WO2002077203A1 - Procedes de selection de beauveriolide i ou beauveriolide iii et procede servant a effectuer la production selective de ces substances - Google Patents

Procedes de selection de beauveriolide i ou beauveriolide iii et procede servant a effectuer la production selective de ces substances Download PDF

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WO2002077203A1
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beauveriolide
substance
iii
medium
culture
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PCT/JP2001/003069
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Satoshi Omura
Hiroshi Tomoda
Original Assignee
Gakkou Houjin Kitasato Gakuen
Japan Society For The Promotion Of Science
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention uses a Bauveriolide-producing bacterium (Bauve rias p.) FO-6979 strain or a mutant strain thereof, and uses a Beveriolide I substance or a Beauveriolide III substance (hereinafter, a Beauveriolide I substance). Or sometimes referred to as substance III) in order to produce selectively and in high yields, a selective culture medium for Beauveriolide I or III, which contains specific amino acids added to a known filamentous fungal medium. It relates to their selective production method.
  • a Bauveriolide-producing bacterium Bauve rias p.
  • FO-6979 strain or a mutant strain thereof uses a Beveriolide I substance or a Beauveriolide III substance (hereinafter, a Beauveriolide I substance). Or sometimes referred to as substance III) in order to produce selectively and in high yields, a selective culture medium for Beauveriolide I or III, which contains specific amino acids added to a known filamentous fungal medium. It
  • the present invention relates to a selective medium for beauveriolide I or III substance for efficiently producing beauveriolide I or III substance in a medium, and a large amount of beauveriolide I or III substance from the selective medium. It provides an efficient selective manufacturing method for manufacturing.
  • the strain used in the present invention is Beauveria sp. FO-6997 (Beauveriasp. Deposited with the Research Institute of Technology on March 18, 1998, and the accession number was FERMP-16771. Then, based on the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedures, the strain was established on March 1-3, 1-1, 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. Industrial Technology Total Transferred to the International Depositary of the National Research Institute for Biotechnology and Industrial Technology, and the accession number is FERMBP—66681.
  • the present invention has been completed on the basis of the above-mentioned findings.
  • the purification method can be performed by extracting from a culture, and then purifying the column. Chromatography has made it possible to purify large quantities of highly purified volume I or III substances. That is, the present invention uses Beauveriasp. Strain F0-6979 or a mutant thereof, and cultivates in a selective medium for the production of a specific substance to which a specific amino acid has been added.
  • Beauveriolide I or III which selectively accumulates Beauveriolide I or III in the culture, and collects Beauveriolide I or III from the culture. It is a selective manufacturing method.
  • the present invention is described in detail by using a Beauverio-producing bacterium FO-6979 strain or a mutant strain thereof, and selectively and with high yield of Beauveriolide I substance or III substance.
  • the present invention relates to a selective medium for Beauveriolide I or III substance, which is obtained by adding a specific amino acid to a filamentous fungal medium for production.
  • the selective medium for the selective production of poly-Veriolide I substances is a salt or ester form in which a specific amino acid added to a known filamentous fungal medium is easily converted into L-leucine or L-single-isine. Derivatives are used.
  • the selective medium used for the production is that a specific amino acid added to a known filamentous fungal medium is easily converted to L-isoleucine, D-isoleucine or L-isoleucine or D-isoleucine.
  • Derivatives such as salts and esters are used.
  • a particularly preferred amino acid used in the present invention is L-leucine in the case of selective production of boberiolide I substance, and L-isoleucine in the case of selective production of boberiolide III substance.
  • the Beauveriolide-producing FO_6979 strain or its mutant strain was cultured in a selective medium containing these specific amino acids in a known filamentous fungus medium, and the Beauveriolide I substance or III was added to the culture. The substance is selectively produced and accumulated, and Beauveriolide I substance or It relates to the selective production of Beauveriolide I or III, which collects III in high yield.
  • the above-mentioned Beauveria sp. F0-69979 strain is mentioned as a preferred example.
