WO2002088179A1 - Proteine participant a la restauration de fertilite de la sterilite male cytoplasmique et gene codant ladite proteine - Google Patents

Proteine participant a la restauration de fertilite de la sterilite male cytoplasmique et gene codant ladite proteine Download PDF

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WO2002088179A1
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dna
amino acid
gene
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PCT/JP2002/004092
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Jun Imamura
Hideya Fujimoto
Ritsuko Imai
Nobuya Koizuka
Takako Sakai
Takahiko Hayakawa
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Mitsubishi Chemical Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a gene involved in the recovery from cytoplasmic male sterility to fertility. More specifically, the present invention relates to a gene involved in the recovery of a cytoplasmic male sterility trait (hereinafter sometimes abbreviated to cms) used for the development of a hybrid of a first generation (hereinafter abbreviated as F1), And a transformant containing the same.
  • cms cytoplasmic male sterility trait
  • cms / R consisting of a cytoplasmic male sterility (cm s) line and a line that restores the male sterility (hereinafter abbreviated as R f).
  • R f cytoplasmic male sterility
  • f There is a seed collection system, for example, which has been developed using vegetation such as rice, sorghum, and corn, and oil crops such as sunflower, all of which have been developed using hybridization or cell fusion techniques. Things.
  • the F1 seeding system using self-incompatibility is widely used, but for oilseed rape, there is no stable self-incompatibility, so the F1 seeding system using the cms line and the Rf line Is required.
  • cytoplasmic male sterility derived from Kosena radish in rapeseed. Both cms genes are encoded in the genome of the mitochondrial cytoplasmic organelle, and their nucleotide sequences are known. Is difficult to isolate genes from the nucleus because the molecular biology research has not progressed and the markers required for gene isolation are almost unknown. Has only been introduced into rapeseed from a radish-restoring line by means of crossing or cell fusion.
  • one or more restoration genes are present for each cms line of the plant.
  • the simultaneous presence of the Rf1 gene and the Rf2 gene is necessary for the restoration of fertility, and in addition, the Rf1 gene is known to be the cms causative protein of radish. It is known that the accumulation of ORF125 protein in mitochondria (M. Iwabuchi et al. Plant Mol. Biol. 39: 183-188, 1999) is greatly reduced. (The Journal of Breeding Science 47 (Annex 1) P 186, 1997, The Journal of Breeding Science 48 (Annex 1) P 197, 1998).
  • the genetic analysis experiment revealed that the Rf1 gene of radish, introduced by crossing or cell fusion, was the ORF 125 or ORF 138 protein (M. Grelon et al. Gen. Genet. 243: 540-547) should be able to reduce the amount of accumulation, and the decrease in the amount of accumulation of these ORF 125 or ORF 138 proteins and the phenomenon of restoration of fertility should be completely consistent. It is known ( ⁇ Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100: 949-955, 2000). In other words, in order to restore sex in the rapeseed male sterile line, it is necessary to reduce the amount of accumulated ORF 125 or ORF 138 protein, and therefore, the Rf1 gene is an important gene.
  • the nucleotide sequence of the Rf gene has been identified and isolated only for the Rf2 gene, one of the recovery genes for T-cytoplasm, which is one of the maize cms.
  • the nucleotide sequence of the R ⁇ gene in other plants is not known at all. Disclosure of the invention
  • GSL rapeseed recovery line
  • an object of the present invention is to solve the problem of isolating the Rf gene, particularly the Rf1 gene derived from radish, and identifying its structure. Furthermore, an object of the present invention is to provide a means for establishing a rapeseed recovery line using the isolated Rf gene.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, succeeded in cloning the Rf1 gene from radish and rape, and have solved the present problem.
  • PPR Pentatricopeptide Repeat
  • the PPR motif group is divided into three or more blocks, and each of the blocks is at least two.
  • the carboxy-terminal (.terminal) side block having the above PPR motif and having four PPR motifs is involved in restoring the sterility of male cytoplasmic male sterile individuals. Protein is provided.
  • a protein having 14 to 16 PPR motifs The PPR motif group is divided into three blocks, and each block has 5, 7, and 4 PPR motifs in order from the amino terminal (N-terminal) side. From the amino terminal (N-terminal) rule The 4th amino acid present in the 2nd PPR motif The 4th amino acid present in the 2nd PPR motif from the amino terminal (N-terminal) side is any one of asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid or histidine ; And
  • the fertility of a cytoplasmic male sterile individual which is brought into contact with a transcript of a cytoplasmic male sterility gene and then causes the transcript to undergo a gel shift, is made fertile.
  • a protein involved in restoring the sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 to fertility;
  • SEQ ID NO: 27 A protein involved in restoring sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence described in 1) to fertility;
  • a protein involved in restoring the sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 to fertility;
  • Protein involved in restoring sterility of a cytoplasmic male sterile individual having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 to fertility:
  • any of the following proteins is provided.
  • any one of the following proteins is provided.
  • the cytoplasmic male sterile individual comprises a cytosolic male sterility gene of kosena radish and / or ogla radish or a homolog thereof.
  • a DNA encoding any of the above-described proteins of the present invention.
  • any one of the following DNAs is provided.
  • nucleotides are missing in the nucleotide sequence at positions 3754 to 8553 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence at positions 812 to 3002 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15
  • any one of the following DNAs is provided.
  • the cytoplasmic male sterile individual is Has a cytoplasmic male sterility gene of Japanese radish or a homolog thereof.
  • a vector containing the DNA of the present invention is provided.
  • a transformant having the DNA of the present invention or the vector of the present invention.
  • the transformant is preferably a transformed plant.
  • a method for restoring the sterility of a cytoplasmic male sterile body to fertility which comprises using the DNA of the present invention.
  • a part or all of the DNA of the present invention is introduced together with an inducible promoter into a cell having the cytoplasmic male non-gene and having the DNA of the present invention.
  • the present invention comprises an oligonucleotide primer of 15 to 5 O mer arbitrarily set from the above DNA of the present invention, or all or a part of the above DNA of the present invention.
  • the amount of the base sequence amplified by the primer or the amount of the base sequence detected by the probe in the target biological sample should be 1 / genome. Confirmation of the presence of genes or more provides a method for detecting genes involved in the restoration of cytoplasmic male sterility.
  • the first to third nucleotides of the nucleotide sequence of nucleotides 3754 to 5901 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or the nucleotide sequence of nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 881 1 A promoter DNA having the 11th base sequence is provided.
  • FIG. 1 shows the R f marker genetic map.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the structure of lambda clone CHI sufficiently retaining the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 3 shows the results of detection of the introduced DNA in the transformant using the PCR method. Lane 1: control vector, Lane 2: transformed rape, Lane 3: cytoplasmic male sterile rape,
  • FIG. 4 shows the results of Western blotting analysis of the decrease in the amount of accumulated CMS protein ORF125 in the transformants.
  • Lane 2 Restorable rapeseed 15 ⁇ g
  • Lanes 4-7 Cytoplasmic male sterile rapeseed 1_
  • Lane 8 Transformed rape 15 ⁇ g
  • Figure 5 shows the results of removing anthers from the flowering bodies of transformed rape and observing them under a microscope.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequences of PSTV125-5 '# LA6 and PSTV125-5' # LA12. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the protein of the present invention relates to any one of the following (i) to (V).
  • PPR Pentatricopeptide Repeat
  • PPR motif group is divided into three or more blocks, and each block has at least two or more PPR motifs.
  • cytoplasm having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 26 to 29.
  • the PPR motif refers to a “Peni: atricopeptide Repeat” motif, which is involved in restoring the sterility of a cytoplasmic male sterile individual.
  • This PPR motif is the structure of a new protein motif discovered by the progress of the Arabidopsis Genome Project.
  • the basic motif is a tandem repeat of 35 degenerate amino acid sequences on the primary structure of the protein.
  • the PPR motif is a consensus amino acid
  • the sequence has a sequence represented by the amino terminal (N-terminal)-"VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV"-the carboxy terminal (C-terminal).
  • This motif was proposed by Small and Peeters (Literature 'Trends Biochem Sci 2000, 25 46-47), and the gene that can take this motif was found in the Arabidopsis genome. This publication was published. At that time about 200 GenBank
  • PPR Pentatricopeptide Repeat
  • the protein involved in restoring the sterility of the above-mentioned cytoplasmic male sterile individual to fertility is a PPR motif having 14 to 16 PPR motifs, and more preferably a PPR motif.
  • the group is divided into three blocks, and each block has 5, 7, and 4 PPR motifs in order from the amino-terminal (N-terminal) side.
  • PR cluster # 1 a PPR cluster consisting of 175 residues in which the 5th PPR motif continues from the 1st PPR motif from the N-terminal
  • PPR cluster # 2 a PPR cluster consisting of 245 residues in which the 12th PPR motif continues from the 6th PPR motif from the N-terminal,
  • PPR cluster # 3 140 residues from the 13th PPR motif from the N-terminal to the 16th PPR motif
  • the fourth amino acid present in the second PPR motif is other than serine, threonine or -cysteine, and more preferably from the amino terminal (N-terminal) side.
  • the fourth amino acid present in the second PPR motif is any one of asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid and histidine, and particularly preferably the second PPR motif from the amino terminal (N-terminal) side
  • the fourth amino acid present in Asparagine is asparagine.
  • the fertility restoring gene is present in the nuclear genome, and the cytoplasmic male sterility gene is known to be present in the mitochondria. Therefore, the fertility of the above cytoplasmic male sterile individual is restored to fertility. It is preferable that the protein involved in this process further has a signal peptide sequence for mitochondrial translocation at the amino terminal or a sequence consisting of "LysAspGluLeu" at the carboxy terminal.
  • the N-terminal signal peptide for migrating to the mitochondria is 0.1 g. Emanuelsson et al. (J. Mol. Biol. 300, 1005- 1016 (2000)), a forecasting program “TargetP” http: //. Cbs. Dtu. Dk / services / TargetP /) or a forecasting program rpsortj ( http: // psort. nibb. ac. jp /).
  • Specific examples of the signal peptide include the signal peptide of the Arabidopsis AtOXAl gene (W. Sakamoto et al: Plant Cell Physiol , 41: 1157-1163)
  • amino acid sequences of 1 to 79 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are particularly preferred are amino acids of 1 to 34 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Sequences.
  • the protein of the present invention involved in restoring the sterility of the cytoplasmic male sterile individual to fertility can be obtained by binding to the transcription product of the cytoplasmic male sterility gene.
  • the translational inhibition of S. cerevisiae is caused, and the sterility of the cytoplasmic male sterile individual is restored to fertility.
  • the transcripts of the cytoplasmic male sterility gene include the genes of ORF 125, a protein that causes Kosena cytoplasmic male sterility, and ORF 138, a protein that causes ogla cytoplasmic male sterility, respectively.
  • a transcript (mRNA) is preferable, and a 5, -UTR (Bonhorame et al; Mol Gen Genet, 235: 340-348 (1992)) region of the gene is preferable.
  • a protein of the present invention is added to orfl25 or orf138 mRNA artificially transcribed in vitro, followed by electrophoresis.
  • a method a so-called gel shift method, may be mentioned.
  • the gel shift method may be performed under the condition usually used. Expression of a fusion gene of ORF125 or ORF138 with a detectable reporter gene such as -galactosidase luciferase expressed in Escherichia coli or the like is further expressed by adding the present protein. There is also a method of confirming whether or not is suppressed.
  • the fertility restoring gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was incorporated into an Escherichia coli expression vector, and the 5'-UTR region of orf 125 and the 25 amino acid coding portion were fused to the LacZ gene.
  • Escherichia coli was prepared by incorporating the selected Better into Escherichia coli and induced to express, the expression of LacZ gene was suppressed and the presence of X-Gal only when the expression vector incorporating the fertility restoring gene was used together. The blue E. coli colony turns white below.
  • the above-described confirmation using the gene encoding the protein of the present invention can also inhibit the translation of the cytoplasmic male sterile gene, thereby reducing the sterility of the cytoplasmic male sterile individual. It can be confirmed that it has a function to restore fertility.
  • the most preferred protein involved in restoring sterility of the cytoplasmic male sterile individual of the present invention to fertility is the amino acid described in SEQ ID NOS: 26 to 29 which is a consensus sequence. 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 90% or more, further preferably 92% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, based on the sequence.
  • a protein having an amino acid sequence having homology to The consensus sequence includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 or 28, and particularly preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.
  • amino acid sequence at the 80th to 68th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 the amino acid sequence at the 80th to 68th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; or A protein having the amino acid sequence of amino acids 82 to 690 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or
  • those having a mitochondrial transition sequence in the sequence include:
  • the protein of the present invention is a protein that can participate in restoring sterility of a cytoplasmic male sterile individual to fertility. More specifically, when a transgenic plant (R f line) into which DNA encoding the protein of the present invention has been introduced is crossed with an individual of a cytoplasmic male sterile gun (cm s line), The recovered F1 seed can be obtained.
  • R f line transgenic plant
  • cm s line cytoplasmic male sterile gun
  • the recovered F1 seed can be obtained.
  • Preferred examples of the cms strain individuals include individuals into which a cytosolic male sterility gene of Kosena radish and Z or radish has been introduced.
  • the protein of the present invention can be screened and isolated using the gel shift method as described above, or isolated or synthesized using the DNA of the present invention described below. The method for obtaining the protein of the present invention will be described later.
  • the DNA of the present invention relates to any one of the following DNAs (i) to (iv). (i) DNA encoding the above-mentioned protein of the present invention.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18 has a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, added and Z or substituted, And a cytoplasmic male; a DNA involved in restoring sterility of a sex-sterile individual to fertility; or (3) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1.6, or SEQ ID NO: 18
  • nucleotides are missing in the nucleotide sequence at positions 3754 to 8553 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence at positions 812 to 3002 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15
  • the DNA of the present invention may be referred to as the present invention.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a genomic DNA base sequence consisting of 8553 bases, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to the base sequence obtained from SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 is a genomic DNA base sequence consisting of 330 bases
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 is a code sequence obtained from SEQ ID NO: 15. It is.
  • SEQ ID NO: 17 is an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
  • a base sequence in which one or more bases are deleted, added and / or substituted or Z is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, and more preferably 1 to 20 bases. It refers to a base sequence in which an arbitrary number of bases has been deleted, added and / or substituted by up to 10, more preferably 1 to 5.
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added and Z or substituted means, for example, 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 5 amino acids, and more preferably 1 amino acid. It refers to an amino acid sequence in which ⁇ 10, more preferably 1-5, amino acids are deleted, added or substituted.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to a method using a DNA as a probe, such as a colony hybridization method, a plaque hybridization method, or a Southern blot hybridization method.
  • DNAs that hybridize under stringent conditions include DNAs having a certain degree of homology with the base sequence of the DNA used as the probe.
  • the homology of a certain degree or more for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, most preferably Is 97% or more.
  • the DNA having a certain degree of homology includes both the polynucleotide having the above-mentioned homology and its complementary polynucleotide.
  • the DNA of the present invention is a DNA that can be involved in restoring the sterility of a cytoplasmic male sterile individual to fertility. More specifically, F1 seeds whose fertility has been restored by crossing a transgenic plant (Rf line) into which the DNA of the present invention has been introduced with individuals of a cytoplasmic male sterile line (cms line). Can be obtained.
  • the individuals of the above cms strain are preferably individuals into which the cytosolic male non-human gene of kosena radish and / or ogla radish has been introduced.
  • the method for obtaining DNA of the present invention is not particularly limited. PPR obtained based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 disclosed in the present specification and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the DNA of the present invention can be obtained by utilizing general breeding techniques and general genetic engineering techniques known to those skilled in the art based on information on the amino acid sequence obtained by combining the motif mitochondrial translocation sequences. It can be isolated or synthesized.
  • plants suitable for the expression of the gene of the present invention are plants of the genus Raphanus, including varieties and closely related species of dyne, or these plants are obtained by crossing or cell fusion techniques.
  • Other plants into which genomic DNA containing a gene for restoring cytoplasmic male sterility has been transferred from the plant more specifically Raphanus genus such as Kosena radish, Odara radish, Sono radish or varieties or closely related species of these radish Plants containing a gene for restoring cytoplasmic male sterility in these plants or by crossing or cell fusion techniques
  • Nom DNA can be obtained from a plant of the genus Brassica into which it has been transferred.For example, a DNA marker located near the Rf gene was isolated, and the relationship between this DNA marker and the genetic distance of the R ⁇ gene was demonstrated.
  • the gene of the present invention can be isolated and obtained by preparing a map of the genome and using the map of the genome as a starting point by the positional cloning method of the
  • the technique begins by finding the appropriate DNA marker on the genomic DNA and mapping the genome by measuring the genetic distance between the Rf gene and the DNA marker.
  • the DNA marker is required to distinguish between the genome from the father and the genome from the mother, and is generally several 100 bp in length.
  • the DNA marker must be located on the same chromosome as the gene, and the genetic pattern is almost ⁇ -like due to the short distance from the gene. The more the marker is, the more desirable.
  • the RFLP method has been used for DNA marker isolation for some time.
  • RAPD and AFLP (Amplified fragment length polymorphism) methods (Nucleic Acids Research, 1995), which are simple methods using PCR, have been used. , Vol.23, No.21, 4407-4414).
  • the AFLP method is effective as a means for obtaining strong genetic linkage.
  • an F2 population obtained by self-pollinating the F1 generation in which a recessive homozygous individual having no Rf1 gene and a dominant homozygote homozygous having the Rf1 gene are bred.
  • a BC1 population obtained by crossing the F1 generation with a recessive homozygous individual having no parent gene of interest can be used.
  • the recessive homologous individuals include varieties of radish of cytoplasmic male sterile line, Raphanus genus plants including closely related species, and more specifically, kosena daikon radish radish of pulp male male sterile line, or derived from kosena radish
  • the above dominant homologous individuals include varieties of radish, which are R f strains, Raphanus plants including closely related species, and more specifically, Kosenadai, a cytoplasmic male sterility recovery line. Brassica, into which genomic DNA containing the gene for restoring cytoplasmic male sterility of Rapanus plants, including varieties and closely related species of radish, sorrel radish, soybean radish, and other radishes, has been transferred by crossing and cell fusion techniques Plant, more specifically, R f rape.
  • the F2 population obtained by self-pollinating the F1 generation obtained by crossing these parents, and the BC1 population obtained by crossing the F1 generation with a recessive homozygote are usually 100 or more individuals More preferably, it is desirable to analyze 100 or more individuals. As the number of individuals increases, the accuracy of the genomic map increases, and the physical distance from the DNA marker to the target gene decreases. Similarly, in the case of the Rf gene, it is possible to obtain a DNA marker having a shorter physical distance.
  • An aggregate of clones having genomic DNA fragments can be obtained by creating a genomic library.
  • a genomic library usually, several types of vectors are used depending on the length of genomic DNA that can be cloned, for example, a lambda phage vector that can clone fragments up to about 20 kb, and a relatively long fragment ( ⁇ 40 kb).
  • Libraries using cosmid vectors that can jung, and BAC (Bacterial artificial chromosome) vectors that can clone longer fragments of 100 kb or more can be mentioned.
  • the average length of cloned fragments multiplied by the number of library populations is about 4 to 5 times the total length (genome size) of the genome provided to the library. This is very important. Since genome size of radish is believed to be about 500 Mb p, if the average length 20 13 lambda phage base Kuta one, the number of population becomes 1. 25 X 1 0 5 from 1.0 10 5, old ink stick de If the library has an average length of 40 kb, the number of populations will be from 5.0 ⁇ 10 4 to 6.25 ⁇ 10 4 . Since genome size of rapeseed is thought to about 1000Mb, if the average length 20 kb lambda phage vector, the number of population becomes 2. 5 X 10 5 cells from 2. 0 X 10 5 cells, an average of cosmid library If the length is 40 kb, the number of population: 1. a 25 X 10 5 inferiority complex from 1.0's 10 5.
  • the genomic DNA to be provided to the library may be obtained by extracting genomic DNA from an organism containing the target gene by a conventional method.
  • varieties of radish that are Rf strains plants of the genus Raphanus including closely related species, and more specifically, kosena radish, ogla radish, soy beet radish of the cytoplasmic male sterility restoration strain, or Restoration of cytoplasmic male sterility of Raphanus genus plants including radish varieties and related species of the genus Drosophila genus DNA containing a gene containing the gene by crossing and cell fusion techniques, more specifically Can use R f rape.
  • Get Nome DNA can be prepared according to a conventional method such as the CTAB method (Murray, MG and Thompson, WF (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321).
  • clones carrying the DNA markers flanking the Rf gene are isolated. Isolate from the genomic library using a plaque hybridization method in the case of a lambda phage library, and a co-mouth knee hybridization method in the case of a cosmid library and a BAC library, using a conventional method. . Next, a contig is prepared by isolating a clone adjacent to the clone using the terminal region of the isolated clone as an index. After preparation, the base sequence of the container is determined by a standard method.
  • Gene discovery program represented by "Gen SC an” can be estimated genes in considerable accuracy.
  • a homology search program represented by “BLAST” can estimate the similarity of other genes and proteins.
  • the target gene is estimated and isolated using such analysis software.
  • the genomic DNA sequence of the container can be isolated and identified using the same analysis software.
  • the promoter, the structural gene containing introns, and the terminator on the genomic DNA base sequence are clearly shown.
  • the structural gene containing the intron the gene that can be translated into a protein without the intron and the amino acid sequence for that gene are specified.
  • the isolated gene of the present invention specifically includes the DNA represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 This made it possible to easily isolate cDNA from other plant sources and the like based on the DNA sequence by a general genetic engineering technique.
  • a suitable plant source in which the gene of the present invention is expressed specifically, a plant of the genus Raphanus including varieties or closely related species of radish, or a plant derived from these plants by means of crossing or cell fusion.
  • a cDNA library was prepared from plants or Brassica plants into which genomic DNA containing the gene for restoring cytoplasmic male sterility of these plants was transferred by means of crossing or cell fusion, according to a conventional method.
  • examples of the origin of the cDNA include various cells and tissues expressing the gene of the present invention, and cultured cells derived therefrom. Separation of total RNA, separation and purification of mRNA, acquisition of cDNA, and cloning thereof can be carried out in accordance with a conventional method.
  • the method for screening the gene of the present invention from the cDNA library is not particularly limited, and can be performed according to a usual method.
  • DNA or the like chemically synthesized based on the information on the nucleotide sequence of the gene of the present invention can be generally used, but the gene of the present invention or a fragment thereof which has already been obtained is also preferable.
  • sense primers and antisense primers set based on the base sequence information of the gene of the present invention are used for screening. It can also be used as a probe for Leeung.
  • the nucleotide sequence of the sense primer and the antisense primer used as the probe is a partial nucleotide sequence corresponding to the DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19, Those having at least 15 to 50 continuous bases, preferably 20 to 30 continuous bases, are mentioned. Alternatively, the positive clone itself having the above sequence can be used as a probe.
  • the gene of the present invention can be obtained by combining techniques commonly used for gene isolation, such as the DNA / RNA amplification method by PCR and the RACE method represented by the 5′-RACE method. .
  • Primers to be used in the adoption of the PCR method can be appropriately set based on the sequence information of the gene of the present invention revealed by the present invention, and can be synthesized according to a conventional method. Isolation and purification of the amplified DNA / RNA fragment can be performed according to a conventional method as described above, for example, by gel electrophoresis.
  • nucleotide sequence of the gene or various DNA fragments of the present invention obtained above can be determined according to a conventional method.
  • the gene of the present invention thus obtained, for example, by utilizing a part or all of the nucleotide sequence of the gene, the presence and expression of the gene of the present invention in an individual or various tissues can be characterized. Can be detected.
  • examples of the gene of the present invention include a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 19, but are not particularly limited thereto.
  • a homologue of a gene has sequence homology to the gene of the present invention (or a gene product thereof), and has the above-mentioned structural characteristics and similarity to its biological function as described above, and thus is similar to one gene family. It refers to a set of related genes that are recognized, including alleles of the genes.
  • the gene of the present invention is a specific gene represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • a gene having a base sequence it is also possible to have a base sequence selected by combining arbitrary codons for each amino acid residue shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence selected by combining any codon for each amino acid residue shown in SEQ ID NO: 17 is not limited to the gene having the specific base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16. It is also possible to have a base sequence selected by combining any codon for each amino acid residue shown in SEQ ID NO: 19, not limited to a gene having a specific base sequence shown in SEQ ID NO: 18 It is possible. Codon selection can be performed according to a conventional method, for example, considering the codon usage of the host to be used.
  • the gene of the present invention is a stringent condition with DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, or a part thereof. Also includes DNA hybridizing below. Such a DNA has at least a certain degree of homology with DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, or a part thereof. A.
  • the above-mentioned DNA having a certain degree of homology is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, or a part thereof or SEQ ID NO: 3. At least 70% identity, preferably at least 90% identity, more preferably at least 95% with the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19, or a part thereof. %, And most preferably at least 97% of the polynucleotide and its complementary polynucleotide.
  • Examples include a DNA having a base sequence that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18, or a DNA having a partial nucleotide sequence thereof. be able to. Further, among the DNAs of the present invention,
  • a method of bringing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 or a part thereof into contact with a mutagenic agent, a method of irradiating ultraviolet rays, a method of genetic engineering It can be performed using a technique or the like.
  • Site-directed mutagenesis which is one of the genetic engineering techniques, is useful because it is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position, and should be performed according to the method described in Molecular Cloning, 2nd Edition, etc. be able to.
  • the DNA of the present invention can be incorporated into an appropriate vector and used as a recombinant vector.
  • the type of vector may be an expression vector or a non-expression vector, and can be selected according to the purpose.
  • a vector capable of autonomous replication in Escherichia coli K12 strain is preferable, and an Escherichia coli expression vector, which can be used as any of a phage vector and a plasmid vector, may be used as a cloning vector.
  • an Escherichia coli expression vector which can be used as any of a phage vector and a plasmid vector, may be used as a cloning vector.
  • ZAP Express (Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)
  • the expression vector can be selected in consideration of the combination with the host, and is preferably one capable of autonomous replication in a host cell or integration into a chromosome, and containing a promoter at a position where the gene of the present invention can be transcribed. Is used.
  • an expression vector for expressing DNA is capable of autonomous replication in the bacterium and, at the same time, is a recombinant vector composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the above-mentioned D8 and a transcription termination sequence. It is preferable to be a doctor.
  • the gene controlling the promoter may be included.
  • bacterial expression vectors examples include pBTrP2, pBTacl, and pBTac2 (all commercially available from Ringermanheim), pKK233-2 (Pharmacia),
  • pSE280 Invitrogen
  • pGEMEX-1 Promega
  • pQE-8 QIAGEN
  • pQE-30 QIAGEN
  • pKYPIO JP-A-58-110600
  • pKYP200 Agrc. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]
  • PLSAl Agrc. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]
  • pGELl Proc. Natl. Acad. Sci.
  • promoters for bacteria include trp promoter (P trp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter, etc., promoters derived from Escherichia coli, phage, etc., SP01 promoter, SP02 promoter. And penP promoter.
  • Examples of expression vectors for yeast include YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • Examples of promoters for yeast include PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gall promoter, gallO promoter, heat shock protein promoter, FQ;; (promoter, CUP1: promoters such as mouth motor, etc.) be able to.
  • pcD N AI commercially available from Funakoshi
  • P cDM8 pAGE107 [JP-3- 22979; Cytotechnology, 3, 133 , (1990) ]
  • PAS3 - 3 Patent 2- 227075
  • pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)]
  • pc DNAI / AmP Invitrogen
  • pREP4 Invitrogen
  • pAGE103 [J. Blochem., 101, 1307 (1987)]
  • pAGE210 and the like.
  • animal cell promoters include the cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, the SV40 early promoter, the retrovirus / less promoter, the metamouth protein promoter, and the heat shock promoter. And the Ra promoter.
  • promoters for plant cells include the force reflower mosaic virus 35S promoter [Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392]. The details of the plant transformation will be described later.
  • the transformant having DNA of the present invention can be prepared by introducing the above-described recombinant vector (preferably, an expression vector) into a host.
