WO2002071068A1 - Verfahren zum erfassen von makromolekularen biopolymeren mittels mindestens einer mit einem fängermolekül versehenen immobilisierungseinheit - Google Patents

Verfahren zum erfassen von makromolekularen biopolymeren mittels mindestens einer mit einem fängermolekül versehenen immobilisierungseinheit Download PDF

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WO2002071068A1
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macromolecular biopolymers
molecules
dna
detected
unit
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Johannes R. Luyken
Franz Hofmann
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Infineon Technologies Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for detecting macromolecular biopolymers by means of at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers.
  • the sensor 200 has two electrodes 201, 202 made of gold, which are embedded in an insulator layer 203 made of insulator material. Electrode connections 204, 205 are connected to the electrodes 201, 202, to which the electrical potential applied to the electrode 201, 202 can be supplied. The electrodes 201, 202 are arranged as planar electrodes. DNA probe molecules 206 are immobilized on each electrode 201, 202 (cf. FIG. 2a). The immobilization takes place according to the so-called gold-sulfur coupling.
  • the analyte to be examined for example an electrolyte 207, is applied to the electrodes 201, 202.
  • the electrolyte 207 contains DNA strands 208 with a sequence that is complementary to the sequence of the DNA probe molecules 206, these DNA strands 208 hybridize with the DNA probe molecules 206 (cf. FIG. 2b).
  • Hybridization of a DNA probe molecule 206 and a DNA strand 208 takes place only if the sequences of the respective DNA probe molecule 206 and the corresponding DNA Strands 208 are complementary to each other. If this is not the case, no hybridization takes place. Thus, a DNA probe molecule of a given sequence is only able to bind to a specific one, namely the DNA strand with a complementary sequence, ie to hybridize with it.
  • [5] discloses a further procedure for examining the electrolyte for the existence of a DNA strand with a predetermined sequence.
  • the DNA strands of the desired sequence are labeled with a fluorescent dye and their existence is determined on the basis of the reflective properties of the labeled molecules.
  • light in the visible wavelength range is radiated onto the electrolyte and the light reflected by the electrolyte, in particular by the marked DNA strand to be detected, is detected. Due to the reflection behavior, i.e. in particular on the basis of the detected, reflected light rays, it is determined whether or not the DNA strand to be detected with the correspondingly predetermined sequence is contained in the electrolyte.
  • This procedure is very complex, since a very precise knowledge of the reflection behavior of the corresponding DNA strand is required and it is also necessary to label the DNA strands before starting the method. Furthermore, a very precise adjustment of the detection means for detecting the reflected light rays is necessary so that the reflected light rays can be detected at all. This procedure is therefore expensive, complicated and very sensitive to interference, which means that the measurement result can easily be falsified.
  • affinity chromatography cf. [6]
  • immobilized small molecules in particular ligands of high specificity and affinity
  • ligands of high specificity and affinity to generate peptides and proteins, e.g. Enzymes to bind specifically in the analyte.
  • a reduction / oxidation-recycling method for detecting macromolecular biopolymers from [2] and [3] is also known.
  • the reduction / oxidation recycling process hereinafter also referred to as the redox recycling process, is explained in more detail below with reference to FIGS. 4 a to 4 c.
  • FIG. 4a shows a biosensor 400 with a first electrode 401 and a second electrode 402, which are applied to a substrate 403 as an insulator layer.
  • a holding area designed as a holding layer 404, is applied to the first electrode 401 made of gold. The holding area is used to immobilize DNA probe molecules
  • the sensor 400 is treated with a solution 406 to be examined, e.g. an electrolyte, brought into contact in such a way that any DNA strands contained in the solution 406 to be examined can hybridize with the complementary sequence to the sequence of the DNA probe molecules 405.
  • a solution 406 to be examined e.g. an electrolyte
  • Fig.4b shows the case that in the solution to be examined
  • the DNA strands 407 to be detected are contained and hybridized to the DNA probe molecules 405.
  • the DNA strands 407 in the solution to be examined are marked with an enzyme 408, with which it is possible to cleave the molecules described below into partial molecules.
  • DNA probe molecules 405 is provided than the DNA strands 407 to be determined are contained in the solution 406 to be examined.
  • the biosensor 400 is rinsed, as a result of which the non-hybridized DNA strands are removed and the biosensor 400 from it investigating solution 406 is cleaned.
  • An electrically uncharged substance is added to this rinsing solution used for rinsing or another solution 412, which is supplied in a separate phase, and which contains molecules which, by means of the enzyme on the hybridized DNA strands 407, into a first submolecule of a negative first electrical charge and into a second Part of a positive second electrical charge can be split.
  • the negatively charged partial molecules are drawn to the positively charged anode, as indicated by arrow 411 in FIG. 4c.
  • the negatively charged first partial molecules 410 are oxidized on the first electrode 401, which has a positive electrical potential as the anode, and are oxidized as the oxidized partial molecules 413 on the negatively charged cathode, i.e. pulled the second electrode 402 where they are reduced again.
  • the reduced sub-molecules 414 in turn migrate to the first electrode 401, i.e. to the anode.
  • the electrical parameter that is evaluated with this method is the change in the electrical current - as dt
  • the abovementioned methods for the detection of macromolecular biopolymers have in common that the macromolecular biopolymers to be detected are marked before the actual detection method is carried out. This is not only complex and, for example, associated with the risk that, for example, part of the sample to be examined can be lost or that the marking does not run quantitatively, but can also entail other disadvantages.
  • the fluorescent markers can reduce the mobility of the DNA molecules and thus slow down the detection process.
  • [15] also discloses a method for screening target-ligand interactions using a chemical library of ligands, in which at least one fluorescence property of a chemical library of ligands immobilized on a solid phase, a molecular fluorescence sensor being bound to each ligand , before and after adding the target.
  • a self-addressable microelectronic device is known from [17], which is designed in such a way that it can actively carry out molecular-biological multi-step reactions and multiplex reactions in microscopic formats.
  • the problem underlying the invention is to provide an alternative method and a device for the detection of macromolecular biopolymers.
  • This method for detecting macromolecular biopolymers uses at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers.
  • the at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers is (first) provided with capture molecules, the capture molecules being able to bind macromolecular biopolymers on the one hand and having a label on the other that can generate a detectable signal.
  • a sample to be examined is then brought into contact with the at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers, wherein the sample to be examined can contain the macromolecular biopolymers to be detected.
  • the macromolecular biopolymers contained in the sample to be examined are then bound to the capture molecules. Subsequently, capture molecules to which no macromolecular biopolymers to be detected have bound are removed and the macromolecular biopolymers are detected by means of the marking.
  • the present method is based on the knowledge that the macromolecular biopolymers to be detected are not provided with a label, as before, but that the capture molecules are provided with a label before immobilization. This has the advantage that the sample to be examined no longer has to be subjected to a labeling reaction in which a part of the sample or possibly the entire sample is lost or does not run completely during the labeling.
  • the device for detecting macromolecular biopolymers disclosed here has at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers and one detection unit.
  • the at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers is provided with capture molecules, the capture molecules being able to bind macromolecular biopolymers, and the capture molecules having a label which can generate a detectable signal.
  • the detection unit in the device is designed in such a way that it detects macromolecular biopolymers that have bound to the capture molecules by means of the marking.
  • the device has a plurality of units for immobilizing macromolecular biopolymers in a regular arrangement (an array).
  • the at least one immobilization unit or the regular arrangement of the units is preferably applied to a CMOS camera or a CCD.
  • the marking generates a signal.
  • a signal is an electrical current.
  • the signal is visible light or UV light.
  • the signal can also consist of radioactive radiation or X-rays.
  • the label can be a (chemical) compound or group that is directly capable of generating a signal that can be used to detect the macromolecular biopolymers.
  • This signal can be generated can be excited externally, but the marker can also emit the signal without external excitation.
  • the label is, for example, a fluorescent dye (fluorophore) or a cheiluminescent dye, in the latter case, for example, a radioisotope.
  • the label can be a substance that only indirectly generates a signal for the detection of the macromolecular biopolymers, i.e. a substance that causes the signal to be generated.
  • a reporter group can be an enzyme that catalyzes a chemical reaction and the chemical reaction is used to detect the biopolymers.
  • enzymes are alkaline phosphatase, glutathione-S-transferase, superoxide dismutase, marine right peroxidase, alpha-galactosidase and beta-galactosidase. These enzymes are able to cleave suitable substrates, the colored end products or e.g.
  • the group of labels that only indirectly generate a signal that can be used to detect macromolecular biopolymers also includes ligands for binding proteins and substrates for enzymes. This label is commonly referred to here as enzyme ligands. Examples of such enzyme ligands that can be used as labels are biotin, digoxigenin or substrates for the above-mentioned enzymes.
  • detection means both the qualitative and quantitative detection of macromolecular biopolymers in an analyte to be examined.
  • capture also includes determining the absence of macromolecular biopolymers in the analyte.
  • unit for immobilization in the sense of
  • Invention understood an arrangement that has a surface on which the capture molecules can be immobilized, i.e. to which the capture molecules can bind through physical or chemical interactions.
  • Interactions include hydrophobic or ionic
  • suitable surface materials that can be used for the at least one immobilization unit are metals such as gold or silver, plastics such as polyethylene or polypropylene or inorganic substances such as silicon dioxide, e.g. in the form of glass.
  • An example of a physical interaction that causes immobilization of the capture molecules is adsorption on the surface.
  • This type of immobilization can take place, for example, if the immobilization agent is a plastic material that is used for the production of microtiter plates (e.g. polypropylene).
  • a covalent linkage of the capture molecules to the immobilization unit is preferred because the orientation of the capture molecules can thereby be controlled.
  • the covalent linkage can take place via any suitable linker chemistry ("linker chemistry").
  • the at least one immobilization unit is applied to an electrode or a photodiode.
  • the at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers is a nanoparticle.
  • a nanoparticle is understood to mean a particle which can be obtained by so-called nanostructuring processes.
  • Nanostructuring methods that can be used to produce such nanoparticles on suitable substrates are, for example, the use of block copolymer microemulsions described in [12] and [13] or the use of colloid particles as structuring asks described in [14].
  • the method described in [14] is in principle analogous to a lithography method usually used in the field of substrate structuring.
  • a nanoparticle within the meaning of the invention is therefore not restricted to those particles which are obtained by one of the methods mentioned here by way of example. Rather, such a nanoparticle is any particle whose diameter is in the nanometer range, ie generally in the range from 2 to 50 nm, preferably in the range from 5 to 20 nm, particularly preferably in the range from 5 to 10 nm.
  • a “unit for immobilization, which is a nanoparticle”, which is also referred to below as a nanoparticle-shaped unit, is consequently a nanoparticle described above, which has a surface on which the capture molecules can be immobilized, ie the surface is such that you can bind the capture molecules through physical or chemical interactions. These interactions include hydrophobic or ionic (electrostatic) interactions and covalent bonds.
  • suitable surface materials that can be used for the at least one nanoparticle-shaped unit for immobilization are metals such as gold or silver, semiconducting materials such as silicon, plastics such as polyethylene or polypropylene or silicon dioxide, for example in the form of glass.
