WO2002097093A1

WO2002097093A1 - Acides nucleiques isoles dans le neuroblastome

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Publication number: WO2002097093A1
Application number: PCT/JP2002/005294
Authority: WO
Inventors: Akira Nakagawara
Original assignee: Chiba-Prefecture; Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2002-12-05
Also published as: EP1939292A2; EP1792990A2; JP4129227B2; EP1398376A1; US20040265812A1; EP1939292A3; EP1792990B1; EP1939292B1; EP1792990A3; US7335755B2; DE60239025D1; JPWO2002097093A1; DE60239087D1; EP1398376A4

Description

明細書

神経芽細胞腫において単離された核酸技術分野

本発明は、予後良好な、および不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後不良なヒト神経芽細胞腫で発現が増強していることを特徴とする核酸に関する。

背景技術

(腫瘍形成と遺伝子）

個々の腫瘍にはそれぞれの個性があり、発がんの基本的な原理は同じであっても、その生物学的特性は必ずしも同じではない。近年、がんの分子生物学や分子遺伝学が急速に進歩し、発がんやいわゆる腫瘍細胞のバイオロジーが遺伝子レベルで説明できるようになつてきた。

(神経芽細胞腫）

神経芽細胞腫は末梢交感神経系細胞に由来する交感神経節細胞と副腎髄質細胞から発生する小児癌である。この交感神経系細胞は発生初期の神経堤細胞が腹側へ遊走し、いわゆる交感神経節が形成される場所で分化成熟したものである。その一部の細胞はさらに副腎部へ遊走し、先に形成されつつある副腎皮質を貫通して髄質部に達し、そこで髄質を形成する。神経堤細胞はほかの末梢神経細胞の起源ともなつており、後根神経節（知覚神経）、皮膚の色素細胞、甲状腺 C細胞、肺細胞の一部、腸管神経節細胞などへ分化する。

(神経芽細胞腫の予後）

神経芽細胞腫は多彩な臨床像を示すことが特徴である（中川原：神経芽腫の発生とその分子機構小児内科 3 0， 1 4 3 1 9 9 8 )。例えば、 1歳未満で発症する神経芽細胞腫は非常に予後が良く、大部分が分化や細胞死を起こして自然退縮する。現在、広く実施されている生後 6か月時の尿のマススクリ一二ングで陽性となる神経芽細胞腫の多くは、この自然退縮を起こしやすいものに属する。一方、 1歳以上で発症する神経芽細胞腫は悪性度が高く、多くの場合、治療に抵抗して患児を死に至らしめる。 1歳以上の悪性度の高い神経芽細胞腫は体細胞突然変異（S o m a t i c m u t a t i o n) が起こり、モノクロ一ナノレであるのに対し、自然退縮する神経芽細胞腫では生殖細胞突然変異（ g e r m l i n e m t a t i o n) のみの遺伝子変異でとどまっているとの仮説もある (K n u d s o n AG等： R e g r e s s i o n o f n e u r o b 1 a s t o m a I V - S： A g e n e t i c h y o t h e s i s . N E n g l J M e d 3 0 2 , 1 2 5 4 ( 1 9

8 0 ))。

(神経芽細胞腫の予後を推定する遺伝子）

最近の分子生物学的研究の進展により、神経成長因子（n e r V e g r o w t h f a c t o r : NGF) の高親和性レセプターである T r k Aの発現が分化と細胞死の制御に深くかかわつていることが明らかとなってきた（N a k a g a w a r a A. T h e N G F s t o r y a n d n e u r o b l a s t o m a . Me d P e d i a t r O n c o l 3 1， 1 1 3 ( 1 9 9 8))。 T r kは神経栄養因子の高親和性受容体で、膜貫通型受容体であり、 T r k—A、 B、 Cの 3つが主なものである。

T r kファミリー受容体は、中枢神経および末梢神経系において、特異的な神経細胞の分化と生存維持に重要な役割を果たしている（中川原等：神経芽細胞腫におけるニューロトロフィン受容体の発現と予後小児外科 2 9 : 4 2 5— 4 3 2、 1 9 9 7)。腫瘍細胞の生存や分化は T r kチロシンキナーゼゃ R e tチロシンキナーゼからのシグナルで制御されている。なかでも、 T r k A受容体の役割は最も重要で、予後良好な神経芽細胞腫では T r k Aの発現が著しく高く、これからのシグナルが腫瘍細胞の生存 '分化、または細胞死（アポトーシス）を強く制御している。一方、予後不良神経芽細胞腫では、 T r k Aの発現が著しく抑えられており、これに代わって T r k Bあるいは R e tからのシグナルが生存の促進という形で腫瘍の進展を助長している。

また、神経の癌遺伝子である N-m y cの増幅が神経芽細胞腫の予後に関連していることが明らかになつてきた（中川原：脳 ·神経腫瘍の多段階発癌 Mo l e c u l a r Me d i c i n e 3 6 4 , 3 6 6 ( 1 9 9 9 ))。この遺伝子は神経芽細胞腫で初めてクローユングされたが、正常細胞や予後良好な神経芽細胞腫では通常 1倍体当たり 1つしか存在しないのに対し、予後不良の神経芽細胞腫においては数十倍に増幅されるのが見つかった。

しかしながら、現在までに神経芽細胞腫に発現されている癌遺伝子は N-my c以外に知られておらず、その予後の良不良に関する遺伝子情報に関しても N— my c と T r k A以外についてはほとんど知られていなかった。

発明の開示

本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、神経芽細胞腫の予後良不良に関係する遺伝子配列を明らかにし、その遺伝子情報の提供および予後良不良に関する診断を可能とすることを目的とする。

本発明者らは鋭意研究した結果、ヒト神経芽細胞腫の予後を検定し、予後良好および予後不良の臨床組織の各々から c DNAライブラリーを作製することに成功した。この 2種類の c DNAライブラリーから各々約 2 4 0 0クローンをクローユングし、神経芽細胞腫の予後の良悪によつて分類した。さらに本発明者は、分類された遺伝子のうち、いくつかで神経芽細胞腫の予後不良な臨床組織でのみ発現が増強している遺伝子を見いだした, かかる知見に基づき、本発明者は少なくとも予後不良な臨床組織でのみ発現が増強している遺伝子を検出おょぴクローニングするための塩基配列情報を提供することを可能とした。

さらに、当該領域の塩基配列情報に基づき、予後同定の方法およびそのために使用可能な腫瘍マーカーを設計することを可能とする塩基配列情報を提供することを可能とし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、予後良好な、および不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後不良なヒト神経芽細胞腫で発現が増強していることを特徴とする配列表の配列番号 1から 6 9のうちのいずれか一つに記载の塩基配列からなる核酸を提供することを目的とし、さらに、配列表の配列番号 1から 6 9に記載の塩基配列のうち、いずれかの塩基配列の —部からなる核酸を提供することを目的とする。また、上記核酸と、もしくはその相捕的な核酸とストリンジェントな条件下でハイプリダイズすることを特徴とする単離された核酸を提供する。