  • bacterial host cells include the genus Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Panyu, Bacillus, Microbacterium ⁇ Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium thu, Alicyclobacillus, Anabaena bird, Anacystis, Arthrobacter 3 ⁇ 4 Azobacter, Chromatium Microorganisms belonging to the genus, Erwinia eu, Methylobacterium, Phormiaium, Rhodobactez eu, Rnodopseudomonas, Rhoaospiri Rlumfe, Scenedesmun3 ⁇ 4, Streptomycesfe Synnecoccus ⁇ Zymomonasfe etc. can be mentioned.
  • Examples of a method for introducing a recombinant vector into a bacterial host include a method using calcium ions and a protoplast method.
  • yeast hosts include Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporus pullans, and Trichosporus pullulans. (Schwanniomyces alluvius) and the like.
  • any method for introducing a recombinant vector into a yeast host any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • electoporation method examples include a target blast method and a lithium acetate method.
  • Animal cell hosts include Namalpa cells, C0S1 cells, C0S7 cells, CH0 cells and the like.
  • any method capable of introducing DNA into animal cells can be used, and for example, an elect-mouth poration method, a calcium phosphate method, a ribofusion method, or the like can be used.
  • the method for obtaining the protein of the present invention is not particularly limited. Based on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 disclosed in this specification Based on the amino acid sequence information obtained by combining the obtained PPR motif ⁇ mitochondrial translocation sequences, those skilled in the art can utilize a general genetic engineering technique to isolate, express, or synthesize the protein of the present invention. be able to.
  • DNA encoding the protein of the present invention can be isolated or synthesized, and expressed by introducing it into cells.
  • the protein of the present invention can be obtained, for example, by culturing a transformant having the gene of the present invention, producing and accumulating the protein of the present invention in a culture, and collecting the protein from the culture. it can.
  • the method for culturing the transformant having the gene of the present invention can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the culture medium for culturing these microorganisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be utilized by the microorganism.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the transformant.
  • Culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is usually 15 to 40 ° C. Usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted by using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like. If necessary, an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • a medium usually used according to the plant species such as an MS medium or an R2P medium, is used. Cultivation is usually carried out for 1 to 21 days under conditions of pH 6 to 8 and 15 to 35 ° C. If necessary, antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • the cells when the protein of the present invention is expressed in a lysed state in cells, the cells are recovered by centrifugation after cell culture, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a crusher, french press, and Mentongaulin homogenizer. The cells are disrupted using a Dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation / purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion-exchange chromatography using resin such as getylaminoethyl (DEAE) Sepharose, DIAI0N HPA-75 (Mitsubishi Chemical)
  • a resin such as getylaminoethyl (DEAE) Sepharose, DIAI0N HPA-75 (Mitsubishi Chemical)
  • One method cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia), hydrophobic chromatography using a resin such as butyl sepharose, hu-noresepharose, and molecular sieve
  • a purified sample can be obtained by using a method such as gel filtration, affinity chromatography, chromatofocusing, or electrophoresis such as isoelectric focusing alone or
  • the cells When the protein is expressed in an insoluble form in the cells, the cells are similarly recovered, crushed, and recovered from the precipitate fraction obtained by centrifugation in a usual manner. Thereafter, the insoluble form of the protein is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the solubilized solution to a solution containing no protein denaturing agent or a diluting concentration of the protein denaturing agent such that the protein is not denatured, the protein is formed into a normal three-dimensional structure. A purified sample can be obtained by the same isolation and purification method.
  • the protein of the present invention or its derivative such as a modified sugar is secreted extracellularly
  • the protein or its derivative such as a sugar chain adduct can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to.
  • the protein of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl) method, the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), and the like.
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl) method, the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), and the like.
  • Kuwawa Trading US Advanced Chem Tech
  • Perkin Elmer Giaban US Perkin Elmer
  • Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech
  • "Roca US Protein Technology Instrument
  • Clabo II made by Synthecell-Vega, USA
  • Nippon Perceptive Limited made by PerSeptive, USA
  • Shimadzu Corporation and other peptide synthesizers.
  • the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 15 are the original nucleotides of the plant genome. This is a base sequence extracted from the sequence. This nucleotide sequence contains a promoter and a terminator necessary for gene expression in an operable form.
  • the gene to be introduced can be cloned into a general closing vector, for example, cosmid pWE15 (manufactured by STRATAGENE).
  • cosmid pWE15 manufactured by STRATAGENE
  • an agrobacterium it can be cloned into a general plant transformation vector, for example, PBI121 (manufactured by Clontec).
  • DNA of a base sequence from which some introns were extracted from this sequence (genome sequence)
  • DNA of a base sequence from which almost all introns were extracted SEQ ID NO: 2 or 238 to 2064 DNA represented by the fourth base, DN'A represented by the fourth base, SEQ ID NO: 16 or its 2-38 to 206, DNA represented by the fourth base, SEQ ID NO: 18 or its 24 4 to 207 DNA represented by a base, or a portion corresponding to SEQ ID NO: 3 or its 80 to 687 residue, SEQ ID NO: 7 or a portion corresponding to its 80 to 687 residue, or SEQ ID NO: 19
  • DNA encoding the protein represented by the portion corresponding to the 82 to 690 residues thereof may be introduced into a plant cell.
  • nucleotide sequence of nucleotides 3754 to 509 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of nucleotides 1 to 81 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 is The DNA has a promoter capable of transcribing mRNA in anthers, and is preferably used for restoring male sterility.
  • the promoter and a part of the terminator may be replaced with a promoter or a terminator that functions in a known plant cell.
  • a common expression vector to be used is pBI121 (manufactured by clonetec).
  • This vector has a promoter of 35S promoter of reflower mosaic virus, a terminator and a Ti plasmid of A. tumefacience.
  • the terminator of the nopaline synthase present in Japan is used.
  • the promoter required for expression is not limited to the 35S promoter of the force reflower mosaic virus, but may be the rbcS promoter widely present in plants, and more preferably, it is expressed during the pollen growing period.
  • a variety of promoters such as the TA29 promoter are used, and more preferably the original promoter positioned upstream of the gene is used.
  • the terminator is not limited to the terminator of the nopaline synthase described above, but a 35S terminator of cauliflower mosaic virus or the like can be used. More preferably, the original terminator coordinated downstream of the gene is used. Can be
  • DNA represented by the above-mentioned SEQ ID NO: 2 or its 23rd to 24th base DNA represented by SEQ ID NO: 16 or its 23rd to 24th base, sequence No. 18 or its 24 4 to 20 7 DNA represented by the third base, or SEQ ID NO: 3 or a portion corresponding to its 80 to 68 7 residues, SEQ ID NO: 17 or its 80 to Using DNA encoding the protein corresponding to the portion corresponding to residue 687 or SEQ ID NO: 19 or the portion corresponding to residues 82 to 690 thereof, a cytoplasmic male 'sterile individual was obtained. When used for the purpose of restoring sterility to fertility, in addition to this sequence, a mitochondrial translocation sequence is required.
  • Examples of the migrating sequence for mitochondria include DNA represented by the nucleotides 1 to 23 of SEQ ID NO: 2 or DNA encoding the amino acid sequence of nucleotides 1 to 79 of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: DNA represented by the 1st to 23th bases in 16 or DNA encoding the 1 to 79th amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, or the 1st to 24th bases in the above SEQ ID NO: 18
  • the DNA shown or the DNA encoding the 1st to 81st amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, the above-mentioned known transition sequence, and the like can be used.
  • the present inventors set out in the following examples that In order to introduce the Rf gene DNA containing the introns from the original promoter to the terminator into the plant in its original form, a plant transformation vector was prepared.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is excised from a clone that forms part of the container by restriction enzymes, subcloned into an appropriate cloning vector, and then subcloned into plant transformation vectors pKM424 and pBIGRZ2.
  • the obtained fragment was introduced to obtain a vector capable of introducing the fragment into a plant.
  • This vector was introduced into agrobacterium for plant transformation. By infecting a plant with an agrobacterium carrying this vector, the DNA fragment is integrated into the plant genome.
  • Plants to which the gene of the present invention is applied include, for example, oil crops such as rapeseed, sunflower, soybean, palm palm, etc., for example, cereals such as rice, corn, wheat, etc., and flowers such as tobacco and petunia, for example, Examples include various vegetables such as tomato, procoli, cabbage, Chinese cabbage, and carrot.
  • plant tomatoes of the genus Brassica such as rape, cabbage, Chinese cabbage, broccoli and the like are preferred, and rape, cabbage, Chinese cabbage, and broccoli are particularly preferred, and rape is most preferred.
  • the transformed plant source includes seeds, sprouts, seedlings, calli, cultured cells, plants, and the like.
  • sprouts or protoplasts in the case of rape, sprouts or protoplasts; in the case of soybeans, sprouts; Callus or cultured cells; germination for castor; callus or cultured cells for palm palm; sprouts, callus, cultured cells or protoplasts for rice; sprouts, seedlings, callus, culture for maize Sprouts, callus or cultured cells for wheat; sprouts, callus, cultured cells or protoplasts for cabbage or broccoli; wheat, sprouts, calli, cultured cells for wheat Or the target plant, such as protoplasts, A suitable site may be appropriately selected according to the conditions.
  • Transformation into a plant can be performed according to a conventional method. Infecting plant cells with agrobacterium after transfection into agrobacterium, a method for introducing a vector into a plant, the electo-mouth boration method, the DEAE dextran method, the calcium phosphate method, the polyethylene glycol method, Examples include a method of directly introducing a vector into cells using a particle gun method or the like. For example, a preferred gene transfer method in the case of rape is the method described below.
  • Agrobacterium grown on YEB medium is collected by centrifugation, and resuspended in MS medium containing sucrose. After adding the rapeseed hypocotyl to this suspension and shaking it, returning the extracted hypocotyl to the original pre-culture medium and co-cultivating for 3 days, and then planting zeatin, benzylaminopurine, etc. Transfer to a selective medium containing hormones, carbecillin, and kanamycin for selection.
  • the resulting green regenerated sprouts were then transformed into an elongation medium optionally containing plant hormones such as benzylaminopurine, followed by a rooting medium optionally containing plant hormones such as naphthaleneacetic acid and benzylaminopurine.
  • a regenerated individual can be obtained by cultivating the hybrid with an individual of the cms line, whereby an F1 hybrid whose fertility has been restored can be obtained.
  • the expression of the regenerated individuals can be confirmed by crossing with the rape of the cms line and examining the fertility of their progeny.However, when the rapeseed having cms cytoplasm is used as a material for transformation, By transferring a transformant (regenerated individual) having a root formed as described above to a soil containing ordinary fertilizer and flowering, pollen fertility can be adjusted, and the method is simple and convenient in terms of time and operation, and is preferable.
  • rapeseed cells or tissues having cms cytoplasm as cells to be used preferably hypocotyls, cotyledons, leaves, pollen, cultured cells, calli, prototypes
  • pollen fertility is restored by transferring the plant (regenerated individual) obtained by the above method to soil containing ordinary fertilizer and flowering.
  • the obtained plant individual can be obtained.
  • the DNA of the present invention is introduced into the cms cells by the above-described gene transfer method, and cells in which the DNA has been integrated into the nucleus are selected for resistance to antibiotics such as Kanamysis or herbicides. After selection using the marker as an indicator, the cells can be cultured in an elongation medium and a rooting medium as described above to obtain a plant having the DNA integrated into the nucleus. In this plant, the male sterility trait is restored and becomes fertile.
  • a 15 to 50-mer oligonucleotide primer arbitrarily set from the DNA according to any one of claims 1 to 4, or the method of claim 1 to 4.
  • the amount of the nucleotide sequence amplified by the primer in the target biological sample, or detected by the probe It can be performed by confirming that the amount of the base sequence is one or more in one genome.
  • Specific confirmation methods include, for example, the PCR method and the Southern hybridization method, of which the PCR method is preferable. These methods are described in, for example, "Molecuar Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Gold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.” It can be performed according to the method.
  • the PCR method requires that the same copy number of DNA be type III as a simple method, and that the same level of amplification be observed.
  • an arbitrary primer that amplifies a known gene known to have one gene in one genome as an internal standard using quantitative PCR, the same amount of this known gene ⁇ ⁇ ⁇ It can be confirmed by comparing the amount of the width with the amount of the base sequence amplified by the primer.
  • fertility in which the DNA is known to have one gene in one genome Compare the DNA of the recovery line plant individual and the DNA of the target plant sample in equal amounts to confirm that the amount of DNA detected is the same or more.
  • the primer used in the PCR method includes, for example, a 15 to 50-mer oligonucleotide having the same or complementarity with the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the probe used in the Southern hybridization method may be a DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, the entire or at least the same double-stranded DNA as the DNA sequence described in SEQ ID NO: 2, or at least a part thereof of 15 mer or more, or 1
  • the entire region of the single-stranded DNA or its complementary chain or at least a part of at least 15 mer or more can be mentioned.
  • DNAs having a certain degree of homology with the nucleotide sequence of DNA used as a probe can also be mentioned.
  • the homology of a certain level or more is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably. Is 97% or more.
  • DNA having a certain degree of homology includes both the polynucleotide having the homology described above and its complementary polynucleotide.
  • the method for detecting the gene described above not only confirms whether or not the DNA is integrated in the transformant, but also can be used in individuals who have attempted to introduce the Rf gene by mating. It can be used as a means to confirm the presence or absence.
  • this method it is possible to confirm the presence of the Rf gene before flowering when the Rf gene is introduced into a cytoplasmic male sterile individual.
  • the fertility of the next-generation individual obtained by crossing flowering pollen with a cytoplasmic male sterile individual must be confirmed.
  • the presence or absence of the Rf gene can be confirmed before this method.
  • Such use is generally called marker DNA use or marker DNA breeding.
  • the Rf gene it can be used for IJ as a marker DNA (Rf marker) of the Rf gene.
  • the Rf marker is the mother plant of a transgenic individual into which the DNA has been introduced or a plant into which the Rf gene has been introduced by crossing which is a non-recombinant. It is important for breeding practical varieties.
  • the Rf gene restores plant sex by reducing the amount of ORF125 or ORF138 protein that is the cms causative protein accumulated in mitochondria. Therefore, by confirming a decrease in the accumulated amount of the ORF 125 or ORF 138 protein in the mitochondria of the transformed individual, it can be confirmed that the transgene is the Rf gene.
  • a method for detecting an ORF 125 or ORF 138 protein by Western blotting according to the conditions described in this specification is used as an internal standard.
  • An antibody against a protein derived from the mitochondrial genome to be used for example, Anti-F-Factory F described in N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100: 949-955, 2000.
  • ATPA ATPase
  • the antibody against the ORF 125 or ORF 138 protein in the above-mentioned method can be obtained by using the following general method. That is, an antiserum can be obtained by immunizing an animal with these proteins as antigens, and an immunoglobulin G antibody can be purified by using an affinity column to which proteinA is bound.
  • the antigen to be used can be obtained by purifying a protein from an expressed cytoplasmic male plant or cultured cells by a conventional method. Alternatively, it can be obtained by connecting the ORF 125 or ORF 138 gene to an expression vector, expressing it in an E. coli fermentor, and purifying in the same manner. Furthermore, peptides obtained by chemically synthesizing the full length or a part of ORF 125 or ORF 138 can also be used as the antigen. Antibodies to ATPA can be obtained in a similar manner.
  • the expression of the DNA of the present invention can be specifically regulated.
  • temporary control can create a new hybrid seed production system that does not require the male sterility maintenance line (maintenance line) required for hybrid seed production.
  • the rapeseed of the cms line is usually sterile, it is necessary to separately provide a maintenance line in which the cms and R ⁇ are not involved in order to grow and maintain the cms line.
  • Production required three plants, the R f line, the cms line, and the maintenance line.
  • the present invention isolated and identified the R i gene. By using the method of inducing the promoter by the expression and controlling the expression of the restored gene, a cms strain capable of growing and maintaining without a maintenance strain can be constructed.
  • a part or the entire length of the gene of the present invention is integrated in a sense- or sense-directed manner into a vector having a promoter induced from the outside, for example, a drug-sensitive promoter, and using the vector, A cell having the cytoplasm and having the DNA of the present invention is transformed.
  • Cells having the cms cytoplasm and having the DNA of the present invention include not only cells having the cms cytoplasm transformed with the DNA of the present invention, but also (1113-gun and 1 It may be obtained by crossing f-systems.
  • the above-mentioned inducible promoter is known, for example, from Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-46697, and the methods for preparing and transforming the vector include the same methods as described above.
  • a transformant having the cms cytoplasm obtained by the above method and having the DNA of the present invention, and further incorporating a part or all of the DNA of the present invention together with an inducible promoter is usually used. Since the promoter is not induced, the plant shows fertility due to the originally existing R f gene, and the line can be maintained by self-pollination.However, during hybrid production, the promoter is introduced into this plant. When a chemical having the ability to induce Rf is acted on and the promoter is induced, the expression of the Rf gene is inhibited. As a result, the plant becomes male-sterile and can be used as a cms line during hybrid seed production. Therefore, by using this method, self-pollination can be used to propagate and maintain even the cms line, which previously required three lines for hybrid seed production. Maintenance systems are no longer needed, and production costs can be significantly reduced.
  • Example 1 Isolation of DNA marker linked to cytoplasmic male sterility restoration gene
  • the DNA marker was isolated by GI BCO BRL's AFLP Analysis System, based on the Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) method (Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, No. 21 4407-4414). AFLP was performed according to the AFLP S tarter Primer Kit. As a material to measure the genetic distance from the marker, one individual ((KC 2 / KA1) -1) of the cms strain Kosena radish (Raphanus sativus cv. Kosena) and the Rf strain Sonobeni radish (Raphanus sativus cv.
  • AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
  • a collection of clones containing genomic DNA fragments is called a genomic library.
  • F 2 As a DNA donor, F 2 than the same Enbeni radish as the parent of the recovery system was used when the were prepared population, according to the conventional method, CTAB method (Murray, MG and Thompson, WF (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321 )
  • CTAB method Murray, MG and Thompson, WF (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321
  • DASHII vector manufactured by STRATAGENE
  • a lambda phage library having an average length of 20 kb and a population of 1.5 ⁇ 10 5 was prepared.
  • a pWEB :: TNC vector EPICENTRE TECHNOLOGIES
  • cosmid library having an average length of 40 kb and a population of 5.5 ⁇ 10 4 was prepared.
  • a lambda clone was isolated from the lambda phage library prepared above using the plaque hybridization method using DNA markers located on both sides of the R f gene as an index.
  • a cosmid clone was isolated from the cosmid library using the colony hybridization method, and a contig for carparing between DNA markers at both ends as shown in FIG. 1 was completed.
  • the nucleotide sequences of cosmid clones NIT7 / 2 and T03-2, which form part of the contig, were determined by a conventional method.
  • 10XH restriction enzyme buffer 500 mM Ti "is-HCl (pH 7.5), lOOmM MgCl 2 , lOmM Dithiothre tol, lOOOmM NaCl
  • 10XH restriction enzyme buffer 500 mM Ti "is-HCl (pH 7.5), lOOmM MgCl 2 , lOmM Dithiothre tol, lOOOmM NaCl
  • 11 lOunit / 1 restriction enzyme Swal (Takara Shuzo) was added and the mixture was heated for 1 hour at 25 ° C.
  • 10 ⁇ loading buffer 1% SDS, 50% Glycetrol, 0.05% Bromophenol Blue
  • the electrophoresis gel transferred to a 0.5 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 E histidinol ⁇ -time professional bromide Z1XTAE solution, was stained for 30 minutes. Placed on a transilluminator that emit long-wave UV 3 6 5 nm to gel, a fragment of 8546bp of interest were excised using a sterile scalpel. The gel was further chopped into pieces of about one thigh angle, transferred to a pre-weighed 2 ml microtube, and weighed.
  • 1/3 volume of 10 M ammonium acetate (pH 7.0) was added to the gel volume, stirred, and centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes. The supernatant was transferred to a new 2 ml microtube and 2 volumes of ethanol were added above. After stirring the tube, it was centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C for 20 minutes. The supernatant was removed, 1 ml of 70% ethanol was gently added, and the mixture was centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C for 5 minutes. The supernatant was removed, and the precipitate was dried using a centrifugal vacuum drier for 5 minutes. To the precipitate was added 201 buffer of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), ImM EDTA), completely dissolved, and the DNA fragment was recovered. .
  • TE buffer 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), ImM EDTA
  • PCR buffer (lOOmM Tris-HCl (pH8.3) , 500mM KC1), 25mM MgCl 2 of 6 [mu 1, 8 1 of 2.5mM dNTP mix, 1 J ul of 5 units / [mu] l of rTaqDNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd. ), Mix and heat at 72 ° C for 30 minutes. DATP was added to the end.
  • Tris-HCl pH8.0
  • lmM EDTA lmM EDTA
  • Ultrafiltration filter unit The above reaction solution was transferred to Microcon-50 (manufactured by Millipore) together with 100 1 sterilized water, and centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C for 20 minutes. The water in the trap was discarded, 100 1 of sterile water was added again, and the mixture was centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C for 20 minutes. The filter unit was removed and mounted in a new microtube upside down.
  • the DNA was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C for 5 minutes to collect the DNA of the filter unit.
  • the collected DNA was put on ice together with the tube and cooled.
  • 30 ⁇ l of E. coli DH10B (Gibco BRL) for electoral poration was placed in a tube and mixed gently.
  • Cuvette for electroporation electroporation (electrode spacing lmm) pre-cooled on ice (USA
  • E. coli mixed with DNA was transferred to Scientific Plastics). Using an Electro Cell Manipulator 600 (manufactured by BTX), electroporation was performed under the conditions of 1.3 ⁇ 4kv, 129 ⁇ , 50 ⁇ F, and immediately thereafter, 5001 S0C medium (Gibco BRL) warmed to 37 ° C Was added to the cuvette. The E. coli was transferred to a 10 ml culture tube and cultured with shaking at 37 ° C for 1 hour.
  • LB agar medium (l fl / .Bacto) supplemented with 100 / ig / nd Ampiciline (Wako Pure Chemical Industries), 20 ⁇ g / ml X-Gal (Takara Shuzo), and ImM IPTG (Takara Shuzo).
  • -Tryptone 100 / ig / nd Ampiciline (Wako Pure Chemical Industries), 20 ⁇ g / ml X-Gal (Takara Shuzo), and ImM IPTG (Takara Shuzo).
  • the cultured E. coli was spread on 0.5% Bacto-Yeast Extract, l% NaCl, 1.5% Bacto-Agar) and cultured at 37 ° C for 18 hours or more.
  • White colonies appearing on the agar medium were cultured at 37 ° C. for 18 hours or more in 2 ml of LB medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of Ampicillin.
  • Plasmid DNA was extracted from the cultured E. coli by a standard method. The fact that the desired fragment was cloned in the plasmid DNA was confirmed by digestion with the restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) to obtain cds6BT / pGEM-T easy.
  • the vector After digesting cds6BT / pGEM-Teasy with the restriction enzyme EcoRI, the vector is separated from the vector by gel electrophoresis using agarose for fragment recovery, and the recovered DNA fragment is converted to a plant transformation vector pKM424 (pKM424 with CaMV35S promoter: GUS gene : The vector to which the fragment of the NOS terminator was added was cloned into the EcoRI site of pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290 vector) to obtain the plant transformation vector cds6BT / pKM424.
  • Tris-HCl pH 8.0
  • ImM EDTA ImM EDTA
  • Ultrafiltration filter unit The above reaction solution was transferred to Microcon-50 (manufactured by Millipore) together with 100 ⁇ l of sterilized water, and centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The water in the trap was discarded, 100 ⁇ 1 sterile water was added again, and the mixture was centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C for 20 minutes. The filter unit was removed, inverted and mounted in a new microtube.
  • E. coli mixed with DNA was transferred to Scientific Plastics). Using an Electro Cell Manipulator 600 (manufactured by BTX), electroporation was performed under the conditions of 1.25 kv, 129 ⁇ , and 50 ⁇ F. Immediately thereafter, 5001 S0C medium (Gibco BRL, Inc.) was heated to 37 ° C. Was added to the cuvette. The E. coli was transferred to a 10 ml culture tube and cultured with shaking at 37 ° C for 1 hour. LB agar medium supplemented with Spectinomycin (manufactured by Sigma) at SO ⁇ g / ml
  • the cultured E. coli was spread on (1% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar) and cultured at 37 ° C for 18 hours or more.
  • Plasmid DNA was extracted from the cultured E. coli by a standard method. It was confirmed by cutting with restriction enzyme Hindlll (Takara Shuzo) that the Hpal site was cloned from the BamHI site in plasmid DNA.
  • Escherichia coli DH10B holding cds6BT / pKM424 was cultured at 37 ° C. for 18 hours in 250 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of Spectinomycin. Purified by the alkaline SDS method using Qiagen Midi kit (Qiagen).
  • Example 4-2 Preparation of plant transformation vector (2)
  • a lambda clone CHI (see FIG. 2, cloning fragment length of about 17 kb) which sufficiently retains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is cut with the restriction enzyme Notl (manufactured by Takara Shuzo) located in the multiple cloning site, and then agarose for fragment recovery is obtained.
  • the DNA fragment was separated from the vector by gel electrophoresis using, and the recovered DNA fragment was ligated to the Notl site of the plant transformation vector PBIGRZ2 (Bioscience and Industry 55 (1997) 37-39).
  • a vector for plant transformation was designated as CHI / P BIGRZ2. Details are shown below.
  • IM Tris-HCl pH 8.0
  • Bacterial Alkaline Phosphatase manufactured by Takara Shuzo
  • Phenol / chloroform saturated with 200 ⁇ l of ⁇ buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), ImM EDTA) was added, and the mixture was stirred vigorously. After centrifugation at 15000 rpm for 5 minutes, transfer the supernatant to a new tube. The same operation was repeated once to remove the protein. After adding 20 1 of 3M sodium acetate (pH 5.6) and 500 ⁇ l of ethanol and stirring, the mixture was cooled at ⁇ 80 ° C. for 5 minutes, and centrifuged at 15,000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes.
  • Tris-HCl pH 8.0
  • ImM EDTA ImM EDTA
  • Ultrafiltration filter unit The above reaction solution was transferred to Microcon-50 (manufactured by Millipore) together with sterilized water ( ⁇ ), and centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C for 20 minutes. The water in the trap was discarded, 100 ⁇ l of sterile water was added again, and the mixture was centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C for 20 minutes. The filter unit was removed, inverted and mounted in a new microtube.
  • the DNA was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C for 5 minutes to collect the DNA of the filter unit.
  • the collected DNA was put on water together with the tube and cooled.
  • 30 ⁇ l of E. coli DH10B for electroporation (manufactured by Gibco BRL) was placed in a tube and mixed gently.
  • Cuvette (USA) for erect mouth poration cooled in advance on ice
  • E. coli mixed with DNA was transferred to Scientific Plastics). Using an Electro Cell Manipulator 600 (manufactured by BTX), electroporation was performed under the conditions of 1.25 kv, 129 ⁇ , and 50 ⁇ F. Immediately thereafter, 5001 S0C medium (Gibco BRL, Inc.) was heated to 37 ° C. Was added to the cuvette. The E. coli was transferred to a 10 ml culture tube and cultured with shaking at 37 ° C for 1 hour. LB agar medium (l Bacto-Tryptone, 0.5 ° /.
  • Bacto-Yeast Extract l% NaCl, 1.5% Bacto-Agar supplemented with 25 / ⁇ 1 Kanamycin (Wako Pure Chemical Industries)
  • the cultured E. coli was expanded and cultured at 37 ° C for 18 hours or more.
  • Plasmid DNA was extracted from the cultured E. coli by a standard method. The presence of the desired fragment in the plasmid DNA was confirmed by digestion with the restriction enzyme Hindlll (Takara Shuzo), and designated as CHI / pBIGRZ2.
  • Escherichia coli DH10B holding CHI / pBIGRZ2 was cultured at 37 ° C. for 18 hours in 250 ml of LB medium supplemented with 25 ⁇ g / ml of Kanamycin. Purification was performed by the alkaline SDS method using a Qiagen Midi kit (Qiagen).
  • Example 5 Introduction of a vector for plant transformation into Agrobacterium
  • Example 2 A combi-tent cell of Agrobacterium was prepared, and in Examples 4-11 and 4-2. Each of the obtained cds6BT / pKM424 vector and CHI / pBIGRZ2 vector was introduced into the prepared plant transformation agrobacterium EHA101. The details are shown below.
