WO2002064770A1 - Nouvelle proteine de classe a du type recepteur eboueur - Google Patents

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WO2002064770A1
WO2002064770A1 PCT/JP2002/001320 JP0201320W WO02064770A1 WO 2002064770 A1 WO2002064770 A1 WO 2002064770A1 JP 0201320 W JP0201320 W JP 0201320W WO 02064770 A1 WO02064770 A1 WO 02064770A1
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dna
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adse
gene
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Yusuke Nakamura
Sumio Sugano
Hiroyuki Kawano
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Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention provides a novel scavenger receptor class A subtype and a fragment thereof, a DNA encoding the protein and a fragment thereof, an expression vector containing the DNA, and a trait transformed with the expression vector.
  • the present invention relates to a transformed cell, an antibody reactive with the protein or a fragment thereof.
  • a characteristic of arteriosclerosis seen with hyperlipidemia is the accumulation of foamy mac phages, which have accumulated a large amount of cholesterol ester, in atherosclerotic lesions.
  • the origin of such foam cells is monocyte phage and vascular smooth muscle cells derived from monocytes in peripheral blood, but most of them are macrophages in their initial lesions.
  • Atherosclerosis is said to begin with damage to vascular endothelial cells.
  • LDL and its degeneration are important. LDL in the blood penetrates into the subendothelium and undergoes various modifications to become denatured LDL.
  • SR Scavenger receptor
  • the macrophage force-venger receptor is classified into class A, which also reports four subtypes: I, II, III, and MARCO. Have been. These subtypes are inside-out type trimer membrane glycoproteins, especially subtypes. Groups I to III consist of 6 domains (N-terminal force, cytoplasmic domain, transmembrane domain, spacer domain, ⁇ -helical coiled-coil domain). And a collagen-like domain and a C-terminal specific domain (see Fig. 1).
  • the cytoplasmic domain is characterized by the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sequence found in the LDL and insulin receptors and the endcytosis signal similar to the YXR F sequence found in the trans-ferrin receptor. It has a distinctive title-turn structure. In fact, it is said that deletion of these sequences suppresses endcytosis.
  • ⁇ -helical-coil docoyl domain The feature of ⁇ -helical-coil docoyl domain is that the active receptor is formed by associating three scavenger receptor polypeptides as primary protein structures. is there.
  • This domain has a right-handed heptad repeat that rotates twice every 7 amino acids, that is, a spiral coiled coil structure, and three polypeptides are 7 amino acids. It forms a trimer with hydrophobic amino acids such as leucine diso leucine, which are present in each acid, facing inward and polar amino acids and sugar chain binding sites facing outward.
  • a characteristic of the collagen-like domain is that it has a repeating structure of dalysin (Gly) -X-Y unique to collagen. At the C-terminal side, a large amount of positively charged amino acids suitable for binding negatively charged ligands are concentrated. It has been confirmed that the mutant lacking the 22 amino acids at the C-terminal side loses the ligand binding property.Therefore, the collagen-like domain is an MRS ligand. It is presumed to be a binding site.
  • the characteristic of the C-terminal specific domain is that it is rich in cysteine and has high homology to wood, such as complement factor 1 and CD5 and CD6.
  • Subtypes of the same type e.g. type I
  • the saptype is characterized in that the spacing between the six cysteine residues on the amino acid sequence is completely conserved across the species of origin, while the type II or type III subtypes Thus, the entire domain structure is highly diverse, with all or part of this domain being lost.
  • MSRs with these structural features take up excessive denatured LDL and transform macrophages into foam cells. It has been pointed out that the incorporation of denatured LDL by this MSR and the resulting foaming of the macula phage play an important role in the development of atherosclerosis. In fact, in the case of dap noreno knockout mice in which the MSR and apo E were inactivated by genetic manipulation, atherosclerotic lesions shrunk compared to the knock out mouse with apo E alone. It has been confirmed that MSR is deeply involved in the development of arteriosclerosis. Furthermore, it is clear that this MSR is involved in the protection of bacterial infections and in the uptake of advanced glycation end product (AGE), which causes diabetic vascular disorders. (Nature, Vol. 386, 292-296, 1997). '
  • the present invention provides a medicament and a method useful for preventing and treating arteriosclerotic diseases by identifying a new arteriosclerosis-related protein and its gene, which are different from known MSRs. Things. Means for solving the problem
  • the present invention relates to a novel gene (hereinafter referred to as “adse”), an SR-like protein encoded by the gene, particularly a novel saptype ADSE (hereinafter referred to as “ADSE”) presumed to belong to Class A. Further, the present invention provides a host cell transformed with the gene and a method for producing a recombinant ADSE using the transformed cell.
  • adse novel gene
  • ADSE novel saptype ADSE
  • the present invention provides a gene, adse, which encodes ADSE (described in detail below).
  • the gene adse is a DNA encoding a scavenger receptor-like protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the cDNA shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • the genomic DNA derived from the cDNA is also included.
  • the gene can be isolated and identified from human adipose tissue, but is disclosed herein. DNA prepared by chemical synthesis techniques such as cloning and phosphoamidite techniques using genetic techniques such as general hybridization based on the sequence Good. Examples of the form include cDNA and genomic DNA, as well as synthetic DNA, but are not particularly limited.
  • the DNA of the present invention may be single-stranded, or may form double or triple chains by binding to DNA or RNA having a sequence complementary thereto. Further, the DNA may be labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP0), a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or the like.
  • HRP0 horseradish peroxidase
  • a radioisotope a fluorescent substance
  • chemiluminescent substance or the like.
  • RNA corresponding to DNA or DNA and RNA having a sequence complementary to the DNA of the present invention is also provided.
  • DNAJ is synonymous with “polynucleotide j”.
  • the DNA of the present invention also includes a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a DNA that hybridizes under stringent conditions.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the protein hybridized under stringent conditions with the DNA and the protein encoded by the DNA is a scavenger receptor-like protein
  • variation of the base sequence is allowed.
  • the presence of multiple codons encoding the same amino acid residue due to so-called codon degeneracy, or random mutations caused by various artificial treatments such as site-directed mutagenesis and mutagen treatment Even if the DNA sequence is partially changed due to mutation, deletion, ligation, etc. of the DNA fragment due to restriction enzyme digestion, these DNA mutants can be substituted with the DNA of SEQ ID NO: 1.
  • the extent of the above DNA mutation is within the allowable range as long as it has 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more identity with the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1. is there.
  • BLAST J. Mol. Evol., Vol. 36; 290-300 (1993), J. Mol. Biol., Vol. 215; 403_10 (1990)
  • force S force S.
  • the degree of hybridization may be reduced under stringent conditions, for example, DIG DNA Labeling kit (Roche Diagnostics). For example, 32 if the probe is labeled with Cats No. 1175033).
  • C preferably 37 ° C, more preferably 42.
  • Hybridized in DIG Easy Hyb solution of C (Roche Diagnostics Cat No. 1603558), for example 0.5 XSSC solution at 50 ° C, preferably 65 ° C (0.1 X / v) containing SDS) Southern hybridization under conditions (1 XSSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate) in medium It is sufficient to hybridize to the nucleic acid described in SEQ ID NO: 1.
  • the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial fragment thereof is considered to be useful as a specific probe for diseases involving the protein of the present invention, such as arteriosclerosis.
  • the DNA of the present invention can be used to produce ADSE in large quantities.
  • the DNA can also be labeled with an enzyme or the like and used for examining the expression status of the protein of the present invention in a tissue. That is, by using the DNA as a probe and confirming the expression level of the protein of the present invention in cells using the itiRNA expression level as an index, cells suitable for producing the protein of the present invention can be obtained.
  • diseases associated with the protein of the present invention in particular, arteriosclerosis.
  • PCR-RFLP Restriction fragment length polymorphism
  • PCR-SSCP Single strand conformation polymorphism
  • sequencing using a part of the DNA of the present invention as a primer.
  • Another object of the present invention is to introduce the DNA of the present invention into cells in a living body, and to impart the modified LDL uptake activity to the cells, thereby reducing the concentration of denatured LDL in blood. It can also be used for gene therapy to prevent the onset of arteriosclerosis.
  • the DNA of the present invention is extremely useful for preparing transformed cells, further, for producing a recombinant protein ADSE using the transformed cells, or for searching for a compound that specifically inhibits ADSE expression. .
  • the transformed cells of the present invention can be prepared by applying techniques known to those skilled in the art, for example, by using various vectors that are commercially available or generally available to those skilled in the art. However, it is possible to incorporate the DNA of the present invention into a suitable host cell. At this time, the expression of the gene adse in the host cell can be arbitrarily controlled by placing the gene adse under the influence of an expression control gene represented by the promoter. It is.
  • This technique can be suitably used in the production of ADSE using transformed host cells, and can also be applied to studies on the regulation mechanism of the expression of the gene adse or search for substances capable of regulating the expression of the gene. It will be possible.
  • a substance having an action of promoting or suppressing the expression of the gene adse of the test substance can be obtained. You can search or evaluate.
  • a transgenic animal can be prepared based on a mouse or other suitable animal.
  • Such transgenic animals when fed with a high cholesterol diet, can induce the animals to develop atherosclerotic characteristic atherosclerotic lesions.
  • it is very useful as an arteriosclerosis model animal, and is expected to greatly promote the development of a drug effective against arteriosclerosis caused by ADSE.
  • the gene adse of the present invention it is possible to produce a so-called knockout animal in which a gene corresponding to human adse is disrupted from an animal other than human.
  • Physics of this model animal By analyzing the characteristic, biological, pathological and genetic characteristics, it becomes possible to elucidate the functions of the genes and proteins according to the present invention.
  • a model animal having only the human adse can be produced. It will be possible. This model animal is useful for the development and evaluation of a drug targeting the introduced human adse.
  • ADSE a protein encoded by adse, is a scavenger receptor-like protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • it is determined that it is a novel subtype protein belonging to Class A from the structural features found in its amino acid sequence.
  • ADSEs are classified into class A subtype proteins, especially characteristic structural domains present in type I subtypes, cytoplasmic domains (1-59 aa) from the N-terminal side, and membranes.
  • Penetration domain 60 to 9 laa
  • spacer domain 92 to 126 aa
  • ⁇ -helical force domain ⁇ -helicalcoiled- coil domain
  • collagen-like domain (306-384 aa)
  • C-terminal specific domain (385-49) 5 aa. Therefore, ADSE, like other SR class A subclass proteins, is recognized as an inside-out type trimeric membrane glycoprotein.
  • denatured LDL as a ligand; for example, acetylated LDL, malondialdehyde LDL, oxidized LDL, acetoacetylated LDL, malereiyl And LDL, succinylated LDL, and the like; and it is considered that they bind to male / norreid / aniolebumin, AGE (advanced glycation end product), LPS (lypopolysaccharidej, etc.).
  • the scavenger receptor-like protein of the present invention is It is understood as a receptor protein having an activity of binding to a ligand as described above, and more preferably has an activity of binding to a ligand such as denatured LDL and taking up into a cell. It is a protein.
  • ADSE highly retains the features found in class A receptor class A in the domain structure, it has a high level at the amino acid sequence level.
  • the homology is about 42.6% of the total homology with the most homologous subtype I (human SRA I), and the homology is the highest among the domain structures. Only about 70% in the main domain. This fact suggests that ADSE may be able to help other atherosclerosis in developing or progressing atherosclerosis. It is strongly inferred that it plays a characteristic role not found in Lass. Therefore, a drug compound targeting ADSE is expected to be a drug with unprecedented features.
  • polypeptides or proteins consisting of sequences are also within the scope of the present invention.
  • Amino acid residue side chains which are constituents of proteins, differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but have a substantially three-dimensional structure (also referred to as a three-dimensional structure) of the entire protein.
  • Several highly conservative relationships are known in the sense that they have no effect.
  • Ser serine
  • Ser serine
  • Ala lysine
  • Arg arginine
  • Such modification of amino acid is observed in nature, such as a mutation caused by a genetic polymorphism and the like, and is also carried out by a method known to those skilled in the art, for example, a sudden Using site-directed mutagenesis and various site-directed mutagenesis methods
  • You can go to The mutation site and number of amino acids are not particularly limited as long as the mutant protein is a scavenger receptor-like protein, but the number of mutations is usually within several tens of amino acids, and preferably 10 amino acids. Within amino acids, more preferably within one or several.
  • ADSE can be understood as an entire receptor having all the domain structures as described above, and also a domain having a binding ability to a characteristic domain, particularly, a ligand. It can also be understood as a partial peptide that holds in.
  • a partial fragment containing a ligand binding site is free (or is not isolated) by being separated from other domain forces while maintaining a characteristic three-dimensional structure.
  • the partial peptide in ADSE is also substantially equivalent to the present invention as long as it has the ligand binding ability in this sense.
  • ADSE it is presumed that such a ligand-binding function is retained in the C-terminal partial peptide including the recoil coil domain.
  • Preferred embodiments of the partial peptides include, for example, spacer domains (92-126a.a.), ⁇ - helical-coiled coil domains ⁇ he 11 ca 1c 011 ed ⁇ co 11 domain; 127 ⁇ ci05a.a.), coff 1 ⁇ gen-like domain (306 ⁇ 384a.a.), or C-terminal specific domain
  • the protein of the present invention or its partial peptide can be used for searching for a substance that regulates the activity of the protein.
  • Compounds and the like obtained through the search are expected to be effective therapeutic or prophylactic agents for diseases associated with the protein of the present invention, such as arteriosclerosis.
  • the present invention further provides antibodies that bind to ADSE.
  • the antibody of the present invention is an antibody that specifically recognizes the entire ADSE or a partial peptide thereof as an antigen, and includes a monoclonal antibody and Z or polypeptide. Includes clonal antibodies. There are also five classes classified as immunoglobulin structures, physicochemical and immunological properties.
  • an antibody having a function of regulating ADSE activity includes, for example, a neutralizing antibody that inhibits the binding of ADSE to a ligand. These antibodies are useful for research or clinical detection of C-ADSE.
  • the present invention provides a so-called antisense nucleic acid capable of suppressing ADSE biosynthesis at the nucleic acid level in a living body.
  • These antisense nucleic acids are used to generate the mRNA encoding ADSE, from the genomic region to the pre-mRNA transcription stage, from the pre-mRNA to the mature mRNA, and from the nuclear envelope.
  • DNA or RNA that carries genetic information at either the transit stage or the translation stage into protein That regulates protein expression by affecting the normal flow of genetic information and is a sequence that complements the whole or any part of the nucleic acid sequence of the gene adse. It may be composed of.
  • nucleic acid including DNA and RNA
  • it is a nucleic acid (including DNA and RNA) consisting of a sequence corresponding to or complementary to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • sequence corresponding to or complementary to the sequence of the untranslated portion is used. All the antisense nucleic acids will have the same function as the antisense nucleic acid of the present invention.
  • the antisense nucleic acid of the present invention includes not only DNA and RNA but also various derivatives whose tertiary structure and function are similar to DNA or RNA. For example, substitution or modification may occur in at least one of the nucleic acid, oligonucleotide base, sugar, and phosphoric acid with other substance bound to the 3 'end or 5' end. Nucleic acids, nucleic acids having a base, sugar or phosphoric acid which do not exist in nature, and nucleic acids having a skeleton (backbone) other than the saccharide-monophosphate skeleton. These nucleic acids are derivatives with at least one increase in nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability, and binding. It is suitable. That is, the form of the nucleic acid is not limited as long as it has a function of suppressing the expression of ADSE activity.
  • nucleotide sequence that hybridizes to a loop portion of an mRNA that forms a stem loop that is, a region that forms a stem loop
  • Antisense nucleic acids having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence are preferred.