  • Nanoparticulate units made of plastics and silicon dioxide can be created using the colloid mask described in [14]. Process available. Nanoparticle-shaped units made of semiconducting materials such as silicon can also be formed, for example, by the Stranski-Krastanov process. By oxidizing such nanoparticles from silicon, nanoparticle-shaped units made from silicon dioxide are still available.
  • nanoparticle-shaped immobilization units which are applied to suitable substrate surfaces (holding areas), for example of photodiodes or electrodes, assume a regular arrangement with distances from one another in the range of a few 10 nanometers, for example from approximately 10 to 30 nm on these surfaces.
  • substrate surfaces holding areas
  • nanoparticle-shaped units for immobilization An advantage of using nanoparticle-shaped units for immobilization is that a precisely defined number of capture molecules can be immobilized on these nanoparticles. This is particularly advantageous in the quantitative detection of macromolecular biopolymers using the present method.
  • Another advantage of using nanoparticles as immobilization units is that the spacing of the nanoparticles from one another, i.e. the spatial separation of the capture molecules, gives the capture molecules better spatial accessibility for the macromolecular biopolymers that bind to them, and thus the probability of one Interaction is increased. Training as a nanoparticle also increases the effective surface.
  • Macromolecular biopolymers include nucleic acids such as DNA and RNA molecules or shorter nucleic acids such as
  • the nucleic acids can be double-stranded, but can also have at least single-stranded regions or, for
  • the sequence of the nucleic acids to be detected can be at least partially or completely predetermined, i.e. be known.
  • Other macromolecular biopolymers are
  • Proteins or peptides These can usually be found in
  • proteins or peptides are to be detected as macromolecular biopolymers
  • ligands which can specifically bind the proteins or peptides to be detected are preferably used as capture molecules.
  • the capture molecules / ligands are preferably linked to the immobilization agent by covalent bonds.
  • Low-molecular enzyme agonists or enzyme antagonists pharmaceuticals, sugars or antibodies or any molecule that has the ability to specifically bind proteins or peptides can be considered as ligands for proteins and peptides. If DNA molecules (nucleic acids or oligonucleotides) have a given nucleotide sequence with the one described here
  • Methods are recorded, they are preferably recorded in single-stranded form, i.e. they may be before the
  • Capture molecules then preferably used DNA probe molecules with a sequence complementary to the single-stranded region.
  • the DNA probe molecules can in turn
  • the present method not only to detect a single type of biopolymer in a single series of measurements. Rather, several macromolecular biopolymers can be recorded simultaneously or one after the other.
  • several types of capture molecules each of which has a (specific) binding affinity for a specific biopolymer to be detected, can be bound on the immobilization unit and / or several immobilization units can be used, each of these units only a kind of capture molecule is bound.
  • a mark that can be distinguished from the other markings is preferably used for each macromolecular biopolymer to be detected.
  • two or more fluorophores can be used as labels, each of these fluorophores preferably having a specific excitation and emission wavelength.
  • Unit for immobilization with the capture molecules which have a label that has a detectable
  • a sample to be examined preferably a liquid medium such as an electrolyte
  • the immobilization unit is then brought into contact with the immobilization unit. This is done in such a way that the macromolecular biopolymers can bind to the capture molecules.
  • the conditions are selected such that they can bind to their corresponding capture molecule at the same time or one after the other.
  • the unbound ligands used as capture molecules are removed from the at least one immobilization unit by bringing a material into contact with the at least one immobilization unit, the material being able to do so to hydrolyze the chemical bond between the ligand and the immobilization unit.
  • the capture molecules are low molecular weight ligands, they can also be removed enzymatically, if unbound.
  • the ligands are covalently linked to the immobilization unit via an enzymatically cleavable compound, for example via an ester compound.
  • a carboxyl ester hydrolase (esterase) can be used to remove unbound ligand molecules.
  • This enzyme hydrolyzes the ester bond between the immobilization unit and the respective ligand molecule that was not bound by a peptide or protein.
  • the ester compounds between the immobilization unit and those molecules which have entered into a binding interaction with peptides or proteins remain intact due to the reduced steric accessibility which occurs due to the space filling of the bound peptide or protein.
  • the unbound probe molecules are DNA strands
  • the unbound probe molecules are removed enzymatically, for example with the aid of an enzyme with nuclease activity.
  • An enzyme which selectively degrades single-stranded DNA is preferably used as the enzyme with nuclease activity.
  • the selectivity of the degrading enzyme for single-stranded DNA must be taken into account. If the enzyme selected for the degradation of non-hybridized single DNA strands does not have this selectivity, the DNA to be detected, which is present in the form of a double-stranded hybrid with the probe molecule, may also be degraded undesirably.
  • DNA nucleases for example a nuclease from mung beans, the nuclease P1 or the nuclease S1 can be used. Likewise, you can
  • DNA degradation can be used.
  • the macromolecular biopolymers are detected by means of the label.
  • a signal spontaneously emitted by the marking such as radioactive radiation or by a signal caused by external excitation such as emitted fluorescent radiation is measured.
  • the biosensor can be designed in such a way that the measurement takes place in a spatially resolved manner directly on the sensor, for example by the immobilization unit is applied directly to a photocell used for the measurement and the photocell is connected to a corresponding evaluation unit.
  • This has the advantage of a simplified measuring arrangement.
  • Such a measuring arrangement can e.g. using a conventional CMOS camera or a CCD.
  • an external unit for the detection of the emitted fluorescence radiation can be used in such a way that the measurement takes place in a spatially resolved manner directly on the sensor, for example by the immobilization unit is applied directly to a photocell used for the measurement and the photocell is connected to a corresponding evaluation unit.
  • the signal can also be measured before or after the at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers is provided with the capture molecules.
  • the determined values from the two measurement of the signal compared with each other. If the signal intensity of the measured values differ in such a way that the
  • FIGS. 2a and 2b show a sketch of two planar electrodes, by means of which the existence of DNA strands to be detected in an electrolyte (FIG. 2a) or their nonexistence (FIG. 2b) can be verified;
  • Embodiment of the method described here can be carried out
  • FIGS. 4a to 4c sketches of a biosensor according to the prior art, on the basis of which individual conditions are explained in the context of the redox recycling process;
  • FIG. 5 shows a functional curve of a circulating current according to the prior art in the context of a redox recycling process
  • FIGS. 6a and 6b show a biosensor with which a redox
  • FIG. 1 shows a detail from a biosensor 100 with which a first exemplary embodiment of the method described here can be carried out.
  • Fig.la shows the biosensor 100 with a first photodiode 101 and a second photodiode 102, which are arranged in an insulator layer 103 made of insulator material.
  • the first photodiode 101 and the second photodiode 102 are connected to an evaluation unit (not shown) via first electrical connections 104 and second electrical connections 105, respectively.
  • the two photodiodes 101, 102 are further provided with an oxide layer 106 and a first unit 107 for immobilizing macromolecular biopolymers and a second unit 108 for immobilizing macromolecular biopolymers.
  • the immobilization units 107 and 108 are made of gold.
  • the units 107, 108 for immobilization can also be made of silicon oxide and coated with a material that is suitable for immobilizing capture molecules.
  • alkoxysilane derivatives can be used, such as
  • a capture molecule to be immobilized reacts with such an activated group, it is bound via the selected material as a kind of covalent linker on the surface of the coating on the immobilization unit.
  • DNA probe molecules 109, 110 are applied to the immobilization units 107 and 108 as capture molecules.
  • first DNA probe molecules 109 with a sequence complementary to a predetermined first DNA sequence are applied to the first photodiode 101 by means of the unit 107.
  • the DNA probe molecules 109 are each labeled with a first fluorophore 111.
  • fluorescein can be used as the fluorophore.
  • the capture molecules 109 can be labeled by enzymatically labeling a correspondingly labeled nucleotide such as ChromaTide Fluorescein-12-dUTP (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, Product No. C-7604). by means of suitable polymerases such as DNA polymerase or Klenow polymerase, into which oligonucleotides (capture molecules) 109 are incorporated (cf. [10]).
  • suitable polymerases such as DNA polymerase or Klenow polymerase
  • Second DNA probe molecules 110 with a sequence that is complementary to a predetermined second DNA sequence are applied to the second photodiode 102.
  • the DNA probe molecules 110 are each with a second fluorophore
  • the marking 112 can be e.g. the
  • TM fluorophore "Oregon Green 488" serve that also at a
  • Nucleotide such as dUTP coupled (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, Product No. C-7630) is enzymatically incorporated into the DNA molecules 110.
  • adenine (A), guanine (G), thymine (T) or uracil (u) in the case of a label described above, or cytosine (C) sequences of DNA strands complementary to the sequences of the probe molecules can be in each case hybridize in the usual way, ie by base pairing via hydrogen bonds between A and T or U or between C and G.
  • Fig.la also shows an electrolyte 113, which is brought into contact with the photodiodes 101, 102 and the DNA probe molecules 108, 109.
  • FIG. 1b shows the biosensor 100 in the event that the electrolyte 113 contains DNA strands 114 which have a predetermined first nucleotide sequence which is complementary to the sequence of the first DNA probe molecules 109.
  • the DNA strands 114 complementary to the first DNA probe molecules 109 hybridize with the first DNA probe molecules 109, which are applied to the first photodiode 101.
  • a biochemical method for example by adding DNA nucleases the electrolyte 113, causes hydrolysis of the single-stranded DNA probe molecules 110 on the second photodiode 102.
  • the selectivity of the degrading enzyme for single-stranded DNA must be taken into account. If the enzyme selected for the degradation of the non-hybridized single DNA strands does not have this selectivity, the nucleic acid to be detected as double-stranded DNA may also be degraded (undesirably), which would lead to a falsification of the measurement result.
  • DNA polymerases which, owing to their 5 '-> 3' exonuclease activity or their 3 '- ⁇ 5' exonuclease activity, are able to degrade single-stranded DNA.
  • the electrolyte can optionally be removed from the photodiodes 101 and 102. This increases the contrast, i.e. reduces the background during the subsequent fluorescence measurement.
  • the irradiated light excites only the fluorophore 111 located on the first DNA probe molecules 109 because the unbound second DNA probe molecules 110 together with the fluorophore 112 have been removed from the second photodiode 102 by the nuclease treatment (cf. FIG. 1c ).
  • the fluorescence radiation symbolized by the arrow 116, which is emitted by the fluorophore 111, is detected by the first photodiode 101. In contrast, no fluorescence radiation is detected at the second photodiode 102.
  • the presence of the DNA molecules 114 is determined in this way.
  • the use of the biosensor 100 described here permits locally resolved detection and offers a significant simplification of the entire measuring arrangement, since no external unit for detecting the fluorescence radiation is necessary.
  • FIG. 3 shows a section of a biosensor 300, which is designed with at least one immobilization unit in the form of nanoparticles, and with which a further embodiment of the method described here can be carried out.
  • the biosensor 300 has a first photodiode 301 and a second photodiode 302, which are arranged in an insulator layer 303 made of insulator material such as silicon.
  • the biosensor 300 furthermore has an oxide layer 304 and a second layer 305 thereon.
  • the second layer 305 consists of a metal that is not suitable for the immobilization of macromolecular biopolymers.
  • Layer 305 can be formed from platinum, for example.
  • the units for immobilizing macromolecular biopolymers in the form of nanoparticles are formed on layer 305 by the following method.