本発明の核酸は、予後良好な、および不良な神経芽細胞腫の比較により、予後不良な神経芽細胞腫においてのみ発現の増強が認められたものであり、これらの核酸はヒト神経芽細胞腫の予後の診断に用いることができることを特微とする。その目的で特に好適な核酸は、配列表の配列番号 2 1または配列番号 6 4に記載の塩基配列からなる核酸、或いはその関連の核酸（塩基配列の一部からなる等）である。

また、本発明は、配列表の配列番号 1から 6 9に記載の塩基配列の一部または全部からなる核酸のうち少なくとも一つの核酸を含有することを特徴とする神経疾患検出用診断薬を提供する。このような腫瘍検出用診断薬としては、具体的には、例えば、前記核酸を用いて製造した D N Aチップやマイクロアレイが挙げられる。そこで、本発明は、配列表の配列番号 1から 6 9に記載の塩基配列の一部または全部からなる核酸を複数個含むことを特徴とするマイクロアレイ用組成物をも提供する。このような組成物は、好ましくは全ての核酸（すなわち、各々が配列表の配列番号 1から 6 9に記載の塩基配列の一部または全部からなる計 6 9 個の核酸）を含む。

さらに、本発明に従えば、上記核酸と、もしくはその相捕的な核酸とストリンジェントな条件下でハイプリダイズすることを特徴とする単離された核酸であって、 D N Aであるものも提供される。このような核酸 ( D N A ) の一対からなるプライマーセットを有効成分とするヒト神経芽細胞腫の予後の診断キットもさらに提供される。

加えて、本発明は、神経芽細胞腫の臨床組織サンプルから配列表の配列番号 1から 6 9のうちいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸の有無を検出することを特徴とする、ヒト神経芽細胞腫の予後の診断方法を提供する。

図面の簡単な説明

図 1は、半定量的 P C Rによる予後良好 ·不良ヒト神経芽細胞腫における遺伝子発現量の測定結果の一例を示す電気泳動写真に対応する図である。

図 2は、新生マウス S C Gニューロン含む一次培養物の電子顕微鏡写真に対応する図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明における「核酸」という用語は、例えば D N A、 R N A、または誘導された活性な D N Aもしくは R N Aでありうるポリヌクレオチドを指し、好ましくは、 D N Aおよび/または R N Aをいう。

「ストリンジェントな条件下でハイプリダイズする」という用語は、 2つの核酸断片が、サムブルックら（S a mb r o o k , J .) の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（E x p r e s s i o n o f c 1 o n e d g e n e s i n E. c o l i )」 (Mo l e c u l a r C 1 o n i n g ： A l a b o r a t o r y m a n u a l ( 1 9 8 9 )) じ o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , N e w Y o r k , U S A, 9. 4 7-9. 6 2および 1 1. 4 5-1 1. 6 1に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。

より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約 4 5 °Cにて 6. 0 X S S Cでハイブリダイゼーションを行った後に、 5 0 °Cにて 2. 0 X

S S Cで洗浄することを指す。ストリンジエンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジエンシーとしての約 2. 0 X S S C、 5 0でから、高ストリンジエンシーとしての約 0. 2 X S S C、 5 0°Cまで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェェンシー条件の室温、約 2 2 から、高ストリンジエンシー条件の約 6 5 °Cまで増大させることができる。

本明細書でいう「単離された」とは、組換え DNA技術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。また、本発明の核酸は、「単離された」と特記されていない場合でも、単離された核酸を指すものとする。

本明細書でいう「予後良好」とは、ヒト神経芽細胞腫のうち、腫瘍が限局して存在するか、または退縮や良性の交感神経節細胞腫になった状態を指し、 N— my cその他腫瘍マーカーから判断して、悪性度が低いと判断される。本発明の好適な実施の形態では、病期 1または 2、発症年齢が 1歳未満、手術後 5年以上再発なく生存し、臨床組織中に N— m y cの増幅が認められないものを予後良好としたが、このような特定の例には限定されない。また、本明細書で使用する「予後不良」 'とは、ヒト神経芽細胞腫のうち、腫瘍の進行が認められる状態を指し、 N— m y cその他腫瘍マーカーから判断して、悪性度が高いと判断されるものである。本発明の好適な実施の形態では、病期 4、発症年齢が 1歳以上、手術後 3年以内に死亡、臨床組織中に N _ m y cの増幅が認められたものを予後不良としたが、このような特定の例には限定されない。

本発明の核酸は、ヒト神経芽細胞腫の臨床組織より見出されたものであり、かかる核酸は以下のような特徴を有する。

神経芽細胞腫はヒトでは 2種類しか知られていない神経細胞そのものの腫瘍の 1つであり、そこで発現している遺伝子を解析することは、神経細胞のバイオロジーを理解する上で非常に大きな知見をもたらすものと考えられる。すなわち、脳や末梢神経から、部位特異的な均質な組織を得ることは極めて困難で、事実上不可能である。それに反し、神経芽細胞腫は末梢交感神経細胞に由来するほぼ均一な神経細胞集団（腫瘍化してはいるが）から成り、均質に発現している神経関連遺伝子が得られる可能性が高く、また神経芽細胞腫は癌であるため、神経発生の未熟な段階で発現している重要な遺伝子が多いことが特徴として挙げられる。

さらに、神経芽細胞腫は、予後のよいものと予後の不良なものとが臨床的、生物学的にはっきり分けられる。予後良好な神経芽細胞腫である癌細胞は増殖速度が極めて遅く、ある時点から自然退縮を始めることが特徴である。これまでの知見から、この自然退縮は、神経細胞の分化およびアポトーシス（神経細胞死）が起こっており、正常神経細胞の成熟段階で起こる分化とプログラム細胞死と非常によく似た現象が起こっているものであることが分かってきた。したがって、この腫瘍に発現している遺伝子を解析することは、神経の分化やアポトーシスに関連した重要な情報を入手できる可能性が極めて高い。

さらに、予後不良な神経芽細胞腫は明らかに悪性増殖を続ける癌細胞からなる腫瘍である。したがって、神経細胞の増殖に関連した重要な遺伝子や、未分化な神経細胞で発現している遺伝子が多数存在する可能性が高い。つまり、予後良好な神経芽細胞腫で発現している遺伝子のプロファイルとは全く異なる遺伝子情報を入手する可能性が極めて高い。一般的に神経細胞は、他の臓器由来の細胞と比較して、発現している遺伝子の種類が多いと言われている。神経芽細胞腫の細胞株（セルライン）は、予後不良の臨床組織由来であり、腫瘍化に伴い遺伝子発現のプ口ファイルが正常神経細胞と大きく変化しているものと考えられる。また、神経芽細胞腫は小児由来の腫瘍であることも一つの特徴であり、後天的な因子の影響が非常に少ない可能性が高く、癌発生のメカニズムの解析とともに発生学的な情報を入手できる可能性が高いことが予想される。また、さらに驚くべきことに本発明に係る遺伝子または遺伝子断片の中に、ある特定の細胞周期にのみ発現を増強する遺伝子が含まれており、このことからも癌発生のメカニズムの解析および発生、分化に関する非常に有用な情報を入手できる可能性が高いことが予想される。上記特徴を有し、上記情報を入手できる核酸は、ヒト神経芽細胞腫の臨床組織より得られ、配列表の配列番号 1から 6 9の塩基配列、またはその塩基配列の一部の塩基配列を有する。