  • a competent cell for electroporation of Agrobacterium EHA101 was prepared by the following method. Agrobacterium EHA101 is streaked on LB agar medium supplemented with 50 g / ml Kanamycin (Wako Pure Chemical Industries) and 25 mg / ml Chloramphenicol (Wako Pure Chemical Industries), and incubated at 28 ° C for 24 hours.
  • Agrobacterium containing the cds6BT / pKM424 vector introduced was 50 g / ml Kanamycin (Wako Pure Chemical Industries), 25 ⁇ g / ml Chloramphenicol (Wako Pure Chemical Industries), 50 ⁇ g / ml Spe tinomycin (Sigma) LB agar supplemented with 2.5 ⁇ g / ml Tetracycline (Sigma) Spread cultivated agrobacterium on medium (1 ° / o Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, l ° / oNaCl, 1.5% Bacto-Agar), 24 hours or more at 28 ° C And cultured.
  • Agrobacterium transfected with CHI / pBIGRZ2 vector is 50 ⁇ g / ml Kanamycin (Wako Pure Chemical), 25 ⁇ / ⁇ 1 Chloramphenicol (Wako Pure Chemical), 30 ⁇ g / ml
  • the cultured Agrobacterium was spread on LB agar medium supplemented with Hygromycin (Sigma), and cultured at 28 ° C for 24 hours or more.
  • Plasmid DNA is extracted from the cultured Agrobacterium by a standard method, and the introduction of the cds6BT / pKM424 vector or the CHI / pBIGRZ2 vector into the Agrobacterium is confirmed by digestion with the restriction enzyme Hindlll (Takara Shuzo). did.
  • the confirmed clones were mixed with an equal volume of sterilized 80% glycerol in a culture solution cultured for 24 hours, mixed and stored at _80 ° C, and used for rape transformation.
  • Example 6 Preparation of rapeseed transformant
  • Transformation into rape was performed as follows.
  • the seeds of CMS rape (SW18), which has the ors 125, the gene responsible for cms, from radish, are sterilized with a 10% hypochlorous acid solution, and the hormone-free MS medium (T. Murashige and F. Skoog Physiol. Plant. 15: 485, 1962).
  • 7 to 14 days after germination cut off only the hypocotyl part from the seedlings on day 14 and cut into 3 to 5 mm lengths, MS medium (Sigma M5519) + sucrose 3% + 2.4-D
  • the cells were pre-cultured 23 times at 12 mg / l, agarose (Sigma, typel) at 0.4% for 12 to 16 hours. At this time, co-culture was performed with a tobacco-derived cell line BY-2 for protection culture.
  • the cells of the agrobacterium were suspended in a liquid MS hormone-free medium.
  • the cut hypocotyl was mixed with this agrobacterium solution and co-cultured for about 20 minutes.
  • hypocotyls from which agrobacterium was removed with filter paper For example, infection was carried out by culturing for 2 days in a medium containing S basal medium + B5 vitamin (Sigma, M404) + sucrose 3% + 2,4-D lmg / 1.
  • antibiotic carpenicillin (Fizza One, Zeopen or GIBCO-BRL Carbenicillin di sodium salts) to 500 mg / l in MS basic medium + B5 vitamin + sucrose 3% + 2,4-D lmg / 1. Hypocotyls were transplanted to a sterilized culture medium added at a concentration to remove agrobacterium.
  • hypocotyls are added to S basic medium + B5 vitamin + sucrose 1% + benzylaminopurine 3mg / l + carbenicillin 500mg / l, and silver nitrate 5mg / l
  • the cells were cultured on a medium supplemented with 5-30 mg / l of kanamycin (Nacalai Tesque, Kanamycin sulfate) for 14-21 days. At this time, green calli may appear, so they were quickly replaced with the medium for the next step.
  • MS medium Sigma, M5191 + sucrose 1% + benzylaminopurine 3 mg / l + zeatin lmg / l + carbenicillin 500 mg / l + kanamycin 5 to 30 mg
  • selection medium containing / l. The hypocotyls that formed callus from the incision were transferred to this medium and cultured at 23 ° C for 3 weeks, and thereafter, transplantation was repeated 3 to 5 times every 3 weeks until green calli appeared.
  • Green calli were cut from the hypocotyl as soon as they were found and transferred to a medium of the same composition. After that, when only the green part was cut off and planted, adventitious shoots were formed with a probability of 1 to 30%. The adventitious buds are then transferred to B5 basic medium (Sigma, G5893) + sucrose 3% + benzylaminopurine lmg / 1 and grown, and then MS medium (Sigma M5519) + sucrose 3% + The roots were rooted on a medium containing 0.1 mg / l of naphthalene acid and 0.01 mg / l of benzylaminopurine.
  • Example 7 Analysis of transformant (detection of introduced DNA)
  • the a site is 568 bp from 3186 bp to 3753 bp of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, ⁇ 5'-GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3 '''(SEQ ID NO: 4) as a forward primer, and ⁇ 5'-CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3''' as a reverse primer. Sequence number 5) was used.
  • the b site is 244 bp from 4869 bp to 5112 bp of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, "5, -CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3 '" (SEQ ID NO: 6) as the forward primer, and "5' -TCCACAAACCCTAGCCAACA-3 '" as the reverse primer. SEQ ID NO: 7) was used.
  • the c site is 485 bp from 7766 bp to 8250 bp of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, ⁇ 5'-GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3 '''(SEQ ID NO: 8) as a forward primer, and ⁇ 5'-CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3''' as a reverse primer. SEQ ID NO: 9) was used.
  • the protein extraction method and Western blotting method were performed according to the method of N. Koizuka et al. (Theor Appl Genet (2000) 100: 949-955).
  • one bud (length 1 ⁇ ) of the obtained transformed rape and 1 ⁇ of ice-cold protein extraction buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2% (W / V ) SDS
  • ice-cold protein extraction buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2% (W / V ) SDS
  • This solution was transferred to a microcentrifuge tube and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new microcentrifuge tube and heated at 100 ° C for 5 minutes.
  • the mixture was centrifuged again at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C, and the supernatant was transferred to a new microcentrifuge tube to obtain an SDS soluble protein solution.
  • the concentration of the SDS-soluble protein solution was measured using a protein quantification kit (Bio-rad) by the blood feed method.
  • the SDS soluble protein solution was similarly extracted from the buds of the rape of the cytoplasmic male sterile line and the rape of the reproductive line, and the concentration was measured.
  • the PVDF membrane was transferred to Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188)) and shaken for 18 hours.
  • the PVDF membrane was transferred to 100 ml of TTBS (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20) and shaken for 10 minutes. This operation was repeated three times to wash away excess primary antibody solution.
  • the accumulation amount of the control ATPA was almost the same in the buds of the two strains of cytoplasmic male sterile rape, the rapeseed rapeseed rape, and the buds of the transgenic rapeseed in which the DNA was inserted into the cytoplasmic male sterile strain.
  • the accumulated amount of ORF125 protein was significantly reduced in the transgenic rape. The degree of this decrease is comparable to that of the fertility-recovery line in which the fertility-restoring gene has been introduced by crossing the cytoplasmic male-sterile line (Fig. 4, and M. Iwabuchi et al.
  • the Rfl gene from buds of F 2 individuals with pollen fertility with the homo by guaiacolsulfonate Niji ⁇ whip oscillation ⁇ sulfonates method is a conventional method, using the RNeasy kit (Qiagen), and extract total RNA.
  • PolyA + RNA was purified from all RA using “mRNA Purification kit” (Amersham Pharmacia) using an Origo (dT) cellulose column to obtain mRNA.
  • cDNA was isolated using the Marathon RACE system 5, RACE 3, and RACEJ kit using the 5, -RACE and 3'-RACE methods.
  • a gene-specific primer for 5, -RACE use 5, -GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3, (SEQ ID NO: 10).
  • SEQ ID NO: 10 For 3, -RACE,
  • PPR cluster # 1 A PPR cluster consisting of 175 residues consisting of the first PPR motif from the N-terminal to the fifth PPR motif,
  • PPR cluster # 2 A PPR cluster consisting of 245 consecutive residues of the 12th PPR motif from the 6th PPR motif from the N-terminal, and
  • PPR cluster # 3 PPR cluster consisting of 140 residues consisting of the 13th PPR motif from the N-terminal to the 16th PPR motif,
  • Example 11 1 Analysis of the protein of the present invention
  • the fertility restoring gene shown in SEQ ID NO: 2 is introduced into the BamHI-Sphl site of the E. coli expression vector pQE-80L (Qiageri), and an expression vector is constructed in which six histidine residues are added to the (6XHis) N-terminal. ( PQEB1 / cds6) .
  • DNA was amplified using the pSTV29 (Takara Shuzo) vector as type I, a primer for introducing a BamHI site: CGGGATCCGCTCACMTT (SEQ ID NO: 12), and an M13 primer RV (Takara Shuzo). DNA was amplified using Takara LA PCR Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • the amplified DNA was cut with restriction enzymes BamHI and EcoRI (Takara Shuzo) and purified using Suprec-02 (Takara Shuzo). BamHI and EcoRI sites at both ends of the 5, -UTR region of orfl25 gene and 25 amino acids of orfl25
  • PCR was performed using two primers according to the method of Fujimoto (protocol of plant PCR experiment: actual synthetic DNA, PP84-87 (Shujunsha)). The primer is
  • the amplified DNA was digested with restriction enzymes BamHI and EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.), and then purified using Suprec-02 (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • the purified DNA was ligated using TaKaRa Ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) and transformed into E. coli DH10B (Gibco BRL).
  • LB agar medium (l% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar) supplemented with 50 ⁇ g / ml Kuguchi Lamb-Fenicole (Sigma) , 0.
  • the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is found to be orf 125 mRNA, more specifically, the transcript of at least orf 125-5, the UTR region and the coding region of the 25 amino acid residue of ORF 125. It is presumed to be involved in suppressing the expression of 0RF125 protein.
  • the translation product of the gene of the present invention after being transferred to mitochondria, binds to the male sterility gene in the mitochondria and inhibits translation, thereby accumulating the amount of the protein responsible for cytoplasmic male sterility. It is presumed that by reducing the amount of cysteine, cytoplasmic male sterility was restored to fertility.
  • Example 12 Isolation of a gene for restoring fermentation of Rosa rape
  • the genomic sequence of the gene for restoring fertility was obtained by PCR from a rapeseed line obtained by introducing the gene for restoring fertility of Kosena radish by cell fusion (hereinafter referred to as Kosena rape). DNA was extracted from 0. lg using a Qiagen DNA isolation kit (DNeasy plant mini).
  • 5′-ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 1), which is a sequence from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 from 1027 bp to 1059 bp 30) was set as a forward primer
  • 5′-AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 31), which is a sequence from the base sequence of 7675 bp to 765 lbpbp of SEQ ID NO: 1, was set as a reverse primer.
  • DNA was amplified by repeating 30 times.
  • the thermal cycler used was UNOII (manufactured by Biometra) .
  • the amplified product of about 6 kb was used using an ultrafiltration filter Microcon-PCR (manufactured by Millipore). It was purified.
  • the purified amplification product as ⁇ and have One in a portion corresponding to 4280-758 5 th in SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence was determined 3306B P by a conventional method (SEQ ID NO: 1 5).
  • SEQ ID NO: 1 5 the resulting Comparison of the genomic nucleotide sequence of Kosena rape with the sequence of Sorenko radish revealed that Of these, only 7 bp had DNA base substitutions, indicating high homology.
  • CDNA was synthesized from 1 ⁇ g of the entire atmosphere using SUPERSCRIPT II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen). Using 5′-TGGAGTAAAGAGGAGAACTAAAAAGGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 32) (3) as a fertility recovery gene 3 ′ partial-specific primer,
  • the thermal cycler used was UNOII (manufactured by Biometra). Add 1 ⁇ of pGEM-Teasy vector (Promega), 2 ⁇ ligation buffer of 5 ⁇ 1 (Promega), 1 ⁇ l of T4 DNA ligase (Promega) to room temperature Left for 1 hour to bind to vector. This vector was transformed into E. coli DH5 (Gibco BRL) to obtain a clone. The nucleotide sequence of the obtained clone was determined by a conventional method, and it was confirmed that the cDNA of Kosena rape was spliced with introns, as in the case of Soybean radish. That is, the 7 bp base substitution found by comparing the genomic sequence is
  • a partial sequence of the fertility restoring gene of R. .ra a LZ'sirM? was isolated from cDNA.
  • RNA was extracted by the Guanidium-Phenol-Chloroform) method (Shujunsha, Cell Engineering, Separate Volume, Bio-Experimental, Basics of Gene Analysis, P161-166). PolyA + RNA from total RNA, ⁇ mRNA Purification kit '' using Origo (dT) cellulose column
  • CDNA was synthesized from the purified 1 mRNA using the “Marathon RACE system 5 ′ RACE 3, RACE” kit (Clontech).
  • Fertility-restoring gene-specific forward primer 5 using -GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3 '(SEQ ID NO: 34) as a reverse primer specific for the fertility restoration gene,
  • 5′-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 35) was used.
  • ⁇ .. raphanist c Add 14.4 ⁇ 1 sterile water, 2.51 10x Pyrobest PCR buffer (Takara Shuzo), 2 ⁇ 1 2.5mM dNTP mix, 2.5 ⁇ 1 10 ⁇ M Add Ima solution, 2.5 1 lO ⁇ uM reverse primer solution, 0.1 ⁇ 1 5 unit / ⁇ 1 Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), mix, 98 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 DNA was amplified by repeating a cycle of 30 minutes at 1 ° C for 30 times.
  • the thermal cycler used was UN0II (manufactured by Biometra).
  • Example 14 Isolation of a gene for restoring fermentation of Raphanus rape
  • the cDNA sequence of the fertility-recovering gene was isolated from the rapeseed line (hereinafter referred to as "Radseed rape") obtained by introducing the fertility-and-sex-restoring gene of ogla radish using the 5, -RACE method and the 3'-RACE method. .
  • CDNA was synthesized from 1 g of the purified mRNA using the “Marathon RACE system 5, RACE 3, RACE” kit (Clontech). Using 5'-GATCCATGCATTTGTCAAGG-3 (SEQ ID NO: 36) as a forward primer specific for the fertility restoration gene,
  • This vector was transformed into Escherichia coli DH5 (manufactured by Gibco BRL) to obtain a clone. After confirming the nucleotide sequence of the obtained clone by a conventional method, four types of cDNA partial sequences were obtained. Based on the obtained information on the four types of sequences, primers for 5'-RACE and 3'-RACE were set in portions common to the four, and cDNA was isolated for each.
  • CDNA was synthesized in the same manner as described above, and cDNA was isolated by performing the 5'-RACE and 3'-RACE methods using the "Marathon RACE system 5, RACE 3 'RACE” kit (Clontech). 5'-RACE as a gene-specific primer
  • the obtained DNA solution was diluted 100-fold, and into 2 // I, 8.6 1 sterile water, 21 1 ( ⁇ LA PCR buffer (Takara Shuzo), 2 ⁇ 1 25raM MgCl 2 , 3.2 ⁇ 1 of 2.5 mM dNTP mix, 1 ⁇ 1 of 10 ⁇ SEQ ID NO: 5, ogu-1 primer solution, 1 ⁇ 1 of 10 ⁇ adapter primer solution (Marathon RACE system 5, RACE 3 'RACE kit, Clontech), 0.2 Add 5 ⁇ l of 5 units / jul TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) and mix.Five cycles of 98 ° C 5 seconds, 72 ° C 3 minutes 5 times, 98 ° C 5 seconds, 70 ° C 3 minutes 3 cycles DNA was amplified by repeating a cycle of 5 times, 5 seconds at 98 ° C and 3 minutes at 68 ° C for 25 times
  • the thermal cycler used was UN0II (manufact
  • each of the Rf genes derived from the radish, radish, and rapeseed rape of the present invention has 16 PPR motifs, and this PPR motif group consists of five, seven, and four PPR motifs from the amino side.
  • Asparagine was the fourth amino acid present in the second PPR motif from the amino terminal after being divided into two blocks.
  • a partial fragment derived from Raffanas raphanis tram was analyzed by applying the corresponding portion to the above sequence (94-264 of SEQ ID NO: 26). It has a part corresponding to the PPR motif.
  • the PPR motif group and the fourth amino acid present in the second PPR motif from the amino side also have the above characteristics.
  • the protein of the present invention obtained as a result of analysis of the partial sequence of the three fertility restoring genes R.. R3 ⁇ 4 ⁇ ir fertility restoring genes obtained from the soybean radish, the rapeseed rape, and the rapeseed rape (SEQ ID NO: 26) And among the genes that encode it (SEQ ID NO: 22), the radish and radish have a very high homology, and the amino acid sequence is 99.6% (only three amino acids differ. Since the nucleotide sequence shows a high value of 99.7%, it is particularly preferable to use a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and a gene encoding the same (SEQ ID NO: 25). Can be