  • Antisense nucleic acids having a sequence complementary to the sequence are also preferable in that generally high expression suppression effects can be expected.
  • the antisense nucleic acid of the present invention has a chain length of 15 bases or more and 30 bases or less, preferably 1 base or less. It is preferable that the base sequence be composed of 5 to 25 bases, and more preferably 18 to 22 bases.
  • the effect of suppressing the expression of the antisense nucleic acid of the present invention can be determined by a known method, for example, DNA and Lucifif containing the expression control region of the gene of the present invention, the 5 ′ untranslated region, the region near the translation start site, or a part of the translation region.
  • Create an expression plasmid linked to a reporter gene such as erase Gene of the present invention such as a system that uses a combination of an in vitro transcription reaction (such as Ribo max system) and an in vitro translation anti-j ⁇ (such as Rabbit Reticulocyte Lysate System). This can be evaluated by adding a test substance to the system in an environment where the gene is transcribed or translated, and measuring the expression level of the reporter gene.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can suppress the expression of adse in a living body, it is useful as an agent for preventing and treating ADSE-related diseases.
  • an appropriate genomic DNA library or cDNA library can be obtained by the screening method using hybridization or the screening method using hybridization. Screening by an immunoscreening method using an antibody, growing clones containing the target DNA, and cutting out the clones using restriction enzymes or the like. There is. Screening by the noise predication method is a method in which a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof is labeled with 32 P or the like as a probe, and any cDNA library is used. To On the other hand, it can be done by known methods (for example, Maniatis T.
  • the novel DNA of the present invention can also be obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using a genomic DNA library or a cDNA library as a ⁇ type.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • a sense primer and an antisense primer are prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and any DNA library can be prepared by a known method (for example, PCR using Michael AI, PCR, etc.). Protocols, a Guide to Methods an Applications, Academic Press, 1990) can be performed to obtain the DNA of the present invention.
  • a DNA library having the DNA of the present invention is selected and used.
  • any library can be used as long as it has the DNA of the present invention.
  • a commercially available DNA library can be used or the DNA library of the present invention can be used.
  • Selection of cells suitable for preparing a cell library cDNA library using known methods J. Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) can be used to create and use cDNA libraries.
  • the recombinant vector containing the DNA of the present invention may be in any form, such as circular or linear.
  • Such a recombinant vector may contain, if necessary, other nucleotide sequences in addition to the whole or a part of the DNA of the present invention (a part is, for example, a DNA encoding a partial peptide of the protein of the present invention). You may have one.
  • Other base sequences include the sequence of the enhancer, the sequence of the promoter, the ribosome binding sequence, the base sequence used for the purpose of amplifying the number of copies, and the base encoding the signal peptide.
  • Sequence a base sequence encoding another polypeptide, a polyA addition sequence, a splicing sequence, a replication origin, a base sequence of a gene to be a selection marker, and the like.
  • One preferred example of the recombinant vector of the present invention is an expression vector.
  • gene recombination a translation initiation codon and a translation termination codon are added to the DNA of the present invention using an appropriate synthetic DNA adapter, or an appropriate restriction enzyme cleavage sequence is newly added to the base sequence. It can also be generated or eliminated.
  • the vector holding the DNA of the present invention can be used by selecting an appropriate vector according to the host to be used.
  • viruses such as virus, retrovirus, and vaccinia virus can be used, and there is no particular limitation.
  • the gene of the present invention can be expressed under the control of a promoter sequence unique to the gene.
  • a promoter sequence unique to the gene By using such an expression system, it is possible to more advantageously search for a substance that promotes or suppresses transcription of the gene of the present invention.
  • another suitable expression promoter upstream of the gene of the present invention can be used by connecting to or replacing the promoter sequence unique to the gene.
  • the promoter used in this case may be appropriately selected according to the host and the purpose of expression.
  • the T7 promoter, lac promoter, trp promoter, ⁇ If the host is yeast, PHO5 promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc., if the host is an animal cell, SV40-derived promoter, retro Virus
  • a promoter and the like can be illustrated, it is needless to say that the present invention is not limited to these.
  • the protein of the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein, and a peptide synthesizer (for example, Peptide Synthesizer 433A, manufactured by Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) Alternatively, it can be prepared by a chemical synthesis method using E. coli or a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotes or eukaryotes. However, in terms of purity, production by genetic engineering techniques and recombinant proteins are preferred.
  • a peptide synthesizer for example, Peptide Synthesizer 433A, manufactured by Applied Biosystems Japan Co., Ltd.
  • E. coli and B. subtilis strains are S. cerevisiae.
  • Many cells such as lower cells, insect cells, animal cells such as COS 7 cells, CH 0 cells, and Hela cells, which can be used in genetic engineering techniques represented by It is.
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by transforming a suitable host cell with the recombinant vector of the present invention.
  • Methods for introducing the recombinant vector described in the preceding section into host cells include the electroporation method, protoplast method, alkaline metal method, calcium phosphate precipitation method, and DEAE Known methods such as the dextran method, the micro-fusion method, and the method using virus particles (Experimental medicine extra edition, Handbook of Genetic Engineering, published March 20, 1999, sheep There are two types of methods, but any of them may be used.
  • the above-mentioned transformed cells are cultured, a culture mixture is recovered, and the protein is purified.
  • Culture of the transformed cells can be performed by a general method. There are various books (eg, “Microbial Experiment Method” edited by The Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1992) for culturing transformed cells, and the culture is performed with reference to them. be able to.
  • an appropriate method is used among methods usually used for protein purification. It can be selected at any time. That is, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography Various kinds of affinity such as chromatography, chromatography, chromatography, adsorption chromatography, reversed-phase chromatography, etc.
  • An appropriate method may be appropriately selected from methods that can be used usually, and if necessary, purification may be performed in an appropriate order using an HPLC system or the like.
  • a fusion protein of the protein of the present invention with another protein or tag (eg, glutathione S-transferase, protein A, hexahistidine tag, FLAG tag, etc.) It is also possible to express by expressing.
  • the expressed fusion form can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin, enterokinase, etc.), which may provide more advantageous protein preparation.
  • the protein of the present invention may be purified by appropriately combining techniques generally used by those skilled in the art. In particular, when the protein is expressed in the form of a fusion protein, a purification method characteristic of the form may be employed. Is preferred.
  • the protein of the present invention can be prepared in its own form or in the form of a fusion protein with another protein, but is not limited thereto, and is not limited thereto. It is possible to further convert the protein into various forms. For example, processing by various methods known to those skilled in the art, such as various chemical modifications to proteins, binding to polymers such as polyethylene glycol, and binding to insoluble carriers, can be considered. In addition, depending on the host used, the presence or absence of the addition of sugar chains and the degree of addition are also different. Even in such a case, as long as it functions as a scavenger receptor-like protein, it should be said that it is under the concept of the present invention.
  • the protein of the present invention can be used as an antigen for producing an antibody, or can be used for screening a substance that binds to the protein, or a substance that regulates the activity of the protein. It is.
  • the ADSE of the present invention enables high expression of a target molecule on the cell surface by culturing the above-described transformed cell, particularly an animal cell.
  • ADSE extracellular region protein flag When an appropriate fragment such as a fragment is produced as a soluble protein, a transformed cell is prepared as described above using the DNA coding for the extracellular region or each domain. The transformant can be produced by culturing the transformed cell to secrete it into the culture supernatant.
  • the cells suspended in an appropriate buffer can be treated with, for example, sonication, freeze-thawing, or lysozyme treatment.
  • the membrane fraction can be further purified using an appropriate surfactant. Dissolve and prepare a crude solution. Then, the target protein can be isolated and purified from the crude solution by an ordinary method.
  • transgenic non-human mammal By using the gene adse of the present invention, a transgenic non-human mammal can be produced.
  • This transgenic non-human mammal also belongs to the invention of the present application.
  • the transgenic non-human mammal can be prepared using standard methods commonly used in the production of transgenic animals (eg, developmental engineering experiment manuals, Kodansha Scientific issue, edited by Motoya Katsuki, supervised by Tatsuji Nomura, year). That is, the gene or the recombinant vector of the present invention is introduced into a totipotent cell of a non-human animal, the cell is developed into an individual, and the transgene is incorporated into the genomic of a somatic cell. Sorted individuals.
  • a transgenic mouse it is constructed so that the adse gene can be expressed in a pronuclear stage fertilized egg obtained from a normal C57B lack Z6 mouse. Inject DNA directly. More specifically, construct a construct into which the adse gene has been introduced by connecting the adse gene downstream of an appropriate promoter, and then, if necessary, remove as much of the prokaryotic sequence as possible. The obtained linear DNA is directly injected into the pronucleus of the pronuclear stage by using a fine glass needle. The fertilized egg is transplanted into the uterus of another pseudopregnant mouse as a foster parent.
  • Pseudopregnant mice are generally produced by mating ICR female mice with male mice whose vas deferens have been cut or ligated. Genomic DNA is extracted from the tissues of the offspring derived from the transplanted embryos, and the presence or absence of the adse gene is confirmed by PCR or Southern blotting to obtain transgenic mice.
  • the “knockout mouse” in the present invention is a knockout mouse in which an endogenous gene encoding a mouse-derived protein of the present invention is knocked out.
  • (Inactivated) mouse for example, a positive negative selection method using homologous recombination (US Pat. Nos. 5,464,764, 5,487,992, No. 5,627,059, oc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, 8932-8935, 1989, Nature, Vol. 342, 435-438, 1989, etc.).
  • a knockout mouse is also one embodiment of the present invention.
  • homologous recombination is performed in the same manner as performed for ES cells, a nucleus is obtained from the obtained cells, and cloned using the nucleus. You can get animals.
  • the animal is a knockout animal that has lost adse (or the homologous gene of adse in each animal).
  • adse or the phase of adse in each animal is It is also possible to produce transgenic animals by introducing a gene and using the nucleus to obtain a cloned animal. Human animals and transgenic non-human animals are an aspect of the present invention, regardless of their species.
  • the antibodies of the present invention can be obtained by referring to known methods for both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (for example, procedures for immunological experiments, edited by the Japanese Society of Immunology, Japanese Immunology). Published by the Society, see). This will be briefly described below.
  • an animal is first treated with the protein of the present invention as an immunizing antigen and, if necessary, a complete adjuvant of Freund.
  • the protein of the present invention used as an antigen may be obtained by any method as long as it has the degree of purification used to produce an antibody.
  • the partial polypeptide of the protein of the present invention is also suitably used as an immunizing antigen.
  • the polypeptide used as an immunizing antigen is a low molecular weight polypeptide, that is, a polypeptide composed of about 10 to 20 amino acids. If so, copy it to the keyhole link.
  • the animal to be immunized can be any animal, but is preferably used in rats, mice, rabbits, sheep, dogs, horses, and rats normally used in immunological experiments by those skilled in the art. ⁇ It is preferable to select and use an animal species that produces the desired antibody from birds, goats, pigs, and sea lions.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by purifying the obtained anti-blood plasma. Purification may be carried out by appropriately combining known methods such as salting out, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • antibody-producing cells such as spleen cells or lymphocytes are collected from the immunized animal, and the cells are collected by a known method using polyethylen glycol, Sendai innole, electric pulse, or the like. Thus, it is fused with a myeloma cell line or the like to produce a hybridoma.
  • clones producing an antibody that binds to the protein of the present invention are selected and cultured, and the culture supernatant of the selected clone is purified to obtain the clone.
  • Purification can be performed by appropriately combining known methods such as salting out, ion-exchange chromatography, and ab- tea chromatography. I just need to be.
  • the novel antibody can also be obtained by using a genetic engineering method. For example, spleen cells and lymphocytes of an animal immunized with the protein of the present invention or a partial polypeptide thereof, or a type that produces a monoclonal antibody against the protein of the present invention or a partial polypeptide thereof.
  • the mRNA is collected from the lidoma and a cDNA library is created based on the mRNA. Screening clones producing antibodies that react with antigen, culturing the resulting clones, and purifying the desired antibody from the culture mixture by a combination of known methods .
  • humanized antibodies are preferred in terms of immunogenicity.
  • Humanized antibodies can be prepared by immunizing a mouse whose immune system has been replaced with that of a human (eg Nat. Genet. 15; 146-156 (1997)). I can do it. It can also be prepared by genetic engineering using the hypervariable region of a monoclonal antibody.
  • Antisense nucleic acids can be produced by known methods (eg, X- is edited by Stanley T. Crooke and Bernald Lebleu, in Antisense Research and Applications, CRC Publishing, Florida, 1993). 0 Natural DNA or RNA can be synthesized using a chemical synthesizer, or the antisense nucleic acid of the present invention can be obtained by PCR using ADSE as type III. In addition, some derivatives such as methylphosphonate and phosphophorate are synthesized using a chemical synthesizer (for example, Model 394, manufactured by PerkinElmer Japan KK). Some things can be done. In this case, the operation is performed according to the manual attached to the chemical synthesizer, and the obtained synthetic product is purified by an HPLC method using a reversed-phase chromatography or the like. In addition, antisense nucleic acids can be obtained.
  • the DNA or antisense nucleic acid of the present invention is used as a diagnostic probe, it is labeled with a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like according to a known method.
  • DNA or mRNA is prepared from the sample sample by a known method, and this is used as a test substance. After reacting by adding the labeled probe, washing is performed to remove the unreacted labeled probe. I do. If the test substance contains the gene ADSE or RNA, the antisense nucleic acid binds to them. The presence or absence of bond formation can be determined by using, as an index, luminescence, fluorescence, radioactivity, etc.
  • the DNA, the antisense nucleic acid or the recombinant vector of the present invention is used for pharmaceutical use, it should be of a purity that is suitable for use as a pharmaceutical and a pharmacologically acceptable method of use. It is preferable to use it.
  • the DNA, antisense nucleic acid or recombinant vector of the present invention may be used by directly dissolving or suspending it in an appropriate solvent, or may be encapsulated in ribosome. It may be used by incorporating it into an appropriate vector. If necessary, pharmacologically acceptable scavengers may be added, and injections, tablets, capsules, eye drops, creams, suppositories, sprays, patches, etc. It may be used in an appropriate dosage form.
  • Pharmacologically acceptable auxiliary ingredients include solvents, bases, stabilizers, preservatives, solubilizers, excipients, buffers and the like.
  • the DNA, the antisense nucleic acid or the recombinant vector of the present invention is in the above-mentioned dosage form, its administration method, depending on the age, sex, type and degree of disease of the patient, and The dose can be set and used. That is, oral administration, or inhalation, transdermal administration, eye drops, vaginal administration, intraarticular administration, rectal administration, intravenous administration, topical administration, intramuscular administration, subcutaneous administration An appropriate method such as administration or intraperitoneal administration may be selected and administered. (Screening method)
  • the present invention relates to a protein of the present invention, a transformed cell expressing the protein, a DNA of the present invention, a recombinant vector containing the DNA, a transformed cell transformed with the recombinant vector, or a transformant.
  • a transgenic non-human mammal recombinant with the DNA of the present invention is used, and the present invention relates to a method for screening a substance that regulates the function or expression of the protein of the present invention.
  • (1) a method for evaluating the binding ability to a ligand in the presence / absence of a test substance; (2) the present invention in the presence / absence of a test substance And a method of comparing the expression level of the protein or gene of the present invention and screening a substance that regulates the expression of the protein of the present invention.
  • the binding / uptake activity of denatured LDL in the system shown in Example 3 in the presence / absence of the test substance may be measured.
  • DNA containing the expression control region of the adse gene, the 5 'untranslated region, the region near the translation initiation site or a part of the translated region, and a reporter gene such as luciferase are linked.
