WO2002092831A2 - Verfahren zur identifizierung von liganden für g protein coupled receptors - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von liganden für g protein coupled receptors Download PDF

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WO2002092831A2
WO2002092831A2 PCT/EP2002/004845 EP0204845W WO02092831A2 WO 2002092831 A2 WO2002092831 A2 WO 2002092831A2 EP 0204845 W EP0204845 W EP 0204845W WO 02092831 A2 WO02092831 A2 WO 02092831A2
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protein
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Kirsten Uhlenbrock
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    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying ligands for orphan GPCRs (G protein coupled receptors) using FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader).
  • GPCR G-protein coupled receptors
  • GPCRs are a family of integral membrane proteins located on the cell surface of cells. They receive signals from extracellular signal substances (e.g. hormones, neurotransmitters, peptides, lipids) and transmit these signals to the interior of the cell via a family of guanine nucleotide-binding proteins, so-called G-proteins. They activate different signal transduction pathways depending on the specificity of the receptor, the activated G protein and the cell type.
  • the polypeptide chain of all GPCRs fold into seven ⁇ -helices that span the phospholipid double layer of the cell membrane. The seven membrane passages result in extra- and intracellular loops that enable extracellular ligand binding and the intracellular coupling of G proteins.
  • GPCRs are also called seven-transmembrane receptors. All G protein-coupled receptors work according to a common basic pattern: the binding of an extracellular ligand leads to a change in the conformation of the receptor protein so that it can make contact with a G protein. A G-protein-mediated signal transduction cascade within the cell ultimately leads to a biological response from the cell.
  • G-proteins are heterotrimeric proteins, which consist of the subunits, ß and ⁇ and are located on the inside of the cell membrane due to lipid anchors.
  • the coupling of activated GPCRs to G proteins causes a GDP / GTP exchange of the G ⁇ subunit and the dissociation of the heterotrimer into an ⁇ and a ⁇ subunit. Both the activated ⁇ subunit and the ⁇ complex can influence intracellular effector proteins.
  • G proteins of the gas type leads, for example, to an increase in the intracellular cAMP level or to a decrease in the latter when G proteins of the G ⁇ i type are activated.
  • Gq-type G proteins activate phospholipase C (PLC), which catalyzes the formation of inositol-1, 4,5-triphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG). These molecules in turn lead to
  • G protein kinase C PLC
  • Promiscuity refers to the non-selectivity of the G protein towards a GPCR.
  • promiscuous G proteins can be produced from hybrid G proteins or by mutagenesis within the G16 family. So z. B. by the fusion of the receptor recognition region of G ⁇ i with the effector activation region of G ⁇ q a G ⁇ q / i hybrid can be produced, which receives signals from Gi-coupled receptors but receives the G ⁇ q-PLCß signal transduction pathway.
  • Such a hybrid, in which the C-terminal 5 amino acids of G ⁇ q has been replaced by the corresponding G ⁇ i sequence (G ⁇ qi5) was described for the first time by Conklin et al., Nature 363, 274-276 (1993).
  • Adenylate cyclase is more easily accessible by measurement methods and can be used in high-throughput screening.
  • One device that can measure intracellular Ca 2+ levels in the 96-well or 384-well formal is the FLIPR (Molecular Devices).
  • GPCRs No natural ligands are known for many GPCRs. Such GPCRs are called orphan (English: Weisenkind) GPCRs.
  • GPR stands for another name of G-protein-coupled-receptor. The numbers refer to the specific type. For all three receptors, a strong form was originally found in the central nervous system. In the meantime, however, it has been demonstrated that GPR 3, 6 and 12 are also expressed in the peripheral vascular system (endothelial cells and smooth muscle cells). It can therefore be assumed that these receptors play an essential role in the physiology / pathophysiology of the endothelium and thus of the entire vascular system of humans. The development of high blood pressure, atherosclerosis or other cardiovascular diseases could be associated with these receptors. Sequence comparisons revealed a high degree of homology to GPCRs with lipid ligands.
  • GPR 3, 6 and 12 could also be lipid receptors.
  • the sequence information for the genes of the three receptors is available to the public.
  • the sequence number for the human gene of GPR 3 is the number “L 32831”, for the human gene GPR 6 the number “L 36150” and for the human gene of GPR 12 the number “U 18548”.
  • the information is available for example via www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • ligands for GPCRs are usually determined in laboratory experiments by trial and error.
  • the disadvantage of this approach is that it is often time-consuming and controlled by chance. It is therefore an object of the present invention to provide a quick and simple method by means of which one or more ligands for a GPCR can be identified.
  • the incorporation of results from bioinformatics is indispensable for the assay setup and the targeted search for physiological ligands.
  • Receptors should be able to be switched on by adding the activator exogenously.
  • attempts were made to switch the receptors on the HTS-capable Ca 2+ pathway after stimulation with potential lipid activators.
  • the functional experiments were carried out in the presence of 300 ⁇ M suramin in order to reduce the background present by endogenous lipid receptor expression and to potentiate the signals mediated by GPR3, 6, 12.
  • a physiological ligand is also unknown for the rat GPR3.
  • the invention therefore relates to a method for identifying a ligand of a G protein-coupled receptor (GPCRs)
  • a cell is made available whose endogenous signal transduction cascades allow the coupling of the orphan GPCRs GPR3, 6 and 12 as well as rGPR3 to the Ca 2+ pathway. This is essential here
  • the cell line from a) is transfected with a recombinant construct of a GPCR in such a way that said GPCR is overexpressed in this cell line, c) at least one chemical compound is made available which, based on theoretical considerations, is supported by bioinformatics and literature research (Eggerickx et al, 1995) comes into consideration as a possible ligand.
  • Fluorescence measurement from e) is carried out with the results of a fluorescence measurement after contacting a cell according to a) with a chemical compound according to c).
  • the GPCRs of the present invention interact particularly with the G ⁇ i class of the G protein ⁇ subunits.
  • the activation of G ⁇ i causes the inhibition of the adenylate cyclase.
  • the ß ⁇ complex can in turn cause an intracellular release of Ca2 + from storage organelles.
  • G alpha proteins are used, the GPCRs of different ligand specificity at the
  • the protein "G ⁇ 16" is particularly suitable for carrying out a method of the aforementioned invention. Further G ⁇ proteins that can be used to carry out the method are disclosed in DE 10033353.2.
  • a GPCR for which no physiological ligand is known is preferably used for carrying out the method.
  • a physiological ligand is to be understood as a molecule which is formed by an organism, in particular a mammal, which binds to this GPCR and thereby activates a downstream G alpha protein.
  • a GPCR from the group GPR 3, 6 or 12 is furthermore preferably suitable for implementation.
  • the complete receptor of the GPR 3 from rat is particularly preferred.
  • Those of mammals are preferably suitable as cells. These cells can consist of primary cells or cell lines. Examples of such cells are primary cells from mammalian organs (e.g. brain, muscle, adipose tissue, heart, lungs, liver, Kidney, blood vessels, hormone glands, etc.). Suitable cell lines are preferably CHO, HEK 293, COS, mouse 3T3, Heia cells or others. Yeast cells can furthermore preferably be used.
  • the provision of a cell comprises its manufacture, cultivation and further processing. It is provided, for example, by preparing suitable cell material from organs or tissues or by multiplying suitable cell lines or microorganisms. Various suitable nutrient media can be used for cultivation. The cells are kept at the optimal temperature for the organism. If necessary, preservatives, antibiotics, pH indicators, blood serum components, blood serum, auxiliaries or others are added to the growth medium used in each case. Methods for the production, cultivation and further processing are described in standard works. (Example: Basic Cell Culture; Ed. J.M. Davis; IRL Press; 1994).
  • a construct to be expressed in a cell is in the form of a polynucleotide sequence that can be routinely produced by the person skilled in the art with the help of his specialist knowledge.
  • the specialist knowledge of the biochemical / molecular biological specialist for this can be found, for example, in “FM Ausubel et al.; Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley &Sons; New York ".
  • a polynucleotide which codes for the amino acid sequence of a GPCR for example, is incorporated into an expression vector.
  • An expression vector is to be understood as a vector in which a polynucleotide sequence can be transfected and expressed in a host cell.
