement ou indirectement, par liaison covalente-NH-, avec le composé polysaccharidique.
29. Objet selon la revendication 28, caractérisé en ce que la chaîne polyosidique du composé polysaccharidique est celle d'un polysaccharide choisi dans le groupe constitué par l'amidon, le glycogène, les celluloses, les dextranes, les poly-β-1 ,3-glucanes, les poly-β-1 ,6-glucanes, les pullulanes, la chitine, le chitosane, les arabanes, les xylanes, les fucanes, et les pectines.
30. Objet selon la revendication 28, caractérisé en ce que la chaîne polyosidique du composé polysaccharidique est celle d'un dextrane avec un poids moléculaire supérieur à environ 5000 g/mol, et comprend une multiplicité de motifs α-D-glucopyranosiques reliés entre eux par des liaisons α (1 -6).
31. Objet selon la revendication 28, caractérisé en ce que le composé polysaccharidique est un dérivé polysaccharidique fonctionnalisé, c'est-à-dire dont au moins une partie des motifs osidiques est substituée quant aux fonctions hydroxyles libres de chaque motif osidique, par un ou plusieurs constituants, choisis chacun dans le groupe comprenant les méthylcarboxylates, les carboxyméthylbenzyl amides, les sulfates, et les sulfonates, dont carboxyméthylsulfonates.
32. Objet selon la revendication 31 , caractérisé en ce que les composés polysaccharidiques seront choisis parmi les composés de formule générale DMCaBbSucSd dans laquelle : D représente une chaîne polysaccharidique, constituée par des enchaînements d'unités α-D-glucopyranosiques reliées entre elles par des liaisons α(1-6),
MC représente des groupes méthylcarboxylates, B représente des groupes carboxyméthylbenzylamide,
Su représente des groupes sulfates,
S représente des groupes sulfonates, et a, b, ç et d représentent le degré de substitution (ds), exprimé par rapport au nombre de fonctions hydroxyles libres dans une unité glucosidique du dextrane, respectivement en groupements MC, B, Su et S, a étant égal à 0 ou > à 0,2, b étant égal à 0 ou ≥ à 0,1, ç étant égal à 0 ou > à 0,1 et d étant égal à 0 ou ≤ à 0,15, à condition que lorsque d=0, a et/ou b soient ≠ 0.
33. Objet selon la revendication 32, caractérisé en ce que les composés polysacchariques seront choisis parmi le groupe constitué par : - les dextranes fonctionnalisés dans lesquels a ≥ 0,7, 0,15 ≤ b ≤
0,3, 0 < c < 0,15 et d = 0 ou < 0,1 et dont la masse molaire moyenne en poids est comprise entre 5 000 et 200 000 g/mol,
- les dextranes fonctionnalisés dans lesquels 0,4 < a ≤ 0,8, 0,3 ≤ b < 0,8, 0,1 ≤ c < 0,9 et d = 0 ou < 0,1 et dont la masse molaire moyenne en poids est comprise entre 5 000 et 200 000 g/mol,
- les dextranes fonctionnalisés dans lesquels a > 0,5, 0,3 ≤ b < 0,5, c = 0 ou ≤ 0,1 et d = 0 ou ≤ 0,1 et dont la masse molaire moyenne en poids est comprise entre 5 000 et 200 000 g/mol,
34. Objet selon la revendication 28, caractérisé en ce que la chaîne polyosidique du composé polysaccharidique est celle d'un dextrane, avec un poids moléculaire supérieur à environ 5000 g/mol, constitués de motifs osidiques A, B et C , les motifs A étant des motifs de dextrane, et les motifs osidiques comprennent de manière statistique :
- au moins 35 % environ de motifs B constitués de motifs osides A substitués par des radicaux possédant une fonction carboxyle répondant à la structure -O-(CH2)n-R-COO" dans laquelle R représente une simple liaison ou un groupe -CO-NH-(CH2)n'~, n étant un nombre compris entre 1 et 10 et n' étant compris entre 1 et 7.
- - au moins 3 % environ de motifs D, c'est à dire de motifs osides A substitués par une chaîne comportant un groupe de structure :
Figure imgf000031_0001
dans laquelle n'est défini ci-dessus, R2 représente un anion d'un sel minéral ou organique physiologiquement tolérable, et R^ représente une simple liaison, un groupe -CH2- ou un groupe :
-CH — CH2
COO-
- éventuellement, des motifs osides A non substitués et/ou des motifs C constitués de motifs A substitués par des radicaux de structure suivante, dans laquelle Ri et n sont tels que définis ci-dessus :
Figure imgf000031_0002
35. Objet selon la revendication 28, caractérisé en ce que la chaîne polyosidique du composé polysaccharidique est celle d'un dextrane, et comprend une multiplicité de motifs composés polysaccharidique pouvant être choisis parmi les dérivés de dextranes, possédant un poids moléculaire supérieur à environ 5000 g/mol, constitués de manière statistique de motifs A,
B et C et qui comprennent des motifs A et C et au moins 35% de motifs B, les motifs A étant des motifs osides de dextranes, les motifs B étant constitués de motifs osides A substitués par des radicaux possédant une fonction carboxyle répondant à la structure -0-(CH2)n-R-COO" dans laquelle R représente une simple liaison ou un groupe -CO-NH-(CH2)n , n étant un nombre compris entre 1 et 10 et n' étant compris entre 1 et 7 et les motifs C étant constitués de motifs A substitués par des radicaux de structure suivante,
Figure imgf000032_0001
dans laquelle Ri représente une simple liaison, un groupe -CH2- ou un groupe :
CH — CH2
COO- et n est un nombre compris entre 1 et 10.
36. Objet selon la revendication 28, caractérisé en ce que le composé polysaccharidique est un polysaccharide naturel ou synthétique, non modifié, en particulier non fonctionnalisé.
37. Objet métallique à usage médical ou chirurgical, du type prothèse, par exemple endoprothèse vasculaire (dite "stent") pour angioplastie coronarienne transluminale percutanée, comprenant un substrat métallique dont la surface est revêtue au moins en partie par un agent de recouvrement comportant un composé silanique, caractérisé en ce que le composé silanique, est lié au substrat métallique par une liaison métal-O-.
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