WO2002095026A1 - Procede permettant de faire proliferer des cellules a differenciation terminal et vecteur de recombinaison pour la mise en oeuvre de ce procede - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for growing terminally differentiated cells and a recombinant vector used for the same, and more particularly, to terminal differentiation using cyclin and cyclin-dependent kinase.
  • the present invention relates to a method for growing cells. Background art
  • CDK cyclin-dependent kinase
  • CDK activity is regulated by a group of inhibitors called CDK inhibitors. Based on their primary structural characteristics and specificity of the inhibitory CDK, they are roughly divided into two groups: the INK4 (Inhibitor of CDK4) family and the CIP / KIP (CDK interacting protein / kinase inhibitory protein) family. If the cell cycle progress is compared to driving a car, CDK is an accelerator and CDK inhibitor is a factor playing a role in brake. The accelerator and brake cooperate to regulate the progress of the cell cycle. Have been.
  • INK4 Inhibitor of CDK4
  • CIP / KIP CDK interacting protein / kinase inhibitory protein
  • D-type cyclins are expressed from mid to late G 1 in response to growth stimuli. Its transcription is promoted by Ras / Raf-1 / MAPK, and its degradation is suppressed by P13K (phosphatidyl inositol 3-kinase) / Akt (protein kinase B). CDK4 and 6 bind to D-type cyclin, translocate into the nucleus, and become activated by phosphorylation by CAK (CDK-activating kinase).
  • D-type cyclins increase It is thought that the expression of the proliferative signal is an intracellular sensor that is induced in response to the proliferative signal and acts to transmit the signal to CDK2 and CDC2, which actually progress through the cell cycle.
  • the role of D-type cyclins / CDK4,6 in cell cycle progression is thought to have two roles. One phosphorylates RB (retinoblastoma gene protein) and releases its growth inhibitory effect. The other is to trap CI PZK IP. The presence of CIP / KIP alone in cells inhibits CDK2 activity that appears late in G1. D-type cyclin / CDK is thought to reduce CDK2 inhibitory activity by these inhibitors in cells by binding to CIP / KIP.
  • the substrate targeted by the CDK during the G1 phase of the cell cycle is RB.
  • RB is known to interact with many proteins, the key of which is the transcription factor E2F.
  • E2F regulates the transcription of genes required for cell cycle progression and DNA replication, e.g., activates cyclin E transcription and plays an important role in the initiation of S phase through the action of cyclin E / CDK2 are doing.
  • RB binds strongly to E 2 F, preventing E 2 F from promoting DNA replication.
  • RB is phosphorylated by CDKs that progress through the cell cycle, and phosphorylated RB loses its ability to suppress E 2 F and is inactivated.
  • RB and E2F have similar proteins, respectively, and have been called RB family and E2F family proteins.
  • progression from the G1 to S phase of the cell cycle is a process that is highly regulated by RB and E2F family members.
  • this RB-E2F pathway is involved in many life phenomena such as cell division, canceration, and apoptosis.
  • inactivation of the above RB and the like leads to cell canceration due to abnormal cell cycle regulation, and many such cell cycle regulatory genes have been reported as cancer suppressor genes.
  • terminally differentiated cells such as cardiomyocytes and nerve cells are known to deviate from such a cell cycle and to be in a special state called a quiescent phase (GO phase).
  • Cardiomyocytes one of these terminally differentiated cells, lose proliferative capacity shortly after birth. Therefore, if cardiomyocytes are necrotic or lost due to myocardial infarction or dilated cardiomyopathy, the cardiomyocytes will Not born. Therefore, there are many cases of death afterwards due to heart failure, which causes the mortality rate of these heart diseases to be extremely high.
  • cardiomyocytes had been arrested in G0 phase, and it was thought that the cell cycle did not progress, but recent studies have begun to suggest that cardiomyocytes also have a cell cycle regulatory mechanism .
  • E1A an adenovirus oncogene
  • RB adenovirus oncogene
  • E1A binds to the RB to promote transcription of an E2F-dependent gene, thereby inducing cell DNA synthesis.
  • E1A released E2F in cardiomyocytes and caused DNA synthesis and dedifferentiation. Apoptosis is not clear. It has been reported that E1A induces DNA synthesis in the presence of E1B (see Kirshenbaum, LA et al., The Journal of Biological Chemistry 270, 7791-7794, 1995).
  • E2F suppresses the expression of myocardial-specific genes in cardiomyocytes and induces DNA synthesis (Kirshenbaum, LA et al., Developmental Biology 179, 402-411, 1996).
  • ES cells embryonic stem cells
  • the present invention has been made in view of the above problems, and provides a method for expanding terminally differentiated cells which enables regeneration of terminally differentiated cells such as cardiomyocytes and can be applied to treatment of heart diseases and the like.
  • the purpose is to do.
  • the present inventors have studied the cell cycle regulation mechanism in terminally differentiated cells, particularly the role of cyclin / CDK in cardiomyocytes in the presence of serum or other growth stimuli.
  • D-type cyclin CDK4 induced by growth stimulation was restricted to the cytoplasm and did not translocate into the nucleus, and that evening-phosphorylation of the target RB and activation of cyclin EZCDK2 did not occur. I found it. Therefore, we created an adenovirus vector that incorporates a gene that adds a nuclear translocation signal (NLS) to cyclin D1 and a gene that encodes CDK4, and infects cultured cardiomyocytes.
  • NLS nuclear translocation signal
  • a first aspect of the present invention is characterized in that cyclin and a cyclin-dependent kinase are introduced into the nucleus of a terminally differentiated cell, and then the cell is cultured or its tissue is maintained.
  • a nucleotide sequence encoding a nuclear localization signal is added to at least one of a cyclin gene and a cyclin-dependent kinase gene, and each of the genes is introduced into a terminally differentiated cell. It is characterized by the ability to culture cells or the direct introduction of each of the genes into terminally differentiated cells in a living body.
  • the cyclin is a cyclin capable of activating CDK4 or CDK6, for example, mammalian cyclin D1, D 2 and D 3 are preferred.
  • the cyclin-dependent kinase is activated by a D-type cyclin.
  • mammalian CDK4 and CDK6 are preferable.
  • the terminally differentiated cells are cardiomyocytes, nerve cells, kidney cells or kidney cells.
  • the introduction into the terminally differentiated cells is a gene introduction using an adenovirus vector.
  • a recombinant vector used to achieve the above object has a nucleotide sequence encoding a nuclear translocation signal (a signal peptide having a function of translocating a protein into the nucleus). It is characterized by containing a cyclin gene or a cyclin-dependent kinase gene to which a nucleotide sequence encoding a nuclear localization signal is added.
  • the above-described recombinant vector may contain both a cyclin gene and a cyclin-dependent kinase gene as long as a nucleotide sequence encoding a nuclear localization signal is added to at least one of them.
  • the cyclin gene is a cyclin gene capable of activating mammalian CDK4 or CDK6, and the cyclin-dependent kinase gene is a cyclin-dependent kinase activated by mammalian cyclin D1, D2 or D3. It is a ubiquitous kinase gene.
  • the recombinant vector is an adenovirus vector
  • the nucleotide sequence encoding the nuclear transport signal is a nucleotide sequence of a nuclear transport signal derived from the large T antigen of SV40.
  • the nucleotide sequence encoding the nuclear transport signal is a nucleotide sequence of a nuclear transport signal derived from the large T antigen of SV40.
  • one that encodes a nuclear translocation signal derived from the SV40 large T antigen three times is recommended.
  • the present invention relates to an animal cell or tissue grown by any method according to the first aspect.
  • the present invention relates to an agent for growing terminally differentiated cells and Z or tissue, characterized in that any one of the recombinant vectors according to the second aspect is used as an active ingredient.
  • a preferred embodiment of the use of the drug in this aspect is a method for treating a patient having a heart disease, wherein at least one of the nucleotide sequences encodes a nuclear transport signal.
  • a virus vector expressing the added cyclin gene and cyclin-dependent kinase gene is directly administered to a patient's heart (myocardium) to proliferate the patient's myocardium (cardiomyocytes).
  • FIG. 1 is a diagram showing Western blot analysis of cyclin D1 expression and RB phosphorylation of cardiomyocytes by various growth stimulations. Abbreviations are as follows. ppRB: phosphorylated RB protein, pRB: RB protein,
  • FIG. 2 is a diagram showing Western blot analysis of the expression of D-type cyclin and CDK4 in cardiomyocytes induced by various growth stimuli in cytoplasmic and nuclear extracts. Abbreviations are as follows.
  • RB RB protein
  • FIG. 3 is a photomicrograph of the intracellular localization of cyclin D1 in cardiomyocytes induced by various growth stimuli, which was immunofluorescently stained with a mouse anti-sarcomeric lactin monoclonal antibody.
  • FIG. 4 is a diagram showing Western blot analysis of the transfer of cyclin D1 into the nucleus of cardiomyocytes by adding a nuclear transfer signal to cyclin D1.
  • FIG. 5 shows Western blot analysis of the localization of cyclin D1 and CDK4 expressed by various recombinant adenoviruses in cardiomyocytes.
  • FIG. 6 is a diagram showing Western blot analysis of RB phosphorylation in cardiomyocytes infected with various recombinant adenoviruses. Abbreviations are as follows. ppRB: phosphorylated RB protein, pRB: RB protein,
  • FIG. 7 is a diagram showing Western blot analysis of the expression of cyclin A and cyclin E in the nuclei of cardiomyocytes infected with the recombinant adenovirus.
  • FIG. 8 is a graph showing the results over time of the results of analyzing the cell cycle of cardiomyocytes that have been subjected to various growth stimuli by laser scan cytometry (LSC).
  • LSC laser scan cytometry
  • FIG. 9 is a photograph and a diagram showing the results of analyzing cardiomyocytes undergoing cell division by LSC equipped with a confocal laser microscope.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of measuring the number of cardiomyocytes after virus infection over time.
  • Figure 11 shows that a rat heart was infected in vivo with a recombinant adenovirus containing D1NLS / CDK4 (a and b) or the lacZ gene (c), and immunohistochemical staining of the heart tissue section visualized the expressed proteins.
  • red represents sarcomeric actin
  • green represents Ki-67 protein
  • bar length is 20.
  • Mammalian D-type cyclins have three subtypes (Dl, D2, D3), are expressed from the middle to late G1 of the cell cycle, and are activated by binding to CDK4 and CDK6. Mainly phosphorylates RB protein and promotes G1ZS phase transition. Cyclin D1 is localized in the nucleus in the G1 phase, but in the S phase, Tlir286 is phosphorylated by a protein kinase called GSK-33 (glycogen synthase kinase-3) and translocates to the cytoplasm. It is decomposed by the Proteasom as it is. Cyclin D 1 ZC DK 4 has various functions other than cell cycle, such as controlling muscle differentiation by inhibiting the transcription factor MyoD, and activating by binding to ER (estrogen receptor) in mammary epithelial cells Have been reported.
  • the present invention is a method for promoting the cell cycle and growing terminally differentiated cells by introducing such cyclins and cyclin-dependent kinases into the nuclei of terminally differentiated cells.
  • a method of introducing these proteins into the nucleus there is a method of physically injecting them by microinjection, but a gene introduction method is preferred from the viewpoint of introduction efficiency.
  • the introduced cyclin may be any as long as it can activate CDK4 or CDK6, and examples thereof include the above three subtypes (cyclins D1, D2, and D3).
  • the cyclin-dependent kinase may be any one that is activated by D-type cyclin, such as CDK4 or CDK6. I can do it.
  • the terminally differentiated cells used in the method of the present invention can be separated from a living body by various methods and cultured.