  • Vectors can be derived of plasmids, viruses, or cosmids. Vectors must have the ability for autonomous replication. They generally contain an origin of replication, interfaces for restriction enzymes and marker genes such as genes for antibiotic resistance Functional control of a promoter
  • a promoter is a functional polynucleotide sequence of different lengths by means of which the transcription, ie the synthesis of mRNA, is directly in 3 ' direction behind the promoter polynucleotide sequence is controlled. There are promoters that are only active in procarotes, such as the lac, tac or trc promoter, and promoters that are only active in eukaryotes, such as the CMV, T, or ADH promoter.
  • the recombinant vector construction consists of an expression vector which can be used in eukaryotes and / or prokaryotes.
  • An expression vector contains a promoter which can be functionally linked to a polynucleotide sequence so that a protein encoded by this polynucleotide sequence is synthesized in an organism, for example a bacterium, fungus or the cells of a eukaryotic cell line.
  • the promoter can be inducible, for example by means of tryptophan, or it can be constitutively active.
  • expression vectors are pUC18, pUC19, pBluesccript, pcDNA3.1 or others.
  • Transfection is understood to be the introduction of foreign polynucleotide sequences into a host cell by means of a vector and the subsequent multiplication of this polynucleotide sequence to any number of identical copies.
  • transient transfection of a cell line with a recombinant construct takes place by means of routine methods which the person skilled in the art has mentioned in the above-mentioned "Current Protocols in Molecular Bioiogy” published by John Wiley & Sons, New York or in “Sambrook et al., A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory , ISBN 0- 87969-309-6 "finds.
  • routine procedures are, for example, electroporation, Ca2 + phosphate coprecipitation or transfection using liposomes.
  • Expression of transfected genes in the host cell can be detected by Western blotting of cell lysates from transfected cells in combination with an immunological detection method.
  • a chemical compound is made available in particular by chemical synthesis or by isolation of chemical substances from biological material.
  • Biological material contains living or non-living cells or components thereof.
  • Suitable solvents can be water, buffer substances (e.g. Tris, Hepes, Mops etc.) monovalent and / or divalent ions (e.g. K + , Na + , Mg 2+ , Ca 2+ etc.), acids (e.g. HCL, H2SO4,
  • alkalis e.g. NaOH etc.
  • alcohol e.g. methanol, ethanol, glycerin
  • detergents e.g. Na-dodecyl sulfate etc.
  • organic solvents e.g. formamide, acetone, Dimethyl sulfoxide, etc.
  • other components in particular for solubilization or stabilization.
  • a chemical compound for the process according to the invention should be suitable as a ligand for a GPCR. This chemical compound could also be a lipid due to the similarity of GPR
  • Such a connection can in particular from tissues or organs of vertebrates such.
  • B. endothelial cell tissue, heart tissue, brain tissue, blood, serum or plasma can be obtained.
  • the natural ligand of a GPCR is preferably suitable for carrying out the method according to the invention.
  • the person skilled in the art can use routine methods from the laboratory to bring the chemical compound into contact with the cell line mentioned. The contacting takes place, for example, in Erlenmayer vessels, tubes, Eppendorf vessels or on microtiter plates. Temperature-controlled incubators can be used to bring them into contact, in which a constant temperature of, for example, 30 ° C. or 37 ° C. and uniform CO 2 conditions or humidity conditions can be regulated.
  • the contacting can in particular also be carried out in devices provided for this purpose in a laboratory robot (FLIPR).
  • FLIPR laboratory robot
  • the contacting is possible over different time spans of a few seconds, over minutes up to several hours.
  • the conditions to be selected depend on the receptor, the cell line and the chemical compound.
  • FLIPR Fluometric Imaging Plate Reader
  • the system is suitable for measuring intracellular Ca 2+ signals. The determinations are carried out in microtiter plates with 96 or 384 wells.
  • the binding of a ligand to a GPCR leads to the intracellular release of Ca 2+ .
  • the amount of Ca + released can be determined using a calcium-sensitive fluorescent dye (e.g. fluo- 4).
  • GPCR can be determined.
  • a ligand activates the Ca 2+ release much more strongly in the cell, which functionally overexpresses a GPCR.
  • the technical equipment of the FLIPR system including the reagents for the determination of Ca 2+ are commercially available.
  • One provider is in particular the company Molecular Devices with offices in Sunnyvale (CA), Ismaning (AE) and Ashiya (JP), among others.
  • the invention also relates to a ligand identified by the method described above.
  • S1 P and DHS1 P cause Ca 2+ release in HEK293 cells.
  • Suramin was used in the present assay to reduce the endogenous lipid background.
  • a natural ligand is used by an organism e.g. B. a vertebrate to appropriately activate a GPCR in the context of the organism.
  • the purpose is there especially in the initiation of biochemical functions such.
  • B. the activation of action potentials to process sensory stimuli, the activation of a gene synthesis for a structural or messenger protein, the release of messenger substances, the regulation of metabolic functions, the regulation of organ functions such as the heartbeat of blood pressure or similar biological processes.
  • a chemical compound that is suitable as a ligand for a GPCR binds to this GPCR. Binding of a ligand triggers activation of this receptor.
  • the activation of a GPCR leads to the release of intracellular Ca2 + in the cell in the method according to the invention.
  • the invention further relates to a medicament which contains a ligand mentioned above and furthermore additives for stabilizing the ligand and / or for formulating a medicament.
  • the invention also relates to the manufacture of a medicament. For this purpose, the above-mentioned ligand is mixed with the additives, then the drug is processed to its final form, filled, provided with an instruction leaflet and packaged.
  • the final form of a drug relates to the final formulation, for example as a tablet, granulate, spray, solution, ointment, tincture or other formulation forms.
  • the processing to the final form refers to the production of the respective formulation.
  • the invention also includes the use of a ligand as mentioned above for the manufacture of a medicament which is suitable for the treatment of a disease which is based on a malfunction of the GPCR to which this ligand binds.
  • the ligand is preferably used for the production of a medicament for the treatment of cardiovascular diseases and CNS diseases.
  • the ligand is preferably in the form of a pharmaceutical composition with an acceptable carrier.
  • the carrier must of course be compatible, in the sense that it is compatible with the other components of the composition and is not harmful to the health of the patient.
  • the carrier can be a solid or a liquid or both and is preferably formulated with the compound as a single dose, for example as a tablet, ranging from 0.05% to Can contain 95% by weight of the active ingredient.
  • compositions according to the invention can be prepared by one of the known pharmaceutical methods, which essentially consist in mixing the constituents with pharmacologically acceptable carriers and / or auxiliaries.
  • Pharmaceutical compositions according to the invention are those which are suitable for oral, rectal, topical, peroral (e.g. sublingual) and parenteral (e.g. subcutaneous, intramuscular, intradermal or intravenous) administrations.
  • the amount of a ligand, as mentioned above, required to achieve a desired biological effect depends on a number of factors such as e.g. The specific compound chosen, the intended use, the mode of administration or the clinical condition of the patient.
  • the quantities given below relate to a ligand.
  • the daily dose is in the range from 0.3 mg to 100 mg (typically from 3 mg to 50 mg) per day per kilogram of body weight, e.g. B. 3-10 mg / kg / day.
  • An intravenous dose can e.g. B. are in the range of 0.3 mg to 1.0 mg / kg, which can suitably be administered as an infusion of 10 ng to 100 ng per kilogram per minute.
  • Suitable infusion solutions for these purposes can e.g. B. from 0.1 ng to 10 mg, typically from 1 ng to 10 mg per milliliter.
  • Single doses can e.g. B. from 1 mg to 10 g of the active ingredient.
  • ampoules for injections may contain, for example, from 1 mg to 100 mg, and orally administrable egg dose formulations, such as tablets or capsules, for example, from 1.0 to 1000 mg, typically from 10 to 600 mg.
  • the invention also relates to a polynucleotide sequence according to Seq ID No. 1, which codes for a GPR 3 of the rat.
  • the invention further comprises a protein for the GPR 3 of the rat containing at least one amino acid sequence according to Seq ID No. 2.
