CN114618024B - 一种内皮功能仿生材料、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种内皮功能仿生材料、其制备方法及应用，涉及生物医学材料技术领域。内皮功能仿生材料通过在聚多酚涂层上形成功能涂层，在功能涂层中含有铜离子基团和尼龙‑3分子，铜离子能通过原位催化血液中的NO供体持续释放NO分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制平滑肌细胞增殖，保护血管内皮层；尼龙‑3分子在能促进内皮细胞的生长的同时，也能抑制平滑肌的增殖。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体而言，涉及一种内皮功能仿生材料、其制备方法及应用。
背景技术
血管支架介入术作为心血管疾病治疗的一种主要策略，虽然已经发展了近30年，仍一直面临着诸如支架置入后再狭窄和晚期血栓等问题。健康血管最内层是由内皮细胞构成的内皮层，其能稳定释放的NO具有抑制血小板聚集、抑制平滑肌细胞增生、调节血管张力、介导细胞免疫等作用，可以维持血管的舒张和通畅。而在支架的植入部位不可避免地会损伤原位的内皮细胞，以至于局部NO释放量过低，难以发挥正常血管内膜层的功能。所以赋予血管支架NO释放能力是血管支架表面改性的一个重要的研究方向。
二价铜离子(Cu2+)是人体中诸多金属酶(二胺氧化酶、细胞色素C氧化酶等)的组成成分，是人体必需的微量元素；Cu2+的缺乏甚至可能导致胚胎发育不全、结缔组织缺陷等疾病的发生。Cu2+被证实有显著的抗菌功能，同时Cu2+还具有促进骨折处骨痂形成，抑制牙磨片上骨吸收陷窝的矿物组织吸收进程。此外，Cu2+/Cu+还具备强的氧化催化功能，其中包括一氧化氮(NO)催化功能，即能够催化人体中源源不断合成的NO供体，例如S-亚硝基硫醇(RSNO)等释放NO。因此，装载铜离子的材料，往往被应用于抗菌、促成骨、催化材料或界面(包含NO催化功能生物材料)的制备。
传统的NO供体型材料表面，由于是将NO供体型材料涂覆或者固定在生物材料的表面，受到涂层厚度的制约，NO供体型材料的NO储存量有限，这也意味着NO的持续释放受到限制，NO初期释放速率过快等因素也会引发负面的病理状况。
目前关于Cu2+的接枝，无一例外地借助其络合物的Cu2+螯合作用，然后通过过渡分子与高分子材料结合，高分子材料再与基底材料结合的方式来实现。这样的接枝方法存在以下缺点：接枝需要多步骤相对繁琐；Cu2+仅仅存在于改性材料的表层，其接枝量有限，并且随着过渡高分子层的降解，表层Cu2+很容易从改性层脱落。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种内皮功能仿生材料及其制备方法，旨在利用具有原位催化释放NO的Cu2+基团和尼龙-3的协同作用，达到即抑制平滑肌增殖、促进内皮细胞的生长的功能，而实现高度的血管内皮化再生。
本发明的另一目的在于提供上述内皮功能仿生材料在制备血管支架中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种内皮功能仿生材料，包括基材，在基材上依次沉积有聚多酚涂层和功能涂层，功能涂层上含有铜离子基团和尼龙-3分子。
第二方面，本发明提供一种前述实施方式中的内皮功能仿生材料的制备方法，包括：在具有聚多酚涂层的基材上沉积功能涂层，以通过功能涂层引入铜离子基团和尼龙-3分子。
第三方面，本发明提供前述实施方式中的内皮功能仿生材料或前述实施方式中的制备方法制备得到的内皮功能仿生材料在制备血管支架中的应用。
本发明具有以下有益效果：其通过在聚多酚涂层上形成功能涂层，在功能涂层中含有铜离子基团和尼龙-3分子，铜离子能通过原位催化血液中的NO供体持续释放NO分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制平滑肌细胞增殖，保护血管内皮层；尼龙-3分子在能促进内皮细胞的生长的同时，也能抑制平滑肌的增殖。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的内皮功能仿生材料的制备方法的原理图；
图2为本发明实施例提供的含有铜离子基团所形成的功能转化溶液的结构示意图；
图3为本发明实施例在316L SS表面制备的Cu2+-尼龙-3涂层与316L SS基地材料的X射线光电子能谱(XPS)结果；
图4为316L SS与在316L SS表面制备的Cu2+-尼龙-3涂层上种植的2W Cells/ml内皮细胞1d、3d的增殖实验荧光图片；
图5为316L SS与在316L SS表面制备的Cu2+-尼龙-3涂层上种植的2W Cells/ml平滑肌细胞1d、3d的增殖实验荧光图片；
图6为本发明实施例在316L SS表面制备的Cu2+-尼龙-3涂层与在316L SS表面制备Cu2+-RGD(对比例1)、Cu2+-REDV(对比例2)、Nylon-3(对比例3)和Cu2+(对比例4)涂层上种植的2W Cells/ml平滑肌细胞1d、3d的增殖实验荧光图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括：在具有聚多酚涂层的基材上沉积功能涂层，以通过功能涂层引入铜离子基团和尼龙-3分子。
需要说明的是，通过该制备方法可以制备得到同时含有铜离子基团和尼龙-3(Nylon-3)分子的材料，铜离子能通过原位催化血液中的NO供体持续释放NO分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制平滑肌细胞增殖，保护血管内皮层；性质稳定的Nylon-3主链上富含酰胺键，与蛋白质结构类似，能抵抗蛋白酶的作用，并对内皮细胞具有促进作用，相反对平滑肌细胞能抑制增殖。