  • Terminally differentiated cells such as cardiomyocytes, nerve cells, kidney cells, and knee cells, are cells that are in the GO phase of the cell cycle without being divided from birth until the individual dies.
  • cultured cardiomyocytes of neonatal rats 1 to 2 days after birth show that 90% or more of the cells are in the GOZG1 phase within 24 hours after culturing by cell cycle assay such as flow cytometry. It is confirmed that.
  • a growth stimulus such as serum is added, the transition to the S phase is not observed. (See Claycomb, W. C., Trends Cardiovascular Medicine 2, 231-236, 1992).
  • neurons especially central nervous cells such as the brain, complete cell division during the fetal period, so recovery is difficult if the brain is damaged after birth.
  • kidney cells are damaged, they cannot be regenerated and require treatment such as artificial dialysis.
  • Knee cells produce various digestive enzymes or gastrointestinal hormones, but if / 3 cells are damaged, it is difficult to regenerate, and it is known that they interfere with insulin secretion and cause diabetes.
  • these terminally differentiated cells can be proliferated by taking them out of a living body or applying the method of the present invention as they are in a living body, and culturing or maintaining them.
  • the D-type cyclin gene and cyclin-dependent kinase gene have already been cloned from humans and various other organisms, and their nucleotide sequences have been reported.
  • the nucleotide sequence of the mouse cyclin D1 gene has been reported in Matsushime, H. et al., Cell, 65, 701-713, 1991 and registered in GenBank (Accession No. M64403).
  • the human cyclin D1 gene has also been reported in Lee, D. et al., Cell, 66, 1197-1206, 1991 and the like.
  • Human. 01 ⁇ 4 is a protein consisting of 303 amino acids, and the cDNA sequence encoding it is registered in GenBank (Accession No. M14505).
  • PCR using primers DNA specific for the desired gene Can also be obtained.
  • a nucleotide sequence encoding a nuclear localization signal is added to at least one of the above genes, preferably a cyclin gene.
  • a nuclear localization signal is added to at least one of the above genes, preferably a cyclin gene.
  • three types of nuclear transport signals are known. All of these have more common sequences called motifs.
  • the first type has almost no basic amino acids such as lysine-arginine.
  • Very few examples of this motif include, for example, the nuclear translocation signal of influenza virus nucleoprotein (AAFEDLRVLS: SEQ ID NO: 1) (Davy, J. et al., Cell 40, 667-1675, 1980).
  • the second type contains a large amount of basic amino acids. Examples of this motif are numerous, such as the nuclear localization signal of the SV40 large T antigen (PPKKKRKV: SEQ ID NO: 2) (Kalderon, D. et al., Nature 311, 33-38). , 1989).
  • the third type is a type in which basic amino acids form a class with a spacing of about 10 amino acids, which is called a bipartite-type nuclear translocation signal.
  • this motif such as the nuclear translocation signal (KRPAATKKAGQAKKKK: SEQ ID NO: 3) of the nucleoplasmin of African Megael (Xenopus laevis) (Robbins, J. et al., Cell 164, 6 15—6 2 (See page 3, 1991)
  • the nucleotide sequence encoding the nuclear localization signal is added to at least one of the D-type cyclin gene and the cyclin-dependent kinase gene activated by the cyclin. Since the two proteins expressed by these genes form a complex in the cytoplasm, if either or preferably the cyclin gene has a nuclear translocation signal, the complex can pass through the nuclear membrane. Recombinant vectors having the nucleotide sequences encoding these nuclear translocation signals and translocating the cloned expression protein of DNA into the nucleus can be easily obtained. An expression plasmid pEF / myc / nuc having a large T antigen nuclear translocation signal is commercially available from Invitrogen.
  • Vectors include adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, Examples include vectors derived from viruses such as vaccinia virus, evatribox virus, and papovavirus such as SV40.
  • the adenovirus vector used in a preferred embodiment of the present invention is a method by homologous recombination using human fetal kidney 293 cells or Escherichia coli (Miyake, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 132, pp. 1996) and a simple in vitro method (Mizuguchi, E. et al., Hum. Gene Ther., Vol. 9, pp. 25 7 7— (See page 258, page 1988).
  • Adenovirus is one of the DNA viruses with a linear double-stranded D ⁇ ⁇ genome, the most studied being human adenovirus serotype 5 (AD5) and serotype 2 (AD2).
  • Adenovirus Expression Vector Kit is commercially available from Takara Shuzo Co., Ltd. and can be used in the present invention.
  • Gene transfer by retroviruses usually infects specific cells and integrates the genetic information into the cells' own DNA, but it can infect two or more cells in some cases.
  • the introduced gene may be expressed transiently, or may be constitutively expressed by integration into the chromosomal DNA of the recipient cell.
  • a recombinant adenovirus vector efficient gene transfer and high-level expression of the transferred gene can be performed.
  • Adenovirus-mediated gene transfer is one of the most powerful ways to transfer genes into mammalian cells, and virtually all types of human cells and many To be introduced into non-human cells.
  • infection with adenovirus is independent of the cell cycle, the gene can be expressed in a variety of primary and transformed cell lines.
  • gene transfer can be performed efficiently even in cells that do not undergo DNA synthesis or cell division, such as terminally differentiated cells. Since many cells receive multiple copies of the recombinant DNA after infection, the transfected gene is temporarily expressed at a high level.
  • adenovirus DNA is not normally integrated into the cell genome and remains as an episome. As a result, the use of adenovirus has the advantage that almost no mutagenic errors occur randomly when the foreign DNA is integrated into the host cell genome.
  • the D-type cyclin gene and the cyclin-dependent kinase gene activated by the cyclin in order to express both the D-type cyclin gene and the cyclin-dependent kinase gene activated by the cyclin, these can be infected by the same recombinant virus, or they can be infected by separate recombinant viruses. It can be transmitted. When co-infected with two types of recombinant viruses, they may be transmitted simultaneously or separately after a certain period of time.
  • Terminally differentiated cells that express D-type cyclin and a cyclin-dependent kinase activated by the cyclin in the nucleus are grown by culturing according to a conventionally known method.
  • a suitable method for culturing the cells can be selected depending on the type of the cells.
  • the method can be selected from static culture in microtiter plates, petri dishes or flasks, rotary culture using culture bottles, and microculture.
  • carrier culture For example, in the case of cardiomyocytes, use Eagle's minimum essential medium (MEM), etc., add 5-20% of growth factors such as fetal calf serum, and culture at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. it can.
  • MEM Eagle's minimum essential medium
  • Nerve cells, kidney cells, knee cells and the like can be cultured by the same method. Development and sales of various media to grow various cells under optimal conditions Have been. For example, there are RPMI 1640 medium and CMRL1066 medium. Many such media are available from distributors such as Flow Laboratories and Gibco.
  • the gene is directly introduced into a living body, for example, into a terminally differentiated cell or tissue of a mammal by the above-mentioned various methods, and the cell or tissue is propagated by maintaining the cell or tissue in the living body.
  • the term “maintain” means that cells are maintained in a physiological environment such as body temperature or blood flow without impairing the physiological functions of the cells or tissues, and cells are proliferated.
  • the present invention also relates to cells or tissues characterized by being grown by the method of the present invention.
  • a terminally differentiated cell isolated from a patient is introduced with a D-type cyclin gene to which a nuclear translocation signal is added and a cyclin-dependent kinase gene activated by the cyclin by the above-described method, and cultured by culturing.
  • These expanded cells or tissues can be used to administer to the patient in which the cells or tissues have been necrotic and to regenerate them.
  • cardiomyocytes, nerve cells, kidney cells, knee cells, and the like grown by the method of the present invention can be transplanted into patients.
  • the recombinant vector of the present invention can be used for the prevention or treatment of disease, and when a specific cell or tissue is damaged, the recombinant vector according to the present invention is added to such a cell or tissue as an active ingredient.
  • the terminally differentiated cells can be proliferated to repair and replenish the necrotic tissue or organ.
  • it can be used for the treatment of myocardial infarction and dilated cardiomyopathy.
  • the patient's myocardium (cardiac muscle cells) can be obtained by administering the drug containing the recombinant vector directly to the patient's heart. Can be propagated.
  • cardiomyocytes which are one of the terminally differentiated cells.
  • This example shows one embodiment of growing rat cardiomyocytes in vitro.
  • the present invention is not limited to these examples. Absent.
  • the adenovirus vector Ad-CM4 containing CDK4 was obtained from plasmid pCMV-CM4 (obtained from Dr. Sander van den Heuvel of Massachusetts General Hospital Cancer Center, van den Heuvel et al., Science, 262, 2050-2054, 1993) Mouse), and an adenovirus construction kit (Adenovirus Expression Vector Kit Code No. 6150, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). That is, pCMV-CDK4 was digested with BamHI to prepare a DNA fragment of about 920 base pairs. The end of this fragment was blunt-ended using DNA Blunting Kit Takara Shuzo Co., Ltd. Code No.
  • this cosmid and human adenovirus type 5 DNA-TPC were derived from human fetal kidney.
  • the recombinant adenovirus (Ad-CM4) was prepared by transfection into 293 cells (hereinafter referred to as “293 cells”).
  • the plasmid containing the cyclin D1 gene to which the nucleotide sequence encoding the nuclear localization signal (NLS) was added was a mouse cyclin D1 gene fragment derived from pRSV-cyclinDl (see Matsusime, H. et al., Supra) and pEF / myc / nuc It was constructed by ligating NLS derived from a plasmid (manufactured by Invitrogen).
  • the plasmid pEF / myc / nuc was digested with restriction enzymes Ncol and Xhol, and the first DNA of about 5.5 kb was obtained using 1.0% agarose gel electrophoresis and QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Cat.28704). Fragments were prepared.
  • the plasmid pRSV-cyclinDl was cleaved with the restriction enzyme Ncol to prepare a second DNA fragment of 603 bp in the same manner as described above.
  • PCR was performed using the plasmid pRSV-cydinDl as a type II and the following two primers to prepare a third DNA fragment encoding the C-terminal side of the mouse cyclin D1 gene.
  • Ncol primer 5 'ACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGA 3' (SEQ ID NO: 4) and Xhol primer: 5 'TGATCTCGAGGTCGATGTCCACATCTCGCACGT 3' (SEQ ID NO: 5).
  • NLS nuclear translocation signal
  • Ad-D1NLS adenovirus Expression Vector Kit Code No. 6150, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • Ad-D1NLS a recombinant adenovirus
  • This recombinant adenovirus Ad-D1NLS contains the CAG promoter-1 (avian) 3-actin promoter + site megalovirus in the DNA sequence of the adenovirus deleted for the E1 and E3 genes.
  • Enhancer and a mouse cyclin D1 gene having a base sequence encoding the above-described nuclear translocation signal added between the poly-A addition signal sequence of the ⁇ Egret] 3-globin gene.
  • the culture was aseptically transferred to a sterile tube for each cell in which the cells were completely died, and the freeze-thaw was repeated 6 times.
  • the supernatant centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes was stored at -80 ° C as a primary virus solution.
  • 10 liters of this primary virus solution infects 293 cells cultured on a collagen-coated 24-well plate, and after 3-4 days the dead cells Z culture medium is aseptically transferred to a sterile tube and freeze-thawed Was repeated 6 times, and the supernatant obtained by centrifugation at 5000 rpm for 5 minutes was stored at -80 ° C as a secondary virus solution.
  • the secondary viral solution 15/1 were infected with 2 9 3 cells cultured in 25 cm 2 bottles coated with collagen, die after 3-4 days
  • the cells / cultures were aseptically transferred to sterile tubes and freeze-thawed or disrupted overnight with sealed sonication to release the virus.