  • An expression plasmid is prepared, and the expression level of the reporter gene is tested in an environment where the gene of the present invention is transcribed or translated.
  • a method of measuring in the presence / absence of a substance and confirming the transcription promoting activity or the transcription repressing activity of the test substance can be mentioned.
  • the screening method of the present invention comprises a protein of the present invention, a transformed cell expressing the protein, a DNA of the present invention, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant using the recombinant vector.
  • the substance having an activity of regulating the activity of the protein of the present invention may be any substance having an activity of enhancing (agonist) or inhibiting (antagonist) the activity of ADSE protein, but is preferably It is an antagonist.
  • the substance exhibiting a DNA expression regulating action of the present invention may be any substance having an action of promoting or suppressing the expression of the gene adse, but is preferably a substance having a function of suppressing the expression.
  • Whether the test substance has the activity of regulating the activity of the protein of the present invention or the activity of regulating the expression of the DNA of the present invention depends on whether a system capable of confirming the activity of the protein or the DNA is used. It is only necessary to examine whether there is a difference in the protein activity or DNA expression level between the case where the test substance is added and the case where the test substance is not added to the system in which expression can be confirmed.
  • the expression level of DNA may be detected by any of the expression intensity of the mRNA of the adse gene and the expression intensity of the protein.
  • the expression level of the reporter gene may be detected.
  • the reporter-assay system screens substances acting on the transcription control region using the expression level of a reporter gene arranged downstream of the transcription control region as an index.
  • the transcription control region include a promoter, an enhancer, a CAAT box, a TATA box, etc. which are usually found in one region of the promoter.
  • reporter genes the gene for AT (ch ⁇ oramphen lco ⁇ acety ⁇ transferase), lucif erase gene,
  • the expression control region and 5 ′ untranslated region of the gene of the present invention can be obtained by a known method (New Cell Engineering Experimental Protocol (Shujunsha), 1S93). Having an inhibitory (or suppressing) effect or having an enhancing (or promoting) effect means that the activity or activity of the protein The difference in the measured value of the expression level of DNA between the test substance-added group and the test substance-free group was observed.
  • the inhibition (or suppression) rate or enhancement (or promotion) rate calculated by the following formula is 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more, and more preferably It should be at least 70%, particularly preferably at least 90%.
  • Inhibition (or suppression) rate or enhancement (or promotion) rate Absolute value of (measured value in group without test substance – measured value in group with test substance added) Z-measured value without group * 100
  • the activity is inhibition or enhancement, and the measured value are appropriately determined depending on the type of the system in which the activity of the protein can be confirmed or the expression of the DNA can be confirmed.
  • the system capable of confirming the activity of the protein is the system for measuring the uptake activity of knitted LDL shown in Example 3, radioactivity can be used as the measured value, and the test substance can be used. If the measured value of the added group ⁇ the measured value of the group without the test substance, it can be said that the test substance has an ADSE protein activity inhibitory effect. If the measurement system includes background and noise values, it is needless to say that the value obtained by subtracting such values is used as the measured value.
  • the protein of the present invention is a scavenger receptor class A-like protein, it can be obtained by the screening method described above or a compound obtained through a search using a transgenic animal. Is expected to be an effective therapeutic or prophylactic agent for arteriosclerosis.
  • Test substances include proteins, peptides, oligonucleotides, synthetic compounds, naturally occurring compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. The substance is not limited to this, and may be a new substance or a known substance.
  • FIG. 1 shows a domain structure diagram of a scavenger receptor protein belonging to Class A. i, n, m, and M represent subtypes.
  • A is a cytoplasmic domain
  • B is a transmembrane domain
  • C is a spacer domain
  • D is ⁇ -helical force domain
  • ⁇ is collagen-like.
  • the domain F represents a C-terminal specific domain.
  • FIG. 2 shows the results of the alignment of ADSE with a known scavenger receptor.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence homology between the human force benger receptor class II subtype I and ADSE.
  • a for cytoplasmic domain B for transmembrane domain, C for spacer domain, D for ⁇ Recalcoiled coil domain, E represents a collagen-like domain, and F represents a C-terminal specific domain.
  • FIG. 4 shows expression files of the adse gene in human organs and various cells.
  • PHA refers to leukocytes derived from human peripheral blood cultured in the presence of PHA.
  • BAP Bacterial Alkaline Phosphatase
  • TiKaRa Bacterial Alkaline Phosphatase
  • the reaction mixture was extracted twice with this mixture, and the poly (A) + RNA was recovered as ethanol precipitate.
  • the recovered poly (A) + RNA was prepared in a buffer containing 50 mM sodium acetate (pH 5.5), ImM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol and 100 U RNasin.
  • TAP Tobacco acid pyrophosphatase
  • the recovered poly (A) + RNA2-4 / g was added to 0.4 / ig of 5 'oligomer (5'-AGC AUC GAG UCG GCC UUG UUG GCC UAC UGG-3 ') and ligated.
  • a reaction was performed. Reaction is of 50 mM Tris-HC1 This (P H7.5), MgCl 2 of 5 mM, 5 mM 2-Menore force flop preparative E data Roh one Honoré, the RNAsin of ATP, 25% of PEG8000 and 100U of 0.5m
  • the reaction was performed for 3-16 hours at 20 ° C. using 250 U] NA ligase (TaKaRa) in the buffer containing the solution.
  • c ie cDNA was synthesized by removing the O Li Goma unreacted, 2_4 ⁇ g Oh Li Gokya Ppupori (A) + RNA and lOpmol of dT adapter primer (5 '-GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CTT ⁇ TTT TTT TTT-3 ') and mix with Superscript II Rnase H ⁇ Reverse Transcriptase (GibcoBRL) was reacted for 1 hour at 42 ° C in a buffer solution to be added.
  • Plasmids were prepared from the cDNA library prepared by the method (1) using a PI-100 port bot (KURAB0), the nucleotide sequence of each clone was confirmed, and a database was prepared. Sequencing, AutoCycle sequencing kit (Amersham Pharmacia) and R.0. B. DNA processor (Amersham Pharmacia ) to use Rere accompanying to prodrugs co 1 Honoré (this hence rows Sequence reaction Rere, ALF DNA sequencer (Amersham Pharmacia).
  • the clone C-ADSE02045 obtained by the method described in (1) encodes a novel protein consisting of 495 amino acids represented by SEQ ID NO: 2, encoding 1485 represented by SEQ ID NO: 1. It contained a cDNA consisting of a base sequence of a total length of 3644 base pairs (SEQ ID NO: 3), including an open reading frame (0RF) consisting of a base sequence of bases.
  • This plasmid C-ADSE02045 is a patented biological depository center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), an international microbial depository organization. Deposit No. FERM BP-7867 on February 1, 2001.
  • HMMER R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh, G. Mitchison., Cambridge University Press., (1998)
  • Pfam http: //www.Sanger, ac.uk/Pfam/; ELL Sonnhammer, SR Eddy, and R. Durbin., Proteins., 28, pp. 405-420 (1997))
  • ADSE secondary structure of ADSE was analyzed using computer software such as PR0SITE, C0IL, TMpred, and PS0RT.
  • PR0SITE computer software
  • C0IL C0IL
  • TMpred TMpred
  • PS0RT computer software