请结合图1，本发明实施例所提供的内皮功能仿生材料的制备方法包括如下步骤：
S1、聚多酚涂层的制备
聚多酚涂层的制备过程包括：将基材置于含有邻酚类化合物的碱性溶液中，在5-35℃(如5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等)的条件下沉膜6-48h(如6h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、48h等)；碱性溶液是指pH值为7-10的缓冲溶液。
需要说明的是，多酚类化合物的分子结构中含有大量的邻位酚羟基，这些邻位酚羟基可与金属形成稳定螯合作用，因此多酚类化合物能在金属表面形成较稳定的固定或结合，这样的涂层与金属、陶瓷基底具有优良的结合力。此外，该交联聚合涂层还能通过分子间疏水相互作用和氢键作用，与聚合物基底材料具有良好结合力。因此，该涂层可广泛的应用于几乎所有的生物材料表面。本发明实施例是利用聚多酚涂层为基础，便于引入功能涂层。
具体地，邻酚类化合物选自多巴胺、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、邻苯二酚、焦棓酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、去甲肾上腺素、左旋多巴、右旋多巴和单宁酸中的至少一种。以上原料适合于在基材表面形成聚多酚涂层，邻酚类化合物可以为一种也可以为几种。
需要说明的是，基材的种类不限，可以根据需要进行选择，在此不做限定。
在一些实施例中，基材选自金属基生物材料、陶瓷基生物材料、高分子基生物材料和杂化生物材料中的至少一种，可以为一种或几种。
其中，金属基生物材料选自不锈钢、钴基合金、钛及其合金、镁及其合金、锌合金和纯铁及其合金中的至少一种；
其中，陶瓷基生物材料选自TiO2薄膜、各向同性热解碳、硅、SiO、羟基磷灰石、磷酸钙、金刚石和类金刚石中的至少一种。
其中，高分子基生物材料选自天然生物材料和人工合成高分子材料中的至少一种；天然生物材料选自胶原、明胶、丝素蛋白、纤维素、壳聚糖、海藻酸和透明质酸中的至少一种；人工合成高分子材料选自涤纶、聚四氟乙烯、聚氨酯、聚甲醛、硅橡胶、聚乳酸和乙交酯-丙交酯共聚物、聚三亚甲基碳酸酯和聚己内酯中的至少一种。
其中，杂化生物材料选自聚乳酸/羟基磷灰石复合材料和壳聚糖/羟基磷灰石复合材料中的至少一种。
以上多种基材均适合于本发明实施例中所提供的制备方法，可以根据需要进行选择，如可以根据产品的用途选择合适的基材。本发明实施例所提供的制备方法几乎适用于所有材质、复杂几何形状和不同拓扑结构材料的表面改性。
在一些实施例中，邻酚类化合物在反应溶液中的初始浓度为0.1ng/mL-100mg/mL，在此浓度范围内均可以形成聚多酚涂层。
在一些实施例中，在沉膜完成之后将具有聚多酚涂层的基材置于水中超声处理，再进行清洗、干燥，得到无水的涂层材料。
在一些实施例中，在沉积聚多酚涂层之前，将基材进行抛光、清洗和干燥，以提升基材与涂层的结合力。
S2、含有铜离子的氨基涂层的制备
将具有聚多酚涂层的基材置于功能转化溶液中反应以形成多氨基涂层，其中，功能转化溶液为同时含有铜离子和多氨基的化合物形成的溶液，在功能转化溶液中，铜离子的含量为0.1ng/mL-100mg/mL，优选为0.05-20mg/mL为宜，以保证铜离子的引入量。
在一些实施例中，多氨基涂层的制备过程中，控制反应pH值为8-13，反应的温度为5-35℃(如5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等)，浸泡时间为6-48h(如6h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、48h等)。通过进一步控制pH值和温度促进氨基与聚多酚涂层反应，形成氨基涂层。
需要说明的是，聚多酚涂层在碱性条件下，部分邻苯二酚会自解离，其结构容易被氧化脱氢，易转化成邻苯二醌结构，该结构可进一步与含有氨基的化合物发生迈克尔加成反应和希夫碱反应，因此将多酚类化合物与分子结构中含两个或两个以上氨基的化合物反应，能在材料表面形成聚合交联涂层。
请结合图1和图2，功能转化溶液的制备过程包括：将同时含有四氮杂环和多羧基的化合物溶解之后进行羧基活化得到第一活化溶液，将第一活化溶液与可溶性铜盐溶液反应，之后再与多氨基化合物溶液反应。
需要说明的是，铜离子可以与四氮杂环进行螯合，达到在化合物中引入铜离子的目的，之后利用羧基与多氨基化合物的反应得到引入氨基，使氨基的数量较多，便于后续引入尼龙-3。
在一些实施例中，同时含有四氮杂环和多羧基的化合物为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸三叔丁酯中的至少一种，多氨基化合物为分子量为1000D-100000D的聚烯丙胺。
在其他实施例中，同时含有四氮杂环和多羧基的化合物以及多氨基化合物不限于以上两种原料。
在一些实施例中，功能转化溶液的制备过程包括：
(1)第一活化溶液的制备过程：将同时含有四氮杂环和多羧基的化合物溶解于pH值为4-12的缓冲溶液中控制浓度为0.1ng/mL-100mg/mL，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行羧基活化10min-6h；
(2)将第一活化溶液与浓度为0.1ng/mL-100mg/mL(优选为0.05-20mg/mL)的可溶性铜盐溶液混合超声3min-1h，然后将超声之后的溶液与浓度为0.1ng/mL-100mg/mL(优选为0.05-20mg/mL)的多氨基化合物溶液在5-35℃的条件下反应6-48h，然后将反应后的溶液装于200-50000D的透析袋中透析1-5d，透析过程可以每隔3-8h换一次水。透析之后，将溶液取出封装，放在4℃中低温保存，即得目标溶液。