  • the supernatant centrifuged at 4 ° C for 10 minutes at 3000 rpni was stored as a third virus solution at -80 ° C. .
  • the tertiary virus solution 50 il l were infected with 2 9 3 cells cultured in 75 cm 2 bottles coated with collagen, were transferred 3-4 days dead cells / culture after aseptically sterile tubes, frozen Virus was released by thawing or crushing in a sealed sonicator.
  • the supernatant centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C was stored at -80 ° C as a fourth virus solution.
  • the titer of this quaternary virus solution was determined by plaque assay using 293 cells, and all were always within the KlOU pfu / ml range.
  • Cardiomyocytes are separated from 1 to 2 days old rats (Sprague-Dawley (SD) rats), and a layer (fraction) of cardiomyocytes is collected by Percoll gradient centrifugation and contains 5% bovine serum (CS) Dispersed in MEM (minimum essent ial medium; Sigma, Cat. M-4655) (Tamamori, M., et al., Am. J. Phys iol. 275 (Heart Circ. Phys iol. 44), H2036—see H204, page 1988). More than 95% of the cells thus obtained were confirmed to be cardiomyocytes by immunostaining using a mouse monoclonal anti-actin antibody (Dakopas, Denmark).
  • the neonatal rat cardiomyocytes were seeded on a culture dish in Eagle's minimum medium (MEM, Flow Laboratories) supplemented with 5% fetal calf serum (FCS, Flow Laboratories) and placed in a gas carbonate incubator. The cells were cultured at 37 ° C for 24 hours. The next day, the culture solution was replaced with serum-free Eagle's minimal medium (MEM), and the cells were further cultured for 24 hours. After that, each virus prepared in Example 1 was infected alone or in combination of two or more. Virus infection was performed by adding lOO piu (plaque forming unit) of recombinant adenovirus per cell and culturing for a certain period of time. As a control, a similar experiment was performed using REF52 cells, a type of fibroblast, instead of rat cardiomyocytes.
  • MEM Eagle's minimum medium
  • FCS fetal calf serum
  • Example 3 Analysis of gene expression in cardiomyocytes by Western blot analysis, phosphorylation analysis and immunofluorescence staining
  • Various growth factors and Z or the various recombinant adenoviruses prepared in Example 1 were used to infect rat cardiomyocytes prepared by the method described in Example 2. After culturing these virus-infected cells, whole cells, cytoplasmic fractions and nuclear fractions were extracted from the culture medium after a predetermined time by the following method. The cells on the culture dish were washed with ice-cooled (4 ° C) PBS (Phosphate buffered saline), scraped off with a cell scraper, centrifuged, and the supernatant was discarded.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the obtained precipitate was washed again with a small amount of PBS, and then transferred to a 1.5-ml eppendorf tube. 10 times the volume of the precipitate in ice-cold (4 ° C) Lysis Buffer (50 inM HEPES (pH 7. 9), 150 mM NaCl, 0. lmM EDTA, 0. 1 mM EGTA, 0. 1% NONIDET P - 40, 0. 4 mM NaF, 0. 4 mM Na 2 V0 4, 103 ⁇ 4 glycerol) was added, on ice Then, the mixture was stirred with a vortex mixer for 15 seconds and left on ice for 30 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm at 4 ° C for 10 minutes, and the supernatant was stored as a whole cell extract (rapidly frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C).
  • Lysis Buffer 50 inM HEPES (pH 7. 9)
  • Cytoplasmic proteins and nuclear proteins were fractionated as follows. In the same manner as above, the cells on the culture dish were washed with ice-cold PBS, scraped off with a cell scraper, centrifuged, and the supernatant was discarded. The obtained precipitate was washed again with a small amount of PBS, transferred to a 1.5 ml eppendorf tube, and ice-cooled Buiier A (10 mM HEPES (pH 7.9), 1.5 times the volume of the precipitate). The mixture was pipetted with mM MgCl 2 , 10 mM KC1, 0.5 mM DTT), stirred with a vortex mixer for 15 seconds, and allowed to stand on ice for 10 minutes.
  • Buiier A 10 mM HEPES (pH 7.9)
  • NONIDET P-40 was added to a final concentration of 0.2%, stirred with a vortex mixer, and allowed to stand on ice for 5 minutes. Finally, the supernatant obtained by centrifugation at 5,000 rpm for 5 minutes was stored as a cytoplasmic fraction (rapidly frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C). The precipitate is pipetted with an equal volume of Buffer C (20 mM HEPES (pH 7.9), 25% glycerol, 0.42 M NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM EDTA) and vortexed for 15 seconds. After stirring with a mixer, the mixture was left on ice for 30 minutes.
  • Buffer C (20 mM HEPES (pH 7.9), 25% glycerol, 0.42 M NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM EDTA
  • Protein extracted by the above method is extracted from the same number of cells for each sample. Corrected as done. That is, proteins extracted from 6 lxlO per sample were electrophoresed by 6% or 11% SDS-PAGE GEL, then transferred to a dinitrocellulose membrane, containing 5% skin milk and 0.2% Tween20. The cells were immersed in PBS and shaken for 1 hour (blocking).
  • a mouse monoclonal anti-cyclin D1 antibody (Ab-3; manufactured by Oncogene science), a mouse monoclonal anti-RB antibody (1400 1A manufactured by Piiarmingen), a heron polyclonal anti-cyclin A antibody (SC-751; Santa Cruz) Biotechnology), Egret polyclonal anti-cyclin E antibody (SC-481; Santa Cruz Biotechnology), and Z or Egret polyclonal anti-CDK4 antibody (SC-260; Santa Cruz Bioteclmoiogy) After shaking for an additional hour, wash these antibodies with PBS containing 5% skin milk and 0.2 Tween20.
  • Ab-3 manufactured by Oncogene science
  • a mouse monoclonal anti-RB antibody (1400 1A manufactured by Piiarmingen
  • SC-751 heron polyclonal anti-cyclin A antibody
  • SC-481 Egret polyclonal anti-cyclin E antibody
  • Z or Egret polyclonal anti-CDK4 antibody (SC-260; Santa Cruz Bioteclmoio
  • anti-hidge mouse Ig horseradish peroxidase linked whole antibody (Amersham LifeSdence; NA931) or anti-hidge antibody.
  • egret Ig horseradish peroxidase linked whole antibody (Amersham LifeScience; NA934)
  • PBS 5% skin milk and 0.2% Tween20
  • ECL kit Western blotti Immunofluorescent staining was performed using ng detection reagents; Amersham LifeScience; RPN 2109), and Western blot analysis was performed.
  • Ad-Ras61L Duke University Medical Center
  • PE Phenylephrine
  • an adrenergic receptor agonist an adrenergic receptor agonist
  • an active Ras protein acting as a cardiac hypertrophy factor Cyclin D1 expression and phosphorylation of RB when cardiomyocytes were stimulated using Leone, G. et al., Nature, 387, 422-426 (1997).
  • the presence or absence of oxidation was examined by Western plot analysis.
  • the adenovirus Ad_Con without the Ras gene as Ad-Ras6iL or control cardiomyocytes were infected, 18 hours later the culture medium with 10% serum, medium containing 1 (gamma 6 Micromax of PE (phenylephrine) The After the cells were replaced with serum-free medium and cultured for an additional 18 hours, the cell extract was electrophoresed and stained with each antibody, as shown in Fig. 1. As shown in Fig. 1, cyclin D was induced in cardiomyocytes by these stimulations.
  • FIG. 2 shows the results of Western blot analysis of cytoplasmic and nuclear fractions extracted from cardiomyocytes and REF52 cells.
  • cardiomyocytes subjected to various proliferation stimuli neither D-type cyclin nor CDK4 was present in the nucleus and expressed only in the cytoplasm.
  • REF52 cells stimulated with proliferation cyclins D1, D3 and CDK4 were translocated into the nucleus.
  • the RB protein was present in the nucleus in both cardiomyocytes and REF52.
  • FIG. 3 is a photomicrograph of cardiomyocytes stimulated with fetal calf serum (FCS) or recombinant adenovirus Ad-RAS61L immunofluorescently stained with a mouse anti-sarcomeric lactin monoclonal antibody. In each case, it can be seen that cyclin D1 is accumulated in the cytoplasm.
  • FCS fetal calf serum
  • Ad-RAS61L recombinant adenovirus Ad-RAS61L immunofluorescently stained with a mouse anti-sarcomeric lactin monoclonal antibody.
  • FIG. 4 shows that overexpression of wild-type cyclin D1 and CDK4 by the adenoviruses Ad-Dl and Ad-CDK4 does not accumulate cyclin D1 in the nucleus. Therefore, a recombinant adenovirus Ad-D1NLS containing the cyclin D1 gene to which a nuclear localization signal (NLS) was added was constructed. As shown in FIGS. 4 and 5, co-infection with Ad-MNLS and Ad-CDK4 revealed that cyclin D1 and CDK4 were strongly expressed in the nucleus of cardiomyocytes.
  • the adenovirus Ad-Dl expressing human cyclin D1 was obtained from Dr. Albrecht, J. of the Minneapolis Medical Research Foundation (Albrecht, JH et al., Cell Growth & Differentiation, Vol. 10, pp. 397-404, 1999). Year).
  • the recombinant adenovirus prepared in Example 1 was used to infect the rat cardiomyocytes prepared in Example 2, and after various lapses of time, the cells were covered on a 25 glass cover slip glass with a diameter of 25. The cells were fixed with 70% ethanol and stained with propidium iodide (PI; propidi orchid iodide) to measure the DNA content.
  • PI propidium iodide
  • iasarcomeric actin antibody (1: 1000) labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), washed with PBS, and then PI 50 g / ml, RNase After adding 500 g / ml of eA and leaving it to stand at 37 ° C for 15 minutes and then at room temperature for 15 minutes, the position of each cell in the cell cycle is determined by laser scanning cytometry (LSC, Olympus). Detected. Cardiomyocytes were confirmed by double staining with the anti-sarcomeric actin antibody described above.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • FIG. 8 shows the results of cell cycle analysis by LSC.
  • FIG. 8a shows the distribution of cells (relationship between DNA content and cell number) after a certain period of time in cardiomyocytes stimulated by various virus infections or growth factors.
  • Cardiomyocytes D1NLS / CDK4 co-infected with Ad-DINLS / Ad-CDK4 in a serum-free medium were transformed into S phase and G 2 It is inferred from the change in the DNA content that the cells have entered the phase.
  • cells supplemented with 5% bovine serum 53 ⁇ 4CS + D1NLS / CDK4
  • cardiomyocytes D1 / CDK4 infected with serum-stimulated (10% FCS) or Ad-Dl / Ad-CDK4 containing cyclin D1 without nuclear translocation signals have little cell cycle progression You can see that. 5% bovine serum alone (5% CS) remains in G1 phase. These results indicate that co-infection with M_D1NLS / Ad-CDK4 progresses the cell cycle of cardiomyocytes.
  • Figure 9 shows the myocardium 48 hours after Ad-D1NLS / Ad-CDK4 co-infection with a laser-scan cytometer (LSC; Olympus, Japan) equipped with a confocal laser microscope. Photograph of cells.
  • Figure 9a shows cells in mitosis or just after mitosis. The cell cycle position of each cell was determined by the DNA content (the amount of H fluorescence) measured by PI staining and the peak (maximum) of PI fluorescence intensity. Cells that have undergone DNA replication have an increased DNA content (the amount of PI fluorescence), whereas cells immediately before and immediately after division have a higher PI fluorescence intensity (brighter) due to DNA aggregation.
