WO2002059305A1 - Procede de detection d'un facteur etiologique d'asthme - Google Patents

Procede de detection d'un facteur etiologique d'asthme Download PDF

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WO2002059305A1
WO2002059305A1 PCT/JP2002/000540 JP0200540W WO02059305A1 WO 2002059305 A1 WO2002059305 A1 WO 2002059305A1 JP 0200540 W JP0200540 W JP 0200540W WO 02059305 A1 WO02059305 A1 WO 02059305A1
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mutation
bronchial asthma
gene
human
detecting
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PCT/JP2002/000540
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Yusuke Nakamura
Mayumi Tamari
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a novel polymorphism involving a mutation in a gene associated with human bronchial asthma and a technique for detecting the same. More specifically, the present invention particularly relates to a method for detecting a gene polymorphism associated with a risk factor for the development of childhood bronchial asthma, an oligonucleotide used for the detection method, and a kit for detection.
  • bronchial asthma clinically characterized by chronic reversible airway obstruction with wheezing, wheezing, and shortness of breath . It has been suggested that various genetic and environmental factors are involved in the pathogenesis of bronchial asthma (complex disease).
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • Haplotype analysis using multiple SNPs has also been shown to be useful in analyzing disease susceptibility in genetically complex diseases (eg, Stephens, J. C "et al., Am. Hum.
  • the present invention relates to polymorphisms of genes containing genetic mutations that have the potential to cause the onset of bronchial asthma in humans or to transmit the onset of bronchial asthma to future offspring in the future, that is, risk factors for developing bronchial asthma (mutations). It is a main object of the present invention to provide a means for detecting a gene), particularly a means for detecting the risk factor for developing bronchial asthma in children.
  • the present inventors have developed a combination of bronchial asthma, ischemic heart disease, and rheumatoid arthritis.
  • bronchial asthma we have begun screening single nucleotide polymorphisms that are genome-wide and correlate with disease susceptibility (Ohnishi, ⁇ ⁇ , et al "Hum. Genet., 106, 288-292 (2000); Unoki, M” et. a, Hum. Genet., 106, 440-446 (2000); Yamada, R., et a, Hum. Genet, 106, 293-297 (2000)).
  • the present inventors have found that a specific set of eight protypes, which is one set combining the above six single nucleotide polymorphisms, is particularly correlated with the development of childhood bronchial asthma. Therefore, analysis of these specific single nucleotide polymorphisms or haplotypes in a specimen can detect risk factors for the development of human bronchial asthma, particularly those for the development of bronchial asthma in children, and thus can predict and diagnose the development of human bronchial asthma. I found that it was possible. The present invention has been completed based on this knowledge.
  • the present invention provides a method for detecting a bronchial asthma onset risk factor shown in the following (1) to (11).
  • a method for detecting a polymorphism in a gene containing a mutation that has the potential to cause bronchial asthma onset in humans or congenitally transmit bronchial asthma onset to offspring of the human A method for detecting a bronchial asthma onset risk factor, comprising obtaining a nucleic acid containing a gene encoding human IKAP from a sample, and (b) determining the DNA sequence of the nucleic acid to detect a polymorphism in the human IKAP gene.
  • the polymorphism of the gene is the amino acid sequence of human IKAP of SEQ ID NO: 1 lie mutation of lie to Leu, 830th mutation of lie to Met, 1072th mutation of Cys to Ser.
  • the method for detecting a bronchial asthma development risk factor according to the above (1) which is accompanied by at least one kind of amino acid mutation selected from the group consisting of mutation and mutation of Pro at position 1158 to Leu.
  • the polymorphism of the gene is 1072 of the amino acid sequence number of the human HKAP of SEQ ID NO: 1.
  • the polymorphism of the gene is associated with mutation of the 1072nd Cys of the amino acid sequence number of human IKAP of SEQ ID NO: 1 to Ser, and the risk factor for the development of adult bronchial asthma according to (5) above. Detection method.
  • the polymorphism of the gene is the mutation of the coding region of the human IKAP gene described in SEQ ID NO: 2 at position 819 at C, at position 2295 at G, and at position 2446 at C At least one nucleic acid mutation selected from the group consisting of mutation of A to G at position 2490, mutation of T to A at position 3214, and mutation of C to T at position 3473.
  • the method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma according to the above (1).
  • the nucleic acids at positions 819, 2295, 2446 and 2490 of the coding region of the HKAP gene described in SEQ ID NO: 2 are D, G, A and A, respectively, and The method for detecting a childhood bronchial asthma development risk factor according to the above (2), wherein the method detects a TGAAAT haplo evening having a mutation and a mutation of the 3473rd C to T.
  • Gene polymorphism detection can be performed by direct nucleotide sequencing, PCR-allele-specific oligonucleotide (ASO) and dot blot hybridization analysis, single-base extension, PGR-single-stranded higher order According to the above (1), which is performed by a method including at least one selected from the group consisting of structural polymorphism (SSCP) analysis, PCR-RFLP analysis, invader method, and quantitative real-time PCR detection method (TaqMan method). The method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma described above.
  • SSCP structural polymorphism
  • PCR-RFLP analysis PCR-RFLP analysis
  • invader method invader method
  • TaqMan method quantitative real-time PCR detection method
  • the present invention provides a method for detecting the gene mutation, wherein the PCR- (DGGE) method,
  • the method described above is performed by a method including at least one selected from the group consisting of a PCR-DGGE / GC-clamp method, a PCR-SSO method, a fluorescence in situ hybridization (FISH) method, a Southern plot method, and an RNase-protected Atsey method. Also provided is a method for detecting a bronchial asthma onset risk factor described in 1).
  • the present invention also provides an oligonucleotide, a kit for detection, and a human IKAP gene having a mutation, which are used in the method for detecting a bronchial asthma onset risk factor of the present invention, as shown in the following (11) to (17).
  • the detection kit for a method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma according to (1) comprising the oligonucleotide according to (11) or (12) as an active ingredient.
  • a human HKAP gene having at least one nucleic acid mutation selected from the group consisting of a mutation of G to G, a mutation of T at position 3214 to A, and a mutation of C at position 3473 to T.
  • the nucleic acids at positions 819, 2295, 2446 and 2490 of the coding region of the human IKAP gene set forth in SEQ ID NO: 2 are D, G, A and A, respectively, and the T The human IKAP gene, which is a TGAAAT octuple with a mutation and a mutation at the 3473rd C.
  • the number of the nucleic acid in the coding region of the human HKAP gene shown in this specification Is the IKAP cDNA sequence information shown in SEQ ID NO: 2 (GenBank accession number
  • sequence information described in AF044195 was partially modified with reference to the major alleles of the Japanese population), and the start codon of the coding region, A in ATG, was taken as the first position 3 'downstream.
  • the amino acid sequence number shall be counted continuously toward the C-terminal side with the Met encoded by the ATG as the first. .
  • the term “gene” includes not only double-stranded DNA but also each single-stranded DNA (sense strand and antisense strand) constituting the same. That is, unless otherwise specified, the present invention gene (DNA) is a double-stranded DNA containing human genomic DNA, a single-stranded DNA (sense strand) containing cDNA, a single-stranded DNA having a sequence complementary to the sense strand. Includes DNA and fragments thereof. Further, the gene (DNA) can include a regulatory region, a code region, exons and introns. Polynucleotide includes RNA and DNA. DNA includes cDNA, genomic DNA and synthetic
  • Polypeptides include fragments, homologues, derivatives and variants thereof.
  • mutants include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, modified (deletion, substitution, addition and insertion) variants and substantially the functions of the encoded polypeptide.
  • the amino acid sequence may be altered in nature by, for example, mutation or post-translational modification, and may be artificially performed using a naturally-occurring gene.
  • SNP Single nucleotide polymorphism
  • SNPs Single nucleotide polymorphism
  • the haplotype indicates the type of the mutation (SNPs) represented by the type and number of alleles at a plurality of mutation sites in a continuous gene region or a group of genes. Specific examples thereof will be described in Examples below.
  • the present invention relates to polymorphisms containing mutations at specific positions in the coding region of the iKAP gene, particularly SNPs, which are strongly correlated with human bronchial asthma disease susceptibility. If bronchial asthma, especially childhood bronchial asthma It has been completed based on the discovery that the disease can be predicted and diagnosed.
  • the detection method according to the present invention requires detection of these polymorphisms, that is, SNPs and eight prototypes, in a sample.
  • SNPs that are detected and analyzed by the method of the present invention and that contain a genetic mutation that has the potential to cause bronchial asthma onset in humans or congenitally transmit bronchial asthma onset to human offspring (i.e. The following are examples of the bronchial asthma development risk factor).
  • the human IKAP gene is a gene having a total length of 4803 bases, reported by Cohen et al. As GenBank Accession No. AF044195.
  • FIG. 1 shows an outline of the gene and specific examples of gene polymorphisms (SNPs) detected by the detection method of the present invention.
  • the IKAP gene is represented by five WD (Trp-Asp) -like repeats represented by five numbers 1-5, an NF- ⁇ -induced kinase binding site (NIK binding site), and an I ⁇ kinase- ⁇ It has a binding site (IKK binding site), an IKK-3 binding site (IKK 3 binding site) and a serine-rich domain (denoted as Ser in the figure).
  • the coding region of the gene is from position 304 to position 4299 (having a termination codon tga at positions 4300-4302) of SEQ ID NO: 2 shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence encoded thereby is represented by SEQ ID NO: 1. It consists of the 1332 amino acids shown.
  • the IKAP gene is mapped on chromosome 9q34 (Cohen, L, et a, Nature, 395 (6699), 292-296 (1998).
  • T819C Leu273Leu
  • G2295A Gly765Gly
  • G2295A Gly765Gly is displayed as G2295A Gly765Gly
  • A2446C (lle816Leu) is displayed as A2446C lle816Leu, and A2490G (lle830Met) is displayed
  • A2490Glle830Met is displayed, T3214A (Cys1072Ser) is displayed as T3214A Cys1072Ser, and C3473T (Pra1158Leu) is displayed as C3473T Pro1158Leu.
  • SNPs shown above the bar indicating the IKAP gene are synonymous substitutions (those that do not change the sequence of the protein product), and SNPs shown below the bar indicate missense substitutions of the protein. is there.
  • T to A at position 3214 (T3214A (Cys1072Ser)), which is one SNP strongly associated with bronchial asthma, is located in the ⁇ and IKK / 3 binding domains, and The ⁇ mutation [C3473T (Pro1158Leu)] is located in the region encoding the serine-rich domain.
  • a mutated IKAP gene (SNPs and octatype) can be detected. It provides extremely useful information and tools for elucidating, understanding, diagnosing, preventing, and treating risk factors.
  • the polymorphism of the IKAP gene of the present invention provides extremely useful information and tools for elucidating, understanding, diagnosing, preventing, and treating risk factors.
  • SNPs and octatype detection methods are also useful in the development of new drugs that may be useful in the treatment or treatment of bronchial asthma, such as drugs targeting the site of action of the polymorphic site in the IKAP gene . Further, the detection of the gene polymorphism or octatype of the present invention in an individual or tissue is useful for elucidation of bronchial asthma, particularly childhood bronchial asthma, and early diagnosis before asthma onset.
  • a human IKAP gene polymorphism having at least one selected amino acid mutation can be exemplified.
  • SNPs include: a mutation from T to C at position 819, a mutation from G to A at position 2295, a mutation from A to C at position 2446 in the coding region of the human iKAP gene, The A to G mutation, the 3214 T to A mutation, and the 3473 C mutation And human T gene polymorphisms having at least one nucleic acid mutation selected from the group consisting of T to T mutations.
  • the human gene of the present invention includes those having the DNA sequence of the human gene polymorphism exemplified above and those having the complementary strand of those DNA sequences.
  • Examples of the human ⁇ gene (haplotype) having a mutation include a haplotype typified by six specific nucleic acids of the ⁇ gene. Specific examples thereof are as shown in Examples below. Table 1 below shows examples of major haplotypes.
  • the nucleic acids 819, 2295, 2446 and 2490 of the coding region of the HKAP gene are T, G, A and A, respectively, and the nucleic acid T at position 3214 is mutated to A and 3473.
  • the TGAAAT octatype having a mutation of the nucleic acid C to T of the present invention can be exemplified as a preferable one showing particularly strong association with pediatric bronchial asthma.
  • the IKAP gene (SNPs and octaprotype) of the present invention is the present invention disclosed by the present invention. It can be easily produced and obtained by general genetic engineering techniques based on the specific sequence information of the invention gene [Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab.