  • cytoplasmic domain (From the N-terminal side) cytoplasmic domain, transmembrane domain, spacer domain, ⁇ -helical calcoiled-coin domain domain), a collagen-like domain, and a C-terminal specific domain were all found.
  • FIG. 3 shows a comparison of the domain structure of ADSE and the domain structure of human-derived SR class A subtype I, which are the results of the above search.
  • ADSE also has many phosphorylation sites and sugar chain binding sites, as well as heme binding sites and C-terminal targeting signals for microbodies (peroxisome). Was confirmed. This result suggests that ADSE is a post-translationally modified tank.
  • Example 2 Expression in mammalian cells
  • C-ADSE02045 plasmid was introduced into C0S-1 Itoda parcel by the following method to express the protein.
  • FuGE EG (Roche 'die Aguno Stick, Inc.) 50/2 1 were mixed in accordance with the attached pro-door call the above plus Mi-de-DNA 12. 5 ⁇ g, 150cm 2 off La scan co-to cell Son Nburue was added to the C0S-1 cells that had grown in the cells. After culturing under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. for 72 hours, the ADSE protein-expressing cells were recovered and subjected to the activity measurement assay described in Example 3.
  • Oxidized LDL or acetylated LDL was added to the ADSE protein-expressing cells prepared in Example 2, and the cells were incubated for a certain period of time.
  • [ 14C ] -labeled oleic acid was added to ADSE protein-expressing cells together with oxidized LDL or acetylated LDL, and the cells were incubated for a certain period of time.
  • the plasmid obtained by linking the genomic DNA and an appropriate selectable marker gene was linearized to obtain a targeting vector.
  • the medium was changed to a selective medium (the medium was changed every 2 days thereafter, and the cells were cultured.
  • a selective medium the medium was changed every 2 days thereafter, and the cells were cultured.
  • the targeting vector Hundreds of neomycin-resistant ES cell clones were obtained under a microscope using microcrops. By separately culturing each of them on a 24-well plate covered with E. coli, the repliability of neomycin-resistant ES cells was obtained.
  • each of the ES cell clones in which the endogenous gene encoding the mouse ADSE obtained above was inactivated (knocked down) by homologous recombination was replaced with C57BL6 mouse (Charles River Japan). Inject 15 mice per blastocyst into the blastocysts obtained by mating male and female (microclonal injection). Immediately after the injection, transfer about 10 blastocysts per side of the uterus to the offspring of the foster parent ICR mouse (B-Clear) 2.5 days after pseudopregnancy treatment. Thus, each ES cell Get Knockout Kim Ramaus for Clone. Then, each of the obtained chimaeras is crossed with a normal C57BL6 mouse to obtain an agouti-colored mouse derived from a hair color gene derived from an ES cell.
  • HCAEC coronary artery endothelial cells
  • human placental tissues by a standard method.
  • human peripheral blood-derived leukocytes were cultured in the presence of 50 ⁇ g / ml of PHA for 24 hours, and then total RNA was prepared by an ordinary method.
  • the ADSE of the present invention is a protein that can cause the onset or progression of arteriosclerosis, and is extremely useful in the development of drugs for preventing or treating these diseases. .
  • SR acts protectively against various stresses generated in cells, pathological symptoms and diseases caused by stress, foreign substances, or denatured proteins generated in cells are also considered. It is expected to be useful for the development of medicines for
  • the gene adse can be used as an antisense drug and in gene therapy
  • the protein ADSE can be itself or a soluble fragment thereof (extracellular region or each domain). It is useful as a soluble protein drug by producing a protein.
  • an antibody reactive with ADSE or a fragment thereof and a part of the antibody are useful as an antibody drug for controlling ADSE function in a living body.

Description

明
新規スカベンジャー受容体ク ラ ス A蛋白質
発明の属する技術分野
本発明は、 新規スカベンジャー受容体ク ラス A サブタイ プ及 びその断片、 該タ ンパク をコー細ドする D N A及びその断片、 該 D N Aを含む発現ベク ター、 該発現べク タ一で形質転換された 形質転換細胞、 該タ ンパク若 し く はそ の断片に反応性を有する 抗体に関する。
従来の技術
高脂血症に伴って見られる動脈硬化症の特徴と して、 コ レス テロールエステルを多量に蓄積 した泡沫マク 口 ファージの粥状 硬化巣への集簇が挙げられる。 こ の よ う な泡沫細胞の起源は、 末梢血中の単球由来のマク 口 フ ァージおよび血管平滑筋細胞で あるが、 その初期病変においてはほと んどがマク ロ ファ ージで ある。 粥状動脈硬化は、 血管内皮細胞の障害に始ま る と いわれ る。 これには多く の因子が関与する が、 中でも LDL とその変性 は重要である。 血中の LDL は、 内皮下に侵入し、 種々 の修飾を 受けて変性 LD L と なる。 一方、 変性 LDL の影響をは じめ とする 原因によって障害された内皮細胞には接着因子が発現して、 末 梢血中の単球がこれを介 して接着 し内皮下に侵入する。 侵入し た単球はマク 口 フ ァ ージに分化 して内皮下に蓄積 した変性 LDL を貪食 して泡沫細胞 と な り 、 粥状動脈硬化の初期病変を形成す る。 病変が さ らに進行する と 、 過剰にコ レステ ロ ールエステル を蓄積 した泡沫細胞は破綻 して、 心血管ィ ベン ト の原因 と なる リ ピッ ドコアを形成する。 ス カベ ンジャ ー受容体 （ SR) は、 泡 沫化の原因 と なる変性 LDL と結合しあるいはこれを取り 込む受 容体蛋白質である。
これまでに、ゥシ（ Kodama, et al.， Nature, Vol. 343, 531-535, 1990) ゃヒ ト （Matsumoto, et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, 9133-9137, 1990) を含む多種の生体力 ら多く の SRの cDNAがク ロ一ニングされた結果、 SRは主にク ラス Aと ク ラ ス B に分け られ、 さ らに各ク ラスには幾つかのサブタイ プ蛋白質が 存在する こ と が明 ら力 と なってきた。
マ ク 口 フ ァ ージス 力ベンジャ ー受容体 ( MSR) は ク ラス Aに分 類され、 さ らにこ のク ラス Aには I 、 I I 、 I I I 、および MARCO と い う 4つのサブタイ プが報告されている。 これ らサブタイ プ は、 inside- out型の三量体膜型糖蛋白質であ り 、 特にサブタイ プ I ~ I I I はと も に 6 個の ドメ イ ン （ N末端側力、 ら、 細胞質 ドメ イ ン、 膜貫通 ドメ イ ン、 スぺーサー ドメ イ ン、 α ヘ リ カル コイ ル ドコイル ドメ イ ン、 コ ラーゲン様 ドメ イ ン、 及ぴ C末端 特異 ドメ イ ン） で構成される と い う 特徴を有している （第 1 図 を参照されたい） 。
細胞質 ドメ イ ンの特徴は、 LD L 受容体やイ ンス リ ン受容体に 見 られる ΝΡ ΧΥ 配列並びに ト ラ ンス フエ リ ン受容体に見られる YXR F配列と 同様のェ ン ドサイ トーシスシグナルに見られる特徴 的なタイ ト ター ン構造を有している点にあ る。 事実これ ら の配 列を欠失させる と 、 エ ン ドサイ トーシス が抑制 される と言われ ている。
α ヘ リ カルコ ィ ル ドコ イ ル ドメ イ ンの特徴は、 蛋 白一次構造 と して のス カベンジャー受容体ポ リ べプチ ドの 3 本を会合 させ て活性受容体を形成させている点にある。 こ の ドメ イ ンは、 7 ア ミ ノ 酸毎に 2 回転する右巻のヘプテ ッ ド リ ピー ト 、 即ち、 へ リ カルコィル ドコイル構造を取 り 、 3 本のポ リ ペプチ ドは 7 ァ ミ ノ 酸毎に存在する ロイ シンゃィ ソ ロイ シンな どの疎水性ァ ミ ノ 酸を内側に向け、極性ア ミ ノ酸や糖鎖結合部位を外側に して、 3 量体を形成 している。 また、 変性 LD L な どの リ ガン ドを結合 して細胞内に入 り 、 ェン ドゾーム内での p Hの低下に依存して 受容体の高次構造を変化させて リ ガン ドを解離させる役割を有 する。 特にこ の ドメ イ ンに続く コ ラーゲン様 ドメ イ ン側に存在 する ヒ スチジンが、 細胞内での リ ガン ドの解離において機能 し ている こ と が実験的に証明 されている。 さ らに、 こ のコイル ド コイル ドメ イ ンの ヒ スチジンを中心 とする 1 5 ア ミ ノ酸領域を 認識する抗体がマ ク 口 フ ァージのカルシゥム非依存性の細胞接 着を阻害する こ と から、 こ の MSR が細胞接着分子と しての機能 も有している こ と が示唆されている。
コ ラーゲン様 ドメ イ ンの特徴は、 コ ラーゲンに特有なダリ シ ン （Gly)-X- Y の繰返 し構造を有している点にある。 その C末端 側には、 負に架電 した リ ガン ドの結合に適 した正に架電 したァ ミ ノ酸が多く 集ま っている。 こ の C末端側 22個のア ミ ノ 酸を欠 失 した変異体は リ ガ ン ド結合性を失 う こ と が確認されている こ と から、 コ ラーゲン様 ドメ イ ンは MRS の リ ガン ド結合部位であ る と推察されている。
C末端特異 ドメ イ ンの特徴は、 システィ ンに富み、 また捕体 因子 1 ( complement factor 1) 、 CD 5 及び CD 6 な どと高 、木目 同性を有している点にある。 同 じ型のサブタイ プ、 例えば I 型 サプタイ プでは、 6 つのシスティ ン残基のア ミ ノ 酸配列上の間 隔が由来動物種を超えて完全に保存されている と い う特徴を有 する一方で、 I I 型あるいは I I I 型サブタイ プではこの ドメ ィ ンの全部あるいは一部を失っている など、 ドメ イ ン構造全体 での多様性は高い。
以上のよ う な構造的特長を有する MSR は、 過剰の変性 LDL を 取込み、 マ ク ロ フ ァ ージを泡沫細胞化させる。 こ の MSR によ る 変性 LDL の取り 込み とそれによ るマク 口 フ ァ ージの泡沫化が、 粥状動脈硬化症の発症に重要な役割を果たすこ と が指摘されて いる。 事実、 こ の MSR と アポ E を遺伝子操作で不活性化 したダ プノレノ ッ ク ァ ゥ ト マ ウス では、 アポ E 単独の ノ ッ ク ァ ゥ ト マ ウ ス に比べ、 動脈硬化病巣が縮小 している こ と が確認されてお り 、 動脈硬化の発症に MSR が深 く 関与 している こ と が実証されてい る。 さ らに、 こ の MSR が、 細菌感染防御や糖尿病性の血管障害 惹起の原因 で あ る 糖ィ匕産物 （ AGE、 Advanced Glycation End Product) の取込みにも関与している こ とが明 らかに されている ( Nature, Vol.386, 292-296, 1997) 。 '
しかし、 SR ク ラス Aの各サブタイ プ蛋白質の役割は依然明確 ではな く 、またこれまでに報告 されているサブタイ プ以外にも SRが存在するか、 またその機能的役割は、 などについては未知 のままである。
発明が解決 しよ う とする課題
本発明は、 既知の MSR と は異なる、 新たな動脈硬化症関連蛋 白質と その遺伝子を同定する こ と によ り 、 動脈硬化性疾患の予 防並びに治療に有用な医薬及ぴ方法を提供する ものである。 課題を解決するための手段
本発明は、 新規な遺伝子 （adse とする） 、 当該遺伝子にコー ドされる SR様蛋白質、 特にク ラ ス Aに属する と推測 される新規 サプタイ プ ADSE ( ADSE とする） に関する。 また、 当該遺伝子を 用いて形質転換 した宿主細胞、 該形質転換細胞を用いた組換 ADSE の生産方法を提供する。
(核酸）
本発明は、 ADSE (後に詳 しく 述べる） を コー ドする遺伝子 adse を提供する。 遺伝子 adse と は具体的には、 配列番号 2 に示すァ ミ ノ 酸配列か らなる スカベンジャー受容体様蛋白質をコー ドす る DNAのこ と であ り 、 配列番号 1 や配列番号 3 に示す cDNA のほ か該 cDNAの由来するゲノ ム DNA も含まれる。 該遺伝子はヒ ト脂 肪組織から単離同定する こ と ができ るが、 本明細書に開示 され た配列を基に、 一般的なハイ プ リ ダイゼーショ ン等の遺伝子ェ 学的手法を用いたク ローニングやホスホア ミ ダイ ト法な どの化 学合成的手法によ り 調製される DNA であっても よい。 その形態 と しては cDNA、 ゲノ ム DNAの他、 ィ匕学合成 DNAな どが含まれる が、 特に制限はない。 本発明の DNA は 1 本鎖であっても、 それ に相捕的な配列を有する DNAや RNA と結合 して 2 重鎖、 3 重鎖 を形成していても良い。 また、 当該 DNA は、 ホース ラデイ ツシ ュペルォキシダーゼ （HRP0) 等の酵素や放射性同位体、 蛍光物 質、 化学発光物質等で標識されていても よい。
また、 ads e の塩基配列が提供されれば、 これよ り 導かれる RNA の配列や、 相捕的な DNA および RNA の配列な どは一義的に決定 されるので、 本発明は、 本発明の DNA に対応する RNA あるいは 本発明の DNA と相捕的な配列を有する DNA および RNA もまた提 供する も の と理解すべき である。 本明細書中において、 「DNAJ は「ポ リ ヌ ク レオチ ド jと 同義である。
