WO2002079458A1 - Cellules precurseurs du systeme nerveux central induisant des neurones synaptogeniques dans la moelle epiniere - Google Patents

Cellules precurseurs du systeme nerveux central induisant des neurones synaptogeniques dans la moelle epiniere Download PDF

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Yuhto Ogawa
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Definitions

  • the present invention relates to a central nervous system progenitor cell (CNS-NPC) capable of inducing neurons capable of synapse formation in the spinal cord, a method for preparing such a central nervous system precursor cell, and a method for preparing such a central nervous system precursor.
  • CNS-NPC central nervous system progenitor cell
  • the present invention relates to a method for screening a synapse formation promoting substance or inhibitor using a cell or the like.
  • Spinal cord injury is a disease in which spinal cord tissue is damaged by trauma and spinal cord function is impaired.
  • Current treatments for this disease are high-dose steroid therapy aimed at minimizing the secondary chemical damage that occurs immediately after trauma, and maximizing residual function Surgery such as rehabilitation therapy and muscle transfer surgery are performed for the purpose.
  • high doses of methylprednisolone among steroids are effective in improving neurological symptoms associated with spinal cord injury (J. Spinal Disord. 5 (1), 125-131, 1992). Large doses of the drug cause severe systemic side effects, which are difficult to control and, in addition, have a problem of impaired infection defense function in spinal cord injury accompanying infection.
  • treatments for spinal cord injury include treatments that minimize acute tissue damage and treatments that maximize residual function. In the adult spinal cord, which does not show re-extension of dislocated axons, there is no established treatment to regenerate the damaged spinal cord. No.
  • CNS-NPC central nervous system progenitor cells
  • An object of the present invention is to provide a central nervous system progenitor cell capable of inducing neurons, oligodendrocytes, astrosites, and the like capable of synapse formation by transplantation into a spinal cord having a damaged or lost function.
  • the present inventors obtained by fetal spinal cord tissue culture on day 14.5 of rat embryos by the method described in the literature (Science 255, 1707-1710, 1992).
  • CNS_NPC central nervous system progenitor cells
  • transplanted cell-derived neurons, oligodendrocytes, and astrocyte cells are injured in the injured area
  • myelin is formed in the axon of such transplanted cell-derived neurons and that synapses are formed, thereby improving spinal cord function. Reached. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a central nervous system progenitor cell (Claim 1) capable of inducing neurons capable of synapse formation in the spinal cord, a neuron capable of synapse formation in the spinal cord, And 3.
  • the central nervous system progenitor cell according to claim 1 or 2 wherein the spinal cord is an injured spinal cord or a central nervous system progenitor cell capable of inducing an oral site.
  • the present invention also provides a method for preparing a central nervous system progenitor cell capable of inducing a synapse-forming neuron in the spinal cord, comprising culturing a spinal cord-derived neural stem cell in the presence of a cytokine. Claim 5) and culturing spinal cord-derived neural stem cells in the presence of cytokines, inducing oligodendrocytes and / or astrocytes in the spinal cord in addition to synapse-forming neurons. And a method for preparing a central nervous system progenitor cell according to claim 5 or 6, which can be induced in an injured spinal cord (claim 7).
  • the method for preparing a central nervous system progenitor cell according to any one of claims 5 to 7, which can be induced in a human spinal cord (claim 8).
  • a method for preparing a central nervous system precursor cell according to any one of 5 to 9 (claim 10).
  • the present invention relates to the central nervous system progenitor cell, wherein at least in the spinal cord, the central nervous system progenitor cell according to any one of claims 1 to 4 or a neuron derived from the cell is brought into contact with a test substance.
  • a method for screening a synapse formation-promoting or inhibiting substance (claim 11), which comprises evaluating the degree of synapse formation in neurons induced from, and the synaptic formation-promoting substance or suppression according to claim 11.
  • Synapse formation promoting substance obtained by a screening method for a substance
  • the active ingredient is a synapse formation inhibitor (Claim 13) obtained by the method of screening a synapse formation promoting substance or inhibitor, or the central nervous system progenitor cell according to any one of Claims 1 to 4.
  • a therapeutic agent for nerve damage or nerve function improvement (Claim 14), a central nervous system progenitor cell according to any one of Claims 1 to 4, and a synapse formation promoting substance according to Claim 12.
  • Introducing into the spinal cord a therapeutic agent for nerve damage or nervous function improvement characterized by being an active ingredient (claim 15) or the therapeutic agent for nerve damage or nervous function improvement according to claim 14 or 15.
  • a method for ameliorating or treating a nerve injury or a nervous function disorder characterized by the following features: (c) implanting the central nervous system progenitor cells according to any one of claims 1 to 4 into the spinal cord.
  • Nerve damage or nervous function disorder characterized by: A neuron, an oligodendrocyte or an ostium site, wherein the central nervous system progenitor cells according to any one of claims 1 to 4 are transplanted into the spinal cord.
  • FIG. 1 shows a description of the preparation of a spinal cord injury model at the rat vertebral level by the weight compression method.
  • FIG. 2 is a photograph showing the differentiation of transplanted neural stem cells in the host spinal cord.
  • Fig. 3 shows the test method (a) for the forelimb elaboration behavior associated with neural stem cell transplantation and the recovery results (b).
  • FIG. 4 is a photograph showing neuronal differentiation and synapse formation in a donor spinal cord of a donor cell.
  • FIG. 5 is a photograph showing engraftment of transplanted human neural stem cells in a host spinal cord injury rat. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the central nervous system precursor cells of the present invention include, in addition to neurons capable of synapse formation, preferably neurons capable of synapse formation, in the spinal cord, particularly in the spinal cord of vertebrates such as humans whose spinal cord is damaged.
  • the vertebrate-derived central nervous system progenitor cells from which oligodendrocytes, astrocytes and the like can be induced.
  • the vertebrates include humans, rats, rats, cats, Specific examples include, but are not limited to, vertebrates such as monkeys, goats, magpies, canines, magpies, sheep, zebrafish, medakas, sharks, and power frogs.