  • cDNA or genomic DNA is extracted from a human having SNPs or a haplotype of the IKAP gene (a human who has not developed bronchial asthma) or a patient with bronchial asthma in accordance with a conventional method, and a modification specific to the IKAP gene of the present invention is extracted.
  • the IJAP gene of the present invention can be obtained by selecting a clone containing the desired gene using an appropriate probe containing the difference, a restriction enzyme, an antibody or the like. The selection of the above clones can be carried out according to a conventional method (see, for example, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)).
  • examples of the origin of cDNA or genomic DNA include various human cells and tissues having the IKAP gene (SNPs) of the present invention, cultured cells derived therefrom, and the like.
  • Specific examples include body fluids such as blood such as serum or plasma, saliva, lymph, airway mucus, urine, and semen. From these source materials
  • RNA libraries are commercially available, and in the present invention, those cDNA libraries, for example, various cDNA libraries commercially available from Clontech Lab. it can.
  • the method for screening the gene of the present invention from a cDNA library is not particularly limited, either, and ordinary methods can be followed. Specifically, a probe containing a mutated portion that can selectively bind to the DNA sequence of the desired SNPs or haplotype is prepared, and plaque hybridization, colony hybridization, etc. are performed using this probe. Or a combination thereof.
  • a forward primer and a reverse primer set based on the nucleotide sequence information of the gene of the present invention can be used. These can be synthesized according to a conventional method, for example, using an automatic synthesizer.
  • the screening probe is usually a labeled probe, but may be an unlabeled probe as long as it can specifically bind directly or indirectly to the labeled ligand.
  • Probe and ligand labeling agents and methods are already well known in the art. Examples of labeling methods include known methods such as nick * translation, random priming or kinase treatment. Can be mentioned.
  • the labeling agent include a radiolabeling agent, a biotin, a fluorescent dye, a chemiluminescent agent, an enzyme such as luciferase, an antibody, etc., which can be incorporated by these various methods.
  • the extracted gene or mRNA can be amplified by a gene amplification method.
  • detection in the detection method of the present invention can be more easily and accurately performed.
  • the gene amplification method include the PCR method (Saiki, R. ⁇ ⁇ , Bugawan, T.L., et al., Nature, 324, 163-166 (1986)) and the NASBA method (Comptom, J., Nature, 650, 91-92 (1991)), TMA method (Kacian, D. Shi., And Fultz, TJ, U.S. Pat. No. 5,399,491 (1995)), SDA method (Walker, GT, Little, MC, et al.) Natl. Acad. Sci "USA, 89, 392-396 (1992)).
  • the isolation and purification of the gene fragment amplified by the PCR method or the like can be performed according to a conventional method, for example, by gel electrophoresis. It can also be purified using a column. The isolated and purified gene fragment can be confirmed, for example, by mass spectrometry.
  • the gene fragment amplified by these methods is used for the detection of the IKAP gene (SNPs or octatype) according to the present invention, depending on the characteristics of the amplified product.
  • a preferable example of the specimen is DNA or genomic DNA derived from a human who has developed or is likely to develop bronchial asthma.
  • a sample can be prepared by extracting from tissues and cells of a bronchial asthma patient, preferably blood, target tissue cells and the like, according to a conventional method.
  • the detection of the IKAP gene is commonly used to determine the sequence of this type of gene, such as the dideoxy method (Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463). -5467 (1977)) and the Maxam-Gilbert method [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)].
  • the method can be carried out according to a method in which these methods are combined with a DNA amplification method such as a PCR method.
  • a DNA amplification method such as a PCR method.
  • a combination of the PCR method or a DNA amplification method The method is preferred from the viewpoint that simple and easy detection using a small amount of a DNA sample can be performed with high sensitivity and accuracy.
  • This preferred method is most basic, for example, by cloning a gene fragment (specimen) amplified by a PCR method into a plasmid, and then directly sequencing the nucleotide sequence according to the dideoxy method, the Maxam-Gilbert method, or the like. It can be carried out simply by determining the nucleotide sequence using a commercially available sequence kit or the like. Thus, it is possible to determine the presence of the aforementioned mutation at the specific site in the coding region of the HKAP gene, and to determine its haplotype.
  • the DNA fragment (specimen) to be amplified by the PCR method or the like is not particularly limited as long as it contains at least one of the specific sites where the above-mentioned mutation is assumed to be present.
  • the sample should have a length of about 50 to several thousand bases, preferably 50 to several hundred bases. Further, it is preferable that at least all of the mutated portions are included.
  • an allele-specific oligonucleotide As an alternative to the detection method of the present invention, an allele-specific oligonucleotide
  • the detection of the polymorphism (SNPs or haplotypes) of the IKAP gene of the present invention is carried out using a single-base extension method such as a snapshot method, a pyrosequence method, and a point mutation detection method disclosed in JP-A-2000-279197. You can also. In these cases, a probe set to correspond to the base immediately before or several bases before the target mutation (SNP), that is, its 3 'end is set one base upstream or near the mutation to be detected Can be performed by annealing the probe to the DNA sample. You.
  • Each of the above methods can be carried out using a commercially available kit for detecting SNPs and software attached to the kit.
  • the snapshot method is ABI PRISM SNaPshot ddNTP Primer
  • Detection and analysis can be performed using Analyzer (both manufactured by ABI Biosystems) and GeneScan software.
  • the pyrosequencing method can be performed, for example, as follows. Isolate genomic DNA from blood samples, etc. by conventional methods, PCR-amplify tens to hundreds of bases containing mutations using a primer labeled with biotin, and purify single-stranded DNA using magnet peas Then, use this purified DNA as a sample. The sample is annealed with a primer set to sequence from several bases upstream of the desired mutation, and then dNTPs are added to the device one by one according to the sequence near the mutation input to the software.
  • DNA polymerase base-extends When DNA polymerase base-extends, it generates pyrophosphate ( ⁇ ), so the PPi is returned to ⁇ ⁇ ⁇ by sulfurylase, and this is used as a substrate for luciferase, using a luminescence detector, a CCD camera, etc. to perform chemiluminescence. Is detected.
  • a luminescence detector a CCD camera, etc.
  • gene typing becomes possible by analyzing the luminescence peak obtained in response to the added dNTP.
  • Using this method has the advantage that 96 samples can be typed in about 15 minutes.
  • the reagents and the equipment are those usually used, for example, a mixture of four kinds of enzymes, DNA polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase and apyfase; luciferin and APS (adenosine 5'-sulfate phosphate) Substrate solution; commercially available SNP Reagent Kits consisting of dATP (doxyadenosine ⁇ -thio 'triphosphate), dCTP, dNTP consisting of dGTP and cTTTP
  • PSQ96 system (Pyrosequencing AB) and SNP software (Pyrosequencing AB) for its use can be used.
  • the above pyrosequencing method involves, as described in, for example, US Pat. No. 6,159,693, isolating a nucleic acid, amplifying the nucleic acid, purifying the amplified PCR product, and then reading the READIT TM System
  • the reaction can also be carried out by reacting pyrophosphoric acid with this using Promega Corporation (manufactured by Promega Corporation) and analyzing the resulting data.
  • Promega Corporation manufactured by Promega Corporation
  • Excel analysis using commercially available READIT technology promega corporation
  • the detection method of the present invention includes a PCR-SSCP method (non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis of the above-mentioned PCR amplification product (single-stranded DNA) and discriminating the presence or absence of a single base mutation based on the difference in mobility. Orita, M., Iwahara, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 2776-2770 (1989)).
  • the detection is carried out by restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP method: Botstein, DR, et a, Am. J. Hum. Gen., 32, 314-331 (1980)).
  • RFLP method Botstein, DR, et a, Am. J. Hum. Gen., 32, 314-331 (1980)
  • this mutation is located in the region of the human IKAP gene at positions 3468-3473 in the nucleotide sequence.
  • Specific cleavage site of restriction enzyme Nla IV is located in the region of the human IKAP gene at positions 3468-3473 in the nucleotide sequence.
  • GGNNCC can be detected by the RFLP method.
  • the RFLP method can be carried out using various known restriction enzymes capable of recognizing the sequence before and after each target mutation site.
  • a specific example thereof is, for example, Nla IV.
  • the RFLP method is more preferably a PCR-RFLP method, i.e., a method in which a sample DNA is amplified and prepared in advance by the PCR method or a modification thereof, and then the RFLP method is performed on a large amount of the prepared and concentrated sample DNA. Can be. Thus, the presence or absence of a specific cleavage site can be detected.
  • Detection of SNPs or haplotypes of the IKAP gene of the present invention by the PCR-RFLP method is specifically performed, for example, according to the following method. That is, first, DNA of the IKAP gene is extracted from a human biological sample, and a DNA fragment of several tens to several hundreds of bases including the position of nucleotide sequence No. 3473 in the coding region of the gene is amplified, and the DNA fragment is abundantly concentrated. Inspection Obtain a body sample. Next, this sample is digested with the restriction enzyme Nla IV, and the DNA cleavage mode (presence / absence of cleavage, base length of the digested fragment, etc.) is confirmed in a usual manner. A sample having a desired mutation (C3473T (Pro1158Leu)) generates two fragments by the above-mentioned Nla IV digestion, but a sample without this mutation does not generate such a fragment. it can.
  • C3473T Pro1158Leu
  • Detection of SNPs or octaprototypes of the IKAP gene of the present invention can also be carried out by the Invader method shown below.
  • This method does not require amplification of the target DNA in advance to analyze SNPs of genomic DNA, and is performed, for example, as follows.
  • genomic DNA is first isolated, and then a 5 'flap consisting of 15 to 50 bases and a 3' end of the 5 'flap are placed.
  • a first target probe consisting of an oligonucleotide of up to several hundred bases synthesized to complement the target genomic DNA except for the mutant nucleic acid having the nucleic acid to be detected (SNP in the present invention), and the nucleic acid to be detected Invaders, oligonucleotides, and probes consisting of oligonucleotides of 15 to several tens bases in length synthesized to complement the target genomic DNA except that a nucleic acid complementary to Combine.
  • An isolated genomic DNA and an enzyme that cleaves the 5 ′ flap of the first probe are simultaneously added to these probes and reacted in an appropriate reaction solution. 'If the genomic DNA in the sample has the desired mutant nucleic acid (the desired SNP), the first reaction to release the 5' flap having the mutant nucleic acid at the 3 'end is terminated. If the sample does not have a genomic DNA mutant nucleic acid sequence, cleavage by the restriction enzyme does not occur.
  • the 5 'flap released from the first probe cleaved with the restriction enzyme was targeted.
  • FRET fluorescent resonance energy transfer
  • the 3 'end of the 5' flap invades into the FRET probe.
  • a reaction by the restriction enzyme occurs, releasing the fluorescent dye.
  • each FRET probe used in the second reaction is constructed to consist of the following two elements: (1) a 3 'region that is complementary to the product cleaved from the first reaction, (2) —to mimic a single-stranded probe Self-complementary regions that form duplexes and where the targets hybridize together and they contain a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye.
  • the reporter fluorescent dye When the reporter fluorescent dye is bound to the same probe as the quencher fluorescent dye, the fluorescence intensity is suppressed by fluorescence resonance energy transfer. When the quencher is not bound to the same probe as the fluorescent dye, the fluorescence intensity is not suppressed.
  • the 5 'flap released from the cleaved first probe hybridizes to the FRET probe, it acts as an invader-oligonucleotide probe in the second reaction, and the invading complex recognized by the restriction enzyme To produce
  • restriction enzyme cleavage of the FRET probe separates the two fluorochromes and produces a detectable fluorescent signal. In this manner, the product can be read and detected by the standard fluorescence microplate reader.
  • the signal can be amplified from 1 to 1 ⁇ 10 6 times by the combination of the above first and second reactions.
  • the presence or absence of desired SNPs or haplotypes can be detected by the Invader-Atsey method.
  • the detection of the IKAP gene polymorphism of the present invention is performed by a quantitative real-time PCR
  • the method can be performed as follows. First, a DNA fragment containing a mutant nucleic acid site for detecting the presence or absence of a target mutation is prepared using a forward primer consisting of 15 to 39 bases and a reverse primer. Then, the presence of the target mutation is detected between the forward primer and the reverse primer. Mutated nucleic acid sites for Then, the reporter fluorescent dye and the quencher fluorescent dye are bound to an oligonucleotide having a base sequence of 15 to 50 bases, and the region where the forward primer hybridizes and the region where the probe hybridizes overlap each other. Create a probe that selects a combination that will not result in a collision.
  • the probe is prepared so as to have a sequence complementary to an allele-specific sequence for detecting the presence or absence of a desired single nucleotide nucleic acid mutation.