  • a solution of 0.5% by weight block copolymer polystyrene (PS) - block-poly (2-vinylpyridine) (P2VP) of the general formula PS (x) -b-P2VP (y) is, as in [12] and [13], with 0.5 equivalents of HAuCl -H 2 0 per pyridine unit to form monodisperse (micellar dissolved) gold particles, x and y in the formula give the number of basic units according to the ratio between monomer and Initiator.
  • a monolayer of gold nanoparticles is deposited on layer 305 from this solution by reduction with hydrazine, as described in [12] and [13].
  • the gold particles 306, which serve as the units for immobilizing macromolecular biopolymers, remain intact during this treatment with plasma and, as illustrated in the sectional view of FIG. 3b and the top view of FIG. 3c, form a regular arrangement on the layer 305 (see [12]).
  • the distances between the gold nanoparticles 306 are usually a few 10 nm, e.g. approx. 20 to 30 nm.
  • the nanoparticles preferably have a size in the range from approx. 5 to 10 nm.
  • the units 306 for immobilization in nanoparticle form can be generated on the biosensor, as described in [14], by first forming a mask for the nanostructuring from colloid particles on the layer 305 and then depositing gold particles, for example by means of vacuum deposition.
  • the sensor 300 is structured in such a way that the layer 305 made of platinum, together with the units 306, remains only for immobilization on areas located on the photodiodes 301, 302, as in the sectional view of FIG and the top view of Fig.3e is shown.
  • This structuring is e.g. possible with the help of any suitable common chemical etching process.
  • the biosensor 300 designed in this way can be used to carry out the method described in the first exemplary embodiment for detecting macromolecular biopolymers.
  • 3f shows a DNA capture molecule 307 immobilized on a gold nanoparticle 306 by means of the gold-sulfur coupling.
  • the use of the biosensor 300 offers the advantage that the immobilization units 305, which are in the form of nanoparticles, make it possible to immobilize a precisely defined number of capture molecules.
  • the use of the biosensor 300 is therefore preferred for a quantitative detection of macromolecular biopolymers.
  • FIG. 6 shows a biosensor 600 with which a redox recycling process can be carried out according to a further exemplary embodiment of the method of the invention.
  • the biosensor 600 has three electrodes, a first electrode 601, a second electrode 602 and a third electrode 603.
  • the electrodes 601, 602, 603 are electrically insulated from one another by means of an insulator material as the insulator layer 604.
  • a holding area 605 is provided on the first electrode 601 for holding probe molecules which can bind macromolecular biopolymers.
  • This holding area can be designed as a unit for immobilization, but it is also possible to form this holding area with units for immobilization in the form of nanoparticles.
  • the probe molecules (capture molecules) 606 are DNA probe molecules with which DNA strands can hybridize with a sequence complementary to the sequence of the DNA probe molecules.
  • the probe molecules 606 carry a biotin group at their 5 * terminus, which e.g. can be added there by using the "FluoReporter Biotin-X-C5 Oligonucleotide Labeling Kit" (product no. F-6095) from Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA (cf. 11).
  • the DNA probe molecules 606 are immobilized on the first electrode 601 made of gold by means of the known gold-sulfur coupling. If another material is used to bind the probe molecules, the material is provided with the corresponding coating material on which the probe molecules can be immobilized.
  • a solution 609 to be examined for example an electrolyte, with the macromolecular biopolymer to be detected, ie the DNA strands which can hybridize with the DNA probe molecules are brought into contact with the biosensor 600, ie in particular with the first electrode 601 and the labeled DNA probe molecules 606 located thereon. This is done in such a way that any DNA strands 608 contained in the solution to be examined can hybridize with the DNA probe molecules 606.
  • capture molecules 606 to which no DNA strands to be detected have hybridized are removed. This can be done by adding the DNA nucleases mentioned above in the first embodiment to the electrolyte 606. In this case too, one of the following substances can be used for the hydrolysis of the single-stranded DNA probe molecules 606:
  • DNA polymerases which, due to their 5 '- ⁇ 3' exonuclease activity or their 3 '- ⁇ 5' exonuclease activity, are able to break down single-stranded DNA.
  • the biosensor 600 is rinsed by means of a rinsing solution (not shown), that is to say the Fragments of the non-hybridized DNA strands and the solution to be examined removed.
  • a further solution (not shown) is brought into contact with the biosensor 600, in particular with the first electrode 601.
  • This further solution contains an enzyme 610 which binds to the label 607 of the hybridized DNA probe molecules 606 and which can cleave the molecules explained below, which are added in a further solution 611.
  • enzyme 610 for example
  • the enzyme 610 is used here in the form of an avidin conjugate.
  • the reason for this is that avidin forms a specific bond with the biotin label 607 used here as an example (FIG. 6b).
  • the further solution 611 contains molecules 612 which can be split by the enzyme 610 into a first sub-molecule 613 with a negative electrical charge and into a second sub-molecule with a positive electrical charge (cf. FIG. 6b).
  • the electrodes 601, 602, 603 are used for this
  • a first electrical potential V (E1) is applied to the first electrode 601, a second electrical potential V (E2) to the second electrode 602 and a third electrical potential V (E3) to the third electrode 603.
  • the third electrode 603 has a positive electrical potential V (E3), then the third electrode 603 has the greatest electrical potential of the electrodes 601, 602, 603 of the biosensor 600.
  • the first electrode 601 is no longer used both as a holding electrode for holding the probe molecules and as a measuring electrode for oxidizing or reducing the respective partial molecules. Rather, the electrode 601 only serves to immobilize the probe molecules or the complexes of probe molecules and macromolecular biopolymers to be detected.
  • the third electrode 603 now takes over the function of the electrode on which the oxidation or reduction of the partial molecules generated takes place.
  • the coverage of the first electrode with the DNA probe molecules 606 can be increased considerably.
  • the oxidized sub-molecules are reduced at the second electrode 602 and the reduced sub-molecules 615 are again drawn to the third electrode 603, where oxidation is again carried out.
  • a circulating current results which is also detected in a known manner. This also results in a course of the circuit current over time as a signal. From this, the number of hybridized DNA strands 606 and thus of the DNA molecules 608 to be detected can again be determined (by means of the enzyme 610 bound via the marker 607) based on the proportionality of the circulating current to the number of charge carriers generated by the enzyme 610.

Abstract

Bei diesem Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren wird mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren eingesetzt. Die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren wird mit Fängermolekülen versehen, wobei die Fängermoleküle zum einen makromolekulare Biopolymere binden können, und zum anderen eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares Signal erzeugen kann. Bei dem Verfahren wird danach eine zu untersuchende Probe mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt gebracht, wobei die zu untersuchende Probe die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. Danach werden in der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen gebunden. Anschliessend werden Fängermoleküle, an die keine zu erfassenden makromolekularen Biopolymere gebunden haben, entfernt und die makromolekularen Biopolymere mittels der Markierung erfasst.

Description

Beschreibung
VERFAHREN ZUM ERFASSEN VON MAKROMOLEKULAREN BIOPOLYMEREN MITTELS MIDENSTENS EINER MIT EINEM MARKIERTEN FÄNGERMOLEKÜL VERSEHENEN IMMOBILISIERUNGSEINHEIT
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren .
Aus [1] bis [4] sind Verfahren zum Erfassen von DNA-Molekülen bekannt, bei denen zur Erfassung Biosensoren eingesetzt werden, die auf Elektrodenanordnungen basieren.
Fig.2a und Fig.2b zeigen einen solchen Sensor, wie er in [1] und [4] beschrieben ist. Der Sensor 200 weist zwei Elektroden 201, 202 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 203 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die Elektroden 201, 202 sind Elektroden-Anschlüsse 204, 205 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 201, 202 anliegende elektrische Potential zugeführt werden kann. Die Elektroden 201, 202 sind als Planarelektroden angeordnet. Auf jeder Elektrode 201, 202 sind DNA-Sondenmoleküle 206 immobilisiert (vgl. Fig.2a). Die Immobilisierung erfolgt gemäß der sogenannten Gold-Schwefel- Kopplung. Auf den Elektroden 201, 202 ist der zu untersuchende Analyt, beispielsweise ein Elektrolyt 207, aufgebracht .
Sind in dem Elektrolyt 207 DNA-Stränge 208 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 206 komplementär ist, so hybridisieren diese DNA-Stränge 208 mit den DNA-Sondenmolekülen 206 (vgl. Fig.2b).
Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenmoleküls 206 und eines DNA-Strangs 208 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 206 und des entsprechenden DNA- Strangs 208 zueinander komplementär sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt. Somit ist ein DNA-Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d.h. mit ihm zu hybridisieren .
Findet eine Hybridisierung statt, so verändert sich, wie aus Fig.2b ersichtlich, die Kapazität zwischen den Elektroden. Diese Änderung der Kapazität wird als Messgröße für die Erfassung von DNA-Molekülen herangezogen.
Aus [5] ist eine weitere Vorgehensweise für die Untersuchung des Elektrolyts auf die Existenz eines DNA-Strangs mit vorgegebener Sequenz bekannt. Bei dieser Vorgehensweise werden die DNA-Stränge der gewünschten Sequenz mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert und deren Existenz wird anhand der Reflexionseigenschaften der markierten Moleküle bestimmt. Hierzu wird Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich auf den Elektrolyten gestrahlt und es wird das von dem Elektrolyten, insbesondere von dem nachzuweisenden markierten DNA-Strang, reflektierte Licht erfasst. Aufgrund des Reflexionsverhaltens, d.h. insbesondere aufgrund der erfassten, reflektierten Lichtstrahlen wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz in dem Elektrolyten enthalten ist oder nicht.
Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, da eine sehr genau Kenntnis über das Reflexionsverhalten des entsprechenden DNA- Strangs erforderlich ist und weiterhin eine Markierung der DNA-Stränge vor Beginn des Verfahrens notwendig ist. Weiterhin ist eine sehr genaue Justierung des Erfassungsmittels zum Erfassen der reflektierten Lichtstrahlen erforderlich, damit die reflektierten Lichtstrahlen überhaupt erfasst werden können. Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.
Ferner ist es aus der Affinitätschromatographie (vgl. [6]) bekannt, immobilisierte niedermolekulare Moleküle, insbesondere Liganden hoher Spezifität und Affinität, zu verwenden, um Peptide und Proteine, z.B. Enzyme, im Analyt spezifisch zu binden.
Ferner ist ebenfalls bekannt, dass bei Nachweisverfahren für Antigene oder Antikörper wie den sogenannten ELISA-Tests, die auf Festphasensystemen beruhen, einer der beiden Reaktionspartner an eine feste Phase (z.B. Mikrotiterplatten) gebunden wird. Die erfolgte Antikörper-Antigen-Reaktion wird durch einen markierten Reaktionspartner nachgewiesen (vgl. [7]). Genauer gesagt wird in einem solchen Antikörper- Einfang-Test zunächst das Antigen an einen festen Träger gebunden. Danach reagiert ein markierter, sich in einer Lösung befindender Antikörper mit dem Antigen. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Antikörpers erhält man eine qualitative oder quantitative Aussage durch Messen der Markierung am gebundenen Antikörper (vgl. [8] und [9]) .
Weiterhin ist ein Reduktions-/Oxidations-Recycling-Verfahren zum Erfassen makromolekularer Biopolymere aus [2] und [3] bekannt .