さ らに、 本発明の DNA には、 配列番号 1 に記載の塩基配列か ら なる DNA と ス ト リ ンジヱ ン ト な条件でハイ ブ リ ダィ ズする DNA をも含むものである。
配列番号 1 に記載の塩基配列からなる DNA に対 しては、これ と ス ト リ ンジヱン ト な条件でハイ ブリ ダイ ズし、 かつ該 DNA に コー ド される蛋白質がス カベンジャ ー受容体様蛋白質であれば. 塩基配列のバ リ エーシ ョ ンが許容される。 例えば、 いわゆる コ ドン縮重によ る同一アミ ノ 酸残基を コー ドする複数のコ ド ンの 存在や、 種々 の人為的処理例えば部位特異的変異導入、 変異剤 処理に よ る ラ ンダム変異、 制限酵素切断によ る DNA 断片の変 異 · 欠失 · 連結等によ り 、 部分的に DNA 配列が変化 したも ので あっても、 これら DNA変異体が配列番号 1 に記載の DNA と ス ト リ ンジェ ン ト な条件下でハイ プ リ ダイ ズ し、 かつス 力べンジャ 一受容体様蛋白質をコー ドする DNA であれば、 配列番号 1 に示 した DNA 配列と の相違に関わらず、 本発明の範囲内のも のであ る。
上記の DNA変異の程度は、配列番号 1 に記載の DNA配列と 70 % 以上、 好ま し く は 80%以上、 更に好ま し く は 90%以上の同一性 を有する ものであれば許容範囲内である。 DNA 配列の同一性の 判 断 に は 、 BLAST(J. Mol. Evol. , Vol.36；290-300(1993) 、 J. Mol. Biol. , Vol.215;403_10(1990))を用いる こ と 力 Sでき る。 ま た、 ハイ ブ リ ダィ ズする程度 と しては、 ス ト リ ンジェン ト な条 件下、 例えば DIG DNA Labeling kit (ロ シュ · ダイ ァグノ ステ ィ ッ ク ス社製 Cat No. 1175033) でプロープをラベルした場合に、 例えば 32。C、好ま レ く は 37°C、 よ り 好ま し く は 42。Cの DIG Easy Hyb 溶液 （ロシュ · ダイ ァ グ ノ ステ ィ ッ ク ス Cat No. 1603558) 中でハイ プ リ ダイ ズさせ、 例えば 50°C、 好ま し く は 65°Cの 0. 5 XSSC溶液 （0. 1% /v) SDS を含む） 中でメ ンプ レンを洗浄す る条件 （ 1 XSSC は 0. 15M NaCl、 0.015M ク ェ ン酸ナ ト リ ウムで ある） でのサザンハイプ リ ダイゼーシ ヨ ンで、 配列番号 1 に記 載の核酸にハイ プ リ ダイ ズする程度であればよい。
配列番号 1 に記載の塩基配列からなる DNA あるいはその部分 断片は、 動脈硬化症等本発明の蛋白質が関与する疾患の特異的 プローブと して有用である と考えられる。
本発明の DNA は、 ADSE を大量に生産するために使用する こ と ができ る。 該 DNA はまた、 酵素等で標識して、 組織における本 発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用する こ と ができ る。 すなわち、 該 DNA をプローブと して使用 し、 細胞における 本発明の蛋白質の発現量を、 itiRNA発現量を指標 と して確認する こ と によ り 、 本発明の蛋白質の製造に適 した細胞やその培養条 件を決定する こ と ができ る ほか、 本発明の蛋白質が関連する疾 患、 特に動脈硬化症の診断を行 う こ と も可能である。 ま た、 本発明 の DNA の一部を プラ イ マー と して使用 した PCR-RFLP ( Restriction fragment length polymorphism) 法、 PCR-SSCP ( Single strand conformation polymorphism) 法、 シ 一ク ェンシ ング等の方法によ り 、 核酸配列上の異常ある いは多 形を検査 · 診断する こ と ができ る。
また、 本発明の D N Aを生体内の細胞に導入 し、 該細胞に変 性 L D L取 り 込み活性を賦与する こ と によ り 血中の変性 L D L 濃度を低下させる こ と を 目 的と した、 動脈硬化症等の発症を予 防するための遺伝子治療にも使用する こ と が出来る。
本発明の DNA は、 形質転換細胞の調製、 さ らには該形質転換 細胞を用いた組換蛋白質 ADSE の生産方法、 あるいは ADSE の発 現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用 し て調製する こ と が可能であ り 、 例えば、 市販されあ るいは当業 者が一般に入手容易な様々 なべク ターを利用 して、 適当 な宿主 細胞へ本発明の DNA を組み入れる こ と が可能である。 その際、 遺伝子 adse をプロモータ 一ゃェンハンサ一に代表される発現 制御遺伝子の影響下におく こ と で、 遺伝子 adse の宿主細胞内で の発現を任意にコ ン ト ロ 一ルする こ と が可能である。 こ の手法 は、 形質転換された宿主細胞を用いた ADSE の生産において好適 に用い られる他、 遺伝子 adse の発現制御機構の研究あるいは該 遺伝子の発現を調節 し得る物質の探索な どにも応用する こ と が 可能と なる。
例えば、 任意の被験物質と遺伝子 adse を含むベタ ターで形質 転換された細胞と を適当 な条件下で接触させる こ と で、 被験物 質の遺伝子 adse の発現を促進あるいは抑制する作用を有する 物質を探索 し、 あるいは評価を行 う こ と ができ る。
また、 本発明である DNA と公知の方法と を組み合わせて、 マ ウスまたはその他の適当な動物を基に ト ラ ンスジエ ニッ ク動物 を調製する こ と が出来る。 かかる ト ラ ンス ジエ ニ ッ ク動物は、. これに高コ レステロ ール食を摂取させる こ と で、 該動物に動脈 硬化症に特徴的な粥状効果病変を誘発 させる こ と が可能と なる こ と から、 動脈硬化症モデル動物と して大変有用であ り 、 ADSE に起因する動脈硬化症に対して有効な薬物の開発の大幅な促進 が期待される。
さ らに、 本発明の遺伝子 adse を利用すれば、 ヒ ト 以外の動物 から ヒ ト adse に相当する遺伝子を破壊したいわゆる ノ ッ クァ ゥ ト動物を作製する こ と も可能である。 このモデル動物の物理学 的、 生物学的、 病理学的及び遺伝子的特徴を分析する こ と によ り 、 本発明に係る遺伝子及び蛋白質の機能を解明する こ と が可 能と なる。 さ らに、 その よ う に して内在性遺伝子が破壊 された 該動物に本発明の ヒ ト ads e を導入する こ と によ り 、 ヒ ト adse のみを有するモデル動物を作製する こ と も可能と なる。 こ のモ デル動物は、 該導入された ヒ ト adse をターゲッ ト と した薬剤の 開発、 評価に有用である。
(蛋白質 ADSE)
adse にコー ドされる蛋白質 ADSE は、 配列番号 2 に示すア ミ ノ 酸配列か らなるス カベンジャー受容体様蛋白質である。 特に そのア ミ ノ 酸配列に見られる構造的特長から、 ク ラ ス A に属す る新規のサブタイ プ蛋白質である と決定される。
ADSEは、 ク ラ ス A に分類される 'サブタイ プ蛋白質、 特に I 型 のサブタイ プに存在する特徴的な構造 ドメ イ ン、 N末端側から 細胞質 ドメ イ ン （ 1 〜 5 9 a. a. ) 、 膜貫通 ドメ イ ン （ 6 0 〜 9 l a. a. ) 、 スぺーサー ドメ イ ン （ 9 2 〜 1 2 6 a. a. ) 、 αヘ リ 力 ノレ コ ィ ル ド コ ィ ノレ ド メ ィ ン ( α - helicalcoiled - coil domain) ( 1 2 7 〜 3 0 5 a. a. ) 、 コ ラーゲン様 ドメ イ ン （ 3 0 6 〜 3 8 4 a. a. ) 、 及び C末端特異 ドメ イ ン （ 3 8 5 〜 4 9 5 a. a. ) の 6 種を全て有している。 従って、 他の SR ク ラス Aサ プク ラス蛋白質と 同様、 ADSE は inside-out 型の三量体膜型糖 蛋白質である と認め られる。 また、 他の SR ク ラス Aに分類され るサブタイ プ蛋白質同様、 リ ガン ドと して変性 L D L ； 例えば ァセチル化 L D L、 マロ ンジアルデヒ ドィ匕 L D L、 酸化 L D L、 ァセ ト ァセチル化 L D L、 マ レイルイ匕 L D L、 サク シ二ル化 L D L等；や、マ レイ ノレイ匕ァノレブミ ン 、 A G E ( advanced glycation end pr oduc t 、 L P S ( lypopolysaccharidej 等に結合する と 考え られる。 本発明のスカベンジャー受容体様蛋白質は、 上述 の様な リ ガ ン ドに結合する活性を有する受容体蛋白質と して理 解される。 更に好ま しく は、 変性 L D L等の リ ガン ドに結合し、 細胞への取 り 込み活性を有する蛋白質である。
こ の様に、 ADSE は ドメ イ ン構造レべノレ においてはス力べ ンジ ヤ ー受容体ク ラス A に認め られる特徴を高度に保持 している一 方、 そのア ミ ノ酸配列レベルでの相同性は、 最も相同性の高い サブタイ プ I (ヒ ト SRA I ) と の全体比較で約 42.6%であ り 、 かつ各 ドメ ィ ン構造相互で比較 しても、 最も相同性の高いシス ティ ン リ ツチ ドメ イ ンで約 70%に留ま る。 こ のこ と力 ら、 ADSE は、 粥状動脈硬化症の発症あるいは進行において、 他のサプク ラスにはない特徴的な役割を果た している こ と が強く 推認され る。 従って、 ADSE を標的と した医薬化合物は、 従来にはない特 徴を備えた医薬と な り 得る も の と期待される。
なお、 スカベンジャー受容体様蛋白質である限 り 、 配列番号 2 に示す蛋白質のア ミ ノ 酸配列において、 1 以上のアミ ノ酸が 置換、 欠失、 および/若 し く は付加 したア ミ ノ 酸配列か らなる ポ リ ぺプチ ドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
蛋白質の構成要素と なるア ミ ノ酸残基側鎖は、 疎水性、 電荷、 大き さ などにお .いてそれぞれ異なるが、 実質的に蛋白質全体の 3 次元構造 （立体構造と も言 う ） に影響を与えない とい う 意味 で保存性の高い幾つかの関係が知 られてい る。 例えば、 ァ ミ ノ 酸残基の置換については、 グリ シン （Gly) と プロ リ ン （Pro) 、 Gly と ァラニ ン （Ala) またはバ リ ン ( Val) 、 ロ イ シン （ Leu) と ィ ソ ロ イ シン ( He) 、 グルタ ミ ン酸 （ Glu) と グルタ ミ ン （ Gin) . ァスパラ ギン酸 （Asp) と ァスパラギ ン （ Asn) 、 システィ ン （ Cys) と ス レオニ ン （Thr) 、 Thr と セ リ ン （Ser) ま たは Ala、 リ ジン ( Lys) と ア ルギニ ン （ Arg) 、 等が挙げ られる 。 また、 Ala Val、 Leu, Ile、 Pro、 メ チォユ ン （ Met) 、 フ エ ニルァ ラ - ン （ Phe) 、 ト リ プ ト フ ァ ン （ Trp) 、 Gly, Cys は、 共に非極 性ア ミ ノ酸に分類されるため、 互いに似た性質を有する と考え られる。非荷電極性ア ミ ノ酸と しては、 Ser、 Thr、チロ シン （Tyr) 、 Asn、 Ginが挙げられる。 酸性ア ミ ノ 酸と しては、 Aspおよび Glu が挙げられる。 塩基性ア ミ ノ酸と しては Lys、 Arg、 ヒ スチジン
(His) が挙げられる。 上述の意味の保存性を損な う 場合でも、 なおその蛋白質の本質的な機能、 本発明においてはスカベンジ ヤ ー受容体様蛋白質と して の機能、 を失わない変異も当業者に 多く 知 られている。 さ ら に、 異なる生物種間に保存される同種 の蛋白質が、 幾つかのア ミ ノ酸が集中ある いは分散 して欠失あ るいは挿入されていても なお本質的な機能を保持 している例も 多く 認め られている。
従っ て、 配列番号 2 に示 したア ミ ノ 酸配列上の置換、 揷入、 欠失等によ る変異蛋白質であっても、 それがス カベ ンジ ャー受 容体様蛋白質であれば、 これらは本発明の範囲内にある もの と 言 う こ と ができ る。
こ の よ う なア ミ ノ酸の改変は、 遺伝子多型等によ って生ずる 変異の様に自然界において認め られる他、 当業者に公知の方法、 例えば NTG な どの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々 の 組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用 して、 人為的 に行 う こ と ができ る。 ア ミ ノ酸の変異部位および個数は、 変異 蛋白質がス カベンジ ャー受容体様蛋白質である限 り 特に制限は ないが、 変異個数は通常数十ア ミ ノ 酸以内、 好ま し く は 1 0 ァ ミ ノ 酸以内、 よ り 好ま し く は 1 も し く は数個以内である。
また本発明では、 A D S E を上述のよ う な全ての ドメ イ ン構造を 有する受容体全体と して理解でき る ほか、 特徴的な ドメ イ ン、 特に リ ガン ド と の結合能を担 う ドメ イ ンを保持 した部分べプチ ドと して理解する こ と もでき る。 受容体蛋白質の中 には、 リ ガ ン ド結合部位を含む部分断片が、 特徴的な立体構造を保持 した まま他の ドメ イ ン力 ら切 り 離されるな ど して、 遊離の （あるい は可溶化と も言われる） 部分べプチ ド と して存在 し得る ものが ある こ とが、 以前よ り 報告されている。 こ の様な部分ペプチ ド は、 依然と して特異的な リ ガン ドと の結合能を保持 している こ と から、 これを用いて該受容体への結合能を有する化合物の探 索が可能と なる。 A D S E における部分ペプチ ドも、 かかる意味に おいてその リ ガン ド結合能を有する限 り 、 実質的には本発明 と 同等の物質である と理解すべきである。 特に、 A D S E では、 a へ リ カルコイル ドコイル ドメ ィ ンを含む C 末端側の部分ぺプチ ド においてかかる リ ガン ド結合機能が保持される もの と推定され る。 部分ペプチ ドの好ま しい態様と しては、 例えばスぺーサー ドメ イ ン （ 92〜 126a. a. ) 、 α ヘ リ カルコ ィ ル ド コ イ ル ドメ イ ン ~h e 11 c a 1 c 011 e d~ c o 11 domain; 127~ ci05a. a. ) 、 コ フ 1 ~~ ゲン様 ドメ イ ン （ 306~ 384a. a. ) 、 または C 末端特異 ドメ イ ン
( 385- 495a. a. ) のいずれかを含むペプチ ドが挙げられる。 リ ガン ド結合能を有する と い う 観点では、 少なく と も コラーゲン 様 ドメ イ ン （ 306〜 384a. a. ) を含むこ と が好ま しい。 少な く と も コ ラーゲン様 ドメ イ ン （ 306〜 384a. a. ) を含む限 り 、 他の ド メ イ ンの全部または一部が連結 していても 良い し、 他の蛋白質 ゃぺプチ ドと の融合蛋白質でも 良い。
本発明の蛋白質またはその部分べプチ ドは、 該蛋白質の活性 を調節する物質の探索に使用する こ と が出来る。 探索を通 じて 得られる化合物等は、 本発明の蛋白質が関連する疾患、 例えば 動脈硬化症等に対する有効な治療薬または予防薬と なる こ と が 期待される。
(抗体）
本発明はさ らに ADSE に結合する抗体を提供する。 本発明の抗 体は、 ADSE全体あるいはその部分べプチ ドを抗原と して特異的 に認識する抗体であ り 、 モ ノ ク ロ ーナル抗体及び Zまたはポ リ ク ローナル抗体が含まれる。 また、 免疫グロ プ リ ンの構造、 物 理化学的性質や免疫学的性質と し て分類 される 5 つ のク ラ ス
( IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) 、 あるいは H鎖のタイ プによ るサ プク ラ スのいずれに属する も のであっても よい。 さ らに、 免疫 グロプ リ ンを例えばペプシンで分解 したと き の F (ab' ) 2、パパイ ンで分解した と きの Fab などのフラ グメ ン トであっても、 また キメ ラ抗体ゃヒ ト化抗体であっても よい。 また ADSE あるいはそ の部分べプチ ドを特異的に認識する のみでなく 、 ADSEの活性を 調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。 ADSE の活性を 調節する機能を有する抗体と は、 例えば ADSE と リ ガン ドの結合 を阻害する 中和抗体が挙げられる。 これ ら の抗体は、 C -ADSE の研究的あるいは臨床的な検出等に有用である。
(ア ンチセ ンス核酸）
本発明は、 生体内において核酸レベルでの ADSE生合成を抑制 する こ と のでき る、 いわゆるアンチセ ンス核酸を提供する。 か かるアンチセ ンス核酸は、 ADSE をコー ドする m RNA を作り 出す のに必要なゲノ ム領域力 ら pre- mRNA への転写段階、 pre-mRNA から成熟 mRNA へのプロ セ ッ シング段階、 核膜通過段階、 蛋白へ の翻訳段階のいずれかで、 遺伝子情報を担 う DNA も しく は RNA に結合 し、 遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質 の発現を調節する ものを意味し、 遗伝子 a d s e の核酸配列の全体 あ るいはいずれかの部分に相捕する配列か らなる も のであって も よい。 好ま し く は、 配列番号 1 または配列番号 3 に記載の核 酸配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸 （ DNA、 RNA を 含む） である。 また、 ゲノ ム領域か ら転写される m RNA がイ ン ト ロ ン構造あるいは 5 ' 末端や 3 ' 末端に非翻訳領域を含む形 である と き は、 かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補す る ア ンチセ ンス核酸も本発明のア ンチセ ンス核酸と 同等の機能 を有する も の と なろ う。