  • RT-PCR reverse transcription PCR
  • a reporter fluorescent colorant used in the above-mentioned Invader-Assy method and TaqMan method is preferable.
  • the quencher fluorescent dye a rhodamine-based fluorescent dye such as TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) is preferable.
  • the binding positions of the reporter fluorescent dye and the quencher fluorescent dye are not limited, but usually, the reporter fluorescent dye is bound to one end (preferably the 5 'end) of the oligonucleotide as a probe, and the quencher fluorescent dye is bound to the other end.
  • Methods for binding a fluorescent dye to an oligonucleotide are known, for example, Noble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12: 3387-3403 and Lyer et al "(1990) J. Am. Chem. Soc. . 112: 1253-1254.
  • the PCR method itself is known, and devices and kits for the PCR method are commercially available. Therefore, such a commercially available device and kit can be used in the detection method of the present invention.
  • the detection method of the present invention employing the real-time detection PCR method can be performed, for example, according to the method described in Japanese Patent No. 2825976, or according to the ABI PRISM 7700 sequencing system user manual manufactured by PE Biosystems.
  • the method can be carried out by the following various methods known as a method for determining the base sequence of DNA and a method for detecting mutation.
  • PCR-DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
  • PCR-DGGE / GC clamp method (Shefield, VC, et al "Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 232-236 (1989)); In addition to the PCR-DGGE method, GC content This method compensates for the shortcomings of detection when there are multiple base substitutions, deletions, additions, and insertions by connecting a region having a high degree of mutation to a DNA fragment from which a mutant nucleic acid is to be detected. Requires the step of adding a GC clamp to the DNA fragment.
  • a polymorphism containing a genetic mutation having a possibility of causing bronchial asthma or congenitally transmitting bronchial asthma to offspring, that is, the presence of a bronchial asthma development risk factor can be detected.
  • detection of the TGAAAT octaprototype of the HKAP gene according to the present invention is effective for detecting the presence of a risk factor for the development of human childhood bronchial asthma. Early detection of risk factors is possible.
  • the primer or probe used in the PCR method can specifically amplify only a region containing a mutated portion (SNPs or haplotype) in the gene of the present invention.
  • SNPs or haplotype a mutated portion
  • This synthesis and construction can be carried out according to a chemical synthesis method such as the phosphoramidite method or the phosphoric acid triester method.
  • the desired primers and probes can also be synthesized using a commercially available automatic oligonucleotide synthesizer such as (Pharmacia LKB Gene Assembler Plus: manufactured by Pharmacia).
  • a commercially available automatic oligonucleotide synthesizer such as (Pharmacia LKB Gene Assembler Plus: manufactured by Pharmacia).
  • each complementary strand is synthesized and annealed under appropriate conditions, or the complementary strand is added to the chemically synthesized single-stranded product using an appropriate primer sequence and DNA polymerase. It can be obtained by doing.
  • the nucleotide sequences used as primers and probes include those having at least 10 contiguous bases, usually about .10-35 bases in length.
  • a primer having a nucleotide sequence designed and synthesized so as to sandwich the SNP of the haplotype sequence of the gene of the present invention is used.
  • a probe a positive clone containing the above nucleotide sequence was used. It can be used as such.
  • Suitable nucleotides used as probes or primers include mutations in which the T at position 819 in the coding region of the human IKAP gene has been mutated to C, mutations in which the G at position 2295 has been mutated to A, and A in which position 2446 has been mutated to C.
  • a partial nucleotide corresponding to the obtained DNA having at least 10, and more preferably at least 15 consecutive nucleotides.
  • the present invention also provides a DNA fragment used as a specific primer and / or a specific probe for detecting SNPs or haplotypes of the IKAP gene.
  • Specific examples thereof include forward primers and reverse primers of SEQ ID NOS: 19 to 30 shown in Examples described later, and allele-specific oligonucleotides and probes shown by SEQ ID NOS: 30 to 36. .
  • the method of the present invention detects a polymorphism in the IKAP gene as a risk factor for the development of bronchial asthma, in particular, a risk factor for the development of bronchial asthma in children.
  • T819C Leu273Leu
  • a gene-specific probe for detection a gene-specific probe for detection
  • the gene of the present invention also includes such a gene-specific probe for detection.
  • probes for detecting bronchial asthma in children are preferably those capable of detecting any of the SNPs of T3214A (Cys1072Ser) and C3473T (Pro1158Leu) .
  • Probes for detection of adult bronchial asthma are preferred.
  • T3214A (Cys1072Ser) can be detected.
  • nucleic acids at positions 819, 2295, 2446 and 2490 in the coding region of the human IKAP gene are D, G, A and A, respectively, and A gene-specific probe prepared to detect a TGAAAT octatype consisting of a mutation in which the Tth is mutated to A and a mutation in which the 3473th C is mutated to ⁇ can be mentioned.
  • the detection method of the present invention can be carried out more easily by using a reagent kit for detecting SNPs of the human IKAP gene or TGAAAT haplotype of the human IKAP gene in a sample.
  • the present invention also provides such a kit for detection.
  • the kit of the present invention contains the following DNA fragments or restriction enzymes as its essential components.
  • the DNA fragment should be at least part or all of the nucleotide sequence of the DNA fragment of the six SNPs of the human IKAP gene or the TGAAAT octatype of the human IKAP gene or its complementary nucleotide sequence, or one nucleotide before or at the mutation site. It is a DNA fragment that hybridizes to a sequence consisting of the sequence before the base.
  • a restriction enzyme is a restriction enzyme that recognizes a nucleic acid sequence of several bases including a mutation site.
  • the kit of the present invention further comprises, for example, a labeling agent, a reagent essential for PCR (for example,
  • the labeling agent include a radioisotope or a chemical modifier such as a luminescent or fluorescent substance, and the DNA fragment itself may be conjugated in advance with the labeling agent.
  • the reagent kit may contain a reaction diluent, a standard antibody, a buffer, a detergent, a reaction stop solution, etc., which are suitable for the convenience of performing the measurement.
  • a polymorphism of a gene that may cause the onset of bronchial asthma in humans that is, a human bronchial asthma onset risk factor can be detected according to the method of the present invention.
  • a human bronchial asthma onset risk factor can be detected according to the method of the present invention.
  • adult or pediatric bronchial asthma can be detected. Therefore, the detection kit is also useful as a diagnostic agent or a diagnostic kit for a human bronchial asthma onset risk factor, particularly a diagnostic agent or a diagnostic kit for adult or pediatric bronchial asthma. Also provide.
  • the present invention provides a method for detecting a human bronchial asthma development risk factor, a detection kit, a primer or probe for mutation detection used therein, and a gene related to a human bronchial asthma development risk factor. provide. They are useful as a new means of detecting human bronchial asthma onset risk factors, particularly as a means of detecting bronchial asthma onset risk factors in children.
  • FIG. 1 is a drawing showing the positions of six SNPs of the IKAP gene. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the target patients were 235 outpatients with bronchial asthma in Osaka Prefecture Habikino Hospital.
  • Many of these patients have been diagnosed with atopic asthma.
  • Twenty percent of adult patients were atopic but had no serum IgE levels.
  • This adult bronchial asthma patient does not include those with a reported history of asthma as a child.
  • 372 healthy individuals were randomly selected from controls based on population ratio as controls.
  • Peripheral blood was collected from each of the above subjects and healthy subjects and used for the following tests.
  • CDNA was obtained from 51 of the healthy subjects, and genomic DNAs were prepared from all participants.
  • GenBank to screen the entire coding region of human IKAP cDNA (accession number AF044195)
  • Each PCR reaction was performed with 40 ng of the mixed cDNA of the three samples (the method of sequencing the cDNAs of three individuals in one tube).
  • the 50 I reaction is
  • dNTPs 25 mM
  • magnesium chloride (6.68 mM)
  • 16.6 mM ammonium sulfate 6.7 mM Tris-HCl (pH 8.8)
  • 10 mM] 3-mercaptoethanol was included.
  • Each sample was amplified by GeneAmpPCR System 9600 (manufactured by PE Applied Biosystems).
  • SNPs Gene polymorphisms
  • Polyfreded program Polyphred program: ABI Prism 377 DNA autosequencer: manufactured by PE Applied Biosystems, Inc.
  • Nickerson, DA et al., Nucleic Acids Res., 25, 2745-2751 (1997)).
  • PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis was performed on the same material, and the 3473rd C of the IKAP gene was analyzed. The T to T mutation was identified.
  • each reaction mixture used was 10 PGR product, 3 units of restriction enzyme Nla iV (1 UI; manufactured by BioLab Inc.), 2 l of 10X Buffer K (manufactured by Yukara) and 15 I 0.01% BSA (Yukara). After 1 hour incubation at 37, the reaction product is Electrophoresis was performed on a 2% agarose gel.
  • Leu ⁇ Leu at position 273 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene is a silent substitution located in the WD-like repeat sequence.
  • the amino acid mutation of lle ⁇ Leu at position 816 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene and the amino acid mutation of lle ⁇ Met at position 830 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene are located at the ⁇ binding site.
  • the amino acid mutation of Cys ⁇ Ser at position 1072 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene is located at the IKKo; / IKKi3 binding site, and the amino acid sequence of amino acid sequence encoded by the IKAP gene is 1158.
  • the second Pro ⁇ Leu mutation was located in the serine 'rich domain. Two of these polymorphisms were silent substitutions, while the four nonsynonymous substitutions were missense mutations in the protein product.
  • Haplotype analysis was performed on 207 controls from the general population, 235 pediatric patients with bronchial asthma and 90 adult bronchial asthma patients using the ARLEQUiN software version 2.0 based on maximum likelihood method (Anthropology, University of Zienepa, Genetics, Switzerland). ⁇ Biometrics Laboratory: Genetics and Biometry Laboratory, Department of Philosophy, University of Geneva, Geneva). Bronchial asthma patients The difference in haplotype frequency between and control was evaluated by the chi-square test. At this time, one haplotype was compared with another haplotype, and the degree of freedom was 1. The ⁇ values were corrected by multiplying the number of eight prototypes compared (Bonferroni correction).
  • gene polymorphisms detected according to the method of the present invention were analyzed in 235 pediatric bronchial asthma samples and 270 adult bronchial asthma samples, along with 372 controls. The results are as follows.
  • bronchial asthma patients were divided into two groups according to the age of onset of asthma: children under the age of 18 (children) and children over the age of 18 (adults). Groups younger than 18 years were represented by atopic bronchial asthma, and those older than 18 years were more likely to have non-atopic bronchial asthma.
  • SNPs of the IKAP gene for bronchial asthma phenotype it was confirmed that all six SNPs detected followed the Hardy-Weinberg equilibrium rule in the control group.
  • Table 3 shows the results of examining whether linkage disequilibrium holds between these SNPs.
  • SNPs were in linkage disequilibrium with each other as shown in Table 3.
  • SNP in which the 2295th G of the IKAP gene was mutated to A and the 2490th A of which was mutated to G SNPs G2295A and A2490G
  • Table 4 shows the results of genotyping the above six SNPs.
  • the T3214A (Cys1072Ser) allele was also associated with the development of popular bronchial asthma
  • P is the value corrected by the number of haplotypes compared (Bonferroni's correction).
  • this TGAAAT haplotype is more frequently observed in the control group, and can be considered as an allele that is protective or resistant to onset of asthma. Also, since this octatype is associated with two amino acid substitutions in the I-KAP ⁇ -binding domain and the serine-rich domain, this type of allele promotes or suppresses NF-B signaling. Or alter the function of protein as a constituent protein.