さらに、ヒト神経芽細胞腫の予後良好なものと不良なものの臨床組織における遺伝子発現量を比較した結果、配列番号 1から 6 9の塩基配列を有する核酸の全てにおいて非常に顕著な差が認められた。すなわち、これらの核酸は予後不良なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されていた。従って、配列番号 1から 6 9の塩基配列は、上記の有用な遺伝子情報以外に；それらの塩基配列を有する D N Aおよび/または R N Aを検出することによって神経芽細胞腫の良不良を診断する腫瘍マーカーの情報としても利用可能である。

すなわち、本発明は、ヒト祌経芽細胞腫およびそれに関連する様々な予後診断を以下の手段により実施可能とする。

( 1 ) ハイプリダイゼーシヨンに用いるプローブ

本発明において開示された塩基配列の一部、または全部からなる核酸 (以下、本発明の核酸ともいう）をハイプリダイゼーシヨンのプローブとして使用することによつて少なくともヒト神経芽細胞腫において発現している遺伝子を検出することが可能である。また、本発明の核酸をハイブリダィゼーシヨンのプローブとして使用し様々な腫瘍、正常組織における遺伝子発現を調べることで、遺伝子発現の分布を同定することも可能である。

本発明において開示された塩基配列の一部、または全部からなる核酸をハイプリダイゼーションのプローブとして使用する場合、ハイプリダィゼーション法自身については特に限定されない。好適な方法としては、例えばノザンハイプリダイゼ——ンョン、サザンハイプリダイゼーション、コロニーハイプリダイゼーション、ドットノヽイブリダィゼーシヨン、 F l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ( F I S H：)、 i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ( I S H；)、 D NAチップ法、マイクロアレイ法、などが挙げられる。

前記ハイプリダイゼーシヨンの 1つの応用例として、本発明の核酸をノザンハイプリダイゼーションのプローブとして用い、検定したサンプル中において m R N Aの長さを測定することや、遺伝子発現を定量的に検出することが可能である。

また、本発明の核酸をサザンハイブリダイゼ一ションのプローブとして用いる場合は、検定したサンプルのゲノム D N A中の、当該塩基配列の有無を検出することが可能である。

また、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部からなる核酸を F l u o r e s c e n c e i n s i t h y b r i d i z a t i o n (F I S H) のプローブとして用いることで、遺伝子の染色体上の位置を同定することも可能である。

また、本発明の核酸を i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ( I S H) のプローブとして用いることでその遺伝子の発現の組織分布を同定することも可能である。

本発明の核酸をハイプリダイゼーション用プローブとして使用する場合は、少なくとも 4 0個の核酸残基の長さが必要であり、本発明に係る遺伝子配列のうち、 4 0個以上の連続した残基を有する核酸が好ましく用いられる。さらに好ましくは、 6 0個以上の核酸残基をもつものが用いられる。

当業者には、核酸プローブ技法は周知であり、個々の長さの本発明に係るプローブと目的とするポリヌクレオチドとの適当なハイプリダイズ条件は容易に決定される。種々の長さを含むプローブに対し至適であるハイプリダイズ条件を得るためのこのような操作は当業者では周知であり、例えばサンブルックら、「分子クローニング：実験手法（Mo 1 e c u l a r し l o n i ii g :A L a b o r a t o r y M a n u a l 第 2版、コールドスプリングハーパー（ 1 9 8 9 )」が参照される。好ましくは、本発明のプローブは、容易に検出されるように標識される。検出可能な標識は、目視によって、または機器を用いるかのいずれかによつて検出され得るいかなる種類、部分であってもよい。通常使用される検出可能な標識は、例えば、 ³²P、 ¹⁴C、 ¹²⁵ I、 ³H、 ³⁵S等の放射性標識である。ビォチン標識ヌクレオチドは、ニックトランスレーション、化学的および酵素的手段等によって、 DNAまたは RNAに組み込むことができる。ピオチン標識されたプローブは、アビジン zストレプトァビジン、蛍光標識剤、酵素、金コロイド複合体等などの標識手段を使用したハイプリダイゼーションの後検出される。核酸はタンパク質と結合させることによって標識されてもよい。また、放射性または蛍光ヒストン一本鎖結合タンパク質に架橋された核酸を使用してもよい。

( 2 ) P C R法に用いるプライマー

遺伝子を検出する方法には他にも、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部からなる核酸である D NAをプライマーとして P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n P C R) 法を用いることにより可能である。例えば、検定したいサンプルから R N Aを抽出し R T— P C R法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。このような方法は当事者にとって周知の方法によって行われる；^、ィ列えば M o l e c u l a r C l o n i n g A L A B O R A T O R Y MA NUA L ( T . M a n i a t i s著： C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s社)、遺伝子病入門（高久史麿著：南江堂）を参照して行うことができる。

本発明の核酸である D N Aを P C R用プライマーとして使用する場合は、 1 0個から 6 0個の塩基の長さが必要であり、本発明に係る遺伝子配列のうち、 1 0個から 6 0個の連続した塩基を有する核酸が好ましく用いられる。さらに好ましくは、 1 5個から 3 0個の塩基をもつものが用いられる。また一般的には、プライマー配列中の G C含量が 4 0 %から 6 0 %が好ましい。さらに、増幅に用いる 2つのプライマー間の Tm 値に差がないことが望まれる。またプライマーの 3，末端でァニールせず、プライマー内で 2次構造をとらないことが望ましい。

( 3 ) 核酸のスクリーニング

本発明において開示された塩基配列の一部、または全部からなる核酸を使用することによって様々な組織や細胞で発現している遺伝子発現の分布を検出することが可能である。例えば、本発明の核酸をハイブリダィゼーシヨンのプローブ、または P C Rのプライマーとして使用することによって、遺伝子発現の分布を検出することが可能である。

また D N Aチップ、マイクロアレイ等を用いても遺伝子発現の分布を検出することが可能である。すなわち本発明の核酸を直接チップ、ァレィ上に張り付けることが出来る。そこに細胞から抽出した R N Aを蛍光物質などでラベルし、ハイブリダィズさせ、その遺伝子がどの様な細胞で高発現しているかを解析することが可能である。またチップ、アレイ上に張り付ける D N Aは本発明の核酸を用いた P C Rの反応産物であつても良い。チップ、アレイ上に核酸を張り付ける方法の一例は、例えば、 H e 1 1 e r ら米国特許第 5 6 0 5 6 6 2号に記載されている。