  • the invention also contains an expression vector in which the above-mentioned polynuclide sequence of the GPR 3 of the rat according to Seq ID No. 1 was incorporated.
  • the invention also relates to the production of a cell which expresses the GPR 3 of the rat containing at least the amino acid sequence according to Seq ID No. 2, this cell being transfected by means of the expression vector mentioned above.
  • the human genes of GPR 3, 6 and 12 do not contain introns. They can therefore be amplified from human genomic DNA using PCR (polymerase chain reaction). The coding sequences were cloned via the Hind III / Xbal sites of pcDNA 3.1 (Invitrogen).
  • the sequence of the complete gene of GPR 3 in the rat was determined by PCR amplification of cDNA of the rat brain using the ⁇ 'primer 5' -ATG GCC CTT ATG GCC TGG TTC GCC TCA GCC TCA-3 '(Seq ID3) and the 3 ' Primers (mouse) 5 ' -TCT AGA CTA GAC ATC ACT AGG GGA CCG GGA-3 '(Seq ID4) increased.
  • the ⁇ ' primer additionally provides a Hind III site and generates a Kozac sequence before the start codon. An Xbal position is also taken into account in the 3 ' primer.
  • the 990 bp long amplification product was cloned into the Hind III / Xbal sites of pcDNA 3.1 (Invitrogen) and then sequenced.
  • HEK293 cells (cell line from Human Embryonic Kidneys) were cultivated in DMEM, which was supplemented with 10% fetal bovine serum 10,000 lU / ml penicillin, 10,000 ⁇ g / ml streptomycin and 25 mM Hepes pH 7.0.
  • CHO-K1 cells (cell line from Chinese Hamster Ovary) were cultivated in Iscove medium, which was supplemented with 10% fetal bovine serum, 10,000 lU / ml penicillin, 10,000 ⁇ g / ml streptomycin, gentamycin and 2 mM L-glutamine.
  • Iscove medium is commercially available e.g. B. of biochrom.
  • the transfection was in the case of HEK293 cells using FuGene 6 transfection reagent (commercially available, for example from Röche Diagnostics) and in the case of CHO cells using Lipofectamine reagent (commercially available, for example from GIBCO-BRL) according to the instructions in the Manufacturer carried out.
  • FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader
  • HEK293 cells were transferred to 96 well microtiter plates 24 hours after transient transfection.
  • the cell density was 80,000 cells per well.
  • Microtiter plates were coated with poly-D-lysine.
  • the cells were kept in medium with 1% FCS (fetal calf serum) for 18 to 24 hours. After this The cells were trypsinized in DMEM (Dulbecco 's modified Eagle medium), which additionally contains 25 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N ' -2-ethanesulfonic acid) pH 7.0, 1% FCS, 10,000 lU / ml of penicillin, 10,000 ⁇ g / ml streptomycin and 4 ⁇ M dye fluo4 (fluorescent calcium indicator from Molecular Dynamics) contained suspended and then incubated for 1 hour at 37 ° C. under 5% CO 2.
  • DMEM Dulbecco 's modified Eagle medium
  • HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N ' -2-ethanesulfonic acid
  • PBS phosphate buffered saline
  • FAF-BSA bovine serum albumin free
  • Fatty acids contained. After the last washing step, the volume was 100 ⁇ l per well.
  • the compounds to be examined were mostly in the form of 2 mM stock solutions in DMSO (dimethyl sulfoxide). This was diluted 1: 500 with the PBS solution, which contained 1 mM MgCl2 1 mM EDTA and 0.4 mg / ml FAF-BSA. Lipids were pre-assayed as triple-concentrated solutions.
  • Suramin (Sigma) was prepared in PBS containing 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA and 0.4 mg / ml FAF BSA as a triple-concentrated solution.
  • the FLIPR was programmed in such a way that 50 ⁇ l from the triple concentrated stock solution of suramin was added to the cells. This gave a final concentration of 300 ⁇ M with respect to suramin. Fluorescence was measured at 3 second intervals for the first 3 minutes and at 10 second intervals for the last 2 minutes. Ca2 + signals from ligands were determined analogously. The fluorescence measurements of the time interval from 18 seconds to 37 seconds were used to determine agonist activity. The device itself carries out an internal comparison of the zero values.
  • GPCR 3, 6 and 12 are orphan receptors of the GPCR protein family With the help of Genbank searches (EMBL), the lipid receptors EDG, (endothelial differentiation gene) and cannabinoid GPCRs were found to be the structurally closest relatives of GPR 3, 6 and 12 be identified. Within one Species homology is 65-68% based on the nucleotide sequence. In comparison to the rat sequences, the human sequences each show 87% (GPR 3), 83% (GPR 6) and 88% (GPR 12) homology.
  • RT-PCR Reverse transcripase polymerase chain reaction
  • lipid library consisting of 200 bioactive lipids did not provide any further ligands and also showed the ineffectiveness of cannabinoids.
  • the newly cloned rGPR 3 (L 32829, 33 bp partial sequence), like its human homolog, can be switched on by S1 P / DHS1 P in a Ca 2+ FLIPR assay.
  • the coupling of GPR 3, 6 and 12 to the Ca 2+ signaling pathway works in HEK293 cells without the co-transfection of G-Q or other chimeras, promiscous G ⁇ subunits.
  • the S1 P / DHS1 P-induced Ca 2+ release in HEK293 cells is sensitive to pertussis toxin, ie the signal transduction cascade runs via G proteins of the G ⁇ i type.
  • the Ca 2+ release is partially sensitive to inhibitors of sphingosine kinase.

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Abstract

Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Liganden für orphan GPCRs.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Identifizierung von Liganden für G protein coupled receptors
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Liganden für orphan GPCRs (G protein coupled receptors) mittels FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader).
G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) spielen eine zentrale Rolle bei einer Vielzahl unterschiedlichster physiologischer Prozesse. Es wird angenpmmen, daß im menschlichen Genom etwa 1000 Gene für diese Rezeptorfamilie kodieren. Schätzungsweise 60% der gegenwärtig verfügbaren, verschreibungspflichtigen Arzneimittel wirken als Agonisten oder Antagonisten von GPCRs. Dies unterstreicht die bedeutende Rolle dieser Rezeptorklasse für die arzneimittelforschende Industrie. Aufgrund der Größe und Bedeutung der Proteinfamilie und angesichts Tatsache, daß für viele GPCRs noch kein physiologischer Ligand bekannt sind (orphan GPCRs), ist davon auszugehen, daß diese Rezeptorklasse in Zukunft eines der wichtigsten Reservois für geeignete Zielproteine bei der Suche nach neuen Arzneistoffen sein wird.
GPCRs sind eine Familie von integralen Membranproteinen, die auf der Zelloberfäche von Zellen lokalisiert sind. Sie empfangen Signale von extrazellulären Signalstoffen (z.B. Hormone, Neurotransmitter, Peptide, Lipide) und übertragen diese Signale über eine Familie von Guanin-Nucleotid-bindenden Proteinen, sogenannten G-Proteinen, ins Zellinnere. Dabei aktivieren sie in Abhängigkeit von der Spezifität des Rezeptors, des aktivierten G-Proteines und des Zelltyps verschiedene Signaltransduktionswege. Die Polypeptidkette aller GPCRs falten sich zu sieben α-Helices, die die Phospholipid- Doppelschicht der Zellmembran durchspannen. Aufgrund der sieben Membrandurchgänge ergeben sich extra-, und intrazelluläre Loops, die die extrazelluläre Ligandenbindung und die intrazelluläre Kopplung von G-Proteinen ermöglichen. Aus diesem Grund werden GPCRs auch als Sieben-transmembranäre Rezeptoren bezeichnet. Alle G-Protein gekoppelten Rezeptoren funktionieren nach einem gemeinsamen Grundmuster: die Bindung eines extrazellulären Liganden führt zu einer Konformationsänderung des Rezeptorproteins, so daß dieses Kontakt mit einem G- Protein aufnehmen kann. Über G-Protein-vermittelte Signaltransduktionskaskaden innerhalb der Zelle kommt es letztendlich zu einer biologischen Antwort der Zelle.