  • the central nervous system progenitor cells are human central nervous system progenitor cells, they are prepared from the aborted fetus-derived spinal cord because transplant cells can be obtained indefinitely and donor shortages can be eliminated. It is more preferred to use
  • central nervous system progenitor cells capable of inducing neurons capable of synapse formation in the spinal cord preferably in the injured spinal cord, and the neurons capable of synapse formation
  • oligodendrocytes The method for preparing central nervous system progenitor cells capable of inducing and / or astrocyte is not particularly limited as long as spinal cord-derived neural stem cells are cultured in the presence of cytokines.
  • spinal cord-derived neural stem cells are cultured in the presence of tocaine into the injured spinal cord, they can be induced into neurons, oligodendrocytes, and astrocytes in the injured spinal cord.
  • the origin of the injured spinal cord and the origin of the neural stem cells may be the same or different.
  • neural stem cells derived from human spinal cord can be introduced and transplanted into rat injured spinal cord.
  • neural stem cells derived from the human spinal cord it is preferable to use neural stem cells derived from the spinal cord in an aborted human fetus.
  • the culture method for culturing spinal cord-derived neural stem cells in the presence of cytokines is not particularly limited, but the collected spinal cord is treated with trypsin according to a conventional method, and the cells are dispersed by pipetting or the like.
  • a method of performing floating culture by using a neurosphere method (Science 255, 1707-1710, 1992), which is a selective culture method for neural stem cells, at 37 to 7 to 0 days can be preferably exemplified. it can.
  • a cell mass called a neurosphere which is a cell population containing a large amount of neural stem cells, can be obtained.
  • Neurospheres such as marimo are separated into individual cells by pipetting or the like, and again under the same conditions.
  • a serum-free DMEMZF12 medium is preferable as the culture medium for suspension culture, and the site force-in used in the above culture medium is IL-12, IL-1H, IL-1 ⁇ , IFN- And TN F-H, FGF-2, GM-CSF, IL-4, etc., and may be one or a combination of two or more selected from these sites.
  • FGF-2 basic fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • PDG F platelet-derived growth factor
  • neuropeptide leukemia inhibitory factor
  • a synapse formation promoting substance or a synapse formation inhibitory substance can be screened.
  • a method for screening for a bus formation promoting substance or an inhibitory substance for example, the central nervous system progenitor cell of the present invention or a neuron derived from such a cell is contacted with a test substance in at least the spinal cord, A method for evaluating the degree of synapse formation in neurons derived from systemic progenitor cells may be mentioned.
  • Examples of the method for contacting the test substance with the central nervous system progenitor cells or the neurons derived from such cells include central nervous system Transplantation of a mixture of progenitor cells and test substance into the injured spinal cord, transplantation of CNS progenitor cells into the injured spinal cord after oral administration of the test substance, and CNS progenitor cells
  • the method can be specifically exemplified by, for example, a method of implanting a test substance into an injured spinal cord and injecting a test substance into induced neurons.
  • Examples of a method for evaluating the degree of synapse formation include electron microscopic observation and a method based on immunohistological analysis of synaptophysiology.
  • the synapse formation promoting substance obtained by such a screening method include BDNF, NT_3, and NGF.
  • the synapse formation inhibitor include semaphorin, Nogo, and MAG.
  • the synapse formation promoting substance and the synapse formation inhibitory substance in the present invention mean a substance whose synapse formation promoting action ⁇ synapse formation suppressing action has not been known before.
  • the therapeutic agent for improving nerve damage or nervous function of the present invention includes those having the central nervous system progenitor cell as an active ingredient and those having the central nervous system progenitor cell and the synapse formation promoting substance as active ingredients. Anything is fine.
  • a pharmaceutically acceptable ordinary carrier such as a diluent, a pH buffer, a disintegrant, a solubilizer, a solubilizer, and an isotonic agent.
  • diluents for dispensing such as a diluent, a pH buffer, a disintegrant, a solubilizer, a solubilizer, and an isotonic agent, can be added.
  • Such therapeutic agents include, for example, solutions, emulsions, A suspension or the like can be parenterally administered in the form of an injection to a site such as a spinal cord injury site.
  • Examples of the method for improving or treating a nerve injury or a neurological disease according to the present invention include a method of introducing the therapeutic agent for neurological injury or nerve function improvement into the spinal cord, and injecting or transplanting the central neural progenitor cells into the spinal cord.
  • the therapeutic method can produce synapse formation in neurons derived from central nervous system progenitor cells, and can improve nerve damage or neurological dysfunction.
  • the method for inducing any of the neurons, oligodendrosites, and astral sites of the present invention into the spinal cord is a method of directly injecting the central nervous system progenitor cells of the present invention into the spinal cord and transplanting them.
  • the present invention also relates to synapses formed in neurons induced by transplanting the central nervous system progenitor cells of the present invention into the spinal cord. Such synapse formation leads to improved spinal cord function injured by the injury.
  • An adult rat with a spinal cord injury model (SD rat female, weighing 200 to 230 g) was subjected to a weight following the method of Ho 1tz et al. (Surg. Neurol. 31, 350-360, 1989). It was made using the compression method. Specifically, after laminectomy of the 4th and 5th cervical vertebrae (C4 and C5), 35 g of weight is placed on the 4th and 5th cervical vertebrae from the back of the spinal cord and placed on the spinal cord for 15 minutes. (See Fig.
  • Reference Photo 1 Reference Photo 1.
  • Reference Photo 1 Nine days post-injury, under operating microscope using a microsyringe into the cavity resulting in spinal cord injury unit, including neural stem cells obtained in Reference Example 1 5 ⁇ 1 0 X 1 0 6 cells / m 1 Transplantation was performed by injecting culture solution 301.
  • Figure 2 Five weeks after transplantation, the transplanted rats were fixed in reflux with paraformaldehyde, and the spinal cord at the transplanted site was removed for histological examination. The results are shown in Figure 2 (see Reference Photo 2).
  • Figure 2a shows the injury site of a spinal cord injured animal transplanted with medium alone, indicating that the injury resulted in cavitation.
  • Figure 2 b-1 shows the injury site of a spinal cord injured animal transplanted with neural stem cells pre-labeled with Brd U (scale bar 250 im), and b-2 is an enlarged view of b-1 (scale Bar 100 m).