上記技術を用い、本発明において開示された塩基配列の一部または全部からなる核酸のうち少なくとも一つを用いて診断薬として使用することが可能である。近年、ある疾患に罹患しやすいまたはしにくい、特定の薬剤が効くまたは効かないということが、個々人が持つ遺伝子情報によって支配されているということが明らかになりつつあるが、前記核酸を用いて製造した D N Aチップやマイクロアレイ等を使用することにより、被験者における疾患と前記核酸との因果関係が明らかとなり、当該疾患の診断が可能となるばかりカ投与すべき薬剤の選択が可能となる。特に、 D N Aチップやマイクロアレイによる検出結果を投与すべき薬剤の選択の指標とするには、本発明の核酸のうち一つの核酸の発現量を検討するばかりでなく、二個以上の核酸の発現量を相対的に比較 ·検討し投与すべき薬剤の選択を行うことができ、より正確な判断が可能となる。ここで、前記疾患としては本発明にかかる核酸で診断可能な疾患であれば特に制限はないが、神経疾患であることが好ましく、神経芽細胞腫であることがより好ましい。

( 4 ) D N Aのクローユング

本発明において開示された塩基配列の一部、または全部からなる核酸を使用することによって少なくともヒト神経芽細胞腫において発現している遺伝子をクローユングすることが可能である。例えば、本発明の核酸をノザンハイブリダイゼーションのプローブ、コロエーハイブリダイゼーションのプローブまたは P C Rのプライマーとして使用し、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部を含む遺伝子をクローニングすることが可能である。クローニング可能な遺伝子としては特に、予後不良な神経芽細胞腫と予後不良な神経芽細胞腫で発現量に差がある遺伝子、他の組織や癌細胞での発現様式とは異なって発現している遺伝子、細胞周期依存的に発現している遺伝子、神経分化に伴って誘導される遺伝子、癌遺伝子または癌抑制遺伝子によって発現が制御される遺伝子等が挙げられる。

( 5 ) 腫瘍の予後同定の方法およびそのために使用可能な腫瘍マーカ本発明において開示された塩基配列の一部、または全部からなる核酸をハイブリダィゼーシヨンのプローブ、または P C Rのプライマーとして使用し、試料細胞中の遺伝子発現の増強の有無を調べることにより、予後同定が可能である。遺伝子発現の増強の有無を調べるには、例えば本発明により開示された塩基配列の任意の配列からなる核酸とハイプリダイズし得る核酸（プローブ）を使用する全ての方法が提供される。すなわち試料細胞中にプローブとハイブリダィズする核酸の量が増強する場合、予後が不良であると診断することが可能である。また P C Rのプライマーとして使用する場合は、例えば、検定したいサンプルから R N

Aを抽出し R T― P C R法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。

( 6 ) ァンチセンスオリゴヌクレオチド

本発明の別の実施態様では、本発明に係る塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。本発明を実施する際に考慮されるように、本発明に係る塩基配列に対応する RN Aに結合して、それにより RN Aの合成を阻止することができるそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは容易に調製できる。

( 7) 遺伝子治療

本発明の別の態様では、遺伝子治療に用いられる治療用遺伝子が提供される。本発明を実施する際に考慮されるように、本発明に係る遺伝子を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモータ一により導入遺伝子を発現させ、例えば癌の遺伝子治療に用いることができる。

1. ベクター

導入されうるウィルスべクターは、 D N Aまたは R N Aウィルスをもとに作製できる。 MoMLVベクター、ヘルぺスウィルスベクター、了デノウィルスベクター、 AAVベクター、 I- I I Vベクター、 S I Vベタター、センダイウイノレスべクタ一等のいかなるウィルスベクターであつても良い。また、ウィルスベクターの構成タンパク質群のうち 1つ以上を、異種ウィルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する塩基配列のうち一部を異種ウィルスの塩基配列に置換する、シユードタイプ型のウィルスベクターも本発明に使用できる。例えば、 H I Vの外皮タンパク質である E n Vタンパク質を、小水痘性口内炎ゥイノレス (V e s i c u l a r s t o m a t i t i s V i r u s ： V

S V) の外皮タンパク質である V S V— Gタンパク質に置換したシユードタイプウィルスベクターが挙げられる ( N a 1 d i n i L等： S c i e n c e 2 7 2 2 6 3— ( 1 9 9 6 ) )。さらに、治療効果を持つゥィルスであれば、ヒト以外の宿主域を挎つウィルスもウィルスベクタ一として使用可能である。ウィルス以外のベタターとしてはリン酸カルシゥムと核酸の複合体、リボソーム、カチオン脂質複合体、センダイゥィルスリボソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キヤリァ一等が使用可能である。さらに遺伝子導入系としてはエレクトロポレーシヨン、遺伝子銃等も使用可能である。

2 . 発現プロモーター

さらに、薬物遺伝子に用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく何でも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、シミアンゥイノレス 4 0、ラウス肉 S重ウイノレス、単純へノレぺスゥィルス、マウス白血病ゥィルス、シンビスゥィノレス、 A型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス、パピロ一マゥイノレス、ヒト T細胞白血病ゥイノレス、インフスレエンザゥイノレス、日本脳炎ウィルス、 J Cウィルス、パルボゥィノレス B 1 9、ポリオウイルス等のウィルス由来のプロモーター、アルブミン、 S R α、熱ショック蛋白、ェロンゲーシヨン因子等の哺乳類由来のプロモーター、 C A Gプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。 (実施例）

以下、実施例および製造例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

(製造例 1 ) ヒト神経芽細胞腫からの c D NAの構築

1. サンプノレ入手、

ヒト神経芽細胞腫のサンプルを手術摘出直後に準無菌的に凍結し、その後一 8 0 °Cに保存した。

2. 予後不良サンプルの選別

上記 1で得られたサンプルについて予後の検定を以下の指標をもとに行った。

予後良好：

•病期 1または 2

-発症年齢が 1歳未満

•手術後 5年以上再発なく生存

■ N- m y c の増幅なし

予後不良：

■病期 4

•発症年齢が 1歳以上

-手術後 3年以内に死亡

■ N- m y c増幅あり

このうち N- m y c増幅は以下のように確かめた。すなわち、実施例 1 にて得られた臨床組織を剃刀で細かく切断し、 5 m 1 の T E Nバッファ一（ 5 0 mM T r i s - H C L ( p H= 8 . 0 ) / l mM E D T A / l O O mM N a C 1 ) を加え良くホモジナイズした。この混合液に 7 5 0 μ 1 の S D S ( 1 0 %)、 1 2 5 i l の p r o t e i n a s e K