进一步地，可溶性铜盐选自氯化铜、氯化亚铜、溴化铜、溴化亚铜、碘化铜、碘化亚铜、硫酸铜、硫酸亚铜、硝酸铜、碳酸铜、柠檬酸铜、酒石酸铜、丙酸铜和醋酸铜中的至少一种。以上几种可溶性铜盐均适合于引入铜离子和四氮杂环进行螯合，可溶性铜盐可以为一种也可以为多种。
在一些实施例中，在制备多氨基涂层的反应完成之后，进行水洗、干燥，以通过水洗去除未反应的原料，干燥可以采用吹干的形式，去除表面的水分，得到干燥的材料。
S3、在氨基涂层中引入尼龙-3分子
将具有多氨基涂层的材料置于同时含有羧基和炔基的化合物所形成的溶液中，以在材料表面引入炔基；然后利用炔基与叠氮化尼龙-3中的叠氮基反应，以引入尼龙-3分子，其中，叠氮化尼龙-3的结构式为：
需要说明的是，利用多氨基涂层上的氨基与羧基反应引入含有炔基的化合物，然后再利用炔基与叠氮基的反应引入尼龙-3分子。具体地，叠氮化尼龙-3可以为市购原料，也可以通过现有的合成方法自主合成，如Nylon-3Polymers that Enable SelectiveCulture of Endothelial Cells。
在一些实施例中，在材料表面引入炔基的过程包括：将同时含有羧基和炔基的化合物所形成的溶液在酸性条件下进行羧基活化之后得到第二活化溶液，将具有多氨基涂层的材料置于第二活化溶液中，在5-35℃条件下反应6-48h；同时含有羧基和炔基的化合物可以为戊炔酸，活化之前的戊炔酸溶液的浓度为0.1ng/mL-100mg/mL。
需要说明的是，在S2制备得到的材料表面含有丰富的胺基，通过WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基与胺基发生酰胺反应而接枝上戊炔酸，得到炔基成功引入的材料。
具体地，活化反应在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的缓冲溶液中进行，缓冲溶液为2-吗啉乙磺酸(MES)溶液。羧基活化的过程是在pH值为5-6的EDC/NHS活化体系中活化10min-6h；
在一些实施例中，在第二活化溶液中反应完成之后，将材料进行清洗、干燥，以通过清洗(可以为水洗3-5次)去除未反应的原料，干燥可以采用吹干的形式，去除表面的水分，得到干燥的材料。
在一些实施例中，引入尼龙-3分子的过程包括：将叠氮化尼龙-3(N3-Nylon-3)溶于PBS缓冲液中，调节pH值为7-10后与还原剂和铜盐混合得到尼龙前液；将引入炔基之后的材料置于尼龙前液中，在5-35℃的条件下避光反应6-48h。
需要说明的是，接枝戊炔酸而引入的炔基(Alkynyl)与N3-Nylon-3中的叠氮基(Azide)发生点击环加成反应。Alkynyl-Azide点击在一价铜离子存在下反应生成区域选择性的1,4-二取代-1,2,3-三氮唑，其中一价铜离子起到激活炔烃的催化作用，还原剂起到将二价铜离子还原成一价铜离子的目的，提高目标产物的转化率。
在一些实施例中，将叠氮化尼龙-3与PBS缓冲液的用量是控制叠氮化尼龙-3在溶解之后的浓度为0.1ng/mL-100mg/mL(优选为0.05-20mg/mL)；还原剂为抗环血酸盐；铜盐选自氯化铜、溴化铜、碘化铜、硫酸铜、硝酸铜、碳酸铜、柠檬酸铜、酒石酸铜、丙酸铜和醋酸铜中的至少一种。
在其他实施例中，还原剂和铜盐可以为其他原料，不限于以上原料。
在一些实施例中，在避光反应完成之后，进行清洗、干燥，以通过清洗(可以为水洗3-5次)去除未反应的原料，干燥可以采用吹干的形式，去除表面的水分，得到干燥的目标材料。
本发明实施例提供一种内皮功能仿生材料包括基材，在基材上沉积有聚多酚涂层和功能涂层，功能涂层上含有铜离子基团和尼龙-3分子，可以采用本发明实施例所提供的制备方法进行制备。
在一些实施例中，功能涂层的制备是在聚多酚涂层中引入多胺类分子，并在多胺类分子上接枝铜离子基团和尼龙-3分子。
为进一步提升铜离子的基团和尼龙-3分子的协同作用，铜离子基团和尼龙-3分子的摩尔比为1:0.001-100，优选为1:0.1-10。基材的厚度为0.001mm-10cm，聚多酚涂层的厚度为0.1-200nm，功能涂层的厚度为0.1-400nm；优选地，基材的厚度为0.01mm-5cm，聚多酚涂层的厚度为10-100nm，功能涂层的厚度为20-200nm。
该内皮功能仿生材料可以进一步制备形成血管支架等产品，具体产品的形式不做限定。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将需要改性修饰的316L不锈钢进行抛光、清洗、干燥；
(2)将步骤(1)所得材料放置于碱性pH＝8缓冲溶液、25℃条件下0.1mg/mL的多巴胺(DA)溶液中沉膜12h。
(3)将步骤(2)所得材料置于去离子水溶液中超声5分钟，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(4)将步骤(3)所得材料浸没在0.1mg/mL含有铜离子基团所形成的功能转化溶液中，并用NaOH调节pH，使得pH＝12，25℃条件下浸泡12h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
其中，功能转化溶液的制备过程包括：将2mg/mL的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)溶解在pH＝8的缓冲溶液中，再加入EDC、NHS活化DOTA分子上的羧基3h。将所得的羧基活化后的DOTA溶液中加入1mg/mL可溶性铜盐(氯化铜)，再超声1h，然后在溶液中加入10mg/mL聚烯丙胺(PAa，10000D)，30℃，反应30h。将反应后所得的溶液装在10000D的透析袋中透析，透析3d，每隔5h换一次水。透析完成之后，取出并封装，放在4℃中低温保存，即得目标溶液。