  • Mycological properties are highly variable and non-constant, and naturally or commonly used ultraviolet radiation or mutagenic derivatives such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosogazine, ethylmethansulfone It is a well-known fact that mutations are made by artificial mutation means using a cell or the like, and such artificial mutants as well as natural mutants belong to the genus Beauveria and produce Beauveriolide substances. All strains having the ability to do so can be used in the present invention. In addition, all strains belonging to the genus Beauveria and producing Beauveriolide substances, including strains mutated by cell engineering such as cell fusion and genetic manipulation, can be used in the present invention.
  • a Beauveriolide substance-producing bacterium belonging to the genus Beauveria is cultured from a selective medium obtained by adding a specific amino acid to a generally used filamentous fungal medium.
  • a nutrient source of a commonly used medium a nutrient medium containing a carbon source that can be assimilated by microorganisms, a nitrogen source that can be digested, and, if necessary, inorganic salts and vitamins is used.
  • the carbon source glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, dextrin, saccharides such as starch, and vegetable oils such as soybean oil are used alone or in combination.
  • peptone, yeast extract, meat extract, soybean flour, cottonseed flour, corn steep liquor, malt extract, casein and the like are used alone or in combination.
  • Other salts such as phosphates, magnesium salts, sodium salts, potassium salts, etc., and heavy metal salts such as iron salts, manganese salts, copper salts, cobalt salts, zinc salts, etc. are added as needed.
  • the known filamentous fungal medium used in the present invention for example, a medium having a composition of glucose 1.0, tripeptone 0.5%, yeast extract 0.3%, maltect structure 0.3%, and agar 0.1% is used. Is used.
  • This filamentous fungus culture In the case of selective production of Beauveriolide I substance, specific amino acids to be added to the ground are L-port isine or a salt or ester derivative that is easily converted to L-port isine from the time of inoculation. It is added before the production of Riolide I material begins.
  • a derivative such as salt or ester which is easily converted to L-isoleucine or L-isoleucine is used in the same manner as in the above-mentioned Beauveriolide I substance.
  • Is added to The amount of addition is, of course, selected in the range in which the Beauveriolide I substance or III substance is best produced, but is preferably, for example, in the range of 0.1% to 0.3%.
  • an antifoaming agent such as liquid paraffin, animal oil, food oil, silicone oil, or a surfactant may be added as necessary.
  • the medium may be liquid or solid as long as it contains the above-mentioned nutrient source. However, it is usually preferable to culture using a liquid medium. In the case of small-scale production, cultivation using a flask is preferred. When cultivation is carried out in a large tank, in the production process, a relatively small amount of the medium is first inoculated with the production bacteria, and then the culture is transferred to a large tank to prevent the growth of the bacteria from delaying. Culture is preferred. In this case, the composition of the medium used for the preculture and the composition of the medium used for the production culture may be the same, or both may be changed if necessary.
  • the cultivation temperature can be appropriately changed within a range in which the present berylloid substance-producing bacterium produces the present beveriolide substance, but it is usually 25 to 35 ° C, preferably about 27 ° C. It is better to culture.
  • Culture pH is usually 5 to 8, preferably around 7.
  • the cultivation time varies depending on the cultivation conditions. Normally, it is about 72 to 120 hours.
  • a known method for collecting fat-soluble substances or the like can be used.
  • the bacterial cells from which the culture solution has been removed are treated with organic solvents such as acetone, methanol, etc.
  • organic solvents such as acetone, methanol, etc.
  • water in the bacterial cells and a precipitate insoluble in water can be obtained.
  • This is filtered to remove water, and the precipitate is washed with an organic solvent such as hexane, which does not dissolve the beauveriolide substance, and then concentrated under reduced pressure to dryness to give the beauveriolide substance.
  • the obtained concentrate can be separated and collected by a method of silica gel column chromatography.
  • FIG. 1 is an absorbance curve at 210 nm when beauveriolide I substance or III substance was produced in a filamentous fungal medium without addition of an amino acid.
  • FIG. 2 shows an absorbance curve at 210 nm when L-leucine as a specific amino acid was added to a filamentous fungal medium to produce a borideolide I substance or an III substance.
  • FIG. 3 is an absorbance curve at 21 O nm when L-isoleucine as a specific amino acid was added to the filamentous fungal medium to produce sorbiolide I substance or III substance.