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Description

明 細 書
気管支喘息発症危険因子の検出方法
技 術 分 野
本発明は、 ヒト気管支喘息に関連する遺伝子の変異を伴う新規な多型とその検 出技術に関する。 より詳しくは、 本発明は、 特に小児気管支喘息発症の危険因子 に関連する遺伝子の多型を検出する方法と、 該検出方法に利用するオリゴヌクレ ォチドおよび検出用キッ卜に関する。
背 景 技 術
現在、 日本人成人の約 3%および子供の約 6%は、 喘鳴、 晐、 息切れなどを伴 う慢性の可逆的気道閉塞によって臨床的に特徴付けられる気管支喘息に罹患して いるといわれている。 この気管支喘息 （複合疾患） の病因には、 種々の遺伝因子 と環境因子が複雑に関与することが示唆されている。
気管支喘息の病因に関与する遺伝的素因を解析するために、 これまで多くの研 究者が、 DNA多型マーカーを用いて、 連鎖解析および患者対照関連解析を実施 してきた。 例えば、 マニアン (Manian)は、 第 11染色体におけるアトピーとの連 .. 鎖および第 5染色体長腕と第 12染色体長腕におけるアトピーと気道過敏性との 連鎖について総説を述べている（Manian, P., Chest, 112, 1397-1407(1997)) 0 他 の研究者らも、 下記に示すような各種因子における遺伝子多型が、 気管支喘息の 発症に相関する旨を報告している。
(1) )32アドレノレセプター (Hopes, E" et al.， Β. Μ· J., 316, 664(1998))、 (2)腫 壊死因子 (tumor necrosis factor: TNF; Moffatt, et al.， M.F., Cookson, W.O., Hum. Molec. Genet, 6(4) 551-554 (1997))、 (3)血小板活性化因子
(platelet-activating factor; Stafforini.D.M. et aに，丄 Clin. Invest., 103, 989-997
(1999)、 （4)顆粒球/マク口ファージ-コロニ一刺激因予
(granulocyte/macrophage-colony stimulating factor; Rohrbach, Μ·， et aに J.
Allergy Clin. Immunol. 104, (1) 247-248(1999))、 (5)ィン夕一ロイキン- 4レセプ 夕一 (interieukin-4 receptor; Ober, C, et ai., Am. J. Hum. Genet, 66， 517-526
(2000) ) o
これまで行われた喘息とアトピー感受性に対する全ゲノムスクリーニングは、 気管支喘息の発症に相関する幾つかの染色体上の候補領域を明らかにしてきた (前記 Manian(1997)参照)。 そのような候補遺伝子のひとつは第 9染色体長腕上に 位置している。 例えばジャスト (Wjst)らは、 ドイツおよびスウェーデンの 156兄 弟を含む 97家系、 415人で行った連鎖解析において、 第 9染色体長腕に、 喘息感 受性 (p=0.0073)との連鎖、 血清免疫グロブリン Eの上昇 (lgE;p=0.0098)との連鎖 および RAST(p=0.0025)との連鎖を見出している (Wist, M.F., et al., Genomics, 58， 1 -8 (1999))。 染色体 9q34に存在している IKAP遺伝子（ I κ )3関連蛋白（I κ β -associated Protein: IKAP)をコードする遺伝子)は、 この連鎖の見られた領域 に存在しており、 気管支喘息に関与する候補遺伝子であると考えられる。
ヒトゲノムにおいて、 一塩基多型 (Single nucleotide polymorphisms: SNPs)は、 最も利用頻度の高い遺伝子多型マーカーであり、 これまでに、 ありふれた疾患、 薬剤応答などに関連する遺伝子を解析する上で有用であることが示されている (例えば、 Brookes, A. J., Gene, 234， 177-186(1999); Cargill, M， et aに， Nature Genet., 22, 231-238 (1999); Evans, W. Ε·, & Re!ling, M. V.， Science, 286, 487-491 (1999)等参照)。 また、 複数の SNPsを用いたハプロタイプの解析が、 遺伝的に複雑な疾患における疾患感受性を解析する上で有用であることも示され ている (例えば、 Stephens, J. C" et al., Am.丄 Hum. Genet., 62, 1507-1515 (1998); Tishkoff, S. A., et al" Am. J. Hum. Genet., 67, 518-522 (2000)等参照)。 実際に、 アルツハイマー病および高血圧症のような疾患は、 この方法で既に集中 的にその関連遺伝子の解析がなされている (例えば、 Jeunemaitre, X., et al., Am. J. Hum. Genet., 60, 1448-1460 (1997); Martin, E. R.， Am. J. Hum. Genet., 67, 383-394 (2000)等参照)。
発 明 の 開 示
本発明は、 ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは将来子孫に先天 的に気管支喘息発症を伝達する可能性を有する遺伝的変異を含む遺伝子の多型、 即ち、 気管支喘息を発症する危険因子 (変異遺伝子)を検出する手段、 特に小児 における当該気管支喘息発症危険因子を検出する手段、 を提供することをその主 な課題とする。
本発明者らは、.気管支喘息、 虚血性心疾患、 慢性関節リウマチのような複合的 疾患について、 ゲノムワイドで疾患感受性と相関する一塩基多型のスクリーニン グを開始した (Ohnishi, Υ·, et al" Hum. Genet., 106， 288-292 (2000); Unoki, M" et aに， Hum. Genet., 106, 440-446 (2000); Yamada, R., et aに， Hum. Genet, 106, 293-297 (2000))。 その過程で、 気管支喘息の病態に関与する可能性のある 一塩基多型を同定するために、 IKAPをコードする遺伝子の多型を広範囲に亘っ て検索した。 この検索の結果、 IKAP遺伝子のコード領域内に 6つの一塩基多型 が存在することを見出すと共に、 これらの一塩基多型とヒト気管支喘息の疾患の 感受性との間に相関性を見出した。
また、 本発明者らは、 上記 6つの一塩基多型を組合せた一つのセットである 特定の八プロタイプが、 特に小児気管支喘息の発症と相関することを見出した。 従って、 検体について、 これら特定の一塩基多型乃至ハロタイプを解析すれば、 ヒト気管支喘息発症危険因子、 特に小児の気管支喘息発症の危険因子が検出でき、 かくして、 ヒト気管支喘息の発症の予測診断が可能となることを見出した。 本発 明はかかる知見を基礎として完成されたものである。
本発明は、 下記 (1)〜(11)に示される気管支喘息発症危険因子の検出方法を提 供する。
(1) ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒ卜の子孫に先天 性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する変異を含む遺伝子の多型を検出 する方法であって、 （a) 検体からヒト IKAPをコードする遺伝子を含む核酸を 得、 （b) 当該核酸の DNA配列を決定して、 ヒト IKAP遺伝子の多型を検出する、 気管支喘息発症危険因子の検出方法。
(2) 気管支喘息が小児気管支喘息である上記 (1 )に記載の気管支喘息発症危険因 子の検出方法。
(3) 遺伝子の多型が、 配列番号 1に記載のヒト IKAPのアミノ酸配列番号 816番 目の lieの Leuへの変異、 830番目の lieの Metへの変異、 1072番目の Cysの Serへ の変異および 1158番目の Proの Leuへの変異からなる群から選ばれる少なくとも 1種のアミノ酸変異わ伴うものである上記 (1)に記載の気管支喘息発症危険因子 の検出方法。
(4) 遺伝子の多型が、 配列番号 1に記載のヒ HKAPのアミノ酸配列番号の 1072 番目の Cysの Serへの変異および Zまたは 1158番目の Proの Leuへの変異を伴う ものである上記 (2)に記載の小児気管支喘息発症危険因子の検出方法。
(5) 気管支喘息が成人気管支喘息である上記 (1)に記載の気管支喘息発症危険因 子の検出方法。
(6) 遺伝子の多型が、 配列番号 1に記載のヒト IKAPのアミノ酸配列番号の 1072 番目の Cysの Serへの変異を伴うものである上記 (5)に記載の成人気管支喘息発症 危険因子の検出方法。
(7) 遺伝子の多型が、 配列番号 2に記載のヒト IKAP遺伝子のコ一ド領域の 819 番目の丁の Cへの変異、 2295番目の Gの Aへの変異、 2446番目の Aの Cへの変異、 2490番目の Aの Gへの変異、 3214番目の Tの Aへの変異および 3473番目の Cの T への変異からなる群から選ばれる少なくとも 1種の核酸変異を有するものであ る上記 (1 )に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。
(8) 配列番号 2に記載のヒ HKAP遺伝子のコード領域の 819番目、 2295番目、 2446番目および 2490番目の核酸がそれぞれ丁、 G、 Aおよび Aであり且つ 3214番 目の Tの Aへの変異および 3473番目の Cの Tへの変異を有する TGAAATハプロ夕 イブを検出する上記 (2)に記載の小児気管支喘息発症危険因子の検出方法。
(9) 遺伝子の多型の検出が、 ヌクレオチド直接配列決定法、 PCR-対立遺伝子 特異的オリゴヌクレオチド (ASO)とドットブロットハイブリダィゼーシヨン分 析、 一塩基伸長法、 PGR-単鎖高次構造多型 (SSCP)分析、 PCR-RFLP分析、 ィ ンベーダー (Invader)法及び定量的リアルタイム PCR検出法 (TaqMan法)からなる 群から選ばれる少なくとも一つを含む方法によって行わ る上記 (1 )に記載の気 管支喘息発症危険因子の検出方法。
更に、 本発明は、 上記遺伝子変異の検出が、 PCR-(DGGE)法、
PCR-DGGE/GC-クランプ法、 PCR-SSO法、 蛍光 in situハイブリダゼーション (FISH)法、 サザンプロット法および RNase保護アツセィ法からなる群から選ば れる少なくとも一つを含む方法によって行われる上記 (1)に記載の気管支喘息発 症危険因子の検出する方法をも提供する。
(10) 遺伝子の多型の検出が、 制限酵素認 Nla lVを用いた PCR-RFLP分析によ り行われる上記 (9)に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。 また、 本発明は下記 (11)〜(17)に示す、 本発明の気管支喘息発症危険因子の 検出方法に用いられるオリゴヌクレオチド、 検出用キットおよび変異を有するヒ ト IKAP遺伝子を提供する。
(11) 上記 (1)から (8)のいずれかに記載の検出方法に用いられる PCR反応用ブラ イマ一またはプローブとしてのオリゴヌクレオチド。
(12) 配列番号 19から 36のいずれかから選択される上記 (11)に記載の PCR反応 用プライマーまたはプローブとしてのォリゴヌクレオチド。
(13) 上記 (11)または (12)に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有す る、 前記 (1)に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法のための検出キット。
(14) 制限酵素 Nla IVを有効成分として含有する、 前記 (10)に記載の気管支喘息 発症危険因子の検出方法のための検出キット。
(15) 配列番号 1に記載のヒト IKAPのアミノ酸配列番号の 816番目の lieの Leuへ の変異、 830番目の lieの Metへの変異、 1072番目の Cysの Serへの変異および 1158番目の Proの Leuへの変異からなる群から選ばれる少なくとも 1種のアミノ 酸変異を有するヒト IKAP遺伝子。
(16) 配列番号 2に記載のヒト IKAP遺伝子のコード領域の 819番目の Tの Cへの 変異、 2295番目の Gの Aへの変異、 2446番目の Aの Cへの変異、 2490番目の Aの Gへの変異、 3214番目の Tの Aへの変異および 3473番目の Cの Tへの変異からな る群から選ばれる少なくとも 1種の核酸変異を有するヒ HKAP遺伝子。
(17) 配列番号 2に記載のヒト IKAP遺伝子のコード領域の 819番目、 2295番目、 2446番目および 2490番目の核酸がそれぞれ丁、 G、 Aおよび Aであり且つ 3214番 目の Tの Aへの変異および 3473番目の Cの丁への変異を有する TGAAAT八プロ夕 ィプであるヒト IKAP遺伝子。
本明細書におけるアミノ酸、 ペプチド、 塩基配列、 核酸などの略号による表示 は、 IUPAC-IUBの規定 UPAC-IUB communication on Biological
Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕 、 「塩基配列又はアミノ酸配 列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」 （特許庁編） および当該分野に おける慣用記号に従うものとする。
尚、 本明細書中に示されるヒ HKAP遺伝子のコ一ド領域における核酸の番号 は、 配列番号 2に示される IKAPcDNA配列情報 （GenBank accession number
AF044195に記載の配列情報を、 日本人の主要対立遺伝子を参照して一部修正 したもの） を基準として、 そのコード領域の開始コドンである ATG中の Aを 1番 目として 3'下流側に向かって連続して数えるものとし、 アミノ酸配列番号は、 当該 ATGによってコードされる Metを 1番目として C末端側に向かって連続して 数えるものとする。 .