(5)将0.1mg/mL的戊炔酸(4-PA)加入pH＝5～6缓冲溶液中，用WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基10min，得到活化后的戊炔酸溶液，将步骤(4)所得材料置于活化后的戊炔酸溶液中，25℃条件下反应24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(6)将0.1mg/mL的N3-Nylon-3溶解于PBS缓冲溶液中，用DIPEA调节pH为8，再向其中加入0.5mg/mL抗坏血酸钠、0.325mg/mLCuSO4.5H2O，得到Nylon前液。将步骤(5)所得样品置于Nylon前液中，25℃条件下，避光6h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干，即得目标材料。
实施例2
本实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将需要改性修饰的316L不锈钢进行抛光、清洗、干燥；
(2)将步骤(1)所得材料放置于碱性pH＝8缓冲溶液、25℃条件下2mg/mL的邻苯二酚溶液中沉膜24h。
(3)将步骤(2)所得材料置于去离子水溶液中超声5分钟，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(4)将步骤(3)所得材料浸没在2mg/mL含有铜离子基团所形成的功能转化溶液中，并用NaOH调节pH，使得pH＝12，25℃条件下浸泡24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
其中，功能转化溶液的制备过程参照实施例1，仅调整用量满足铜离子浓度要求。
(5)将2mg/mL的戊炔酸(4-PA)加入pH＝5～6缓冲溶液中，用WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基10min，得到活化后的戊炔酸溶液，将步骤(4)所得材料置于活化后的戊炔酸溶液中，25℃条件下反应24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(6)将2mg/mL的N3-Nylon-3溶解于PBS缓冲溶液中，用DIPEA调节pH为8，再向其中加入0.5mg/mL的抗坏血酸钠、0.325mg/mL的CuSO4.5H2O，得到Nylon前液。将步骤(5)所得样品置于Nylon前液中，25℃条件下，避光24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干，即得目标材料。
实施例3
本实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将需要改性修饰的TiO2薄膜进行清洗、干燥；
(2)将步骤(1)所得材料放置于碱性pH＝8缓冲溶液、25℃条件下0.1mg/mL的多巴胺溶液中沉膜12h。
(3)将步骤(2)所得材料置于去离子水溶液中超声5分钟，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(4)将步骤(3)所得材料浸没在0.1mg/mL含有铜离子基团所形成的功能转化溶液中，并用NaOH调节pH，使得pH＝12，25℃条件下浸泡12h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
其中，功能转化溶液的制备过程参照实施例1。
(5)将0.1mg/mL的戊炔酸(4-PA)加入pH＝5～6缓冲溶液中，用WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基10min，得到活化后的戊炔酸溶液，将步骤(4)所得材料置于活化后的戊炔酸溶液中，25℃条件下反应24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(6)将0.1mg/mL的N3-Nylon-3溶解于PBS缓冲溶液中，用DIPEA调节pH为8，再向其中加入0.5mg/mL的抗坏血酸钠、0.325mg/mL的CuSO4.5H2O，得到Nylon前液。将步骤(5)所得样品置于Nylon前液中，25℃条件下，避光6h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干，即得目标材料。
实施例4
本实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将需要改性修饰的TiO2薄膜进行清洗、干燥；
(2)将步骤(1)所得材料放置于碱性pH＝8缓冲溶液、25℃条件下2mg/mL的邻苯二酚溶液中沉膜24h。
(3)将步骤(2)所得材料置于去离子水溶液中超声5分钟，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(4)将步骤(3)所得材料浸没在2mg/mL含有铜离子基团所形成的功能转化溶液中，并用NaOH调节pH，使得pH＝12，25℃条件下浸泡24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
其中，功能转化溶液的制备过程参照实施例1，仅调整用量满足铜离子浓度要求。