  • LSC laser-scan cytometer
  • FIG. 9b shows the relative results of counting the number of these cells with a Coulter counter (cell counter). It can be seen that the number of myocardial cells cultured with co-infection with Ad-DINLS / Ad-CDK4 increased about three-fold after 5 days. In contrast, cardiomyocytes infected with the vector-only adenovirus as a control showed almost no increase in cell number.
  • adeno-D1NLS and Ad-CDK4 prepared in Examples 1 and 2 were prepared.
  • the virus was injected into the apical region of a Wistar rat (250-300 g) by thoracotomy and visually.
  • an adenovirus containing the lacZ gene was similarly performed.
  • Four days after the injection 4% paraformaldehyde was perfused to fix the heart cells, and a section of the heart tissue was labeled with a rabbit ego-anti-Ki-67 antibody and a mouse anti-sarcomeric act-in antibody.
  • Labeled antibodies were stained and visualized in green and red, respectively, using an anti-Egret Mexa488 antibody or an anti-mouse Alexa568 antibody (both from Molecular Probes).
  • the visualized images were observed using a laser scanning confocal image system (ZEISS LSM510), and the results are shown in FIG. In FIG. 11, red indicates sarcomeric actin and green indicates Ki-67.
  • Ki-67 nucleoprotein is expressed in proliferating cells in all cycles of the cell cycle (Sdiolzen et al., J. Cell. Physiol., 182, 311-32, 2 This was used to detect cells in which the cell phase was progressing. Images of heart sections co-infected with two types of adenoviruses, Ad-D1NLS and Ad-CM4 (Fig. 11a and b) show that Ki-67 nuclear protein is expressed in many cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. I knew it was. On the other hand, Ki-67 nucleoprotein expression was not observed in cardiomyocytes injected with adenovirus containing the lacZ gene (FIG. 11c). These results suggest that the translocation of cyclin D1 and CDK4 into the nucleus also advances the cardiomyocyte cell cycle in vivo.
  • cell division of terminally differentiated cells can be induced, and cells can be proliferated to produce cells and tissues for transplantation.
  • terminally differentiated cells such as cardiomyocytes, nerve cells, kidney cells, and knee cells
  • the use of is expected.

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Description

明 細 書 終末分化細胞の増殖方法及びそのための組換えベクター 技術分野 - 本発明は終末分化細胞の増殖方法及びこれに用いる組換えベクターに関し、 詳 しくはサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼを用いて終末分化細胞を増殖さ せる方法等に関する。 背景技術
真核細胞の細胞周期はサイクリン依存性キナ一ゼ（ C D K)によつて制御される 。 これらは単独では活性をもたずサイクリンと呼ばれるサブュニッ卜が結合して はじめて活性型となるリン酸化酵素群である。 細胞周期における異なるプロセス (複製や有糸分裂への導入など） は、 異なる CD Kによって制御されるが、 一般 に CD Kの発現量は細胞周期を通じて一定で、 その活性はサイクリンの発現量に 依存する。 サイクリンは細胞周期の必要な時期に一過性に発現して CDKを活性 化する。
更に、 CDKの活性は CDKインヒビターと呼ばれる一連の阻害因子群によつ ても調節されている。 その一次構造上の特徴と、 阻害する CD Kの特異性から I NK4 (Inhibitor of CDK4)ファミリーと、 C I P/K I P (CDK interacting pr otein/kinase inhibitory protein)ファミリーの 2群に大別されている。 細胞周 期の進行を車の運転にたとえると CDKはアクセル、 CDKインヒビ夕一はブレ ーキの役割を果たす因子で、 アクセルとブレーキが協調的に調節しあうことで、 細胞周期の進行が決定されている。
静止期の細胞が細胞周期に入る際、 D型サイクリンは増殖刺激に反応して G 1 中期から後期にかけて発現する。 Ras/Raf- 1/MAPKによりその転写が促進され、 P1 3K (phosphatidyl inositol 3 - kinase) /Akt (protein kinase B)により分解が抑制 されている。 CDK4， 6は D型サイクリンと結合し、 核内に移行し CAK (CDK -activating kinase)によるリン酸化を受け活性型となる。 D型サイクリンは増 殖シグナルのいわば細胞内センサーで、 増殖シグナルに応じてその発現が誘導さ れ、 シグナルを実際に細胞周期を進行させる CDK2、 CDC 2に伝える働きを するものと考えられている。 D型サイクリン/ CDK4, 6の細胞周期進行にお ける役割は 2つあると考えられている。 1つは RB (網膜芽細胞腫遺伝子蛋白） をリン酸化し、 その増殖抑制効果を解除する。 もう 1つは C I PZK I Pをトラ ップする働きである。 細胞内に単独で C I P/K I Pが存在すると G1後期に出 現する CDK 2活性は阻害されてしまう。 D型サイクリン/ CDKは C I P/K I Pと結合することで細胞内のこれらのインヒビ夕一による CDK2阻害活性を 低下させると考えられている。
細胞周期の G 1期において CDKの標的となる基質は RBである。 RBは多く のタンパク質と相互作用することが知られているが、 その中で鍵となるのが転写 因子 E 2 Fである。 E 2 Fは細胞周期の進行や DN A複製に必要な遺伝子の転写 を制御し、 例えばサイクリン Eの転写を活性化し、 サイクリン E/CDK2の作 用を介して S期の開始に重要な働きをしている。 RBは非リン酸化状態では、 E 2 Fと強く結合し、 E 2 Fが DNA複製を促進しないように抑えている。 RBは 細胞周期を進行させる CDKによってリン酸化され、 リン酸化された RBは E 2 Fを抑制する作用を失い、 不活性化される。 近年、 RBと E 2 Fにはそれぞれ類 似したタンパク質が存在することが示され、 RBファミリー、 E2Fファミリー タンパク質と呼ばれるようになった。 その結果、 細胞周期の G1から S期への進 行は、 RBと E 2 Fファミリ一タンパク質によって高度に制御されているプロセ スであることが明らかになつてきた。 更に、 この RB— E2F経路は、 細胞の分 ィ匕、 癌化、 アポトーシスなどの多くの生命現象に関与していることが明らかにな つてきた。 例えば、 上記 RB等の不活化が細胞周期調節の異常によって細胞の癌 化へつながることが明らかとなり、 このような細胞周期調節遺伝子の多くが癌抑 制遺伝子として報告されている。
一方、 心筋細胞、 神経細胞等の終末分化細胞は、 このような細胞周期から逸脱 して静止期 （GO期） と呼ばれる特別な状態にあることが知られている。 これら 終末分化細胞の一つである心筋細胞は生直後に増殖能を失う。 そのため、 心筋梗 塞や拡張型心筋症によって心筋細胞の壊死、 喪失が起こった場合、 心筋細胞は再 生されない。 従ってその後、 心不全に陥ってさらには死亡する症例が多く、 これ らの心疾患の死亡率が非常に高い原因となっている。 これまで心筋細胞は G 0期 で停止しており、 細胞周期は進行しないものと考えられていたが、 近年の研究に よって心筋細胞にも細胞周期の調節機構が存在することが示唆され始めた。
例えば、 アデノウイルスの発癌遺伝子である E 1 Aは上記 RBに結合すること により、 E 2 F依存性の遺伝子の転写を促し、 細胞の DNA合成を誘導する。 ラ ット新生仔培養心筋細胞を用いて、 E 1 Aが心筋細胞において E 2 Fを遊離し、 DNA合成及び脱分化を起こすかどうかを確かめたところ、 E 1 Aのみでは DN A合成の誘導は明らかでなくアポ卜一シスが起こる。 E 1 Bの共存下で E 1 Aが DN A合成を誘導することが報告されている （Kirshenbaum, LA ら、 The Journ al of Biological Chemistry 270巻、 7791— 7794頁、 1995年参 照） 。
次に E 2 Fアデノウイルスを使用した結果、 E 2 Fは心筋細胞において心筋特 異的な遺伝子の発現を抑制し、 DNA合成を誘導することが報告されている （Ki rshenbaum, L. A. ら、 Developmental Biology 179巻、 402— 411頁、 1 996年参照） 。
一方、 核移行シグナルをもたない野生型のサイクリン D 1を過剰発現するトラ ンスジエニックマウスでは、 心筋細胞において CDK 4の発現レベルの上昇と共 に DNA合成も認められるが、 異常な多核細胞が増加することが報告されている (Soonpaa, M.Hら、 Clin. Invest. 99巻、 2644— 2654頁、 1997 年参照） 。
このような一連の研究から、 心筋細胞においても D N A合成は認められ細胞周 期が進行する可能性が示唆されるが、 これに続く細胞の分裂や細胞数が増加した という報告は無く、 アポトーシスへ誘導されることなく心筋細胞を増殖させる方 法は実質的に知られていない。
近年、 臓器移植や白血病等の治療を目的として、 胚性幹細胞 （ES細胞） と呼 ばれる、 いろいろな細胞に分化する能力を秘めた万能細胞を用いて所望の種類の 細胞を作り出す再生医療技術が研究されている。 しかし、 ES細胞は胎児になる 可能性がある胚を壊してつくるため、 研究には倫理面からの抵抗が強い。 発明の課題
本発明は、 上記問題点に鑑みなされたものであって、 心筋細胞等の終末分化し た細胞の再生を可能にして、 心疾患等の治療に応用できるような終末分化細胞の 増殖方法を提供することを目的とする。