  • Figure 2c shows Dona cells differentiated into neurons (brown: Hu of a neuron marker, gray: BrdU), and Figure 2d shows Dona cells differentiated into oligodendrocytes (brown: oligo dendrocytes).
  • FIG. 2e shows donor cells differentiated into astrocytes (brown: GFAP of the astrocyte marker, grey: B.rd U).
  • an anti-Hu antibody for confirmation of neurons, oligodendrocytes, and ostium sites, an anti-Hu antibody, an anti-2'3'-cyclic nucleotide 3-phosphohydrolase antibody, and a bl Glial fibrillary acidic protein antibody were used, respectively.
  • an anti-Hu antibody for confirmation of neurons, oligodendrocytes, and ostium sites, an anti-Hu antibody, an anti-2'3'-cyclic nucleotide 3-phosphohydrolase antibody, and a bl Glial fibrillary acidic protein antibody were used, respectively.
  • bromodeoxyperidine labeling that the cells differentiated into neurons, oligodendrocytes, and fast-mouth sites were derived from the transplanted neural stem cells.
  • Figure 3a shows the pellet retrieval test, in which 2.5 cm rectangular boxes are arranged in four rows and three rows, and separated by iron bars so that they can only be placed in the box with the forefoot. A device was created that could not remove the small pelleted bait placed. Each box was filled with 5 pellets of food and the number of foods taken in 15 minutes was recorded. As a protocol for such a test, pretraining was performed for one week while restricting food, surgery was performed using the above-mentioned weight compression method, and similar pretraining was performed again for four weeks after transplantation. It is to test continuously.
  • FIG. 3b The results are shown in FIG. 3b.
  • Example 1 Transfer of CNS-NPC from rat fetal spinal cord to spinal cord injury model Confirmation of introduction of transplanted cell-derived neurons into host neural network in transplantation experiment
  • Transgenic rat-derived transplant cells that specifically express EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) in neurons were prepared and transplanted in the same manner as in Reference Example 2. I took it out.
  • the transgenic rat expressing EYFP was prepared according to the method described in the literature (Sawamoto et al. J. Neurosci. In press). That is, the FYFP cDNA under the control of a 1.1 kb promoter element of the ⁇ -1 tubulin gene expressed in the nervous system was obtained by the method described in the literature (J. Neurosci. 14, 7319-7330, 1994).
  • the rat was ligated, and the cDNA was microinjected into the pronucleus of a rat fertilized egg, and then the fertilized egg was returned to the SD rat of the foster parent to prepare a transgenic rat.
  • Genomic DNA was extracted from the tail of the transgenic rat, and identified by the PCR method using primers specific for the introduced EYFPc DNA. Confirmation that the transplanted cell-derived neurons differentiated and survived in the host spinal cord was performed by staining the transplanted spinal cord with an anti-EYFP antibody. The results are shown in Figs. 4a to 4d (see Reference Photo 4).
  • FIG. 4a shows that all EYFP-expressing cells are Hu-positive neurons (scale bar 5 m).
  • Figure 4b shows the donor cells dividing and transforming into neurons in the host spinal cord after transplantation (scale bar 5 m). From FIG. 4, it is observed that EYFP-positive donor-derived neurons extend their axons in the host spinal cord in the longitudinal direction (scale 150 m). From Fig. 4d, accumulation of synaptophysin-positive synaptic vesicles is observed around neurons derived from EYFP-positive donors (scale 5 m).
  • FIGs. 4e to 4h show by immunoelectron microscopy analysis that a portion of the axons of EYFP-positive donor-derived neurons are partially myelinated in the host spinal cord (scale 1.0. 1 ⁇ , m
  • Figure 4f shows that EYFP-positive donor-derived neurons (*) form synapses with host neurons as presynaptic cells (scale 0.5 m).
  • Figure 5g shows that neurons from EYFP-positive donors are synaptic with host neurons (*) as postsynaptic cells (scale bar 0.2 m).
  • Figure 5h shows that host-level motor neurons at the injury level and EYFP-positive donor-derived neurons are synaptic (scaler h_l; 2rn, h-2; 0.5).
  • Example 2 Transplantation of CNS-NPC derived from aborted human fetus into spinal cord injury model rat
  • rat spinal cord injury model was prepared by the Tator method (J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58: 489-498, 1999) with a compression pressure of 35 g. On the 9th day after the damage, The vesicles were injected into the cavity created in the spinal cord injury using a microsyringe under a surgical microscope.
  • cyclosporins A (cyclosporins A) as an immunosuppressant was administered intraperitoneally 10 g / g body weight every day from the day before the transplantation.
  • the spinal cord transplant was stained with an antibody against an anti-human cell nucleus-specific antigen, and it was confirmed that the transplanted cells had survived in the transplant (Fig. 5: Reference Photo 5).
  • transplantation of spinal cord-derived central nervous system progenitor cells into an injured spinal cord can induce synapse-forming neurons, oligodendrocytes and astrosites, and can be used to induce a damaged spinal cord. Improvements in function have been observed in experiments using rat spinal cord injury models, and cultured central nervous system progenitor cells derived from human fetal spinal cord can also be transplanted and engrafted to spinal cord injury model rats. became. Further development of these technologies is expected to develop new treatments for spinal cord regeneration for spinal cord injury.