Das Reduktions-/Oxidations-Recycling-Verfahren, im weiteren auch als Redox-Recycling-Verfahren bezeichnet, wird im weiteren anhand der Fig.4a bis Fig.4c näher erläutert.
Fig.4a zeigt einen Biosensor 400 mit einer ersten Elektrode 401 und einer zweiten Elektrode 402, die auf einem Substrat 403 als Isolatorschicht aufgebracht sind. Auf der ersten Elektrode 401 aus Gold ist ein Haltebereich, ausgestaltet als Halteschicht 404, aufgebracht. Der Haltebereich dient zum Immobilisieren von DNA-Sondenmolekülen
405 auf der ersten Elektrode 401.
Auf der zweiten Elektrode ist kein solcher Haltebereich vorgesehen.
Sollen mittels des Biosensors 400 DNA-Stränge mit einer Sequenz erfasst werden, die komplementär zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 405 ist, so wird der Sensor 400 mit einer zu untersuchenden Lösung 406, z.B. einem Elektrolyten, derart in Kontakt gebracht, dass in der zu untersuchenden Lösung 406 eventuell enthaltene DNA-Stränge mit der komplementären Sequenz zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 405 hybridisieren können.
Fig.4b zeigt den Fall, dass in der zu untersuchenden Lösung
406 die zu erfassenden DNA-Stränge 407 enthalten sind und an die DNA-Sondenmoleküle 405 hybridisiert sind.
Die DNA-Stränge 407 in der zu untersuchenden Lösung sind mit einem Enzym 408 markiert, mit dem es möglich ist, im weiteren beschriebene Moleküle in Teilmoleküle zu spalten.
Üblicherweise ist eine erheblich größere Anzahl von DNA- Sondenmolekülen 405 vorgesehen, als zu ermittelnde DNA- Stränge 407 in der zu untersuchenden Lösung 406 enthalten sind.
Nachdem die in der zu untersuchenden Lösung 406 eventuell enthaltenen DNA-Stränge 407 mit dem Enzym 408 mit den immobilisierten DNA-Sondenmolekülen hybridisiert haben, erfolgt eine Spülung des Biosensors 400, wodurch die nicht hybridisierten DNA-Stränge entfernt werden und der Biosensor 400 von der zu untersuchenden Lösung 406 gereinigt wird. Dieser zur Spülung verwendeten Spüllösung oder in einer weiteren Phase eigens zugeführten weiteren Lösung 412 wird eine elektrisch ungeladene Substanz beigegeben, die Moleküle enthält, die durch das Enzym an den hybridisierten DNA- Strängen 407 in ein erstes Teilmolekül einer negativen ersten elektrischen Ladung und in ein zweites Teilmolekül einer positiven zweiten elektrischen Ladung gespalten werden können.
Die negativ geladenen Teilmoleküle werden, wie in Fig.4c gezeigt ist, zu der positiv geladenen Anode gezogen, wie durch den Pfeil 411 in Fig.4c angedeutet ist.
Die negativ geladenen ersten Teilmoleküle 410 werden an der ersten Elektrode 401, die als Anode ein positives elektrisches Potential aufweist, oxidiert und werden als oxidierte Teilmoleküle 413 an die negativ geladene Katode, d.h. die zweite Elektrode 402 gezogen, wo sie wieder reduziert werden.
Die reduzierten Teilmoleküle 414 wiederum wandern zu der ersten Elektrode 401, d.h. zu der Anode.
Auf diese Weise wird ein elektrischer Kreisstrom generiert, der proportional ist zu der Anzahl der jeweils durch die Enzyme 408 erzeugten Ladungsträger.
Der elektrische Parameter, der bei dieser Methode ausgewertet wird, ist die Änderung des elektrischen Stroms — als dt
Funktion der Zeit t, wie dies in dem Diagramm 500 in Fig.5 dargestellt ist.
Die vorstehend genannten Verfahren zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren haben gemeinsam, dass vor der Durchführung des eigentlichen Nachweisverfahrens die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere markiert werden. Dies ist nicht nur aufwendig und z.B. mit der Gefahr verbunden, dass z.B. ein Teil der zu untersuchenden Probe verloren gehen kann, oder dass die Markierung nicht quantitativ verläuft, sondern kann auch andere Nachteile mit sich bringen kann. So können im Fall von mit Fluoreszenz- Farbstoffen markierten DNA-Molekülen die Fluoreszenzmarker beispielsweise die Beweglichkeit der DNA-Moleküle reduzieren und so den Nachweisprozess verlangsamen.
Aus [15] ist darüber hinaus ein Verfahren zum Screening von Target-Liganden-Wechselwirkungen unter Verwendung einer chemischen Bibliothek von Liganden bekannt, bei dem zumindest eine Fluoreszenzeigenschaft einer an einer Festphase immobilisierten chemischen Bibliothek von Liganden, wobei an jeden Liganden ein molekularer Fluoreszenzsensor gebunden ist, vor und nach Zugabe des Targets gemessen wird.
Ferner ist aus [16] ein in si tu Hybridisierungsverfahren bekannt, mit dem Transkriptionsprodukte von Proteinen der Knochenmatrix in Mausgewebezellen nachgewiesen wurden.
Des weiteren ist aus [17] ist eine selbst-addressierbare mikroelektronische Vorrichtung bekannt, die so gestaltet ist, dass sie aktiv molekularbiologische mehrschrittige Reaktionen und Multiplex-Reaktionen in mikroskopischen Formaten ausführen kann.
Aus [18] schließlich ist ein z.B. in der biochemischen oder pharmazeutischen Forschung einsetzbares Erkennungssystem bekannt, das mindestens eine immobilisierte
Bindungskomponente A mit einer mindestens einer Bindestelle für eine Erkennungsspezie B sowie mindestens eine Erkennungsspezie B, die an die Bindungskomponente A binden kann, aufweist. Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein alternatives Verfahren und eine Vorrichtung für die Erfassung von makromolekularen Biopolymeren bereitzustellen.
Das Problem wird durch das Verfahren und die Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst.
Bei diesem Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren wird mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren eingesetzt.
Dabei wird die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren (zuerst) mit Fängermolekülen versehen, wobei die Fängermoleküle zum einen makromolekulare Biopolymere binden können, und zum anderen eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares Signal erzeugen kann. Bei dem Verfahren wird danach eine zu untersuchende Probe mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt gebracht, wobei die zu untersuchende Probe die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. Danach werden in der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen gebunden. Anschließend werden Fängermoleküle, an die keine zu erfassenden makromolekularen Biopolymere gebunden haben, entfernt und die makromolekularen Biopolymere mittels der Markierung erfasst.
Einfach ausgedrückt beruht das vorliegende Verfahren auf der Erkenntnis, dass nicht, wie bisher, die zu erfassenden makromolekulare Biopolymere mit einer Markierung versehen werden, sondern, dass die Fängermoleküle vor der Immobilisierung mit einer Markierung versehen werden. Dies hat den Vorteil, dass die zu untersuchende Probe nicht mehr einer Markierungsreaktion unterworfen werden muss, bei der möglicherweise ein Teil der Probe oder eventuell die gesamte Probe verloren geht oder bei der Markierung nicht vollständig abläuft . Die hier offenbarte Vorrichtung zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren weist mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren und eine eine Erfassungseinheit auf. Bei der Vorrichtung ist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen ist, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können, und wobei die Fängermoleküle eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares Signal erzeugen kann. Die Erfassungseinheit ist bei der Vorrichtung derart ausgestaltet, dass sie makromolekulare Biopolymere, die an die Fängermoleküle gebunden haben, mittels der Markierung erfasst .
In einer Ausführungsform weist die Vorrichtung mehrere Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren in einer regelmäßigen Anordnung (einem Array) auf. Vorzugsweise ist bei der Vorrichtung die zumindest eine Einheit zum Immobilisieren oder die regelmäßige Anordnung der Einheiten auf einer CMOS-Kamera oder einem CCD aufgebracht.
Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird durch die Markierung ein Signal erzeugt. In einer Ausgestaltung ist ein solches Signal ein elektrischer Strom. In einer weiteren Ausgestaltung ist das Signal sichtbares Licht oder UV-Licht. Das Signal kann auch aus radioaktiver Strahlung oder Röntgenlicht bestehen.
Daraus wird ersichtlich, dass bei dem Verfahren verschiedene Arten der Markierung, die nachfolgend auch als Reportergruppe bezeichnet wird, eingesetzt werden können.
Zum einen kann die Markierung eine (chemische) Verbindung oder Gruppe sein, die unmittelbar in der Lage ist, ein zur Erfassung der makromolekularen Biopolymere einsetzbares Signal erzeugen. Die Erzeugung dieses Signals kann dabei extern angeregt werden, jedoch kann die Markierung das Signal auch ohne äußere Anregung abgeben. Im erstgenannten Fall ist die Markierung beispielsweise ein Fluoreszenz-Farbstoff (Fluorophor) oder ein Che ilumineszens-Farbstoff , im zweitgenannten Fall beispielsweise ein Radioisotop.
Zum anderen kann die Markierung eine Substanz sein, die nur mittelbar ein Signal zur Erfassung der makromolekularen Biopolymere erzeugt, d.h. eine Substanz, die die Erzeugung des Signals veranlasst. Beispielsweise kann eine solche Reportergruppe ein Enzym sein, welches eine chemische Reaktion katalysiert, und die chemische Reaktion zur Erfassung der Biopolymere herangezogen wird. Beispiele für solche Enzyme sind Alkalische Phosphatase, Glutathion-S- Transferase, Superoxid-Dismutase, Meerrechtich-Peroxidase, alpha-Galaktosidase und beta-Galaktosidase. Diese Enzyme sind in der Lage, geeignete Substrate zu spalten, die farbige Endprodukte oder z.B. Verbindungen ergeben, die in dem vorstehend beschriebenen Reduktions-/Oxidations-Recycling- Verfahren eingesetzt werden können. Zu der Gruppe der Markierungen, die nur mittelbar ein zum Nachweis von makromolekularen Biopolymere einsetzbares Signal erzeugen, gehören ferner Liganden für Bindungsproteine und Substrate für Enzyme. Diese Markierung werden hier allgemein als Enzym- Liganden bezeichnet. Beispiele für solche als Markierung einsetzbare Enzym-Liganden sind Biotin, Digoxigenin oder Substrate für die oben genannten Enzyme.
Unter Erfassen wird im Sinne der Erfindung sowohl der qualitative als auch quantitative Nachweis von makromolekularen Biopolymeren in einem zu untersuchenden Analyten verstanden. Dies bedeutet, dass der Begriff "Erfassen" ebenfalls einschließt, die Abwesenheit von makromolekularen Biopolymeren im Analyten festzustellen. Unter "Einheit zur Immobilisierung" wird im Sinne der
Erfindung eine Anordnung verstanden, die eine Oberfläche aufweist, auf der die Fängermoleküle immobilisiert werden können, d.h. an die die Fängermoleküle durch physikalische oder chemische Wechselwirkungen binden können. Diese
Wechselwirkungen schließen hydrophobe oder ionische
(elektrostatische) Wechselwirkungen und kovalente Bindungen ein. Beispiele für geeignete Oberflächen-Materialien, die für die mindestens eine Einheit zur Immobilisierung verwendet werden können, sind Metalle wie Gold oder Silber, Kunststoffe wie Polyethylen- oder Polypropylen oder anorganische Stoffe wie Siliziumdioxid, z.B. in Form von Glas.