また、 このような方法に用いる組換えベクター又はこれを含有する薬剤を提供 することを目的とする。 発明の開示
上記課題を解決するために、 本発明者等は終末分化した細胞における細胞周期 調節機構、 特に心筋細胞において、 血清などの増殖刺激を加えた場合におけるサ イクリン/ CD Kの役割について研究を行なった結果、 増殖刺激によって誘導さ れた D型サイクリンノ CDK 4は細胞質に限局し核内へ移行しないこと、 その夕 —ゲッ卜である R Bのリン酸化及びサイクリン EZCDK2の活性化が起こらな いことを見出した。 そこで、 サイクリン D 1に核移行シグナル（NLS)を付加し た遺伝子と CDK 4をコードする遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを 作成し、 培養心筋細胞に感染させたところ、 サイクリン D1/CDK4が核内に 発現し、 RBのリン酸化を介して心筋細胞の増殖、 分裂を起こすことを見出し、 本発明を完成するに到つた。
すなわち、 本発明の第一の視点において、 サイクリン及びサイクリン依存性キ ナーゼを終末分化細胞の核内に導入し、 次いでその細胞を培養又はその組織を保 持することを特徴とする。
上記核内へ導入するための好ましい態様において、 サイクリン遺伝子及びサイ クリン依存性キナーゼ遺伝子の少なくとも一方に核移行シグナルをコードする塩 基配列を付加し、 前記各遺伝子を終末分化細胞に導入し次いでその細胞を培養す る力、 又は前記各遺伝子を生体内の終末分化細胞に直接導入することを特徴とす る。
更に本発明の好ましい態様において、 上記サイクリンは CDK4又は CDK6 を活性化することができるサイクリンであり、 例えば哺乳類のサイクリン D 1、 D 2及び D 3等が好適である。 また、 上記サイクリン依存性キナーゼは D型サイ クリンにより活性化されるものであり、 例えば哺乳類の C D K 4及び C D K 6が 好適である。
本発明の別の好ましい態様において、 前記終末分化細胞は心筋細胞、 神経細胞 、 腎臓細胞又は腾臓細胞であることを特徴とする。
更に別の好ましい態様において、 前記終末分化細胞への導入はアデノウイルス ベクタ一を用いた遺伝子導入であることを特徴とする。
本発明の第二の視点において、 上記目的を達成するために用いられる組換えべ クタ一は、 核移行シグナル （タンパク質を核内に移行させる機能があるシグナル ペプチド） をコードする塩基配列を付加したサイクリン遺伝子、 又は核移行シグ ナルをコードする塩基配列を付加したサイクリン依存性キナ一ゼ遺伝子を含むこ とを特徴とする。 上記組換えベクターは、 少なくとも一方に核移行シグナルをコ ―ドする塩基配列が付加されていれば、 サイクリン遺伝子とサイクリン依存性キ ナ一ゼ遺伝子の両方を含んでいてもよい。
好ましい態様において、 上記サイクリン遺伝子は哺乳類の C D K 4又は C D K 6を活性化し得るサイクリン遺伝子であり、 上記サイクリン依存性キナーゼ遺伝 子は哺乳類のサイクリン D 1、 D 2又は D 3によって活性化されるサイクリン依 存性キナーゼ遺伝子であることを特徴とする。
更に好ましい態様において、 ·前記組換えベクターはアデノウイルスベクターで あり、 前記核移行シグナルをコードする塩基配列は S V 4 0の l arge T抗原由来 の核移行シグナルの塩基配列であることを特徵とする。 特に S V 4 0の large T 抗原由来の核移行シグナルを 3回コ一ドするものが推奨される。
本発明の第三の視点において、 上記第一の視点における何れかの方法により増 殖させたことを特徴とする動物細胞又は組織に関する。
更に、 本発明の第四の視点において、 上記第二の視点におけるいずれかの組換 えベクターを有効成分とすることを特徴とする終末分化した細胞及び Z又は組織 を増殖させるための薬剤に関する。
本視点における薬剤を使用する好ましい態様としては、 心臓疾患を有する患者 の治療方法であって、 少なくとも一方に核移行シグナルをコードする塩基配列が 付加されたサイクリン遺伝子及びサイクリン依存性キナ一ゼ遺伝子を発現させる ウィルスベクタ一を直接患者の心臓 （心筋） に投与し、 患者の心筋 （心筋細胞） を増殖させることを特徴とする。 図面の簡単な説明
図 1は、 種々の増殖刺激による心筋細胞のサイクリン D 1の発現と R Bのリン 酸化をウエスタンブロット解析した図である。 略称は次の通りである。 ppRB： リン酸化された R B蛋白質、 pRB： R B蛋白質、
図 2は、 種々の増殖刺激による心筋細胞の D型サイクリンと C D K 4の発現を 細胞質と核のそれぞれの抽出物に分けてウェスタンブロット解析した図である。 略称は次の通りである。 RB： R B蛋白質、
図 3は、 種々の増殖刺激によって誘導された心筋細胞におけるサイクリン D 1 の細胞内の局在性をマウス抗 sarcomericァクチンモノクローナル抗体を用いて免 疫蛍光染色した顕微鏡写真である。
図 4は、 サイクリン D 1への核移行シグナルの付加によって、 心筋細胞の核内 へのサイクリン D 1の移行をウエスタンブロット解析した図である。
図 5は、 種々の組換えアデノウイルスにより発現させたサイクリン D 1及び C D K 4の心筋細胞内での局在性をウェスタンプロット解析した図である。
図 6は、 種々の組換えアデノウィルスを感染させた心筋細胞内の R Bのリン酸 化をウエスタンプロット解析した図である。 略称は次の通りである。 ppRB： リン 酸化された R B蛋白質、 pRB : R B蛋白質、
図 7は、 組換えアデノウィルスを感染させた心筋細胞核内でのサイクリン A及 びサイクリン Eの発現をウェスタンプロット解析した図である。
図 8は、 レーザースキャンサイトメ一夕一 (L S C ) により種々の増殖刺激を 受けた心筋細胞の細胞周期を解析した結果を経時的に示した図である。
図 9は、 細胞分裂中の心筋細胞を共焦点レ一ザ一顕微鏡 (confocal laser micr oscope)を備えた L S Cにより解析した結果を示した写真及び図である。
図 1 0は、 ウィルス感染後の心筋細胞の細胞数を経時的に計測した結果を示し た図である。 図 11は、 D1NLS/CDK4 (a及び b) 又は lacZ遺伝子 （c) を含む組換えアデノ ウィルスを生体内においてラッ卜心臓に感染させ、 その心臓組織切片を免疫蛍光 染色して発現タンパク質を視覚化した図である。 図中、 赤色は sarcomeric actin を、 緑色は Ki- 67タンパク質を、 バーの長さは 20 を表す。
なお、 上記各図面において用いられる符合は以下の内容を意味する。
+：各種の増殖因子を添加し、 又は各種の組換えアデノウイルスを感染させたこ とを示す。
一：各種の増殖因子を添加せず、 又は各種の組換えアデノウイルスを感染させな かったことを示す。 発明の実施の形態
(サイクリン及び該サイクリン依存性キナーゼ）
哺乳類の D型サイクリンは 3種類 （Dl， D 2, D 3) のサブタイプを有し、 細胞周期の G 1中期から後期にかけて発現し、 CDK4、 CDK6と結合して活 性化する。 おもに RBタンパク質をリン酸化して G1ZS期移行を促進する。 サ イクリン D 1は G1期には核内に局在するが、 S期に入ると GSK— 3 3 (glyc ogen synthase kinase- 3 ) と呼ばれるタンパク質キナーゼによって Tlir286をリ ン酸化されて細胞質へ移行しそのままプロテアソ一ムによつて分解される。 サイ クリン D 1 ZC D K 4は細胞周期以外にも転写制御因子 My o Dの阻害を通じて 筋分化を制御したり、 乳腺上皮細胞において ER (estrogen receptor) と結合 して活性化するなどの多彩な機能が報告されている。
本発明は、 このようなサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼを終末分化細 胞の核内に導入することにより、 細胞周期を進行させて終末分化細胞を増殖させ る方法である。 これらのタンパク質を核内に導入する方法としては、 マイクロイ ンジェクシヨンにより物理的に注入する方法もあるが、 導入効率の観点から遺伝 子導入法が好ましい。 導入されるサイクリンとしては CDK4又は CDK6を活 性化できるものであれば良く、 例えば上記 3種類のサブタイプ （サイクリン D 1 , D 2, D 3) が挙げられる。 また、 サイクリン依存性キナーゼとしては D型サ イクリンによつて活性化されるものであれば良く、 CDK4又は CDK6等が挙 げられる。
(終末分化細胞の調製）
本発明の方法に使用される終末分化細胞は、 生体から種々の方法により分離し 、 培養することができる。 終末分化細胞とは、 心筋細胞、 神経細胞、 腎臓細胞及 び膝臓細胞等のように、 生まれてから個体が死ぬまで一度も分裂しないで細胞周 期の GO期にある細胞のことを言い、 例えば、 生後 1〜2日の新生仔ラットの培 養心筋細胞は、 フローサイトメトリ一等の細胞周期アツセィを行うと、 培養後 2 4時間以内には 90%以上の細胞が GO ZG1期にあることが確認される。 更に 、 血清などの増殖刺激を加えた際にも S期への移行は認められない。 （Claycomb, W. C, Trends Cardiovascular Medicine 2巻、 231— 236頁、 1992年 参照)。
同様に神経細胞、 特に脳等の中枢神経細胞は胎児期において細胞分裂が完了す るため、 生後脳に障害を受けた場合は回復が困難である。 腎臓細胞が障害を受け ると再生することができず人工透析等の治療が必要となる。 膝臓細胞は種々の消 ' 化酵素又は消化管ホルモンを産生するが、 /3細胞に障害を受けると再生が困難な ためインシュリンの分泌に支障をきたし糖尿病の原因になることが知られている 。 本発明においては、 これらの終末分化細胞を生体外に取り出して、 又は生体内 のそのままの状態で本発明の方法を適用し、 培養又は保持することによって増殖 させることができる。
(組換えベクターの構築）
D型サイクリン遺伝子及びサイクリン依存性キナーゼ遺伝子は、 既にヒトを初 め種々の生物からクロ一ン化され、 その塩基配列が報告されている。 例えば、 マ ウスサイクリン D 1遺伝子の塩基配列は、 Matsushime, H.ら、 Cell、 65巻、 7 01 -713頁、 1991年等に報告され、 GenBankに登録されている （Accessi on No. M64403) 。 また、 ヒトサイクリン D 1遺伝子も Lee, D.ら、 Cell、 66巻 、 1197— 1206頁、 1991年等に報告されている。 ヒト。01^4は303 個のアミノ酸からなるタンパク質であって、 これをコ一ドする c DNA配列は、 GenBankに登録されている （Accession No. M14505) 。 さらに、 哺乳類のゲノム DN Aを鎊型として、 所望の遺伝子に特異的なプライマー DN Aを用いた PC R により取得することもできる。
これらの遺伝子にコードされるタンパク質を終末分化細胞の核内に導入するた めには、 細胞質内で合成されたタンパク質を核内に移行させることが必要となる 。 このためには、 上記各遺伝子の少なくとも一方、 好ましくはサイクリン遺伝子 に核移行シグナルをコードする塩基配列を付加する。 現在、 核移行シグナルと考 えられるものには 3種類が知られている。 これらはいずれもモチーフと呼ばれる 共通の配列をもっとされている。
第一は、 リジンゃアルギニン等の塩基性のァミノ酸をほとんどもたないタイプ である。 このモチーフの例は非常に少ないが、 例えばインフルエンザウイルスの nucleoproteinの核移行シグナル (AAFEDLRVLS：配列番号 1 )がある（Davy, J. ら、 Cel l 4 0巻、 6 6 7— 6 7 5頁、 1 9 8 5年参照）。 第二は、 塩基性アミノ酸 を多く含むタイプである。 このモチーフの例は非常に多く、 例えば S V 4 0 lar ge T抗原の核移行シグナル (PPKKKRKV：配列番号 2 )がある（Kalderon, D. ら、 N ature 3 1 1巻、 3 3— 3 8頁、 1 9 8 4年参照）。 第三は、 塩基性アミノ酸が 約 10アミノ酸を隔ててクラス夕一を作っているタイプで、 Bipart i teタイプの核 移行シグナルと呼ぶ。 このモチーフの例も非常に多く、 例えばアフリカッメガエ ル (Xenopus laevis)の nucleoplasminの核移行シグナル (KRPAATKKAGQAKKKK：配列 番号 3 )がある（Robbins, J. ら、 Cel l 6 4巻、 6 1 5— 6 2 3頁、 1 9 9 1年 参照)