本明細書において 「遺伝子」 なる語は、 2本鎖 DNAのみならず、 それを構成 する各 1本鎖 DNA (センス鎖およびアンチセンス鎖） を包含する。 即ち、 本発 明遺伝子 （DNA) は、 特に言及しない限り、 ヒトゲノム DNAを含む 2本鎖 DNA、 cDNAを含む 1本鎖 DNA (センス鎖） 、 該センス鎖と相補的な配列を有する 1本 鎖 DNAおよびそれらの断片を含む。 また、 上記遺伝子 (DNA) は、 調節領域、 コ一ド領域、 ェキソンおよびイントロンを含むことができる。 ポリヌクレオチド は、 RNAおよび DNAを包含する。 DNAには、 cDNA、 ゲノム DNAおよび合成
DNAが含まれる。 ポリペプチドには、 その断片、 同族体、 誘導体および変異体 が含まれる。 更に、 変異体には、 天然に存在するアレル変異体、 天然に存在しな い変異体、 改変 (欠失、 置換、 付加および挿入)のなされた変異体およびコード するポリぺプチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配列が含まれる。 尚、 アミノ酸配列における改変は、 天然において例えば突然変異、 翻訳後の修飾 などにより生じることもあり、 天然由来の遺伝子を利用して人為的にこれを行う こともできる。
また、 本明細書において、 SNP (Single nucleotide polymorphism:一塩基多 型)とは、 ある遺伝子乃至遺伝子群における一塩基の核酸の変異として表わされ る。 複数箇所に存在する上記一塩基の核酸の変異 (SNP)を SNPsとして表す。 ハ プロタイプとは、 連続した遺伝子領域または遺伝子群中の複数箇所の変異部位に おける対立遺伝子の種類と数とによって表される上記変異 （SNPs) のタイプ を示す。 その具体例を後記実施例に示す。
本発明は、 iKAP遺伝子のコード領域内の特定位置における変異を含む多型、 殊に SNPsがヒト気管支喘息の疾患感受性と強く相関しており、 特定の SNPsを 検出し、 その八プロタイプを解析すれば、 気管支喘息、 特に小児気管支喘息の発 症を予測診断できるという事実の発見に基づいて完成されている。 本発明に係わ る検出方法は、 検体におけるこれらの多型、 即ち SNPsおよび八プロタイプの 検出を行うことを必'須の要件とする。
本発明方法によって検出、 解析される、 ヒトにおける気管支喘息発症を引き起 こすかまたは当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有 する遺伝的変異を含む SNP (即ち、 気管支喘息発症危険因子） としては、 以下 のものを例示できる。
配列番号 1に記載のヒト IKAPのァミノ酸配列をコ一ドする遺伝子 (配列番号 2 に記載のヒト IKAP遺伝子)の 819番目の丁の Cへの変異 [以下、
「丁 819C(Leu273Leu)」 と表示する] 、 2295番目の Gの Aへの変異 [以下、 「G2295A(Gly765Gly)」 と表示する] 、 2446番目の Aの Cへの変異 [以下、 「A2446C(lle816Leu)」 と表示する] 、 2490番目の Aの Gへの変異 [以下、 「A2490G(lle830Met)」 と表示する] 、 3214番目の Tの Aへの変異 [以下、 「T3214A(Cys1072Ser)」 と表示する] および 3473番目の Cの Tへの変異 [以下、 「C3473T(Pro1158Leu)」 と表示する] 。
ヒト IKAP遺伝子は、 コ一ェン (Cohen)らによって、 GenBank Accession No. AF044195として報告された全長 4803塩基長の遺伝子である。 該遺伝子の概略 および本発明検出方法によって検出される遺伝子の多型 (SNPs)の具体例を図 1 に示す。
図 1に示すように、 IKAP遺伝子は 1-5の 5つの番号で示される WD (Trp-Asp) 様反復配列、 NF- κ β誘導キナーゼ結合部位 (NIK binding site)、 I κ βキナーゼ - α結合部位 (IKKひ binding site), IKK- /3結合部位 (IKK 3 binding site)およびセリ ン ' リッチドメイン (図中、 Serと表示)を有している。
該遺伝子のコード領域は、 配列番号 2に示す配列番号の 304番目から 4299番目 (4300-4302番目に終止コドン tgaを有する)であり、 これによつてコードされる ァミノ酸配列は配列番号 1に示す 1332個のァミノ酸からなっている。
尚、 該 IKAP遺伝子は染色体 9q34上にマップされる (Cohen, L， et aに， Nature, 395 (6699), 292-296 (1998)。
本発明方法によって検出される前記 6つの SNPsは、 それぞれ図 1に矢印を付 して表示されている。 但し、 図 1では T819C(Leu273Leu)は T819C Leu273Leu と表示し、 G2295A(Gly765Gly)は G2295A Gly765Glyと表示し、
A2446C(lle816Leu)は A2446C lle816Leuと表示し、 A2490G(lle830Met)は
A2490G lle830Metと表示し、 T3214A(Cys1072Ser)は T3214A Cys1072Serと表 示し、 C3473T(Pra1158Leu)は C3473T Pro1158Leuと表示している。 IKAP遺伝 子を示す棒の上に表示した SNPsは、 同義的置換 （蛋白産物の配列に変化を生 じないもの） であり、 棒の下に表示した SNPsは蛋白のミスセンス置換を生じ るものである。 気管支喘息と強い相関の認められる一つの SNPである 3214番目 の Tの Aへの変異 [T3214A(Cys1072Ser)〕 は、 ΙΚΚαおよび IKK/3結合ドメイン 内に位置しており、 また 3473番目の Cの Τへの変異 [C3473T(Pro1158Leu)] は、 セリン · リッチドメインをコードする領域内に位置している。
本発明の遺伝子多型の検出方法によれば、 変異を有する IKAP遺伝子 (SNPsお よび八プロタイプ)が検出可能であり、 この遺伝子は、 ヒト気管支喘息 (特に早 期発症の気管支喘息)における発症危険因子の解明、 把握、 診断、 予防および治 療に極めて有用な情報乃至手段を与える。 また、 本発明の IKAP遺伝子多型
(SNPsおよび八プロタイプ)の検出方法は、 気管支喘息の治療または処置に有 と考えられる新規薬剤、 例えば IKAP遺伝子の多型部位の作用点を標的とした 薬剤などの開発の上でも有用である。 更に、 個体或は組織における本発明遺伝子 多型または八プロタイプの検出は、 気管支喘息、 特に小児気管支喘息の解明、 喘 息発症前の早期診断にも有用である。
以下、 本発明方法によって検出される変異を有するヒト IKAP遺伝子 （SNPs およびハプロタイプ） にっき詳述すれば、 該 SNPsの具体例としては、 ヒト
IKAPのァミノ酸配列番号の 816番目の lieから Leuへの変異、 830番目の lieから Metへの変異、 1072番目の Cysから Serへの変異および 1158番目の Proから Leu への変異からなる群より選ばれる少なくとも 1種のアミノ酸変異を有するヒト IKAP遺伝子多型を例示できる。
上記 SNPsの具体例には、 また、 ヒ'卜 iKAP遺伝子のコード領域の 819番目の T から Cへの変異、 2295番目の Gから Aへの変異、 2446番目の Aから Cへの変異、 2490番目の Aから Gへの変異、 3214番目の Tから Aへの変異および 3473番目の C から Tへの変異からなる群より選ばれる少なくとも 1種の核酸変異を有するヒト ΙΚΑΡ遺伝子多型も含まれる。
本発明ヒト ΙΚΑΡ遺伝子には、 上記例示のヒト ΙΚΑΡ遺伝子多型の DNA配列を 有するものと共に、 それらの DNA配列の相補鎖を有するものが包含される。 また変異を有するヒト ΙΚΑΡ遺伝子 （ハプロタイプ） の例としては、 ΙΚΑΡ遺 伝子の特定の 6ケ所の核酸によつて類型化されたハプロタイプを挙げることが できる。 その具体例は後記実施例に示される通りである。 主なハプロタイプの例 を下記表 1に示す。
表 1
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これらの中では、 ヒ HKAP遺伝子のコード領域の 819番目、 2295番目、 2446 番目および 2490番目の核酸がそれぞれ T、 G、 Aおよび Aであり且つ 3214番目の 核酸 Tの Aへの変異および 3473番目の核酸 Cの Tへの変異を有する TGAAAT八プ 口タイプが特に小児気管支喘息と強い関連を示す好ましいものとして例示できる 本発明 IKAP遺伝子 (SNPsおよび八プロタイプ)は、 本発明により開示された本 発明遺伝子の具体的配列情報に基いて、 一般的遺伝子工学的手法により容易に製 造 ·取得することができる [Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座 「遺伝子研究法 I、 II、 III」 、 日本生化学会編 (1986)など参照〕 。 より具体的には、 IKAP遺伝子の SNPsまたはハプロタイプ を有するヒト （気管支喘息を発症していないヒト） または気管支喘息患者より、 常法に従って cDNAまたはゲノム DNAを抽出し、 本発明 IKAP遺伝子に特有の変 異を含む適当なプロ一ブ、 制限酵素、 抗体などを用いて、 所望遺伝子を含むクロ —ンを選択することによって、 本発明 IJAP遺伝子を得ることができる。 上記ク ローンの選択も常法に従うことができる 〔Proc. Natl. Acad. Sci.， USA., 78， 6613 (1981)； Science, 222, 778 (1983)など参照〕 。
上記において、 cDNAまたはゲノム DNAの起源としては、 本発明 IKAP遺伝子 (SNPs)を有するヒトの各種紬胞、 組織、 これらに由来する培養細胞などを例示 することができる。 具体的には、 血清または血漿のごとき血液、 唾液、 リンパ液、 気道粘液、 尿、 精液などの体液を例示することができる。 これら起源材料からの
RNAの分離、 mRNAの分離および精製、 cDNAの取得、 そのクローニングなど は、 いずれも常法に従うことができる。 また、 cDNAライブラリ一は市販され ており、 本発明においてはそれらの cDNAライブラリー、 例えばクローンテツ ク社 (Clontech Lab.lnc.)などより市販されている各種 cDNAライブラリ一を期限 材料として用いることもできる。
本発明遺伝子を cDNAライブラリーからスクリーニングする方法も、 特に制 限されず、 通常の方法に従うことができる。 具体的には、 目的の SNPsまたは ハプロタイプの DNA配列に選択的に結合し得る変異部分を含むプローブを作成 し、 これを用いてプラークハイブリダィゼ一シヨン、 コロニーハイブリダィゼー ションなどを実施するかこれらを組合せて実施すればよい。
上記スクリーニング用プライマ一としては、 本発明遺伝子の塩基配列情報に基 き設定したフォワード ·プライマ一およびリバース ·プライマーを用いることが できる。 これらは常法に従い、 例えば自動合成装置を用いて合成することができ る。 該スクリーニング用プローブは、 通常、 標識したプローブであるが、 直接的 または間接的に標識したリガンドと特異的結合できるものであれば、 非標識のも のであってもよい。 プローブおよびリガンドの標識剤および標識法は、 既にこの 種技術分野でよく知られている。 標識法の例としては、 例えばニック * トランス レーション、 ランダム ·プライミングまたはキナーゼ処理のような既知の方法を 挙げることができる。 標識剤はこれらの各種方法によつて取り込ませることがで きる放射性標識剤、 ピオチン、 蛍光性色素、 化学発光剤、 ルシフヱラ一ゼなどの 酵素、 抗体などを例示できる。
さらに、 抽出した遺伝子あるいは mRNAは、 遺伝子増幅法によって増幅する ことができる。 この増幅によれば、 本発明検出方法における検出をより容易に且 つ精度の高いものとすることができる。 遺伝子増幅法の例としては、 PCR法 (Saiki, R. Κ·， Bugawan, T. L, et al., Nature, 324, 163-166 (1986))、 NASBA法 (Comptom, J., Nature, 650, 91-92 (1991)) 、 TMA法 （Kacian, D.し.， and Fultz, T. J.，米国特許第 5,399，491号 (1995)) 、 SDA法 (Walker, G. T., Little, M. C.， et al, Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 89, 392-396 (1992)) などが挙げられ る。
尚、 PCR法などで増幅させた遺伝子断片の単離精製は、 常法に従うことがで き、 例えばゲル電気泳動法などによればよい。 またカラムを用いて精製すること もできる。 単離精製された遺伝子断片は、 例えばマススペクトル法によって確認 することができる。
これらの方法により増幅された遺伝子断片は、 その増幅物の特性に応じて、 本 発明に係る IKAP遺伝子 （SNPsまたは八プロタイプ） の検出に供される。
以下、 本発明検出方法につき詳述する。
本発明検出方法において、 検体としては気管支喘息を発症しているかまたは発 症するおそれのあるヒトに由来する DNAまたはゲノム DNAを好ましいものとし て例示できる。 かかる検体は、 気管支喘息患者の組織、 細胞など、 好ましくは血 液、 標的組織細胞などより常法に従い抽出して調製できる。
(1) ヌクレオチド直接塩基決定法