本発明のア ンチセ ンス核酸は、 DNA や RNA の他、 その立体構 造や機能が DNA あるいは RNA と類似する各種誘導体のすべてを 含むものである。 例えば、 3 ' 末端も しく は 5 ' 末端に他の物 質が結合した核酸、 オリ ゴヌ ク レオチ ドの塩基、 糖、 リ ン酸の 少な く と もいずれか 1 つにおいて置換や修飾が生 じた核酸、 天 然には存在しないよ う な塩基、 糖あるいは リ ン酸を有する核酸、 糖一 リ ン酸骨格以外の骨格 （バッ ク ボーン） を有する核酸等が 挙げられる。 これらの核酸は、 ヌ ク レアーゼ耐性、 組織選択性、 細胞透過性、 結合力の少な く と も 1 つが高め られた誘導体と し て好適である。 すなわち、 A D S E の活性発現を抑制 し得る機能を 有する限り 、 核酸の形態に制限はない。
また本発明では、 一般的には、 ス テ ム · ループを形成 してい る mRNA のループ部分にハイ プ リ ダイ ズする よ う な塩基配列、 す なわちステム · ループを形成している領域の塩基配列に相補的 な塩基配列をもつア ンチセ ンス核酸が好適である。 ある いは、 翻訳開始コ ド ン付近、 リ ボ ソ ー ム結合部位、 キ ヤ ッ ビ ン グ部位、 ス プラ イ ス部位に結合する よ う なア ンチセ ンス核酸、 すなわち こ れ ら の部位の配列に相補的な配列を有するア ンチセ ン ス核酸 も、 一般に高い発現抑制効果が期待でき る点で好ま しい。
こ の様なアンチセ ンス核酸を細胞内に取 り 込ませ、 効率的に 作用 させるためには、 本発明のアンチセ ンス核酸の鎖長は 1 5塩 基以上 3 0塩基以下、 好ま し く は 1 5塩基以上 2 5塩基以下、 よ り 好ま し く は 1 8塩基以上 2 2 塩基以下の塩基数からなる塩基配列 力 らなる も のが好適である。
本発明のアンチセ ンス核酸の発現抑制効果は、 公知の手法、 例えば本発明の遺伝子の発現制御領域、 5 ' 非翻訳領域、 翻訳 開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含む D NA とルシフ エラーゼ等のレポーター遺伝子を連結 した発現プラ ス ミ ドを作 製し、 in vitro transcription反応 (プ口 メ ガ社： Ribo max system 等 ） と in vitro translation 反 j¾ ( プ ロ メ ガ社 ： Rabbit Reticulocyte Lysate System等） を併用する系のよ う な本発明 の遺伝子が転写または翻訳される環境下で被験物質を系に添加 し、 該レポーター遺伝子の発現量を測定する こ と に よ り 評価す る こ と ができ る。
本発明のアンチセ ンス核酸は、 生体内における adse の発現を 抑制するこ と ができ るので、 ADSEが関連する疾患の予防 · 治療 剤と して有用である。
発明の実施の最良の形態
(核酸）
本発明の DNA を DNA ライ ブラ リ 一力 ら得る例 と しては、 適当 なゲノ ム DNA ライ ブラ リ 一や cDNA ライ プラ リ ーを、 ハイ ブリ ダ ィゼーショ ンによ る ス ク リ ーユング法や、 抗体を用いたィ ム ノ ス ク リ ー-ング法等でス ク リ ーユング し、 目 的の DNA を有する ク ロー ンを増殖させ、 そ こか ら制限酵素等を用いて切り 出す方 法がある。 ノヽィ プリ ダイゼーショ ン法によ るス ク リ ーユングは、 配列番号 1 に記載の塩基配列も しく はその一部を有する DNA を 32 P等でラベルしてプローブと し、 任意の cDNA ライ プラ リ ーに 対 し て 、 公 知 の 方 法 で （ 例 え ば 、 Maniatis T. 等 , Mole cu larCloning, a Laboratory Manual, Cold S ring harbor Laboratory, New York, 1982年） 行 う こ と カ でき る。 ィ ム ノ ス ク リ ーニ ング法で用いる抗体は、 後述する本発明の抗体を使用 する こ と ができ る。 本発明の新規 DNA はまた、 ゲノ ム DNA ライ プ ラ リ ー も し く は cDNA ラ イ プ ラ リ ー を 铸 型 と す る PCR (Polymerase Chain Reaction)によ つて も得る事力 Sでき る。 PCR は、 配列番号 1 に記載の塩基配列をも と に、 セ ンス プライ マ ー 、 アンチセ ンスプライ マ ーを作成 し、 任意の DNA ライ プラ リ 一に対し、公知の方法（例えば Michael A. I.等， PCR Protocols, a Guide to Methods an Applications, Academic Press、 1990 年参照） 等を行って、 本発明の DNA を得る事もでき る。 上記各 種方法で使用する DNA ライ プラ リ ーは、 本発明の DNA を有する DNA ライ プラ リ ーを選択して使用する。 当該 DNA ライ プラ リ ー は、 本発明の DNA を有する ライ プラ リ ーであれば、 いかなる も のも使用可能であ り 、 市販の DNA ライ ブラ リ ーを使用 した り 、 本発明の DNAを有する細胞カゝら cDNAライブラ リ ーを作成するの に適 した細胞 を選ぴ公知の方法 ( J. Sambrook 等、 Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989年参照） に従って、 cDNA ライ プラ リ ーを作製 し、 利用する こ とができ る。
また、 本明細書に開示 された配列を基にホ スホア ミ ダイ ト法 な どの化学合成的手法によ り調製する こ と も可能である。
本発明の DNA を含む組換えベク ターは、 環状、 直鎖状等いか なる形態のも の であっても よい。 かかる組換えベク ターは、 本 発明の DNA の全部または一部 （一部 と は例えば本発明の蛋白質 の部分ペプチ ドをコー ドする DNA である） に加え、 必要な らば 他の塩基配列を有していても よい。 他の塩基配列と は、 ェンハ ンサ一の配列、 プロモーターの配列、 リ ボゾーム結合配列、 コ ピー数の増幅を 目 的 と して使用 される塩基配列、 シグナルぺプ チ ドを コ一 ドする塩基配列、 他のポ リ ぺプチ ドをコー ドする塩 基配列、 ポ リ A付加配列、 スプライ シ ング配列、 複製開始点、 選択マーカー と なる遺伝子の塩基配列等のこ と である。 本発明 の組換えべク ター の好ま しい一例は、 発現ベク ターである。 遺伝子組み換えに際しては、 適当な合成 DNA アダプターを用 いて翻訳開始コ ド ンや翻訳終止コ ド ンを本発明の DNA に付加 し た り 、 ある いは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに 発生させあ るいは消失させる こ と も可能である。 これら は当業 者が通常行 う 作業の範囲内であ り 、 本発明の D NA を基に任意か つ容易に加工する こ と ができ る。
また本発明の DNA を保持するベク ターは、 使用する宿主に応 じた適当なベク ターを選択 して使用すればよ く 、 プラス ミ ドの 他にノく クテ リ オフ ァ ージ、 バキュ ロ ウイ ノレ ス 、 レ ト ロ ウ イ ルス、 ワ ク シニア ウ ィルス等の種々 の ウィルスを用いる こ と も可能で あ り 、 特に制限はない。
本発明の遺伝子の発現は、 該遺伝子固有のプロモータ ー配列 の制御下に発現させる こ と ができ る。 かかる発現系を用いれば、 本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がよ り 有利に行える。 あ るいは、 本発明の遺伝子の上流に別の適当 な発現プロ モーターを該遺伝子固有のプ ロ モーター配列に接続 あるいは置き換えて使用する こ と もでき る。 こ の場合に使用す る プロモータ一は、 宿主及び発現の 目 的に応 じて適宜選択すれ ばよ く 、 例えば宿主が大腸菌である場合には T 7 プ ロ モーター、 l a c プロモーター、 t r p プロモーター、 λ P L プロモータ 一などが、 宿主が酵母である場合には P H O 5 プ ロ モーター、 G A P プ ロ モーター、 A D Hプロモータ一等が、 宿主が動物細 胞である場合には S V 4 0 由来プロモーター、 レ ト ロ ウ ィ ルス プロ モーター等を例示でき るが、 当然なが ら これら には限定さ れない。
DNA をベク ターに導入する方法は公知である （ J. Sambrook等、 Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd e d. , Cold S ring Harbor Laboratory, ニューヨーク (New York) , 1989年、 参照） c すなわち、 DNA とべク タ一をそれぞれ適当な制限酵素で消化 し、 得られたそれぞれの断片を、 DNA リ ガーゼを用いてライ ゲーシ ョ ンさせればよい。
(蛋白質）
本発明の蛋白質は、 該蛋白質を発現 している細胞や組織か ら 調製する こ と ができ、 またペプチ ド合成機 （例えば、 ペプチ ド シンセサイ ザー 433A型、 アプライ ドバイ オシステ ムズ ジャパ ン株式会社製） を使用 した化学合成法でも、 また原核生物ある いは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方 法によ って も調製する こ と ができ る。 しか しなが ら、 その純度 の面か ら遺伝子工学的な手法によ る生産な らびに組換え型蛋白 質が好ま しい。
前項の組換えベク ターを用いて形質転換させる宿主細胞には 特に制限はな く 、 E. coli、 B. subtilis あるレヽは S. cerevisiae に代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、 昆 虫細胞、 C O S 7細胞、 CH 0細胞、 H e l a細胞に代表される動物細胞 など多く の細胞が、 本発明に対しても利用可能である。
本発明の形質転換細胞は、 適当な宿主細胞を本発明の組換え ベク ターに よ り 形質転換させる こ とで得る こ と ができる。 前項 の組換えベク ターを宿主細胞に導入する方法と しては、 エ レク ト ロポ レー シ ヨ ン法、 プ ロ ト プラ ス ト法、 アルカ リ 金属法、 リ ン酸カルシウム沈澱法、 D EAEデキス ト ラ ン法、 マイ ク ロイ ンジ ュク シ ヨ ン法、 ウ ィ ルス粒子を用いる方法等の公知方法 （実験 医学臨時増刊、 遺伝子工学ハン ドプッ ク 1 99 1 年 3月 20 日発行、 羊土社、 参照） があるが、 いずれの方法を用いても構わない。
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産する には、 上述の形質転換 細胞を培養 して培養混合物を回収 し、 当該蛋白質を精製する。 形質転換細胞の培養は、 一般的な方法で行 う こ と ができ る。 形 質転換細胞の培養については各種の成書 （例、 「微生物実験法」 社団法人 日 本生化学会編、 株式会社東京化学同人、 1 9 92年） が あるので、 それら を参考に して行う こ と ができ る。
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法と しては、 蛋 白質の精製に通常使用 されている方法の中から適切な方法を適 宜選択 して行 う こ と ができ る。 すなわち、 塩析法、 限外濾過法、 等電点沈澱法、 ゲル濾過法、 電気泳動法、 イオン交換ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 疎水性ク ロ マ ト グラ フ ィ ーゃ抗体ク ロ マ ト グラ フ ィ 一等の各種ァフ ィ 二テ ィ ーク 口マ ト グラ フィ 、 ク ロマ ト フ オーカ シング法、 吸着ク ロマ ト グラ フ ィーおよび逆相ク ロマ ト グラ フ ィ 一等、 通常使用 され得る方法の中から適切な方法を適 宜選択し、 必要によ り H P L C システム等を使用 して適当な順序で 精製を行えば良い。
また、 本発明の蛋白質を他の蛋白質やタ グ （例、 グルタチォ ン S ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼ、 プロ テイ ン A、 へキサ ヒ ス チジンタ グ、 F L A G タ グその他） と の融合蛋白質と して発現させる こ と も可能である。 発現させた融合型は、 適当なプロテアーゼ （例 ト ロ ンビン、 ェンテ ロカイネースその他） を用いて切 り 出すこ と が可能であ り 、 と き と して蛋白質の調製を よ り 有利に行 う こ と が可能と なる。 本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手 法を適宜組み合わせて行えばよ く 、 特に融合蛋白質の形態で発 現させたと き は、 その形態に特徴的な精製法を採用する こ と が 好ま しい。
ま た 、 組換 え DNA 分子 を利用 し て 無細胞系 の合成方法 ( J. Sambrook, et a 1. ： Molecular Cloning 2nd e d. ( 1989年)) で得る方法も、 遺伝子工学的に生産する方法の 1 つである。
こ の様に本発明の蛋白質は、 それ単独の形態でも別種の蛋白 質と の融合蛋白質の形態でも調製する こ と ができ る が、 これら のみに制限 される も のではな く 、 本願発明の蛋白質を更に種々 の形態へと 変換させる こ と も可能であ る。 例えば、 蛋白質に対 する種々 の化学修飾、 ポ リ エチレンダ リ コール等の高分子 と の 結合、 不溶性担体への結合な ど、 当業者に知 られている多種の 手法に よ る加工が考えられる。 また、 用いる宿主によっては糖 鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認め られる。 かか る場合にあっても、 スカベンジャ ー受容体様蛋白質と して機能 する限 り において、 なお、 本発明の思想下にある と いう べきで ある。
本発明の蛋白質は、 抗体を作製するための抗原と して使用 し、 あるいは該蛋白質に結合する物質ゃ該蛋白の活性を調節する物 質のス ク リ ーニングに使用する こ と ができ、 有用である。
本発明の ADSE は、 上述のよ う な形質転換細胞、 特に動物細胞 を培養する こ と によ り 、 その細胞表面に 目 的分子を高発現させ る こ と が可能である。 一方、 ADSE の細胞外領域タ ンパク フ ラ グ メ ン ト などの適当な断片を可溶性タ ンパク と して製造する場合 には、 当該細胞外領域あるいは各 ドメ イ ンをコー ドする D N A を 用いて上述のよ う に形質転換細胞を調製 し、 該形質転換細胞を 培養する こ と によ り 培養上清中に分泌させる こ と によ り 製造す る こ と ができ る。
一方、 A D S Eが形質転換細胞のペ リ プラズムまたは細胞質内に 存在する場合は、 適当な緩衝液に懸濁 した細胞に対 して、 例え ば超音波処理、 凍結融解処理、 あるいは リ ゾチーム処理な どを 行って細胞壁および または細胞膜を破壊 した後、 遠心分離や ろ過な どの方法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、 さ ら に該膜画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化 して粗溶液を調 製する。 そ して、 当該粗溶液から常法によ り 目的蛋白質を単離、 精製する こ と ができ る。
( ト ラ ンスジエニ ッ ク動物）
本発明の遺伝子 adse を用いれば、 ト ラ ンスジエニッ ク非 ヒ ト 哺乳動物を作製する こ と ができ る。 こ の ト ラ ンス ジエニッ ク非 ヒ ト哺乳動物も本願の発明に属する。 該 ト ラ ンス ジエニ ッ ク非 ヒ ト哺乳動物は、 ト ラ ンス ジヱニッ ク動物の製造において通常 使用 される よ う な定法 （例、 発生工学実験マニュアル、 講談社 サイェ ンティ フ ィ ク発行、 勝木元也編、 野村達次監修、 年） に従っ て作製する こ とができ る。 すなわち、 本発明の遺伝子ま たは組換えベク ターを非ヒ ト動物の全能性細胞に導入し、 こ の 細胞を個体へと発生させ、 体細胞のゲノ ム中に導入遺伝子が組 み込まれた個体を選別する。
具体的には、 例えば、 ト ラ ンスジエニッ ク マ ウス の場合には、 正常 C 5 7 B l a c k Z 6 マ ウスカゝ ら取得した前核期受精卵に adse遺伝 子が発現可能なよ う に構築 された DNA を直接注入する。 よ り 具 体的には、 適切なプロ モーターの下流に adse遺伝子を接続して 導入 したコ ンス ト ラ ク ト を作製 し、 その後必要であれば原核生 物由来の配列を可能な限 り 除去 した直鎖状 DNA を得て、 これを 前核期受精卵前核に微細なガラ ス針を用いて直接注入する。 該受精卵を仮親と して別の偽妊娠マ ウスの子宮に移植する。 偽 妊娠マ ウスは一般的に I CR 雌マ ウス を、 精管を切断または結紮 した雄マウス と交配 して作製する。 移植胚由来の仔の組織よ り ゲノ ム DNA を抽出 し、 P CR 法またはサザンプロ ッテ ィ ング法に て adse遺伝子の導入の有無を確認 し ト ラ ンスジヱニ ック マ ウス を得る。
また、 adse (または adseのマ ウス相同遺伝子） の塩基配列に基 づいて、 いわゆる 「ノ ッ ク ア ウ トマ ウス」 を作製するこ と がで き る。 本発明におけ る 「ノ ッ ク ア ウ トマウス」 と は、 本発明の マ ウス 由来の蛋白質をコー ドする内在性遺伝子がノ ック ァ ゥ ト
(不活性化） されたマ ウスであ り 、 例えば相同組換えを応用 し たポジティ プネガティ プセ レク ショ ン法（米国特許第 5, 464, 764 号公報、同 5， 487， 992号公報、同 5 , 627 , 059号公報、 o c . Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, 8932-8935, 1989、 Nature, Vol. 342, 435-438, 1989 など） を用いて作製する こ と ができ、 このよ う なノ ッ ク ァ ゥ トマ ウス も本発明の一態様である。
または、 最近中大動物においても核移植によ る ク ロー ン動物 の作出が可能と なった。 これに伴い本技術を用いた ト ラ ンス ジ ヱニッ クおよびノ ッ ク ァ ゥ ト動物の作出も実際に行われる よ う になった。 すなわち体細胞、 あるいは生殖系列の細胞に対し adse