  • a seed culture was obtained by shaking culture at 3 ° C for 3 days. -In a 500-ml Erlenmeyer flask, 1.0% glucose, 0.5% tryptone, 0.3% east extract, 0.3% malt extract, and 0.1% agar are supplied in tap water. 100 ml of the medium (adjusted to pH 6.0) dissolved in step 1 was charged, sterilized by steam, 1 ml of the seed culture solution was aseptically transplanted, and stirring culture was started at 27 ° C. .
  • a seed culture solution was obtained according to the same method as in Example 2 described above, and placed in a 30-liter volume culture apparatus (manufactured by Mitsugi Co., Ltd., Japan) with glucose 1.0%, tryptone 0.5%, and yeast extract.
  • a medium (adjusted to pH 6.0) prepared by dissolving 0.3% of Struct, 0.3% of Malt Sect, and 0.1% of Agar in tap water was charged with 20 liters, steam-sterilized, and sterilized by steam. 200 ml of the seed culture was aseptically transplanted, and stirring culture was started at 27 ° C. Twenty-four hours later, a filter-sterilized aqueous solution of L-isoleucine was added aseptically to the culture at a final concentration of 0.1%.
  • a specific amino acid-added filamentous fungal medium is added to a fungus medium for producing B. veriolide FO-6979 or By culturing the mutant strain, selectively producing and accumulating polyvinylidolide I or III in the culture, extracting the beauveriolide I or III from the culture, followed by purification. Highly pure volume I or III substances can be selectively and efficiently produced in large quantities.

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Description

明 細 書 ボーべリオライ ド I物質あるいはボーべリオライ ド I I I物質 の選択培地およびそれらの選択製造法 技術分野
本発明はボーべリオライ ド生産菌 （Bauve r i a s p. ) FO- 69 79株あるいはその変異株を用い、 ボ一ベリオライ ド I物質あるいはボーべリオ ライ ド I I I物質 （以下、 ボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質と呼称す ることもある） を選択的にかつ高収率で生産せしめるために既知の糸状菌培地に 特定のアミノ酸を添加したボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質の選択培 地およびそれらの選択製造法に関する。 背景技術
従来の技術
ボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質 [特願平 1 0— 83659号 （ 特開平 1 1— 279 1 95号公報） ] は、 ボーべリア エスピー （B e a u V e r i a s p. ) FO— 6979株より生産され、 マクロファージ泡沫化を阻害 する物質として、 動脈硬化症の予防、 治療薬として有用であることが既に報告さ れている （生田目ら、 ジャーナル ォブ アンド バイオテックス、 52巻、 1 〜6頁、 1 999年） 。
これらのボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質はその理化学的性状が 互いに類似し、 その分離精製には、 培養液を有機溶媒を用いて抽出し、 抽出液を 減圧下で有機溶媒を留去後、 得られた粗物質について、 逆相系樹脂を用いたカラ ムクロマトグラフィー、 順相系樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー、 高速液 体クロマトグラフィーを行うことによって、 高純度のボーべリオライ ド I物質あ るいは I I I物質を得ていた。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
しかしながら、 ボーべリオライド I物質および I I I物質は理化学的性状が 類似しているために、 両成分を分離するために、 多くの精製工程を必要とするこ とから一度に大量のボーべリオライド I物質あるいは I I I物質を取得すること は困難であると共に精製に多大な時間を要し、 収率低下などを招くなどの種々の 問題があった。 そこで、 ボ一ベリオライド I物質および I I I物質を効率よく大 量に製造し得る簡便な方法が強く求められていた。
本発明はボーべリオライド I物質あるいは I I I物質を培地中で効率よく産 生させるためのボーべリオライド I物質あるいは I I I物質の選択培地、 および 該選択培地からボーべリオライド I物質あるいは I I I物質を大量に製造するた めの効率的な選択製造法を提供するものである。
課題を解決するための手段
ボーべリオライド I物質あるいは I I I物質を直接醱酵法により収率よく大 量に蓄積せしめたという報告は未だ知られていないことから、 本発明者らはボー ベリオライド I物質あるいは I I I物質の生産のための優れた培養、 精製法の検 討を行った。 その結果、 菌株としてボーべリア エスピー （B e a u V e r i a s p . ) F O - 6 9 7 9株を用い、 ボーべリオライド物質を生産せしめる既知 の糸状菌培地に、 L一口イシンあるいは L一イソロイシンなどの特定ァミノ酸を 添加して培養することにより、 ボーべリオライド I物質あるいは I I I物質を選 択的に生産せしめることを見出し、 本発明を完成するに至った。
本発明に用いられる菌株はボーべリア エスピー F O— 6 9 7 9 ( B e a u v e r i a s p . F O— 6 9 7 9 ) として、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の工業技術院生命工学工業技術研究所に平成 1 0年 3月 1 8日に寄託さ れ、 受託番号は F E R M P - 1 6 7 1 6であった。 その後、 本菌株は、 特許手 続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて、 平成 1 1 年 3月 1 6日に日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の経済産業省産業技術総 合研究所生命工学工業技術研究所に国際寄託へ移管され、 受託番号は F E R M B P— 6 6 8 1である。
. 本発明は上記の知見に基づいて完成されたものであって、 ボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質の両物質を選択的に生産させることにより、 精製法を 培養物からの抽出後、 カラムクロマトグラフィーで行うことにより高い純度のボ 一べリオライ ド I物質あるいは I I I物質の大量精製が可能となった。 即ち、 本 発明はボーべリア エスピー （B e a u v e r i a s p . ) F 0— 6 9 7 9株 あるいはその変異株を用い、 特定のァミノ酸を添加した特定物質産生のための選 択培地で培養し、 培養物中にボ一ベリオライ ド I物質あるいは I I I物質を選択 的に蓄積させ、 該培養物よりボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質を採取 することを特徴とするボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質の選択製造法 である。