  • the Rf gene particularly the Rf1 gene derived from radish, was isolated and its structure was identified. Further, according to the present invention, it has become possible to provide a means for establishing a rapeseed recovery line using the isolated Rf gene.

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Description

明細書
細胞質雄性不稔から可稔への回復に関与するタンパク質
及ぴそれをコードする遺伝子 技術分野
本発明は、 細胞質雄性不稔から可稔への回復に関与する遺伝子に する。 より 詳細には、 本発明は、 一代雑種 （以下、 F1と略す） 品種開発のために利用される 細胞質雄性不稔形質（以下、 c m sと略すことがある）の回復に関与する遺伝子、 当該遺伝子を含有するべクタ一及び形質転換体に関するものである。 背景技術
禾穀類、 野菜などの農作物では、 1) 雑種強勢による優れた農業形質、 2) 収 穫物の均一性、 3) 次世代で遺伝形質が分離するため品種育成者の利益が保護さ れる、 などの特徴のもと、 F1品種の開発が盛んであり、多くの主要作物で実用化 されている。
F1品種の種子を生産するための方法の一つとしては、細胞質雄性不稔（cm s) 系統とその雄性不稔を回復する （以下、 R f と略すことがある） 系統からなる c m s /R f採種システムがあり、 例えばイネ、 ソルガム、 トゥモロコシ等の禾榖 類や例えばひまわりなどの油量作物で開発されているが、 これらはいずれも、 交 配あるいは細胞融合の手法を用いて開発されたものである。
一方、アブラナ科では、 自家不和合性を用いた F1採種システムが広く利用され ているが、 ナタネに関しては、 安定な自家不和合性のないため、 cms系統と R f系統を利用した F1採種システムが求められている。
これに対して、 近年、 コセナダイコン由来の細胞質雄性不稔 （コセナ cm s) ゃォグラダイコン由来の細胞質雄性不稔 （ォグラ cms) をナタネで利用する研 究がなされている。 両 cms遺伝子に関しては細胞質小器官であるミトコンドリ ァのゲノムにコードされており、 塩基配列についても知られているが、 ダイコン は、 分子生物学的な研究が進んでおらず、 遺伝子単離に必要なマーカーもほとん ど知られていない状態であるため、 核からの遺伝子の単離が困難であり、 R iに 関しては、 ダイコンの稔性回復系統から交配あるいは細胞融合の手法を使いナタ ネに導入されているのみである。
さらに、 R f遺伝子に関しては、 植物の各 cms系統により、 1つ又は複数の 回復遺伝子が存在する。 ダイコンにおいては、 R f 1遺伝子及ぴ R f 2遺伝子が 同時に存在することが稔性回復に必要であり、 加えて、 R f 1遺伝子が、 ダイコ ンの cm s原因タンパク質として知られている、 ミ トコンドリア内の OR F 12 5タンパク質 (M. Iwabuchi et al. Plant Mol. Biol. 39:183-188， 1999) の蓄 積量を大幅に減少させることが知られている。 （育種学雑誌 47 (別 1) P 1 86, 1997, 育種学雑誌 48 (別 1 ) P 197、 1998) 。
またナタネにおいては、 遺伝解析実験により、 交配または細胞融合によって導 入されたダイコンの R f 1遺伝子が、 cm s原因タンパク質として知られている ORF 125または ORF 138タンパク質（M. Grelon et al. Mol. Gen. Genet. 243:540- 547)の蓄積量を減少ざせること、 これら ORF 125または OR F 13 8タンパク質の蓄積量の減少と稔性が回復する現象は完全に一致していることが 知られている （Ν· Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955, 2000) 。 つまり、 ナタネ雄性不稔系統で稳性が回復するには、 ORF 125または ORF 138タンパク質の蓄積量の減少が必須であり、 そのために、 R f 1遺伝子は重 要な遺伝子である。
しかしながら、 一方で R f遺伝子の塩基配列については、 トウモロコシの cm sの一つである T一サイトプラズムに対する回復遺伝子の一つである R f 2遺伝 子のみについては同定、 単離されているが、 他の植物で R ί遺伝子の塩基配列に ついては、 全く知られていない。 発明の開示
交配あるいは細胞融合によりオダラダイコン由来の R f 1遺伝子を導入したナ タネ回復系統とその系統を父親として作出された F l品種は、 ダルコシノレート
(以下 G S Lと略す） 含量が、 規制値より高くなることがわかり、 実用上問題と なっている。 これは、 G S Lの生合成に関与するダイコン由来の遺伝子が R f 1 遺伝子の近傍に存在し、 遺伝的に強連鎖しているため、 ナタネの回復系統 （R f 系統） の G S Lの含量が上昇するものと考えられている。 G S Lはナタネの搾油 かすに含まれ、 それを飼料として動物に与えたとき、 甲状腺肥大をもたらすこと が知られているため、 ナタネ種子の G S L含量は、 育種段階において、 北米では 18 ,u fflole/g ヨーロッパでは SO ^ mole/g以下にすることが求められている。
さらに、 近年では、 除草剤耐性等の機能を遺伝子組換えにより付カ卩した植物の 開発も活発であり、 これらの植物を効率的に創出するためには、 交配あるいは細 胞融合により得られたナタネ回復系の存在のみでは不十分であり、 R f遺伝子、 特には、 ダイコン由来の R f 1遺伝子の単離が望まれていた。
即ち、 本発明は、 R f遺伝子、 特には、 ダイコン由来の R f 1遺伝子を単離し てその構造を同定することを解決すべき課題とした。 さらに、 本発明は、 単離し た R f遺伝子を利用してナタネ回復系統を確立する手段を提供することを解決す べき課題とした。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 ダイコン及ぴナ タネから R f 1遺伝子をクローニングすることに成功し、 本課題を解決するに至 つた。
すなわち、 本発明によれば、 Pentatricopeptide Repeat (以下 PPRと略） モチー フを 1 4個以上持ち、 該 P P Rモチーフ群は 3つ以上のブロックに分割されてお り、該各プロックはそれぞれ少なくとも 2つ以上の P P Rモチーフを有し、かつ、 カルボキシ末端 （。末端） 側のブロックは 4つの P P Rモチーフを有することを 特徴とする細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパ ク質が提供される。
上記タンパク質の好ましい態様によれば、
P P Rモチーフの数が 1 4〜 1 6個であるタンパク質； P P Rモチーフ群が 3つのブロックに分割されており、ァミノ末端（N末端）側 から順に各プロックが 5個、 7個及ぴ 4個の P P Rモチーフを有するタンパク質； ァミノ末端 （N末端） ί則から 2番目.の PPRモチーフに存在する 4番目のアミノ酸 ァミノ末端 （N末端） 側から 2番目の PPRモチーフに存在する 4番目のアミノ酸 がァスパラギン、 グルタミン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸又はヒスチジンの いずれかであるタンパク質；並びに
さらに、 ァミノ末端にミ トコンドリアに移行するためのシダナルぺプチド配列 を有するか又はカルポキシ末端に一 LysAspGluLeu—からなる配列を有するタンパ ク寳；
が提供される。
本発明の別の側面によれば、 細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と接触させた後 に該転写産物にゲルシフトを起こさせることを特徴とする細胞質雄性不稔個体の 不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 配列番号 2 6に記載のァミノ酸配列を有す る細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質； 配列番号 2 7に記載のァミノ酸配列を有する細胞質雄性不稳個体の不稔性を可 稔に回復することに関与するタンパク質；
配列番号 2 8に記載のァミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可 稔に回復することに関与するタンパク質；並びに、
配列番号 2 9に記載のァミノ酸配列を有する細胞質雄性不稳個体の不稔性を可 稔に回復することに関与するタンパク質：
が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 下記の何れかのタンパク質が提供される。 ( 1 ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 配 列番号 1 7に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 又は配列 番号 1 9に記載のァミノ酸配列の 8 2〜 6 9 0番目のァミノ酸配列を有するタン パク質；又は
( 2 ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 配 列番号 1 7に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 又は配列 番号 1 9に記載のアミノ酸配列の 8 2〜 6 9 0番目のアミノ酸配列において 1か ら複数個のアミノ酸が欠失、 付加及び Zまたは置換されているアミノ酸配列を有 し、 かつ細胞質雄性不稳個体の不稔性を可稔に回復することに関与する 本発明のさらに別の側面によれば、 下記の何れかのタンパク質が提供される。
( 1 ) 配列番号 3、 配列番号 1 7、 又は配列番号 1 9に記載のアミノ酸配列を有 するタンパク質；又は
( 2 ) 配列番号 3、 配列番号 1 7、 又は配列番号 1 9に記载のァミノ酸配列にお いて 1から複数個のアミノ酸が欠失、 付加及び/または置換されているアミノ酸 配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する 本発明において好ましくは、 細胞質雄性不稔個体は、 コセナダイコン及び/又 はォグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものである。 本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明のいずれかのタンパク質を コードする D N Aが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、
配列番号 2 2に記載の塩基配列を有する D NA；
配列番号 2 3に記載の塩基配列を有する D NA；
配列番号 2 4に記載の塩基配列を有する D NA；並びに、
配列番号 2 5に記載の塩基配列を有する D NA：
が提供される。
本発明.のさらに別の側面によれば、 下記の何れかの D N Aが提供される。
( 1 ) 配列番号 2、 配列番号 1 6、 .又は配列番号 1 8に記載の塩基配列を有する D N A；又は (2) ·配列番号 2、 配列番号 16、 又は配列番号 18に記載の塩基配列において 1から複数個の塩基が欠失、 付加及び/または置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DNA；又は
(3) 配列番号 2、 配列番号 1 6、 又は配列番号 1 8に記載の塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ細胞質雄性不稔個 体の不稔性を可稔に回復することに関与する DNA。
本発明のさらに別の側面によれば、 下記の何れかの DN Aが提供される。
( 1 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3754番目〜 8553番目の塩基配列又 は配列番号 15に記載の塩基配列の 812番目〜 3002番目の塩基配列を有す る DNA；又は
( 2 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3754番目〜 8553番目の塩基配列又 は配列番号 1 5に記載の塩基配列の 812番目〜 3002番目の塩基配列におい て 1から複数個の塩基が欠失、付加及び/または置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DN A；又は
( 3 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3754番目〜 8553番目の塩基配列又 は配列番号 1 5に記載の塩基配列の 812番目〜 3002番目の塩基配列を有す る DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ細胞質雄性不稔 個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DNA。
本発明のさらに別の側面によれば、 下記の何れかの DN Aが提供される。
( 1 ) 配列番号 1又は配列番号 15に記載の塩基配列を有する D N A；又は
( 2 ) 配列番号 1又は配列番号 15に記載の塩基配列において 1から複数個の塩 基が欠失、 付加及ぴ Zまたは置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄性不 稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DN A；又は
( 3 ) 配列番号 1又は配列番号 15に記載の塩基配列を有する D N Aとス トリン ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稳 に回復することに関与する D NA。
本発明において好ましくは、 細胞質雄性不稔個体は、 コセナダイコン及び/又 はオダラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものである。 本発明のさらに別の側面によれば、 本発明の D N Aを含有するベクターが提供 される。
本発明のさらに別の側面によれば、 本発明の D N A又は本発明のベクターを有 する形質転換体が提供される。 形質転換体は、 好ましくは形質転換植物である。 本発明のさらに別の側面によれば、本発明の D N Aを用いることを特徴とする、 細胞質雄性不稔倜体の不稳性を可稔に回復する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 細胞質雄性不稳遺伝子を有し、 かつ、 本発 明の D N Aを有する細胞に、 さらに本発明の D NAの一部又は全部を誘導型プロ モーターと共に導入することによ-り、 雄性不稔回復遺伝子の発現を制御すること が可能となつた形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した形質転換体を利用することによる 細胞質雄性不稔系統の維持方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本努明の D N Aから任意に設定し た 1 5〜 5 O merのオリゴヌクレオチドプライマー、又は、上記した本発明の D N Aの全部又は 1部からなる少なくとも 1 5 mer以上のプローブを使用し、目的の生 物試料中に、 該プライマーにより増幅される塩基配列の量、 又は、 プローブによ り検出される塩基配列の量が、 1ゲノム中に 1遺伝子以上あることを確認するこ とで、 細胞質雄性不稔回復に関与する遺伝子を検出する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 配列番号 1に記載の塩基配列の 3 7 5 4番 目〜 5 0 9 1番目の塩基配列、 又は配列番号 1 5に記載.の塩基配列の 1番目〜 8 1 1番目の塩基配列を有する、 プロモーター D N Aが提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 R f マーカー遺伝地図を示す。
図 2は、配列番号 1に記載の塩基配列を十分に保持するラムダクローン CHIの構 造の模式図を示す。 図 3は、 形質転換体中の導入 DNAを P C R法を用いて検出した結果を示す。 レーン 1 ：コントロールベクター、 レーン 2 ：形質転換ナタネ、 レーン 3 ：細 胞質雄性不稔ナタネ、
a ： 3 1 8 6 b p— 3 7 5 3 b p、 長さ ： 5 6 8 b p
b : 4 8 6 9 b p - 5 1 1 2 b p , 長さ ： 244 b p
c ： 7 7 6 6 b p— 8 2 5 0 b p、 長さ ： 4 8 5 b p
図 4は、 形質転換体中における CMSタンパクである OR F 1 2 5の蓄積量の 減少をウェスタンプロッティング法により解析した結果を示す。
レー 1 ：細胞質雄性不稔ナタネ 一 1一 1 5 g
レーン 2 ：稔性回復ナタネ 1 5 μ g
レーン 3 ：細胞質雄性不稔ナタネ 一 2— 1 5 μ g
レーン 4〜 7 ：細胞質雄性不稔ナタネ 一 2 _
1 5/2 μ g, 1 5/4 μ g、 1 5/8 μ g , 1 5/ 1 6 μ g希釈系列 レーン 8 ：形質転換ナタネ 1 5 μ g
図 5は、 形質転換ナタネの開花体から葯を取り出し、 顕微鏡観察した結果を示 す。
図 6は、 PSTV125- 5' #LA6と PSTV125- 5' #LA12の塩基配列を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
(1) 本発明のタンパク質の態様
本発明のタンパク質は下記（ i )から（V)のいずれかのタンパク質に関する。 ( i ) Pentatricopeptide Repeat (以下 PPRと略） モチーフを 1 4個以上持ち、 該 P P Rモチーフ群は 3つ以上のブロックに分割されており、 該各プロックはそ れぞれ少なくとも 2つ以上の P P Rモチーフを有し、 かつ、 カルボキシ末端 (C 末端） 側のブロックは 4つの; P P Rモチーフを有することを特徴とする細胞質雄 性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質； ( i i ) 細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と接触させた後に該転写産物にゲル シフトを起こさせることを特徴とするタンパク質；
( i i i ) 配列番号 2 6〜 2 9の何れかに記載のァミノ酸配列を有する細胞質 雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンバク質。
( i v ) 下記の何れかのタンパク質。
( 1 ) 配列番号 3に記载のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 配 '列番号 1 7に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 又は配列 番号 1 9に記載のアミノ酸配列の 8 2〜6 9 0番目のアミノ酸配列を有するタン パク質；又は
( 2 ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 配 列番号 1 7に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 又は配列 番号 1 9に記載のアミノ酸配列の 8 2〜6 9 0番目のアミノ酸配列において 1力、 ら複数個のアミノ酸が欠失、 付加及び/または置換されているアミノ酸配列を有 し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク 質；並びに、
( V ) 下記の何れかのタンパク質。
( 1 ) 配列番号 3、 配列番号 1 7、 又は配列番号 1 9に記載のアミノ酸配列を有 するタンパク質；又は
( 2 ) 配列番号 3、 配列番号 1 7、 又は配列番号 1 9に記載のァミノ酸酉 B列にお いて 1から複数個のアミノ酸が欠失、 付加及ぴ/または置換されているアミノ酸 配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する 本明細書において、 PPRモチーフとは 「Peni:atricopeptide Repeat」 モチーフの ことを称す。 この PPRモチーフは、ァラビドピシスのゲノムプロジェクトの進行に よって見出された新しいタンパク質のモチーフ構造である。 その基本モチーフは 35個の縮重した （degenarate) したアミノ酸配列が、 そのタンパク質の一次構造 上でタンデムに繰り返されたものである。 PPRモチーフは、 コンセンサスアミノ酸 配列として、 ァミノ末端 （N末端） - 「VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV」 - カルボキシ末端（C末端）に代表される配列を有する。このモチーフは、 Small and Peeters (文献' Trends Biochem Sci 2000, 25 46-47) によって提唱されたもの で、 ァラビドピシスのゲノム中には、 このモチーフを取りうる遺伝子が、. この文 献が出版された当時で 200ほど GenBank
(http//w . ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/index. html) などの ¾：伝子パンクに幸告 されている。 現在、 ある任意のタンパク質が、 このモチーフ構造を持ち得るか否 か半 IJ断は、 英国のサンガー研究所内にある Protein families database of alignments and HMNs (以下 Pfamと略、
http//:www. sanger. ac. uk/Sof tware/Pf am/ search, shtml)【こあるプログフムで容 易に判断することができる。
現在までのところで PPRモチーフを有するタンパク質の機能が明らかになつて いる例としては、 1 ) ミ トコンドリアに移行するタンパク質である酵母の PET309 ゃァカパン力ビの CYA- 5が、 ミ トコンドリア遺伝子である coxl mR Aと相互作用を して coxlの発現を転写後のプロセシングもしくは翻訳のレベルで制御している例 (Manthey and McEwen EMBO J 1995 14 4031-4043, Coffin et. al. Curr Genet 1997 32 273-280) や 2 ) 葉緑体に移行する PPRモチーフタンパク質であるトウモロコシ の CRP1が、 葉緑体遺伝子である petAおよび petD遺伝子の翻訳に必須であり、 加え て petDmRNAのプロセシングのステップにも必須である例（Fisk et. at. EMBO J 1999 18 2621-2630) 等が挙げられ、 従って、 P P Rモチーフを有するタンパク質は、 何らかの形で翻訳制御に関わっている可能性が高いと推察される。
今回、 本発明者らがコセナダイコン細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復 することに関与する遺伝子を単離したところ、 それによりコードされているタン パク質は、 Pentatricopeptide Repeat (以下 PPRと略）モチーフを 1 4個以上持ち、 加えて該 P P Rモチーフ群が 3つ以上のブロックに分割されており、 さらに該各 ブロックはそれぞれ少なくとも 2つ以上の P P Rモチーフを有し、 かつ、 最も力 ルポキシ末端 ( C末端) 側に存在するブロックは 4つの P P Rモチーフを有する ものであることを見出した。
上述の細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク 質として好ましくは、 P P Rモチーフの数が 1 4〜1 6個のものであり、 より好 ましくは P P Rモチーフ群が 3つのブロックに分割されており、 ァミノ末端 （N 末端） 側から順に各ブロックが 5個、 7個及び 4個の P P Rモチーフを有するも のである。
具体的には、
( 1 ) PRクラスター # 1 ： N末端から 1番目の PPRモチーフから 5番目の PPRモチー フが連続した 1 7 5残基からなる PPRクラスター、
( 2 ) PPRクラスター # 2 ： N末端から 6番目の PPRモチーフから 12番目の PPRモチ ーフが連続した 2 4 5残基からなる PPRクラスター、
( 3 ) PPRクラスター # 3 ： N末端から 13番目の PPRモチーフから 16番目の PPRモチ ーフが連続した 1 4 0残基、
からなるものである。
更に好ましくはァミノ末端 （N末端） 側から · 2番目の PPRモチーフに存在する 4 番目のアミノ酸がセリン、 スレオニン又は-システィン以外であるものであり、 更 に好ましくはァミノ末端 （N末端） 側から 2番目の PPRモチーフに存在する 4番目 のアミノ酸がァスパラギン、 グルタミン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸又はヒ スチジンのいずれかであるものであり、特に好ましくはァミノ末端（N末端） 側か ら 2番目の PPRモチーフに存在する 4番目のアミノ酸がァスパラギンであるもの でめる。
通常、 稔性回復遺伝子は、 核ゲノムに存在し、 細胞質雄性不稔遺伝子はミ トコ ンドリァに存在する事が知られているため、 上記細胞質雄性不稔個体の不稔性を 可稔に回復することに関与するタンパク質は、 さらに、 ァミノ末端にミ トコンド リァに移行するためのシグナルぺプチド配列を有するか又はカルボキシ末端に 「LysAspGluLeu」 からなる配列を有することが好ましい。
該ミ トコンドリアに移行するための N末端のシグナルペプチドとしては、 0. Emanuelsson ら（J. Mol. Biol. 300, 1005- 1016 (2000)のアルゴリズムを基にした 予測プログラム 「TargetP」 http: // . cbs. dtu. dk/services/TargetP/)又は予 測プログラム rpsortj (http： //psort. nibb. ac. jp/)から確認されるものが挙げら れ、 また、 該シグナルペプチドの具体例としては、 シロイヌナズナ AtOXAl遺伝子 のシグナルペプチド（W. Sakamoto et al : Plant Cell Physiol, 41 : 1157-1163)
(MetAlaPheArgGlnThrLeuSerlleArgSerArgLeuPheAlaArgArgAsnGlnProValTyrHisI 1 el 1 ePr oArgGluSerAspHi sGluAr gAsp) といった配列が挙げられる。 このうち、 好 ましくは配列番号 3に記載のァミノ酸配列における 1〜7 9のァミノ酸配列が挙 げられ、 特に好ましくは、 配列番号 3に記載のァミノ酸配列における 1〜 3 4の アミノ酸配列が挙げられる。
また、 本発明の細胞質雄性不稔個体の不稳性を可稔に回復することに関与する タンパク質は、 細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と結合することにより、 その細' 胞質雄性不稔遺伝子の翻訳阻害を起こさせ、 細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔 に回復させるものである。
細胞質雄性不稳遺伝子の転写産物としては、 コセナ細胞質雄性不稔を引き起こ す原因タンパク質である O R F 1 2 5又はォグラ細胞質雄性不稔を引き起こす原 因タンパク質である O R F 1 3 8のそれぞれの遺伝子の転写産物（mRNA)が挙げら れ、 好ましくは該遺伝子の 5， - U T R (Bonhorame et al ; Mol Gen Genet, 235 : 340-348 (1992)領域が挙げられる。
細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と結合するか否かを確認する方法としては、 in vitroで人工的に転写させた orfl25又は orf 1 3 8の mRNAに本発明のタンパク 質を加え、 電気泳動させる方法、 いわゆるゲルシフト法が挙げられ、 具体的操作 方法としては、ゲルシフト法として、通常行われているような条件で行えばよい。 また、 O R F 1 2 5又は O R F 1 3 8の遺伝子と、例えば -ガラクトシダーゼ ゃルシフェラーゼのような検出可能なレポーター遺伝子との融合遺伝子を大腸菌 などに発現させたものに、 さらに本願タンパク質を加えることで発現が抑制され るか否かを確認する方法も挙げられる。 具体的には、 配列番号 2の塩基配列で示される稔性回復遺伝子を大腸菌発現べ クタ一に組み込んだものと、 orf 125の 5' - UTR領域と 25アミノ酸のコーディング部 分を LacZ遺伝子に融合したベタターを大腸菌に組み込みんだものを作成し、 誘導 発現させると、 稔性回復遺伝子を組み込んだ発現ベクターを同居させた場合にの み、 LacZ遺伝子の発現が抑制されて、 X- Galの存在下で青い大腸菌コロニーが白く なる。 このように本願タンパク質をコードする遺伝子を利用し、 上記のような確 認を行うことによっても、 細胞質雄性不稳遺伝子の翻訳阻害を起こさせることに より、 細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復させる機能を有することが確認 できる。
本発明の細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパ ク質の中で最も好ましいものとしては、 コンセンサス配列である配列番号 2 6〜 2 9に記載のァミノ酸配列に対して 7 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以上、 より好 ましくは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9 2 %以上、 さらに好ましくは 9 5 %以 上、 特に好ましくは 9 7 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク 質が挙げられる。 コンセンサス配列としては配列番号 2 6に記載のアミノ酸配列 が挙げられ、好ましくは配列番号 2 7又は 2 8に記載のァミノ酸配列が挙げられ、 特に好ましくは配列番号 2 9に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
また、 上記したタンパク質の好ましい具体例としては、
( 1 ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 配 列番号 1 7に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 又は配列 番号 1 9に記載のアミノ酸配列の 8 2〜6 9 0番目のアミノ酸配列を有するタン パク質；又は
( 2 ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 配 列番号 1 7に記载のァミノ酸配列の 8 0〜 6 8 7番目のァミノ酸配列、 又は配列 番号 1 9に記載のアミノ酸配列の 8 2〜6 9 0番目のアミノ酸配列において 1か ら複数個のァミノ酸が欠失、 付加及び/または置換されているアミノ酸配列を有 し、 かつ細胞質雄性不稔ィ固体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク 質が挙げられる。
また、 該配列にミトコンドリァへの移行配列を有するものとしては、
(1) 配列番号 3、 配列番号 1 7、 又は配列番号 1 9に記載のアミノ酸配列を有 するタンパク質；又は
(2) 配列番号 3、 配列番号 1 7、 又は配列番号 1 9に記載のアミノ酸配列にお いて 1から複数個のアミノ酸が欠失、 付加及び/または置換されているアミノ酸 配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稳性を可稔に回復することに関与する タンパク質が挙げられる。
本発明のタンパク質は、 細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに 関与することができるタンパク質である。 より具体的には、 本発明のタンパク質 をコードする DNAが導入されている形質転換植物（R f 系統）を細胞質雄性不稔系 銃 (cm s系統) の個体と交配させた場合に、稳性の回復された F1種子を得るこ とができる。 上記 cm s系統の個体として好ましくは、 コセナダイコン及ぴ Z又 はォグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子が導入された個体が挙げられる。
本発明のタンパク質は、 上述のようなゲルシフト法を利用してスクリーニング をし、 単離したり、 下記で説明する本発明の DNAを利用し、 単離又は合成する ことができる。 本発明のタンパク質の取得方法については後記する。
(2) 本発明の DN Aの態様
本発明の DNAは、 下記の （i).から （i v) の何れかの DNAに関する。 ( i ) 上記した本発明のタンパク質をコードする DNA。
( i i )配列番号 22〜配列番号 25の何れかに記載の塩基配列を有する DNA。 ( i i i ) 下記の何れかの DNA。
(1) 配列番号 2、 配列番号 16、 又は配列番号 1 8に記載の塩基配列を有する DNA；又は
(2) 配列番号 2、 配列番号 16、 又は配列番号 1 8に記載の塩基配列において 1から複数個の塩基が欠失、 付加及ぴ Zまたは置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄.性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DN A；又は (3) 配列番号 2、 配列番号 1.6、 又は配列番号 1 8に記載の塩基配列を有する
DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズレ、 かつ細胞質雄性不稔個 体の不稔性を可稔に回復することに関与する DN A。
( i v) 下記の何れかの DNA。
( 1 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3754番目〜 8553番目の塩基配列又 は配列番号 1 5に記載の塩基配列の 812番目〜 3002番目の塩基配列を有す る DNA；又は
( 2 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3754番目〜 8553番目の塩基配列又 は配列番号 1 5に記載の塩基配列の 812番目〜 3002番目の塩基配列におい て 1から複数個の塩基が欠失、付加及び/または置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DN A；又は
( 3 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3754番目〜 8553番目の塩基配列又 は配列番号 15に記載の塩基配列の 812番目〜 3002番目の塩基配列を有す る DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ細胞質雄性不稔 個体の不稔性を可稳に回復することに関与する D N A。
(v) 下記の何れかの DNA。
( 1 ) 配列番号 1又は配列番号 15に記載の塩基配列を有する D N A；又は
(2) 配列番号 1又は配列番号 15に記載の塩基配列において 1から複数個の塩 基が欠失、 付加及び Zまたは置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄性不 称個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DNA；又は
( 3 ) 配列番号 1又は配列番号 15に記載の塩基配列を有する D N Aとストリン ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔 に回復することに関与する D N A。
本明細書では、 本発明の DNAを、 本発明. < 遺伝子と称する場合もある。
配列番号 1で示される塩基配列は、 8553個の塩基から成るゲノム DNA塩 基配列であり、 配列番号' 2で示される塩基配列は、 配列番号 1より得られたコー ド配列である。 配列番号 3は、 配列番号 2で示される塩基配列がコードするアミ ノ酸配列である。
配列番号 1 5で示される塩基配列は 3 3 0 6個の塩基から成るゲノム D N A塩 基配列であり、 配列番号 1 6で示される塩基配列は、 配列番号 1 5より得られた コ一ド配列である。 配列番号 1 7は、 配列番号 1 6で示される塩基配列がコード するアミノ酸配列である。
本明細書において 「1から複数個の塩基が欠失、 付加及ぴ Zまたは置換されて いる塩基配列」， とは、 例えば 1〜 2 0個、 好ましくは 1〜1 5個、 より好ましく は 1〜 1 0個、 さらに好ましくは 1〜 5個の任意の数の塩基が欠失、 付加及び/ または置換されている塩基配列のことを言う。
本明細書において、 「1から複数個のアミノ酸が欠失、 付加及び Zまたは置換 されているアミノ酸配列」 とは、 例えば 1〜 2 0個、 好ましくは 1〜ί 5個、 よ り好ましくは 1〜 1 0個、 さらに好ましくは 1〜 5個の任意の数のァミノ酸が欠 失、 付加または置換されているアミノ酸配列のことを言う。
本明細書において 「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N A」 とは、 D N Aをプローブとして使用し、 コロニーハイプリダイゼーシヨン法、 プ ラークハイプリダイゼーシヨン法、 あるいはサザンブロットハイプリダイゼーシ ヨン法等を用いることにより得られる D N Aの塩基配列を意味し、 例えば、 コロ ニーあるいはプラーク由来の D N Aまたは該 D N Aの断片を固定化したフィルタ 一を用いて、 0 . 7〜1 . 0 Mの N a C 1存在下 6 5 °Cでハイブリダィゼーショ ンを行つた後、 0 . 1〜 2 X S S C溶液 （ 1 X S S Cの組成は、 1 5 0 mM塩ィ匕 ナトリウム、 1 5 mMクェン酸ナトリウム） を用い、 6 5。C条件下でフィルター を洗浄することにより同定できる D NA等を挙げる.ことができる。