(または各動物における adse の相同遺伝子） の塩基配列に基づい て、 E S細胞に対して行う のと同様に相同組換えを行い、 得られた 細胞から核を得て、 その核を用いてク ローン動物を得ることができ る。 該動物は adse (または各動物における adseの相同遺伝子） が 失われたノ ッ ク ア ウ ト動物である。 または、 上述の方法と 同様、 任意の動物の任意の細胞に adse (または各動物におけ る adseの相 同遺伝子） 遺伝子を導入 し、 その核を用いてク ローン動物を得 る事によ り ト ラ ンスジエ ニ ッ ク動物を作製する事も可能である こ のよ う なノ ッ ク ァ ゥ ト 非ヒ ト動物おょぴ ト ラ ンス ジエ ニ ッ ク 非ヒ ト動物はその種に関わ らず本発明の一態様である。
(抗体）
本発明の抗体は、 ポ リ ク ローナル抗体、 モ ノ ク ロ ーナル抗体 いずれも公知方法を参考に して得る こ とができ る （例えば、 免 疫実験操作法、 日本免疫学会編、 日 本免疫学会発行、 参照） 。 以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、 まず動物に、 免疫抗原 と して本発 明 の蛋 白 質 を必要に応 じ て フ ロ イ ン ト の完全ア ジュ バ ン ト
( F CA ) や不完全アジュ バ ン ト ( F IA ) 等の適切なアジュ バ ン ト と と も に接種し、 必要があれば 2〜 4 週間の間隔で追加免疫す る。 追加免疫後、 採血を行い、 抗血清を得る。 抗原 と して用い る本発明の蛋白質は、 それか抗体の作製に使用 し う る精製度の も のであれはいかな る方法で得られたものであって もよい。 本 発明の蛋白質の部分ポ リ ぺプチ ドも免疫抗原と して好適に使用 し う る。 免疫抗原と して使用するポ リ ペプチ ドが、 低分子のポ リ ペプチ ド、 すなわち約 1 0〜 2 0ア ミ ノ 酸からなるポ リペプチ ド であ る場合に は、 それを キーホール リ ンぺ ッ トへモ シァ ニ ン
( KLH ) 等のキヤ リ ァ と結合させて抗原と して使用すればよい。 免疫する動物はいかなる も のであって も良いが、 好ま し く は通 常当業者で免疫学的な実験に使用 される ラ ッ ト、 マ ウス、 ゥサ ギ、 ヒ ッジ、 ゥマ、 ニヮ ト リ 、 ャギ、 ブタ 、 ゥシ等から、 目 的 の抗体を産生 し う る動物種を選択して使用する こ と が好ま しい。 ポ リ ク ロ ーナル抗体は、 得られた抗血淸を精製するこ と によ つて得る事が出来る。 精製は、 塩析、 イ オン交換ク ロマ ト ダラ フ ィ 一、 ァ フ ィ 二テ ィ ーク ロマ ト グラ フ ィ 一等の公知方法を適 宜組み合わせて行えば良い。
モ ノ ク ロ ーナル抗体を得るには以下のよ う に行 う 。 すなわち、 免疫 した動物から脾細胞も し く は リ ンパ球等の抗体産生細胞を 採取 し、 ポ リ エチ レ ング リ コ ール、 セ ンダイ ゥイ ノレス、 電気パ ルス等を用いる公知方法によ って、 ミ エローマ細胞株等 と融合 し、 ハイ プ リ ドーマを作製する。 その後、 本発明の蛋白質に結 合する抗体を産生している ク ロー ンを選択 して培養 し、 その選 択されたク ロー ンの培養上清を精製する こ と によ って得れは良 い。 精製は、 塩析、 イオン交換ク ロマ ト グラフ ィ ー、 アブ イ - ティ ーク ロマ ト グラ フィ 一等の公知方法を適宜組み合わせて用 いれば良い。
また、 遺伝子工学的な方法を用いて も当該新規抗体が得られ る。 例えば、 本発明蛋白質またはその部分ポ リ ペプチ ドで免疫 した動物の脾細胞、 リ ンパ球あるいは、 本発明蛋白質またはそ の部分ポ リ ぺプチ ドに対するモ ノ ク ロ ーナル抗体を産生するハ ィ プ リ ドーマ力 ら mRNA を採取し、 これをも と に cDNA ライ ブラ リ ーを作成する。 抗原と 反応する抗体を産生 してい る ク ロ ー ン をス ク リ ーニング し、 得 られたク ローンを培養 し、 培養混合物 から 目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製する こ と が でき る。 抗体を治療に使用する場合には、 免疫原性の点から ヒ ト化抗体が好ま しい。 ヒ ト化抗体は、 免疫系を ヒ ト のも の と入 れ替えたマ ウス （例 Nat. Genet. 15； 146-156 (1997) ) を免疫す る こ と によ り 調製する こ と が出来る。 また、 モ ノ ク ローナル抗 体の超可変領域を用いて遺伝子工学的に調製する こ と もでき る
( Method in Enzyraology 203； 99-121 (1991) ) 。
(アンチセ ンス核酸）
ア ンチセ ンス核酸は、 公知方法で製造する こ と ができ る （例 X-は、 Stanley T . Crookeおよひ Bernald Lebleu編、 in Antisense Research and Applications, CRC出版、 フ ロ リ ダ、 1993年） 0 天然の DNA や RNA であれば、 化学合成機を使用 して合成 し、 あ るいは ADSEを铸型と して PCR法によ り 本発明のアンチセ ンス核 酸を得る こ と ができ る。 また、 メ チルフォ ス フ ォネー ト型ゃフ ォ ス フ ォ ロ チォエー ト型等、 誘導体の中には化学合成機 （た と えばパーキ ンエルマ一ジャパン （株） 製、 394 型） を使用 して 合成でき る ものも ある。 この場合には、 化学合成機に添付され たマニュアルに従って操作を行い、 得 られた合成産物を、 逆相 ク ロマ ト グラ フィ 一等を用いた HPLC 法によ り 精製する こ と に よ っても、 アンチセ ンス核酸を得る こ と ができ る。
本発明の DNA やアンチセ ンス核酸を診断用のプローブと して 使用する場合には、 それら を公知の方法に従い、 ラ ジオァイ ソ トープ、 酵素、 蛍光物質、 あるいは発光物質等で標識する。 次 に、 検体カゝ ら DNA も しく は mRNA を公知方法で調製し、 これを被 検物質と して、 前記標識プローブを加えて反応させた後、 洗浄 して未反応の前記標識プローブを除去する。 被検物質中に、 遺 伝子 ADSE も しく は RNAが含まれていれば、 当該ア ンチセ ンス核 酸はそれら と結合する。 結合形成の有無は、 標識 した酵素、 蛍 光物質、 発光物質、 あるいは放射性同位元素.等によ る発光、 蛍 光、 放射能等を指標と して知る こ と ができ る。 本発明の D NA、 アンチセンス核酸または組換えベク ターを医 薬用途に使用する場合には、 医薬品 と して使用する のに適 した 純度の ものを、 薬理学的に許容され う る使用方法で使用する こ と が好ま しい。
本発明の D NA、 ア ンチセ ンス核酸または組換えベク ターは、 それら を直接適当な溶媒に溶解も しく は懸濁 して使用 しても よ い し、 リ ボ ソー ム中に封入 した り 、 適当なベク ターに組み込ん だ形に して使用 して も よい。 また、 必要に応 じて、 薬理学的に 許容され得る捕助成分を添加 し、 注射剤、 錠剤、 カ プセル剤、 点眼剤、 ク リ ー ム剤、 座剤、 噴霧剤、 パッ プ剤等適当な剤型に して使用 しても よい。 薬理学的'に許容され得る補助成分と は、 溶媒、 基剤、 安定化剤、 防腐剤、 溶解剤、 賦形剤、 緩衝剤等の こ とである。
本発明の D NA、 ア ンチセ ンス核酸または組換えベク ターは、 上述のよ う な剤型と した場合、 患者の年齢や、 性別、 疾患の種 類、 程度に応 じて、 その投与方法、 その投与量を設定して使用 する こ とができ る。 すなわち、 病態を改善するのに適した量を、 経口投与、 あるいは、 吸入、 経皮投与、 点眼、 膣内投与、 関節 内投与、 直腸投与、 静脈内投与、 局所投与、 筋肉内投与、 皮下 投与、 腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。 ( ス ク リ ーユ ン グ方法）
本発明は、 本発明の蛋白質、 該蛋白質を発現している形質転 換細胞、 本発明の D N A、 該 D N Aを含む組換えベク ター、 該 組換えベク ターで形質転換された形質転換細胞または本発明の DNA によ り 組換えた ト ラ ンス ジエニッ ク非ヒ ト哺乳動物を用い る こ と を特徴と し、 本発明の蛋白質の機能または発現を調節す る物質をス ク リ ーニング方法に関する。 よ り 具体的には、 （ 1 ) 被験物質の存在下/非存在下における リ ガ ン ドと の結合能を評 価する方法、 （ 2 ) 被験物質の存在下/非存在下における本発 明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較 し、 本発明の蛋白 質の発現を調節する物質をスク リ 一二ングする方法などが挙げ られる。 （ 1 ) の例と しては、 実施例 3 に示す系において、 被 験物質存在下/非存在下における変性 LD Lの結合 · 取り 込み活 性を測定すればよい。 （ 2 ) の例と しては、 a d s e遺伝子の発現 制御領域、 5 ' 非翻訳領域、 翻訳開始部位近傍領域または翻訳 領域の一部等を含む DNA と ルシフェラーゼ等のレポ一ター遺伝 子を連結した発現プラス ミ ドを作製 し、 本発明の遺伝子が転写 または翻訳される環境下で該レポーター遺伝子の発現量を被験 物質の存在下/非存在下で測定し、 被験物質の転写促進活性ま たは転写抑制活性を確認する方法が挙げられる。 本発明のス ク リ ーユング方法は、 本発明の蛋白質、 該蛋白質を発現している 形質転換細胞、 本発明の D NA、 該 D NA を含む組換えベク ター、 該組換えベク ターで形質転換された形質転換細胞または本発明 の D NA によ り 組換えた ト ラ ンスジエニ ッ ク 非ヒ ト哺乳動物と被 験物質を接触させる工程 ； 被験物質添加群と被験物質無添加群 と における本発明の蛋白質の活性または本発明の D NAの発現レ ベルに差があるかど う かを検出する工程 ； 差が認め られた被験 物質を本発明の蛋白質の活性調節物質または本発明の D N Aの発 現調節物質と して選択する工程を含み得る。 本発明の蛋白質の 活性を調節する作用を示す物質と は、 ADSE蛋白質の活性を増強（ァ ゴニス ト）あるいは阻害する （アンタ ゴニス ト） 作用を有する物 質のいずれでも良いが、 好ま し く はア ンタ ゴニス ト である。 本 発明の D NA の発現調節作用を示す物質と は、 遺伝子 adseの発現 を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでも よいが、 好ま し く は抑制する作用を有する物質である。 被験物質が本発 明の蛋白質の活性調節作用または本発明の D NAの発現調節作用 を示すかど う かは、 蛋白質の活性を確認でき る系または D NA の 発現を確認でき る系に被験物質を添加 した場合と 無添加の場合 の蛋白質の活性または DNAの発現レベルに差があ るかど う かを 調べればよい。 DNAの発現レベル と は、 adse遺伝子の mRNA の発 現強度、 蛋白質の発現強度のいずれによ り 検出 しても良い。 ま た、 adse遺伝子または ADSE蛋白質自体の発現レベルではなく 、 代替 と して レポーター遺伝子の発現レベルを検出 して も良い。 レポ ータ一ア ツセィ 系は、 転写調節領域の下流に配置 したレポ一 ター遺伝子の発現量を指標 と して、 該転写調節領域に作用す る物質をス ク リ ーニ ングする ア ツセィ系をい う 。 転写調節領 城 と して は、 プロ モー タ ー、 ェ ンハ ンサー、 通常プロ モー タ 一領域に見 られる C A A Tボ ッ ク ス、 T A T Aボ ッ ク ス等を 例示する こ と ができ る 。 ま た レポータ ー遺伝子 と して は、 し A T (ch丄 oramphen lco丄 acety丄 transferase) 遺 十、 ノレ シ フ エラーゼ （ lucif erase) 遺伝子、 |3—ガラ ク ト シダーゼ ( β — galactosidase) 遺伝子等を利用する こ と ができ る。 本発明の遺 伝子の発現制御領域や 5 ' 非翻訳領域は公知の方法で取得する こ と が可能である （新細胞工学実験プロ ト コール （秀潤社） 、 1S93年） 。 阻害 （または抑制） する作用 を有する、 あるいは増 強 （または促進） する作用 を有する と は、 蛋白質の活性または DNA の発現レベルの測定値が、 被験物質添加群と、 被験物質無 添加群と の間に差がある こ と をレ、 う 。 たと えば、 下記の式で計 算 される阻害 （または抑制） 率あるいは増強 （または促進） 率 が 10%以上、 好ま しく は 30%以上、 よ り 好ま しく は 50%以上、 更に好ま し く は 70%以上、 特に好ま しく は 90%以上である こ と をい う 。
阻害 （または抑制） 率あるいは増強 （または促進） 率 = (被 験物質無添加群の測定値一被験物質添加群の測定値） の絶対値 Z無添加群の測定値 *100
こ こで、 阻害または増強の どち らの活性である かについて、 お よ び測定値については蛋 白質の活性を確認でき る 系ま たは DNA の発現を確認でき る系の種類によって適宜定め られる。 た と えば、蛋白質の活性を確認でき る系が実施例 3 に示す編成 LDL の取 り 込み活性の測定系の場合には、 測定値と しては放射活性 を用いる こ と ができ、 被験物質添加群の測定値 <被験物質無添 加群の測定値となる場合、 被験物質には ADSE蛋白質活性阻害作 用がある と いえる。 測定系にバッ ク グラ ウ ン ドやノ イズの値が 含まれる場合には、 その よ う なも のを差し引いた値を測定値と する こ と は言 う までもない。 本発明である蛋白質は、 ス カベンジャー受容体ク ラ ス A様蛋 白質である こ と から、 上述のス ク リ ーニング方法あるいは ト ラ ンス ジエニ ッ ク動物を用いた探索を通 じて得られる化合物等は， 動脈硬化症等に対する有効な治療薬または予防薬と なる こ と が 期待される。 被験物質と しては蛋白質、 ペプチ ド、 オリ ゴヌ ク レオチ ド、 合成化合物、 天然由来化合物、 醱酵生成物、 細胞抽 出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液な どが挙げられるがこれに 限定されず、 新規物質でも公知物質でも よ い。
図面の簡単な説明
第 1 図は、 ク ラ ス A に属するスカベンジャ ー受容体蛋白質の ドメ イ ン構造図を示す。 i 、 n、 m、 Mはサブタイ プを表す。
Aは細胞質 ドメ イ ン、 B は膜貫通 ドメ イ ン、 C はスぺーサー ド メ イ ン、 D は α ヘ リ 力ノレコ イ ル ド コ ィ ノレ ド メ イ ン、 Ε は コ ラ ー ゲン様 ドメ イ ン、 F は C末端特異 ドメ イ ンを表す。
第 2 図は、 AD S E と公知のスカベンジャー受容体と のァライ メ ン ト結果を示す。
第 3 図は、 ヒ ト ス力ベンジャー受容体ク ラス Α サブタイ プ I と AD S E と のア ミ ノ 酸配列上の相同性を示す。 Aは細胞質 ドメ イ ン、 B は膜貫通 ドメ イ ン、 Cはスぺーサー ドメ イ ン、 D は αへ リ カルコィ ル ド コ イ ル ド メ イ ン、 E は コ ラ ーゲン様 ドメ イ ン、 F は C末端特異 ドメ イ ンを表す。
第 4図は、 adse遺伝子の ヒ ト臓器および各種細胞での発現プ 口 フ ァ イ ルを示す。 PHA と は PHA 存在下培養ヒ ト末梢血由来白 血球を表す。
実施例
以下の実施例によ り 本発明を更に詳述するが、 本発明はこれ ら実施例に限定して理解されるべき も のではない。
実施例 1 遺伝子 adse のク ローニング
( 1 ) オリ ゴキヤ ップ法によ る完全長 cDNA ライ ブラ リ ーの作製 ヒ ト JI旨肪糸且織よ り Sambrook らの方法 ( Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd e d. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. ) ίこ従レヽ、 オ リ ゴ dT セノレ ロ ースを用 いてポ リ （A)+RNA を調製した。 次に 5-10 g のポ リ （A)+RNA を、 100mM の Tris - HC1 (pH8.0)、 5m の 2—メノレカプ トエタ ノ ーノレ及 ぴ 100Uの RNasin( Pr omega)を含む緩衝液中で、 1.2Uの Bacterial Alkaline Phosphatase (以下 BAP と略する） ( TaKaRa) と 37。C で 40分間反応させ、 キャ ップ構造を持たないポリ （A) +RNA の脱 リ ン酸ィ匕を行った。 そ の後、 フ エ ノ ール ： ク ロ 口 ホルム = 1 : 1 の混合液にて反応液を 2 回抽出 し、ポ リ （A) +RNA をエタ ノ ール沈 殿と して回収した。 回収 したポ リ （A) +RNA は、 50mM の酢酸ナ ト リ ウ ム （ pH5.5) 、 ImM の EDTA、 5mM の 2—メ ルカ プ ト エタ ノ ーノレ 及ぴ 100U の RNasin を含む緩衝液中で 20U の Tobacco acid pyrophosphatase 、以" TAP と略する i, aruyaraa and Sugano, Gene vol. 138, 171 - 174) にて 37 °Cで 45分間処理 し、 キャ ップ 構造の除去を行った。 その後、 フエ ノ ール ： ク ロ 口 ホルム = 1 : 1 の混合液にて反応液を 2 回抽出 して、 エタ ノ ール沈殿を行い、 BAP-TAP処理済ポリ （A) +RNA を回収 した。
こ の回収 したポ リ （A) +RNA2-4 / g を 0.4/i g の 5 ' オ リ ゴマー ( 5' - AGC AUC GAG UCG GCC UUG UUG GCC UAC UGG - 3' ) と ラ ィ ゲ ー シ ョ ン 反応 を 行 っ た 。 こ の 反 応 は 50mM の Tris- HC1 (PH7.5)、 5mMの MgCl2、5mM の 2—メノレ力プ ト ェタ ノ 一ノレ、 0.5m の ATP、 25%の PEG8000及び 100U の RNAsin を含む緩衝液中で、 250U の ]? NA リ ガーゼ ( TaKaRa) を用いて 20 °Cで 3 - 16 時間行つ た。 その後、 未反応のォ リ ゴマーを除去して cDNA合成を行った c すなわち、 2_4μ gのオ リ ゴキャ ップポリ （A) +RNA を lOpmol の dT アダプタープライマー ( 5' -GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CTT ΤΤΤ TTT TTT TTT - 3' ) と混合し、 Superscript I I Rnase H~ Reverse Transcriptase ( GibcoBRL) を用レヽ、 添すの緩衝液 中で 42°C、 1時間反応させた。