核移行シグナルをコードする塩基配列は、 D型サイクリン遺伝子及び該サイク リンにより活性化されるサイクリン依存性キナーゼ遺伝子の少なくとも一方に付 加する。 これらの遺伝子によって発現された 2つのタンパク質は細胞質内で複合 体を形成するから、 何れか一方、 好ましくはサイクリン遺伝子に核移行シグナル を有すれば該複合体が核膜を通過することができる。 なお、 これらの核移行シグ ナルをコードする塩基配列を有し、 クローン化した D NAの発現タンパク質を核 内に移行させるための組換えベクターは容易に入手することができ、 例えば、 S V 4 0 large T抗原の核移行シグナルを有する発現プラスミド pEF/myc/nucは、 Invi t rogen社から市販されている。
ベクターとしては、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス、 レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、 エワトリボックスウィルス、 S V 4 0のごときパポバウイ ルス等のウィルス由来のベクタ一が例示される。
本発明の好ましい形態において用いられるアデノウイルスベクタ一は、 ヒト胎 児腎臓 2 9 3細胞又は大腸菌を使用し、 相同組換えによる方法 （Miyake, S.ら、 P roc. Nat l. Acad. Sci. USA, 9 3巻、 1 3 2 0頁、 1 9 9 6年参照） や簡単な in vi troライゲ一シヨンによる方法 (Mizuguchi, Eら、 Hum. Gene Ther. , 9巻、 2 5 7 7— 2 5 8 3頁、 1 9 9 8年参照）により調製することができる。 アデノウィル スは線状の二本鎖 D Ν Αゲノムを有する D NAウィルスの一つであり、 最も良く 研究されているのは、 ヒトアデノウイルス抗原型 5 (AD5)と抗原型 2 (AD2)である 。 これらの野生型アデノウイルスの初期遺伝子 1 (E1)及び 3 (E3)の大部分を欠失 することにより、 複製能のないアデノウイルスベクターを作製することができ、 ウィルス粒子形成に有害な作用を及ぼすことなく、 数 kbの外来 D NAを挿入する ことが可能となる。 この組換えアデノウイルスは、 転写調節因子である E1遺伝子 を欠いているが、 挿入した遺伝子特異的な転写ユニットによって、 標的細胞の増 殖や、 その他のウィルス遺伝子の有無に依存せずに、 挿入した目的遺伝子のみを 発現させることができる。 このような発現系を構築するために、 たとえば宝酒造 株式会社から Adenovirus Express ion Vector Ki tが市販されており本願発明に利 用可能である。
(遺伝子導入と細胞の培養）
遺伝子導入方法としては、 従来より公知の方法が使用可能であり、 例えばリン 酸カルシウムやリボソームを使用した組換え D NAによるトランスフエクション 法やレ卜ロウィルス等の種々のウイルスを用いた遺伝子導入法がある。 レトロゥ ィルスによる遺伝子導入は、 通常特定の細胞に感染して遺伝情報を細胞自体の D NAに組込むが、 2種以上の細胞に感染できる場合もある。 導入された遺伝子の 発現は一過性発現であっても良く、 また、 受容細胞の染色体 D N Aに組込まれて 構成的に発現しても良い。 好ましくは、 組換えアデノウイルスベクターを使用す ることによって、 効率的な遺伝子導入と導入した遺伝子の高レベル発現を行うこ とができる。 アデノウイルスによる遺伝子の導入は、 哺乳動物の細胞に遺伝子を 導入する最も強力な方法の一つであり、 事実上すベての種類のヒト細胞及び多く の非ヒト細胞に導入するために使用できる。 また、 アデノウイルスによる感染は 細胞周期に依存しないため、 様々な初代培養細胞系および形質転換細胞系で遺伝 子を発現させることができる。 特に終末分化細胞のように D N A合成や細胞分裂 を起こさない細胞でも効率良く遺伝子導入ができる。 感染後に多くの細胞が組換 え D NAのコピーを複数受け取ることから、 導入された遺伝子は一時的に高レべ ルに発現する。 更に、 通常アデノウイルス D NAは細胞ゲノムに組込まれず、 ェ ピゾ一ムとしてとどまる。 その結果、 アデノウイルスを使用した場合には、 外来 D N Aが宿主細胞ゲノムに組込まれた時にランダムに発生する突然変異誘発性の エラ一は殆ど生じないという利点もある。
本発明においては、 D型サイクリン遺伝子と該サイクリンによって活性化され るサイクリン依存性キナーゼ遺伝子の両方を発現させるために、 これらを同一の 組換えウィルスによって感染させることも、 又は別々の組換えウィルスによって 感染させることもできる。 2種類の組換えウィルスによって共感染させる場合は 、 これらを同時に感染させても良いし、 一定時間をおいて別々に感染させても良 い。 本発明においては、 感染させるウィルス量は例えば 109 ~ 10 /inlのウィルス 保存液を用い、 細胞当たり好ましくは 100個程度 (MOI=100)に調整することにより 感染させる。 タイプの異なる 2種の組換えアデノウイルスの共感染によっても、 遺伝子導入の効果が高く、 また、 細胞の生存率が高い状態を得ることができる。 なお、 ウィルス量の測定 （力価測定） は、 プラークアツセィにより容易に行うこ とができる。
D型サイクリンと、 該サイクリンにより活性化されるサイクリン依存性キナー ゼとを核内において発現する終末分化細胞は、 従来より公知の方法に従って培養 することにより増殖させる。 該細胞の培養方法は細胞の種類によってそれぞれ好 適な方法を選択することができ、 マイクロタイ夕一プレート、 ペトリ皿又はフラ スコ中での静置培養や培養びんを用いた回転培養、 さらに微小担体培養等の方法 がある。 例えば心筋細胞の場合は、 イーグルの最小必須培地 (MEM)等を用い、 5〜 20%の牛胎児血清等の増殖因子を添加し、 5 %炭酸ガス存在下、 37°Cで培養する ことができる。 神経細胞、 腎臓細胞及び膝臓細胞等も同様の方法により培養でき る。 各種細胞をそれぞれ最適の条件で増殖させるために種々の培地が開発、 巿販 されている。 例えば、 RPMI 1640培地や CMRL1066培地等がある。 このような多くの 培地は Flow Laboratories社や、 Gibco社等の巿販業者から入手できる。
また、 本発明においては、 上述した種々の方法によって生体内、 例えば哺乳動 物の終末分化細胞又は組織に直接遺伝子を導入し、 該細胞又は組織を生体内で保 持することによつても増殖させることができる。 ここで、 「保持する」 とは、 体 温や血流等の生理的な環境において、 該細胞や組織の生理的な機能を損なうこと なく維持し、 細胞を増殖させることをいう。
(増殖した細胞又は組織）
本発明はまた、 本発明の方法により増殖させたことを特徴とする細胞又は組織 に関する。 例えば患者から摘出された終末分化細胞に核移行シグナルを付加した D型サイクリン遺伝子と該サイクリンによって活性化されるサイクリン依存性キ ナーゼ遺伝子を上述した方法で導入し、 培養することによって増殖させる。 これ らの増殖した細胞又は組織は、 当該細胞又は組織の壊死した患者に投与してその 再生を図るために用いることができる。 具体的には、 本発明の方法により増殖さ せた心筋細胞、 神経細胞、 腎臓細胞又は膝臓細胞などを患者に移植することがで きる。
(終末分化した細胞及びノ又は組織を再生させるための薬剤）
本発明の組換えベクターは、 疾病の予防又は治療に使用することができ、 特定 の細胞や組織が障害を受けた場合に、 そのような細胞又は組織に本発明に係る組 換えベクターを有効成分とする薬剤を投与することによって、 終末分化した細胞 を増殖させて壊死した組織又は臓器の修復、 補充をさせることができる。 例えば 、 心筋梗塞や拡張型心筋症の治療に用いることができ、 この場合には患者の心臓 に直接、 上記組換えべクタ一を含む薬剤を投与することによって患者の心筋 （心 筋細胞） を増殖させることができる。 実施例
以下、 終末分化細胞の一つである心筋細胞を用いた実施例により本発明をさら に具体的に説明する。 この実施例においては、 ラット心筋細胞を試験管内で増殖 させる一実施形態を示す。 ただし、 本発明はこれら実施例に限定されるものでは ない。
[実施例 1 ]組換えアデノウィルスの調製
1) Ad_CDK4の調製
CDK4を含むアデノウイルスベクター Ad- CM4は、 プラスミド pCMV-CM4 (Ma ssachusetts General Hospital Cancer Centerの Sander van den Heuvel博士よ り入手、 van den Heuvelら、 Science、 262巻、 2050— 2054頁、 19 93年参照） から切り出したマウス CDK4遺伝子とアデノウイルス構築キット (宝酒造社製 Adenovirus Expression Vector Kit Code No. 6150) を用いて調 製した。 すなわち、 pCMV- CDK4を BamHIで切断し、 約 920塩基対の DN A断片を調 製した。 この断片の末端を DNA Blunting Kit 宝酒造社製 Code No.6025を用いて 平滑 （Blunt end) 化した後、 コスミド pAxcwの Swal部位に挿入してコスミド pAd- CDK4を作製し、 さらに斎藤らの方法 （Miyake，S.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 93巻、 1320頁、 1996年参照） に従ってこのコスミドとヒトアデノウィ ルス 5型の DNA-TPC (ターミナルペプチドコンプレックス） とをヒト胎児腎臓由 来の 293細胞 （以下 「293細胞」 という。 ） へトランスフエクシヨンさせる ことにより、 組換えアデノウイルス（Ad-CM4)を作製した。
2) Ad- D1NLSの調製
核移行シグナル (NLS)をコードする塩基配列を付加したサイクリン D 1遺伝子 を含むプラスミドは、 pRSV- cyclinDl 由来のマウスサイクリン D 1遺伝子断片 （ Matsus ime, H.ら前掲参照） と pEF/myc/nucプラスミド （Invitrogen社製） 由来 の NLSを連結して構築した。 すなわち、 プラスミド pEF/myc/nucを制限酵素 Ncol及 び Xholで切断し、 1.0%ァガロースゲル電気泳動と QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製、 Cat. 28704)を用いて約 5.5 kbの第一の DN A断片を調製した。 次にプラスミド pRSV-cyclinDlを制限酵素 Ncolで切断し上記と同様の方法で 603 b pの第二の DNA断片を調製した。 更に、 プラスミド pRSV- cydinDlを錶型として 以下の 2種類のプライマーを用いて PC Rを行い、 マウスサイクリン D 1遺伝子 の C末端側をコードする第三の DNA断片を調製した。
Ncolプライマー： 5' ACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGA 3' (配列番号 4) 及び、 Xholプライマ一： 5' TGATCTCGAGGTCGATGTCCACATCTCGCACGT 3' (配列番号 5 ) 。 これらの 3種類の D NA断片を DNA Ligat ion Ki t 宝酒造社製 Code No. 6022を 用いて連結することによってマウスサイクリン D 1遺伝子の C末端側に SV40 Lar ge T抗原由来の核移行シグナル (NLS)を重複して 3回コードする塩基配列を有す るプラスミドを構築した。 このプラスミドから制限酵素 PmaCI及び Smalで切り出 した D N A断片を上記と同様の方法によりコスミド pAxcwの Swal部位に挿入し、 アデノウイルス構築キッ卜 （宝酒造社製 Adenovirus Express ion Vector Ki t Co de No. 6150) を用いて組換えアデノウイルス（Ad- D1NLS)を作製した。 この組換 えアデノウイルス Ad- D1NLSは、 E 1および E 3遺伝子を欠失したアデノウイルス の D NA配列の中に、 C A Gプロモータ一 （トリ ]3—ァクチンプロモー夕一 +サ イトメガロウィルスェンハンサー） と、 ゥサギ ]3—グロビン遺伝子のポリ A付加 シグナル配列の間に上記核移行シグナルをコードする塩基配列を付加したマウス サイクリン D 1遺伝子を有する。