(5)将2mg/mL的戊炔酸(4-PA)加入pH＝5～6缓冲溶液中，用WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基10min，得到活化后的戊炔酸溶液，将步骤(4)所得材料置于活化后的戊炔酸溶液中，25℃条件下反应24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(6)将2mg/mL的N3-Nylon-3溶解于PBS缓冲溶液中，用DIPEA调节pH为8，再向其中加入0.5mg/mL的抗坏血酸钠、0.325mg/mL的CuSO4.5H2O，得到Nylon前液。将步骤(5)所得样品置于Nylon前液中，25℃条件下，避光24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干，即得目标材料。
实施例5
本实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将需要改性修饰的聚乳酸PLA进行清洗、干燥；
(2)将步骤(1)所得材料放置于碱性pH＝8缓冲溶液、25℃条件下0.1mg/mL的多巴胺溶液中沉膜12h。
(3)将步骤(2)所得材料置于去离子水溶液中超声5分钟，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(4)将步骤(3)所得材料浸没在0.1mg/mL含有铜离子基团所形成的功能转化溶液中，并用NaOH调节pH，使得pH＝12，25℃条件下浸泡12h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
其中，功能转化溶液的制备过程参照实施例1。
(5)将0.1mg/mL的戊炔酸(4-PA)加入pH＝5～6缓冲溶液中，用WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基10min，得到活化后的戊炔酸溶液，将步骤(4)所得材料置于活化后的戊炔酸溶液中，25℃条件下反应24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(6)将0.1mg/mL的N3-Nylon-3溶解于PBS缓冲溶液中，用DIPEA调节pH为8，再向其中加入0.5mg/mL的抗坏血酸钠、0.325mg/mL的CuSO4.5H2O，得到Nylon前液。将步骤(5)所得样品置于Nylon前液中，25℃条件下，避光6h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干，即得目标材料。
实施例6
本实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将需要改性修饰的聚乳酸PLA进行清洗、干燥；
(2)将步骤(1)所得材料放置于碱性pH＝8缓冲溶液、25℃条件下2mg/mL的邻苯二酚溶液中沉膜24h。
(3)将步骤(2)所得材料置于去离子水溶液中超声5分钟，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(4)将步骤(3)所得材料浸没在2mg/mL含有铜离子基团所形成的功能转化溶液中，并用NaOH调节pH，使得pH＝12，25℃条件下浸泡24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
其中，功能转化溶液的制备过程参照实施例1，仅调整用量满足铜离子浓度要求。
(5)将2mg/mL的戊炔酸(4-PA)加入pH＝5～6缓冲溶液中，用WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基10min，得到活化后的戊炔酸溶液，将步骤(4)所得材料置于活化后的戊炔酸溶液中，25℃条件下反应24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(6)将2mg/mL的N3-Nylon-3溶解于PBS缓冲溶液中，用DIPEA调节pH为8，再向其中加入0.5mg/mL的抗坏血酸钠、0.325mg/mL的CuSO4.5H2O，得到Nylon前液。将步骤(5)所得样品置于Nylon前液中，25℃条件下，避光24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干，即得目标材料。
实施例7
本实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将需要改性修饰的聚乳酸/羟基磷灰石进行清洗、干燥；
(2)将步骤(1)所得材料放置于碱性pH＝8缓冲溶液、25℃条件下0.1mg/mL的多巴胺溶液中沉膜12h。
(3)将步骤(2)所得材料置于去离子水溶液中超声5分钟，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(4)将步骤(3)所得材料浸没在0.1mg/mL含有铜离子基团所形成的功能转化溶液中，并用NaOH调节pH，使得pH＝12，25℃条件下浸泡12h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
其中，功能转化溶液的制备过程参照实施例1。