錄型の RNA を除去するために 15mM の NaOH を用いて 65°Cで 1 時間反応させた後に、 cDNA の増幅操作を行った。 1 X gのオ リ ゴ キ ャ ッ プポ リ （A) +RNAよ り 合成された cDNAを 16pmol のセ ンス プ ライマー 1 ( 5' - AGC ATC GAG TCG GCC TTG TTG ― 3' ) 及びア ン チセ ンスプライマー 1 ( 5' - GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT - 3' ) と混合 し、 XL PCR kit ( Perkin-Elmer) を用いて増幅した。 こ の際の PCR反応の条件は、 94°Cで 1 分間、 58°Cで 1 分間、 72°C で 10分間のサイ クノレを 5_ 10回行った。 PCR産物をフ エ ノ ーノレ ： ク ロ 口 ホルム = 1 : 1 の混合液にて抽出 し、 エタ ノ ール沈殿と し て回収 した。 その後、 回収物を Sfi l で消化し、 ァガロ ースゲ ル電気泳動にて lOOObp 以上の cDNA を分離し、 哺轧動物細胞発 現 べ ク タ ー で あ る ME18S-FL3 ( GenBank accession No. AB 009864) の Dra l I I サイ ト に挿入した。 尚、 ME18S-FL3 の Dra I I I サイ ト は非対称性と なってお り 、 cDNA 断片の末端 にはこれと相捕的な Sfi I サイ ト と なっているため、 挿入した cDNA断片は一方向性に挿入されている。
( 2 ) cDNA ク ローン塩基配列及びそ の推定蛋白質情報の解析 ( 1 ) の方法で作製した cDNA ライ プラ リ ーよ り 、 PI-100 口 ボッ ト （ KURAB0) を用いてプラス ミ ドを調製 し、 各ク ローンの 塩基配列を確認 し、 データベース化 した。 塩基配列決定は、 AutoCycle sequencing kit (Amersham Pharmacia) と R.0. B. DNA processor (Amersham Pharmacia) を用レヽ添付のプロ ト コ 1 ~ ノレ (こ 従ってシークェンス反応を行レヽ、 ALF DNA sequencer ( Amersham Pharmacia) によ り 行った。
( 1 ) に記載の方法で取得したク ローン C-ADSE02045 には、 配列番号 2 で表される 495 個のア ミ ノ酸からなる新規な蛋白質 をコー ドする、 配列番号 1 で表される 1485塩基の塩基配列から な る オープン リ ーディ ング フ レーム (0RF) を含む、 全長 3644 塩基対の塩基配列 （配列番号 3 ) か らなる c DNA が含まれてい た。 こ のプラ ス ミ ド C-ADSE02045 は、 国際微生物寄託機関であ る独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンタ ー (日本国茨城県つく ば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、 平成 13 年 (2001)2月 1 日付にて受託番号 FERM BP - 7867 と して寄託されている。
C - ADSE02045 に含まれている 0RF 部分の相同性の検索には、 BLAST (Altschul SF. , J Mol Evol. , 36, pp.290-300 (1993) ； Altschul SF et al.， J. Mol. Biol. , 215, pp.403- 410 (1990) )を用いて、 ア ミ ノ 酸配列におけ る局部的な配列の一 致を検索 した。 その結果、 ヒ ト ス力ベンジャ ー受容体ク ラ ス A タイ プ I と、 N末端側から細胞質 ドメ イ ン （ 1 ~ 5 9 a. a. ) に おいて 4 2 %、 膜貫通 ドメ イ ン （ 6 0〜 9 1 a. a. ) において 5 9 %、 スぺーサー ドメイ ン （ 9 2〜 1 2 6 a. a. ) において 2 6 % . α ヘ リ カ ノレ コ ィ ノレ ド コ ィ ノレ ド メ イ ン ( a -helicalcoiled coil domain) ( 1 2 7〜 3 0 5 a. a . ) において 5 1 %、 コ ラ ーゲ ン 様 ドメ イ ン （ 3 0 6〜 3 8 4 a. a. ) におレ、 て 5 6 %、 及び C末 端特異 ドメ イ ン （ 3 8 5〜 4 9 5 a. a. ) において 7 0 %、 全体 で 4 3 %の相同性を示した。
推定された蛋白質配列 と相同性検索から得られた異な る生物 種由来の SR ク ラス Aサブタイ プ I のア ミ ノ酸配列と を、 マルチ ブルア ラ イ メ ン トプロ グ、ラ ム ClustalW (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. , Nucleic Acids Res. , 22, pp.4673-4680 (1994) ) を用いて整列 した結果を第 2図に示す。
隠れマル コ フモデルを用いた相同性検索プロ グラ ムであ る HMMER (R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh, G. Mitchison. , Cambridge University Press. , (1998))を用レヽてタ ンパク 質 ド メイ ンデータベースである Pfam (http://www. Sanger, ac. uk/Pfam/; E. L. L. Sonnhammer, S. R. Eddy, and R. D u r b i n . , Proteins . , 28, pp. 405 - 420 (1997) )に検索を実施した結果、 MSR
I 型及び II型 ( GenBank 了クセ ッ シ ョ ン番号： S08278； Rohrer, L. ら、 Nature, Vol. 343, 570-572, 1990) と構造的類似†生を有 していた。
さ らに、コ ン ピ ュータ ソ フ ト PR0SITE、C0IL、TMpred及び PS0RT 等を用い、 ADSEの 2 次構造を解析 した。 この結果、 特に、 SR ク ラス Aサプタイ プ I に認め られる 6 種の ドメ イ ン構造である、
( N末端側から） 細胞質 ドメ イ ン、 膜貫通 ドメ イ ン、 ス ぺーサ 一 ド メ イ ン 、 α ヘ リ カ ノレ コ ィ ノレ ド コ ィ ノレ ド メ イ ン ( a - heli calcoiled-coi l domain) 、 コ ラーゲン様 ドメ イ ン、 及び C 末端特異 ドメ イ ンがすべて見出 された。
上記の検索結果である ADSEの ドメ イ ン構造と、 ヒ ト由来 S R ク ラ ス Aサブタイ プ I の ドメイ ン構造と の比較を第 3 図に示す。 また、 ADSE は、 多く の リ ン酸化部位及び糖鎖結合部位、 並ぴ にヘム結合部位及びミ ク ロ ボディ ー （ microbody ； ペルォキシ ソ ―ム ( peroxi some) ) C末端ターゲティ ングシグナルを有 して いる こ と が確認された。 この結果は、 ADSE が翻訳後修飾を受け るタ ンノ ク である こ と を示唆する も のである。 実施例 2 哺乳細胞での発現
C-ADSE02045 プラ ス ミ ドを下記の方法で C0S— 1糸田 包に導入 し、 蛋白質の発現を行った。
FuGE EG ( ロ シュ ' ダイ ァグノ スティ ッ ク ス社） 50 /2 1 を上記 プラ ス ミ ド DNA 12. 5 μ g と 添付プロ ト コールに従い混合 し、 150cm2 フ ラ ス コ にセ ミ コ ンブルエ ン ト に増殖した C0S-1 細胞に 添加 した。 5 % CO 2、 37°Cの条件下で 72時間培養 した後に、 ADSE 蛋白質発現細胞を回収し、 実施例 3 に示す活性測定アツセィ に 供した。
実施例 3 変性 LDL取り 込み活性の検出
実施例 2 で作成 した ADSE蛋白発現細胞に酸化 LDLあるいはァ セチル化 LDL を添加 して一定時間イ ンキュベー ト した。 対照群 と して、 ADSE を発現 しないべク ターで組み換えた細胞を用意 し 同様に処理 した。 イ ンキュベー ト終了後、 へキサン ： イ ソプロ パノ —ノレ = 3 ： 2 で細胞の脂質を抽出 · 乾固 し、イ ソプロパノ ー ルで再溶角¥させたも ののコ レステロ一ノレエステル量を酵素蛍光 法で測定した。 または、 ADSE蛋白発現細胞に酸化 LDLあるいは ァセチル化 LDL と と もに [14C]ラベルしたォレイ ン酸を添加 し、 一定時間イ ンキュベー ト した。 対照群と して、 ADSE を発現 しな いベク ターで組み換えた細胞を用意 し、 同様に処理 した。 イ ン キュベー ト終了後、 へキサン ： イ ソプロパノ ール = 3 : 2で細胞 の脂質を抽出 · 乾固 した後、 イ ソプロパノ ールで再溶解させた ものを TLC で展開 し、 コ レステロールエステル画分を集めてそ の放射活性を測定した（細胞工学別冊 医学実験マ -ユアルシ リ ーズ 2 動脈硬化 +高脂血症研究ス ト ラ テジー 秀潤社 P 148 - 151、 pl59-164) 。 その結果、 ADSE 蛋白質発現群では、 対照群 と比 して、 変性 LDL取り 込み量の有意な増加が観察 された。 実施例 4 ノ ッ ク ア ウ トマ ウ ス の作製
( 1 ) ターゲッティ ングベク ターの構築
マ ウ ス ADSE タ ンパク をコー ドする内在性遺伝子を相同組換 え （ 日経サイ エンス、 1994年 5月 号、 第 52-62頁） によ り 不活 性化 （ノ ッ ク ァ ゥ ト） するためのタ ーゲティ ングべク ターを構 築した。 adse の c DNA を 32Pで標識 して常法に従ってハイ プ リ ダ ィゼーシ ョ ン用プロ ープを作製した。 こ のプローブを用いて、 マ ウスゲノ ム D N A (染色体 D N A ) が導入されたコス ミ ドラ イ ス ラ リ ー ( 「ラボマニュアルヒ ト ゲノ ムマ ッ ピング」 、 堀雅 明及び中村祐輔編、 丸善出版の方法と 同様に して作製した。 ） をス ク リ ーニ ングし、 マ ウス ADSE をコー ドするェク ソ ンを含む マ ウスゲノ ミ ッ ク DNA ク ロー ンを取得した。
該ゲノ ミ ッ ク DNA と適当な選択マーカー遺伝子を連結 したプ ラス ミ ドを線状化 してターゲテイ ングベク ターと した。
( 2 ) ターゲティ ングベク ターの E S細胞への導入
15%ゥシ胎児血淸を含有する DMEM 培地中で培養 したマ ウス胚 性幹細胞 ( ( Nature, Vol.362, p.255-258, 1993 及び Nature, Vol.326, p.292-295, 1987) を 卜 リ プシ ンで処理 して単一細胞 と した後、 リ ン酸緩衝液で 3 回洗浄して細胞濃度を 1 1 0 7 細 胞 / ml に調製した。 細胞懸濁液 1 ml あた り 25 μ g の前記ターゲ ティ ングベク ターをカ卩え、 350V/cm ( 25 μ F) の条件下で電気パ ルスを 1 回かけた。 次いで、 シャ ー レ （ 10cm) に 1 X I 0 7細胞 の ES細胞を播種し維持培地中で 1 日培養 した後、 培地を選択培 地 （に交換 した。 以後 2 日毎に培地交換を行い培養 した。 ター ゲティ ングベク ター導入から 1 0 日 目 に、 マイ ク ロ ピぺッ ト を 用いて、 顕微鏡下で数百個のネオマイ シン耐性 ES細胞ク ローン を取得 した。 得られた ES 細胞ク ロー ンを、 Feeder 細胞を敷い た 24穴プレー ト で各々別々 に培養する こ と によ り 、 ネオマイ シ ン耐性 ES細胞の レプリ 力を取得 した。
( 3 ) ノ ッ ク ア ウ ト E S細胞のスク リ ーニング 得られたネオマイ シン耐性 ES 細胞の各々 について、 マ ウス ADSE をコー ドする内在性遺伝子の相同組換えによ る破壌 （ノ ッ ク ァ ゥ ト） が起こ っているか否かをゲノ ミ ッ ク サザンプロ ッテ イ ングによ り 確認する。 ゲノ ミ ツ ク サザンブロ ッテ イ ングは、 各々 のネオマイ シ ン耐性 ES細胞から抽出 したゲノ ミ ック DNAの EcoRI で切断断片について、 マ ウスゲノ ミ ッ ク DNA の 5 ' 側及 び 3 ' 側の配列を有する 2 つのプローブを用いて常法によ り行 う。 DNA の精製は、 自動 DNA 精製ロ ボッ ト （ク ボタ製） を用い る。 こ う して ES細胞ク ローン中で、 目 的とする ノ ッ クア ウ トが 起こっている こ と が確認される。 こ の ES細胞ク ロー ンを下記に 述べる ノ ッ ク ァ ゥ トマ ウ ス の作製に用いる。
( 4 ) ノ ッ ク ア ウ トマ ウスの作製
前記で得たマ ウス ADSE をコー ドする 内在性遺伝子が相同組 換えによ り 不活性化 （ノ ッ ク ァ ゥ ト） された ES細胞ク ローンの 各々 を、 C57BL6マ ウス （日本チャールズ リ バ一製） の雄雌を交 配して得た胚盤胞に 1 胚あた り 1 5 個ずつ注入 （マイ ク ロイ ン ジェク ショ ン）する。注入直後に、偽妊娠処理してから 2.5 日 目 の仮親 ICR マ ウス （ B本ク レア製） の子宫に子宮の片側あた り 約 1 0個ずつの 胚盤胞を移植する。 こ う して、 各々 の ES 細胞 ク ローンについて、 ノ ッ ク ァ ゥ ト キメ ラマ ウス を得る。 次いで 得られた各々 のキメ ラマ ウスを正常 C57BL6マ ウス と 交配 し、 ES 細胞由来の毛色遺伝子によ るァグーチ （ agouti ) 色のマ ウスを 得る。
実施例 5 ATAC-PCR を用いた発現プロ フ ァ イ ルの解析
Adaptor-tagged competitive PGR ( ATAC-PCR) は外部機関へ 委託し、 Katoらの方法に従つて行つた（Nucleic Acids Research, 1997, Vol.25, 4694— 4696) 。 また角爭析 ίこ用 Vヽた ヒ ト RNA fま以下 の通 り である。 ヒ ト冠動脈内皮細胞 （ HCAEC) 及び、 ヒ ト胎盤組 織から定法によ り total RNA を調製した。 また、 ヒ ト末梢血由 来白血球を 50 μ g/mlの PHA存在下で 24時間培養 した後に total RNA を定法によ り 調製 した。 さ らに ヒ ト の肺、 腎臓、 瞵臓、 小 腸、 胸腺、 脾臓、 心臓、 子宮、 精巣、 前立腺、 骨格筋の total RNA をク ローンテ ッ ク社よ り 、 肝臓、 大腸、 白血球、 脳の total RNA については BioChain Institute よ り 購入した。 次に、 これら各 total RNA よ り オ リ ゴ dT プライマーを用レヽて 1 本鎖 cDNA の 合 成 を 定 法 に 従 っ て 行 っ た 。 逆 転 写 酵 素 と し て は SuperSc iptllRNase H一 Reverse Transcriptase ( Invitrogen 社） を用いた。 また、 PCR に用いた adse特異的なプライマーの 配列は 5' - TGT TGC TGT TCC TAT ACC TG 一 3'である。 解析結 果を第 4図に示す。
発明の効果
本発明の ADSE は、 動脈硬化症の発症あるいは進行に対 してそ の原因 と な り 得る蛋 白質であ り 、これ ら疾患の予防あるいは治 療のための医薬品の開発において、極めて有用である。 また、 SR が細胞内に発生 した種々 ス ト レス に対 して防御的に作用する こ と から も、細胞内に生 じたス ト レス 、 異物あるいは変性蛋白に起 因する病的症状や疾患に対する医薬の開発にも有用である と期 待される。
また、 遺伝子 a ds e は、 ア ンチセ ンス医薬品 と して、 また遺伝 子治療において利用する こ と ができ、 蛋白質 ADSE は、 それ自体 あるいはそ の可溶性断片 （細胞外領域や各 ド メ イ ン） を作製す る こ と によ り 可溶性蛋白医薬品 と して有用である。 さ らに、 ADSE またはその断片に反応性を有する抗体及びその抗体の一部は、 生体内での ADSE機能を制御する抗体医薬品 と して有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の （ a ) または （ b ) の DNA ；
( a ) 配列番号 ： 1 に記載の塩基配列からなる DNA ；
( ) 配列番号 ： 1 の DNA と ス ト リ ンジェ ン トな条件でハイブ リ ダイ ズし、 かつス カベンジャー受容体様蛋白質を コー ドする DNA。
2 . 請求項 1 に記載の DNA にコー ドされる蛋白質。
3 . 以下の （ a ) または （ b ) の蛋白質 ；
( a ) 配列番号 ： 2 に記載のア ミ ノ 酸配列からなる蛋白質 ； ( ) 配列番号 ： 2 のア ミ ノ 酸配列においてア ミ ノ 酸が欠失、 置換も しく は付加されたア ミ ノ 酸配列から なるス カベンジャー 受容体様蛋白質。
4 . 請求項 1 に記載の DNA を含む組換えベク ター。
5 . 請求項 4 に記載の組換えベク ターに よ り 形質転換された 形質転換細胞。
6 . 請求項 2 または請求項 3 に記載の蛋白質の発現を抑制す るア ンチセ ンス核酸。
7 . 塩基配列が、 請求項 1 に記載の DNA の核酸の全部または 一部に相捕する配列であ る、 請求項 6 に記載のア ンチセ ンス核 酸。
8 . 請求項 2 または請求項 3 に記載の蛋白質も し く はその部 分べプチ ドに対する抗体。
9 . 請求項 2 または請求項 3 に記載の蛋白質ある いは該蛋白 質を発現している形質転換細胞と被験物質と を接触 させる こ と を特徴とする、 該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
1 0 . 請求項 4 に記載の組換えベク ターまたは請求項 5 に記 載の形質転換細胞 と披験物質と を接触させる こ と を特徴とする 請求項 1 記載の DNAの発現調節作用を示す物質の検索方法。
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