ハイブリダイゼーションは、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989. 以後"モレキ ユラ一クローニング第 2版〃 と略す） 等に記載されている方法に準じて行うこと ができる。 ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aとしては、 プローブと して使用する D N Aの塩基配列と一定以上の相同性を有する D N Aが挙げられる。 ここで言う一定以上の相同性とは、 例えば 7 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、さらに好ましくは 9 3 %以上、特に好ましくは 9 5 % 以上、 最も好ましくは 9 7 %以上である。 なお。 ここで言う一定以上の相同性を 有する D NAとしては、 上記した相同性を有するポリヌクレオチドおよびその相 補鎖ポリヌクレオチドの両方を包含する。
本発明の D N Aは、 細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与 することができる D N Aである。 より具体的には、 本発明の D N Aを導入した形 質転換植物 （R f 系統） を細胞質雄性不稔系統 （c m s系統） の個体と交配させ ることにより、稔性の回復された F 1種子を得ることができる。上記 c m s系統の 個体として好ましくは、 コセナダイコン及ぴ /又はォグラダイコンの細胞質雄性 不稳遺伝子が導入された個体が挙げられる。
( 3 ) 本発明の D N Aの取得方法
本発明の D N Aの取得方法は特に限定されない。 本明細書中に開示した配列番号 1または配列番号 2に記載の塩基配列、 並びに配列番号 3に記載したァミノ酸配 列または配列番号 3に記载したアミノ酸配列の情報に基づいて得られた PPRモチ ーフゃミ トコンドリァ移行配列を組み合わせて得られるァミノ酸配列の情報に基 づいて、 当業者に公知の一般的育種手法及び一般的遺伝子工学的手法を利用する ことにより、 本発明の D N Aを単離又は合成することができる。
具体的には、 本発明の遺伝子が発現される適当.な植物起源、 具体的にはダイ ンの品種や近縁種を含む R a p h a n u s属の植物又は交配や細胞融合の手法に よりこれらの植物から細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノム D NAが移入さ れたその他の植物、 より具体的にはコセナダイコン、 オダラダイコン、 園紅ダイ コン又はこれらのダイコンの品種や近縁種等の R a p h a n u s属の植物又は交 配や細胞融合の手法によりこれらの植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲ ノム DNAが移入されたブラシカ属の植物から得ることができ、 例えば、 R f遺 伝子の近傍に位置する DNAマーカーを単離し、 この DNAマーカーと R ί遺伝 子の遺伝距離の関係を示したゲノムの地図を作製し、 ゲノムの地図を出発点とし て R f領域のポジショナルクローニング法（クロモゾームウォーキングとも言う） によって、 本発明の遺伝子を単離、 取得できる。
この手法はゲノム DNA上に適当な DNAマーカーを見いだし、 R f遺伝子と DN Aマーカーの遺伝距離を測ることでゲノムの地図を作製することから始める。 DN Aマーカーは父親由来のゲノムと母親由来のゲノムとを識別する必要があり、 一般的には数 1 00 b pの長さからなる。 また DN Aマーカーは遺伝子と同一染 色体上に座乗している必要があり、 遺伝子との距離が近いために遺伝様式がほぼ ^様となるようなもの、つまり遺伝的に強く連鎖しているマーカーほど望ましレ、。
DNAマーカー単離法には、 以前より RF LP法が使われていたが、 近年は P CRを用いた簡便な方法である RAPD法や AF L P (Amplified fragment length polymorphism) 法 (Nucleic Acids Research, 1995, Vol.23, No.21, 4407-4414) が利用されている。特に、 AF L P法は遺伝的に強く連鎖するマ一力 一を得る手段として有効である。マーカーとの遺伝距離を測る材料として、通常、 R f 1遺伝子を持たない劣性ホモ個体と R f 1遺伝子をホモに有する優性ホモ個 体を交配した F1世代を自家受粉して得られる F 2集団や F1世代とこの親である 目的の遺伝子を持たない劣性ホモ個体を交配して得られる BC 1集団を用いるこ とができる。
上記劣性ホモ個体としては、 細胞質雄性不稔系統のダイコンの品種、 近縁種を 含む R a p h a n u s属植物、 より具体的には紬胞質雄性不稔系統のコセナダイ コンゃオダラダイコン、 又は、 コセナダイコン由来の細胞質雄性不稔 （コセナ c m s ) やォグラダイコン由来の細胞質雄性不稔 （ォダラ cm s) が移入されたブ ラシカ属植物、 より具体的には cm sナタネを使用することができる。
上記優性ホモ個体としては、 R f 系統であるダイコンの品種、 近縁種を含む R a p h a n u s属の植物、 より具体的には細胞質雄性不稔回復系統のコセナダイ コン、 オダラダイコン、 園紅ダイコン、 又は、 これらのダイコンの品種や近縁種 を含む R a p a n u s属植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノム D N Aが交配や細胞融合の手法により移入されたブラシカ属の植物、 より具体的には R f ナタネを使用することができる。
これらの両親を交配して得られた F 1世代を自家受粉して得られる F 2集団や、 F 1世代と劣性ホモ個体を交配して得られる B C 1集団は、通常は 1 0 0個体以上、 より好ましくは 1 0 0 0個体以上解析することが望ましく、 個体数が増すほどゲ ノムの地図の精度が上がり、 D N Aマーカーから目的の遺伝子までの物理的距離 が短くなる。 R f遺伝子の場合も同様に、 より物理的距離が短い D NAマーカー を得るこ.とが可能になる。
D N Aマーカーと R f遺伝子の遺伝距離を測る材料としては、 例えば、 c m s 系統コセナダイコン (Raphanus sativus cv. Kosena)と R f 系統である園紅ダイコ ン (Raphanus sativus cv. Yuanhong)とを N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100 : 949-955, 2000に記載の方法に準じ、 交配したダイコン F l世代を自家受粉し て得られる数千個の F 2集団を用いることができる。 これらを解析することによ り、 R f遺伝子を挟むような形で、両側にそれぞれ 0. 2cM程度の遺伝距離で離れた 位置に連鎖する D N Aマーカーを単離することができ、 これにより図 1に示すよ うなマーカーと R f 遺伝子の遺伝距離を示したゲノムの地図を作成することがで きる。
ゲノムの地図作成に続レ、ては、 その位置に対応するゲノム D NAをクローン化 し、 目的の遺伝子を挟む D N Aマーカー間を繋ぐことが必要になる。 通常は D N Aマーカーと目的遺伝子との物理距離が離れているため、 ゲノム D N A靳片を持 つクローンを複数個繋げることによって、 D N Aマーカーから目的遺伝子領域を カバーすることになる。 この D NAマーカー間を、 ゲノム D NA断片を持つクロ ーンで繋ぐ行程がコンテイダの作製である。 R f遺伝子の場合も同様に、 より R f遺伝子に近い位置に存在する D N Aマーカー間を、 R f遺伝子領域をカバーす るように、 ゲノム D NA断片を持つクローンを複数個繋ぐことによってコンティ グを作製することができる。
ゲノム DNA断片をもつクローンの集合体はゲノミックライブラリーを作製す ることで得られる。 通常は、 クローニングできるゲノム DNAの長さによって、 いくつかの種類のベクターが使用され、 例えば、 約 20 k bまでの断片をクロー エングできるラムダファージベクター、 比較的長い断片 （〜40 k b),がクロー ユングできるコスミドベクター、 より長い 100 k b以上の断片をクローニング できる B AC (Bacterial artificial chromosome) ベクター等を利用したライプ ラリーが挙げられる。
いずれのライブラリ一も、 クローニングされた断片の平均長にライブラリーの 集団数を乗じた値が、 ライブラリーに供与されたゲノムの全長 （ゲノムサイズ） に対して 4から 5倍程度の値に成ることが重要である。 ダイコンのゲノムサイズ は約 500Mb pと考えられているので、 ラムダファージべクタ一で平均長 20 13の場合、 集団数は1. 0 105個から 1. 25 X 1 05個となり、 コスミ ド ライブラリーで平均長が 40 k bの場合は、集団数は 5. 0X 104個から 6. 2 5 X 104個となる。ナタネのゲノムサイズは約 1000Mb と考えられている ので、 ラムダファージベクターで平均長 20 k bの場合、集団数は 2. 0 X 105 個から 2. 5 X 105個となり、 コスミドライブラリーで平均長が 40 k bの場合 は、 集団数は 1. 0ズ 105個から 1. 25 X 105僻となる。
ライブラリーに供与するゲノム DNAは、 目的の遺伝子を含む生物からゲノム DNAを常法により抽出すればよい。 R f遺伝子の場合、 R f 系統であるダイコ ンの品種、 近縁種を含む R a p h a n u s属の植物、 より具体的には細胞質雄性 不稔回復系統のコセナダイコン、 ォグラダイコン、 園紅ダイコン、 又は、 これら のダイコンの品種や近縁種を含む R a p h a nu s属植物の細胞質雄性不稔回復 遺伝子を含んだゲノム DN Aが交配や細胞融合の手法により移入されたブラシ力 属の植物、 より具体的には R f ナタネが利用できる。 一般的には、 F 2集団や B C 1集団を作製した時に利用した親と同じ： f 系統の植物からゲノム DN Aを抽 出し、 ゲノミックライブラリーを作製することが最も望ましいと考えられる。 ゲ ノム D NAは C T A B法 (Murray, M. G. and Thompson, W. F. (1980) Nucleic Acids Res. , 8, 4321) のような常法に従い、 調製することができる。
コンテイダの作製は最初に、 R f遺伝子の両側に位置する D NAマーカーを保 持するクローンを単離する。 ゲノミックライブラリ一から、 常法により、 ラムダ ファージライブラリーの場合は、 プラークハイブリダイエーシヨン法を用いて、 コスミドライブラリーと B A Cライブラリ一の場合はコ口ニーハイブリダイゼー シヨン法を用いて単離する。次にその単離したクローンの末端領域を指標にして、 そのクローンに隣接するクローンを単離する事によってコンティグを作製する。 作成後、 コンテイダの塩基配列を、 常法により決定する。
近年のゲノムプロジェクトの進展から、 ゲノム D N Aの塩基配列から機能する 遺伝子を推定する技術が発達してきた。 「GenSCan」に代表される遺伝子発見プロ グラムは、 かなりの確度で遺伝子を推定することができる。 また 「BLAST」 に代表 されるホモ口ジー検索プログラムは、 他の遺伝子やタンパク質の類似性を推定す ることができる。 この様な解析ソフトウェアーを利用して、 目的の遺伝子を推定 し、 単離することが行われている。 R f遺伝子の場合も、 同様にコンテイダのゲ ノム D NA配列を同様の解析ソフトウェアーを利用して、 単離、 同定することが 可能である。 また解析すると、 ゲノム D N A塩基配列上のプロモーター部分、 ィ ントロンを含んだ構造遺伝子部分、 ターミネータ一部分が明示される。 また同時 に、 イントロンを含んだ構造遺伝子に対して、 イントロンが除かれたタンパク質 に翻訳される形の遺伝子とその遺伝子に対するアミノ酸配列が明示される。 この 様にしてコンティグ上の R f遺伝子をかなりの確度で推定することが可能である。 また、 上記解析ソフトを利用し推定された遺伝子配列を元にして、 生体内で目 的のゲノムが実際にはどのような形で発現しているかどうかを確認するために、 mR Aを精製し、これに対する相補 D N A ( c D NA)を単離することで証明できる。 また、どこから転写が開始しているかについては簡便法としては 5' -RACE法と呼ば れる P C Rを応用した方法やより確実にはプライマーイクステンション法や S1マ ッビング法をもちいて解析することで証明することが可能である。 以上の方法は、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual,.. 2nd Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.， 1989.等に記載されている。
上述の手法で推定される塩基配列を元にして、 単離された本発明の遺伝子とし ては、 具体的には、 配列番号 2、 配列番号 1 6、 又は配列番号 1 8で示される D NAが挙げられ、 これにより、 該 D N A配列をもとに、 一般的な遺伝子工学的手 法によって、他の植物起源等から c D N Aを容易に単離することも可能となった。 具体的には、 本発明の遺伝子が発現される適当な植物起源、 具体的にはダイコ ンの品種や近縁種を含む R a p h a n u s属の植物又は交配や細胞融合の手法に よりこれらの植物から細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノム D NAが移入さ れたその他の植物、 より具体的にはコセナダイコン、 オダラダイコン、 園紅ダイ コン又はこれらのダイコンの品種や近縁種等の R a p h a n u s属の植物又は交 配や細胞融合の手法によりこれらの植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲ ノム D NAが移入されたブラシカ属の植物から、 常法に従って c D NAライブラ リーを調製し、 該ライブラリーから、 本発明の遺伝子に特有の適当な D NA断片 をプローブとして、 又は本発明の遺伝子の翻訳産物に対する抗体を用いて所望の クローンを選抜することにより、 本発明の遺伝子に相当する c D NAを単離する ことができる。
上記において、 c D N Aの起源としては、 本発明の遺伝子を発現する各種の細 胞、 組織やこれらに由来する培養細胞が例示される。 また、 これらからの全 R N Aの分離、 m R NAの分離や精製、 c D N Aの取得とそのクローニングなどは ずれも常法に従つて実施することができる。
本発明の遺伝子を c D N Aライプラリーからスクリーニングする方法も、 特に 制服されず、 通常の方法に従うことができる。
ここで用いられるプローブとしては、 本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報 をもとにして化学合成された D N Aなどが一般的に使用できるが、 すでに取得さ れた本発明の遺伝子やその断片も良好に使用できる。 また、 本発明の遺伝子の塩 基配列情報に基づき設定したセンスプライマー、 アンチセンスプライマーをスク リーユング用プローブとして用いることもできる。
前記プローブとして用いられるセンスプライマーとアンチセンスプライマーの ヌクレオチド配列は、 配列番号 3、 配列番号 1 7、 又は配列番号 1 9で示される ァミノ酸配列をコードする D N Aに対応する部分ヌクレオチド配列であって、 少 なくとも 1 5個〜 5 0の連続した塩基、 好ましくは 2 0〜 3 0個の連続した塩基 を有するものが挙げられる。 あるいは前記配列を有する陽性クローンそれ自体を プローブとして用いることもできる。
本発明の遺伝子の取得に際しては、 P C R法による D NA/R N A増幅法や 5 ' - R A C E法等に代表される R A C E法等、 遺伝子の単離に通常用いられる手法 を組み合わせて行えばょレ、。
かかる P C R法の採用に際して使用されるプライマーは、 本発明によって明ら かにされた本発明の遺伝子の配列情報に基づいて適時設定でき、 これは常法に従 つて合成できる。 なお、増幅させた D NA/R NA断片の単離精製は、前記の通り 常法に従うことができ、 例えばゲル電気泳動法などで行うことができる。
また、 上記で得られる本発明の遺伝子あるいは各種 D N A断片は、 常法に従つ て、 その塩基配列を決定することができる。
このようにして得られる本発明の遺伝子によれば、 例えば該遺伝子の一部また は全部の塩基配列を利用することにより、 個体もしくは各種組織における本発明 遺伝子の存在と発現の有無を特徴的に検出することができる。
前述した通り、 本発明の遺伝子としては、 例えば配列番号 3、 配列番号 1 Ί、 又は配列番号 1 9に示されるァミノ酸配列をコードする D N Aを挙げることがで きるが、 特にこれに限定されることなく、 当該遺伝子の相同物も包含される。 ここで遺伝子の相同物とは、 本発明遺伝子 （またはその遺伝子産物） と配列相 同性を有し、 上記構造的特徴、 および上記したようなその生物学的機能の類似性 により一つの遺伝子フアミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、 該遺伝 子の対立遺伝子も当然含まれる。
例えば、 本発明の遺伝子は、 配列番号 1もしくは配列番号 2で示される特定の 塩基配列を有する遺伝子に限らず、 配列番号 3で示した各ァミノ酸残基に対する 任意のコドンを組み合わせて選択した塩基配列を有することも可能である。 同様 に、 配列番号 1 5もしくは配列番号 16で示される特定の塩基配列を有する遺伝 子に限らず、 配列番号 1 7で示した各アミノ酸残基に対する任意のコドンを組み 合わせて選択した塩基配列を有することも可能であり、 配列番号 18で示される 特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、 配列番号 1 9で示した各アミノ酸残基 に対する任意のコドンを組み合わせて選択した塩基配列を有することも可能であ る。 コドンの選択は、 常法に従うことができ、 例えば利用する宿主のコドン使用 頻度などを考慮することができる。
また、 前記の通り、 本発明の遺伝子は、 配列番号 1、 配列番号 2、 配列番号 1 5、 配列番号 16、 配列番号 18又はそれらの一部に示される塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN Aをも包含する。 このような DNAは、 配列番号 1、 配列番号 2、 配列番号 1 5、 配列番号 1 6、 配列番号 18又はそれらの一部に示される塩基配列を有する D N Aと一定以上の 相同性を有する' DN Aである。
上記した一定以上の相同性を有する DN Aとは、 ¾列番号 1、 配列番号 2、 配 列番号 1 5、 配列番号 16、 配列番号 18で示される塩基配列又はそれらの一部 あるいは配列番号 3、 配列番号 1 7又は配列番号 1 9で示されるアミノ酸配列又 はその一部をコードする塩基配列と少なくとも 70%の同一性、 好ましくは少な くとも 90 %の同一性、 より好ましくは'少なくとも 95 %、 さらにもっとも好ま しくは少なくとも 97 %の同一性を有するポリヌクレオチドお びその相補鎖ポ リヌクレオチドを言う。
より具体的には、 例えば、 0. 1%303を含む0. 2 X S SC中 50°Cまた は 0. 1 % S D Sを含む 1 X S SC中 60°Cのストリンジェントな条件下で、 配 列番号 1、 配列番号 2、 配列番号 15、 配列番号 1 6又は配列番号 1 8に示され る塩基配列又はそれらの一部の塩基配列を有する D N Aとハイプリダイズする塩 基配列を有する D N Aを例示することができる。 また、 本発明の D NAのうち、 特に、
配列番号 1又は配列番号 1 5に記載の塩基配列又はその一部において 1から複 数個の塩基が欠失、 付加及び Zまたは置換されている塩基配列を有し、 細胞質雄 性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する D NA；
配列番号 2、 配列番号 1 6又は配列番号 1 8に記載の塩基配列又はその一部に おいて 1から複数個の塩基が欠失、 付加及び Zまたは置換されている塩基配列を 有し、 細胞質雄性不稔個体の不稳性を可稔に回復することに関与する D NA；及 ぴ
配列番号 3、 配列番号 1 7又は配列番号 1 9に記載のアミノ酸配列又はその一 部において 1から複数個のアミノ酸が欠失、 付加及び/または置換されているァ ミノ酸配列を有し、 細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与す るタンパク質をコードする D N A：
については、 化学合成、 遺伝子工学的手法、 突然変異誘発などの当業者に既知の 任意の方法で作製することができる。 例えば、 配列番号 1、 2、 1 5、 1 6、 又 は 1 8に記載の塩基配列またはそれらの一部の塩基配列を有する D N Aを利用し、 これら D N Aに変異を導入することにより変異遺伝子を取得することができる。 変異遺伝子を得るための方法として、 例えばランダム突然変異体、 標的のある 突然変異体、 合成遺伝子を用いた方法など （新遺伝子工学ハンドブック、 実験医 学 別冊、 羊土社、 1996参照） 等の公知の方法を用いることができる。
具体的には、 配列番号 1又は 2の塩基配列又はそれらの一部の塩基配列を有す る D N Aに対し、 変異原となる薬剤と接触作用させる方法、 紫外線を照射する方 法、 遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。 遺伝子工学的手法の一つで ある部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であるこ とから有用であり、 モレキュラークローニング第 2版等に記載の方法に準じて行 うことができる。
( 4 ) 本発明の D N Aを含有するベクター 本発明の D N Aは適当なベクター中に組み込んで組み換えベクターとして使用 することができる。ベクターの種類は発現ベクターでも非発現ベクターでもよく、 目的に応じて選ぶことができる。
クローユングベクターとしては、大腸菌 K12株中で自律複製できるものが好まし く、 ファージベクター、 プラスミドベクター等いずれでも使用できる、 大腸菌の 発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。 具体的には、 ZAP Express〔ストラタジーン社製、 Strategies, 5， 58 (1992)〕、 pBluescrlpt II SK (+)
[Nucleic Acids Research, 17， 9494 (1989) ] 、 Lambda ZAP Π (ストラタジーン 社製）、 I gtlO, X gtll〔D N A Cloning, A Practical APPRoach, 1, 49 (1985)〕、 TriplEx (クローンテック社製）、 λ ExCell (フ了ルマシァ社製）、 pT7T318U (ファ ルマシア社製）、 pcD2 [Mol. Cen. Biol. , 3, 280 (1983)〕 、 pMW218 (和光純薬社 製）、 pUC118 (宝酒造社製）、 pEG400 [J. Bac. , 172, 2392 (1990)〕 、 pQE—30 (QIAGEN 社製)等をあげることができる。
発現ベクターは宿主との組み合わせを考えて選択することができ、 好ましくは 宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、 本発明の 遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌を宿主細胞として用いる場合は、 D N Aを発現させるための発現ベクター は該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、 上記 D 八および転写終結配列よ 構成された組換えべクターであることが好ま しい。 プロモーターを制御する遺伝子^含まれていてもよい。
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、 pBTrP2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもべ 一リンガーマンハイム社より市販）、 pKK233- 2 (Pharmacia社製）、
pSE280 (Invitrogen社製）、 pGEMEX- 1 (Promega社製）、 pQE-8 (QIAGEN社製）、 pQE- 30 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 pKYP200 [Agrc. Biol. Chem.， 48, 669 (1984) ] 、 PLSAl [Agrc. Biol. Chem. , 53, 277 (1989) ] 、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕 、 pBluescrlptll SK+、 pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製）、 pTrS30 (FERMBP-5407) , pTrS32 (FERM BP- 5408)、 pGEX (Pharmacia社製）、 pET- 3 (Novagen社製）、 pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735)、 pSupex, pUB110、 pTP5、 pC194、 pUC18 [Gene, 33, 103 (1985) ]、 pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)〕、 pSTV28 (宝酒造社製）、 pSTV29 (宝酒造社製）、 pUC118 (宝 酒造社製）、 ρΡΑ1 (特開昭 63- 233798)、PEG400〔J. Bacteriol. , 172, 2392 (1990)〕、 pQE - 30 (QIAGEN社製)等を例示することができる。細菌用のプロモーターとしては、 例えば、 trpプロモーター（P trp)、 lacプロモーター（P lac) , PLプロモーター、 PRプロモーター、 PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモー ター、 SP01プロモーター、 SP02プロ ΐ一ター、 penPプロモーター等を挙げること ができる。
酵母用の発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 Ycp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を例示することができる。 酵母用のプロモー ターとしては、例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gallプロモーター、 gallOプロモーター、 ヒートショックタン パク質プロモーター、 F Q; ; [プロモーター、 CUP1 : 口モーター等のプロモーターを 挙げることができる。
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、 pcD N AI、 PcDM8 (フナコシ社より 市販）、 pAGE107 〔特開平 3— 22979 ; Cytotechnology, 3, 133，（1990)〕 、 pAS3 - 3 (特 開平 2- 227075)、 pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)〕 、 pc D N A I/AmP (Invi tr ogen 社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGE103 [J. Blochem. , 101, 1307 (1987)〕、 pAGE210 等を例示することができる。 動物細胞用のプロモーターとしては、 例えば、 サイ トメガロウィルス（ヒ ト CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモーター、 SV40 の初期プロモーター、 .レトロウイ/レスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモ 一ター、 ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等を挙げることができ る。
植物細胞用の発現ベクターとしては、 例えば、 PIG121- Hm [Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995) ] 、 pBI121 〔EMB0 J. 6, 3901 - 3907 (1987)〕 、 pLA llや PLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290) を例示することができる。 また、 特に lOkb以上の長い D NA 断片を植物に導入するときは、 录鎖 D N Aを安定的に保 持 ·導入できるように改良されたべクターの使用が望ましい。 例えば、 pBIBAC2 (Gene 200 (1997) 107- 116)、 pYLTAC7 (PNAS 96 (1999) 6535-6540)や pBIGRZ2 (バイオサイエンスとインダス トリー 55 (1997) 37- 39) があげられる。
植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、力リフラワーモザイクウィルス 3 5 Sプロモーター [Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389- 392〕等が挙げられる。なお、 植物の形質転換についての詳細は別途後述する。
( 5 ) 本発明の D N Aを有する形質転換体
本発明の D N Aを有する形質転換体は、 上記した組み換えベクター （好ましく は発現ベクター） を宿主に導入することにより作製することができる。
細菌の宿主細胞の具体例としては、 Escherichia属、 Corynebacterium属、 Brevibacterium,禺、 Bacillus属、 Microbacterium^^ Serratia属、 Pseudomonas 属、 Agrobacteriumノ禹、 Alicyclobacillus属、 Anabaena鳥、 Anacystis属、 Arthrobacter¾ Azobacter為、 Chromatium属、 Erwinia禹、 Methylobacterium属、 Phormiaium属、 Rhodobactez禹、 Rnodopseudomonas為、 Rhoaospiri丄 lumfe、 Scenedesmun¾、 Streptomycesfe Synnecoccus^^ Zymomonasfe等に ¾する微生物 をあげることができる。 細菌宿主へ糸且換えベクターを導入する方法としては、 例 えば、 カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができ る。
酵母宿主の具体例としては、 サッカロミセス ·セレビシェ（Saccharomyces cerevisae)、 シゾサッカロ セス ·ボンべ (Schizosaccharomyces pombe)、 クリュ ィぺロミセス . ラクチス（Kluyveromyces lactis) , トリコスポロン ·プルランス (Trichosporon pullulans)、 シュヮニオ^セス ·アルビヮス (Schwanniomyces alluvius)等を挙げることができる。
酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、 酵母に D NAを導入する 方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法、 スフエロブラスト法、 酢酸リチウム法等を挙げることができる。
動物細胞宿主としては、ナマルパ細胞、 C0S1細胞、 C0S7細胞、 CH0細胞等を挙げ ることができる。
動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に D N Aを導入 できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクト口ポーレーション法、 リン酸カルシウム法、 リボフヱクシヨン法等を用いることができる。
植物細胞を用レ、た形質転換体については後述する。
( 6 ) 本発明のタンパク質の取得方法
本発明のタンパク質の取得方法は特に限定されない。 本明細書中に開示した配 列番号 3、 配列番号 1 7又は配列番号 1 9に記載したアミノ酸配列又は配列番号 3、 配列番号 1 7又は配列番号 1 9に記載したアミノ酸配列の情報に基づいて得 られる PPRモチーフゃミトコンドリア移行配列を、組み合わせて得られるアミノ酸 配列の情報に基づいて、当業者に一般的遺伝子工学的手法を利用することにより、 本発明のタンパク質を単離、 発現、 又は合成することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする D N Aを単離または合成して、 細胞 に導入することにより発現させることができる。
本発明のタンパク質は、例えば、本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養し、 培養物中に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、 該培養物より該タンパク質を採 取することにより取得することができる。
本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養する方法は、 宿主の培養に用いられ る通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、 酵母菌等の真核生物である場合、 これら微生物を培養する培地は、 該微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩 類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成 培地のいずれでもよい。 培養は、 振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的 条件下で行うことが好ましく、 培養温度は通常 15〜40°Cであり、 培養時間は、 通 常 1 6時間〜 7日間である。 培養中 p Hは、 3 . 0〜9 . 0に保持する。 p Hの 調整は、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモ ユアなどを用いて行う。 また培養中必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイク リン等の抗生物質を培地に添カ卩してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている RPM11640培地 [The Journal of the American Medical
Association, 199, 519 (1967)〕 、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952) ] 、 DMEM培地 [Virology, 8， 396 (1959) ] 、 199培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950) ] またはこれら培地に牛胎児血清等を添 加した培地等が用いられる。 培養は、 通常 p H 6〜8、 3 0〜4 0 °C、 5 % C 02 存在下等の条件下で 1〜 7日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に添カ卩してもよい。
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 M S 培地、 R 2 P培地等、 その植物種に応じて通常用いられる培地が用いられる。 培 養は、 通常 p H 6〜8、 1 5〜3 5 °C等の条件下で 1〜2 1日間行う。 また、 培 養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加 してもよい。
形質転換体の培養物から、 細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復すること に関与する本発明のタンパク質を単離精製するには、 通常のタンパク質の単離、 精製法を用いればよい。
例えば、 本発明のタンパク質が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養 終了後、 細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、 超音波破碎機、 フレ ンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破碎 し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上 清から、 通常のタンパク質の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析 法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルァミノェチル (DEAE)セファロース、 DIAI0N HPA- 75 (三菱化学社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマ 一法、 S- Sepharose FF (フアルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン ¾換クロ マトグラフィ一法、 プチルセファロース、 フエ-ノレセファロース等のレジンを用 いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフイエティー クロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳 動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができる。 また、 該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞 を回収後破碎し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、 通常の方法 により該タンパク質を回収後、 該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶 化する。 該可溶化液を、 タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤 の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 該 タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、 上記と同様の単離精製法により精 製標品を得ることができる。