Ein Beispiel für eine physikalische Wechselwirkung, die eine Immobilisierung der Fängermoleküle bewirkt, ist eine Adsorption an der Oberfläche. Diese Art der Immobilisierung kann beispielsweise stattfinden, wenn das Mittel zur Immobilisierung ein Kunststoffmaterial ist, das für die Herstellung von Mikrotiterplatten verwendet wird (z.B. Polypropylen) . Allerdings ist eine kovalente Verknüpfung der Fängermoleküle an die Einheit zum Immobilisieren bevorzugt, weil dadurch die Orientierung der Fängermoleküle gesteuert werden kann. Die kovalente Verknüpfung kann über jede geeignete Verknüpfungschemie („Linker-Chemie") erfolgen.
In einer Ausgestaltung des Verfahrens ist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren auf einer Elektrode oder einer Photodiode aufgebracht.
In einer weiteren Ausgestaltung ist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren ein Nanopartikel . Unter einem Nanopartikel wird im Sinne der Erfindung ein Partikel verstanden, der durch sogenannte Nanostrukturierungs-Verfahren erhalten werden kann. Nanostrukturierungs-Verfahren, die zur Erzeugung solcher Nanopartikel auf geeigneten Substraten herangezogen werden können, sind beispielsweise die in [12] und [13] beschriebene Verwendung von Block-Copolymer-Microemulsionen oder die in [14] beschriebenen Verwendung von Kolloidpartikeln als Strukturierungs asken. Das in [14] beschriebene Verfahren ist im Prinzip analog zu einem im Bereich der Substrat- Strukturierung üblicherweise eingesetzten Lithographie- Verfahren. Daher sei hier betont, das ein Nanopartikel im Sinne der Erfindung folglich nicht auf diejenigen Partikel beschränkt ist, die durch eines der hier beispielhaft genannten Verfahren erhalten werden. Vielmehr ist ein solcher Nanopartikel jeder Partikel, dessen Durchmesser im Nanometer- Bereich liegt, d.h. allgemein im Bereich von 2 bis 50 nm, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 20 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 nm.
Eine "Einheit zur Immobilisierung, die ein Nanopartikel ist", die im folgenden auch nanopartikelförmige Einheit genannt wird, ist folglich ein oben beschriebener Nanopartikel, der eine Oberfläche aufweist, auf der die Fängermoleküle immobilisiert werden können, d.h. die Oberfläche ist so beschaffen, dass an ihr die Fängermoleküle durch physikalische oder chemische Wechselwirkungen binden können. Diese Wechselwirkungen schließen hydrophobe oder ionische (elektrostatische) Wechselwirkungen und kovalente Bindungen ein. Beispiele für geeignete Oberflächen-Materialien, die für die mindestens eine nanopartikelförmige Einheit zur Immobilisierung verwendet werden können, sind Metalle wie Gold oder Silber, halbleitende Materialien wie Silizium, Kunststoffe wie Polyethylen- oder Polypropylen oder Siliziumdioxid, z.B. in Form von Glas. Nanopartikelförmige Einheiten aus Kunststoffen und Siliziumdioxid sind dabei durch Verwendung der in [14] beschriebenen Kolloidmasken- Verfahren erhältlich. Nanopartikelförmige Einheiten aus halbleitenden Materialien wie Silizium können beispielsweise auch durch das Stranski-Krastanov-Verfahren gebildet werden. Durch Oxidation solcher Nanopartikel aus Silizium sind weiterhin nanopartikelförmige Einheiten aus Siliziumdioxid erhältlich.
Aufgrund der oben beschriebenen Herstellungsverfahren nehmen nanopartikelförmige Einheiten zum Immobilisieren, die auf geeigneten Substratoberflächen (Halte-Bereiche) , beispielweise von Photodioden oder Elektroden, aufgebracht sind, eine regelmäßige Anordnung ein, mit Abständen voneinander im Bereich einiger 10 Nanometer, beispielsweise von ca. 10 bis 30 nm auf diesen Oberflächen. Die Art der Anordnung und der Abstand der Nanopartikel voneinander hängt ebenso wie die Größe der Nanopartikel von dem jeweiligen Verfahren zur Ausbildung der Nanopartikel ab.
Ein Vorteil bei der Verwendung von nanopartikelförmigen Einheiten zum Immobilisieren besteht darin, dass auf diesen Nanopartikeln eine genau definierte Anzahl von Fängermolekülen immobilisiert werden kann. Dies ist insbesondere bei der quantitativen Erfassung von makromolekularen Biopolymeren mittels des vorliegenden Verfahrens von Vorteil. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung von Nanopartikeln als Einheiten zum Immobilisieren bietet sich dadurch, dass durch den Abstand der Nanopartikel untereinander, d.h. die räumliche Trennung der Fängermoleküle, eine bessere räumliche Zugänglichkeit der Fängermoleküle für die daran bindenden makromolekularen Biopolymere gegeben ist und somit die Wahrscheinlichkeit einer Wechselwirkung erhöht wird. Die Ausbildung als Nanopartikel vergrößert zudem die effektive Oberfläche. Unter makromolekularen Biopolymeren werden hier Nukleinsäuren wie DNA und RNA-Moleküle oder auch kürzere Nukleinsäuren wie
Oligonukleotide mit 10 bis 20 Basenpaaren (bp) verstanden.
Die Nukleinsäuren können doppelsträngig sein, jedoch auch zumindest einzelsträngige Bereiche aufweisen oder, zum
Beispiel durch vorangehende thermische Denaturierung
(Strangtrennung) für ihren Nachweis, als Einzelstränge vorliegen. Die Sequenz der zu erfassenden Nukleinsäuren kann dabei zumindest teilweise oder vollständig vorgegeben, d.h. bekannt sein. Weitere makromolekulare Biopolymere sind
Proteine oder Peptide. Diese können aus den üblicherweise in
Proteinen vorkommenden 20 Aminosäuren aufgebaut sein, aber auch natürlich nicht vorkommende Aminosäuren enthalten oder z.B. durch Zuckerreste (Oligosaccharide) modifiziert sein oder post-translationale Modifikationen enthalten. Ferner können auch Komplexe aus mehreren unterschiedlichen makromolekularen Biopolymeren erfasst werden, beispielsweise
Komplexe aus Nukleinsäuren und Proteinen.
Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so werden als Fängermoleküle bevorzugt Liganden verwendet, die die zu erfassenden Proteine oder Peptide spezifisch binden können. Die Fängermoleküle/ Liganden sind vorzugsweise durch kovalente Bindungen mit dem Mittel zur Immobilisierung verknüpft.
Als Liganden für Proteine und Peptide kommen niedermolekulare Enzymagonisten oder Enzymantagonisten, Pharmazeutika, Zucker oder Antikörper oder irgendein Molekül in Betracht, das die Fähigkeit besitzt, Proteine oder Peptide spezifisch zu binden. Wenn DNA-Moleküle (Nukleinsäuren oder Oligonukleotide) einer vorgegeben Nukleotidsequenz mit dem hier beschriebenen
Verfahren erfasst werden, so werden sie vorzugsweise in einzelsträngiger Form erfasst, d.h. sie werden ggf. vor der
Erfassung durch Denaturierung wie vorstehend erläutert in
Einzelstränge überführt. In diesem Fall werden als
Fängermoleküle dann vorzugsweise DNA-Sondenmoleküle mit einer zu dem einzelsträngigen Bereich komplementären Sequenz verwendet. Die DNA-Sondenmoleküle können wiederum
Oligonukleotide oder auch längere Nukleotidsequenzen aufweisen, solange diese keine der intermolekularen
Strukturen ausbilden, die eine Hybridisierung des
Sondenmoleküls mit der zu erfassenden Nukleinsäure verhindern. Allerdings ist es auch möglich, DNA-bindende
Proteine oder Agenzien als Fängermolekül einzusetzen.
Anzumerken ist, dass es selbstverständlich möglich ist, mit dem vorliegenden Verfahren nicht nur eine einzige Art von Biopolymeren in einer einzelnen Messreihe zu erfassen. Vielmehr können mehrere makromolekulare Biopolymere gleichzeitig oder auch nacheinander erfasst werden. Dazu können auf der Einheit zum Immobilisieren mehrere Arten von Fängermolekülen, von denen jedes eine (spezifische) Bindungsaffinität für ein bestimmtes zu erfassendes Biopolymer aufweist, gebunden werden, und/oder es können mehrere Einheiten zum Immobilisieren eingesetzt werden, wobei an jeder von diesen Einheiten nur eine Art von Fängermolekül gebunden wird. Bei diesen Mehrfachbestimmungen wird für jedes zu erfassende makromolekulare Biopolymer vorzugsweise eine von den anderen Markierungen unterscheidbare Markierung verwendet. Beispielsweise können zwei oder mehrere Fluorophore als Markierungen verwendet werden, wobei jedes dieser Fluorophore vorzugsweise eine spezifische Anregungsund Emissionswellenlänge besitzt. In einem ersten Verfahrensschritt wird die zumindest eine
Einheit zum Immobilisieren mit den Fängermolekülen versehen, wobei diese eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares
Signal erzeugen kann.
Eine zu untersuchende Probe, vorzugsweise ein flüssiges Medium wie ein Elektrolyt, wird dann mit der Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht. Dies erfolgt in der Weise, dass die makromolekularen Biopolymere an die Fängermoleküle binden können. Für den Fall, dass sich in dem Medium mehrere zu erfassende makromolekulare Biopolymere befinden, werden die Bedingungen so gewählt, dass diese jeweils zur gleichen Zeit oder nacheinander an ihre entsprechendes Fängermolekül binden können.
Nachdem eine ausreichende Zeitdauer gewartet worden ist, damit die makromolekularen Biopolymere an das entsprechende Fängermolekül bzw. die entsprechenden Fängermoleküle binden konnten, werden nicht gebundene Fängermoleküle von der Einheit bzw. den Einheiten zum Immobilisieren, auf der bzw. auf denen sie sich befinden, entfernt.
Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so werden die nicht gebundenen, als Fängermoleküle verwendeten Liganden von der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren entfernt werden, indem ein Material mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird, wobei das Material imstande ist, die chemische Verbindung zwischen dem Liganden und der Einheit zum Immobilisieren zu hydrolysieren .
Für den Fall, dass die Fängermoleküle niedermolekulare Liganden sind, lassen sich diese, falls ungebunden, auch enzymatisch entfernen. Hierzu sind die Liganden über eine enzymatisch spaltbare Verbindung kovalent mit der Einheit zur Immobilisierung verbunden, beispielsweise über eine Esterverbindung.
In diesem Falle kann beispielsweise eine Carboxylester- Hydrolase (Esterase) eingesetzt werden, um ungebundene Ligandenmoleküle zu entfernen. Dieses Enzym hydrolysiert diejenige Esterbindung zwischen der Einheit zur Immobilisierung und dem jeweiligen Ligandenmolekül , das nicht von einem Peptid oder Protein gebunden wurde. Dagegen bleiben die Esterverbindungen zwischen der Einheit zum Immobilisieren und denjenigen Molekülen, die eine Bindungswechselwirkung mit Peptiden oder Proteinen eingegangen sind, aufgrund der verminderten sterischen Zugänglichkeit, die durch die Raumerfüllung des gebundenen Peptids oder Proteins eintritt, unversehrt .