(5)将0.1mg/mL的戊炔酸(4-PA)加入pH＝5～6缓冲溶液中，用WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基10min，得到活化后的戊炔酸溶液，将步骤(4)所得材料置于活化后的戊炔酸溶液中，25℃条件下反应24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(6)将0.1mg/mL的N3-Nylon-3溶解于PBS缓冲溶液中，用DIPEA调节pH为8，再向其中加入0.5mg/mL的抗坏血酸钠、0.325mg/mL的CuSO4.5H2O，得到Nylon前液。将步骤(5)所得样品置于Nylon前液中，25℃条件下，避光6h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干，即得目标材料。
实施例8
本实施例提供一种内皮功能仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将需要改性修饰的聚乳酸/羟基磷灰石进行清洗、干燥；
(2)将步骤(1)所得材料放置于碱性pH＝8缓冲溶液、25℃条件下2mg/mL的邻苯二酚溶液中沉膜24h。
(3)将步骤(2)所得材料置于去离子水溶液中超声5分钟，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(4)将步骤(3)所得材料浸没在2mg/mL含有铜离子基团所形成的功能转化溶液中，并用NaOH调节pH，使得pH＝12，25℃条件下浸泡24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
其中，功能转化溶液的制备过程参照实施例1，仅调整用量满足铜离子浓度要求。
(5)将2mg/mL的戊炔酸(4-PA)加入pH＝5～6缓冲溶液中，用WSC(EDC/NHS)体系活化戊炔酸上的羧基10min，得到活化后的戊炔酸溶液，将步骤(4)所得材料置于活化后的戊炔酸溶液中，25℃条件下反应24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干。
(6)将2mg/mL的N3-Nylon-3溶解于PBS缓冲溶液中，用DIPEA调节pH为8，再向其中加入0.5mg/mL的抗坏血酸钠、0.325mg/mL的CuSO4.5H2O，得到Nylon前液。将步骤(5)所得样品置于Nylon前液中，25℃条件下，避光24h，再用去离子水清洗3次，然后取出，吹干，即得目标材料。
对比例1
与实施例1不同之处仅在于：将N3-Nylon-3替换为N3-RGD(叠氮化的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽)。
对比例2
与实施例1不同之处仅在于：将N3-Nylon-3替换为N3-REDV(叠氮化的特异性粘附内皮细胞分子REDV多肽)。
对比例3
与实施例1不同之处仅在于：将功能转化溶液中不引入铜离子。
对比例4
与实施例1不同之处仅在于：不进行步骤(5)和步骤(6)。
试验例1
测试实施例1中制备得到内皮功能仿生材料与316L SS基地材料分别进行X射线光电子能谱(XPS)的测试，结果如图3所示。
从图3中可以看出，在实施例1所制备得到的内皮功能仿生材料中明显检测出Cu2p1、Cu2p3峰，都是Cu元素的特征峰，证明实施例1制备得到的内皮功能仿生材料成功螯合Cu2+。相对于316L SS，Cu2+-Nylon-3涂层没能测出Fe2p峰，是因为Cu2+-Nylon-3涂层的成功制备将316L SS基材覆盖，导致XPS电子束无法穿透到316L SS中，也间接证明Cu2+-Nylon-3涂层的成功制备。相较于316L SS，其Cu2+-Nylon-3涂层的C、N、O元素峰的面积极大增大，原因是Cu2+-Nylon-3涂层中的DA、PAa、DOTA、4-PA和Nylon分子的引入导致C、N、O元素含量急剧增加，证明Cu2+-Nylon-3涂层构建成功。
试验例2
将实施例1中制备得到的内皮功能仿生材料与316L SS基材上分别种植2W Cells/ml内皮细胞，1d、3d的增殖实验荧光图片如图4所示。
从图4可以看出，含有Cu2+-Nylon-3的内皮功能仿生材料相比于316L SS基材，能够显著促进内皮细胞的增殖。
试验例3
将实施例1中制备得到的内皮功能仿生材料与316L SS基材分别种植的2W Cells/ml平滑肌细胞，1d、3d的增殖实验荧光图片如图5所示。
从图5可以看出，含有Cu2+-Nylon-3的内皮功能仿生材料相比于316L SS基材，能够抑制平滑肌细胞的增殖，且效果较为显著。
试验例4
将实施例1中制备得到的内皮功能仿生材料与对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备得到的涂层材料上分别种植的2W Cells/ml平滑肌细胞，1d、3d的增殖实验荧光图片如图6所示，其中对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备得到的涂层材料分别为Cu2+-RGD、Cu2+-REDV、Nylon-3和Cu2+涂层材料。
从图6可以看出，Cu2+-RGD、Cu2+-REDV、Nylon-3和Cu2+涂层材料对平滑肌细胞增殖的抑制作用明显差于含有Cu2+-Nylon-3的内皮功能仿生材料的抑制作用，且差异较为显著。
综上，本发明提供一种内皮功能仿生材料、其制备方法及应用，其通过在聚多酚涂层上形成功能涂层，在功能涂层中含有铜离子基团和尼龙-3分子，具有以下优点：
(1)本发明所选用的邻酚结构的化合物，通过静电自组装、共价反应(迈克尔加成和西佛碱反应)形成一个稳定的复合聚合物。邻酚结构的化合物无生物毒性，具有多酚化合物所具备的特异性生物学功能如：保护心血管系统、抑制动脉粥样硬化、抗癌、抗菌、抗炎症等。