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Description

明 細 書 脊髄におけるシナプス形成ニューロンを誘導する中枢神経系前駆細胞 技術分野
本発明は、 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロン等を誘導す ることができる中枢神経系前駆細胞 （C N S— N P C ) や、 かかる中枢 神経系前駆細胞の調製方法や、 かかる中枢神経系前駆細胞等を用いたシ ナプス形成促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法などに関する。 背景技術
脊髄損傷は外傷により脊髄組織が損傷され、 脊髄機能が障害される疾 患である。 この疾患に対する治療法は現在のところ、 外傷を受けた直後 に生じる化学的な二次的損傷を最小限とどめることを目的としたステロ ィ ド大量投与療法と、 残存機能を最大限に活用することを目的としたリ ハビリテ一ション療法や筋移行術等の手術療法などが行われている。 ス テロイ ド剤の中ではメチルプレドニゾロンの大量投与が脊髄損傷に伴う 神経症状の改善に有効であると報告されている （J. Spinal Disord. 5(1), 125-131, 1992) が、 ステロイ ド剤の大量投与は全身的副作用も強く発現 し、 コントロールが難しいことに加えて、 感染症を伴う脊髄損傷では感 染防御機能低下をきたすという問題点がある。 また、 さらに現在ステロ イ ド大量投与療法の有効性についてさえ議論されている。 現在、 脊髄損 傷に対する治療法は、 急性期の組織傷害を最小限にとどめるための治療 法と残存機能を最大限に活用する治療法が行われているが、 傷害により 失われたニューロンの再生や断列した軸索の再伸長を認めない成人脊髄 においては、 損傷脊髄の再生を目的とした治療法は未だ確立されていな い。
その他、 脊髄損傷の治療方法として報告されているものは、 インビト 口で炎症関連サイ トカインにより前処理された神経膠星状細胞を中枢神 経系 （CN S ) 中の損傷部位に、 治療上有効な量を移植する方法 （特表 2 0 0 0— 5 0 3 9 8 3号公報） や、 同種の単核貪食細胞 （単球、 マク 口ファージ等） を、 損傷または疾患部位に、 あるいはその近傍の中枢神 経系 （CN S) に投与することにより、 哺乳動物 CN Sにおける神経軸 索再生を促進する方法 （J. Mol. Med. 77, 713-717, 1999、 J. Neurosci. 19(5), 1708-16, 1999、 Neurosurgery 44(5), 1041-5, 1999、 Trends. Neurosci 22(7), 295-9, 1999) (特表平 1 1 — 5 1 3 3 7 0号公報） など がある。 また、 明確な機序は不明であるが、 spinal cord homogenateに よる vaccinationゃ髄鞘蛋白質である myelin basic proteinに特異的な T細胞を投与することにより、 脊髄損傷後の運動維持の回復を促進させ たとレ fcなされてレ る (Neuron 24, 639-647, 1999, Lancet 354, 286-287, 2000)。
一方、 培養細胞を用いた脊髄損傷に対する移植実験としては、 マウス E S細胞より分化させた中枢神経系前駆細胞 （CN S— N P C) を脊髄 損傷モデルラッ トに移植し機能改善が得られたとの報告がある （Nat. Med. 5， 1410-1412， 1999)。 しかし、 この方法は E S細胞を用いている 点で倫理的な問題があり、 また C N S— N P Cへの E S細胞からの分化 誘導についても未だ充分には確立されているとはいえず移植部位での奇 形種の発生が危惧されている。 また、 脊髄再生を目的とし胎児脊髄を移 植する実験はラッ トゃ猫の脊髄損傷モデルを用いて行われており、 移植 による損傷脊髄機能の改善が報告されている（J. Neurosci.18， 763-778, 1998、 Brain Pathol. 5, 451-457, 1995他） 力 臨床応用へは至っては いない。 この原因の一つとして、 一度の移植に対し複数の胎児からの脊 髄が必要となるためにドナーとなる胎児脊髄の確保が困難であることが 挙げられる。
脊髄損傷を含む中枢神経系の損傷は極めて治療困難な疾患で、 前記の ように現在まで有効な治療法がなく、 新たな治療法の開発が強く望まれ ている。 また近年交通事故の増大や高齢化に伴い、 脊髄損傷に罹患する 患者数は増加する傾向にあり、 大きな社会問題となっている。 本発明の 課題は、 損傷又は機能が失われた脊髄に移植することにより、 シナプス 形成能を有するニューロン、 オリゴデンドロサイ ト、 ァス トロサイ ト等 を誘導することができる中枢神経系前駆細胞や、 かかる中枢神経系前駆 細胞の調製方法や、 かかる中枢神経系前駆細胞等を用いた、 シナプス形 成促進物質若しくは抑制物質のスクリーニング方法又は神経損傷若しく は神経機能改善治療薬等を提供することにある。
上記課題を解決するために、 本発明者らは、 文献 （Science 255, 1707- 1710, 1992) 記載の方法によりラッ ト胎生 1 4 . 5 日目の胎児脊 髄組織を培養することによって獲得した中枢神経系前駆細胞 （C N S _ N P C ) を、 脊髄損傷モデルラッ トに損傷後 9 日目で損傷部に直接注入 することにより、 損傷部に移植細胞由来のニューロン、 オリゴデンドロ サイ ト、 ァス トロサイ ト等を誘導することができ、 さらに、 かかる移植 細胞由来のニューロンの軸索にミエリ ンが形成され、 シナプスを形成す ることによって脊髄機能が改善されることを見い出し、 本発明を完成す るに至った。 発明の開示
すなわち本発明は、 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロンを 誘導することができる中枢神経系前駆細胞 （請求項 1 ) や、 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロンの他に、 オリゴデンドロサイ ト及び 又はァス ト口サイ トを誘導することができる中枢神経系前駆細胞 （請 求項 2 ) や、 脊髄が、 損傷脊髄であることを特徴とする請求項 1又は 2 記載の中枢神経系前駆細胞 （請求項 3 ) や、 脊髄が、 ヒ ト脊髄であるこ とを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞 （請 求項 4 ) に関する。