3 ) ウィルス保存液の調製
2 9 3細胞をコラ一ゲンコートした 6 cmシャーレにそれぞれ 1枚ずつ培養して おく。 上記 1 ) 及び 2 ) で調製したコスミド Ad- CDK4と Ad- D1NLSの 4 を、 それ ぞれ制限酵素処理済み DNA- TPC (宝酒造社製 Adenovi rus Express ion Vec tor Ki t 内） 2. 5 と混合し、 それぞれ 6 cmシャーレで培養した細胞にリポフエクショ ン法でトランスフエクシヨンを行った （FuGENET M 6 Transiect ion Reagent, Roch e社製、 cat# l 814 443を使用） 。 翌日、 細胞を剥がし、 回収した細胞懸濁液を、 それぞれコラーゲンコート 96ゥエルプレートに播き直した。 ウィルスが増殖し細 胞が死滅したゥエルが 7〜15日の間に現れたので、 細胞が完全に死滅したゥエル 毎に培養液を無菌的に滅菌チューブに移して、 凍結融解を 6回繰り返し、 5000 r pm， 5 分間遠心分離した上清を 1次ウィルス液として- 80°Cで保存した。 この 1 次ウィルス液 10 lをコラーゲンコートした 2 4ゥエルプレートに培養した 2 9 3細胞に感染させ、 3 ~ 4日後に死滅した細胞 Z培養液を無菌的に滅菌チューブ に移して、 凍結融解を 6回繰り返し、 5000 rpin, 5 分間遠心分離した上清を 2次 ウィルス液として- 80°Cで保存した。 この 2次ウィルス液 15 / 1を、 コラーゲン コートした 25 cm2 ボトルに培養した 2 9 3細胞に感染させ、 3〜4日後に死滅 した細胞/培養液を無菌的に滅菌チューブに移して、 凍結融解または密封型ソニ ケ一夕一で破砕してウィルスを遊離させた。 3000 rpni, 10分間、 4°Cで遠心分離 した上清を 3次ウィルス液として- 80°Cで保存した。. この 3次ウィルス液 50 il l を、 コラーゲンコートした 75cm2 ボトルに培養した 2 9 3細胞に感染させ、 3〜 4日後に死滅した細胞/培養液を無菌的に滅菌チューブに移して、 凍結融解また は密封型ソニケ一ターで破碎してウィルスを遊離させた。 3000 rpm, 10分間、 4 °Cで遠心分離した上清を 4次ウィルス液として- 80°Cで保存した。 この 4次ウイ ルス液の力価は 2 9 3細胞を用いてプラークアツセィにより決定したところ、 い ずれも常に K lOU pfu/mlの範囲内であった。
[実施例 2 ]心筋細胞の調製と組換えアデノウイルスの感染
生後 1〜 2日後のラット (Sprague-Dawley (SD) rats) から心筋細胞を分離し 、 パーコール濃度勾配遠心分離によって心筋細胞の層 （画分） を回収し、 5%牛 血清（CS)を含む MEM (minimum essent ial medium； Sigma社製、 Cat. M - 4655) に 分散した (Tamamori, M.ら、 Am. J. Phys iol. 2 7 5卷 (Heart Circ. Phys iol. 4 4巻） 、 H 2 0 3 6— H 2 0 4 0頁、 1 9 8 8年参照） 。 このようにして得ら れた細胞の 95%以上は、 マウスモノクローナル抗ァクチン抗体 (Dakopa s社製、 デンマーク）を用いた免疫染色によって心筋細胞であることを確認した。 この新 生仔ラット心筋細胞は、 5%牛胎児血清 (FCS, Flow Laboratories社製）を添加し たイーグル最小培地 (MEM, Flow Laboratories社製）中で培養皿に播種し、 炭酸ガ スインキュベータ中、 37°Cで 24時間培養した。 次の日、 培養液を無血清イーグル 最小培地 (MEM)に交換し、 更に 24時間培養した後、 実施例 1で調製した各々のゥ ィルスを単独で又は 2種以上を組み合わせて感染させた。 ウィルス感染は、 細胞 当り lOO piu (plaque forming uni t) の組換えアデノウイルスを加え一定期間培 養した。 対照として、 ラット心筋細胞の代わりに繊維芽細胞の一種である REF52 細胞を用いて同様の実験を行った。
[実施例 3 ]ウェスタンブロット解析、 リン酸化反応解析及び免疫蛍光染色による 心筋細胞における遺伝子発現の解析 種々の増殖因子及び Z又は実施例 1で調製した各種の組換えアデノウイルスを 、 実施例 2で示した方法で調製したラット心筋細胞に感染させた。 これらのウイ ルス感染細胞を培養後、 所定時間後の培地から、 細胞全体、 細胞質分画及び核分 画をそれぞれ次のような方法で抽出した。 培養皿上の細胞を氷冷した（4°C) PBS (Phosphate buffered sal ine)にて洗浄した後、 セルスクレイパ一にてかき取り 、 遠心分離して上清を捨てた。 得られた沈殿を少量の PBSでもう一度洗浄した後 、 1. 5 mlのエツペンドルフチューブに移し、 沈殿の 10倍容量の氷冷した（4 °C) Ly sis Buffer (50 inM HEPES (pH7. 9) , 150 mM NaCl, 0. lmM EDTA, 0. 1 mM EGTA, 0. 1% NONIDET P - 40, 0. 4 mM NaF, 0. 4 mM Na2 V04 , 10¾ glycerol)を加え、 氷上に てピペッティ グし、 15秒間 vortex mixerで撹拌した後 30分間氷上にて静置した 。 その後、 4°C、 15， 000回転にて 10分間遠心分離し、 その上清を細胞全体の抽出 物として保存した （液体窒素にて急速冷凍し、 -80°Cにて保存した） 。
細胞質タンパク質と核タンパク質は次のように分画した。 上記と同様に、 培養 皿上の細胞を氷冷した PBSにて洗浄した後、 セルスクレイパーにてかき取り、 遠 心分離して上清を捨てた。 得られた沈殿を少量の PBSでもう一度洗浄した後、 1. 5 mlのエツペンドルフチューブに移し、 沈殿の 5倍容量の氷冷した Buiier A (10 mM HEPES (pH7. 9) , 1. 5 mM MgCl2 , 10 mM KC1, 0. 5 mM DTT)にてピベッティング し、 15秒間 vortex mixerで撹拌した後氷上にて 10分間静置した。 NONIDET P- 40を 最終濃度 0. 2%になるように加え vortex mixerで撹拌した後 5分間氷上にて静置 した。 最後に 5, 000回転にて 5分間遠心分離した上清を細胞質分画として保存し た （液体窒素にて急速冷凍し、 - 80°Cにて保存した） 。 沈殿は等容量の Buffer C (20 mM HEPES (pH7. 9) , 25% glycerol, 0. 42 M NaCl, 1. 5 mM MgCl2 , 0. 2 mM EDT A)にてピペッティングし、 15秒間 vortex mixerで撹拌した後 30分間氷上にて静 置した。 最後に 15, 000回転にて 10分間遠心分離した上清を核分画として保存した (液体窒素にて急速冷凍し、 - 80°Cにて保存した） 。 なお、 上記 Lysis Buffer, B uffer A及び Buf fer Cにはいずれも使用直前に、 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 z g/ml aprotinin, \ n§/ \ leupept in, 1 n g/ml pepstat in (いずれも Sigma社にて購入 ) を追加した。
上記の方法で抽出したタンパク質は、 各サンプルごとに同じ数の細胞から抽出 されたように補正した。 すなわち、 一サンプル当たり lxlO6個から抽出したタン パク質を 6%又は 11% SDS- PAGE GELにて電気泳動した後、 二卜ロセルロース膜に トランスファーし、 5% スキンミルク、 0.2% Tween20を含む PBSに浸して 1時間振 とうした (ブロッキング) 。 この溶液に、 マウスモノクローナル抗サイクリン D 1抗体 (Ab- 3; Oncogene science社製）、 マウスモノクローナル抗 RB抗体 （1400 1A Piiarmingen社製) 、 ゥサギポリクローナル抗サイクリン A抗体 (SC-751; San ta Cruz Biotechnology社製） 、 ゥサギポリクローナル抗サイクリン E抗体 （SC- 481; Santa Cruz Bio techno logy社製） 、 及び Z又はゥサギポリクロ一ナル抗 C DK4抗体 （SC- 260;Santa Cruz Bioteclmoiogy社製） を加えてさらに 1時間振 とうし、 5% スキンミルク、 0.2 Tween20を含む PBSにてこれらの抗体を洗浄した 後、 2次抗体としてヒッジ抗マウス Ig， horseradish peroxidase linked whole antibody (Amersham LifeSdence; NA931)又はヒッジ抗ゥサギ Ig, horseradish peroxidase linked whole antibody (Amersham LifeScience; NA934)と反応させ 、 5¾ スキンミルク、 0.2% Tween20を含む PBSにて洗浄後、 ECLキット （Western b lotting detection reagents; Amersham LifeScience; RPN 2109)を用いて免疫 蛍光染色し、 ウェスタンプロット解析を行った。
まず最初に増殖因子としての血清と、 ひアドレナリン作用性受容体ァゴニスト である PE (Phenylephrine)と、 心肥大因子として働く活性型 Rasタンパク質を発 現する組換えアデノウイルス Ad- Ras61L (Duke University Medical Centerの Nev ins, J.R.博士から入手した。 Leone, G.ら、 Nature、 387巻、 422— 426頁 、 1997年参照） を用いて心筋細胞を剌激した時のサイクリン D 1の発現と R Bのリン酸化の有無をウエスタンプロット解析により調べた。 図 1は、 心筋細胞 に Ad-Ras6iL又は対照として Ras遺伝子を含まないアデノウイルス Ad_Conを感染さ せ、 18時間後に培養液を 10%血清、 1(Γ6 Μの PE (Phenylephrine)を含む培地又 は無血清培地に置換してさらに 18時間培養した後、 細胞抽出物を電気泳動し、 各 抗体により染色した結果を示した。 図 1に示したように、 これらの刺激によって 心筋細胞でサイクリン D 1と CDK4 (デ一夕示さず） の発現が誘導されること が分かる。 サイクリン D 1と C D K 4の蓄積にもかかわらず、 心筋細胞ではサイ クリン D 1に関連したキナーゼは活性化されず （データ示さず） 、 RBタンパク 質もリン酸化されなかった。 これに対し、 対照として用いた REF52細胞では、 リ ン酸化により高分子量側にシフトしたバンド （PPRB) が検出されたことから、 R Bが高度にリン酸化されていることが分かる。 増殖している細胞においては、 D 型サイクリンの発現に伴って R Bタンパク質がリン酸化されるが、 心筋細胞では これに反して RBはリン酸化されなかった。 これらの結果は、 増殖刺激に対する 心筋細胞の反応は R B夕ンパク質のリン酸化が起らない点において増殖している 細胞とは異なることが理解される。
サイクリン D 1が細胞内に蓄積しているにもかかわらず、 どうして RBのリン 酸化が起こらないのかを調べるために、 D型サイクリン及び CDK4の細胞内に おける局在性を検討した。 図 2は、 心筋細胞及び REF52細胞から抽出した細胞質 分画と核分画をウエスタンブロット解析により調べた結果である。 各種の増殖剌 激を受けた心筋細胞において、 D型サイクリン及び CDK 4はいずれも核内には 存在せず、 細胞質でのみ発現していた。 一方、 増殖刺激を受けた REF52細胞にお いては、 サイクリン D l、 D 3及び CDK4が核内に移行していた。 RBタンパ ク質は心筋細胞および REF52共に核内に存在した。
図 3は、 ゥシ胎児血清 (FCS)又は組換えアデノウィルス Ad- RAS61Lで増殖刺激し た心筋細胞を、 マウス抗 sarcomericァクチンモノクローナル抗体を用いて免疫蛍 光染色した顕微鏡写真である。 いずれの場合もサイクリン D 1が細胞質に蓄積し ていることが分かる。