本発明をより具体的に説明すれば、 ボーべリオ生産菌 F O— 6 9 7 9株ある いはその変異株を用い、 ボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質を選択的に かつ高収率で生産せしめるために糸状菌培地に特定のァミノ酸を添加したことを 特徴とするボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質の選択培地に関する。 ボ 一べリオライ ド I物質の選択生産の場合の選択培地は、 既知の糸状菌培地に添加 される特定ァミノ酸が、 L—ロイシンあるいは L一口イシンに容易に変換される 塩やエステル体などの誘導体が用いられる。 ボーべリオライ ド I I I物質の選択 生産の場合の選択培地は、 既知の糸状菌培地に添加される特定アミノ酸が、 L 一 イソロイシン、 D—イソロイシンあるいは L—イソロイシン、 D—イソロイシン に容易に変換される塩やエステル体等の誘導体が用いられる。
本発明において用いられる特に好ましいァミノ酸としては、 ボーべリオライ ド I物質の選択生産の場合は、 L —ロイシンであり、 ボーべリオライ ド I I I物 質の選択生産の場合は、 L一イソロイシンである。 これらの特定アミノ酸を既知 の糸状菌培地に添加した選択培地に、 ボーべリオライ ド生産菌 F O _ 6 9 7 9株 あるいはその変異株を培養し、 培養物中にボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質を選択的に生産蓄積させ、 該培養物よりボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質を高収率で採取するボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質の選 択製造法に関する。
本発明で使用されるボ一ベリオライ ド物質生産菌としては、 前述のボーベリ ァ エスピー （B e a u V e r i a s p . ) F 0— 6 9 7 9菌株が好ましい例 として挙げられるが、 菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、 一定したものではなく、 自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘 導体、 例えば N—メチル一 N' —ニトロ一 N—二トロソグァ二ジン、 ェチルメタ ンスルホネ一トなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実で あり、 このような人工的変異株は勿論、 自然変異株を含め、 ボーべリア属に属し 、 ボーべリオライ ド物質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用する ことができる。 また、 細胞融合、 遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株 も含め、 ボーべリア属に属し、 ボーべリオライ ド物質を生産する菌株は、 全て本 発明において使用することができる。
本発明を実施するに当たっては、 通常用いられる糸状菌培地に特定のァミノ 酸を添加した選択培地からボーべリア属に属するボーべリオライ ド物質生産菌を 培養することにより行われる。 通常用いられる培地の栄養源としては、 微生物が 同化し得る炭素源、 消化し得る窒素源、 さらに必要に応じて無機塩、 ビタミン等 を含有させた栄養培地が使用される。 炭素源としては、 グルコース、 フラク トー ス、 マルトース、 ラク トース、 ガラク トース、 デキストリン、 澱粉等の糖類、 大 豆油などの植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
消化し得る窒素源としては、 ペプトン、 酵母エキス、 肉エキス、 大豆粉、 綿 実粉、 コーン 'スチープ · リカー、 麦芽エキス、 カゼインなどが単独または組み 合わせて用いられる。 その他必要に応じてリン酸塩、 マグネシウム塩、 ナトリウ ム塩、 カリウム塩等の塩類、 鉄塩、 マンガン塩、 銅塩、 コバルト塩、 亜鉛塩など の重金属塩類ゃビ夕ミン類などが適宜添加される。
本発明において用いられる既知の糸状菌培地としては、 例えばグルコース 1 . 0 トリペプトン 0 . 5 %、 イーストェクストラク ト 0 . 3 %、 マルトェク ストラク ト 0 . 3 %、 ァガー 0 . 1 %の組成のものが用いられる。 この糸状菌培 地に添加する特定アミノ酸は、 ボーべリオライ ド I物質の選択的生産の場合には 、 L一口イシンあるいは L一口イシンに容易に変換される塩やエステル体などの 誘導体を植菌時からボーべリオライ ド I物質の生産がはじまる前に添加される。 また、 ボーべリオライ ド I I I物質の選択的生産の場合には、 L—イソロイシン あるいは L一イソロイシンに容易に変換される塩やエステル体等の誘導体を上記 のボーべリオライ ド I物質の場合と同様に添加される。 添加量としては、 ボーべ リオライ ド I物質あるいは I I I物質が最良に生産される範囲が選択されること は勿論であるが、 例えば 0 . 1 %〜0 . 3 %の範囲が好ましい。