また本発明は、 脊髄由来の神経幹細胞をサイ トカインの存在下で培養 することを特徴とする、 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロン を誘導することができる中枢神経系前駆細胞の調製方法（請求項 5 )や、 脊髄由来の神経幹細胞をサイ トカインの存在下で培養することを特徴と する、 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロンの他に、 オリゴデ ンドロサイ ト及び/又はァストロサイ トを誘導することができる中枢神 経系前駆細胞の調製方法 （請求項 6 ) や、 損傷脊髄内で誘導することが できる請求項 5又は 6記載の中枢神経系前駆細胞の調製方法（請求項 7 ) や、 ヒ 卜脊髄内で誘導することができる請求項 5〜 7のいずれか記載の 中枢神経系前駆細胞の調製方法 （請求項 8 ) や、 サイ ト力インが、 塩基 性繊維芽細胞増殖因子であることを特徴とする請求項 5〜 8のいずれか 記載の中枢神経系前駆細胞の調製方法 （請求項 9 ) や、 ヒ ト脊髄由来の 神経幹細胞を用いることを特徴とする請求項 5〜 9のいずれか記載の中 枢神経系前駆細胞の調製方法 （請求項 1 0 ) に関する。
さらに本発明は、 少なくとも脊髄内で、 請求項 1〜 4のいずれか記載 の中枢神経系前駆細胞又は該細胞から誘導されるニューロンと、 被検物 質とを接触させ、 前記中枢神経系前駆細胞から誘導されたニューロンに おけるシナプス形成の程度を評価することを特徴とするシナプス形成促 進物質又は抑制物質のスクリーニング方法 （請求項 1 1 ) や、 請求項 1 1記載のシナプス形成促進物質又は抑制物質のスクリ一二ング方法によ り得られるシナプス形成促進物質 （請求項 1 2 ) や、 請求項 1 1記載の シナプス形成促進物質又は抑制物質のスクリ一二ング方法により得られ るシナプス形成抑制物質 （請求項 1 3 ) や、 請求項 1〜4のいずれか記 載の中枢神経系前駆細胞を有効成分とすることを特徴とする神経損傷又 は神経機能改善治療薬 （請求項 1 4 ) や、 請求項 1〜 4のいずれか記載 の中枢神経系前駆細胞及び請求項 1 2記載のシナプス形成促進物質を有 効成分とすることを特徴とする神経損傷又は神経機能改善治療薬 （請求 項 1 5 ) や、 請求項 1 4又は 1 5記載の神経損傷又は神経機能改善治療 薬を、 脊髄内に導入することを特徴とする神経損傷又は神経機能疾患の 改善治療方法 （請求項 1 6 ) や、 請求項 1〜 4のいずれか記載の中枢神 経系前駆細胞を移植することにより、 脊髄内に導入することを特徴とす る神経損傷又は神経機能疾患の改善治療方法 （請求項 1 7 ) や、 請求項 1〜 4のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞を脊髄に移植することを特 徴とするニューロン、 オリゴデンドロサイ ト又はァスト口サイ トのいず れかの脊髄内誘導方法 （請求項 1 8 ) や、 請求項 1〜4のいずれか記載 の中枢神経系前駆細胞を脊髄に移植することにより誘導されたニューロ ンに形成されたシナプス （請求項 1 9 ) に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 重錘圧迫法によるラット顏椎レベルにおける脊髄損傷モデ ルの作製の説明を示している。
第 2図は、 移植神経幹細胞のホスト脊髄内における分化を示す写真で ある。
第 3図は、 神経幹細胞移植に伴う前肢巧緻行動の試験方法 （a ) とそ の回復結果 （ b ) を示している。
第 4図は、 ドナ一細胞のホスト脊髄内におけるニューロン分化とシナ ブス形成を示す写真である。 第 5図は、 移植ヒト神経幹細胞のホスト脊髄損傷ラッ トにおける生着 を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の中枢神経系前駆細胞としては、 脊髄内、 特に脊髄が損傷して いるヒト等の脊椎動物の脊髄内で、シナプス形成能を有するニューロン、 好ましくは該シナプス形成能を有するニューロンに加えて、 オリゴデン ドロサイ ト、 ァストロサイ ト等を誘導することができる脊椎動物由来の 中枢神経系前駆細胞であれば特に制限されるものではなく、 上記脊椎動 物としては、 ヒト、 ラッ ト、 ネズミ、 ネコ、 サル、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ゥシ、 ヒッジ、 ゼブラフィッシュ、 メダカ、 サメ、 力エル等の脊椎動物 を具体的に挙げることができるが、 これらに限定されるものではない。 そして、 中枢神経系前駆細胞がヒト中枢神経系前駆細胞の場合、 無制限 に移植細胞を獲得することが可能で、 かつドナー不足を解消することが できるという点から、 中絶した胎児由来の脊髄から調製したものがより 好ましい。
本発明の、 脊髄内で、 好ましくは損傷脊髄内で、 シナプス形成能を有 するニューロンを誘導することができる中枢神経系前駆細胞や、 シナプ ス形成能を有するニューロンの他に、 オリゴデンドロサイ ト及び/ 又は ァストロサイ トを誘導することができる中枢神経系前駆細胞の調製方法 としては、 脊髄由来の神経幹細胞をサイ トカインの存在下で培養する方 法であれば特に制限されるものではなく、 サイ トカインの存在下で培養 した脊髄由来の神経幹細胞を損傷脊髄内に導入 ·移植することにより、 損傷脊髄内でニューロン、 オリゴデンドロサイ 卜、 ァストロサイ トに誘 導することができる。 また、 損傷脊髄の由来と神経幹細胞の由来は同一 あるいは相異なっていてもよいが、 ヒト由来の損傷脊髄ゃヒト脊髄由来 の神経幹細胞を用いることが好ましい。 例えばヒ ト脊髄由来の神経幹細 胞をラッ ト損傷脊髄内に導入 ·移植することができる。 そして、 ヒ ト脊 髄由来の神経幹細胞を用いる場合は、 中絶したヒ 卜胎児における脊髄由 来の神経幹細胞を用いることが好ましい。