まず第一に、 IKAP遺伝子の検出は、 この種の遺伝子の塩基配列決定に慣用さ れている、 例えばダイデォキシ法 (Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977))、 マキサム—ギルバート法 [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕 などの直接塩基配列決定法に従って実施することができる。
また、 これらの方法と PCR法などの DNA増幅法とを組合せた方法に従って実 施することもできる。 特に、 PCR法もしくはそれに準じた DNA増幅法を組合せ た方法は、 少量の DNA試料を用いて簡便かつ容易にしかも感度および精度の高 い検出が可能である観点から好ましい。
この好ましい方法は、 最も基本的には、 例えば PCR法で増幅させた遺伝子断 片 （検体） をプラスミドにクローニングし、 次いでダイデォキシ法、 マキサム一 ギルバート法などに従って直接塩基配列をシーケンスすることにより、 また簡便 には市販のシークェンスキットなどを用いてヌクレオチド配列を決定することに より実施できる。 かくして、 ヒ HKAP遺伝子のコード領域における前述した特 定部位の変異の存在を決定でき、 またそのハプロタイプを決定できる。
上記方法および以下に示す各方法において、 PCR法などで増幅させるべき DNA断片 (検体)は、 前述した変異の存在が想定される特定部位の少なくとも 1つ を含む限り特に限定されるものではない。 通常、 該検体は、 約 50から数千塩基 の長さ、 好ましくは 50から数百塩基の長さを有するものであるのがよい。 また、 少なくとも前記変異箇所の全てを含むものであるのが好ましい。
(2) 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド—ドットブロット分析
本発明検出方法の別法としては、 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
(ASO)-ドットブロット法 (Conner, B.丄， et al., Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 80， 278-282 (1983))に従う方法を挙げることができる。 該方法は、 例えば目的とす る SNPを挟むように設計したフォワード ·プライマーおよびリバース ·プライ マーを利用して PCR増幅した遺伝子断片に対する対立遺伝子特異的オリゴヌク レオチド ·プローブにハイブリダイズする DNA断片を、 ドット 'ブロット分析 することにより実施できる。 かくして、 該断片中に SNPが存在するか否かを決 定することができる。
(3) 一塩基伸長法
本発明 IKAP遺伝子多型 （SNPsまたはハプロタイプ） の検出は、 また、 スナ ップショット法、 ピロシーケンス法、 特開平 2000-279197号に開示の点変異検 出法のような一塩基伸長法を用いて実施することもできる。 これらの場合、 目的 の変異 (SNP)の直前の塩基または数塩基前の塩基に対応するように設定したプ ローブ、 即ち、 その 3'末端を検出目的である変異の 1塩基上流または近傍に設定 したプローブを DNA検体にァニ一リングさせることにより実施することができ る。 上記各方法は、 市販の SNPs検出用キットおよび該キットに添付のソフト ウェアを利用して実施することができる。
例えばスナップショット法は、 ABI PRISM SNaPshot ddNTP Primer
Extension Kit(ABIバイオシステムズ社製)を用いて実施できる。 SNPsは、 反応 後に生成した蛍光フラグメントを、 ABI PR M310/337/3100/3700DNA
Analyzer (いずれも ABIパイォシステムズ社製)と GeneScanソフトウェアを用い て検出 ·解析できる。
ピロシーケンス法は、 例えば、 以下のごとくして実施できる。 郎ち、 血液サン プルなどから常法によりゲノム DNAを単離し、 ピオチン標識したプライマ一を 用いて変異を含む数十から数百塩基を PCR増幅させ、 マグネットピーズを用い て一本鎖 DNAを精製し、 この精製 DNAを検体とする。 該検体に、 所望の変異の 数塩基上流からシーケンスするように設定したプライマーをァニリングさせ、 次 いでソフトウェアに入力された変異付近のシーケンスに従つて装置に 1種類ず つ dNTPを添加する。 DNAポリメラーゼが塩基伸長するとピロリン酸 (ΡΡί)を生 成するので、 該 PPiをスルフリラーゼ (Sulfurylase)により ΑΤΡに返還させ、 これ をルシフェラ一ゼの基質として発光検出器、 CCDカメラなどを用いて化学発光 を検出する。 かくして、 添加した dNTPに応じて得られる発光のピークを解析 することによって遺伝子のタイピングが可能となる。 該方法を用いれば、 96サ ンプルを 15分ほどでタイピングすることができる利点がある。
上記方法において試薬および装置としては、 通常のもの、 例えば DNAポリメ ラーゼ、 ATP-スルフリラーゼ、 ルシフェラーゼおよびアビラーゼ (apyfase)の 4 種の酵素混合液；ルシフェリンおよび APS (アデノシン 5'硫酸リン酸） からな る基質液； dATP (デォキシアデノシン α—チォ' 3リン酸)、 dCTP dGTPおよ び cTTTPからなる dNTPを構成要素とする市販の SNP Reagent Kits
(Pyrosequencing AB社製)などの試薬；並びに DNA配列自動分析のための
PSQ96システム (Pyrosequencing AB社製)およびその使用のための SNPソフト ウェア (Pyrosequencing AB社製)を用いることができる。
また、 上記ピロシーケンス法は、 例えば米国特許第 6，159，693号の記載に従つ て、 核酸を単離後、 増幅し、 増幅した PCR産物を精製後、 READIT™ System (プロメガ ·コーポレーション社製)を用いて、 これにピロリン酸を反応させ、 得られデ一夕を分析することによつても実施できる。 このデータ分析には、 例え ば市販の READIT技術 (プロメガ ·コーポレーション社製)を利用した Excel分析 を採用することができる。
(4) PCR-単鎖高次構造多型 (SSCP)分析法
更に、 本発明検出法には、 前述した PCR増幅産物 (一本鎖 DNA)を非変性ポリ アクリルアミドゲル電気泳動して、 その移動度の差異により一塩基変異の有無を 識別する PCR-SSCP法 （Orita, M.， Iwahara, H., et al.， Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 2776-2770 (1989)) を採用することもできる。
(5) PCR-制限酵素断片長多型 (RFLP) 分析法
本発明 IKAP遺伝子の SNPsまたはハプロタイプの検出にあたり、 検出目的と する変異を含む核酸配列が制限酵素認識部位を含んでいる場合には、 該検出は、 制限酵素断片長多型分析法 （RFLP法： Botstein, D. R.， et aに Am. J. Hum. Gen., 32, 314-331 (1980)) によることもできる。
例えば、 本発明で特定される小児気管支喘息と連鎖不平衡を示したヒト IKAP 遺伝子の変異 （C3473T(Pro1158Leu)) を検出する場合、 この変異はヒト IKAP 遺伝子の塩基配列 3468-3473位の領域に制限酵素 Nla IVの特異的切断サイト
(GGNNCC)を生じさせるため、 RFLP法によって検出することができる。
RFLP法は、 目的とするそれぞれの変異箇所の前後配列を認識し得る公知の 各種の制限酵素を用いて実施することができる。 その具体例としては、 例えば Nla IVを例示することができる。
RFLP法は、 より好適には、 PCR-RFLP法、 即ち、 予め PCR法またはその変 法などによって検体 DNAを増幅 ·調製後、 多量に調製され且つ濃縮された検体 DNAについて RFLP法を実施する方法によることができる。 かくして、 特異的 切断サイトの存在の有無を検出することができる。
PCR-RFLP法による本発明 IKAP遺伝子の SNPsまたはハプロタイプの検出は、 具体的には例えば次の方法に従って行われる。 即ち、 まず、 ヒト生体試料から IKAP遺伝子の DNAを抽出し、 該遺伝子のコード領域の塩基配列番号 3473番の 位置を含む数十から数百塩基長の DNA断片を増幅し、 多量に且つ濃縮された検 体サンプルを得る。 次いで、 このサンプルを制限酵素 Nla IVを用いて消化し、 DNAの切断様式 （切断の有無、 切断フラグメントの塩基長など） を常法に従つ て確認する。 所望の変異 （C3473T(Pro1158Leu)) を有するサンプルは、 上記 Nla IV消化により 2つのフラグメントを生じるが、 この変異を有しないサンプル はかかるフラグメントを生じないため、 当該方法によって本発明遺伝子の変異を 検出できる。
(6) ィンベーダ一法
本発明 IKAP遺伝子の SNPsまたは八プロタイプの検出は、 また以下に示すィ ンベーダ一 (Invader)法により実施することもできる。
インべ一ダ一法の実施には、 以下の文献が参照できる。
• Lyamichev, V.， et al" Nat. Bioltechnol" 17(3)292-296(1999)および
•国際特許公開 W09823774号 (98/6/4)。
該方法は、 ゲノム DNAの SNPsを分析するのに予め標的 DNAを増幅する必要 がない方法であって、 例えば以下のごとくして実施される。
目的とする IKAP遺伝子の SNPsが存在するかどうかを検出するために、 先ず ゲノム DNAを単離した後、 15から 50塩基長からなる 5'フラップと、 該 5'フラッ プの 3'端に配した検出したい核酸 (本発明では SNP)とを有し且つ変異核酸以外は 標的ゲノム DNAに相補するように合成された数百塩基長さまでのオリゴヌクレ ォチドからなる第一の標的プローブと、 検出したい核酸に相補的な核酸を 3'端 に配する以外は標的ゲノム DNAに相補するように合成された 15から数十塩基長 のオリゴヌクレオチドからなるインベーダー ·オリゴヌクレオチド ·プローブと を、 例えば自動合成機により合成する。 これらのプローブに、 単離したゲノム DNAおよび第一のプローブの 5'フラップを切断する酵素を同時に加えて適当な 反応液中で反応させる。 ' もし検体中のゲノム DNAが所望の変異核酸 (所望の SNP)を有している場合は、 変異核酸を 3'端に有する 5'フラップを遊離する第一の反応が終了する。 もし、 検 体中のゲノム DNA7 ^変異核酸配列を有していない場合は、 前記制限酵素による 切断は生じない。
制限酵素で切断された第一のプローブから遊離した 5'フラップは、 標的とし て蛍光共鳴エネルギ一移転 (FRET)プローブに相補的に結合し、 5'フラップの 3' 端が FRETプローブ内に侵入 (invasion)する。 同様に、 制限酵素による反応が起 こり、 蛍光色素が遊離する。
次いで第二の反応に用いられる各 FRETプローブを構築する。 該 FRETプロ一 ブは、 下記 2つのエレメントからなるように構築される：（1)第一の反応から割 裂した産物に相補する 3'領域、 （2)—本鎖プローブを模倣するために複式を形成 し、 そして標的が共にハイブリダィズして、 それらがレポーター蛍光色素とクェ ンチヤー蛍光色素を含んでいる自家相補的領域。
レポーター蛍光色素は、 .該レポ一ター蛍光色素がクェンチヤ一蛍光色素と同一 のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強 度が抑制される。 クェンチヤ一蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状 態ではその蛍光強度は抑制されない。 従って、 切断された第一のプローブから遊 離した 5'フラップが、 FRETプローブにハイブリダィズしたとき、 それは第二の 反応においてインベーダー ·オリゴヌクレオチド ·プローブとして作用し、 制限 酵素によって認識された侵入複合物を産生する。 かくして、 FRETプローブの 制限酵素による切断が、 二つの蛍光色素を分離し、 検出可能な蛍光シグナルを産 生する。 このようにして標準蛍光マイクロ夕イタ一プレート読み取り機器によつ て産物を読み取り検出することができる。
上記第一と第二の反応の組み合わせにより、 シグナルを 1から 1 X 106倍まで増 幅させることができる。 本発明においては所望の SNPsの有無について、 ある いはハプロタイプについて、 これらをインベーダー ·アツセィ法によって検出す ることが可能である。
(7) 定量的リアルタイム PCR検出法
本発明 IKAP遺伝子多型の検出は、 また定量的リアルタイム PCR検出法
(TaqMan法)によっても簡便に実施することができる。