(2)针对背景技术中提出的NO供体型材料的NO储存量有限的问题，本发明通过铜离子与DOTA形成的螯合物并化学接枝与交联制备铜离子含量具有良好的可调控性的涂层。通过额外添加可溶性金属盐可调控DOTA对铜离子的螯合量，从而制备具有大范围铜离子含量调控的涂层或材料。铜离子的引入可以原位催化血液中的NO供体持续稳定地释放NO分子，不仅可用于NO催化释放，同时也可作为抗癌材料、抗凝血材料、抗菌材料、抗炎症反应、抗免疫原性和骨诱导材料的广泛使用。
(3)目前具有细胞选择性功能的生物分子(如硫代甘油、血管内皮生长因子(VEGF)、RGD多肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)等)对于细胞的选择性都是单向的。这些生物分子，无论是以共价固定还是静电组装到材料表面，都必须依赖分子的尺寸、构象、活性以及其在材料表面发挥作用的稳定性及持久性。生物分子一旦在服役过程中失活或大量丢失，便不能有效发挥其生物学功能。而Nylon-3分子的细胞选择性是双向的，既能促进内皮细胞的生长，也能抑制平滑肌的增殖。Nylon-3分子主链上富含内酰胺，与蛋白质结构类似，作为聚合物材料结构和功能很稳定，也能抵抗蛋白酶的作用，相比于序列特异性多肽更容易合成。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (36)
1.一种内皮功能仿生材料，其特征在于，包括基材，在所述基材上依次沉积有聚多酚涂层和功能涂层，所述功能涂层上含有铜离子基团和尼龙-3分子；
所述功能涂层的制备过程包括：
将具有聚多酚涂层的基材置于功能转化溶液中反应以形成多氨基涂层，其中，所述功能转化溶液为同时含有铜离子和多氨基的化合物形成的溶液；
将具有所述多氨基涂层的材料置于同时含有羧基和炔基的化合物所形成的溶液中，以在材料表面引入炔基；
然后利用炔基与叠氮化尼龙-3中的叠氮基反应，以引入尼龙-3分子，其中，所述叠氮化尼龙-3的结构式为：
2.根据权利要求1所述的内皮功能仿生材料，其特征在于，铜离子基团和尼龙-3分子的摩尔比为1:0.001-100；
所述基材的厚度为0.001mm-10cm，所述聚多酚涂层的厚度为0.1-200nm，所述功能涂层的厚度为0.1-400nm。
3.根据权利要求1所述的内皮功能仿生材料，其特征在于，铜离子基团和尼龙-3分子的摩尔比为1:0.1-10；
所述基材的厚度为0.01mm-5cm，所述聚多酚涂层的厚度为10-100nm，所述功能涂层的厚度为20-200nm。
4.根据权利要求2所述的内皮功能仿生材料，其特征在于，所述基材选自金属基生物材料、陶瓷基生物材料、高分子基生物材料和杂化生物材料中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的内皮功能仿生材料，其特征在于，所述金属基生物材料选自钴基合金、钛及其合金、镁及其合金、锌合金和纯铁及其合金中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的内皮功能仿生材料，其特征在于，所述陶瓷基生物材料选自TiO2薄膜、SiO、羟基磷灰石和磷酸钙中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的内皮功能仿生材料，其特征在于，所述高分子基生物材料选自天然生物材料和人工合成高分子材料中的至少一种；所述天然生物材料选自胶原、明胶、丝素蛋白、纤维素、壳聚糖、海藻酸和透明质酸中的至少一种；所述人工合成高分子材料选自涤纶、聚四氟乙烯、聚氨酯、聚甲醛、硅橡胶、聚乳酸和乙交酯-丙交酯共聚物、聚三亚甲基碳酸酯和聚己内酯中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的内皮功能仿生材料，其特征在于，所述杂化生物材料选自聚乳酸/羟基磷灰石复合材料和壳聚糖/羟基磷灰石复合材料中的至少一种。
9.一种权利要求1-8中任一项所述内皮功能仿生材料的制备方法，其特征在于，包括：在具有聚多酚涂层的基材上沉积功能涂层，以通过所述功能涂层引入铜离子基团和尼龙-3分子；
所述功能涂层的制备过程包括：
将具有聚多酚涂层的基材置于功能转化溶液中反应以形成多氨基涂层，其中，所述功能转化溶液为同时含有铜离子和多氨基的化合物形成的溶液；
将具有所述多氨基涂层的材料置于同时含有羧基和炔基的化合物所形成的溶液中，以在材料表面引入炔基；
然后利用炔基与叠氮化尼龙-3中的叠氮基反应，以引入尼龙-3分子，其中，所述叠氮化尼龙-3的结构式为：
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述多氨基涂层的制备过程中，控制反应pH值为8-13，反应的温度为5-35℃，浸泡时间为6-48h；
在所述功能转化溶液中，铜离子的含量为0.1ng/mL-100mg/mL。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在所述功能转化溶液中，铜离子的含量为0.05-20mg/mL。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在制备所述多氨基涂层的反应完成之后，进行水洗、干燥。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述功能转化溶液的制备过程包括：将同时含有四氮杂环和多羧基的化合物溶解之后进行羧基活化得到第一活化溶液，将所述第一活化溶液与可溶性铜盐溶液反应，之后再与多氨基化合物溶液反应。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，同时含有四氮杂环和多羧基的化合物为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸三叔丁酯中的至少一种，所述多氨基化合物为分子量为1000D-100000D的聚烯丙胺。