脊髄由来の神経幹細胞をサイ トカインの存在下で培養する培養方法と しては、 特に制限されないが、 採取した脊髄を常法に従ってトリプシン 処理した後ピペッティング等により細胞を分散し、 これらの細胞を、 神経 幹細胞の選択的培養法であるニューロスフェア （Neurosphere) 法 (Science 255, 1707-1710, 1992) により、 3 7 で、 7〜： L 0日間浮 遊培養する方法を好適に例示することができる。この浮遊培養法により、 神経幹細胞を多く含む細胞集団であるニューロスフェア（ Neurosphere) と呼ばれる細胞塊が得られるが、 このマリモのようなニューロスフェア をピペッティング等により細胞ひとつひとつに分け、再び同条件で浮遊培 養してニューロスフェアを得る継代培養を 2〜 4回繰り返すことにより 移植用の神経幹細胞を充分量確保することができる。 浮遊培養用の培養 液としては、 無血清の DMEMZF 1 2培地が好ましく、 また上記培養 液に用いるサイ ト力インとしては、 I L— 1 2、 I L— 1 ひ 、 I L - 1 β、 I FN—ァ 、 TN F— ひ 、 F G F— 2、 GM— C S F、 I L— 4等 を具体的に例示することができ、 また、 これらのサイ ト力インから選ば れる 1種又は 2種以上の組み合わせであってもよいが、 中でも F GF— 2 (塩基性繊維芽細胞増殖因子） が好ましい。 また、 サイ ト力インと併 せて、 E GF (上皮増殖因子） や、 NG F (神経成長因子） や、 PDG F (血小板由来増殖因子） や、 神経ペプチドや、 白血病阻害因子などを 用いてもよい。
本発明の中枢神経系前駆細胞を用いると、 シナプス形成促進物質又は シナプス形成抑制物質をスクリーニングすることができる。 かかるシナ ブス形成促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法としては、例えば、 少なく とも脊髄内で、 本発明の中枢神経系前駆細胞又はかかる細胞から 誘導されるニューロンと、 被検物質とを接触させ、 前記中枢神経系前駆 細胞から誘導されたニューロンにおけるシナプス形成の程度を評価する 方法を挙げることができ、 前記中枢神経系前駆細胞又はかかる細胞から 誘導されるニューロンと被検物質との接触方法としては、 中枢神経系前 駆細胞と被検物質との混合物を損傷脊髄内に移植する方法や、 被検物質 を経口投与した後、中枢神経系前駆細胞を損傷脊髄内に移植する方法や、 中枢神経系前駆細胞を損傷脊髄内に移植し、 誘導されたニューロンに被 検物質を注入する方法などを具体的に例示することができる。 また、 シ ナプス形成の程度を評価する方法としては、 電子顕微鏡的観察や、 シナ プトフィジーに対する免疫組織学的解析による方法などを例示すること ができる。 そして、 かかるスクリーニング方法により得られるシナプス 形成促進物質としては、 例えば、 B D N F、 N T _ 3 、 N G F等を具体 的に挙げることができ、 シナプス形成抑制物質としては、 セマフォリン、 N o g o、 M A G等を例示することができるが、 本発明におけるシナプ ス形成促進物質やシナプス形成抑制物質は、 シナプス形成促進作用ゃシ ナプス形成抑制作用が従前知られていない物質を意味する。
本発明の神経損傷又は神経機能の改善治療薬としては、 前記中枢神経 系前駆細胞を有効成分とするものや、 前記中枢神経系前駆細胞及び上記 シナプス形成促進物質を有効成分とするものであればどのようなもので もよい。 かかる中枢神経系前駆細胞やシナプス形成促進物質を神経損傷 又は神経機能不全疾患治療薬として用いる場合は、 薬学的に許容される 通常の担体、 免疫抑制剤、 結合剤、 安定化剤、 賦形剤、 希釈剤、 p H緩 衝剤、 崩壊剤、. 可溶化剤、 溶解補助剤、 等張剤などの各種調剤用配合成 分を添加することができる。 またかかる治療剤は、 例えば溶液、 乳剤、 懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口的に脊髄損傷部位等の局 所に投与することができる。
本発明の神経損傷又は神経機能疾患の改善治療方法としては、 上記神 経損傷又は神経機能改善治療薬を脊髄内に導入する方法や、 前記中枢神 経系前駆細胞を脊髄内に注入 ·移植する方法を挙げることができ、 かか る治療方法により、 中枢神経系前駆細胞から誘導されたニューロンにお けるシナプス形成が生起し、 神経損傷又は神経機能疾患の改善を図るこ とができる。 また、 本発明のニューロン、 オリゴデンドロサイ ト又はァ ス ト口サイ 卜のいずれかの脊髄内誘導方法としては、 本発明の中枢神経 系前駆細胞を脊髄に直接注入して移植する方法であり、 これにより損傷 部脊髄組織内に中枢神経系を構成する主な細胞であるニューロン、 オリ ゴデンドロサイ ト、 ァストロサイ 卜を誘導することが可能となる。 また、 本発明は、 本発明の中枢神経系前駆細胞を脊髄に移植することにより誘 導されたニューロンに形成されたシナプスに関する。 かかるシナプス形 成によって、 損傷により傷害された脊髄機能の改善が認められる。
以下に、 実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、 この発 明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
参考例 1 (ラッ ト胎児脊髄由来の移植用細胞の調製）
スプラーグ—ダウリー （Sprague-Dawley) ラッ トの胎生 1 4 . 5 日 目の胎児より脊髄を採取し、 かかる脊髄を常法に従ってトリプシン処理 した後ピペッティングにより細胞を分散し、 これらの細胞を、 神経幹細胞 の選択的培養法であるニューロスフェア法により培養した。上記培養は、 増殖因子として塩基性繊維芽細胞増殖因子 （F G F— 2 ) を含む無血清 D M E M Z F 1 2培地を使用し、 3 7でで 1週間浮遊培養し、 神経幹細 胞を多く含む細胞集団であるニューロスフェアと呼ばれる細胞塊を得た < このニューロスフェアをピペッティングにより細胞一つひとつに分け、再 び同条件で浮遊培養してニューロスフェアを得た。 かかる継代培養を 2 〜 4回繰り返し、 移植用の神経幹細胞を充分量獲得した。 得られた細胞 を赤色の蛍光を発する蛍光物質であるブロモデォキシゥ リ ジン (Bromodeoxyuridine； B r d U) でラベリレした。
参考例 2 (脊髄損傷モデルラッ 卜への神経幹細胞の移植）
脊髄損傷モデル成体ラッ ト （S Dラッ トの雌、 体重 2 0 0〜 2 3 0 g を使用） は、 H o 1 t z らの方法 (Surg. Neurol.31, 350-360, 1989) に従い重錘圧迫法を用いて作製した。 具体的には第 4、 5頸椎 （C 4、 C 5) 椎弓切除後、 3 5 gの重錘を第 4、 5頸椎高位で脊髄背側から脊 髄上に 1 5分間静置することにより作製した （図 1 ：参考写真 1参照）。 損傷後 9日目に、 脊髄損傷部に生じた空洞内へマイクロシリンジを用い て手術用顕微鏡下に、 参考例 1で得られた神経幹細胞を 5〜 1 0 X 1 0 6個/ m 1含む培養液 3 0 1 を注入することにより移植した。