G-Proteine sind heterotrimere Proteine, die aus den Untereinheiten , ß und γ bestehen und aufgrund von Lipidankern auf der Innenseite der Zellmembran lokalisiert sind. Die Kopplung von aktivierten GPCRs an G-Proteine bewirkt einen GDP/ GTP- Austausch der Gα-Untereinheit und die Dissoziation des Heterotrimers in eine α-, und eine ßγ-Untereinheit. Sowohl die aktivierte α-Untereinheit als auch der ßγ-Komplex können intrazelluläre Effektorproteine beeinflussen.
Die Aktivierung der membranständigen Adenylat-Cyclase (AC) durch G-Proteine vom Typ Gas führt beispielsweise zum Anstieg des intrazellulären cAMP Spiegels bzw. zu dessen Abfall bei Aktivierung von G-Proteinen vom Typ Gαi. G-Proteine vom Typ Gq aktivieren die Phospholipase C (PLC), die die-Bildung von lnositol-1 ,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) katalysiert. Diese Moleküle wiederum führen zur
Freisetztung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern, bzw. der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) mit weiteren Effekten in beiden Fällen. Neben den o.g. genannten G-Protein-Typen (Gαi/s, Gq) existieren noch zahlreiche weitere Typen, die als G16, G12/13 etc. bezeichnet werden. Die Vielfalt von G-Protein- Typen spiegelt die Vielzahl unterschiedlichster Funktionen von GPCRs wider.
Die meisten GPCRs binden nur an Gα-Untereinheiten eines Typs, d.h. sie besitzen Selektivität für einen bestimmten Signaltransduktionsweg. Für den Zweck ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe chemische Verbindungen identifiziert werden sollen, die GPCR-abhängige Signaltransduktionswege anschalten, ist diese enge Spezifität sehr hinderlich. Darüberhinaus sind für einen industriellen Assaytyp mit hohem Probendurchsatz (High Throughput Screening = HTS) beipielsweise nur solche Siganitransduktionswege geeignet, die schnelle und einfach auszuwertende read-outs liefern. Der Anstieg des intrazellulären Ca2+-Spiegels durch Gq bzw. G16-Proteine erfüllt diese Vorraussetztung. Mit dem Ziel, möglichst alle GPCRs funktionell an den Ca2+-pathway zu koppeln und sie so einem HTS-Screening zugänglich zu machen, wurden in den letzten Jahren vermehrt sogenannte promiscuitive G-Proteine konstruiert. Promiscuität bezeichnet die Unselektivität des G-Proteins gegenüber einem GPCR. Mittels der Methoden der Molekularbiologie und Biochemie können promiscuitive G-Proteine aus Hybrid-G-Proteinen oder durch Mutagenese innerhalb der G16-Familie hergestellt werden. So kann z. B. durch die Fusion der Rezeptorerkennungsregion von Gαi mit der Effektor-Aktivierungsregion von Gαq ein Gαq/i-Hybrid hergestellt werden, das Signale von Gi-gekoppelten Rezeptoren empfängt aber den Gαq-PLCß-Signaltransduktionsweg anschaltet. Ein derartiges Hybrid, bei welchem die C-terminalen 5 Aminosäuren von Gαq durch die entsprechende Gαi-Sequenz ersetzt worden ist (Gαqi5) wurde von Conklin et al., Nature 363, 274 - 276 (1993) erstmalig beschrieben.
Diese „Umkopplung" von Rezeptoren hat den Vorteil, daß der Assayendpunkt (Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration im Vergleich zur Hemmung der
Adenylatcyclase) einfacher durch meßtechnische Verfahren zugänglich ist und im High-Throughput-Screening verwendet werden kann. Ein Gerät, das im 96-well bzw. 384-well-Formal intrazelluläre Ca2+-Spiegel messen kann ist der FLIPR (Molecular Devices).
Für viele GPCRs sind noch keine natürlichen Liganden bekannt. Solche GPCRs werden orphan (orphan: engl.: Weisenkind) GPCRs genannt.
Beispiele für orphan GPCRs sind der GPR 3, 6 oder 12 des Menschen. GPR steht für eine andere Bezeichnung von G-protein-coupled-receptor. Die Zahlen beziehen sich auf den spezifischen Typ. Für alle drei Rezeptoren fand man ursprünglich eine starke Ausprägung im Zentralnervensystem. Mittlerweile konnte aber nachgewiesen werden, daß GPR 3, 6 und 12 auch im periphären Gefäßsystem (Endothelzellen und glatte Muskelzellen) exprimiert werden. Es ist deshalb davon auszugehen, daß diese Rezeptoren eine essentielle Rolle spielen in der Physiologie / Pathophysiologie des Endothels und somit des gesamten Gefäßsystems des Menschen. Die Entstehung von Bluthochdruck, Atherosklerose oder anderen Herzkreislauferkrankungen könnte mit diesen Rezeptoren in Zusammenhang gebracht werden. Anhand von Sequenzvergleichen wurde eine hohe Homologie zu GPCRs mit Lipidliganden festgestellt. Aufgrund der sequenziellen Ähnlichkeit ist es naheliegend, daß es sich bei GPR 3, 6 und 12 ebenfalls um Lipidrezeptoren handeln könnte. Die Sequenzinformationen für die Gene der drei Rezeptoren sind für die Öffentlichkeit zugänglich. Die Zugangsnummer der Sequenzen sind für das humane Gen des GPR 3 die Nummer „L 32831 ", für das humane Gen GPR 6 die Nummer „L 36150" und für das humane Gen des GPR 12 die Nummer „U 18548". Die Informationen sind erhältlich beispielsweise über www.ncbi.nlm.nih.gov.
Die Identifizierung von Liganden für GPCRs wird üblicherweise in Laborexperimenten durch Versuch und Irrtum festgestellt. Dieses Vorgehen hat den Nachteil, daß es häufig zeitraubend und vom Zufall gelenkt ist. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines schnellen und einfachen Verfahrens, mittels dessen ein oder mehrere Liganden für einen GPCR identifiziert werden können. Das Einfließen von Ergebnissen aus der Bioinformatik ist hierbei unverzichtbar für den Assayaufbau und die gezielte Suche nach physiologischen Liganden.
Bekannt war aus der Literatur, dass der humane GPR3 konstitutiv aktiv die G-Proteine des αs-Typs stimulieren kann (Eggerickx et al, 1995). Es konnte jedoch nicht geklärt werden, ob es sich im Falle des GPR3 um einen wahrhaft permanent aktiven GPCR handelte, oder ob nicht vielmehr ein Faktor im Zellkulturmedium die konstitutive
Aktivität auslöste.
Durch Sequenzvergleiche ist eine Verwandtschaft der Rezeptoren GPR3,6,12 mit Rezeptoren offenbar, die lipidartige Liganden binden. Lipide sind außerdem wesentliche Bestandteile des Zellkulturmediums. Aus diesem Grund lag die
Spekulation nahe, dass im Medium vorhandene Lipide die Rezeptoraktivierung verursachen könnten.
Bereits maximal aktivierte Rezeptoren lassen sich nicht mehr zusätzlich stimulieren, so daß die Zellen für das Finden der potentiellen Stimulatoren einem Hungerzustand
(Serum- und damit Lipidreduktion im Medium) ausgesetzt wurden. Hungernde
Rezeptoren sollten sich durch exogene Zugabe des Aktivators anschalten lassen. Versucht wurde in der vorliegenden Erfindung, die Rezeptoren nach der Stimulation mit potentiellen Lipid-Aktivatoren an den HTS-fähigen Ca2+-Weg zu schalten. Die funktioneilen Versuche wurden in Gegenwart von 300μM Suramin durchgeführt, um den durch endogene Lipidrezeptorexpression vorhandenen background zu reduzieren und die durch GPR3, 6, 12 vermittelten Signale zu potenzieren.
Ein physiologischer Ligand ist ebenfalls unbekannt für den GPR3 der Ratte. Für diesen Rezeptor liegt in öffentlich zugänglichen Datenbanken nur eine partielle Sequenz vor (Zugangsnummer: L 32829). Damit entsteht der Nachteil beispielsweise für Selektivitätsuntersuchungen bezüglich Arzneimitteln, zu deren Profilierung auf diesen Rezeptor nicht zurückgreifen zu können. Als Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird deshalb auch die Bereitstellung eines vollständigen Gens des GPR3 der Ratte angesehen.
Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden eines G- Protein gekoppelten Rezeptors (GPCRs) wobei
a) eine Zelle zur Verfügung gestellt wird, deren endogene Siganaltransduktionskaskaden die Kopplung der orphan GPCRs GPR3, 6 und 12 als auch rGPR3 an den Ca2+-pathway erlauben. Essentiell ist hier die
Kultivierung der Zellen (HEK293) in Medium mit 1 % FCS und Zugabe von 300μM Suramin zur Reduktion des endogenen, lipid-induzierten Hintergrundsiganls. b) die Zelllinie aus a) mit einem rekombinaten Konstrukt eines GPCR so transfiziert wird, daß besagtes GPCR in dieser Zelllinie überexprimiert wird, c) mindestens eine chemische Verbindung zur Verfügung gestellt wird, die aufgrund von theoretischen Vorüberlegungen gestützt durch die Bioinformatik und Literaturrecherchen (Eggerickx et al, 1995) als möglicher Ligand in Betracht kommt. d) die chemische Verbindung aus c) mit der Zelllinie aus b) in Kontakt gebracht wird, e) eine Fluoreszenzmessung in einem FLIPR-Assay mittels eines calciumsensitiven Fluoreszensfarbstoff nach In-Kontakt-Bringen gemäß d) durchgeführt wird, f) eine Auswertung der Messergebnisse durch Vergleich der Ergebnisse der
Fluoreszenzmessung aus e) mit den Ergebnissen einer Fluoreszenzmessung nach In-Kontakt-Bringen einer Zelle gemäß a) mit einer chemischen Verbindung gemäß c) vorgenommen wird.
Die GPCRs der vorliegenden Erfindung (GPR3, 6 und 12) wechselwirken insbesondere mit der Gαi-Klasse der G-Protein-α-Untereinheiten. Die Aktivierung von Gαi bewirkt die Inhibition der Adenylat Cyclase. Darüber hinaus kann der ßγ-Komplex seinerseits eine intrazelluläre Freisetzung von Ca2+ aus Speicherorganellen bewirken. Im Hinblick auf einen FLIPR-Assay mit Gαi- oder αs-koppelnden GPCRs werden G alpha Proteine verwendet, die GPCRs unterschiedlicher Ligandenspezifität an den
Ca2+ Signalweg koppeln. Das Protein „G α16" ist insbesondere geeignet zur Durchführung eines Verfahrens der vorstehend genannten Erfindung. Weitere Gα Proteine, die zur Durchführung der Verfahrensverwendet werden können, sind in der DE 10033353.2 offenbart.
Durch rekombinante Techniken können unterschiedliche GPCRs in Zelllinien zusammengeführt und getestet werden. Bevorzugt für die Durchführung des Verfahrens wird ein GPCR verwendet, für den noch kein physiologischer Ligand bekannt ist. Als physiologischer Ligand soll ein Molekül verstanden werden, welches von einem Organismus insbesondere einem Säugetier gebildet wird, an diesen GPCR bindet und dadurch eine Aktivierung eines nachgeschalteten G alpha Proteins bewirkt.
Weiterhin bevorzugt eignet sich zur Durchführung ein GPCR aus der Gruppe GPR 3, 6 oder 12. Besonders bevorzugt eignet sich der vollständige Rezeptor des GPR 3 aus Ratte.
Als Zellen eignen sich bevorzugt solche von Säugetieren. Diese Zellen können aus Primärzellen oder Zelllinien bestehen. Beispiele für solche Zellen sind Primärzellen aus Organen von Säugetieren (z. B. Gehirn, Muskel, Fettgewebe, Herz, Lunge, Leber, Niere, Blutgefäße, Hormondrüsen u. a.). Geeignete Zelllinien sind bevorzugt CHO-, HEK 293, COS-, Maus 3T3-, Heia- Zellen oder andere. Weiterhin bevorzugt können Hefezellen verwendet werden.
Die Bereitstellung einer Zelle umfaßt deren Herstellung, Anzucht und Weiterverarbeitung. Die Bereitstellung erfolgt beispielsweise durch Präparation geeigneten Zellmaterials aus Organen oder Geweben oder durch die Vermehrung von geeigneten Zelllinien oder Mikroorganismen. Für die Anzucht können verschiedene geeignete Nährmedien verwendet werden. Die Zellen werden bei der für den Organismus optimalen Temperatur gehalten. Gegebenenfalls werden dem jeweils verwendeten Wachstumsmedium Konservierungsmittel, Antibiotika, pH-Indikatoren, Blutserumbestandteile, Blutserum, Hilfsstoffe oder anderes zugegeben. Verfahren zur Herstellung, Anzucht und Weiterverarbeitung sind in Standartwerken beschrieben. (Beispiel: Basic Cell Culture; Ed. J. M. Davis; IRL Press; 1994).
Die Anwendung rekombinanter Technologien sieht voraus, daß ein in eine Zelle zu exprimierende Konstrukt in Form einer Polynuklestidsequenz vorliegt, die vom Fachmann routinemäßig unter Zuhilfenahme seines Fachwissens hergestellt werden kann. Das Fachwissen des biochemischen/molekularbiologischen Fachmanns hierfür findet dieser beispielsweise in „F. M. Ausubel et al.;Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons; New York". Zur Herstellung einer Vektorkonstruktion wird ein Polynukleotid, welches für die Aminosäuresequenz beispielsweise eines GPCRs codiert, in einen Expressionsvektor eingebaut. Als Expressionsvektor soll ein Vektor verstanden werden, in dem eine Polynukleotidsequenz in einer Wirtzelle transfiziert und exprimiert werden kann. Vektoren können abgeleitet sein von Plasmiden, Viren, oder Cosmiden. Vektoren müssen die Fähigkeit zur autonomen Replikation besitzen. Sie enthalten im allgemeinen einen Replikationsursprung, Schnittstellen für Restriktionsenzyme und Markergene wie beispielsweise Gene für Antibiotikaresistenzen. In einem Expressionsvektor steht die zu vermehrende fremde oder von außen eingefügte Polynukleotidsequenz unter funktioneller Kontrolle eines Promotors. Ein Promotor ist eine funktioneile Polynukleotidsequenz unterschiedlicher Länge mittels derer die Transkription d. h. die Synthese von mRNA einer unmittelbar in 3'-Richung hinter dem Promotor liegender Polynukleotidsequenz gesteuert wird. Es gibt Promotoren, die nur in Prokaroten aktiv sind, wie beispielsweise den lac-, tac-oder trc-Promotor sowie Promotoren, die nur in Eukaryoten aktiv sind, wie beispielsweise den CMV-, T-, oder ADH Promotor. Entsprechend unterscheidet man prokaryotische von eukaryotischen Expressionsvektoren. Die rekombinante Vektorkonstruktion besteht in einer bevorzugten Ausführungsform aus einem in Eukaryoten und/ oder Prokaryoten verwendbaren Expressionsvektor. Ein Expressionsvektor enthält einen Promotor, der funktioneil mit einer Polynukleotidsequenz verbunden werden kann, so daß ein von dieser Polynukleotidsequenz codiertes Protein in einem Organismus beispielsweise einem Bakterium, Pilz oder der Zeller einer eukaryotischen Zellinie synthetisiert wird. Der Promotor kann induzierbar sein beispielsweise mittels Tryptophan oder er kann konstitutiv aktiv sein. Beispiele für Expressionsvektoren sind pUC18, pUC19, pBluesccript, pcDNA3.1 oder andere. Als Transfektion soll das Einschleusen von fremden Polynukleotidsequenzen mittels eines Vektors in eine Wirtzelle und die anschließende Vermehrung dieser Polynukleotidsequenz zu einer beliebigen Anzahl identischer Kopien verstanden werden.