培養するにあたり、 発泡の激しいときには、 必要に応じて液体パラフィ ン、 動物油、 食物油、 シリコン油、 界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。 上記 の培養は、 前記の栄養源を含有すれば、 培地は液体でも固体でもよいが、 通常は 液体培地を用い、 培養するのがよい。 少量生産の場合にはフラスコを用いる培養 が好適である。 培養を大きなタンクで行う場合は、 生産工程において、 菌の生育 遅延を防止するため、 はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、 次 に培養物を大きなタンクに移して、 そこで生産培養するのが好ましい。 この場合 、 前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、 両者ともに同 一であつてもよいし、 必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、 例えばプロペラやその他の機械による攪 拌、 ファメーターの回転または振とう、 ポンプ処理、 空気の吹き込みなど既知の 方法が適宜使用される。 通気用の空気は滅菌したものを使用する。 培養温度は、 本ボ一ベリオライ ド物質生産菌が本ボーべリオライ ド物質を生産する範囲内で適 宜変更し得るが、 通常は 2 5〜3 5 °C、 好ましくは 2 7 °C前後で培養するのがよ レ、。 培養 p Hは、 通常は 5〜8、 好ましくは 7前後で培養するのがよい。 培養時 間は、 培養条件によっても異なる力 \ 通常は 7 2〜 1 2 0時間程度である。
このように、 ボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質を選択的に生産さ せた培養物より、 ボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質を採取するには、 脂溶性物質などを採取する公知の方法を用いることができる。 例えば、 培養液を 除去した菌体をァセトン、 メタノールなどの有機溶媒でボーべリオライ ド物質を 抽出し、 減圧濃縮することにより菌体中の水分と水に不溶な析出物が得られる。 これをろ過することにより、 水分を除去した後、 析出物をへキサンなどのような ボーべリオライド物質が溶解しない有機溶媒により洗浄した後、 減圧濃縮して乾 固することにより、 ボーべリオライド物質を含む濃縮物が得られる。 ボーべリオ ライド I物質あるいは I I I物質を採取するには、 得られた濃縮物をシリカゲル カラムクロマトグラフィ一の方法により分離採取することができる。 図面の簡単な説明
第 1図はァミノ酸添加なしの糸状菌培地にボーべリオライド I物質あるいは I I I物質を生産させた場合の 2 1 0 nmでの吸光度曲線である。
第 2図は糸状菌培地に特定ァミノ酸として L一ロイシンを添加してボーべリ ォライド I物質あるいは I I I物質を生産させた場合の 21 0 nmでの吸光度曲 線である。
第 3図は糸状菌培地に特定ァミノ酸として L—イソロイシンを添加してボー ベリオライド I物質あるいは I I I物質を生産させた場合の 2 1 O nmでの吸光 度曲線である。 発明を実施するための最良の形態
以下本発明の実施例を具体的に説明するが、 本発明はこれのみに限定される ものではない。
実施例 1
5 Om 1容大試験管にグルコース 2. 0%、 ポリペプトン 0. 5%、 ィ一ス トェクストラクト 0. 2%、 KH2 P 04 0. 1 %、 ァガ一 0. 1 %、 MgSO
4 · 7H2 0 0. 05 %を水道水で溶解した培地 （pH6. 0に調整） 1 0m 1を仕込み、 綿栓後、 蒸気滅菌し、 寒天培地上に生育させたボ一ベリア エスピ
- (B e auv e r i a s p. ) F 0- 6979 (FERM BP- 668 1
) の胞子懸濁液 （1 07 s po r e s/m l) を 1 0 z l無菌的に植菌し、 27
°Cで 3日間、 振とう培養して種培養液を得た。 —方、 5 0 0 m 1容三角フラスコにグルコース 1. 0 %、 トリプトン 0. 5 %、 イーストェクストラク ト 0. 3 %、 マルトェクストラク ト 0. 3%、 ァガー 0. 1 %を水道水で溶解した培地 （pH 6. 0に調整） を 1 0 0m 1仕込み、 蒸 気滅菌し、 前記の種培養液 1 m 1を無菌的に移植し、 2 7 °Cで攪拌培養を開始し た。 2 4時間後、 これらの培養液に、 ろ過滅菌したアミノ酸 （L—ロイシン、 D - a 1 l o—イソロイシン、 L— a l l o—イソロイシン、 D—イソロイシンあ るいは L一イソロイシン） 水溶液を最終濃度 0. 1 %で無菌的に添加した。 これ をさらに 2 7 °Cで 6日間、 攪拌培養した。