移植後 5週間目に移植したラッ トをパラホルムアルデヒドで還流固定 し、移植部脊髄を取り出して組織学的検討を行った。その結果を図 2 (参 考写真 2参照） に示す。 図 2 aは、 培地だけを移植した脊髄損傷動物の 損傷部位を示し、 損傷により空洞形成が生じていることがわかる。 図 2 b— 1は、 B r d Uで前標識した神経幹細胞を移植した脊髄損傷動物の 損傷部位を示し （スケールバー 2 5 0 im)、 b— 2は b— 1の拡大図で ある （スケールバー 1 0 0 m)。 図 2 cは、 ニューロンに分化したドナ 一細胞 （茶色 ： ニューロンマーカ一の Hu、 灰色 ： B r d U) を示し、 図 2 dは、 オリゴデンドロサイ トに分化したドナ一細胞 （茶色 ： オリゴ デンドロサイ トマーカ一の C N P、 灰色： B r d U) を示し、 図 2 eは、 ァス トロサイ トに分化したドナー細胞 （茶色 ： ァス トロサイ トマーカー の GF AP、 灰色 ： B .r d U) を示す。 これらの結果から、 移植部に移 植細胞由来のニューロン、 オリゴデンドロサイ ト、 ァス トロサイ トが存 在していることが確認できた。 ニューロン、 オリゴデンドロサイ ト、 ァ ス ト口サイ トの確認には、 それぞれ抗 H u抗体、 抗 2' 3' -cyclic nucleotide 3 -phosphohydrolase 饥体、 bl Glial fibrillary acidic protein 抗体を用いた。 また、 ニューロン、 オリゴデンドロサイ ト、 ァ スト口サイ 卜に分化した細胞が、移植した神経幹細胞に由来することは、 ブロモデォキシゥリジン標識により確認した。
一方、 移植後 5週間目で、 前肢で小さな餌を取りこれを口にもってい くという動作について機能評価を行った （図 3 ：参考写真 3参照）。 図 3 aはペレッ ト検索テスト （pellet retrieval test) の様子を示しており、 2. 5 c mの直方体のボックスを 4列 3段に並べ、 鉄の棒で仕切ること により、 前足でしかボックス中に置かれた小さなペレツ ト状の餌を取れ ない装置を作製した。 各ボックスに 5個ずつペレッ ト状の餌を入れ、 1 5分間で取れた餌の数を記録した。 かかるテストのプロトコ一ルとして は、 餌を制限しながら 1週間プレトレーニングを行い、 その後前記重錘 圧迫法による手術を行い、 移植後 4週間再度同様なプレトレーニングを 行い、 5週目に 2日間連続してテストするというものである。 結果を図 3 bに示す。 図 3 bに示されるように、 脊髄損傷のない対照動物群 (ope (-)； n = 1 0 ) 8 0. 3 0 ± 0. 8 4、 脊髄損傷を加えて移植を 行っていない群 （SCI； n = 8 ) 4 7. 1 2 ± 5. 7 6、 脊髄損傷を加 えて培地だけを移植した群 （SCI+med： n = 9 ) 5 0. 1 1 ±4. 1 9、 脊髄損傷を加えて神経幹細胞を移植した群 （SCI+TP； n = 1 3 ) 6 7. 8 5 ± 2. 0 2であり、 移植を行わなかった対照群に比べ移植群で、 統 計学的に有意な機能改善が認められた （Mann-Whitney U-test)。 かか る前肢の巧緻運動の結果から、 移植により機能改善が認められることが 確認できた。
実施例 1 (脊髄損傷モデルへのラッ ト胎児脊髄由来 C N S— N P Cの移 植実験における移植細胞由来ニューロンのホス ト神経回路網への導入の 確認）
ニューロ ンで特異的に E Y F P ( enhanced yellow fluorescent protein)を発現する トランスジエニックラッ 卜由来の移植細胞を調製し、 参考例 2と同様の方法で移植を行い、 移植後 5週間目に移植部脊髄を取 り出した。 上記 E Y F Pを発現する トランスジエニックラッ トは、 文献 (Sawamoto et al. J.Neurosci. in press) 記載の方法に準じて作製した。 すなわち、 神経系において発現する Τ α— 1チューブリン遺伝子の 1. 1 k bのプロモーター因子の制御下にある F Y F P c D N Aを文献 （J. Neurosci. 14， 7319-7330, 1994) 記載の方法により丰胄製し、 この c DN Aをラッ ト受精卵の前核にマイクロインジェクシヨンした後、 かかる受 精卵を仮親の S Dラッ 卜に戻し、 トランスジエニックラッ トを作製した。 かかる トランスジエニックラッ トは、 ラッ トの尾よりゲノム DNAを抽 出し、 導入した E Y F P c D N Aに特異的なプライマーを用いて P C R 法により同定した。 移植細胞由来のニューロンがホス ト脊髄内で分化 · 生存していることの確認は、 移植部脊髄を抗 E Y F P抗体で染色するこ とにより行った。 結果を図 4 a〜dに示す （参考写真 4参照）。 図 4 aは、 すべての E Y F P発現細胞が、 H u陽性のニューロンであることを示し ている （スケールバー 5 m)。 図 4 bは、 移植後にホス ト脊髄内でドナ 一細胞が分裂し、 ニューロンへと分化した状態を示している （スケール バー 5 m)。 図 4 じから、 E Y F P陽性のドナ一由来のニューロンが、 ホス 卜脊髄内の長軸方向へ軸索を伸ばしていることが観察される （スケ 一ルバ一 5 0 m)。 図 4 dから、 E Y F P陽性のドナ一由来のニューロ ンの周辺に Synaptophysin陽性のシナプス小胞の集積がみられる（スケ 一ルバ一 5 m)。
また、 この組織を坊 E Y F P抗体で染色した後に、 電子顕微鏡で検索 した結果を図 4 e〜hに示す （参考写真 4参照）。 図 4 eは、 免疫電顕的 解析で、 E Y F P陽性のドナ一由来のニューロンの軸索の一部が、 ホス ト脊髄内で一部有髄化していることを示している （スケールバ一0. 1 μ, m 図 4 f は、 E Y F P陽性のドナー由来のニューロン （*印） がシ ナプス前細胞として、 ホストのニューロンとシナプス形成していること を示している （スケ一ルバ一 0. 5 m)。 図 5 gは、 EY F P陽性のド ナ一由来のニューロンがシナプス後細胞として、ホストのニューロン（ * 印） とシナプス形成していることを示している （スケールバー 0. 2 m)。 図 5 hは、 損傷レベルのホストの運動ニューロンと E Y F P陽性の ドナ一由来のニューロンがシナプス形成していることを示している （ス ケールバ一 h _ l ； 2 rn, h - 2 ； 0. 5 m)。 図 4 e〜h力、ら、 E Y F P陽性の細胞すなわち移植細胞由来のニューロンの軸索にミエリン 形成が認められ、 移植細胞由来のニューロンと E Y F P陰性のニューロ ンすなわちホストのニューロンとの間にシナプスが形成されていること が確認された。 これにより、 移植に用いた神経幹細胞が、 脊髄内で、 シ ナプス形成能を有するニューロンの他に、 ォリゴデンドロサイ 卜及び Z 又はァストロサイ トを誘導することができる中枢神経系前駆細胞である ことが確認された。