Die transiente Transfektion einer Zellinie mit einem rekombinanten Konstrukt erfolgt mittels Routineverfahren die der Fachmann in vorstehend erwähnten „Current Protocols in Molecular Bioiogy" veröffentlicht von John Wiley & Sons, New York oder in „Sambrook et al., A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0- 87969-309-6" findet. Solche Routineverfahren sind beispielsweise die Elektroporation, die Ca2+-Phosphat-Copräzipation oder die Transfektion mit Hilfe von Liposomen. Die Expression transfizierter Gene in der Wirtszelle kann durch Westem-Blotting von Zelllysaten transfizierter Zellen in Kombination mit einem immunologischen Nachweisverfahren nachgewiesen werden. Auch hierfür erhält der Fachmann in eben genannten Handbüchern die erforderlichen Laborprotokolle. Spezifische Antikörper zum immunologischen Nachweis von GPCR-Rezeptoren, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahrens eignen (z. B. EDG 1 - 8) sind z.T. kommerziell erhältlich. Ein Anbieter unter mehreren ist die Firma Exalpha Biologicals (www.exalpha.com). Die Immunisierung von Kaninchen gegen GPR3, 6 und 12 wurde im Hinblick auf die Gewinnung von spezifischen Antikörpern vorgenommen.
Eine chemische Verbindung wird zur Verfügung gestellt insbesondere durch chemische Synthese oder durch Isolierung chemischer Stoffe aus biologischem Material. Biologisches Material enthält lebende oder nicht lebende Zellen oder Bestandteile von diesen.
Für die chemische Synthese einer Verbindung bzw. die Isolierung eines Stoffes aus biologischen Zellen kann der Fachmann auf Routinemethoden zurückgreifen. Solche Methoden stehen dem Fachmann zur Verfügung in Lehrbüchern wie dem „Organic Synthesis Workbook; 1995; John Wiley & Sons; ISBN 3-527-30187-9", dem „The Organic Chemistry of Drug Synthesis; 1998; John Wiley & Sons; ISBN 0-471-24510-0" oder dem „"Bioactive Compounds from Natural Sources; 2001 ; Taylor & Francis; ISBN 0-7484-0890-8".
Die durch Synthese oder Isolierung gewonnenen Verbindungen können in einem geeigneten Lösungsmittel in Lösung gebracht werden. Geeignete Lösungsmittel können Wasser, Puffersubstanzen (z. B. Tris, Hepes, Mops u. a.) einwertige und/oder zweiwertige Ionen (z. B. K+, Na+, Mg2+, Ca2+ u. a.), Säuren (z. B. HCL, H2SO4,
Ameinsensäure, Essigsäure u. a.), Laugen (z. B. NaOH u. a.), Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol, Glycerin), Detergenzien (z. B. Na-dodecylsulfat u. a.), organische Lösungsmittel (z. B. Formamid, Azeton, Dimethylsulfoxid u. a.) sowie weitere Bestandteile insbesondere zur Lösungsvermittlung oder Stabilisierung enthalten. Eine chemische Verbindung für das erfindungsgemäße Verfahren sollte sich als Ligand für einen GPCR eignen. Diese chemische Verbindung könnte aufgrund von Ähnlichkeit der GPR3, 6 und 12 zu Lipid-GPCRs ebenfalls ein Lipid sein.
Eine solche Verbindung kann insbesondere aus Geweben oder Organen von Wirbeltieren wie z. B. Endothelzellgewebe, Herzgewebe, Gehirngewebe, Blut, Serum oder Plasma gewonnen werden. Bevorzugt eignet sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahrens der natürliche Ligand eines GPCR. Zum In-Kontakt-Bringen der chemischen Verbindung mit der genannten Zellinie kann der Fachmann Routinemethoden aus dem Labor verwenden. Das In-Kontakt-Bringen erfolgt beispielsweise in Erlenmayergefäßen, Röhrchen, Eppendorfgefäßen oder auf Mikrotiterplatten. Zum In-Kontakt-Bringen können temperierte Brutschränke verwendet werden, in denen eine konstante Temperatur von beispielsweise 30 °C oder 37 °C sowie gleichmäßige Cθ2-Bedingungen oder Luftfeuchtigkeitsbedingungen einregelbar sind. Das In-Kontakt-Bringen kann insbesondere auch in dafür vorgesehenen Vorrichtungen eines Laborroboters (FLIPR) vorgenommen werden. Das In-Kontakt- Bringen ist über unterschiedliche Zeitspannen von wenigen Sekunden, über Minuten bis zu mehreren Stunden möglich. Die jeweils zu wählenden Bedingungen hängen vom Rezeptor, der Zellinie und der chemischen Verbindung ab.
Nach dem In-Kontakt-Bringen wird eine Fluoreszenzmessung mittels FLIPR durchgeführt. FLIPR steht für Fluometric Imaging Plate Reader. Das System eignet sich zur Messung von intrazellulären Ca2+- Signalen. Die Bestimmungen werden in Miktotiterplatten mit 96 bzw. 384 Vertiefung durchgeführt. Die Bindung eines Liganden an einen GPCR führt zur intrazellulären Freisetzung von Ca2+. Die Menge des freigesetzten Ca + kann über einen calziumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff (z. B. fluo- 4) bestimmt werden. Durch Vergleich des Ca2+-Signals einer Zelle mit dem Ca2+- Signal einer GPR3, 6 oder 12-überexprimierenden Zelle kann ein Ligand für diesen
GPCR ermittelt werden. Ein solcher Ligand aktiviert die Ca2+- Freisetzung viel stärker in der Zelle, die einen GPCR funktioneil überexprimiert. Die technische Ausrüstung des FLIPR-Systems einschließlich der Reagenzien zur Bestimmung von Ca2+ sind kommerziell erhältlich. Ein Anbieter ist insbesondere die Firma Molecular Devices mit Büros unter anderem in Sunnyvale (CA), Ismaning (AE) oder Ashiya (JP).
Die Erfindung betrifft auch einen Liganden, der über das vorstehend beschriebene Verfahren identifiziert wurde. S1 P und DHS1 P bewirken eine Ca2+-Freisetzung in HEK293 Zellen. Suramin wurde im vorliegenden Assay zur Reduktion des endogenen Lipidbackground eingesetzt.
Ein natürlicher Ligand wird von einem Organismus z. B. einem Wirbeltier gebildet, um einen GPCR im Kontext des Organismus zweckhaft zu aktivieren. Der Zweck besteht insbesondere in der Initiierung biochemischer Funktionen wie z. B. der Anschaltung von Aktionspotentialen, um Sinnesreize zu verarbeiten, dem Anschalten einer Gensynthese für ein strukturelles oder als Botenstoff fungierendes Protein, der Ausschüttung von Botenstoffen, der Regulierung von Stoffwechselfunktionen, der Regulierung von Organfunktionen wie dem Herzschlag der dem Blutdruck oder ähnlichen biologischen Abläufen. Eine chemische Verbindung, die sich als Ligand für einen GPCR eignet, bindet an diesen GPCR. Die Bindung eines Liganden löst eine Aktivierung dieses Rezeptors aus. Die Aktivierung eines GPCR führt im erfindungsgemäßen Verfahren zur Freisetzung intrazelluläen Ca2+ in der Zelle. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel welches einen vorstehend genannten Liganden enthält sowie weiterhin Zusatzstoffe zur Stabilisierung des Liganden und/oder zur Formulierung eines Arzneimittels. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Herstellung eines Arzneimittels. Hierzu wird der vorstehend genannte Ligand mit den Zusatzstoffen gemischt, anschließend wird das Arzneimittel zur Endform prozessiert, abgefüllt, mit einem Beipackzettel versehen und abgepackt.
Die Endform eines Arzneimittels betrifft die Endformulierung beispielsweise als Tablette, Granulat, Spray, Lösung, Salbe, Tinktur oder andere Formulierungsformen. Die Prozessierung zur Endform bezieht sich auf die Herstellung der jeweiligen Formulierung.
Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung eines Liganden wie vorstehend genannt zur Herstellung eines Arzneimittels, welches sich zur Behandlung einer Krankheit eignet, die auf einer Fehlfunktion der GPCR, an den dieser Ligand bindet, beruht. Bevorzugt wird der Ligand zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herzkreislauferkrankungen sowie ZNS-Erkrankungen verwendet.