( 2 0 m g /m 1 ) を加え、軽く混和し 5 0 °Cで 8時間放置した。その後、フエノール ' クロ口ホルム処理を行い、最後にエタノール沈殿により、ゲノム DN Aを精製した。 5 μ gの得られたゲノム DN Aを制限酵素 E c o R I (N E B社製）で完全に消化し、 N- my cのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーシヨンにより N- m y c増幅を調べた。 3. 予後不良なヒト神経芽細胞腫の臨床組織から mRN Aの調製

上記 2において予後不良であると判断されたヒト神経芽細胞腫の臨床組織 2— 3 gを T o t a l R NA E x t r a c t i o n K i t (Q I GE N社製）用いてトータル R N Aを抽出した。抽出したトータノレ RNAをオリゴ d Tセノレロースカラム（C o 1 1 a b o r a t i v e 社製）を用いて p o l y A構造を有する mRNAのプールを精製した。

4 · m R N Aの脱リン酸化

上記 3において調製した 1 0 0— 2 0 0 gの mR N Aのプールを 6 7. 3 1 の 0. 1 %ジェチルピロカーボネート（D E P C) を含む蒸留滅菌水に溶解させ、 2 0 μ 1 の 5 ΧΒΑΡノッファー（T r i s —H C 1 ( 5 0 0 mM、 p H = 7. 0)/メルカプトエタノーノレ（ 5 0 mM))、

2. 7 μ 1 の RN a s i n ( 4 0 u n i t / μ 1 : P r o m a g a社製）、 1 0 1 の BA P (0. 2 5 ιι η ί ΐ Ζμ 1 、ノクテリァ由来アル力リフォスファターゼ：宝酒造社製）を加えた。この混合液を 3 7 °Cで 1時間反応させ、 mRNAの 5，末端の脱リン酸化処理を行った。その後、フエノール ' クロ口ホルム処理を 2回行い、最後にエタノール沈殿により、脱リン酸化 mRNAのプールを精製した。

5 · 脱リン酸化！ nRNAの脱キヤップ処理

上記 4において調製した脱リン酸化 mRNAのプールの全量を 7 5 · 3 μ 1 の 0. 1 %D E P Cを含む蒸留滅菌水に溶解させ 2 0 μ 1 の 5 X TA Pバッファー（酢酸ナトリウム（ 2 5 0 mM、 p H= 5. 5 ) Zメルカプトエタノール ( 5 0 mM)、 ED TA ( 5 mM、 p H= 8. 0)、 2. 7 μ 1 の R N a s i n ( 4 0 u n i t s / μ 1 )、 2 μ 1 の TA P (T

0 b a c c o a c i d p y r o p h o s p h a t a s e ： 2 0 u n

1 t s / μ 1 )) を加えた。この混合液を 3 7 °Cで 1時間反応させ、脱リン酸化 mR NAの 5 ' 末端の脱キャップ処理を行った。この際キャップ構造を持たない不完全長の脱リン酸化 mR NAは脱キヤップ処理されず

5，末端は脱リン酸化された状態に留まる。その後、フエノール · ク口口ホルム処理、エタノール沈殿により、脱キャップ mRNAのプールを精製した。

6. オリゴキャップ mRNAの調製

上記 5において調製した脱キヤップ: mR NAのプールの全量を 1 1 μ

1 の 0. 1 %D E P Cを含む蒸留滅菌水に溶解させ、 4 μ 1 の 5 ' —ォリゴ R NA ( 5 ' -AG C AU C GA GU C G G C C UUG G C C UA C UG G— 3 ' ： 1 0 0 n g / 1 Ι Ο μ Ι の 1 0 X 1 i g a t i o nバッファー（T r i s— H C 1 ( 5 0 0 mM、 p I- I = 7. 0 ) /メルカプトェタノール（ 1 0 0 mM))、 1 0 μ 1 の塩化マグネシウム（ 5 0 mM)、 2. 5 μ 1 の AT P ( 2 4 mM)ヽ 2. 5 μ 1 の RN a s i n ( 4 O u n i t s / l l O /i l の T 4 RNA 1 i g a s e ( 2 5 u n i t s / / 1 ：宝酒造社製）、 5 0 μ 1 のポリエチレングリコ一ノレ ( 5 0 % w / V , P E G 8 0 0 0 ：シグマ社製）を加えた。この混合液を 2 0 °Cで 3時間反応させ、脱キャップ mR NAの 5 ' 末端に 5 ' —オリゴ

R NAを連結した。この際キヤップ構造を持たない不完全長の脱リン酸化 mR NAは、 5 ' —オリゴ RNAが連結されない。その後、フエノーノレ ' クロ口ホノレム処理、ェタノ一ノレ沈殿により、オリゴキヤップ m R N Aのプールを精製した。

7. オリゴキヤップ mRNAからの D N A除去

上記 6において調製したオリゴキヤップ mR N Aのプールを 7 0. 3 1 の 0 . 1 %D E P Cを含む蒸留滅菌水に溶解させ 4 1 の T r i s - H C 1 ( 1 M、 p H= 7 . 0 )、 5 . 0 μ 1 の D T T ( 0. 1 M)、 1 6 μ 1 の塩化マグネシウム（ 5 0 mM)、 2. 7 μ 1 の R N a s i n ( 4 0 u n i t s / 1 )、 2 μ 1 の D N a s e l ( 5 u n i t s / μ 1 ：宝酒造社製）を加えた。この混合液を 3 7 °Cで 1 0分間反応させ、余分な

D N Aを分角军した。その後、フエノール ' クロ口ホルム処理、エタノール沈殿、力ラム精製（ S — 4 0 0 H R ：フアルマシアバイオテック社製）により、 D NA (—）オリゴキャップ mR N Aのプールを精製した。 8 . 1 s t s t r a n d c D N Aの調製

上記 7において調製した D NA (—）オリゴキャップ mR NAのプールを S u p e r S c r i t I I (ライフテックオリエンタル社製キット）を用いて逆転写し、 1 s t s t r a n d c D N Aのプールを得た。 D NA (—）オリゴキャップ m R NAのプールを 2 1 μ 1 の滅菌蒸留水に溶解させ、 1 0 /i l の l O X F i r s t S t r a n dノッファー（キット付属品）、 8 μ 1 の d N T P m i x ( 5 mM、キット付属品）、 6 / l の D T T ( 0. 1 M、キット付属品）、 2 . 5 1 のオリゴー d Tァダプタープライマー ( 5 p m o 1 / μ 1、 5，一 G C G G C T GAA G A C G G C C T A T G T G G C C T T T T T T T T T T T T Τ Τ Τ Τ Τ一 3 ' ) 2. 0 μ 1 の R N a s i n ( 4 0 u n i t s / μ 1 )、 2 μ 1 の S u p e r S c r i t I I R T a s e (キット付属品）を加えた。この混合液を 4 2 °Cで 3時間反応させ、逆転写反応を行った。その後、フエノール ' クロ口ホルム処理、アルカリ処理、中和処理にて全ての R N Aを分解し、エタノール沈殿で精製した。