実施例 2 (ヒ ト中絶胎児由来 CN S - N P Cの脊髄損傷モデルラッ 卜へ の移植実験）
ヒ ト胎生 9週目の中絶胎児より脊髄を採取し、 増殖因子として F G F 一 2と上皮成長因子 （E G F) を使用し、 さらに白血病阻害因子を添加 した培養液を用いる以外は、 参考例 1 と同様にして移植用細胞を充分量 獲得した。 また、 ラッ ト脊髄損傷モデルは、 圧迫圧を 3 5 gとした T a t o rの方法 (J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58:489-498， 1999) によ りラッ ト脊髄損傷モデルを作製し、 損慯後 9 日目に上記得られた移植細 胞を脊髄損傷部に生じた空洞内へマイクロシリンジを用いて手術用顕微 鏡下で注入した。 なお、 かかるラッ ト脊髄損傷モデルにおいては、 移植 曰の前日より連日、 免疫抑制剤としてシクロスポリン （Cyclosporins A) を体重 1 gあたり 1 0 g腹腔内に投与した。 移植後 5週間目における 脊髄移植部を抗ヒト細胞核特異抗原に対する抗体で染色したところ移植 細胞は移植部に生着していることが確認できた （図 5 ：参考写真 5参照）, 産業上の利用可能性
本発明によると、 脊髄由来の中枢神経系前駆細胞を損傷脊髄に移植す ることによってシナプス形成能を有するニューロン、 オリゴデンドロサ イ ト、 ァス トロサイ トを誘導することができ、 障害された脊髄機能に改 善が認められることがラッ ト脊髄損傷モデルを用いた実験で確認された, ヒ ト胎児脊髄由来の培養中枢神経系前駆細胞を脊髄損傷モデルラッ 卜に 移植し生着させることも可能となった。 これらの技術をさらに発展させ ることで、 脊髄損傷に対する脊髄再生を目的とした新規の治療法が開発 されることが期待される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロンを誘導することがで きる中枢神経系前駆細胞。
2 . 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロンの他に、 オリゴデン ドロサイ ト及び Z又はァストロサイ トを誘導することができる中枢神経 系前駆細胞。
3 . 脊髄が、 損傷脊髄であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の中 枢神経系前駆細胞。
4 . 脊髄が、 ヒ ト脊髄であることを特徴とする請求項 1 〜 3のいずれか 記載の中枢神経系前駆細胞。
5 . 脊髄由来の神経幹細胞をサイ トカインの存在下で培養することを特 徴とする、 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロンを誘導するこ とができる中枢神経系前駆細胞の調製方法。
6 . 脊髄由来の神経幹細胞をサイ ト力インの存在下で培養することを特 徴とする、 脊髄内で、 シナプス形成能を有するニューロンの他に、 オリ ゴデンドロサイ 卜及びノ又はァス トロサイ トを誘導することができる中 枢神経系前駆細胞の調製方法。 '
7 . 損傷脊髄内で誘導することができる請求項 5又は 6記載の中枢神経 系前駆細胞の調製方法。
8 . ヒ ト脊髄内で誘導することができる請求項 5〜 7のいずれか記載の 中枢神経系前駆細胞の調製方法。
9 . サイ ト力インが、 塩基性繊維芽細胞増殖因子であることを特徴とす る請求項 5〜 8のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞の調製方法。
1 0 . ヒ ト脊髄由来の神経幹細胞を用いることを特徴とする請求項 5〜 9のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞の調製方法。
1 1 . 少なく とも脊髄内で、 請求項 1〜 4のいずれか記載の中枢神経系 前駆細胞又は該細胞から誘導されるニューロンと、 被検物質とを接触さ せ、 前記中枢神経系前駆細胞から誘導されたニューロンにおけるシナプ ス形成の程度を評価することを特徴とするシナプス形成促進物質又は抑 制物質のスクリーニング方法。
1 2 . 請求項 1 1記載のシナプス形成促進物質又は抑制物質のスクリ一 ニング方法により得られるシナプス形成促進物質。
1 3 . 請求項 1 1記載のシナプス形成促進物質又は抑制物質のスクリー ニング方法により得られるシナプス形成抑制物質。
1 4 . 請求項 1〜4のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞を有効成分と することを特徴とする神経損傷又は神経機能改善治療薬。
1 5 . 請求項 1〜 4のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞及び請求項 1 2記載のシナプス形成促進物質を有効成分とすることを特徴とする神経 損傷又は神経機能改善治療薬。
1 6 . 請求項 1 4又は 1 5記載の神経損傷又は神経機能改善治療薬を、 脊髄内に導入することを特徴とする神経損傷又は神経機能疾患の改善治 療方法。
1 7 . 請求項 1〜 4のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞を移植するこ とにより、 脊髄内に導入することを特徴とする神経損傷又は神経機能疾 患の改善治療方法。
1 8 . 請求項 1〜 4のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞を脊髄に移植 することを特徴とするニューロン、 オリゴデンドロサイ ト又はァス ト口 サイ 卜のいずれかの脊髄内誘導方法。
1 9 . 請求項 1〜4のいずれか記載の中枢神経系前駆細胞を脊髄に移植 することにより誘導されたニューロンに形成されたシナプス。
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