本発明のタンパク質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場 合には、 培養上清に該タンパク質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収する ことができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理する ことにより可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同様の単離精製法を 用いることにより、 精製標品を得ることができる。
また、本発明のタンパク質は、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシカルポニル法）、 tBoc法 (t一ブチルォキシカルポニル法)等の化学合成法によっても製造すること ができる。 また、 桑和貿易（米国 Advanced Chem Tech社製）、 パーキンエルマージ ャバン（米国 Perkin Elmer社製）、 アマシャムフアルマシアバイオテク（Amer sham Pharmacia Biotech社製)、 "ロカ (米国 Protein Technology Instrument;社製)、 ク ラボゥ（米国 Synthecell-Vega社製〉 、 日本パーセプテイブ · リミテッド（米国 PerSeptive社製）、島津製作所等のぺプチド合成機を利用し合成することもできる。
( 7 ) 本発明の D N Aを有する植物の形質転換体
配列番号 1及び配列番号 1 5に記載された塩基配列は、 植物ゲノム本来の塩基 配列を抜き出した形の塩基配列である。 この塩基配列は、 遺伝子の発現に必要な プロモーターとターミネータ一を作動可能な形で含んでいる。 導入するベクター は、直接導入法の場合は一般的なクローユングベクター、たとえばコスミ ド pWE15 (STRATAGENE社製） などに当該遺伝子をクローユングすることができる。 ァグロ パクテリゥムを利用する場合は、 一般的な植物形質転換用ベクター、 たとえば PBI121 (Clontec社製） などにクローニングすることができる。
また、 この配列 （ゲノム配列） から一部のイントロンを抜き出した塩基配列の D NAや、 ほとんどすべてのイントロンを抜き出した塩基配列の D NA、 配列番 号 2又はその 2 3 8〜2 0 6 4番目の塩基で示される D N'A、 配列番号 1 6又は その 2-3 8〜2 0 6 4番目の塩基で示される D N A、 配列番号 1 8又はその 2 4 4〜2 0 7 3番目の塩基で示される D NA、 あるいは配列番号 3又はその 8 0〜 6 8 7残基に該当する部分、 配列番号 Ϊ 7又はその 8 0〜6 8 7残基に該当する 部分、 又は配列番号 1 9又はその 8 2〜6 9 0残基に該当する部分で示されるタ ンパク質をコードする D N Aを植物細胞に導入してもよい。
ここで、 配列番号 1に記載の塩基配列の 3 7 5 4番目〜 5 0 9 1番目の塩基配 列、 又は配列番号 1 5に記載の塩基配列の 1番目〜 8 1 1番目の塩基配列を有す る D N Aは、 葯で m R NAを転写する能力を有するプロモーターであり、 雄性不 稔性を回復させるのに好ましく用いられる。
さらに、 プロモーターとターミネータ一部分を既知の植物細胞中で機能するプ 口モーターやターミネータ一と置換してもよい。 尚、 上記した配列番号 2又はその 2 3 8〜2 0 6 4番目の塩基で示される D N A、 配列番号 1 6又はその 2 3 8〜2 0 6 4番目の塩基で示される D N A、 配列 番号 1 8又はその 2 4 4〜2 0 7 3番目の塩基で示される D N A、 あるいは配列 番号 3又はその 8 0〜6 8 7残基に該当する部分、 配列番号 1 7又はその 8 0〜 6 8 7残基に該当する部分、 又は配列番号 1 9又はその 8 2〜6 9 0残基に該当 する部分で示されるタンパク質をコードする D NAを植物細胞に導入する場合に は、 この D N Aの他にプロモーターとターミネータ一が必要である。 通常よく使 用される一般的な発 Iベクターとしては、 pBI121 (clonetec社製）が挙げられる力 このベクターはプロモーターに力リフラワーモザィクウィルスの 3 5 Sプロモー ター、ターミネータ一に A. tumefacienceの Tiプラスミドに存在するノパリン合成 酵素のターミネータ一が使用されている。 また発現に必要なプロモーターとして は、上記力リフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモーターに限らずに、植物に 広く存在する r b c Sプロモーター等を用いてもよく、より好ましくは花粉の生育 期に発現する種類のプロモーター例えば TA29プロモーターが、 さらに好ましくは 当該遺伝子の上流に配位された本来のプロモーターが用いられる。 ターミネータ 一についても、 上記ノパリン合成酵素のターミネータ"に限らず、 カリフラワー モザイクウィルスの 3 5 Sターミネータ一等を用いることができ、より好ましくは 当該遺伝子の下流に配位された本来のターミネータ一が用いられる。
加えて、 上記した配列番号 2又はその 2 3 8〜2 0 6 4番目の塩基で示される D NA、 配列番号 1 6又はその 2 3 8〜2 0 6 4番目の塩基で示される D N A、 配列番号 1 8又はその 2 4 4〜2 0 7 3番目の塩基で示される D NA、 あるいは 配列番号 3又はその 8 0〜6 8 7残基に該当する部分、 配列番号 1 7又はその 8 0〜6 8 7残基に該当する部分、 又は配列番号 1 9又はその 8 2〜6 9 0残基に 該当する部分で示されるタンパク質をコードする D NAを用いて、 細胞質雄'性不 稔個体の不稔性を可稔に回復させる目的に使用する場合、 この配列に加え、 ミ ト コンドリァへの移行配列が必要となる。
該ミ トコンドリァへの移行配列としては、 上記配列番号 2の 1〜2 3 7番目の 塩基で示される D N A又は配列番号 3の 1〜7 9番目のアミノ酸配列をコードす る D NA、 上記配列番号 1 6の 1〜2 3 7番目の塩基で示される D N A又は配列 番号 1 7の 1〜7 9番目のアミノ酸配列をコードする D N A、 あるいは上記配列 番号 1 8の 1〜2 4 3番目の塩基で示される D N A又は配列番号 1 9の 1〜8 1 番目のアミノ酸配列をコードする D NA、 その他上述の公知の移行配列等が利用 できる。
本発明者らは以下の実施例において、 配列番号 1に示された、 ゲノムに存在す る本来のプロモーターからターミネータ一までに含まれるイントロンを含んだ R f遺伝子の D N Aを、 本来の形で植物に導入するために、 植物形質転換用べクタ 一を作製した。 コンテイダの一部をなすクローンから配列番号 1に示された塩基 配列を制限酵素によって切り出した後、 適当なクロ一ニングベクターにサブクロ ーンした後、 植物形質転換用ベクター pKM424，pBIGRZ2にサブクローユングした断 片を導入し、 当該断片を植物に導入可能なベクターを得た。 このベクターを植物 形質転換用ァグロバクテリゥムに導入した。 このベクターを保持したァグロパク テリゥムを植物に感染させることによって当該 D N A 断片が植物ゲノム中に組 み込まれる。
本発明の遺伝子が適用される植物は、 例えばナタネ、 ヒマヮリ、 ダイズ、 パ一 ム椰子等の油量作物、 例えばイネ、 トウモロコシ、 コムギ等の禾穀類、 例えば、 タバコ、ペチュニア等の花卉類、例えばトマト、プロッコリー、キャベツ、 白菜、 人参等の各種の野菜類などが例示される。
このうち、 ナタネ、 キャベツ、 白菜、 ブロッコリ一等のブラシカ属の植物ゃト マトなどが好ましく、 特に好ましくは、 ナタネ、 キャベツ、 白菜、 ブロッコリ一 が挙げられ、 最も好ましくは、 ナタネである。
本明細書において、 形質転換植物源としては、 種子、 芽生え、 苗、 カルス、 培 養細胞、 植物体などが挙げられ、 例えば、 ナタネの場合には芽生えまたはプロト プラスト ；ダイズの場合には芽生え、 カルスまたは培養細胞； ヒマヮリの場合に は芽生え；パーム椰子の場合にはカルスまたは培養細胞；イネの場合には、 芽生 え、 カルス、 培養細胞またはプロトプラスト ； トウモロコシには、 芽生え、 苗、 カルス、 培養細胞またはプロ トプラスト ； コムギの場合には、 芽生え、 カルスま たは培養細胞；キャベツ、 ブロッコリ一の場合には、 芽生え、 カルス、 培養細胞 またはプロトプラスト ；エンジンの場合には、 芽生え、 カルス、 培養細胞または プロトプラスト等と言ったように、 当業者が通常行うように、 対象植物によって 適宜好ましい部位を選択して行えばよい。
植物への形質転換法は常法に従って行うことができ、 例えば、 ベクターを一度 ァグロバタテリゥムに導入した後に、 ァグロパクテリゥムを植物細胞に感染させ ることで、 ベクターを植物に導入する方法や、 エレクト口ボーレイシヨン法、 D E A Eデキストラン法、 リン酸カルシウム法、 ポリエチレングリコール法、 パー テイクルガン法などを用いてベクターを細胞へ直接導入する方法等を挙げること ができる。 . 例えば、 ナタネの場合に好ましい遺伝子導入法としては、'下記に記載された方 法が挙げられる。
スクロース等の糖類を炭素源として含んだ MS培地で無菌発芽させたナタネ品 種の下胚軸を 2， 4ージクロロフエノキシ酢酸、 及びスクロースを含む MS培地上 で前培養する。 YEB培地で増殖させたァグロバタテリゥムを遠心により集菌し、ス クロースを含んだ MS培地に再懸濁を行う。 この懸濁液に、 先のナタネ下胚軸を加 え振とうさせた後、 取り出した下胚軸を元の前培養培地に戻し 3日間共存培養し た後、 ゼァチン、 ベンジルアミノプリン等の植物ホルモン、 カルべ-シリン、 及 ぴカナマイシンを含む選択培地に移して選抜を行う。 これにより、得られた緑色 の再生芽を、 ベンジルァミノプリン等の植物ホルモンを任意に含んだ伸長培地、 引き続いてナフタレン酢酸、 ベンジルァミノプリン等の植物ホルモンを任意に含 んだ発根培地で培養することで再生個体を得ることができ、 この個体を c m s系 統の個体と交配することにより、稔性が回復された F 1雑種を得ることができる。 このように植物に本発明の D NAを導入することにより、 細胞質雄性不稔個体 の不稔性を可稔に回復することが可能になる。
尚、 上記再生個体は、 c m s系統のナタネと交配し、 その子孫の稔性を調査す ることで、 発現の確認ができるが、 c m s細胞質を持つナタネを材料として形質 転換を行った場合には、 上記のように根を形成した形質転換体 （再生個体） を通 常の肥料を含む土壌に移し開花させることで、 花粉稔性を調查でき、 時間的にも 操作的にも簡便で好ましい。
また、 上記形質転換において、 用いる細胞として c m s細胞質を有するナタネ の細胞又は組織、 好ましくは胚軸、 子葉、 葉、 花粉、 培養細胞、 カルス、 プロト プラストを利用して上述のように形質転換を行った場合には、 上記の方法で得ら れる植物体 （再生個体） を通常の肥料を含む土壌に移し開花させることで、 花粉 稔性が回復された植物個体を得ることができる。
すなわち、 c m s.細胞を用い、 該 c m s細胞に上述の遺伝子導入法で本発明の D NAを導入し、 該 D N Aが核に組み込まれている細胞をカナマイシ 等の抗生 物質耐性あるいは除草剤耐性選抜マーカーを指標にして選抜した後、 前述のよう な伸長培地及ぴ発根培地で培養することにより該 D N Aが核に組み込まれた植物 体を得ることができる。 この植物体は、 雄性不稔形質が回復され可稔となる。 細胞質雄性不稔回復に関与する遺伝子を検出する方法としては、 請求項 1から 4の何れかに記載の D NAから任意に設定した 15〜50merのオリゴヌクレオチド プライマー、 又は、 請求項 1から 4の何れかに記載の D N Aの全部又は 1部から なる少なくとも 1 5 mer以上のプローブを使用し、 目的の生物試料中に、該プライ マーにより増幅される塩 ¾配列の量、 又は、 プローブにより検出される塩基配列 の量が、 1ゲノム中に 1遺伝子以上あることを確認することにより行うことがで きる。
具体的な確認手法としては、 例えば、 P C R法、 サザンハイブリダィゼーショ ン法などがあげられ、 このうち、 P C R法が好ましい。 これらの手法は、 Molecu 丄 ar Cloning : A laboratory Mannual, 2nd Ed. , Gold Spring Harbor Laborator y, Cold Spring Harbor, NY. , 1989. 以後 "モレキュラークローニング第 2版" と略す） 等に記載されている方法に準じて行うことができる。
1ゲノム中に 1遺伝子以上あることを確認するためには、 P C R法では簡易法 として同じコピー数の D NAを錶型にして、 同程度の増幅が認められることが必 要であり、 より正確には定量 P C R法を用いて、 内部標準として 1ゲノム中に 1 遺伝子存在することがわかっている既知の遺伝子を増幅させる任意のプライマー を用い、 同量の生物試料中に、 この既知の遺伝子の增幅量と該プライマーにより 増幅される塩基配列の量を比較することで ½認できる。 サザンハイブリダイゼー シヨン法では、 当該 D NAが 1ゲノム中に 1遺伝子あることがわかっている稔性 回復系統植物個体の D NAと目的の植物試料の D N Aを等量ずつ比較して、 検出 される D.N Aの量が同じ又はそれ以上であることを確認する。
P C R法に用いるプライマーは、 たとえば配列番号 1もしくは配列番号 2に記 載の D NA配列と同一の、または相補性を有する 15〜50merのオリゴヌクレオチド があげられる。
サザンハイブリダィゼーシヨン法に用いるプローブは、 配列番号 1もしくは配 '列番号 2に記載の D N A配列 ·と同一の 2本鎖 D N Aの全域もしくは少なく'とも 1 5 mer以上のその一部分、または 1本鎖 D N Aまたはその相捕鎖の全域もしくは少 なくとも 1 5 mer以上のその一部分があげられる。また、先に述べたようにプロ一 ブとして使用ずる D N Aの塩基配列と一定以上の相同性を有する D N Aが挙げら れる。 ここで言う一定以上の相同性とは、 例えば 7 0 %以上、 好ましくは 8 0 % 以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9 3 %以上、 特に好ましく は 9 5 %以上、 最も好ましくは 9 7 %以上である。 なお。 ここで言う一定以上の 相同性を有する D N Aとしては、 上記した相同性を有するポリヌクレオチドぉよ びその相補鎖ポリヌクレオチドの両方を包含する。
以上に述べた遺伝子を検出する方法は、 形質転換体において当該 D N Aが組み 込まれているかどうかを確認することだけでなく、 交配により R f遺伝子の導入 を試みた個体においても、 R f遺伝子の有無を確認する手段として用いることが できる。この方法を用いれば、細胞質雄性不稔個体に R f遺伝子を導入した場合、 開花する前に R f遺伝子の有無を確認することが可能である。 また、 通常の細胞 質を持つ個体に R f遺伝子を導入した場合は、 開花時の花粉を細胞質雄性不稔個 体に交配して得られた次世代の個体の稔性を確認しなければならないが、 この方 法を用いることでこれ以前に R f遺伝子の有無を確認できる。 このような利用方 法は、一般的にマーカー D N Aの利用またはマーカー D N A育種と呼ばれている。 R f遺伝子の場合は、 R f遺伝子のマーカー D NA (R f マーカー） としての禾 IJ 用が考えられる。 R f マーカーは、 先に述べたように、 当該 D NAを導入した組 み換え個体や非組み換え体である交配により R f 遺伝子を導入した植物を母本 として用い、 実用品種を育種していく上で、 重要である。
尚、 導入 DN Aが R f遺伝子として機能するかどうかを確認するには、 上述の ように形質転換体の稔性回復を確認することによっても可能であるが、 その他に も、 下記に示すような方法でも行うことができる。
先に述べたように、 R f遺伝子は、 cm s原因タンパク質である ORF 1 25 または OR F 1 38タンパク質のミトコンドリア内の蓄積量を減少させることに より、 植物体の稳性を回復させる。 従って形質転換個体のミトコンドリアにおい て、 ORF 125または OR F 138タンパク質蓄積量の減少を確認することに より、 導入遺伝子が R f遺伝子であることが確認できる。
ミトコンドリアにおける ORF 125または OR F 138タンパク質蓄積量の 減少を確認する方法としては、 本明細書に記述した条件に従ってウェスタンブロ ッティング法により OR F 1 25または ORF 1 38タンパク質を検出した時に、 内部標準として用いるミ トコンドリアゲノム由来のタンパク質に対する抗体、 例 えば、 N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955, 2000に記載されて いる、 抗 F厂 F。ATPase (以下 ATPAと省略） のシグナル量が、 細胞質雄性不稔個体. と、 稔性回復個体または細胞質雄性不稔個体に該 D N Aを導入した形質転換個体 とで等量であって、 かつ、 細胞質雄性不稔個体の OR F 1 25または ORF 13 8タンパク質の蓄積量と比べて、 稔性回復個体または細胞質雄性不稔個体に該 D NAを導入した形質転換個体での蓄積量が 50%より多く減少、 好ましくは 6 0%以上、さらに好ましくは 80%以上減少してい！)ことを確認する方法である。 実際には、 ORF 125を有する細胞質雄性不稔ダイコンのつぼみでは、 稳性 回復遺伝子 R f が導入されると、 ORF 125タンパク質の蓄積量は激減し、 ほ とんど検出されない。 またナタネでは、 細胞質 ORF 125を有する細胞質雄性 不稔ナタネに、 交配により稔性回復遺伝子が導入された稔性回復ナタネのつぼみ では、 ORF 125タンパク質の蓄積量が 80%以上減少していることが観察されて いる。 また、実施例においても、細胞質雄性不稔個体に当該 DN A を導入した形 質転換ナタネのつぼみでは、 ORF 1 25タンパク質の蓄積量が 80%以上減少して いることが観察されている。
尚、 上述の方法における、 ORF 125や ORF 138タンパク質に対する抗 体は、 下記のような一般的な手法を用いることにより得ることができる。 すなわ ち、 抗原としてこれらのタンパク質を動物に免疫することで抗血清が得られ、 さ らに proteinAを結合したァフィ二ティーカラムを用いることでィムノグロブリン G抗体を精製することが出来る。 用いる抗原としては、 発現している細胞質雄性 不稳植物やこの培養細胞から、 定法によりタンパク質を精製する事で得られる。 また、 ORF 125や ORF 138遺伝子を発現ベクターに繋いで、 大腸菌ゃ酵 母において発現させ、 同様に精製することで得られる。 さらには、 ORF 1 25 や ORF 1 38の全長もしくは一部分を化学合成したペプチドも抗原としてもち いる事ができる。 ATPAに対する抗体も同様の手法で得ることができる。
さらに、 cms細胞質を有し、 かつ、 本発明の DN Aを有する細胞に、 さらに 誘導型プロモーターと共に本発明の遺伝子の一部又は全部を導入することで、 本 発明の DNAの発現を特異的にしかも一時的に制御することで、 ハイブリッド種 子生産に必要な雄性不稔性維持系統 （維持系統） を必要としない新しいハイプリ ッド種子生産システムを作ることができる。
すなわち、 通常、 cms系統のナタネは不稔であるため、 cms系統を増殖、 維持するためには、 別途、 cms及び R ίが関与していない維持系統というもの が必要であり、従来、ハイプリッド種子の生産のためには R f 系統、 cms系統、 維持系統という 3つの系統の植物を必要としたが、 本発明により、 R i遺伝子が 単離 ·同定されたため、 ハイプリッド生産の際に、 化学物質によるプロモーター の誘導を行い、 回復遺伝子の発現を制御する方法を用いることにより、 維持系統 が無くとも増殖、 維持が可能となる c m s系統が構築できる。
具体的には、 外部から誘導するプロモーター、 例えば、 薬剤感受性のあるプロ モーターを有するベクターに、 本発明の遺伝子の一部または全長をアンチセンス あるいはセンスの向きで組み込み、 該ベクターを用いて、 cms細胞質を有し、 かつ、 本発明の DN Aを有する細胞を形質転換する。 cms細胞質を有し、 かつ、 本発明の DNAを有する細胞としては、 上述の方 法に従い、 c m s細胞質を有する細胞を本発明の DNAで形質転換したものだけ でなく、 （ 111 3系銃と1 f 系等を交配して得られたものでもよい。
上述の誘導可能なプロモーターとしては、 例えば、 特開平 6— 46697号公 報で知られており、 ベクターの作成及び形質転換の方法としては上述と同様の手 法が挙げられる。
上記方法により得られる cm s細胞質を有し、 かつ、 本発明の DNAを有する 細胞であって、 さらに誘導型プロモーターと共に本発明の DNAの一部又は全部 が組み込まれた形質転換体は、通常、プロモーターが誘導されていないため、元々 存在する R f 遺伝子により植物は可稔性を示し、 該系統の維持も自家受粉により 行うことができるが、 ハイブリッド生産の際には、 この植物にプロモーターを誘 導させる能力を有する化学物質を作用させ、 プロモーターが誘導されることによ り R f遺伝子の発現が阻害される。これにより、その植物は雄性不稔となるため、 ハイブリッド種子生産時に cms系統として使用することができる。 . 従って、 この方法を用いることで、 cms系統であっても増殖、 維持が自家受 粉で行えることになるので、 従来はハイプリッド種子の生産のために 3つの系統 が必要であったものが、 維持系統は必要なくなり、 生産コストを大幅に減少させ ることが可能になる。
なお、 本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願 2001- 12800 8号、 特願 2001-202082号及ぴ特願 2002— 20083号の各明細 書に開示した内容は全て引用により本明細書に開示したものとする。
以下、 実施例について更に詳しく説明するが、 本発明はこれらの実施例によつ て何ら限定されるものではない。 実施例
実施例 1 ：細胞質雄性不稔回復遺伝子に連鎖する DN Aマーカーの単離
地図の作製 ' 稔性回復遺伝子 （R f遺伝子） を単離するために、 まず、 R f遺伝子の近傍に 位置する DNAマーカーを単離し、 この DNAマーカーと R f遺伝子の遺伝距離 の関係を示したゲゾムの地図を作製する必要がある。 それの出発点として R f領 域のポジショナノレクローニングを行った。
DNAマーカー単離法には、 AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 法（Nucleic Acids Research, 1995, Vol.23, No.21 4407-4414) に準じた、 G I BCO BRL社の AFLP An a l y s i s S y s t em I AFLP S t a r t e r P r i me r K i tに従って A F L Pを行つ た。 マーカーとの遺伝距離を測定する材料として、 c m s系統コセナダイコン (Raphanus sativus cv. Kosena)の 1個体 （ （KC 2/KA1) -1) と R f 系統で ある園紅ダイコン（Raphanus sativus cv. Yuanhong)の 1個体（Yu a n l O— 3) とを N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100 :949 - 9552000に記載の方法に準 じ、交配したダイコン F1世代 8個体を自家受粉して得られた約 2100個体の F 2集団を用いた。 その結果、 R f遺伝子を挟むような形で、 両側にそれぞれ 0.2 〜0.3cMの遺伝距離で離れた位置に連鎖するマーカーを 5つ単離した。各 DNAマ 一力一と R f遺伝子の遺伝的距離を示したゲノムの地図を図 1に示す。 実施例 2 ：ゲノム地図を基にしたコンティグの作製と R f遺伝子の解析
ゲノム地図作成に続いてはその位置に対応するゲノム DN Aをクローン化し、 R i遺伝子を挟む DNA マーカー間を繋ぐ事が必要になる。 ここで、 DNAマー カーと R f遺伝子との距離が離れているため、 ゲノム DNA断片を持つクローン を複数個繋げる事によって、 DNAマーカー間をカバーする R f遺伝子領域のコ ンティグを作製した。
ゲノム DNA断片をもつクローンの集合体をゲノミックライブラリーといい、 我々は 2種類のライブラリーを作製した。 DNA供与体として、 F2集団を作製 した時に利用した回復系統の親と同じ園紅ダイコンより、 常法に従い、 CTAB法 (Murray, M. G. and Thompson, W. F. (1980) Nucleic Acids Res.， 8， 4321) によりゲノム D NAを調製した。ライブラリ一は、ラムダベクターとして A DASHII ベクター （STRATAGENE社製） を用いて、 平均長 20kb、 集団数 1. 5 X 105個のラムダ ファージライブラリ一を作製した。 また、 コスミ ドベクターとして pWEB: : TNCベタ ター（EPICENTRE TECHNOLOGIES社製）を用いて、 平均長 40kb、 集団数 5. 5 X 104個の コスミ ドライブラリーを作製した。
コンテイダの作製は最初に、 R f 遺伝子の両側に位置する D NAマーカーを指 標に、 上記で作製したラムダファージライブラリーから、 プラークハイブリダィ ゼーシヨン法を用いて、 ラムダクローンを単離した。 またコスミドライブラリー から、 コロニーハイブリダィゼーシヨン法を用いてコスミ ドクローンを単離し、 図 1に示すような両端の D N Aマーカー間をカーパーするコンティグを完成した。 コンティグの一部を成すコスミドクローン NIT7/2と T03- 2は常法により、塩基配列 を決定した。
続いて、上記コンテイダの一部を成すコスミドクローン NIT7/2と T03- 2の塩基配 列を、 「Genscan」 (三菱スペースソフトウェア社製） を用いて、 ダイコンとゲノ ム D N A 配列が似通つており、最近全ゲノム配列が決定されたシロイヌナズナに 対するパラメーターを加味して解析した。 その結果、 R f遺伝子を発現すると思 われるプロモータ一部分とイントロンを含んだ構造遺伝子部分とターミネータ一 部分を発見した。 さらに、 イントロンが除かれたタンパク質に翻訳される形の遺 伝子とその遺伝子に対するァミノ酸配列を得た。 実施例 3 ：ゲノミック D NA領域のサブクローニング
「Genscan」 で推定されたプロモーターからターミネータ一を十分に含む、配列 番号 1に記載された 1〜8553の塩基配列からなる D N Aの Hpal- Swal断片（8546bp) を、フラグメント回収用ァガロース（FMC社製）を用いたゲル電気泳動によりべクタ 一と分離した。 D N A断片を含むゲルをゲル分角军酵素（Epicentre Technologies 社製）により消化して D NAを回収した。 さらに、 得られた断片を制限酵素 BamHI により切断したクローニング断片を得た。 これら D NA断片を、 pGEM- T easyベタ タ一（Promega社製）にサブク口一-ングして、 cds6BT/pGEM- T easyを得た。 以下、 詳細に記述する。
100 1の 1XK制限酵素緩衝液（20mM Tris- HCl(pH8.5)， 10mM MgCl2, ImM Dithiothreitol, lOOmM KC1)中に、 1 μ gの NIT7/2コスミド DNAと 10 unitの制 P艮酵素 Hpal (宝酒造社製） を加え、 37°Cにて 1時間加温した。
加温後、 l-θμΐの 3M酢酸ナトリゥム（ρΗ5.6)と 250μ 1のエタノールを加えて攪拌 後、 - 80°Cにて 5分間冷却して、 15000i"pm、4°Cで 15分間遠心する。 上清を除き、 さ らに lmlの 70%エタノールを静かに加え、 15000rpm、4°Cで 5分間遠心する。上清を除 き、 遠心真空乾燥機を用いて、 沈殿を 5分間乾燥させる。 回収した DNA沈殿に、 滅菌水 89 μ 1を加えて溶かす。
溶かした DN Α溶液に、 10μ 1の 10XH制限酵素緩衝液（500mMTi"is-HCl(pH7.5), lOOmM MgCl2, lOmM Dithiothre tol, lOOOmM NaCl)、 1 1の lOunit/ 1制限酵素 Swal (宝酒造社製） を加え、 25°Cにて 1時間加温した。 11 μ 1の 10 X loading緩衝液 (1% SDS, 50% Glycetrol, 0.05% Bromophenol Blue)を加えた。
1.2gの低融点ァガロース SeaPlaqueGTG agarose (FMC社製） と、 150ml の IX TAE(40mM Tris- acetate, ImM EDTA) 緩衝液を混和後、 100°Cに加熱してァガロー スを溶かし、 45°Cまで攪拌しながら冷却した。 14 X 15cmのゲルトレイに 30mm幅 X lmm厚のコームを設置し、 冷却したゲルを流し込み固めた。 ゲルコームに loading Dyeを加えた DNAを流し込み、 1 XTAE、 30V/30cmの電圧で 18時間電気泳動した。 電気泳動したゲルを、 0.5μ§/ιη1 ェチジゥムプロミド Z1XTAE溶液に移し、 30 分染色した。ゲルを 365nmの長波紫外線を放射したトランスイルミネーターの上に 乗せ、 目的の 8546bpの断片を、 滅菌したメスを用いて切り出した。 さらにゲルを 約 1腿角の断片になるように刻み、 あらかじめ秤量した 2mlのマイクロチューブに 移し、 ゲルの重さを枰量した。
ゲルの重さ 50mgに対して; 1 の 50 XGELase Buffer (2M Bis- Tris (pH6.0)， 2M NaCl) を加えた。 ゲルの入ったチューブを 68°Cに加温したドライヒートブロック に入れ、 時々チューブを上下にしながら攪拌し、 10分間加温して、 ゲルを完全に 溶かした。 このチューブを 45°Cのドライヒートブロックに移し、 時々チューブを 上下にしながら攪拌し、 5分間加温した。 このチューブに、 ゲルの重さ 200mgに対 して lunitの GELase (Epicentre Technologies社製）を加えて 45。Cのドライヒート ブロックで、 時々チューブを上下にしながら攪拌し、 30分間加温した。
ゲル容積に対して、 1/3容量の 10M酢酸アンモニゥム（pH7.0)を加え攪拌し、 15000rpm, 5分間遠心した。 上清を新しい 2mlのマイクロチューブに移し、 上に対 して 2容量のェ.タノールを加えた。チューブを攪拌後、 15000rpm、4°Cで 20分間遠 心した。上清を除き、 さらに lmlの 70%エタノールを静かに加え、 15000rpm、4°Cで 5 分間遠心した。 上清を除き、 遠心真空乾燥機を用いて、 沈殿を 5分間乾燥させた。 沈殿に 20 1 の TE緩衝液（10mM Tris- HCl(pH8.0)， ImM EDTA)を加え、 完全に溶か し、 DNA断片を回収した。 .
回収した 20μ1の DNA溶液に、 10 1の10 1(制限酵素緩衝液（200 Tris-HCl (pH8.5), lOOmM MgCl2, lOmM Dithiothreitol, lOOOmM KC1)、 68^1 の dH20、 2 μΐの 10 ^1の制限酵素83111111 (宝酒造社製） を加え、 30°Cにて 1時間加温し た。 加温後、 10 1の 3M酢酸ナトリウム（pH5.6)と 250 1のエタノールを加えて攪 拌後、 - 80°Cにて 5分間冷却して、 15000rpm、4°Cで 15分間遠心する。 上清を除き、 さらに lmlの 70°/。エタノールを静かに加え、 15000rpm、4°Cで 5分間遠心する。上清を 除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を 5分間乾燥させる。回収した DNA沈殿に、 滅菌水 20 1を加えて溶かす。 55μ1の滅菌水、 10 1の1(^ PCR 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl (pH8.3), 500mM KC1) 、 6μ 1の 25mM MgCl2、 8 1の 2.5mM dNTP mix、 1 Julの5unit/μlのrTaqDNA polymerase (宝酒造社製） を加えて混和後、 72°C で 30分間加温して、 3'末端に dATPを付加した。
限外ろ過フィルターユニット： Microcon- 50 (ミリポア社製） に、 上記反応液を 移し、 5000rpm、4°Cで 20分間遠心した。 トラップの水を捨て、再度 ΙΟΟμΙの滅菌水 を加えて、 5000rpm、4°Cで 20分間遠心した。 20^ 1の TE緩衝液 (lOmM
Tris-HCl (pH8.0) , lmM EDTA) を加え、 フィルターユニットを取り外し、 向きを逆 さにして新しいマイクロチューブに装着した。 3000rpm、4°C、 5分間遠心して、 フ ィルターユニットの D N A を回収した。
上述の方法で得られた 5 μ 1の精製された DNAに、 の 50ng/ /i l pGEM-T easy ベクター （Promega社製） 、 6 μ 1 の D NA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製）の I 溶液を混和後、 16°Cで 30分間ィンキュベートした。
限外ろ過フィルターユニット： Microcon- 50 (ミリポア社製） に、 上記反応液を 100 1の滅菌水とともに移し、 5000rpm、4°Cで 20分間遠心した。 トラップの水を捨 て、再度 100 1の滅菌水を加えて、 5000rpm、4°Cで 20分間遠心した。 フィルターュ ニットを政り外し、 向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。
3000rpm、4°C、 5分間遠心して、 フィルターユニッ トの D N A を回収した。 回収した D N Aをチューブごと氷上に立て冷却した。 30 μ 1のエレクト口ポレー シヨン用大腸菌 DH10B (Gibco BRL社製） をチューブに入れ、 軽く混ぜた。 予め氷 上で冷やしたエレクトロポレーション用 （電極間隔 lmm) キュベット（USA
Scientific Plastics社製）に、 D N Aと混和した大腸菌を移した。 Electro Cell Manipulator 600 (BTX社製）を用いて、 1. ¾kv、 129 Ω、 50 μ Fの条件でエレク ト口 ポレーシヨンを行い、 その後直ちに 37°Cに温めた 500 1の S0C培地（Gibco BRL社 製）をキュベットに加えた。 大腸菌を 10mlの培養チューブに移し、 37°Cで 1時間振 とう培養した。 100 /i g/ndの Ampiciline (和光純薬社製）、 20 μ g/mlの X- Gal (宝酒造 社製）、 ImMの IPTG (宝酒造社製）を加えた LB寒天培地（lfl/。Bacto- Tryptone,
0. 5%Bacto-Yeast Extract, l%NaCl, 1. 5% Bacto- Agar)に、培養した大腸菌を拡げ、 18時間以上 37°Cで培養した。
寒天培地上に現れた白いコロニーを、 lOO ^u g/mlの Ampicillinを加えた 2mlの LB 培地にて、 37°Cで 18時間以上培養した。 培養した大腸菌から、 定法によりプラス ミ ド D N Aを抽出した。 プラスミド D NAに目的の断片がクローニングされてい ることを制限酵素 EcoRI (宝酒造社製）で切断して確認して、 cds6BT/pGEM-T easy を得た。
上述の方法で得た cds6BT/pGEM- T easyを保持したそれぞれの大腸菌 DH10Bを、 ' lOO /z g/mlの Ampicillinを加えた 100mlの LB培地にて、 37°Cで 18時間培養した。 ァ ルカリ SDS法により、 Qiagen Midiキット （キアゲン社製). を用いて精製した。 実施例 4一 1 ：植物形質転換用ベクターの作製（1)
cds6BT/pGEM-Teasyを制限酵素 EcoRIで切断後、 フラグメント回収用ァガロース を用いたゲル電気泳動によりベクターと分離し、 回収された D N A断片を植物形 質転換用ベクター pKM424 (pKM424に CaMV35Sプロモーター： GUS gene： N0Sターミ ネーターの断片を加えたベクターが pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286- 290ベクター） の EcoRI部位にクローニングして、 植物形質転換用ベクター cds6BT/pKM424とした。 以下に詳細を示す。
100 μ 1の 1 Χ Η制限酵素緩衝液 (50mM Tris-HCl (pH7. 5)， 10mM MgCl2, ImM Dithiothreitol, lOOmM NaCl)中に、 1 μ gの cds6BT/pGEM- T easy D N Aと 10 unit の制限酵素 EcoRI (宝酒造社製） を加え、 37°Cにて 1時間加温した。
以下、 上記の Hpal- Swal断片を取り出した同様の方法で、 cds6BT/pGEM- T easy から cds6BTを含む EcoRI断片を分離回収した。 .