Der Ligand liegt vorzugsweise mit einem verträglichen Trägen in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vor. Der Träger muß natürlich verträglich sein, in dem Sinne, daß er mit den anderen Bestandteilen der Zusammensetzung kompatibel ist und nicht gesundheitsschädlich für den Patienten ist. Der Träger kann ein Feststoff oder eine Flüssigkeit oder beides sein und wird vorzugsweise mit der Verbindung als Einzeldosis formuliert, beispielsweise als Tablette, die von 0,05 % bis 95 Gew.- % des Wirkstoffes enthalten kann.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach einer der bekannten pharmazeutischen Methoden hergestellt werden, die im wesentlichen darin bestehen, die Bestandteile mit pharmakologisch verträglichen Träger- und/oder Hilfsstoffen zu mischen. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen sind solche, die für orale, rektale, topische, perorale (z. B. sublinguale) und parenterale (z. B. subkutane, intramuskuläre, intradermale oder intravenöse) Verabreichungen geeignet sind.
Die Menge eines wie vorstehend genannten Liganden, die erforderlich ist, um einen gewünschten biologischen Effekt zu erzielen, ist abhängig von einer Reihe von Faktoren wie z. B. der gewählten spezifischen Verbindung, der beabsichtigten Verwendung, der Art der Verabreichung oder dem klinischen Zustand des Patienten. Im folgenden genannte Mengenangaben beziehen sich auf einen Liganden.
Im allgemeinen liegt die Tagesdosis im Bereich von 0,3 mg bis 100 mg (typischerweise von 3 mg bis 50 mg) pro Tag pro Kilogramm Körpergewicht, z. B. 3-10 mg/kg/Tag. Eine intravenöse Dosis kann z. B. im Bereich von 0,3 mg bis 1 ,0 mg/kg liegen, die geeigneterweise als Infusion von 10 ng bis 100 ng pro Kilogramm pro Minute verabreicht werden kann. Geeignete Infusionslösungen für diese Zwecke können z. B. von 0,1 ng bis 10 mg, typischerweise von 1 ng bis 10 mg pro Milliliter, enthalten. Einzeldosen können z. B. von 1 mg bis 10 g des Wirkstoffes enthalten. Somit können Ampullen für Injektionen beispielsweise von 1 mg bis 100 mg, und oral verabreichbare Eizeldosisformulierungen, wie zum Beispiel Tabletten oder Kapseln, können beispielsweise von 1 ,0 bis 1000 mg, typischerweise von 10 bis 600 mg enthalten.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Polynukleotidsequenz gemäß Seq ID Nr. 1 , welche für ein GPR 3 der Ratte codiert. Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Protein für den GPR 3 der Ratte enthaltend wenigstens eine Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 2. Die Erfindung enthält auch einen Expressionvektor, in welchen vorstehend genannte Polynuklestidsequenz des GPR 3 der Ratte gemäß Seq ID Nr. 1 eingebaut wurde. Die Erfindung betrifft außerdem die Herstellung einer Zelle, welche den GPR 3 der Ratte enthaltend wenigstens die Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 2 exprimiert, wobei diese Zelle mittels des vorstehend genannten Expressionsvektor transfiziert wurde.
Bezüglich Expressionsvektoren und Zellen sei auf die in früheren Abschnitten gemachten Ausführungen dieser Erfindung verwiesen. Der Fachmann findet die Methoden zur Herstellung und Charakterisierung der Polynuklestidsequenz nach Seq ID Nr. 1 , des Proteins enthaltend wenigstens die Aminosäuresequenz nach Seq ID Nr. 2, des Expressionsvektors und der Zellen in Handbüchern wie den „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; ISBN 0-471 -50338-x" oder in „Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN 0-87969-309-6"
Beispiele:
Beispiel 1 :
Klonierung der humanen GPR 3, 6 und 12
Die humanen Gene von GPR 3, 6 und 12 enthalten keine Introns. Sie können deshalb mittels PCR (polymerase chain reaction) aus humaner genomischer DNA amplifiziert werden. Über die Hind Ill/Xbal Stellen von pcDNA 3.1 (Invitrogen) wurden die codierenden Sequenzen kloniert.
Beispiel 2:
Klonierung des GPR 3 der Ratte
Die Sequenz des vollständigen Gens von GPR 3 der Ratte wurde mittels PCR- Amplifizierung aus cDNA des Rattengehirns unter Verwendung des δ'-Primers 5'-ATG CTT GCC ATG GCC TGG TTC TCA GCC GCC TCA-3' ('Seq ID3) und des 3' Primers (mouse) 5'-TCT AGA CTA GAC ATC ACT AGG GGA CCG GGA-3'(Seq ID4) vermehrt. Der δ'-Primer stellt zusätzlich eine Hind Ill-Stelle zur Verfügung und erzeugt eine Kozac-Sequenz vor dem Start-Codon. Im 3'Primer ist eine Xbal-Stelle mit berücksichtigt. Das 990 bp lange Amplifizierungsprodukt wurde in die Hind Ill/Xbal- .Stellen von pcDNA 3.1 (Invitrogen) kloniert und anschließend sequenziert.
Beispiel 3: Expression der GPR-Gene
HEK293-Zellen (Zelllinie aus Human Embryonic Kidneys) wurden kultiviert in DMEM, welches ergänzt war durch 10 % fötales Rinderserum 10 000 lU/ml Penicillin, 10 000 μg/ml Streptomycin und 25 mM Hepes ph 7,0. CHO-K1 -Zellen (Zelllinie aus Chinese Hamster Ovary) wurde kultiviert in Iscove-Medium, welches ergänzt war durch 10 % fötales Rinderserum, 10 000 lU/ml Penicillin, 10 000 μg/ml Streptomycin, Gentamycin und 2 mM L-Glutamin. Iscove-Medium ist kommerziell erhältlich z. B. von Biochrom.
Zur Durchführung transienter Transfektionen wurden 5 x 10^ HEK293-Zellen oder 2 x 105 CHO-K1 -Zellen in 6 well Platten 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit 1 bis 2 μg eines Vectors, in welchen ein GPR 3, 6 oder 12 unter Kontrolle des eukoryotischen CMV-Promotors kloniert worden war oder eines Kontrollplasmids ohne entsprechendes Klonierungsinsert transfiziert. Die Transfektion wurde im Falle der HEK293-Zellen mit Hilfe von FuGene 6 transfection reagent (kommerziell erhältlich, beispielsweise von Röche Diagnostics) und im Falle von CHO- Zellen mit Hilfe von Lipofectamine reagent (kommerziell erhältlich, beispielsweise von GIBCO-BRL) nach Vorschrift der Hersteller durchgeführt.
Beispiel 4:
Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR)-Assay
HEK293-Zellen wurden 24 Stunden nach transienter Transfektion auf 96 well Mikrotiterplatten überführt. Die Zelldichte betrug 80 000 Zellen pro well. Die
Mikrotiterplatten waren mit poly-D-Lysin beschichtet. Die Zellen wurden für 18 bis 24 Stunden in Medium mit 1 % FCS (fötales Kälberserum) gehalten. Nach dem Trypsinieren wurden die Zellen in DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), i welches zusätzlich 25 mM HEPES (N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N'-2- ethansulfonsäure) ph 7,0, 1 % FCS,10 000 lU/ml Penicillin, 10 000 μg/ml Streptomycin und 4 μM dye fluo4 (fluorescent calcium indicator von Molecular Dynamics) enthielt suspendiert und anschließend für 1 Std. bei 37 °C unter 5 % C02 inkubiert- Die Zellen wurden danach 3 mal mit PBS (Phosphat gepufferte Saline) gewaschen, welches 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA und 0,4 mg/ml FAF-BSA (Rinderserumalbumin frei von
Fettsäuren) enthielt. Nach dem letzten Waschschritt betrug das Volumen 100 μl pro well. Die zu untersuchenden Verbindungen lagen zumeist als 2 mM Stammlösungen in DMSO (Dimethylsulfoxid) vor. Diese verdünnte man im Verhältnis 1 : 500 mit der PBS- Lösung , welche 1 mM MgCl2 1 mM EDTA und 0,4 mg/ml FAF-BSA enthielt. Lipide lagen vor dem Assay als dreifach konzentrierte Lösungen vor. Suramin (Sigma) wurde in PBS enthaltend 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA und 0,4 mg/ml FAF BSA als dreifach konzentrierte Lösung angesetzt.