培養開始から 2 4時間毎に 3 m Lの培養液を無菌的に採取し、 K U B 0 T A KN- 7 0遠心器 （KUBOTA社製、 日本国） を用いて、 3 0 0 0 r pmで 1 0分間、 遠心して上清と菌体に分離し、 菌体を 3mLのメタノールに溶解し、 そのうち 1 〃 1について H ew 1 e t t P a c k a r d s e r i e s 1 1 0 0 HPLC s y s t em (Hew l 1 e t P a k a r d社製、 米国） を 用いて、 高速液体クロマトグラフィ一 [カラム： S ymme t r y (2. 1 x 1 5 0 mm. 5 zm) (W a t e r s社、 米国） 、 流速： 0. Sm l Zm i n、 検 出波長： 2 1 0 nm、 移動相： 3 0〜7 0 %CH3 CNZ0. 0 5 %H3 P04 、 2 0 m i n ] を行った。
上記のようにして培養したボーべリオライド I物質および I I I物質の生産 量は下記の式に従って算出した。
ボーべリオライドの培養液中の溶液 （ g/m l ) = [ボーべリオライド 標品の濃度 （ gZm 1 ) X培養液由来のボーべリオライドのピーク面積]
+ボーべリオライド標品のピーク面積
により生産量を算出した。 その算出結果は、 下記の第 1表にそれぞれ示すとおり であった。 第 1表 上段ボ一ベリオライ ド I物質
添加ァミノ酸 ( g/τη 1 ) 下段ボーべリオライ ド I I I物質
1 曰目 2曰目 3曰目 4曰目 5曰目 6曰目 コン ト口一ノレ 0 4.2 8.0 13 8.2 5.3 (無添加） 0 6.3 11.0 23 19.0 16.0
+ L—口イシン 0 12 34.0 74.0 65 51
0 0 3.2 5.2 11 18
+L -イソロイ 0 0 1.9 2.6 5.2 4.6 シン 0 16 42.0 80.0 89.0 87.0
+D -イソロイ 0 3.0 5.4 6.4 4.8
シン 0 5.8 23.0 19.0 14.0
+ L- a 1 1 0 0 2.4 6.0 5.5 4.7
一イソロイシン 0 4.0 11.0 9.2 7.5
+ D- a 1 1 0 0 3.1 4.7 5.5 4.2 5.3 一イソロイシン 0 5.2 19.0 21.0 13.0 20.0 以上の結果から明らかなように、 ボ一ベリオライ ド I物質およびボーべリオ ライ ド I I I物質の生産量は、 アミノ酸を添加しない培地での培養は 4日目に最 大となり、 特にボーべリオライ ド I物質では 1 3 gZm 1、 ボーべリオライ ド I I I物質では 2 3 g/m 1 [ (モル比で 3 6 ： 6 4) 、 第 1図参照] とそれ ぞれ算出された。
これに対し、 本発明の特定アミノ酸を糸状菌培地に添加した場合には、 ボー ベリオライ ド I物質あるいは I I I物質の高い選択的生産が認められた。 特に培 地に L一口イシンを添加した培養では、 ボーべリオライド I物質を選択的に高生 産させることが可能となり、 4日目での生産量は 7 4 / gZm 1 [ (モル比で 9 3 : 7) 、 第 2図参照] と算出された。 また、 L一イソロイシンを培地に添加し た培養では、 ボーべリオライド I I I物質を選択的に高生産させることが可能と なり、 4日目での生産量は 8 0 u g/m 1 [ (モル比で 3 : 9 7) 、 第 3図参照 ] と算出された。 実施例 2
5 0 0 m 1容三角フラスコにグルコース 2. 0 %、 ポリプトン 0. 5 %、 ィ 一ストェクストラクト 0. % KH2 P 04 0. 1 %、 ァガー 0. 1 %、 Mg S04 - 7H2 0 0. 0 5 %を水道水で溶解した培地 （pH 6. 0に調整） 1 0 0m lを仕込み、 綿栓後、 蒸気滅菌し、 寒天培地上に生育させたボーべリア エスピー （B e a u v e r i a s p. ) FO- 6 9 7 9 (FERM B P— 6 6 8 1 ) の胞子懸濁液 （ 1 07 s p o r e s Zm l ) を 1 0 0 / 1無菌的に植菌 し、 2 7°Cで 3日間振とう培養して種培養液を得た。
一方、 3 0 リ ッ トル容ジャー培養装置 （三ッヮ社製） にグルコース 1. 0 % 、 ト リプトン 0. 5 %、 イーストェクストラク ト 0. 3%、 マルトェクス トラク ト 0. 3 %、 ァガ一 0. 1 %を水道水で溶解した培地 （pH 6. 0に調整） を 2 0リッ トル仕込み、 蒸気滅菌し、 上記の種培養液 2 0 0 m lを無菌的に移植した 。 これを 2 7 °Cで攪拌培養を開始した。 24時間後、 この培養液にろ過滅菌した L一口イシン水溶液を最終濃度 0. 1 %で無菌的に添加した。 これをさらに 2 7 °Cで 4日間攪拌培養して得られた培養液 2 0リッ トルを、 国産式 S型超遠心分離 機 S— 6型 （国産精ェ社製、 日本国） を用いて、 1 0 0 0 0回転で上清と菌体に 分離し、 菌体を 1 8 リ ッ トルのアセトンで処理してろ過した後、 ろ液を減圧濃縮 して水溶液および析出物を得た。