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述第一活化溶液的制备过程包括：将同时含有四氮杂环和多羧基的化合物溶解于pH值为4-12的缓冲溶液中控制浓度为0.1ng/mL-100mg/mL，然后加入EDC和NHS进行羧基活化10min-6h。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，将所述第一活化溶液与浓度为0.1ng/mL-100mg/mL的可溶性铜盐溶液混合超声3min-1h，然后将超声之后的溶液与浓度为0.1ng/mL-100mg/mL的所述多氨基化合物溶液在5-35℃的条件下反应6-48h，然后将反应后的溶液装于200-50000D的透析袋中透析1-5d。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性铜盐溶液为浓度为0.05-20mg/mL，所述多氨基化合物溶液的浓度为0.05-20mg/mL。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性铜盐选自氯化铜、氯化亚铜、溴化铜、溴化亚铜、碘化铜、碘化亚铜、硫酸铜、硫酸亚铜、硝酸铜、碳酸铜、柠檬酸铜、酒石酸铜、丙酸铜和醋酸铜中的至少一种。
19.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在材料表面引入炔基的过程包括：将同时含有羧基和炔基的化合物所形成的溶液在酸性条件下进行羧基活化之后得到第二活化溶液，将具有所述多氨基涂层的材料置于所述第二活化溶液中，在5-35℃条件下反应6-48h。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述同时含有羧基和炔基的化合物为戊炔酸，活化之前的戊炔酸溶液的浓度为0.1ng/mL-100mg/mL。
21.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述羧基活化的过程是在pH值为5-6的EDC/NHS活化体系中活化10min-6h。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，在所述第二活化溶液中反应完成之后，将材料进行清洗、干燥。
23.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，引入所述尼龙-3分子的过程包括：将叠氮化尼龙-3溶于PBS缓冲液中，调节pH值为7-10后与还原剂和铜盐混合得到尼龙前液；将引入炔基之后的材料置于所述尼龙前液中，在5-35℃的条件下避光反应6-48h。
24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，将叠氮化尼龙-3与PBS缓冲液的用量是控制叠氮化尼龙-3在溶解之后的浓度为0.1ng/mL-100mg/mL。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，将叠氮化尼龙-3与PBS缓冲液的用量是控制叠氮化尼龙-3在溶解之后的浓度为0.05-20mg/mL。
26.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述还原剂为抗环血酸盐。
27.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述铜盐选自氯化铜、溴化铜、碘化铜、硫酸铜、硝酸铜、碳酸铜、柠檬酸铜、酒石酸铜、丙酸铜和醋酸铜中的至少一种。
28.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，在所述避光反应完成之后，进行清洗、干燥。
29.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述聚多酚涂层的制备过程包括：将基材置于含有邻酚类化合物的碱性溶液中，在5-35℃的条件下沉膜6-48h。
30.根据权利要求29所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液是指pH值为7-10的缓冲溶液。
31.根据权利要求29所述的制备方法，其特征在于，所述邻酚类化合物选自多巴胺、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、邻苯二酚、焦棓酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、去甲肾上腺素、左旋多巴、右旋多巴和单宁酸中的至少一种。
32.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述邻酚类化合物在反应溶液中的初始浓度为0.1ng/mL-100mg/mL。
33.根据权利要求32所述的制备方法，其特征在于，所述邻酚类化合物在反应溶液中的初始浓度为0.05-20mg/mL。
34.根据权利要求29所述的制备方法，其特征在于，在沉膜完成之后将具有聚多酚涂层的基材置于水中超声处理，再进行清洗、干燥。
35.根据权利要求34所述的制备方法，其特征在于，在沉积所述聚多酚涂层之前，将所述基材进行抛光、清洗和干燥。
36.权利要求1-8中任一项所述的内皮功能仿生材料或权利要求9-35中任一项所述制备方法制备得到的内皮功能仿生材料在制备血管支架中的应用。
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