該方法は、 以下のごとくして実施できる。 まず、 目的とする変異の有無を検出 するための変異核酸部位を含む DNA断片を、 15塩基ないし 39塩基からなるフォ ワード側プライマーとリバ一ス側プライマーとを用いて作成する。 伹し、 フォヮ ード側プライマーとリバ一ス側プライマーとには、 目的とする変異の有無を検出 するための変異核酸部位を含ませてはならない。 次いで、 15塩基ないし 50塩基 からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドにレポーター蛍光色素とクェンチ ャ一蛍光色素とが結合されており且つフォワード側プライマーがハイブリダイズ する領域とプローブがハイプリダイズする領域が互いに重複することがない組み 合わせを選択したプローブを作成する。 該プローブは、 目的とする一塩基の核酸 変異の有無を検出するための対立遺伝子特異的配列に相補的な配列を有するよう に作成する。 該プローブを用いて、 検体中の測定すべき IKAP遺伝子の所望の DNA断片領域を铸型として逆転写 PCR(RT-PCR)を行い、 反応液からの蛍光を リアルタイムに測定する。 かくして、 変異の有無を検出することができる。 上記ィンベーダ一アツセィ法及び TaqMan法に用いられるレポーター蛍光色 系蛍光色素が好ましい。 クェンチヤ一蛍光色素としては、 TAMRA(6-カルボキ シ -テトラメチル-ローダミン） のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。 こ れらの蛍光色素は公知であり、 市販のリアルタイム検出 PCR用キッ卜に含まれ ているのでそれらを用いることができる。 レポーター蛍光色素及びクェンチヤ一 蛍光色素の結合位置は、 限定されないが、 通常、 プローブとするオリゴヌクレオ チドの一端 （好ましくは 5'末端） にレポーター蛍光色素が、 他端にクェンチヤ 一蛍光色素が結合されるのが好ましい。 なお、 オリゴヌクレオチドに蛍光色素を 結合する方法は公知であり、 例えば Noble et al.， (1984) Nuc. Acids Res. 12: 3387-3403及び Lyer et al" (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254に記載さ れている方法に従うことができる。
リアルタイム検出 PCR法自体は公知であり、 そのための装置及びキットも市 販されているので、 本発明検出法ではこのような市販の装置及びキットを用いる ことができる。 リアルタイム検出 PCR法を採用する本発明検出法は、 例えば、 特許第 2825976号に記載の方法に従うか、 または PEバイオシステムズ社製の ABI PRISM 7700配列決定システム ·ユーザーマニュアルに従って実施するこ とができる。
(8) その他の検出法
本発明 IKAP遺伝子の. SNPsまたはハプロタイプの検出は、 更に従来より一般 に DNAについてその塩基配列の決定法として、 また変異の検出法として知られ ている、 以下に挙げる各種の方法によって実施ずることもできる。
(a) 配列特異的オリゴヌクレオチドを用いる PCR-SSO法；各変異に対するプ ローブを担体に固相化し、 これに検体 (遺伝子増幅産物)をハイブリダィズさせ、 ミスマツチの有無によるハイブリダゼーションの効率の差を判定するもの。
(b) 点変異を検出する PCR-SSP法；点変異に対応する塩基を 3'末端に設定した 遺伝子増幅用配列特異的プライマーを用いて、 プライマーの 3'末端が相補的で あるか否かによって PCRによる増幅効率に著しい差が生じることを利用したも の。
(c) PCR-DGGE (変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)法；変異 DNA断片と正常 DNA断 片とを混合してハイブリッド結合させた後、 尿素、 ホルムアミドなどの変性剤の 濃度が徐々に高くなつているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、 ミス マッチのないホモ 2本鎖に比べて、 より低い濃度の変性剤の位置で 1本鎖に解離 する。 1本鎖 DNAは、 2本鎖 DNAに比べて泳動速度が速いため、 移動度の差を比 較することで 1塩基の変異を検出することができる。
(d) PCR-DGGE/GCクランプ法 (Shefield, V. C.， et al" Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 86， 232-236 (1989))；上記 PCR-DGGE法に加えて、 GC含量の高い領域を 変異核酸の検出対象である DNA断片につなげることにより複数の塩基置換、 欠 失、 付加および挿入がある場合の検出の欠点を補った方法である。 該方法は特に 変異検出の対象 DNA断片に GCクランプを付加する工程を必要とする。
(e) RNase保 ¾アツセィ法 (Finkelstein, J., et aに， Genomics, 7， 167-172
(1990))
(f) in situ RT-PCR(Nucl. Acids Res., 21 , 3159-3166 (1993))
(g) in situハイブリダイゼーシヨン
(h) サザンブロッティング (Sambrook,丄， et aに， Molecular Cloning a
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: NY. (1989))
(i)ドットハイブリダィゼーション法 (Southern, E. M.， J. Mol. Biol., 98:
503-517 (1975)など参照） 、
(j) 蛍光 in situハイブリダイゼーション (FISH: Takahashi Ε·， et al., Hum. Genet., 86， 1416 (1990))
(k) 競合的ゲノミック ·ハイブリダイゼ一ション (Comparative Genomic
Hybridization: CGH: Kallioneimi, A., et al.， Science, 258,818-821 (1992))、
(Spectral karyotyping: SKY: Rowley, J. D.， et aに Blood, 93, 2038-2042 (1999)) (I) 酵母人工染色体 （YAC) ベクターのクローンをプローブとする方法
(Lengauer, C, et al., Cancer Res., 52， 2590-2596 (1992))。
本発明方法によれば、 検体について、 気管支喘息発症を引き起こすかまたは子 孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する遺伝的変異を含む多型、 即ち気管支喘息発症危険因子の存在を検出することができる。 特に、 本発明に従 ぅヒ HKAP遺伝子の TGAAAT八プロタイプの検出は、 ヒト小児気管支喘息発症 危険因子の存在の検出に有効であり、 該八プロタイプの検出によってヒト小児気 管支喘息の発症危険因子の早期検出が可能である。
尚、 本発明検出方法において、 PCR法を採用する場合、 該方法に用いられる プライマーまたはプローブは、 本発明遺伝子における変異部分 (SNPsまたはハ プロタイプ)を含む領域のみを特異的に増幅できるものである限り、 特に制限は なく、 本発明遺伝子の配列情報に基いて常法に従って適宜合成、 構築することが できる。 この合成、 構築は、 例えばホスホルアミダイト法、 リン酸トリエステル 法等の化学合成法に従って実施することができる。 また、 市販されている自動ォ リゴヌクレオチド合成装置、 例えば (Pharmacia LKB Gene Assembler Plus:フ アルマシア社製)などを使用しても、 所望のプライマーおよびプロ一ブを合成す ることができる。 二本鎖断片は、 各相補鎖を合成し、 これらを適当な条件下でァ ニーリングさせるか、 または化学合成した一本鎖生成物に適当なプライマー配列 と DNAポリメラーゼとを用いて相補鎖を付加することによつて得ることができ る。
プライマーおよびプローブとして用いられるヌクレオチド配列としては、 いず れも、 少なくとも 10個の連続した塩基長を有するもの、 通常、. 10-35塩基程度 長を有するものが挙げられる。 プライマー対としては、 本発明遺伝子のハプロタ ィプ配列の SNPを挟むように設計、 合成されたヌクレオチド配列を有するもの を利用する。 尚、 プローブとしては、 上記ヌクレオチド配列を含む陽性クローン それ自体を用いることもできる。
プローブまたはプライマーとして用いられるヌクレオチドの好適なものとして は、 ヒト IKAP遺伝子のコード領域の 819番目の Tが Cに変異した変異、 2295番目 の Gが Aに変異した変異、 2446番目の Aが Cに変異した変異、 2490番目の Aが G に変異した変異、 3214番目の Tが Aに変異した変異および 3473番目の Cが丁に変 異した変異から選ばれる少なくとも 1種の変異を含むように設定された DNAに 対応する部分ヌクレオチドであって、 少なくとも 10個、 より好ましくは少なく とも 15個の連続した塩基長を有するものを挙げることができる。
本発明は、 IKAP遺伝子の SNPsまたはハプロタイプを検出するための特異プ ライマーおよび/または特異プローブとして利用される DNA断片をも提供する。 その具体例としては、 後記実施例に示される配列番号 19から 30のフォワード · プライマ一およびリバース ·プライマー並びに配列番号 30から 36で示される対 立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド ·プローブを例示することができる。
本発明方法は、 気管支喘息発症の危険因子、 特に小児気管支喘息発症の危険因 子としての IKAP遺伝子多型の検出を行うものである。 この本発明方法において は、 検出用の遺伝子特異的プロ一ブとして、 T819C(Leu273Leu)、
G2295A(Gly765Gly), A2446C(lle816Leu)、 A2490G(lle830Met)、 の SNPを検出できるものが利用される。 本発明遺伝子にはかかる検出用遺伝子 特異的プローブも包含される。
特に小児気管支喘息の検出のためのプローブは、 T3214A(Cys1072Ser)およ び C3473T(Pro1158Leu)のいずれかの SNPを検出できるものであるのが好まし く、 成人気管支喘息の検出のためのプローブは、 T3214A(Cys1072Ser)を検出 できるものであるのが好ましい。
また、 本発明遺伝子特異的プローブの他の例としては、 ヒト IKAP遺伝子のコ —ド領域の 819番目、 2295番目、 2446番目および 2490番目の核酸がそれぞれ丁、 G, Aおよび Aであり且つ 3214番目の Tが Aに変異した変異および 3473番目の C が Ύに変異した変異からなる TGAAAT八プロタイプを検出するように作成した 遺伝子特異的プロ一ブを挙げることができる。 本発明検出方法は、 検体中のヒト IKAP遺伝子の SNPsまたはヒト IKAP遺伝子 の TGAAATハプ口タイプの検出のための試薬キットを利用することによって、 より簡便に実施することができる。 本発明はかかる検出用キットをも提供する。 本発明キットは、 その必須構成成分として以下の DNA断片または制限酵素を 含んでいる。 該 DNA断片は、 少なくともヒト IKAP遺伝子の 6つの SNPsまたはヒ ト IKAP遺伝子の TGAAAT八プロタイプの DNA断片塩基配列もしくはその相補的 塩基配列の一部または全てに、 あるいは変異部位の 1塩基前または数塩基前の 配列からなる配列に、 ハイブリダィズする DNA断片である。 また、 制限酵素は、 変異部位を含む数塩基の核酸配列を認識する制限酵素である。
本発明キットは、 更に、 例えば標識剤、 PCR法に必須な試薬 （例えば、
TaqDNAポリメラ一ゼ、 デォキシヌクレオチド三リン酸、 DNA増幅用プライマ —など） 等を含むことができる。 標識剤としては、 放射性同位元素または発光ま たは蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられ、 DNA断片自身が予め該標識 剤でコンジュゲートされていてもよい。 更に当該試薬キットには、 測定の実施の 便益のために適当な反応希釈液、 標準抗体、 緩衝液、 洗浄剤、 反応停止液などが 含まれていてもよい。
前記検出キッ卜の利用によれば、 本発明方法に従ってヒトにおける気管支喘息 発症を引き起こす可能性がある遺伝子の多型、 即ち、 ヒト気管支喘息発症危険因 子が検出できる。 特に、 成人または小児気管支喘息が検出できる。 従って、 前記 検出キットは、 ヒト気管支喘息発症危険因子の診断剤乃至診断キット、 特に、 成 人または小児気管支喘息の診断剤乃至診断用キットとしても有用であり、 本発明 はかかる診断剤乃至診断キットをも提供する。
以上詳述したとおり、 本発明は、 ヒト気管支喘息発症危険因子の検出方法、 検 出用キット、 それらに利用される変異検出用プライマーまたはプローブおよびヒ ト気管支喘息発症の危険因子に関連する遺伝子を提供する。 これらはヒト気管支 喘息発症危険因子の新しい検出手段として、 殊に小児における気管支喘息発症危 険因子の検出手段として有用である。
図面の簡単な説明
図 1は IKAP遺伝子の 6つの SNPsの位置を示す図面である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を更に詳しく説明するため、 実施例を挙げるが本発明はこれに限 定されない。
実施例 1
a)対象患者
対象患者は、 大阪府立羽曳野病院の小児気管支喘息外来患者 235人である。 これらの患者の平均年齢は 9.75歳 (1-17歳、 男性：女性比 =1.47 : 1.0、 平均 IgE レベル 1005.9U/ml)である。 これらの患者の多くは、 アトピー性喘息と診断され ている。 また、 大阪府立羽曳野病院の内科からの 103人、 宮武喘息クリニック からの 167人を含む全体で 270人の成人気管支喘息患者 (平均年齢 45.9歳、 18-83 歳；男性：女性比 =1.0 : 1.16) も対象患者とした。 成人患者の 20%はアトピー 性であつたが、 血清 IgEレベルは得られなかった。 この成人気管支喘息患者には 子供の頃喘息の既往歴が報告されたものは含まれていない。 更に、 コントロール (対照） として、 人口比率に基づいた個々から無作為に 372人の健常者を選択 した。
上記対象患者および健常者から、 それぞれ末梢血を採血して、 以下の試験に利 用した。