Für den Fall, dass die Fängermoleküle DNA-Stränge sind, erfolgt die Entfernung der nicht gebundenen Sondenmoleküle enzymatisch, beispielsweise mit Hilfe eines Enzyms mit Nukleaseaktivität . Vorzugsweise wird als Enzym mit Nukleaseaktivität ein Enzym verwendet, das selektiv einzelsträngige DNA abbaut. Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau nicht hybridisierter DNA- Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende DNA, die in Form eines doppelsträngigen Hybrids mit dem Sondenmolekül vorliegt, unerwünschterweise ebenfalls abgebaut.
Insbesondere können zum Entfernen der nicht gebundenen DNA- Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode DNA Nukleasen, beispielsweise eine Nuklease aus Mung-Bohnen, die Nuklease Pl oder die Nuklease Sl verwendet werden. Gleichfalls können
DNA-Polymeräsen, die aufgrund ihrer
5'-^ 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer
3'-^ 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige
DNA abzubauen, verwendet werden.
Nach dem Entfernen der nicht gebundenen Fängermoleküle werden die makromolekularen Biopolymere mittels der Markierung erfasst. Dazu wird entweder ein von der Markierung spontan ausgesandtes Signal wie radioaktive Strahlung oder durch eines durch externe Anregung verursachtes Signal wie ausgesandte Fluoreszenzstrahlung gemessen.
Wenn als Signal die emittierte Fluoreszenzstrahlung gemessen wird, kann der Biosensor derart gestaltet sein, dass die Messung ortsaufgelöst direkt auf dem Sensor erfolgt, indem z.B. die Einheit zum Immobilisierung direkt auf einer zur Messung verwendeten Fotozelle aufgebracht ist und die Fotozelle mit einer entsprechenden Auswerteeinheit verbunden ist. Dies hat den Vorteil einer vereinfachten Messanordnung. Eine solche Messanordnung kann z.B. mittels einer konventionellen CMOS-Kamera oder einem CCD realisiert werden. Allerdings ist es selbstverständlich auch möglich, eine externe Einheit für die Erfassung der emittierten Fluoreszenzstrahlung zu verwenden.
In Abhängigkeit von der eingesetzten Markierung und dem Messverfahren kann auch eine Messung des Signals durchgeführt werden, bevor oder nachdem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit den Fängermolekülen versehen wird. In diesem Fall werden die ermittelten Werte aus den beiden Messung des Signals miteinander verglichen. Wenn die Signalintensität der gemessenen Werte sich in einer Weise unterscheiden, dass die
Differenz der ermittelten Werte größer ist als ein vorgegebener Schwellenwert, so wird angenommen, dass makromolekulare Biopolymere an Fängermoleküle gebunden haben und dadurch die Veränderung der Intensität des am Empfänger empfangenen Signals verursacht worden ist.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im weiteren näher erläutert.
Es zeigen
Figuren la bis lc einen Biosensor zu unterschiedlichen
Verfahrenszuständen, anhand denen das Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung erläutert wird;
Figuren 2a und 2b eine Skizze zweier Planarelektroden, mittels derer die Existenz zu erfassender DNA-Stränge in einem Elektrolyt (Figur 2a) bzw. deren Nichtexistenz (Figur 2b) nachgewiesen werden können;
Figuren 3a bis 3f einen Biosensor, mit dem eine weitere
Ausführungsform des hier beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden kann;
Figuren 4a bis 4c Skizzen eines Biosensors gemäß dem Stand der Technik, anhand derer einzelne Zustände im Rahmen des Redox-Recycling-Vorgangs erläutert werden;
Figur 5 einen Funktionsverlauf eines Kreisstroms gemäß dem Stand der Technik im Rahmen eines Redox-Recycling- Vorgangs ; Figuren 6a und 6b einen Biosensor, mit dem ein Redox-
Recycling-Vorgang als weitere Ausführungsform des Verfahrens durchgeführt werden kann
Fig.l zeigt einen Ausschnitt aus einem Biosensors 100, mit dem ein erstes Ausführungsbeispiel des hier beschriebenen Verfahren durchgeführt werden kann.
Fig.la zeigt den Biosensor 100 mit einer ersten Fotodiode 101 und einer zweiten Fotodiode 102, die in einer Isolatorschicht 103 aus Isolatormaterial angeordnet sind.
Die erste Fotodiode 101 und die zweite Fotodiode 102 sind über erste elektrischen Anschlüsse 104 bzw. zweite elektrische Anschlüsse 105 mit einer Auswerteeinheit (nicht dargestellt) verbunden. Die beiden Fotodioden 101, 102 sind ferner mit einer Oxidschicht 106 und einer ersten Einheit 107 zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren bzw. einer zweiten Einheit 108 zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren versehen. Die Einheiten zum Immobilisieren 107 und 108 sind aus Gold hergestellt.
Alternativ können die Einheiten 107, 108 zum Immobilisieren auch aus Siliziumoxid hergestellt sein und mit einem Material beschichtet werden, das geeignet ist, Fängermoleküle zu immobilisieren.
Beispielsweise können bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie
• 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
• 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
• 3-Aminopropyltriethoxysilan,
• 4- (Hydroxybutyramido) propyltriethoxysilan,
• 3-N,N-bis (2-hydroxyethyl) aminopropyltriethoxysilan, oder andere artverwandte Materialen, die imstande sind, mit ihrem einen Ende eine kovalente Bindung mit der Oberfläche des Siliziumoxids einzugehen und mit ihrem anderen Ende dem zu immobilisierenden Sondenmolekül eine chemisch reaktive Gruppe wie einen Epoxy- , Acetoxy- , Amin- oder Hydroxylrest zur Reaktion anzubieten.
Reagiert ein zu immobilisierendes Fängermolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Beschichtung auf der Einheit zum Immobilisieren gebunden.
Auf den Einheiten zum Immobilisieren 107 und 108 werden DNA- Sondenmoleküle 109, 110 als Fängermoleküle aufgebracht.
Dabei sind auf der ersten Fotodiode 101 mittels der Einheit 107 erste DNA-Sondenmoleküle 109 mit einer zu einer vorgegebenen ersten DNA-Sequenz komplementären Sequenz aufgebracht. Die DNA-Sondenmoleküle 109 sind jeweils mit einem ersten Fluorophor 111 markiert.
Als Fluorophor kann beispielsweise Fluorescein verwendet werden. Die Markierung der Fängermoleküle 109 kann dadurch geschehen, dass ein entsprechend markiertes Nukleotid wie ChromaTide Fluorescein-12-dUTP (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, Produkt-Nr. C-7604) enzymatisch, d.h. mittels geeigneter Polymerasen wie DNA-Polymerase oder Klenow Polymerase, in die Oligonukleotide (Fängermoleküle) 109 eingebaut wird (vgl. [10]).
Auf der zweiten Fotodiode 102 sind zweite DNA-Sondenmoleküle 110 mit einer Sequenz, die komplementär ist zu einer vorgegebenen zweiten DNA-Sequenz ist, aufgebracht. Die DNA- Sondenmoleküle 110 sind jeweils mit einem zweiten Fluorophor
112 markiert. Als Markierung 112 kann dabei z.B. das
TM Fluorophor „Oregon Green 488" dienen, das ebenfalls an ein
Nukleotid wie dUTP gekoppelt (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, Produkt-Nr. C-7630) auf enzymatischem Wege in die DNA-Moleküle 110 eingebaut wird. An die Pyrimidinbasen Adenin (A) , Guanin (G) , Thymin (T) bzw. Uracil (u) im Falle einer oben beschriebenen Markierung, oder Cytosin (C) , können jeweils zu den Sequenzen der Sondenmoleküle komplementäre Sequenzen von DNA-Strängen in der üblichen Weise, d.h. durch Basenpaarung über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T oder U bzw. zwischen C und G, hybridisieren.
Fig.la zeigt ferner einen Elektrolyten 113, der mit den Fotodioden 101, 102 und den DNA-Sondenmolekülen 108, 109 in Kontakt gebracht wird.
Fig.lb zeigt den Biosensor 100 für den Fall, dass in dem Elektrolyten 113 DNA-Stränge 114 enthalten sind, die eine vorgegebene erste Nukleotidsequenz aufweisen, die komplementär ist zu der Sequenz der ersten DNA-Sondenmoleküle 109.
In diesem Fall hybridisieren die zu den ersten DNA- Sondenmolekülen 109 komplementären DNA-Stränge 114 mit den ersten DNA-Sondenmolekülen 109, die auf der ersten Fotodiode 101 aufgebracht sind.
Da die Sequenzen von DNA-Strängen nur mit der jeweils spezifischen Komplementärsequenz hybridisieren, hybridisieren die zu den ersten DNA-Sondenmolekülen komplementären DNA- Stränge nicht mit den zweiten DNA-Sondenmolekülen 110.
Wie aus Fig.lb ersichtlich ist, ist das Resultat nach erfolgter Hybridisierung, dass sich auf der ersten Fotodiode
101 hybridisierte Moleküle befinden, d.h. doppelsträngige DNA-Moleküle immobilisiert sind. Auf der zweiten Fotodiode
102 sind nur die zweiten DNA-Sondenmoleküle 110 als weiterhin einsträngige Moleküle vorhanden.
In einem weiteren Schritt wird mittels eines biochemischen Verfahrens, beispielsweise durch Zugabe von DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyten 113, eine Hydrolyse der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 110 auf der zweiten Fotodiode 102 bewirkt.
Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau der nicht hybridisierten DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise die als doppelsträngige DNA vorliegende zu erfassende Nukleinsäure ebenfalls (unerwünschterweise) abgebaut, was zu einer Verfälschung des Messergebnisses führen würde.
Nach Entfernen der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle, d.h. der zweiten DNA-Sondenmoleküle 110 auf der zweiten Fotodiode 102 sind lediglich die Hybride aus den zu erfassenden DNA- Molekülen 114 und den dazu komplementären ersten DNA- Sondenmolekülen 109 (vgl. Fig.lc) vorhanden.
Beispielsweise kann zum Entfernen der nicht gebundenen einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 110 auf der zweiten Fotodiode 102, d.h. der zweiten Einheit zum Immobilisieren, einer der folgenden Stoffe zugegeben werden:
• Nuklease aus Mung-Bohnen,
• Nuklease Pl, oder
• Nuklease Sl.
Zu diesem Zweck können ebenfalls DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5 ' -> 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer 3'-^ 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, verwendet werden.
Nach dem Abbau der einzelsträngigen Sondenmoleküle kann der Elektrolyt von den Fotodioden 101 und 102 gegebenenfalls entfernt werden. Dies erhöht den Kontrast, d.h. reduziert den Hintergrund, bei der nachfolgenden Fluoreszenz-Messung.
Mittels eines nicht gezeigten Lasers wird daraufhin durch Pfeile 115 symbolisiertes Licht mit einer Wellenlänge eingestrahlt, die geeignet ist, das erste Fluorophor 111 und das zweite Fluorophor 112 zur Fluoreszenz anzuregen. Dabei können, je nach Art der Fluorophore, auch unterschiedliche Wellenlängen verwendet werden, entweder gleichzeitig oder auch nacheinander .