9 . 2 n d s t r a n d c D NAの調製

上記 8で調製した 1 s t s t r a n d c D N AのプールをG e n e Am p (パーキンエルマ一社製キット）を用いて P C Rにて増幅を行った。 1 s t s t r a n d c D N Aのプーノレを 5 2. 4 1 の滅菌蒸留水に溶解させ、 3 0 ^ 1 の 3 . 3 X R e a c t i o nノッファー (キット付属品）、 8 μ 1の d N T P m i x ( 2 . 5 mM、キット付属品）、 4. 4 / 1 の酢酸マグネシウム（ 2 5 mM、キット付属品）、 1 . 6 μ 1 のプライマー F ( 1 0 p m ο 1 1、 5， — A G C A T C G A

G T C G G C C T T G T T G - 3 ' )、 1 . 6 μ 1 のプライマー R ( 1 0 p m o \ / μ 1 , 5 ' - G C G C T G AA G A C G G C C T A T G T - 3 ' )、 2 μ 1 の r T t h (キット付属品）を加えた。この混合液に、 1 0 0 /. 1 のミネラルオイルを静かに加え重層した。この反応液を 9 4 °C で 5分間変性させた後、 9 4 °C、 1分間 ' 5 2 °C、 1分間 · 7 2 ¾、 1

0分間を 1サイクルとして 1 2サイクル繰り返し、さらに 7 2 °Cで 1 0 分間放置し P C R反応を行った。その後、フエノール ' クロ口ホルム処理、ェタノール沈殿で精製し 2 n d s t r a n d c D N Aのプールを得た。

1 0. 2 n d s t r a n d c D NAの S f i l処理

上記 9で調製した 2 n d s t r a n d 。 0 のプールを 8 7 1 の滅菌蒸留水に溶解させ、 1 0 X N E Bバッファー（N E B社製）、 1

0 0 X B S A (ゥシ血清アルブミン、 N E B社製）、 2 μ 1の S f i I (制限酵素、 2 0 u n i t s / / l、 N E B社製）を加えた。この混合液を 5 0 °Cでー晚反応させ、 S f i Iによる制限酵素処理を行った。その後、フエノール ■ ク口口ホルム処理、ェタノール沈殿で精製し両末端が S f

1 I処理された c D NAのプールを得た。

1 1 . S f i l処理された c D N Aのサイズ分画

上記 1 0で調製した S ί i I処理された c D N Aのプールを 1 %のァガ口ースゲノレで電気泳動し、 2 k b以上の分画を G e n e c l e a n

I I (B i o 1 0 1社製）を用いて精製した。精製した c D N Aのプールは Ι Ο Ο μ 1 の滅菌蒸留水に溶解させ、 3 7 °Cで 6時間放置した。その後、フエノール ' クロ口ホルム処理、エタノール沈殿で精製し長鎖 c D N Aのプールを得た。

1 2. c D NAライブラリ一の調製

上記 1 1で調製した長鎖 c D N Aのプールを D N A L i g a t i o n k i t v e r . 1 (宝酒造社製キット）を用いてクローニングべクタ一である p ME 1 8 S— F L 3 (東京大学医科学研究所菅野純夫先生より供与）にライゲーシヨンを行った。長鎖 c D NAのプールを 8 μ 1 の滅菌蒸留水に溶解させ、あらかじめ制限酵素 D r a I I I で処理された l / l の p ME 1 8 S — F L 3、 8 0 μ 1 の S o l u t i o n

A (キット付属品）、 1 0 μ 1 の S ο 1 u t i o n B (キット付属品）を加え、 1 6 °Cで 3時間反応させた。その後、フエノール ' クロロホルム処理、ェタノール沈殿で精製し c D NAライブラリ一を得た。

(実施例 1 ) 大腸菌へのトランスフォーメーション

製造例 1で調製した c D NAライブラリ一を大腸菌（ T O P— 1 0 ：

I n V i t r o g e n社製）にトランスフォーメーションした。 c D N Aライブラリーを Ι Ο μ Ι の滅菌蒸留水に溶解し、 Τ Ο Ρ— 1 0に混合した。その後、氷上にて 3 0分間、 4 0 °〇で 1分間、氷上で 5分間インキュベートした。 5 0 0 μ 1 の S Ο Β培地を加え、 3 7 °Cで 6 0分間振盪培養した。アンピシリンを含む寒天培地上に適量づっ播種し、 3 7 °C で一昼夜培養して、大腸菌クローンを得た。

得られた寒天培地上の大腸菌クローンを、爪楊枝にて拾い上げ、 9 6 穴プレートに準備した 1 の L B培地中に懸濁させた。この 9 6 穴プレートを 3 7 °Cで一晚静置し、大腸菌の培養を行った。その後 6 0 % グリセ口ール溶液を 7 2 μ 1加え、一 2 0 °Cで保存した (グリセ口一ノレストツク）。 (実施例 2 ) 塩基配列の決定

1. プラスミドの調製

実施例 1で調製した 1 0 μ 1のグリセ口一ルストツクを 1 5 m l の遠心チューブに移し、 3 m 1 の L B培地、 5 0 μ g / 1 のアンピシリン加え、 3 7 °Cでー晚振盪し大腸菌の培養を行った。その後、 Q I A G E

N社の Q I A p r e p S i n M i n i p r e p K i tを用いて大腸菌からプラスミド D NAを抽出、精製した。

2. 両末端シークェンスの解析

上記 1で調製したプラスミド D NAを D NA S e q u e n c i n g K i t (A B I社製キット）を用いて両末端のシークェンスを決定した。

6 0 0 n gのプラスミド D NA、 8 /z 1 のプレミックス（キット付属品）、

3 . 2 p m o 1 のプライマーを混合し滅菌蒸留水で合計 2 0 1 になるように調製した。この混合液を 9 6 °Cで 2分間変性させた後、 9 6 °C、 1 0秒間 · 5 0 °C、 5秒間 ■ 6 0 °C、 4分間を 1サイクルとして 2 5サィクル繰り返し反応を行った。その後エタノール沈殿で精製した。変性条件下でポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、配列解析を行つた。解析には A B 1 3 7 7 (A B I社製）を用いた。

(実施例 3 ) データベースを用いたホモ口ジー検索

実施例 2で両末端シークェンスを解析したサンプルについてィンターネットを介した D NA配列のホモロジ一検索を行った。ホモロジ一検索には N C B I (N a t i o n a l C e n t e r o f B i o t e c ' h n o 1 o g y I m f o r m a t i o n U S A) の B L A S Tを用いた。

(実施例 4 ) 半定量的 P C Rによる予後良好 ·不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量の測定