更に、 図 4は、 アデノウイルス Ad-Dlと Ad-CDK4によって野生型サイクリン D 1 と CDK 4を過剰発現させてもサイクリン D 1は核内に蓄積しないことを示す。 従って、 核移行シグナル (NLS)の付加されたサイクリン D 1遺伝子を含む組換え アデノウイルス Ad- D1NLSを構築した。 図 4及び図 5に示したように、 この Ad- MN LSと Ad- CDK4を共感染させると、 心筋細胞の核内でサイクリン D 1と CD K 4が 強く発現していることが分かった。 なお、 ヒトサイクリン D 1を発現させるアデ ノウィルス Ad-Dlは、 Minneapolis Medical Research Foundationの Albrecht, J. 博士より入手した (Albrecht, J. H.ら、 Cell Growth & Differentiation, 10 巻、 397— 404頁、 1999年参照） 。
細胞周期を G 1期から S期に移行させるためには D型サイクリンと CDK4と の複合体が核内に入りそこで CDK 4が CD K活性化キナーゼ （CAK) による リン酸化を受けなければならない （Sherr， C. J.ら、 Genes and Dev. 1999年 参照） 。 従って、 次に、 このように核内で発現したサイクリン D 1および CDK 4が R Bをリン酸化して細胞周期を進行させるかどうかについて調べた。 図 6は Ad- D1NLSと Ad- CDK4の共感染によって心筋細胞の核内で RBがリン酸化されてい ることを示す。 図 6において、 CDKインヒビ夕一である pl6や p21タンパク質を 発現するアデノウィルスベクター (Ad- pl6及び Ad-p21)を上記 Ad- D1NLS/Ad- CDK4と 共感染させると RBのリン酸化が阻害されることから、 Ad- D1NLS/Ad- CDK4の感染 による R Bのリン酸化は、 サイクリン依存性キナーゼの活性に依存していること が確認される。 また、 図 7は RBZE 2 Fのターゲットであるサイクリン Aゃサ イクリン Eが心筋細胞の核内で発現していることを示す。 これらの結果は、 核内 におけるサイクリン D 1ZCDK4の活性が RBをリン酸化し、 細胞周期を進行 させる可能性を示唆する。 [実施例 4 ]細胞周期の解析
次に細胞周期の解析を行うため、 実施例 1で調製した組換えアデノウイルスを 、 実施例 2で調製したラット心筋細胞に感染させ、 種々の時間経過後に、 直径 25 匪カバ一スリップガラス上で 70%エタノールにより固定し、 DN A含量を測定 するためにヨウ化プロビジゥム（PI; propidi蘭 iodide)で染色した。 即ち、 エタ ノールで固定した細胞をフルォレセインイソチオシァネート（FITC)にて標識した iasarcomeric act in抗体（1: 1000)を加え、 PBSにて洗った後、 PI 50 g/ml， RNas e A 500 g/mlを加え、 37°C、 15分間、 更に室温で 15分間静置した後、 各細胞の 細胞周期における位置をレーザースキャニングサイトメ一夕一 （LSC、 ォリン パス社製） により検出した。 心筋細胞は、 上記抗 sarcomeric actin抗体による二 重染色によって確認した。
図 8は、 LSCによる細胞周期の解析結果を示した。 図 8 aは種々のウィルス 感染又は増殖因子によって刺激された心筋細胞を一定時間経過後の細胞の分布状 態 （DN A含量と細胞数の関係） を示したものである。 無血清培地で Ad-DINLS/A d - CDK4を共感染させた心筋細胞 （D1NLS/CDK4) は、 時間経過と共に S期及び G 2 期に移行していることが D N A含量の変化から推測される。 更に 5 %の牛血清を 添加した細胞 （5¾CS+D1NLS/CDK4) では、 無血清の条件に比べてこの細胞周期の 進行は加速される。 これに対し、 血清刺激 （10%FCS) 又は核移行シグナルのない サイクリン D 1を含む Ad- Dl/Ad-CDK4に感染した心筋細胞 （D1/CDK4) は、 ほとん ど細胞周期が進行していないことが分かる。 5 %牛血清のみ （5%CS) では G 1期 にとどまったままである。 これらの結果は、 M_D1NLS/Ad-CDK4の共感染によって 心筋細胞の細胞周期が進行していることを示している。
更に、 細胞周期の進行を起こした細胞の割合を確認するため、 細胞周期を G 2 期で停止させる抗生物質であるノコダゾ一ル （シグマ社製） を添加して L S Cに よる解析結果を図 8 bに示した。 この結果から、 ノコダゾ一ル (50 ng/ml)を添加 して培養した Ad- D1NLS/Ad- CDK4の共感染心筋細胞 （DlNLS/CDK4+Nocodazole) は ほとんどの細胞が S期及び G 2 ZM期にあることが分かる。 従って、 M-D1NLS/A d-CDK4によって共感染させた心筋細胞のほとんどが細胞周期の進行を起こしたこ とが示唆される。 G 2 ZM期に同調培養された心筋細胞からノコダゾールを除去 するとこれらの細胞は再び G 1期に入ることが分かる （pos t Nocodazole wash out) 。 これらの結果は、 核内において発現したサイクリン D 1 /C D K 4が S 期誘導だけでなく、 細胞分裂も誘導し、 心筋細胞の完全な細胞周期の進行を起こ すことを示している。
図 9は、 共焦点レーザ一顕微鏡（confocal laser microscope)を備えたレーザ 一スキャンサイトメータ一 （L S C；ォリンパス社製、 日本） により、 Ad- D1NLS /Ad-CDK4を共感染させ 48時間後の心筋細胞を撮影したものである。 図 9 aには、 有糸分裂中の又は、 有糸分裂直後の細胞が確認される。 各細胞の細胞周期位置は P I染色により計測した D NA含量 （Hの蛍光量） と PI蛍光強度のピーク （最大 値） で決定した。 D N A複製を起こした細胞は、 その D NA含量 （PIの蛍光量） が増加し、 一方、 分裂直前、 直後の細胞は D N Aが凝集するため PI蛍光強度が高 くなる （明るくなる） ことを指標として、 顕微鏡写真の中の個々の細胞 （1〜2 7の番号を付した） を、 その細胞周期位置 （G 1〜M期） によって a〜： f に分類 した （図 9 b ) 。 その結果、 G 1〜M期の各位置の細胞が混在し、 細胞分裂中及 び分裂した細胞が多数観察された。 図 1 0は、 これらの細胞数をコールターカウンター （細胞数計測器） で計測し た結果を相対的に示したものである。 Ad- DINLS/Ad- CDK4を共感染させ培養した心 筋細胞の細胞数は、 5日後には約 3倍に増加していることが分かる。 これに対し 、 対照としてベクターのみのアデノウイルスを感染させた心筋細胞はほとんど細 胞数の増加は認められなかった。
[実施例 5 ]生体内における心筋細胞の増殖可能性の検討
サイクリン D 1と C D K 4の核内への移行が、 生体内における心筋細胞の増殖 を起こすかどうかを確認するため、 実施例 1及び 2で作製した -D1NLSと Ad- CDK 4の 2種類のアデノウイルスを、 ウィスター系ラット （250〜300 g ) を開胸して 目視にて心尖部（apical region)に注入した。 対照として lacZ遺伝子を含むアデ ノウィルスも同様に行った。 注入後 4日間経過後、 4 %パラホルムアルデヒドを 灌流して心臓細胞を固定化し、 心臓組織の切片をゥサギ抗 Ki- 67抗体及びマウス 抗 sarcomeric act in抗体で標識した。 標識された抗体は抗ゥサギ Mexa488抗体又 は抗マウス Alexa568抗体 （何れも Molecular Probes社） を用いてそれぞれ緑色及 び赤色に染色視覚化した。 視覚化された画像は、 レーザースキャニング共焦点ィ メ一ジシステム （ZEISS社 LSM510) を用いて観察し、 その結果を図 1 1に示した 。 図 1 1において、 赤色は sarcomeric act inを示し、 緑色は Ki- 67を示す。
Ki - 67核タンパク質は細胞周期のすべてのサイクルにおいて増殖している細胞 で発現することから （Sdiolzenら、 J. Cel l. Physiol. , 1 8 2巻、 3 1 1— 3 2 2頁、 2 0 0 0年参照） 、 細胞 期が進行している細胞を検出するために用い た。 Ad- D1NLSと Ad- CM4の 2種類のアデノウィルスを共感染させた心臓切片の画 像 （図 1 1 a及び b ) では、 多くの心筋細胞及び非心筋細胞において、 Ki- 67核 タンパク質が発現していることが分かった。 一方、 lacZ遺伝子を含むアデノウィ ルスを注射した心筋細胞では Ki- 67核タンパク質の発現は認められなかった （図 1 1 c ) 。 これらの結果より、 生体内においても、 サイクリン D 1と C D K 4の 核内への移行が心筋細胞の細胞周期を進行させることが示唆された。
以上の結果より、 サイクリン D 1 /C D K 4活性を核内で発現させた心筋細胞 は明らかに増殖能を獲得したことが理解される。 産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 終末分化した細胞の細胞分裂を誘導し、 細胞を増殖さ せて移植用の細胞や組織をつくることができる。 特に心筋細胞、 神経細胞、 腎臓 細胞及び膝臓細胞等の終末分化した細胞自身を増殖させることによって、 E S細 胞等の未分化細胞を分化誘導させる場合と比べてより安全かつ確実な再生医療へ の利用が期待される。

Claims

請求の範囲
1 サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼを終末分化細胞の核内に導入し、 次いでその細胞を培養又は保持することを特徴とする終末分化細胞の増殖方法。
2 サイクリン遺伝子及びサイクリン依存性キナーゼ遺伝子の少なくとも一方に 核移行シグナルをコードする塩基配列を付加し、 前記各遺伝子を試験管内で終末 分化細胞に導入し次いでその細胞を培養する力 又は前記各遺伝子を生体内の終 末分化細胞に直接導入することを特徴とする終末分化細胞の増殖方法。
3 前記サイクリンは哺乳類の C D K 4又は C D K 6を活性化し得るサイクリン であることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の方法。
4 前記サイクリン依存性キナ一ゼは哺乳類のサイクリン D 1、 D 2又は D 3に より活性化されるサイクリン依存性キナーゼであることを特徴とする請求の範囲 第 1項〜第 3項の何れか記載の方法。
5 前記終末分化細胞は心筋細胞、 神経細胞、 腎臓細胞又は膝臓細胞であること を特徴とする請求の範囲第 1項〜第 4項の何れか記載の方法。
6 前記終末分化細胞への遺伝子の導入はアデノウイルスベクターを用いた遺伝 子導入であることを特徴とする請求の範囲第 2項〜第 5項の何れか記載の方法。
7 核移行シグナルをコ一ドする塩基配列を付加した、 サイクリン遺伝子又はサ イクリン依存性キナーゼ遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター。
8 サイクリン遺伝子とサイクリン依存性キナーゼ遺伝子とを含む組換えべクタ 一であって、 これらの遺伝子のうち少なくとも一方に核移行シグナルをコードす る塩基配列を付加したことを特徴とする組換えベクター。 9 前記サイクリン遺伝子は哺乳類の C D K 4又は C D K 6を活性化し得るサイ クリン遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第 7項又は第 8項に記載の組換 えべクタ一。
1 0 前記サイクリン依存性キナーゼ遺伝子は哺乳類のサイクリン D 1、 D 2又 は D 3によつて活性化されるサイクリン依存性キナーゼ遺伝子であることを特徴 とする請求の範囲第 7項又は第 8項に記載の組換えベクター。
1 1 前記組換えべクタ一はアデノウイルスベクターであることを特徴とする請 求の範囲第 7項〜第 1 1項の何れか記載の組換えベクター。
1 2 請求の範囲第 1項〜第 6項の何れか記載の方法により増殖させたことを特 徴とする動物細胞又は組織。
1 3 請求の範囲第 7項〜第 1 1項の何れか記載の組換えベクターを有効成分と することを特徵とする終末分化した細胞及び Z又は組織を増殖させるための薬剤
1 4 心臓疾患を有する患者の治療方法であって、 請求の範囲第 1 3項に記載の 薬剤を直接患者の心筋に投与し、 患者の心筋を増殖させることを特徴とする心臓 疾患の治療方法。
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