この析出物を 20 Om 1へキサンで洗浄し、 不溶の粗物質 3 gを得た。 これ をシリカゲル （ 30 0 g、 シリカゲル 6 0、 メルク社製、 米国） のカラムにチヤ ージし、 クロ口ホルム一メタノール （ 1 0 0 : 0、 1 0 0 : 1、 1 0 0 : 2、 1 0 0 : 3、 0 : 1 0 0) の溶液各 1. 8リツ トルで段階的に溶出させた。 クロ口 ホルム一メタノール = 1 0 0 : 2画分を集め、 減圧乾固して、 ボーべリオライ ド I物質 （純度 9 5%以上） を 4 3 Omg得た。 実施例 3
前記の実施例 2と同様の方法に従って種培養液を得て、 3 0 リツ トル容ジャ 一培養装置 （三ッヮ社製、 日本国） にグルコース 1. 0 %、 トリプトン 0. 5 % 、 イーストェクストラク ト 0. 3 %、 マルトェクストラク ト 0. 3%、 ァガー 0 . 1 %を水道水で溶解した培地 （pH 6. 0に調整） を 2 0リッ トル仕込み、 蒸 気滅菌し、 前記の種培養液 20 0 m lを無菌的に移植し、 27 °Cで攪拌培養を開 始した。 24時間後、 この培養液にろ過滅菌した L一イソロイシン水溶液を最終 濃度 0· 1 %で無菌的に添加した。
これをさらに 2 7°Cで 4日間攪拌培養して得られた培養液 2 0 0リ ツ トルを 、 国産式 S型超遠心分離機 S - 6型 （国産精ェ社製、 日本国） を用いて 1 0 0 0 0回転で上清と菌体に分離し、 菌体を 1 8リッ トルのァセトンで処理し、 ろ過し た後、 ろ液を減圧濃縮して水溶液および析出物を得た。 この析出物を 2 0 0m l へキサンで洗浄し、 不溶の粗物質 3 gを得た。 これをシリカゲル （30 0 g、 シ リカゲル 6 0、 メルク社製、 米国） のカラムにチャージし、 クロ口ホルム ： メタ ノール （ 1 0 0 : 0、 1 0 0 : 1、 1 0 0 : 2、 1 0 0 : 3、 0 : 1 0 0) の溶 液各 1. 8リッ トルで段階的に溶出させた。 そしてクロ口ホルム ： メタノール = 1 0 0 : 2画分を集め、 減圧乾固して、 ボーべリオライ ド I I I物質 （純度 9 5 %以上） を 4 5 Omg得た。 産業上の利用可能性
本発明のボーべリオライ ド I物質あるいは I I I物質を選択的にかつ高収率 で生産せしめるために特定ァミノ酸を添加した糸状菌培地にボ一ベリオライ ド生 産菌 F O— 6 9 7 9株あるいはその変異株を培養し、 培養物中にボ一ベリオライ ド I物質あるいは I I I物質を選択的に生産蓄積させ、 該培養物よりボーべリオ ライド I物質あるいは I I I物質を抽出後、 精製を行うことにより高い純度のボ 一べリオライド I物質あるいは I I I物質を選択的に効率よくかつ大量に製造し 得る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ボーべリオ生産菌 F O— 6 9 7 9株あるいはその変異株を用い、 ボー ベリオライ ド I物質あるいはボーべリオライ ド I I I物質を選択的にかつ高収率 で生産せしめるための培養培地に、 特定ァミノ酸を添加したことを特徴とするボ 一べリオライ ド I物質あるいはボーべリオライ ド I I I物質の選択培地。
2 . 培地が糸状菌培地である請求の範囲第 1項に記載の選択培地。
3 . ボーべリオライ ド I物質の選択生産の場合の培地に添加される特定ァ ミノ酸が、 L—ロイシンあるいは L—ロイシンに容易に変換される塩やエステル 体などの誘導体である請求の範囲第 1項に記載の選択培地。
4 . ボーべリオライ ド I I I物質の選択生産の場合の培地に添加される特 定ァミノ酸が、 L一イソロイシンあるいは L一イソロイシンに容易に変換される 塩やエステル体等の誘導体である請求の範囲第 1項に記載の選択培地。
5 . 請求の範囲第 1項に記載の選択培地にボーベリォライ ド生産菌 F〇一 6 9 7 9株あるいはその変異株を培養し、 培養物中にボーべリオライ ド I物質あ るいはボーべリオライ ド I I I物質を選択的に生産蓄積させ、 該培養物よりボー ベリオライ ド I物質あるいはボーべリオライ ド I I I物質を高収率で採取するこ とを特徴とするボーべリオライ ド I物質あるいはボーべリオライ ド I I I物質の 選択製造法。
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