実施例 3で得られた、遺伝子の一部から、 P C Rプライマーを合成し、ヒト神経芽細胞腫の予後良好'不良の臨床組織で発現量を比較定量した。実施例 1で示した方法でヒト神経芽細胞腫の臨床組織より m R NAを抽出し、 r T a q (宝酒造社製）を用いて P C R反応を行った。 5 μ 1 の滅菌蒸留水、 2 μ 1 の m R NA、 1 μ 1 の l O X r T a qノッファー、 1 1の 2 mM d N T P s、各々 0. 5 1の合成プライマーセット、

0. 5 μ 1 の r T a qを混合した。この混合液を 9 5。じで 2分間変性させた後、 9 5 °C、 1 5秒間 ■ 5 5 °C、 1 5秒間 · 7 2 °C、 2 0秒間を 1 サイクルとして 3 5サイクル繰り返し、さらに 7 2 °Cで 6分間放置し P C R反応を行った。この反応液を 1 %のァガロースゲルで電気泳動した。半定量的 P C Rによる予後良好 ·不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量の測定結果の一例を図 1に示す。なお、図 1中の各レーンの説明は以下のとおりである。

レーン 1〜 8 ：予後良好神経芽細胞腫臨床サンプルにおける配列表の配列番号 2 1に記載の塩基配列からなる核酸に対応する遺伝子の発現レーン 9〜 1 6 ：予後不良神経芽細胞腫臨床サンプルにおける配列表の配列番号 2 1に記載の塩基配列からなる核酸に対応する遺伝子の発現レーン 1 7〜 2 4 ：予後良好神経芽細胞腫臨床サンプルにおける GAPDH の発現

レーン 2 5〜 3 2 ：予後不良神経芽細胞腫臨床サンプルにおける GAPDH の発現。

この結果、配列番号 1から 6 9の塩基配列においては、予後不良ヒト神経芽細胞腫でのみ発現量が增強する核酸が確認された。

(実施例 5 ) マウス上頸神経節細胞における N G F調節アポトーシスにより発現量が変化する遺伝子群

ヒト神経芽細胞で抗分裂剤（例えば、ネオカルジノスタチン）により誘導されるアポトーシスに対して、 N G F (神経成長因子）が保護作用を呈することが知られている（C o r t a z z o MH ， J . N e u r o s c i , 1 6， 3 8 9 5 - 3 8 9 9 ( 1 9 9 6 ))。この作用は、 p 7 5に N G Fが結合して、アポトーシスを抑制するためであると考えられている。また、臨床段階での神経芽腫の退縮（予後良性化）は、腫瘍細胞でのアポトーシスと関連があるとの指摘もある。

そこで、神経芽腫細胞中でのアポトーシス関連遺伝子を同定する目的で、マウス上頸神経節細胞における NG F調節アポトーシスにより発現量が変化する遺伝子群を調べた。

まず、 0〜 1 日齢 C 5 7 B LZ6 ; [マウス 7〜 1 0匹から上頸神経節細胞（S CGェユーロン）を分離した。 2 4ゥヱル細胞培養用プレートに 1 ゥエル当たり約 l〜 2 x 1 0⁴個の細胞を 7ゥェル培養することにした。さらに、約 1〜 2 χ 1 0⁴個の細胞から RNAを回収した（ 0 日対照）。

前記 7ゥエルの細胞に N G F ( 5 m g /m 1 ) を添加した培養液を 5 日間、培養した後、 1 ゥエルの細胞から R N Aを回収した（ + NG F、

5 日後）。 6ゥエルの各 3ゥエルの培養液を N G F ( 5 m g /m 1 ) または抗 NG F抗体（ 1 %) を添加した培養液で、交換して、それぞれ 1 2、 24、 4 8時間培養した。一部のサンプルについては、 NG Fを添加した場合と抗 NG F抗体を添加した場合の形態学的な相違を確認するために、細胞を電子顕微鏡で観察した。この結果を図 2に示す。 NG Fを添加した細胞では、 NG F誘導分化が見られたが、抗 NG F抗体を添加した細胞ではアポトーシスが見られた。抗 NG F抗体による NG F除去（N G F d e p l e t i o n) の結果、アポトーシスが誘導されたことが明らかである。上記の 1 2、 2 4、 4 8時間培養後の各ゥエルの細胞から R N Aを回収した。これらのサンプノレを + N G F 12hrs、 + N G F 24hrs、

+ NG F48hrs、一 NG F12hrsヽ _NG F24hrs、および一 NG F48hrs と表示することにする。

上記のようにして、約 1 6 0匹のマウスから得た各処理細胞の R NA をェタノール沈殿法で濃縮して、 1 j _gの R NAから逆転写酵素を用いて、 c D N Aを合成した。これら c D NAをテンプレートとして、 P C Rにより遺伝子の発現量の比較を行った。ここで使用したプライマーは、ヒト神経芽細胞で見出される遺伝子を基に検索したマウスの相同遺伝子から作成した。発現比較に使用したプライマーの塩基配列を比較のターゲットとなる遺伝子の識別番号（ I D ) と共に表にまとめたものが、表 1である。