Durch das eingestrahlte Licht wird nur das an den ersten DNA- Sondenmolekülen 109 befindliche Fluorophor 111 zur Emission angeregt, da die ungebundenen zweiten DNA-Sondenmoleküle 110 samt dem Fluorophor 112 von der zweiten Fotodiode 102 durch die Nukleasebehandlung entfernt worden sind (vgl. Fig.lc). Die durch den Pfeil 116 symbolisierte Fluoreszenzstrahlung, die von dem Fluorophor 111 emittiert wird, wird von der ersten Fotodiode 101 erfasst. An der zweiten Fotodiode 102 wird hingegen keine Fluoreszenzstrahlung detektiert.
Auf diese Weise wird die Anwesenheit der DNA-Moleküle 114 ermittelt. Die Verwendung des hier beschriebenen Biosensors 100 erlaubt eine örtlich aufgelöste Erfassung und bietet eine deutliche Vereinfachung der gesamten Messanordnung, da keine externe Einheit zur Erfassung der Fluoreszenz-Strahlung notwendig ist.
Fig.3 zeigt einen Ausschnitt eines Biosensors 300, der mit mindestens einer Einheit zur Immobilisierung in Form von Nanopartikeln ausgestaltet ist, und mit dem eine weitere Ausführungsform des hier beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden kann.
Der Biosensor 300 weist eine erste Fotodiode 301 und eine zweite Fotodiode 302 auf, die in einer Isolatorschicht 303 aus Isolatormaterial wie Silizium angeordnet sind. Der Biosensor 300 weist weiterhin eine Oxidschicht 304 und eine zweite darauf befindliche Schicht 305 auf. Die zweite Schicht 305 besteht dabei aus einem Metall, das nicht für die Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren geeignet ist. Die Schicht 305 kann z.B. aus Platin gebildet werden. Auf der Schicht 305 werden die Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren, die die Form von Nanopartikeln aufweisen, durch folgendes Verfahren gebildet.
Eine Lösung von 0,5 Gew.-% Block-Copolymer Polystryol (PS) - block-poly (2-vinylpyridin) (P2VP) der allgemeinen Formel PS(x) -b-P2VP(y) wird, wie in [12] und [13] beschrieben, mit 0,5 Äquivalenten HAuCl -H20 pro Pyridin-Einheit zur Ausbildung von monodispersen (micellar gelösten) Gold- Partikeln versetzt, x und y geben in der Formel die Anzahl der Grundeinheiten entsprechend dem Verhältnis zwischen Monomer und Initator an.
Nach der Bildung homogener Micellen wird aus dieser Lösung durch Reduktion mit Hydrazin, wie in [12] und [13] beschrieben, eine Monoschicht von Nanopartikeln aus Gold auf der Schicht 305 abgeschieden. Anschließend werden die organischen Bestandteile der abgeschiedenen Micellen, d.h. das Block-Copolymer, durch Plasmaätzen mittels eines Sauerstoffplasmas von der Schicht 305 entfernt (vgl. [13]). Die Goldpartikel 306, die als die Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren dienen, bleiben bei dieser Behandlung mit Plasma unversehrt und bilden, wie in der Schnittansicht von Fig.3b und der Draufsicht von Fig.3c veranschaulicht, eine regelmäßige Anordnung auf der Schicht 305 aus (vgl. [12]). Die Abstände zwischen den Gold-Nanopartikeln 306 betragen in der Regel einige 10 nm, z.B. ca. 20 bis 30 nm. Die Nanopartikel besitzen vorzugsweise eine Größe im Bereich von ca. 5 bis 10 nm.
Neben den oben genannten Blockpolymeren sind selbstverständlich auch weitere Blockpolymere zur Ausbildung der Nanopartikel verwendbar. Alternativ können die Einheiten 306 zum Immobilisieren in Nanopartikel-Form auf dem Biosensor erzeugt werden, wie in [14] beschrieben, indem zunächst eine Maske für die Nanostrukturierung aus Kolloidpartikel auf der Schicht 305 ausgebildet wird und dann z.B. mittels Vakuumdeposition Goldpartikel abgelagert werden.
Nach dem Aufbringen der Nanopartikel 306 aus Gold wird der Sensor 300 derart strukturiert, dass die Schicht 305 aus Platin samt den Einheiten 306 zum Immobilisieren nur auf Bereichen zurückbleibt, die sich auf den Fotodioden 301, 302 befinden, wie in der Schnittansicht von Fig.3d und der Draufsicht von Fig.3e gezeigt ist. Diese Strukturierung ist z.B. mit Hilfe jedes geeigneten gängigen chemischen Ätzverfahrens möglich.
Mit Hilfe des so gestalteten Biosensors 300 kann das im ersten Ausführungsbeispiel beschriebene Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren durchgeführt werden. Fig.3f zeigt ein auf einem Gold-Nanopartikel 306 mittels der Gold-Schwefel-Kopplung immobilisiertes DNA- Fängermolekül 307.
Die Verwendung des Biosensors 300 bietet den Vorteil, dass die in Nanopartikel-Form vorliegenden Einheiten 305 zum Immobilisieren es ermöglichen, eine genau definierte Anzahl von Fängermolekülen zu immobilisieren. Der Einsatz des Biosensors 300 ist daher bei einer quantitativen Erfassung von makromolekularen Biopolymeren bevorzugt.
Fig.6 zeigt einen Biosensor 600, mit dem ein Redox-Recycling- Vorgang gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel des Verfahrens der Erfindung durchgeführt werden kann.
Der Biosensor 600 weist drei Elektroden auf, eine erste Elektrode 601, eine zweite Elektrode 602 sowie eine dritte Elektrode 603. Die Elektroden 601, 602, 603 sind mittels eines Isolatormaterials als Isolatorschicht 604 elektrisch voneinander isoliert.
Auf der ersten Elektrode 601 ist ein Haltebereich 605 zum Halten von Sondenmolekülen, die makromolekulare Biopolymere binden können, vorgesehen. Dieser Haltebereich kann als eine einheitliche Einheit zum Immobilisieren ausgestaltet sein, möglich ist jedoch auch, diesen Haltebereich mit Einheiten zum Immobilisieren in Form von Nanopartikeln auszubilden.
Die Sondenmoleküle (Fängermoleküle) 606 gemäß diesem Ausführungsbeispiel, die an dem Haltebereich immobilisiert sind, sind DNA-Sondenmoleküle, mit denen DNA-Stränge mit zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle komplementärer Sequenz hybridisieren können. Als Markierung 607 tragen die Sondenmoleküle 606 an ihrem 5 * -Terminus eine Biotin-Gruppe, die z.B. durch Verwendung des „FluoReporter Biotin-X-C5 Oligonucleotide Labeling Kits" (Produkt-Nr. F-6095) der Firma Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA dort angefügt werden kann (vgl .11] .
Die DNA-Sondenmoleküle 606 werden mittels der bekannten Gold- Schwefel-Kopplung an die erste Elektrode 601 aus Gold immobilisiert. Bei Einsatz eines anderen Materials zum Binden der Sondenmoleküle wird das Material mit dem entsprechenden Beschichtungsmaterial versehen, auf dem die Sondenmoleküle immobilisiert werden können.
Während der Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle auf der ersten Elektrode 601 werden an die Elektroden unterschiedliche elektrische Potentiale angelegt, so dass ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden derart entsteht, dass eine Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle nur an der ersten Elektrode 601 möglich ist und an der zweiten Elektrode 602 und/oder an der dritten Elektrode 603 verhindert wird. In analoger Weise zu dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik, wie er oben beschrieben worden ist (vgl. Fig.4), wird in einem weiteren Schritt eine zu untersuchende Lösung 609, beispielsweise ein Elektrolyt, mit dem eventuell zu erfassenden makromolekularen Biopolymeren, d.h. den DNA- Strängen, die mit den DNA-Sondenmolekülen hybridisieren können, mit dem Biosensor 600, d.h. insbesondere mit der ersten Elektrode 601 und den darauf befindlichen markierten DNA-Sondenmolekülen 606 in Kontakt gebracht. Dies erfolgt derart, dass eventuelle in der zu untersuchenden Lösung enthaltene DNA-Stränge 608 mit den DNA-Sondenmolekülen 606 hybridisieren können.
Anschließend werden Fängermoleküle 606, an die keine zu erfassenden DNA-Stränge hybridisiert haben, entfernt. Dies kann durch Zugabe der oben im ersten Ausführungsbeispiel genannten DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyten 606 erfolgen. Auch in diesem Fall kann zur Hydrolyse der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 606 einer der folgenden Stoffe eingesetzt werden :
• Nuklease aus Mung-Bohnen,
• Nuklease Pl,
• Nuklease Sl, oder
• DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5'-^ 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer 3'-^ 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen.
Nach der Nukleasebehandlung befinden sich auf dem Biosensor lediglich die Hybride aus markierten Fängermolekülen 606 und zu erfassenden DNA-Molekülen 608. Dieser Zustand ist in Fig.6a gezeigt.
In diesem Zustand wird der Biosensor 600 mittels einer nicht dargestellten Spüllösung gespült, d.h. es werden die Fragmente der nicht hybridisierten DNA-Stränge sowie die zu untersuchende Lösung entfernt.
In einem nächsten Schritt wird eine weitere Lösung (nicht dargestellt) mit dem Biosensor 600, insbesondere mit der ersten Elektrode 601, in Kontakt gebracht.
Dabei enthält diese weitere Lösung ein Enzym 610, das an die Markierung 607 der hybridisierten DNA-Sondenmoleküle 606 bindet, und das die im folgenden erläuterten Moleküle, die in einer weiteren Lösung 611 zugegeben werden, spalten kann.
Als Enzym 610 können gemäß diesem Ausführungsbeispiel beispielsweise
• alpha-Galactosidase,
• beta-Galactosidase,
• beta-Glucosidase,
• alpha-Mannosidase ,
• Alkalische Phosphatase,
• Saure Phosphatase,
• Oligosaccharid-Dehydrogenase,
• Glucose-Dehydrogenase,
• Laccase,
• Tyrosinase,
• oder artverwandte Enzyme verwendet werden.
Das Enzym 610 wird vorliegend in Form eines Avidin-Konjugats eingesetzt. Grund dafür ist, dass Avidin eine spezifische Bindung mit der hier beispielhaft verwendeten Biotin- Markierung 607 eingeht (Fig.6b).
Es ist hierbei anzumerken, dass niedermolekulare Enzyme die höchste Umsatzeffizienz und daher auch die höchste Empfindlichkeit bei Verwendung als Enzym, das das Redox- Recyling bewirkt, gewährleisten können. In der weiteren Lösung 611 sind Moleküle 612 enthalten, die durch das Enzym 610 in ein erstes Teilmolekül 613 mit negativer elektrischer Ladung und in ein zweites Teilmolekül mit positiver elektrischer Ladung gespalten werden können (vgl . Fig.6b) .
Als das spaltbare Molekül 612 können vor allem beispielsweise
• p-Aminophenyl-hexopyranoside,
• p-Aminophenyl-phosphate,
• p-Nitrophenyl-hexopyranoside,
• p-Nitrophenyl-phosphate, oder
• geeignete Derivate von Diaminen, Catecholaminen, Fe(CN - ,
Ferrocen,
Dicarboxy1säure,
Ferrocenlysin,
Osmiumbipyridyl-NH, oder
2 PEG-Ferrocen verwendet werden.
An die Elektroden 601, 602, 603 wird bei dieser
Ausführungsform nun jeweils ein elektrisches Potential angelegt .