100 1の1ズ11制限酵素緩衝液（501111 72 3-11(]1 ( 117. 5) , lOmM MgCl2, ImM Dithiothreitol, lOOmM NaCl)中に、 1 μ gの植物形質転換用ベクター pKM424と 10 unitの制限酵素 EcoRI (宝酒造社製） を加え、 37°Cにて 1時間加温した。 加温後、 100 i l (D IM Tri s- HCl (pH8. 0)と、 1 unitの Bacterial Alkaline Phosphatase (宝 酒造社製）を加えて混和後、 50°Cで 1時間加温して脱リン酸ィヒした。
200 μ 1の ΤΕ緩衝液 (10mM Tris-HCl (pH8. 0) , ImM EDTA)で飽和したフエノール · クロ口ホルムを加え、激しく攪拌した。 15000rpm、 5分間遠心後、上清を新しいチ ユーブに移す。 同様の操作をもう一度繰り返し、 タンパク質を取り除いた。 20 l の 3M酢酸ナトリゥム（pH5. 6)と 500 μ 1のエタノールを加えて攪拌後、 - 80°Cにて 5 分間冷却して、 15000rpm、4°Cで 15分間遠心した。 上清を除き、 さらに lmlの 70%ェ タノールを静かに加え、 15000rpm、4°Cで 5分間遠心した。 上清を除き、遠心真空乾 燥機を用いて、 沈殿を 5分間乾燥させた。 沈殿に 100 ^ 1の TE緩衝液（10mM
Tris-HCl (pH8. 0) , ImM EDTA)を加え、 完全に溶かし、 lOng/ ^u 1の濃度とした。 10 1の精製された EcoRI断片、 1 1の脱リン酸化された pKM424ベクター、 11 の D N A Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） I溶液を混和後、 16°Cで 30分間インキ ュベートした。
限外ろ過フィルターユニット： Microcon- 50 (ミリポア社製） に、 上記反応液を 100 μ 1の滅菌水とともに移し、 5000rpm、4°Cで 20分間遠心した。 トラップの水を捨 て、再度 100 ^ 1の滅菌水を加えて、 5000rpm、4°Cで 20分間遠心した。 フィルターュ ニットを取り外し、 向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。
3000rpm、4°C、 5分間遠心して、 フィルターュニットの D N A を回収した。 回収した D N Aをチューブごと氷上に立て冷却した。 30 μ 1のエレクトロポレー シヨン用大腸菌 DH10B (Gibco BRL社製） をチューブに入れ、 軽く混ぜた。 予め氷 上で冷やしたエレクト口ポレーシヨン用 （電極間隔 lmm) キュべッ小（USA
Scientific Plastics社製）に、 D N A と混和した大腸菌を移した。 Electro Cell Manipulator 600 (BTX社製）を用いて、 1. 25kv、 129 Ω、 50 μ Fの条件でエレク ト口 ポレーシヨンを行い、 その後直ちに 37°Cに温めた 500 1の S0C培地（Gibco BRL社 製）をキュベットに加えた。 大腸菌を 10mlの培養チューブに移し、 37°Cで 1時間振 とう培養した。 SO ^ g/mlの Spectinomycin (Sigma社製）を加えた LB寒天培地
(l%Bacto-Tryptone, 0. 5%Bacto-Yeast Extract, l%NaCl, 1. 5% Bacto-Agar)に、 培養した大腸菌を拡げ、 18時間以上 37°Cで培養した。
寒天培地上に現れたコロニーを、 SO ^ g/mlの Spectinomycinを加えた 2mlの LB 培地にて、 37°Cで 18時間以上培養した。 培養した大腸菌から、 定法によりプラス ミ ド D N Aを抽出した。プラスミ ド D N Aに BamHI部位から Hpal部位がクローニン グされていることを制限酵素 Hindlll (宝酒造社製）で切断して確認し、
cds6BT/pKM424とした。
cds6BT/pKM424を保持した大腸菌 DH10Bを、 50 μ g/mlの Spectinomycinを加えた 250mlの LB培地にて、 37°Cで 18時間培養した。アルカリ SDS法により、 Qiagen Midi キット （キアゲン社） を用いて精製した。 実施例 4—2 ：植物形質転換用ベクターの作製（2 )
配列番号 1に記載の塩基配列を十分に保持するラムダクローン CHI (図 2参照、 クローニング断片長約 17kb) をマルチプルクローニング部位に存在する制限酵素 Notl (宝酒造社製） で切断後、 フラグメント回収用ァガロースを用いたゲル電気 泳動によりベクターと分離し、 回収された D N A断片を植物形質転換用ベクター PBIGRZ2 (バイオサイエンスとインダストリ一 55 (1997) 37-39) の Notl部位にク口 一ユングして、 植物形質転換用べクタ一 CHI/PBIGRZ2とした。 以下に詳細を示す。
100； u+1の 1 XH制限酵素緩衝液 (50mM Tris- HC1 (pH7. 5) , 10mM MgC12， ImM Dithiothreitol, lOOmM NaCl, 0. 01% BSA, 0. 01% TritonX_100)中に、 l ^u g のラ ムダクローン CHI D N Aと 10 unitの制限酵素 Notl (宝酒造社製） を加え、 37°Cに て 1時間加温した。 以下、 上記の Hpal-Swal断片を取り出した同様の方法で、 ラム ダクローン CHIの Notl断片を分離回収した。
100 μ 1の 1 ΧΗ制限酵素緩衝液 (50mM Tris-HCl (pH7. 5) , lOmM MgCl2, ImM, Dithiothreitol, lOOmM NaCl, 0. 01% BSA, 0. 01% TritonX - 100)中に、 l gの植物 形質転換用ベクター PBIGRZ2と 10 unitの制限酵素 Notl (宝酒造社製）を加え、 37°C にて 1時間加温した。加温後、 100 μ 1の IM Tris- HCl (pH8. 0)と、 1 unitの Bacterial Alkaline Phosphatase (宝酒造社製）を加えて混和後、 50°Cで 1時間加温して脱リン 酸化した。
200 μ 1の ΤΕ緩衝液 (lOmM Tris-HCl (pH8. 0) , ImM EDTA)で飽和したフエノール · クロロホルムを加え、激しく攪拌した。 15000rpm、 5分間遠心後、上清を新しいチ ュ一ブに移す。 同様の操作をもう一度繰り返し、 タンパク質を取り除いた。 20 1 の 3M酢酸ナトリゥム（pH5. 6)と 500 μ 1のエタノールを加えて攪拌後、 - 80°Cにて 5 分間冷却して、 15000rpm、4°Cで 15分間遠心した。 上清を除き、 さらに lmlの 70%ェ タノールを静かに加え、 15000rpm、4°Cで 5分間遠心した。 上清を除き、遠心真空乾 燥機を用いて、 沈殿を 5分間乾燥させた。 沈殿に ΙΟΟ μ Ιの TE緩衝液 (10mM
Tris-HCl (pH8. 0) , ImM EDTA)を加え、 完全に溶かし、 lOng/ μ 1の濃度とした。
10 の精製された Notl断片、 Ι μ ΐの脱リン酸化された pBIGRZ2ベクター、 Ιΐ μ ΐ の D N A Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） I溶液を混和後、 16°Cで 30分間ィ'ンキ ュベー卜した。
限外ろ過フィルターユニット： Microcon- 50 (ミリポア社製） に、 上記反応液を ΙΟΟ μ Ιの滅菌水とともに移し、 5000rpm、4°Cで 20分間遠心した。 トラップの水を捨 て、再度 100 μ 1の滅菌水を加えて、 5000rpm、4°Cで 20分間遠心した。 フィルターュ ニットを取り外し、 向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。
3000rpm、4°C、 5分間遠心して、 フィルターユニットの D N A を回収した。
回収した D N Aをチューブごと水上に立て冷却した。 30 μ 1のエレクトロポレー シヨン用大腸菌 DH10B (Gibco BRL社製） をチューブに入れ、 軽く混ぜた。 予め氷 上で冷やしたエレクト口ポレーシヨン用 （電極間隔 Iran) キュベット（USA
Scientific Plastics社製）に、 D N A と混和した大腸菌を移した。 Electro Cell Manipulator 600 (BTX社製）を用いて、 1. 25kv、 129 Ω、 50 μ Fの条件でエレク ト口 ポレーシヨンを行い、 その後直ちに 37°Cに温めた 500 1の S0C培地（Gibco BRL社 製）をキュベットに加えた。 大腸菌を 10mlの培養チューブに移し、 37°Cで 1時間振 とう培養した。 25 /^ 1の Kanamycin (和光純薬社製） を加えた LB寒天培地 (l Bacto-Tryptone, 0. 5°/。Bacto- Yeast Extract, l%NaCl, 1. 5% Bacto- Agar)に、 培養した大腸菌を拡げ、 18時間以上 37°Cで培養した。
寒天培地上に現れたコロニーを、 25 z g/mlの Kanamycinを加えた 2mlの LB培地に て、 37°Cで 18時間以上培養した。 培養した大腸菌から、 定法によりプラスミド D' NAを抽出した。 プラスミド D NAに目的の断片がクローユングされていること を制限酵素 Hindlll (宝酒造社製）で切断して確認し、 CHI/pBIGRZ2とした。
CHI/pBIGRZ2を保持した大腸菌 DH10Bを、 25 μ g/mlの Kanamycinを加えた 250mlの LB培地にて、 37°Cで 18時間培養した。 アルカリ SDS法により、 Qiagen Midiキット (キアゲン社） を用いて精製した。 実施例 5 ：ァグロバタテリゥムへの植物形質転換用ベクターの導入
ァグロバタテリゥムのコンビテントセルを調製し、 実施例 4一 1及ぴ 4— 2で 得られた cds6BT/pKM424ベクター及び CHI/pBIGRZ2ベクターのそれぞれを、 調製し た植物形質転換用ァグロバタテリゥム EHA101に導入した。 以下、 詳細に示す。 ァグロパクテリゥム EHA101のエレクトロポレーシヨン用コンビテントセルを以 下の方法で作製した。 ァグロバクテリウム EHA101を、 50 g/ml Kanamycin (和光 純薬社製） ， 25 M g/ml Chloramphenicol (和光純薬社製） を加えた LB寒天培地上 でストリークして、 28°Cで 24時間以上培養し、シングルコロニーを得た。 50 g/ml Kanamycin, 25 μ g/ml Chloramphenicolを加えた LB培地 20mlを 50ml遠心管に入れ、 直径 liiim程度のコロニーを植菌し、 28°Cで 40時間振とう培養した。 40時間後、遠心 管の蓋を一度開閉して、 さらに 4時間同様に培養した。培養液を 1500 X g, 4°Cで遠 心して集菌した。上清を捨てたチューブに 40mlの氷冷した滅菌 10%グリセロールを 入れ、'菌体を再懸濁し、 1500 X g, 4°Cで遠心して集菌した。 この操作を 2回繰り返 した。 得られた菌体に氷冷した 500 μ 1の滅菌 10%グリセロールを加え、 再懸濁し た。 滅菌したマイクロチューブに 100 1ずつ菌体を分注し、 液体窒素で凍結後、 - 80°Cフリ一ザ一に保存した。
ァグロバタテリゥム EHA101のエレクトロポレーション用コンビテントセルを氷 水上で溶かした。予め冷やした 1. 5mlチューブに 40 μ 1のエレクトロコンビテント セルを入れ、 それぞれ 100ngの cds6BT/pKM424又は、 CHI/PBIGRZ2のプラスミ ド D N Aを加えて軽く混和した。
予め氷上で冷やしたエレクトロポレーシヨン用（電極間隔 1腿）キュべット（USA Scientific Plastics社製）に D N A と混和したァグロバタテリゥムを移す。 Electro Cell Manipulator 600 (BTX社製）を用いて、 1. 44kv、 129 Ω、 50 μ Ρの条件 でエレクト口ポレーシヨンを行い、 その後直ちに 30°Cに温めた 1の S0C培地 (Gibco BRL社製）をキュべットに加えた。 ァグロパクテリゥムを 10mlの培養チュ ーブに移し、 30°Cで 1時間振とう培養する。
cds6BT/pKM424ベクターを導入したァグロバタテリゥムは 50 g/ml Kanamycin (和光純薬社製） ， 25 μ g/ml Chloramphenicol (和光純薬社製） , 50 μ g/ml Spe tinomycin (Sigma社製）， 2. 5 μ g/ml Tetracycline (Sigma社製）を加えた LB寒天 培地 ( 1 °/o Bacto-Tryptone, 0. 5% Bacto - Yeast Extract, l°/oNaCl, 1. 5% Bacto-Agar) に、 培養したァグロバタテリゥムを拡げ、 24時間以上 28°Cで培養した。
CHI/pBIGRZ2ベクターを導入したァグロパクテリゥムは 50 ^ g/ml Kanamycin (和 光純薬社製） ， 25 §/ΠΙ1 Chloramphenicol (和光純薬社製） ， 30 μ g/ml
Hygromycin(Sigma社製）を加えた LB寒天培地に、培養したァグロバタテリゥムを拡 げ、 24時間以上 28°Cで培養した。
寒天培地上に現れたコロニーを、 それぞれのベクターごとに適合した上記の抗 生物質を加えた 2ml の LB培地にて、 30°Cで 24時間以上培養した。 培養したァグロ バタテリゥムから、定法によりプラスミド D N Aを抽出し、 cds6BT/pKM424ベクタ 一もしくは CHI/pBIGRZ2ベクターがァグロパクテリゥムに導入されていることを 制限酵素 Hindlll (宝酒造社製）で切断して確認した。 確認されたクローンは、 24 時間培養した培養液に滅菌 80%グリセ口ールを等量カ卩えて混和後、_80°Cに保存し、 ナタネの形質転換に用いた。 実施例 6 ：ナタネ形質転換体の作製
ナタネへの形質転換は以下のように行った。 ダイコン由来の cms原因遺伝子 orf 125をもつ CMSナタネ （SW18) の種子を 1 0 %の次亜塩素酸溶液で滅菌処理し、 ホルモンを含まない MS培地（T. Murashige and F. Skoog Physiol. Plant. 15： 485, 1962) で発芽させた。 発芽後 7日- 1 4日の幼植物から胚軸部分だけを切り 取り 3 _ 5 mmの長さに切り分け、 M S培地 （シグマ社 M 5 5 1 9 ) +しょ糖 3 % + 2 . 4 - D lmg/l、 ァガロース （シグマ社、 typel) 0 . 4 %で 2 3度、 1 2〜1 6時間前培養した。 このとき、 保護培養のためにタバコ由来の細胞系統 B Y— 2と共存培養を行つた。
一方 CHI/pBIGRZ2を含むァグロバタテリゥムを 28°Cで 8〜4 8時間培養し、 0D6Q。=1. 0程度まで増殖させた。 ァグロパクテリゥムの菌体は液体の MSホルモンフ リー培地に懸濁した。 切り分けた胚軸とこのァグロバタテリゥム溶液を混ぜ合わ せ、約 20分共存培養した。 共存培養後、ァグロバタテリゥムをろ紙で除去した胚軸 は例えほ S基本培地 +B5ビタミン （シグマ社、 M 0 4 0 4 ) +スクロース 3 % + 2， 4 -D lmg/1の培地で 2日間培養し、 感染させた。 感染後、 MS基本培地 +B5 ビタミン +スクロース 3 % + 2， 4 -D lmg/1に抗生物質カルペニシリン （ファ ィザ一社、ゼォペンまたは GIBCO- BRL社 Carbenicillin di sodium salts)を 500mg/l の濃度で添加した除菌培地に胚軸を移植し、ァグロバタテリゥムを除去した。 上述の除菌培地で 5日から 1週間経過した後、胚軸は S基本培地 +B5ビタミン + スクロース 1 % +ベンジルァミノプリン 3mg/l +カーべニシリン 500mg/lに加え、 硝酸銀 5mg/l、 また選抜用としてカナマイシン 5- 30mg/l (ナカライテスク社、カナ マイシン硫酸塩）を添加した培地で 14日- 21日培養した。 このとき緑色のカルスが 出現する場合があるので、 それらは速やかに次のステップの培地に植え替えた。 次のステップの培地としては例えば MS培地（シグマ社、 M 5 5 1 9 ) +スクロー ス 1 % +ベンジルァミノプリン 3mg/l +ゼァチン lmg/l +カーべニシリン 500mg/l +カナマイシン 5〜30mg/lを含む選抜培地がある。切り口からカルス形成した胚軸 をこの培地に移植し 23°Cで 3週間培養し、その後緑のカルスが出現するまで 3週間 後ごとに 3〜5回移植を繰り返した。
緑のカルスは、見つけ次第胚軸から切り取り同じ組成の培地に移した。 その後、 緑色の部分だけを切り取って植えついで行くと 1〜3 0 %の確率で不定芽が形成 された。 不定芽はその後 B5基本培地（シグマ社、 G 5 8 9 3 ) +スクロース 3 % + ベンジルアミノプリン lmg/1に移して育成したあと MS培地 （シグマ社 M 5 5 1 9 ) +スクロース 3 % +ナフタレン酸 0. lmg/l +ベンジルァミノプリン 0. 0 lmg/1 を含む培地で発根させた。 実施例 7 ：形質転換体の解析 （導入 D NAの検出）
実施例 6により得られた、 つぼみを形成した形質転換体の 1個体から葉を 1枚 取りキアゲン社の D NA単離キット （DNeasy plant mini) を用いて D N Aを単離 した。'
P C R法を用いて、導入 D N A断片の 3力所（a， b， c部位）について、検出した（結 果を図 3に示す） 。 a部位は配列番号 1の塩基配列 3186bpから 3753bpまでの 568bp であり、 フォワードプライマーとして 「5' -GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3'」 （配 列番号 4)、リバースプライマーとして「5' -CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3'」 (配 列番号 5 ) を使用した。 b部位は配列番号 1の塩基配列 4869bpから 5112bpまでの 244bpであり、 フォワードプライマーとして 「5， -CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3'」 （配 列番号 6) 、 リバースプライマーとして 「5' -TCCACAAACCCTAGCCAACA-3'」 （配列 番号 7 )を使用した。 c部位は配列番号 1の塩基配列 7766bpから 8250bpまでの 485bp であり、 フォワードプライマーとして 「5' -GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3'」 （配 列番号 8 ) 、 リバースプライマーとして 「5' -CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3'」 (配列番号 9) を使用した。
lμlの形質転換体DNA溶液 （50ng// l) に、 12.1 1の滅菌水、 2 1の10¾^ CR 緩衝液（lOOmM Tris- HCl(pH8.3)， 500mM KC1) 、 1.2 μ 1の 25mM MgC12、 1.6 μ 1の 2.5mM dNTP mix, 1 1の各部位の 10 μ Mフォヮ一ドプライマ一溶液、 Ιμΐの 各部位の ΙΟμΜリバースプライマー溶液、 0. Ιμΐの 5 unit/μΐ の rTaq DNA polymerase (宝酒造社製） を加えて混和後、 94°C40秒、 55°C 30秒、 72°C1分のサ イタルを 35回繰り返す事により DNAを増幅した。サーマルサイクラ一は、 UN0II
(Biometra社製） を使用した。 反応終了後、 4°/。 Nusive3: 1 Agarose(FMC社製） /1 XTBE(89mM Tris-borate, 89mM boric acid, 2mM EDTA) 緩衝液のゲル電気泳動に より、 増幅産物を確認した （図 3を参照） 。
その結果、 a部位はこの形質転換ナタネには導入されていないことがわかった。 残りの 2力所（b, c部位） は、ポジティブコント口ールと同じ大きさの増幅産物が 得られ、 形質転換ナタネに当該 D N Aが組み込まれてレ、ることが確認され'た。 実施例 8：形質転換体の解析（cms原因タンパク質 OR F 125蓄積量の減少の確 認)
実施例 7と同じ個体のつぼみを 1つ取り、 CMSタンパクである OR F 125 の蓄積量の減少をウェスタンブロッティング法によって解析した。 結果を図 4に 示す。
( 1 ) 形質転換個体からのタンパク質抽出
タンパク質の抽出法、ウェスタンブロティング法に関して、 N. Koizukaら（Theor Appl Genet (2000) 100： 949-955)の方法に準じて行つた。
具体的には、 得られた形質転換ナタネのつぼみ （長さ 1脑） 1つと、 ΙΟΟ μ Ιの氷 冷したタンパク質抽出緩衝液 (50mM Tris-HCl (pH7. 5)， 2% (W/V) SDS) を氷冷した 乳鉢に入れ、 乳棒で磨り潰した。 この液を、 マイクロ遠心チューブに移し、 15000rpm, 15分間， 4°Cで遠心した。 遠心後、 上澄み液を新しいマイクロ遠心チュ ーブに移し、 100°Cで 5分間加熱した。 再度 15000rpm， 15分間， 4°Cで遠心し、 上澄 み液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、 SDS可溶性タンパク質溶液とした。ブ ラッドフォ一ド法によるタンパク質定量キット （Bio- rad社製） を用いて SDS可溶 性タンパク質溶液の濃度を測定した。 これと平行して、 細胞質雄性不稔系統のナ タネと稔性回復系統のナタネのつぼみからも同様に SDS可溶性タンパク質溶液を 抽出、 濃度測定を行った。
( 2 ) SDS- PAGE法によるタンパク質の分離と PVDF膜への転写： ウェスタンブロテ ィング
7x10cm角の 10%の SDSポリアクリルアミ ドゲルを用いて、 1レーンあたり 15 gの SDS可溶性タンパク質を乗せて電気泳動にて分離した。加えて、 O R F 1 2 5タン ノ、°ク質蓄積量の比較のため、 細胞質雄性不稔系統のナタネの希釈系列も同様に乗 せて分離した。 電気泳動条件は 10mAで 1時間、 15mAで 1時間行った。 電気泳動後、 セミ ドライブ口ティング装置 （日本泳動社製） を用いて、 PVDF膜 （ミリポア社製） にポリアクリルアミ ドゲル中のタンパク質を、 100mA, 1時間の条件で転写した。
( 3 ) 抗体を用いたタンパク質の検出： ウェスタンブ
タンパク質を転写した PVDF膜を、 上下 2枚に分割し、 10mlのブロッキング溶液 (20raM Tris-HCl (pH7. 5) , 500mM NaCl, 0. 05% Tween20, 5%スキムミルク） に移し、 1時間振とうして、 ブロッキングした。 上の PVDF膜でミトコンドリアタンパク質 量のコント口ールとして ATPAを、 下の PVDF膜で細胞質雄性不稔関連タンパク質で ある O R F 1 2 5をそれぞれ検出した。 10mlの 1次抗体反応液 （10mlのブロッキ ング溶液に、 ATPA検出用として 100 μ 1の ATPAモノクローナル抗体を力 flえ、 O R F 1 2 5検出用として 2 μ 1の O R F 1 2 5に対するゥサギ抗血清を加えた (Μ.
Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999) 39 : 183-188) ) に、 PVDF膜を移 し 1 8時間振とうした。 100mlの TTBS (20mM Tris-HCl (pH7. 5) , 500mM NaCl, 0. 05% Tween20) に PVDF膜を移し、 10分間振とうした。 この操作を 3回繰り返し過剰の一 次抗体液を洗い流した。 10mlの 2次抗体反応液（10mlのプロッキング溶液に、 ATPA 検出用として ΙΟ μ Ιのパーォキシダーゼを付加したャギ抗マウス IgG (Amersham社 製）、 O R F 1 2 5検出用として 10 μ 1のアル力リフォスファターゼを付加したャ ギ抗ゥサギ IgG (Bio- rad社製） を加えた （M. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999) 39 : 183-188) ) )に、 PVDF膜を移しそれぞれ 1時間振とうした。 100ml の TTBS (20mM Tris-HCl (pH7. 5) , 500mM NaCl, 0. 05% Tween20) に PVDF膜を移し、 10分間振とうした。 この操作を 3回繰り返し過剰の 2次抗体液を洗い流した。 ATPA 検出用として、 パーォキシダーゼに対する化学発光システム 「ECL+」 （Amersham 社製）を用い、 5秒間露光検出した。 〇R F 1 2 5検出用として、 アルカリフォス ファターゼの発色基質である BCIP/NBT (MOSS Inc.社製） を用い、 5分間発色検出 した。
その結果、 2系統の細胞質雄性不稔ナタネのつぼみ、 稔性回復ナタネ、 細胞質 雄性不稔系統に当該 D N A が挿入された形質転換体ナタネのつぼみでは、コント ロールである ATPAの蓄積量はほとんど変化しないが、 O R F 1 2 5タンパク質の 蓄積量は形質転換体ナタネで優位に減少していることが示された。 この減少の度 合いは、 細胞質雄性不稔系統に交配によって稔性回復遺伝子が導入された稔性回 復系統と同等である（図 4、 及び M. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999) 39： 183-188) oまた、 O R F 1 2 5タンパク質蓄積量の減少の度合いを希釈 系列と比較すると、 稔性回復ナタネで 1/8〜1/16、 形質転換ナタネで 1/8程度であ ることが解った。 以上、 先に述べたようにナタネでは稔性が回復する事と O R F 1 2 5タンパク質の蓄積量が減少する事とは、 強く連鎖し、 同意の関係にあるこ とから、 当該 D NA配列は、 ミ トコンドリア内の O R F 1 2 5タンパク質蓄積量 を減少させる働きがあり、稔性回復遺伝子を保持したゲノム D N A配列であるこ とが証明された。 '
さらに開花体から药を取り出し、 顕微鏡観察したところ、 正常な花粉が形成さ れていることが確認できた （図 5 ) 。 実施例 9 ： c D NAの単離
c DNAの単離は、 R NA供与体として、 遺伝子地図を作製レたときに用いた F 2集団より Rfl遺伝子をホモに持つ花粉稳性のある F 2個体を選ぴ、 つぼみから mRNAを精製した後、 cDNAを合成後、 5， -RACEまたは 3' -RACE法を用いて行った。
(mRNAの精製）
Rfl遺伝子をホモに持つ花粉稔性のある F 2個体のつぼみから、 常法であるグァ ニジゥムチオシァネート法により、 RNeasyキット （Qiagen社） を用いて、全 RNAを 抽出した。 全 R A から PolyA+RNAを、 Origo (dT)セルロースカラムを用いた 「mRNA Pur ication kit」 （Amersham Pharmacia社） を用いて精製し mRNAとした。
(5， -RACEと 3， -RACEによる c DNA の単離）
精製した mRNA * l jLZ gを用いて、 5， -RACEと 3' —RACE法による 「Marathon RACE system 5， RACE 3， RACEJ キットを用いて c DNA を単離した。 遺伝子特異的プラ イマ一として 5， -RACEには 5， -GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG- 3， （配列番号 1 0 ) を 使用し、 3， -RACEには、
5' -ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3 ' (配列番号 1 1 ) を使用した。得られたクロー ンの塩基配列を確定後、 cDNA配列を得た （配列番号 2 ) 。 実施例 1 0 ： cDNAのァミノ酸配列への変換と解析
( 1 ) c DNAのアミノ酸配列への変換は、通常のジエネティックコードを用いて、 遺伝子解析ソフト 「Genetyx- SV」 （ソフトウェア開発 （株） ） を用いて行い、 配 列番号 3に記載のアミノ酸配列を得た。 PPRモチーフの解析は、 Protein families database of alignments and画 s (以下 Pf amと略
http//：' www. Sanger, ac. uk/Software/Pf am/search, shtml )■■にあるプログラムで行 つた。 解析の結果、 配列番号 1に示した稔性回復遺伝子の翻訳産物は 16個の PPR モチーフを持つタンパク質である事を見出した。 また PPRモチーフは、 3つの PPR クラスターとなっていた。 その 3つとは、
① PPRクラスター # 1 ： N末端から 1番目の PPRモチーフから 5番目の PPRモチーフ が連続した 1 7 5残基からなる PPRクラスター、
② PPRクラスター # 2 ： N末端から 6番目の PPRモチーフから 12番目の PPRモチー フが連続した 2 4 5残基からなる PPRクラスター、 並びに
③ PPRクラスター # 3 ： N末端から 13番目の PPRモチーフから 16番目の PPRモチー フが連続した 1 4 0残基からなる PPRクラスター、
であった。
実施例 1 1 ：本発明のタンパク質の解析
コセナ細胞質雄性不稔を引き起こす原因タンパク質 O R F 1 2 5の遺伝子の転 写産物 (niRNA)に結合することで大腸菌において翻訳阻害を起こすかどうかの実験 'を行った。
配列番号 2に示した稔性回復遺伝子を大腸菌発現ベクター pQE-80L (Qiageri社） の BamHI- Sphl部位に導入し、 6個のヒスチジン残基が （6XHis) N末端に付加する発 現ベクターを構築した（pQEB1/cds6)。 また、 pSTV29 (宝酒造） ベクターを錶型と して、 BamHI部位を導入するプライマー： CGGGATCCGCTCACMTT (配列番号 1 2 )と、 M13プライマー RV (宝酒造（株））を用いて D N Aを増幅した。 D N Aの増幅は、 Takara LA PCR Kit (宝酒造（株）） を用いた。増幅した D N Aを、制限酵素 BamHI、 EcoRI (宝酒造 （株） ） で切断後、 Suprec- 02 (宝酒造 （株） ） を用いて精製した。 orfl25遺伝子の 5， - UTR領域と orfl25の 25ァミノ酸の両端に BamHIと EcoRI部位を 有する D N A断片を合成するために、 2本のプライマーを用いて、藤本の方法（植 物の PCR実験プロトコール：合成 D NAの実際 PP84- 87 (秀潤社） ），に従って、 PCR を行った。 プライマーは、
125-5， BamHI：
GCGGATCCCAATT
ACGGGAAGTGACAATACCGCTTTTCTTC (配列番号 1 3 )
125-5， EcoRI：
GGAATTCACTAACT TCATGCATTTATATGCTGAAGAAAAGCG (配列番号 1 4 )
の 2本を用いた。 増幅した D N Aを、 制限酵素 BamHI、 EcoRI (宝酒造 （株） ） で 切断後、 Suprec- 02 (宝酒造 （株） ） を用いて精製した。 精製した D N Aは TaKaRa Ligation kit (宝酒造 （株） ） を用いて結合させ、 大腸菌 DH10B (Gibco BRL社製） に形質転換した。 50 μ g/mlのク口ラムフエ二コール（Sigma社製）を加えた LB寒天培 地（l%Bacto- Tryptone, 0. 5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1. 5% Bacto- Agar, 0. ImMIPTG, 20ug/ml X-Gal)にて、 18時間以上 37。Cで培養した。 薄く青いコロニー から、定法によりプラスミドを抽出し塩基配列を確認した。 この様にして、 EcoRI 部位から lacZ遺伝子の転写開始点の間に orf 125遺伝子の 5， - UTR領域と orfl25の 25ァミノ酸を含む 174bp (図 6に記載の塩基配列のうち、 7〜 1 8 0番目） を導入 したベクターを構築した（PSTV125 - 5' #LA6)。また同時に該 1 7 4 bpに相当する部 分に数箇所に変異を起こさせた断片 （図 6に記載の塩基配列の 7〜 1 8 3番目） を持つベクターが得られた（pSTV125 - 5， #LA12)。
該ベクター pSTVl25-5' #LA6及ぴ #LA12をそれぞれ、 大腸菌 DH10B (GibcoBRL社） に導入し、 LB培地に 50 μ g/mlのクロラムフエ二コール （和光純薬社） 、 200 ^ Μの IPTG (和光純薬社）、 40 μ g/mlの X- Gal (宝酒造社） を加えた寒天培地で、 37°C—晚 静地培養し、 コロニーを生育させたところ、 薄く青色になった。 すなわち、 いず れのベクターを導入した大腸菌においても導入された LacZ遺伝子が発現したこと が認められた。 さらに、上述の PSTV125- 5' ベクターと pQEBl/cds6ベクターとを共に上記と同様 の大腸菌に導入するために、 上記培地に 50 μ g/mlのアンピシリンを加えた培地を 用いて培養したところ、 PSTV125-5' #LA6と共存させた場合は、 コロニーが白くな つたが、 導入断片部位に変異を有する PSTV125-5' #LA12と共存させた場合は、 コ ロニーが薄く青くなり、青さの程度は #LA12単独の場合と変わり無かった。 尚、導 入したこれらのベクターが大腸菌から欠落していないかについては、 それぞれの コロニーを培養後、 常法によりベクターを抽出することで確認した。
以上の結果より、 pQEBlん ds6ベクターにより大腸菌内で発現したタンパク質は、 pSTV125_5' #LA6の mRNAと結合した結果、 LacZ遺伝子の発現が抑えられ白いコロニ 一になつたと考えられる。 また、 pSTV125 - 5， #LA12と共存させた場合には、 導入 断片部位に変異を有することにより pQEBl/cds6由来のタンパク質が mR Aに結合す ることが出来ず、 その結果 LacZ遺伝子が発現し青色になったと考えられる。
このことから、 配列番号 3に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は orf 125 の mRNA、より具体的には、少なくとも orf 125 - 5， UTR領域と ORF125の 25ァミノ酸残 基のコード領域の転写産物に関与して、 0RF125タンパク質の発現を抑えているも のと推察される。
すなわち、 本発明の遺伝子の翻訳産物は、 ミ トコンドリアに移送された後に、 該ミトコンドリア内で、 雄性不稔遺伝子と結合し、 翻訳を阻害することで、 細胞 質雄性不稔の原因タンパク質の蓄積量を減少させることにより、 細胞質雄性不稔 性を可稔に回復していることが推察される。 実施例 1 2 ： コセナナタネ稔性回復遺伝子の単離
コセナダイコンの稔性回復遺伝子を細胞融合により導入して得られたナタネの 系統（以下コセナナタネ） から、 PCR法を用いて稔性回復遺伝子のゲノム配列を得 た。.コセナナタネの葉 0. lgからキアゲン社の DNA単離キット （DNeasy plant mini) を用いて D N Aを抽出した。 DNA増幅のために、配列番号 1の塩基配列 1027bpから 1059bpbpまでの配列である 5' -ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3' (配列番号 30) を、 フォワードプライマーとして設定し、 配列番号 1の塩基配列 7675bpか ら 765 lbpbpまでの配列である 5' -AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3' (配列番号 31 ) を、 リバースプライマーとして設定した。
10μ 1のコセナナタネ DNA溶液（50ngVl)に、 49μ1の滅菌水、 10 1の1(^1^ PCR緩衝液（宝酒造社製） 、 10 1の2501¾1 §(12、 16 1の 2.5mM dNTP mix、 2μ1の ΙΟμΜフォヮ一ドプライマ一溶液、 2μ1の lO^uMリバースプライマー溶液、 の 5 unit/ ΐ の TaKaRa LA Taq (宝酒造社製） を加えて混和後、 98°C20秒、 68°C15 分のサイクルを 30回繰り返す事により DNAを増幅した。サーマルサイクラ一は、 UNOII (Biometra社製）を使用した。反応終了後、限外ろ過フィルター Microcon- PCR (ミリポア社製） を用いて約 6 k bの増幅産物を精製した。 精製された増幅産物 を铸型として、 配列番号 1における 4280〜 758 5番目に相当する部分につ いて、 定法により塩基配列 3306bPを決定した （配列番号 1 5) 。 得られたコセナ ナタネのゲノム塩基配列と園紅ダイコンの配列を比較したところ、 3306bpのうち 7bpのみ DNA塩基置換がみっかり、 高い相同性を有することが解った。
またコセナナタネの稔性回復遺伝子の 3' 部分 cDNA配列を、 RT-PCR法により取得 し、 イントロンが園紅ダイコンと同じ形でスプライスされている事を確認した。 コセナナタネのつぼみから、 常法である AGPC (Acid
Guanidium- Phenol- Chloroform)法（秀潤社 細胞工学別冊バイォ実験ィラストレ ィテツド②遺伝子解析の基礎 P161〜166) により、 全 RNAを抽出した。 1 μ gの 全諷より、 SUPERSCRIPT II RNaseH- Reverse Transcriptase (Invitrogen社製） を用いて c DNAを合成した。稔性回復遺伝子 3' 部分特異的フォヮ一ドプライマ一 として 5' -TGGAGTAAAGAGGAACTAAAAAGGGC-3 ' (配列番号 32) を使用し、 稳性回 復遺伝子 3' 部分特異的リバースプライマーとして、
5， -CAGACAATAGACGCATAAAAGGC-3 ' (配列番号 33) を使用した。 Ιμΐのコセナナ タネ cDNA溶液に、 14· 9 μΐの滅菌水、 2.5 1の10 ？0?緩衝液（宝酒造社製） 、 1.5 1の 25mM MgCl2、 2 ^ 1の 2.5mM d TP mix、 1· 5 1の 10 Μフォワードプライマー 溶液、 1·5μ1の 10/ Μリバースプライマー溶液、 0.1 1の5 11^/ 1の131¾1¾丁& (宝酒造社製） を加えて混和後、 94°C40秒、 60°C 3 0秒、 72°C2分のサイクルを 35 回繰り返す事により D N Aを増幅した。サーマルサイクラ一は、 UNOII (Biometra 社製） を使用した。 3 の増幅産物に、 pGEM - Teasyベクター （プロメガ社製） 1 μ ΐと 5 ^ 1の 2xligation緩衝液 （プロメガ社製） ， 1 μ 1の T4 DNA ligase (プロ メガ社製） を加え、室温で 1時間放置して、ベクターに結合させた。 このベクター を大腸菌 DH5 (Gibco BRL社製）に形質転換してクローンを得た。 得られたクロー ンについて定法により塩基配列を確定し、 コセナナタネの cDNAは、 園紅ダイコン と同様に、 イントロンがスプライスされていることが確認できた。 すなわち、 先 のゲノム配列の比較により見つかった 7bpの塩基置換は配列番号 1の
5444bp - 5814bPに存在し、 スプライシングに影響を与えていないことが判明した。 以上のことからコセナナタネの稔性回復遺伝子は、 園紅ダイコンと同様な形で mRNAを発現していることが解った。 翻訳領域のみをコードする cDNA配列を配列番 号 1 6に記す。 さらに、この cDNA配列からアミノ酸配列を得た（配列番号 1 7 )。 実施例 1 3 ： タ
Figure imgf000063_0001
. raphanis trum) 性回復遺伝子部分配列の単離
R. . ra a LZ'sirM?の稔性回復遺伝子の部分配列を cDNAから単離した。
(mRNAの精製）
R. . raphanistrwiのつ \ま から、 常法である AGPC (Acid
Guanidium- Phenol- Chloroform)法（秀潤社 細胞工学別冊バイォ実験ィラストレ ィテッド②遺伝子解析の基礎 P161〜166) により、 全 RNAを抽出した。 全 RNAか ら PolyA+RNAを、 Origo (dT)セルロースカラムを用いた 「mRNA Purification kit」
(Amers am Pharmacia社） を用いて精製し mRNAとした。
( c DNAの部分配列単離）
精製した 1 の mRNAより、 「Marathon RACE system 5 ' RACE 3， RACE」 キッ ト（Clontech社製）を用いて c DNA を合成した。
稔性回復遺伝子特異的フォワードプライマーとして 5， -GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3 ' (配列番号 34) を使用し、 稔性回復遺伝子特異的リバースプライマーとして、
5' -ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3 ' (配列番号 35) を使用した。
ΙμΚΌβ.. raphanist通 c鳳容液に、 14.4μ1の滅菌水、 2.5 1の 10x Pyrobest PCR緩衝液（宝酒造社製） 、 2 μ 1の 2.5mM dNTP mix、 2.5 ^ 1の 10 μ Mフォヮ一ドプラ イマ一溶液、 2.5 1の lO^uMリバースプライマー溶液、 0.1^1の 5 unit/ μ 1 の Pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製） を加えて混和後、 98°C5秒、 55°C 30秒、 72°C1分 30秒のサイクルを 30回繰り返す事により DN Aを増幅した。サーマルサイ クラ一は、 UN0II (Biometra社製）を使用した。増幅した DNA溶液に 0.1 1の5 11：^/ μΐ TaKaRa Taq (宝酒造社製） を加えて混和後、 72°C10分加温処理し、 DNAの 3' 末端にアデニンヌクレオチドを付加した。 3μ1の増幅産物に、 pGEM-Teasyベクタ 一 （プロメガ社製） と 5^1の 2xligation緩衝液 （プロメガ社製） ， 1^1の T4 DNA ligase (プロメガ社製） を加え、 室温で 1時間放置して、 ベクターに結合 させた。 このベクターを大腸菌 DH5a (Gibco BRL社製）に形質転換してクローンを 得た。得られたクローンを定法により塩基配列を確定後、 cDNA部分配列を得た（配 列番号 20) 。 さらに cDNA配列から、 アミノ酸配列を得た （配列番号 21) 。 実施例 14 ：オダラナタネ稔性回復遺伝子の単離
ォグラダイコンの稔、性回復遺伝子を交配により導入して得られたナタネの系統 (以下オダラナタネ） から、 5， -RACE法と 3' - RACE法を用いて稔性回復遺伝子の cDNA配列を単離した。
(mRNAの精製）
ォグラナタネのつぼみから、 常法である AGPC (Acid
Guanidium-Phenol-Chloroform)法（秀潤社 細胞工学別冊バイォ実験ィラストレ ィテツド②遺伝子解析の基礎 P161〜： 166) により、 全 RNAを抽出した。 全 RNAか ら PolyA+RNAを、 Origo(dT)セルロースカラムを用いた 「m NA Purification kit」 (Amersham Pharmacia社） を用いて精製し mRNAとした。 (c DNAの部分配列単離）
精製した 1 g の mRNAより、 「Marathon RACE system 5， RACE 3， RACE」 キッ ト（Clontech社製）を用いて cDNA を合成した。 稔性回復遺伝子特異的フォワード プライマーとして 5' -GATCCATGCATTTGTCAAGG-3， （配列番号 36 ) を使用し、 稔 性回復遺伝子特異的リバースプライマーとして、
5' -CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3 ' (配列番号 37 ) を使用した。
1 1のォグラナタネ cDNA溶液に、 14.4 の滅菌水、 2.5 μ 1の 10x Pyrobest PCR 緩衝液（宝酒造社製） 、 2^1の 2.5mM dNTP mix、 2.5 ;ζ 1の lO^u Mフォワードプライ マー溶液、 2.5^1の 10^ Mリバースプライマー溶液、 0. Ιμΐの 5 unit/ μ 1 の Pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製） を加えて混和後、 98°C5秒、 55°C 30 秒、 72°C1分 30秒のサイクルを 30回繰り返す事により DNAを増幅した。サーマル サイクラーは、 UN0II (Biome ra社製） を使用した。 増幅した DNA溶液に 0.1 μ 1 の 5ωιϋ:/μ1の TaKaRa Taqを加えて混和後、 72°C10分加温処理し、 DNAの 3' 末端 にアデニンヌクレオチドを付加した。 3μ 1の増幅産物に、 pGEM- Teasyベクター（プ 口メガ社製） ： 1と 5^1の 2xligation緩衝液 （プロメガ社製） ， lμlのT4 DNA ligase (プロメガ社製） を加え、 室温で 1時間放置して、 ベクターに結合させた。 このベクターを大腸菌 DH5ひ（Gibco BRL社製）に形質転換してクローンを得た。 得 られたクローンを定法により塩基配列を確定後、 4種類の cDNA部分配列を得た。得 られた 4種類の配列情報を基にして、 4つに共通な部分に 5' -RACEと 3' -RACE用 のプライマーを設定し、 それぞれ cDNA単離を行った。
(5， -RACEと 3， -RACEによる cDNA の単離）
上記と同様に cDNAを合成し、 「Marathon RACE system 5， RACE 3' RACE」 キッ ト（Clontech社製）を用いて 5' - RACEと 3' - RACE法を行い c DNA を単離した。 遺伝 子特異的プライマーとして 5' -RACEには
5， -CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3 ' (配列番号 37) と
5， -GTCCGGAGAGCAGCCCTTGGTAG-3 ' . (配列番号 38) を使用し、 3， -RACEには、 5' -TCATCGTATAATTCTTCAGCCTC-3 ' (配列番号 39) を使用した。 5' RACEでは、 2回 PCRを行い DNAを得た。 2 1の 250倍希釈したオダラナタネ cDNA 溶液に、 8.6^ 1の滅菌水、 2μ 1の lOxLAPCR緩衝液（宝酒造社製）、2 1の 25mMMgCl2、 3.2 1の 2.5πιΜ dNTP mix, 1 1の ΙΟμΜ配列番号 9907Fのプライマー溶液、 Ιμΐの 10 アダプタープライマー溶液 (Marathon RACE system 5， RACE 3， RACE キッ ト、 Clontech社製） 、 0.2μ1の 5 unit/ μ 1 の TaKaRa LA Taq (宝酒造社製） を加 えて混和後、 98°C5秒、 72°C3分のサイクルを 5回、 98°C5秒、 70°C3分 3のサイクル を 5回、 98°C5秒、 68°C3分のサイクルを 25回繰り返す事に り DNAを増幅した。 得られた DNA溶液を 100倍希釈し、そのうちの 2 //Iに、 8.6 1の滅菌水、 2 1の1(^ LA PCR緩衝液（宝酒造社製） 、 2 β 1の 25raM MgCl2、 3.2 μ 1の 2.5mM dNTP mix, 1 μ 1 の 10 μΜ配列番号 5， ogu- 1のプライマー溶液、 1μ 1の 10μΜアダプタープライマー 溶液 （Marathon RACE system 5， RACE 3' RACEキット、 Clontech社製） 、 0.2μ Ι の 5 unit/jul の TaKaRa LA Taq (宝酒造社製） を加えて混和後、 98°C5秒、 72°C3 分のサイクルを 5回、 98°C5秒、 70°C3分 3のサイクルを 5回、 98°C5秒、 68°C3分の サイクルを 25回繰り返す事により DNAを増幅した。 サーマルサイクラ一は、 UN0II (Biometra社製） を使用した。
3' RACEでは、 2 1の 50倍希釈したオダラナタネ cDNA溶液に、 8.6 1の滅菌水、 2 μ 1の 10x LA PCR緩衝液（宝酒造社製） 、 2 μ 1の 25mM MgCl2、 3.2 μ 1の 2.5mM dNTP mix, 1^ 1の10 1^[配列番号3， ogu- 1のプライマー溶液、 1 1の 10 μ Mアダプタープ' ライマー溶液 （Marathon MCE system 5， RACE 3' RACEキット、 Clontech社製） 、 0.2μ 1の 5 unit/^l の TaKaRa LA Taq (宝酒造社製） を加えて混和後、 98°C5秒、 63°C30秒、 72°C2分のサイクルを 35回繰り返す事により DN Aを増幅した。
3μ 1の増幅産物に、 pGEM - Teasyベクター （プロメガ社製） と 5μ1の
2xligation緩衝液 （プロメガ社製） 、 1 1の 4 DNA ligase (プロメガ社製） を 加え、 室温で 1時間放置して、 ベクターに結合させた。 このベクターを大腸菌 DH5 ' a (GibcoBRL社製）に形質転換してクローンを得た。得られたクローンの塩基配列 を確定後、上記 4種類の cDNA部分配列に対応する 5' - RACE配列と 3' -RACE配列を得 て、各々の配列を結合して全長 c DNA配列を得た。 この内園紅ダイコンの c DNA配 列と最も相同性の高い配列をコセナナタネの稔性回復遺 ί云子とした （配列番号 1 8 ) 。 さらに cDNA配列から、 ァミノ酸配列を得た （配列番号 1 9 ) 。 実施例 1 5 ：稔性回復遺伝子の解析
上記の方法で得られた各々の稔性回復遺伝子について、 cDNA配列及ぴァミノ酸 配列の相同性については遺伝子解析ソフト 「Mac Vecrtor6. 5」 (Oxford
MolecularLtd. ) を用い、モチーフ解析については、英国のサンガー研究所内にあ る Protein families database of alignments and HMNsを用レヽて、 角军析を行った。 本発明の園紅ダイコン、 コセナナタネ及ぴォグラナタネ由来の R f遺伝子は、 いずれも P P Rモチーフを 1 6個有し、 この P P Rモチーフ群はァミノ末端側か ら 5個、 7個及ぴ 4個の 3つのブロックに分割されている上、 ァミノ末端側から 2番目の P P Rモチーフに存在する 4番目のアミノ酸がァスパラギンであった。 また、 ラフアナス ·ラファニス トラム由来の部分断片についても、 上述の配列に 対し相当する部分 （配列番号 2 6の 9 4〜 2 6 4番目） に当てはめて解析したと ころ、ァミノ末端の 1番目から 6番目の PPRモチーフに相当する部分を有しており. PPRモチーフ群とァミノ末端側から 2番目の P P Rモチーフに存在する 4番目の アミノ酸についても上記の特徴を有していた。
さらに園紅ダイコン、コセナナタネ、オダラナタネから得られた 3種の稔性回復 遺伝子ヒ R. . r¾ ^ ir 稔性回復遺伝子部分配列についての解析の結果得られ た本発明のタンパク質 (配列番号 2 6 ) 及びそれをコードする遺伝子 (配列番号 2 2 )の中でも、園紅ダイコンとコセナナタネは相同性が非常に高く、アミノ酸配列 では 9 9 . 6 % (3箇所のアミノ酸で違いが見られただけであった） 、塩基配列で は 99. 7%と高い値を示すことから、 特に好ましくは配列番号 2 9に記載のアミノ 酸配列を有するタンパク質、 及びそれをコードする遺伝子 (配列番号 2 5 )が挙げ られる。
その一方で、 オダラナタネと園紅ダイコン、 そしてオダラナタネとコセナナタ ネを比較するといずれも高い相同性が認められたが、 それぞれの相同性がァミノ 酸配列ではォグラナタネと園紅ダイコンを比較すると 92. 0%、 オダラナタネとコ セナナタネでは 91. 6%であり、塩基配列ではいずれも 95%程度と、園紅ダイコンと コセナナタネ間の値よりは低い値を示した。 産業上の利用の可能性
本発明により、 R f遺伝子、特には、ダイコン由来の R f 1遺伝子が単離され、 その構造が同定された。 さらに、 本発明によれば、 単離した R f遺伝子を利用し てナタネ回復系統を確立する手段を提供することが可能になった。

Claims

請求の範囲
1 . Pentatricopeptide Repeat (以下 PPRと略） モチーフを 1 4個以上持ち、 該 P P Rモチーフ群は 3つ以上のブロックに分割されており、 該各プロックはそ れぞれ少なくとも 2つ以上の P P Rモチーフを有し、 かつ、 カルボキシ末端 ( C 末端） 側のブロックは 4つの P P Rモチーフを有することを特徴とする細胞質雄 性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
2 . P P Rモチーフの数が 1 4〜1 6個であることを特徴とする請求項 1に 記載のタンパク質。
3 . P P Rモチーフ群が 3つのプロックに分割されており、 ァミノ末端 （N 末端） 側から順に各ブロックが 5個、 7個及び 4個の P P Rモチーフを有するこ とを特徴とする請求項 1又は 2に記載のタンパク質。 '
4 . ァミノ末端 （N末端） 側から 2番目の PPRモチーフに存在する 4番目のァ ミノ酸がセリン、 スレオニン又はシスティン以外であることを特徴とする請求項 1〜 3に記載のタンパク質。
5 . ァミノ末端 （N末端） 側から 2番目の PPRモチーフに存在する 4番目のァ ミノ酸がァスパラギン、 グルタミン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸又はヒスチ ジンのレ、ずれかであることを特徴とする請求項 4のタンパク質。
6 . さらに、 ァミノ末端にミ トコンドリアに移行するためのシグナルぺプチ ド配列を有するか又はカルボキシ末端に一 LysAspGluLeu—からなる配列を有する ことを特徴とする請求項 1〜 5のいずれかに記載のタンパク質。
7 . 細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と接触させた後に該転写産物にゲルシ フトを起こさせることを特徴とする細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復す ることに関与するタンパク質。
8 . 配列番号 2 6に記載のァミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔 性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
9 . 配列番号 2 7に記載のァミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔 性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
10. 配列番号 28に記載のァミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不 稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
11. 配列番号 29に記載のァミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不 稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
12. 下記の何れかのタンパク質。
( 1 ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 80〜 687番目のァミノ酸配列、 配 列番号 17に記載のァミノ酸配列の 80〜 687番目のァミノ酸配列、 又は配列 番号 19に記載のアミノ酸配列の 82〜690番目のアミノ酸配列を有するタン パク質；又は
( 2 ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 80〜 687番目のァミノ酸配列、 配 列番号 17に記载のァミノ酸配列の 80〜 687番目のァミノ酸配列、 又は配列 番号 19に記載のアミノ酸配列の 82〜690番目のアミノ酸配列において 1か ら複数個のアミノ酸が欠失、 付加及び/または置換されているアミノ酸配列を有 し、 かつ細胞質雄性不稳個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク 質。
13. 下記の何れかのタンパク質。
(1) 配列番号 3、 配列番号 17、 又は配列番号 19に記載のアミノ酸配列を有 するタンパク質；又は
(2) 配列番号 3、 配列番号 17、 又は配列番号 19に記載のアミノ酸配列にお いて 1から複数個のアミノ酸が欠失、 付加及び/または置換されているアミノ酸 配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する
14. 細胞質雄性不稔個体が、 コセナダイコン及ぴ Z又はォグラダイコンの 細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものであることを特徴とする請 求項 1〜 9に記載のタンパク質。
15. 請求項 1〜10のいずれかに記載のタンパク質をコードする DNA。
1 6. 配列番号 2 2に記載の塩基配列を有する D N A。
1 7. 配列番号 2 3に記載の塩基配列を有する D N A。
1 8. 配列番号 24に記載の塩基配列を有する D N A。
1 9. 配列番号 2 5に記載の塩基配列を有する D N A。
20. 下記の何れかの DNA。
(1) 配列番号 2、 配列番号 1 6、 又は配列番号 1 8に記載の塩基配列を有する DNA；又は
(2) 配列番号 2、 配列番号 1 6、 又は配列番号 1 8に記載の塩基配列において 1から複数個の塩基が欠失、 付加及び/または置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DN A；又は
(3) 配列番号 2、 配列番号 1 6、 又は配列番号 1 8に記載の塩基配列を有する DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ細胞質雄性不稔個 体の不稔性を可稔に回復することに関与する DNA。
2 1. 下記の何れかの DNA。
( 1 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3 7 54番目〜 8 5 5 3番目の塩基配列又 は配列番号 1 5に記載の塩基配列の 8 1 2番目〜 3 00 2番目の塩基配列を有す る DNA ;又は
( 2 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3 7 54番目〜 8 5 5 3番目の塩基配列又 は配列番号 1 5に記載の塩基配列の 8 1 2番目〜 3 00 2番目の塩基配列におい て 1から複数個の塩基が欠失、付加及び/または置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する DNA；又は
( 3 ) 配列番号 1に記載の塩基配列の 3 7 54番目〜 8 5 5 3番目の塩基配列又 は配列番号 1 5に記載の塩基配列の 8 1 2番目〜 3 00 2番目の塩基配列を有す る DNAとストリンジヱントな条件下でハイプリダイズし、 かつ細胞質雄性不稔 個体の不稔性を可稔に回復することに関与する D N A。
2 2. 下記の何れかの DNA。
( 1 ) 配列番号 1又は配列番号 1 5に記載の塩基配列を有する D NA；又は (2) 配列番号 1又は配列番号 1 5に記載の塩基配列において 1から複数個の塩 基が欠失、 付加及ぴ Zまたは置換されている塩基配列を有し、 かつ細胞質雄性不 稔個体の不稔 ^~生を可稔に回復することに関与する DNA；又は
( 3 ) 配列番号 1又は配列番号 15に記載の塩基配列を有する D N Aとストリン ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔 に回復することに関与する DNA。
23. 細胞質雄性不稔個体が、 コセナダイコン及び Z又はォグラダイコンの 細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものである、 請求項 1 5〜22 の何れか 1項に記載の DNA。
24. 請求項 1 5〜23の何れかに記載の DN Aを含有するベクター。
25. 請求項 1 5〜23の何れかに記載の DN A又は請求項 24に記載のベ クタ一を有する形質転換体。
26. 形質転換植物である、 請求項 25に記載の形質転換体。
27. 請求項 1 5〜23の何れかに記載の DNAを用いることを特徴とする、 細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復する方法。
28. 細胞質雄性不稔遺伝子を有し、 かつ、 請求項 15〜 23の何れかに記 載の DN Aを有する細胞に、 さらに請求項 1 5〜23の何れかに記載の DN Aの 一部又は全部を誘導型プロモーターと共に導入することにより、 雄性不稔回復遺 伝子の発現を制御することが可能となった形質転換体。
29. 請求項 28に記載の形質転換体を利用することによる細胞質雄性不稔 系統の維持方法。
30. 請求項 1 5〜 2.3の何れかに記載の DN Aから任意に設定した 15〜 5 Omerのオリゴヌクレオチドプライマー、又は、請求項 1 5〜23の何れかに記 載の DN Aの全部又は 1部からなる少なくとも 1 5 mer以上のプローブを使用し、 目的の生物試料中に、 該プライマーにより増幅される塩基配列の量、 又は、 プロ ープにより検出される塩基配列の量が、 1ゲノム中に 1遺伝子以上あることを確 認することで、 細胞質雄性不稔回復に関与する遺伝子を検出する方法。
3 1. 配列番号 1に記載の塩基配列の 3754番目〜 5091番目の塩基配 列、 又は配列番号 15に記載の塩基配列の 1番目〜 811番目の塩基配列を有す る、 プロモーター DNA。
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