プライマー名プライマ一配列プライマ一名プライマー配列 nbla00031m-F3 TCAGAAGGCTTCGAGACT6 n l a00031m- 3 GCAGATATCTTGTCAAAGGT nbl a00100m-f aGTGAGCCGTAACATCCACA nb!aOOIOOm-r AGCCCGTAAGCGATCAATG nb!a00115m-F3 ATGATGGTGAAAGGCACGTC nbla00115m-R3 CATAATTTCCACGTGTTGTG nbla00116m-F3 AGAGGTTAGCCCTGAGACAG nbla00116m-R3 TGTATGGTTCCAGCAGGTAC nbla0012½-F3 CCTTTATATTAGAAGGTGGC nbla00124m- 3 TAGGTTTTCAGGAGTTGG nb 00144m-F GGA6GATAGCAACCTTGACA nb!aOOH4m-R ATGCATGCTTTGGTGTGTTG nbla00150m-2f CAGCCTGGAGAAACACAAACTG nbla00150m-2r ATGCCGTCCATCTTCATCAC nbla00170m-F3 AACATGAATCTGTGG6TGAG nbla00170m-R3 TCAATCGCTTGACCTTCCTC nbla00204m-F3 AAGGATTGAAGTAACAACGG nbla00204m-R3 TGCATTTGACATATGAGAGC nbl a00225m-F2 TATTAGAACGTGGGCCTCCA nbla00225m- 2 TCGGGACTAGCAG6ACAGAA nbIa00301m-F3 TAAACCAGCAACCCTAACAG nbla00301m-R3 ACTAGAATCAGACCTGCCTT nblaO0315m-F AAGTGGCAGCAAAGAAGGTG nblaO0315m-R AGCAGAAGGACGTCAGTAAGG nbla00402m-F2 TCACCCAGAATGAGACATGG nbla00402m-R2 GTCAGAAGGTGACACGeTGA nbla00433m-F3 CCCAAGGAGGTAAGAGCGTG nbla00433m-R3 AAGCGCTGGAGGTTGTCGGT nbla00437m-F3 AGAACGGTGTAATTCAGAGA nbla00437m-R3 GTCATCAGCAA6CTCGAATA nbla00537m-F3 TTTATATrA6AAC6T6GCGC nbla00537m-R3 AGGACTTGGTAGCTTCrCGG nbla00551m-F TiTTAAAAAGGCAGGATATACAAC nbla00551m-R MGGA6AGGTA6CATTTTATGTGC or i 00660m - F GGGATCCTCATCTCCTGAGA or i00660m-R TCTGAAGCAGTTCGAAGCAC nbla00761m-f TGGTTCAAACTGTTCCCTCCT nbla00761m-r GTTGCACGTGTGCGTTTTCT nbla0083t[n-F3 TGGGAAArCGACCTGGArG nbla00831m- 3 ACCA6GiCACCCT6AAT6TG nbla00908m-2f CGT6GCAACACCTTTTTATTG nbla00908m-2r ACACGGCATGGGTTTGTT nbla02874m-f TGAGGAGTTGAATGCTGACCT nbla02874m-r CATCGGGGTTAATGCTCTTG nbl a03086m-f ACTTGCTGATGGTGCTQTGTC nblaO3086m-r CGGAGAGCGTGGTAATCTTC nb!a03n3m-F CCTCAA6AACCA6ACCAAGC nbIa03H3[n-R CTGATGCTGAGGAGCTGACA nb!a03199m-f GGCCACCAGAGAGGTAATG nbla03199m-r GTGCTGACCTAA6ACCCAAAG nbla03267m-f CTGCCTTTGAGATGGTGATa nbla03267m-r TGTAGTGCTTTGCATTGTTGG nbl a03646m~f TACCTCTTCG6CTGGATGG nbl a03646m-r GGTTGGGCAGGATGAATG nbIa03755m-F AGCCGATGAAGT6TCT6CTT nb la03755m- AGCCACAAAA6GAGGTTAGG nbla03771m-f GCAGCAGATATAGGGACACAGA nbla03771m-r CACGCATAAATG6CTACACC nbl a03777m-F3 AGATTATTCACCTGTAAGC nbl a03777m-R3 TTTTCGAGATGTCCAGCACC nb!a03831m-f GT6ACCAGCAAGGAAACACA nbla03831m-r GA6GATTCAGCCAGGAACA nbla03862m-F GCATGGA6GAAACCATTAGG nbla03862m-R TGGCTCTTCAACCAAACGTT nbl a04021m-F2 ATGACCTGGCACTAGGCTTG nbla04021m-R2 AACAGATCTGCTGGCTTCTG nbl a04137m- f ACGACGACACTGAGAACCAC nbl a04137m-r GGTTGAGGTCCGACTGATCT nbia04196m-f CACCCATGTGTGTCTaTGGT nbla04196m-r CGTGCTGACGATGATGTTG nbla04261m-2f GT6TTT6GCACTACATCACCA nb\a0426{n)-2r CCG6GTTTTCCATTTTCAC nbl a04300m-f TACAGTG6GAACTGCGTTT6 nbl a04300m-r CAGGGTTCGTATGCA6GAG nbla10058m-f AGCCATTACAGGT6GCAAGA nbla10058m-r GTTGGGTCGATCTTAGGAGGTAG nb 10070m-F3 TAACAACTCTAGCACCATC nbla10070m-R3 TACTTAGCAGAAGAGAAGAG nbla10071m-f GTGGACACC GAAT6GAAG nbla10071m-r CAGCCAACTGTGGTAAGAAGG nbla10120m-F CAGTGCA6CCTTG6AAGTGT nbl al0120m-R TGAAAAGCTGCGTGTGTCTC nbla10143m-F3 TTAGTGAGTACACGAGCTGG nbia10143m-R3 AGTTAACCCAGACTGACCAC nblat0283ni-F3 A6ATGTTTAAGG6CAAACC 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遺伝子発現量の変化が観察された遺伝子について、以下のような結果が得られた。 NG F d e p l e t i o n (— NG F) によって、発現量の減少が見られた遺伝子は、 nbla-03267 (配列番号 2 1 ) (ただし、 2 4

- 4 8 h/-NG F 24hrs NG F 48hrs) であった。また、この遺伝子に関して、別の条件下 (-N G F 12hrs) では、発現量の増加が観察された。さらに、 N G Fの添加により、発現量は減少した。同様に、 nbla-11589 (配列番号 6 4) は、 NG F d e p l e t i o nによって、発現量の増加を、また NG Fの添加により、発現量の減少を示した。

これら特定の遺伝子を増幅するのに使用した、プライマー . セットを表 2に示す。

表 2

上記のように、 NG F d e p 1 e t i o nによって、上頸神経節細胞は死滅 (アポトーシス) することが知られているので、その際発現量の変化を示す遺伝子は、アポトーシスの機構に密接に関連している。

産業上の利用可能性

以上説明したように、本発明によれば、神経芽細胞腫の予後良不良に関係する遺伝子配列を明らかにし、その遺伝子情報の提供および予後良不良に関する診断が可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 予後良好な、および不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後不良なヒト神経芽細胞腫で発現が増強していることを特徴とする配列表の配列番号 1から 6 9のうちのいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸。

2 . 前記塩基配列が配列表の配列番号 2 1または配列番号 6 4に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項 1に記載の核酸。

3 . 配列表の配列番号 1から 6 9に記載の塩基配列のうち、いずれかの塩基配列の一部からなる核酸。

4 . 前記配列の一部が配列表の配列番号 2 1または配列番号 6 4に記載の塩基配列から得られることを特徴とする請求項 3に記載の核酸。

5 . 請求項 1または 3に記載の核酸と、もしくはその相補的な核酸とストリンジユントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする単離された核酸。

6 . 配列表の配列番号 1から 6 9に記載の塩基配列の一部または全部からなる核酸のうち少なくとも一つの核酸を含有することを特徴とする神経疾患検出用診断薬。

7 . 前記塩基配列が配列表の配列番号 2 1または配列番号 6 4に記载の塩基配列であることを特徴とする請求項 6に記載の神経疾患検出用診断薬。

8 . 核酸が D N Aであること特徴とする請求項 5に記載の単離された核

9 . 請求項 8に記載の単離された核酸の一対からなるプライマーセットを有効成分とするヒト神経芽細胞腫の予後の診断キット。

1 0 . 神経芽細胞腫の臨床組織サンプルから配列表の配列番号 1から 6 9のうちいずれか一つに記載の塩基配列からなる核酸の有無を検出することを特徴とする、ヒト神経芽細胞腫の予後の診断方法。