Dabei wird an die erste Elektrode 601 ein erstes elektrisches Potential V(E1) angelegt, an die zweite Elektrode 602 ein zweites elektrisches Potential V(E2) und an die dritte Elektrode 603 ein drittes elektrisches Potential V (E3).
Während der eigentlichen Messphase, die grundsätzlich analog der Vorgehensweise aus dem Stand der Technik, wie oben beschrieben wurde, erfolgt, wird ein abhängig von dem Vorzeichen der Ladung, jeweils folgendes Potentialgefälle der elektrischen Potentiale an die Elektroden 601, 602, 603 angelegt derart, dass gilt: V ( E3 ) > V ( E1 ) > V ( E2 ) .
Weist beispielsweise die dritte Elektrode 603 ein positives elektrisches Potential V(E3) auf, so weist die dritte Elektrode 603 das größte elektrische Potential der Elektroden 601, 602, 603 des Biosensors 600 auf.
Dies bewirkt, dass die erzeugten ersten Teilmoleküle 613 mit negativer Ladung aufgrund des größten elektrischen Potentials V(E3), das an der dritten Elektrode 603 anliegt, zu der positiv geladenen dritten Elektrode 603 gezogen wird, und nicht mehr, wie gemäß dem Stand der Technik, zu der ersten Elektrode 601.
Folglich wird in diesem Ausführungsbeispiel die erste Elektrode 601 nicht mehr sowohl als Halte-Elektrode zum Halten der Sondenmoleküle und als Messelektrode zum Oxidieren oder Reduzieren der jeweiligen Teilmoleküle verwendet. Vielmehr dient die Elektrode 601 nur zum Immobilisieren der Sondenmoleküle bzw. den Komplexen aus Sondenmolekülen und zu erfassenden makromolekularen Biopolymeren.
Die Funktion der Elektrode, an der die Oxidation bzw. Reduktion der erzeugten Teilmoleküle stattfindet, übernimmt nunmehr die dritte Elektrode 603.
Anschaulich bedeutet dies, dass mittels der dritten Elektrode 603 die erste Elektrode 601 von den gespaltenen Teilmolekülen abgeschirmt wird.
Auf diese Weise kann als weiterer Vorteil bei dieser Ausführungsform die Bedeckung der ersten Elektrode mit den DNA-Sondenmolekülen 606 erheblich erhöht werden.
An der dritten Elektrode 603 erfolgt eine Oxidation der negativ geladenen Teilmoleküle 613 und die oxidierten ersten Teilmoleküle 614 werden zu der zweiten Elektrode 602 gezogen, da diese das kleinste elektrische Potential V(E2) aller Elektroden 601, 602, 603 in dem Biosensor 600 aufweist.
An der zweiten Elektrode 602 erfolgt eine Reduktion der oxidierten Teilmoleküle und die reduzierten Teilmoleküle 615 werden wiederum an die dritte Elektrode 603 gezogen, wo wiederum eine Oxidation erfolgt.
Auf diese Weise ergibt sich vorliegend - analog zu der im Stand der Technik bekannten Weise - ein Kreisstrom, der ebenfalls auf bekannte Weise erfasst wird. Somit ergibt sich auch hier ein Verlauf des Kreisstroms über die Zeit als Signal. Aus diesem kann (mittels des über die Markierung 607 gebundenen Enzyms 610) aufgrund der Proportionalität des Kreisstroms zu der Anzahl der durch das Enzym 610 erzeugten Ladungsträger wiederum die Anzahl der hybridisierten DNA- Stränge 606 und somit der zu erfassenden DNA-Moleküle 608 ermittelt werden.
Allerdings sei hier angemerkt, dass dieses Redox-Recycling Verfahren im Sinne der Erfindung auch mit der bekannten „2- Elektroden-Anordnung" gemäß Fig.4 durchgeführt werden kann. Dann kann jedoch nicht auf den Vorteil des hier beschriebenen Biosensors 600 zurückgegriffen werden, der durch die Ausgestaltung der Elektrode 601 als
Immobilisierungselektrode, eine höhere Bedeckungsdichte als die aus dem Stand der Technik bekannte Anordnung erlaubt. In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert:
[1] R. Hintsche et al . , Microbiosensors Using Electrodes Made in Si-Technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al . , Dirk Hauser Verlag, Basel, S. 267 - 283, 1997
[2] R. Hintsche et al, Microbiosensors using electrodes made in Si-technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F . W. Scheller et al, Birkhauser Verlag, Basel, Schweiz, 1997
[3] M. Paeschke et al, Voltammetric Multichannel Measurements Using Silicon Fabricated Microelectrode Arrays, Electroanalysis, Vol. 7, Nr. 1, S. 1 - 8, 1996
[4] P. van Gerwen, Nanoscaled Interdigitated Electrode Arrays for Biochemical Sensors, IEEE, International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, Chicago, S.907 - 910, 16. - 19. Juni 1997
[5] N.L. Thompson, B.C. Lagerholm, Total Internal Reflection Fluoresence: Applications in Cellular Biophysics, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 8, S. 58 - 64, 1997P.
[6] Cuatrecasas, Affinity Chromatography of Macromolecules, Advances in Enzymology, Vol. 36, S. 29 - 89, 1972
[7] Römpp-Lexikon Biotechnologie, Gentechnik, S. 280, 1999 Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2. Auflage.
[8] Römpp-Lexikon Biotechnologie, Gentechnik, S. 397, 1999 Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2. Auflage.
[9] J. Dodt et al . , Skript zum biochemischem Praktikum Ild (Immunchemie), ELISA, S. 1, Institut für Biochemie, Technische Hochschule Darmstadt, 10. - 28. Februar 1992. [10] Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, S. 157 - 160, Molecular Probes, Ine, 1996
[11] Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, S. 83 - 84, Molecular Probes, Ine, 1996
[12] J.P. Spatz et al . , Mineralization of Gold Nanoparticles in a Block Gold Copolymer Microemulsion, Chem. Eur . J., Vol. 2, S. 1552 - 1555, 1996
[13] J.P. Spatz et al . , Ordered Deposition of Inorganic
Cluster from Micellar Block Copolymer Films, Langmuir, Vol. 16, S. 407 - 415, 2000
[14] F. Burmeister et al . , Mit Kapillarkräften zu
Nanostrukturen, Physikalische Blätter, Vol. 36, S. 49 - 51, 2000
[15] DE 199 25 402 AI
[16] Medline Abstract, DN 99128068 zu Kitazawa, S et al . In situ hybridization with polymerase chain-reaction derived Single-stranded DNA probe and Sl nuclease; Histchem. Cell Biol . 111(1), S. 7-12, 1999
[17] US 6,017,696
[18] DE 197 41 716 AI Bezugszeichenliste
100 Biosensor
101 Fotodiode
102 Fotodiode
103 Isolator
104 Elektrischer Anschluss
105 Elektrischer Anschluss
106 Oxidschicht
107 Einheit zum Immobilisieren
108 Einheit zum Immobilisieren
109 DNA-Sondenmolekül
110 DNA-Sondenmolekül
111 Markierung
112 Markierung
113 Elektrolyt
114 DNA-Stränge
115 Pfeil
116 Pfeil
200 Sensor
201 Elektrode
202 Elektrode
203 Isolator
204 Elektrodenanschluss
205 Elektrodenanschluss
206 DNA-Sondenmolekül
207 Elektrolyt
208 DNA-Stränge
300 Biosensor
301 Fotodiode
302 Fotodiode
303 Isolator
304 Oxidschicht
305 Schicht aus zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren nicht geeignetem Material 306 Nanopartikelförmige Einheiten zum Immobilisieren
307 DNA-Fängermolekül
400 Biosensor
401 Erste Elektrode
402 Zweite Elektrode
403 Isolatorschicht
404 Haltebereich erste Elektrode
405 DNA-Sondenmolekül
406 Elektrolyt
407 DNA-Strang
408 Enzym
409 Spaltbares Molekül
410 Negativ geladenes erstes Teilmolekül
411 Pfeil
412 Weitere Lösung
413 Oxidiertes erstes Teilmolekül
414 Reduziertes erstes Teilmolekül
500 Diagramm
501 Elektrischer Strom
502 Zeit
503 Kurvenverlauf Strom-Zeit
504 Offsetstrom
600 Biosensor
601 Erste Elektrode
602 Zweite Elektrode
603 Dritte Elektrode
604 Isolatorschicht
605 Haltebereich
606 DNA-Sondenmoleküle
607 Markierung
608 DNA-Stränge
609 Elektrolyt
610 Enyzm
611 weitere Lösung 612 spaltbares Molekül
613 Negativ geladenes erstes Teilmolekül
614 Oxidiertes erstes Teilmolekül
615 Reduziertes erstes Teilmolekül

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren,
• bei dem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen wird, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können, und wobei die Fängermoleküle eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares Signal erzeugen kann,
• bei dem eine zu untersuchende Probe mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt gebracht wird, wobei die zu untersuchende Probe die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann,
• bei dem in der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen gebunden werden,
• bei dem Fängermoleküle, an die keine zu erfassenden makromolekularen Biopolymere gebunden haben, entfernt werden,
• bei dem die makromolekularen Biopolymere mittels der Markierung erfasst werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem durch die Markierung ein Signal erzeugt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Markierung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Farbstoffen, Radioisotopen, Enzymen und Enzym-Liganden besteht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem als makromolekulare Biopolymere Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Proteine, oder Komplexe aus Nukleinsäuren und Proteinen erfasst werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4 ,
• bei dem als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, und
• bei dem als Fängermoleküle Liganden verwendet werden, die die Proteine oder Peptide spezifisch binden können.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem nicht gebundene Liganden von der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren entfernt werden, indem ein Material mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird, wobei das Material imstande ist, die chemische Verbindung zwischen dem Liganden und der Einheit zum Immobilisieren zu hydrolysieren.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Material, das mit der mindestens einen Einheit zur Immobilisierung in Kontakt gebracht wird, ein Enzym ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7 , bei dem das Enzym, das in mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird, eine Carboxylester-Hydrolase (Esterase) ist.
9. Verfahren nach Anspruch , bei dem als makromolekulare Biopolymere DNA- oder RNA- Moleküle erfasst werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
• bei dem als makromolekulare Biopolymere DNA-Einzelstränge mit einer vorgegebenen Nukleotidsequenz erfasst werden, und bei dem als Fängermoleküle Moleküle DNA-Sondenmoleküle mit einer zu der vorgegebenen Nukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem nicht gebundene DNA-Sondenmoleküle von der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren entfernt werden, indem ein Enzym mit Nukleaseaktivität mit der Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem als Enzym mit Nukleaseaktivität mindestens einer der folgenden Stoffe verwendet wird:
• Nuklease aus Mung-Bohnen,
• Nuklease Pl,
• Nuklease Sl, oder
• DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5 ' -> 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer 3'-^ 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren auf einer Elektrode oder einer Photodiode aufgebracht ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Einheit zum Immobilisieren eine Anordnung von Nanopartikeln ist.
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