Der FLIPR wurde so programmiert, daß 50 μl aus der dreifach konzentrierten Stammlösung des Suramin zu den Zellen gegeben wurde. Man erhielt damit eine Endkonzentration von 300 μM bezüglich Suramin. Die Fluoreszenz wurde die ersten 3 Minuten in 3 Sekunden Intervallen und die letzten 2 Minuten in 10 Sekunden Intervallen gemessen. Analog wurden Ca2+-Signale von Liganden bestimmt. Die Fluoreszenzmeßwerte des Zeitintervalls von 18 Sekunden bis 37 Sekunden wurden verwendet, um Agonistaktivität zu bestimmen. Das Gerät selbst nimmt einen internen Vergleich der Nullwerte vor.
Beispiel 5:
Identifizierung von Liganden für GPCR 3, 6 und 12
GPCR 3, 6 und 12 sind orphan Rezeptoren der GPCR-Proteinfamile Mit Hilfe von Genbank-Recherchen (EMBL) konnten die Lipidrezeptoren EDG-, (endothelial differentation gene) und Cannabinoid-GPCRs als die strukturell am nächsten Verwandten von GPR 3, 6 und 12 identifiziert werden. Innerhalb einer Spezies beträgt die Homologie bezogen auf die Nukleotidsequenz 65 - 68 %. Die humanen Sequenzen zeigen im Vergleich zu den Ratten-Sequenzen jeweils 87 % (GPR 3), 83 % (GPR 6) bzw. 88 % (GPR 12) Homologie.
RT-PCR-Analysen (RT-PCR = Reverse transcripase polymerase chain reaction) zeigen die übereinstimmende Expression von hGPR 3, 6 und 12 in cerebralen Geweben und Herz-Kreislauf-relevanten Organen (z. B. Herz, Niere). Darauf aufbauend konnte die Expression in isolierten Endothel-, und glatten Muskelzellen belegt werden. Mit Hilfe eines Ca2+-FLIPR-Assays in HEK293-Zellen konnten die Lipide Sphingosin 1-Phosphat (S1 P) und Dihydrosphingosin 1-Phosphat (DHS1 P), als physiologische Liganden von hGPR 3, 6 und 12 identifiziert werden. Die ECsrj-Werte lagen bei kleiner als 100 nM für S1 P und DHS1 P. Der Einsatz einer Lipidlibrary aus 200 bioaktiven Lipide lieferte keinen weiteren Liganden und zeigte darüber hinaus die Unwirksamkeit von Cannabinoiden. Der neu klonierte rGPR 3 (L 32829, 33bp partielle Sequenz) läßt sich ebenso wie sein humanes Homolog durch S1 P/DHS1 P in einem Ca2+-FLIPR- Assay anschalten.
Die Kopplung von GPR 3, 6 und 12 an den Ca2+-Signaltransduktionsweg funktioniert in HEK293-Zellen ohne die Kotransfektion von G- Q oder anderen Chimären, promiscous Gα-Untereinheiten. Die S1 P/DHS1 P-induzierte Ca2+-Freisetzung in HEK293-Zellen ist Pertussistoxin-sensitiv, d. h. die Signaltransduktionskaskade läuft über G-Proteine des Typs Gαi. Außerdem ist die Ca2+-Freisetzung partiell sensitiv gegenüber Inhibitoren der Sphingosin-Kinase.
Da sie mit S1 P/DHS1 P den identischen Liganden wie Mitglieder der EDG-Familie haben, und auch in ihrem Expressionsmuster größtenteils mit den EDGs übereinstimmen, ist anzunehmen, daß sie vergleichbare physiologische Funktionen ausüben (Schutz vor Apoptose, Angiogenese, Proliferationsförderung und -hemmung, Plättchenaktivierung, vasoaktive Effekte, Chemotaxis, Zelldifferenzierung etc.).

Claims

Ansprüche:
Anspruch 1 :
Verfahren zur Identifizierung eines Liganden eines G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCRs) wobei
a] eine Zelle zur Verfügung gestellt wird, die ein G alpha Protein enthält, welches mindestens einen GPCR an den Ga/Ca2+ Signalweg koppelt, b] die Zelllinie aus a] mit einem rekombinanten Konstrukt eines GPCR so transformiert wird, daß gesagtes GPCR in oder auf dieser Zelllinie exprimiert wird, c] mindestens eine chemische Verbindung, zur Verfügung gestellt wird, d] die chemische Verbindung aus c] mit der Zelllinie aus b] in Kontakt gebracht wird, e] eine Fluoreszenzmessung in einem FLIPR mittels eines Calcium sensitiven Fluoreszenzfarbstoff nach In-Kontakt-Bringen gemäß d] durchgeführt wird, f] eine Auswertung der Messergebnisse durch Vergleich der Ergebnisse der Fluoreszenzmessung aus e] mit den Ergebnissen einer Fluoreszenzmessung nach In-Kontakt-Bringen einer Zelle gemäß a] mit einer chemischen Verbindung gemäß c] vorgenommen wird.
Anspruch 2:
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Zelle eine HEK 293, CHO-, COS-, Maus 3T3-, HeLa-Zelle ist, aus dem Organ eines Säugetiers präpariert und in Kultur genommen wurde oder eine Hefezelle ist. Anspruch 3:
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das G alpha Protein GPCRs unterschiedlicher Spezifität bezüglich der Liganden an den Gq/Ca2+-Signalweg koppelt.
Anspruch 4:
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei für den GPCR noch kein Ligangd identifiziert werden konnte.
Anspruch 5:
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei der GPCR aus der Gruppe der GPR3, 6 oder 12 eines Säugetiers oder des Menschen gewählt wird.
Anspruch 6:
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der GPR3 der Ratte verwendet wird.
Anspruch 7:
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 worin die chemische Verbindung ein Peptid, Polysaccharid, eine Fettsäureverbindung, ein Polynukleotid oder ein organisches Molekül ist, wobei das Molekulargewicht der chemischen Verbindung zwischen 0,1 und 25 kDa liegt.
Anspruch 8:
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Molekulargewicht zwischen 0,1 bis 10 kDa liegt. Anspruch 9:
Ligand eines GPCR, welcher durch ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 identifizierbar ist.
Anspruch 10:
Ligand gemäß Anspruch 9, wobei das Molekulargewicht des Liganden zwischen 0,1 bis 25 kDa liegt.
Anspruch 11 :
Ligand gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei der Ligand ein Protein, Polysaccharid, eine Fettsäureverbindung oder ein Polynukleotid ist.
Anspruch 12:
Ligand für GPR3, 6 oder 12 nach Anspruch 9, 10 oder 11 , der aus LPA, S1 P oder Suramin besteht.
Anspruch 13:
Arzneimittel enthaltend einen Liganden nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 12, sowie Zusatzstoffe zur Stabilisierung des Liganden und/oder zur Formulierung eines Arzneimittels.
Anspruch 14:
Herstellung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 13, wobei der Ligand zuerst mit den Zusatzstoffen gemischt wird, das Arzneimittel zur Endform prozessiert wird, anschließend abgefüllt, mit dem Beipackzettel versehen und abgepackt wird. Anspruch 15:
Verwendung eines Liganden nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die auf der Fehlfunktion eines GPCR, an die besagter Ligand bindet, beruht.
Anspruch 16:
Verwendung eines Liganden nach Anspruch 16 zur Behandlung von Herzkreislauferkrankungen.
Anspruch 17:
Eine Polynukleotidsequenz kodierend für den GPR3 der Ratte gemäß SEQ ID. NO. 1.
Anspruch 18:
Protein GPR3 der Ratte enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NO. 2.
Anspruch 19:
Ein Expressionsvektor enthaltend eine Polynukleotidsequenz nach Anspruch 17.
Anspruch 20:
Eine Zelle enthaltend einen Expressionsvektor nach Anspruch 19. Anspruch 21 :
Herstellung einer Zelle nach Anspruch 20, welche ein Protein nach Anspruch 18 exprimiert, durch Transformation der Zelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 19.
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