尚、 すべての気管支喘息患者は、 日本アレルギー学会のガイドラインに沿う気 管支喘息として診断されたものであり、 疾患の病態は以下の 4つのカテゴリー に分類された。
1)無投薬、 2)クロモグリゲート (DSCG)および Zまたはテオフィリン、 3)400 g/日以下の吸入ダルココルチコィドおよび 4)400 g/日以上の吸入ダルココルチ 3ィド。
前記健常者中の 51人から cDNAを得、 また、 すべての参加者からゲノム DNAs を調製した。
b)多型のスクリーニング方法：
SNPsのスクリーニングは、 大西らの方法 (Ohnishi, Y., et al.， Hum. Genet., 106, 288-292 (2000))に従い実施した。
ヒト IKAPcDNAの全体のコ一ド領域をスクリーユングするために GenBank (accession number AF044195)から入手した IKAPcDNAの配列情報を参考とす る配列番号 2に記載の配列情報に基づいて、 配列番号 3から配列番号 18に示す F1-R1から F8-R8の 8つのプライマー ·セットを設定し、 各プライマーを自動 DNA合成機により合成した。
各 PCR反応は、 40ngの 3つの検体を混合した cDNAで実施した （3人分の cDNAを 1つのチューブでシークェンスする方法） 。 50 Iの反応液は、
dNTPs(25mM)、 塩化マグネシウム (6.68mM)、 16.6mM硫酸アンモニゥム、 6.7mMトリス塩酸 (pH8.8)、 10mM ]3—メルカプトエタノール、 2セットのプラ を含んでいた。 各サンプルは GeneAmpPCRシステム 9600(PEアプライド ·パイ ォシステムズ社製)によって増幅した。
PCR反応は、 94 2分の後、 94°C30秒、 56 30秒および 72°C30秒を 36サイ クル行つた後、 72°C 10分間にて最終の伸長反応を行つた。
得られた各 PCR産物について、 ビッグダイ ·ターミネ一ター RRミックス (BigDye™ Terminator RR mix: PEアプライド ·バイオシステムズ社製)および配 列番号 3-18に示す 16のプライマーの中から一つの内側用プライマーと反応させ た。
遺伝子多型 （SNPs) は、 ABIプリズム 377DNA自動シーケンサ一 (ABI Prism 377 DNA autosequencer: PEアプライド ·バイオシステムズ社製)において得ら れた塩基配列情報をもとに、 ポリフレッド ·プログラム (Polyphred program: Nickerson, D. A., et al.， Nucleic Acids Res., 25, 2745-2751 (1997))によって確 認した。
c)検体の増幅と遺伝子型判定法：
すべてのゲノム DNA検体は、 各 PCR産物が 1または 2の SNPsを含むように配 列番号 19-30に示されるフォワード ·プライマーおよびリバース ·プライマー を用いて、 GeneAmp PCRシステム 9600(PEアプライド ·バイオシステムズ社 製)を用いて増幅させた。 各 PCRの温度条件とハイブリダゼ一ションの温度と条 件は、 表 2に示される通りである。 表 2
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
かくして得られた PCR産物を、 製品の手順書に従いバイオダイン膜 (PALL社 製)上にドット ·ブロットし、 UVクロスリンキングによって固定し、 その後配 列番号 31-36に示す3 2 P標識した対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド (ASO)を 用いて八イブリダイズした。
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド (ASO)法の結果を確認するために、 同 じ材料に対して、 PCR-制限酵素断片長多型 (RFLP)分析を実施して、 IKAP遺伝 子の 3473番目の Cから Tへの変異を同定した。
尚、 用いた各反応混合液組成は 10 Iの PGR産物、 3単位の制限酵素 Nla iV (1 U I;バイオ ·ラボ Inc.製)、 2 lの 10X Buffer K (夕カラ社製)および 15 Iの 0.01 %BSA (夕カラ社製)である。 37でで 1時間のインキュベーション後、 反応産物は、 2%ァガロース ·ゲル上で電気泳動した。
d)結果
51人の日本人対象者において、 IKAP遺伝子上の遺伝子多型をスクリーニング し、 翻訳領域内で 6つの SNPs、 即ち [T819C(Leu273Leu)] 、
[G2295A(Gly765Gly)] 、 CA2446C(lle816Leu)] 、 [A2490G(lle830Met)] 、 [T3214A(Cys1072Ser)l および [C3473T(Pro1158Leu)] を特定した。
それらの 6つの SNPsの位置は、 図 1に示されているとおりである。
IKAP遺伝子によってコードされるアミノ酸配列番号の 273番目の Leu→Leuは、 WD様反復配列に位置したサイレント置換である。 IKAP遺伝子によってコード されるァミノ酸配列番号の 816番目の lle→Leuのアミノ酸変異および IKAP遺伝 子によってコードされるァミノ酸配列番号の 830番目の lle→Metのァミノ酸変異 は、 ΙΚΚα結合サイトにあり、 IKAP遺伝子によってコードされるアミノ酸配列 番号の 1072番目の Cys→Serのアミノ酸変異は、 IKK o;/IKKi3結合サイ卜に位置 しており、 IKAP遺伝子によってコ一ドされるァミノ酸配列番号の 1158番目の Pro→Leuの変異は、 セリン ' リッチドメインに位置していた。 これら遺伝子多 型の 2つは、 サイレント置換であつたが、 4つの非同義置換は、 蛋白産物におけ るミスセンス変異であった。
実施例 2
統計的分析方法：
気管支喘息患者とコントロール （対照） との対立遺伝子頻度を、 スタツトビュ J4.02ソフトウエア (StatView-J4.02 software: Abacus Concepts社製)を使用する contingency χ二乗テストによって比較した。
ォッズ比はブラウン (Brown)法に従い評価した (Brown, C.C., Am. J.
Epidemiol., 113(4), 474-480 (1981))。
ハプロタイプ分析は、 一般集団からの 207のコントロール、 235の小児気管支 喘息および 90の成人気管支喘息患者由来検体について、 最大尤度法に基づいた ARLEQUiNソフトウェア ·バージョン 2.0(スイス、 ジエネパ大学人類学部門、 遺伝学 ·生物測定学研究所： Genetics and Biometry Laboratory, Department of Anthropology, University of Geneva, Geneva)を用いて行った。 気管支喘息患者 とコントロール間のハプロタイプ頻度の差を、 χ二乗テストによって評価した。 この際、 一つのハプロタイプとその他のハプロタイプを比較し、 自由度は 1で あった。 ρ値は、 比較した八プロタイプの数 (Bonferroniの補正)を乗じることに よって捕正した。
更に、 トンプソンらの方法 (Thompson, E.A., et al., Am. J. Hum. Genet., 42, 113-124 (1988))に従い、 ペア 'ワイズ連鎖不平衡係数 （D'=D/Dmaxまたは
D/Dmin) を計算した。
結果：
対立遺伝子頻度の比較のために、 372人のコント口一ルと共に、 235人の小児 気管支喘息検体および 270人の成人気管支喘息検体について、 本発明方法に従 い検出された遺伝子多型を解析した結果は次の通りである。
尚、 気管支喘息患者は、 喘息発症年齢に従い、 18歳未満 (小児)および 18歳以 上 (成人)の 2つのグループに分けた。 18歳未満のグループは、 アトピ一気管支喘 息で代表され、 18歳以上のグループは非アトピーの気管支喘息が多かった。 気管支喘息表現型に対する IKAP遺伝子の SNPsを利用して対象関連解析を行 つた結果、 検出された 6つの SNPsは、 全てコントロール群においてハーディー ワインバーグ平衡の法則に従うことが確認された。
これら SNPs間に連鎖不平衡が成り立つか否かを検討した結果を表 3に示す。 表 3
Figure imgf000028_0001
SNPsの多くは、 表 3に示されるようにお互いに連鎖不平衡にあった。 特に IKAP遺伝子の 2295番目の Gが Aに変異した SNPと 2490番目の Aが Gに変異した SNP(G2295Aおよび A2490G)および IKAP遺伝子の 3214番目の Tが Aに変異した SNPと 3473番目の Cが Tに変異した SNP(T3214Aおよび〇3473ηとは、 ほぼ完全 な連鎖不平衡を示した (D'=0.966， χ 2=124.0ぉょび0'=0.884, χ 2=256.1)。
上記 6つの SNPsに関する遺伝子型決定の結果を表 4に示す。
Figure imgf000030_0001
82
3d S0C6S0/10 OAV 表 4に示される通り、 小児気管支喘息において、 IKAP遺伝子の 3214番目の丁 が Aに変異した SNP (T3214A(Cys1072Ser)) と 3473番目の Cが Ύに変異した
SNP(C3473T(Pro1158Leu))とに強い対立遺伝子の関連が観察された
(T3214A(Cys1072Ser)に関して、 τ 2=16.29, df=1 , P=0.000004および C3473T (Pro1158Leu)に関して、 χ 2=11.09， df=1， P=0.0009)。 前記表 3に既に示した通 り、 これら 2つのサイトは互いに強く関連していた。 また、
T3214A(Cys1072Ser)対立遺伝子は、 成人気管支喘息の発症にも関連していた
Figure imgf000031_0001
これらの結果は、 前記 2つのサイ卜における変異に基づく IKAP遺伝子がコー ドする 1072番目の Serと 1158番目の Leuが、 気管支喘息の病因学において、 特 に気管支喘息の早期発症において重要な役割を有しているかもしれないことを強 く示唆している。
小児気管支喘息は、 その殆どがアトピ一があり、 ハウスダスト、 ダニ、 花粉に 感作されており、 約 90%の患者に血清 IgEレベルの上昇が認められる (Woolcock, A. J. and Peat, J. K" Ciba Found Symp" 206， 122 (1997))„
成人と小児の気管支喘息の病態の違いに関して、 幾つかの遺伝的および環境的 要因が報告されている (Hopes,E. et al.， B. M.丄， 316， 664 (1998))。 本試験にお いて対象とした小児気管支喘息患者は、 殆どの症例において血清 IgEレベルの上 昇がみられ、 アトピー性喘息として診断されていた。 また成人気管支喘息患者は、 小児喘息の既往歴のあるものを除いたため多くが非アトピー性であった。
本試験では、 成人の気管支喘息発症と 3214番目の丁から Aへの変異との間に相 関が認められ、 3473番目の Cから Tへの変異との間には相関は認められなかつ た。 これは、 おそらく成人気管支喘息群中にアトピー性の表現型と非アトピー性 の表現型が混じっているためと考えられる。
尚、 気管支喘息患者を、 日本アレルギー疾患協会のガイドラインに従って、 重 症度によって更に副分類したとき、 これらの各 SNPsは、 臨床的な重症度との 関連においては違いを確認することができなかった。
更に、 IKAP遺伝子の 6つのサイトにおけるハプロタイプの見積られた頻度を、 気管支喘息 （小児および成人） とコントロールとの間で比較検討した。 その結果 を表 5に示す。
表 5
Figure imgf000033_0001
P は、 比較したハプロタイプの数を乗じることによって補正 （Bonferroniの補正） した値である。
表 5に示す結果より、 26の異なったハプロタイプ （表記した 9つの主要なハプ 口タイプおよびその他として 17種のマイナーなハロタイプ） が検出された。 表 記した 9つの優勢なハプロタイプは、 連鎖不平衡を表わした (コントロールに対 して頻度〉 1 %)o 17種のマイナーなハプロタイプを 1個として組合せて見積も られた p値を、 試験したハプロタイプ数を乗じることによって調整した (ボーン フエロニーの調整)。
すべてのグループにおいて、 最も一般的なハプロタイプは、 TGMTCであつ た。
また、 TGAAAT八プロタイプで、 前記したように小児気管支喘息と強い関連 が認められた 2つのアミノ酸の変異 (1072番目の Cysの Serへの変異と 1158番目 の Proの Leuへの変異)が観察された（χ 2=22.34 (df=1)， P=0.00004，予測比率
=2.94， 95o/0CI=2.48-3.4)。 しかしながら、 この TGAAATハプロタイプの後ろの 5 つのヌクレオチドが異なる TACGTC八プロタイプは、 小児気管支喘息において は大変まれで、 気管支喘息表現型と逆に相関していた ( χ 2 =13.65 (df=1), P=0.002，予測比率 =9.83， 95%CI=8.35-11.31)。 両者の対比から、 TGAAATハプ 口タイプを生じている個人間の気管支喘息に対する相対的な危険度は、
TACGTCハプロタイプを持っている個人のそれと比べて 25倍近く高いことが明 らかとなつた（χ 2=23.38 (df=1), =0.002,予測比率=25.12, 95%CI=23.56-26.68)0 尚、 この TGAAATハプロタイプは、 コントロール群においてより多く認めら れており、 防御的または喘息の発症に抵抗性のアレルと考えることができる。 ま た、 この八プロタイプは、 IKAPの ΙΚΚ- 結合ドメインおよびセリン · リッチド メインにおいて 2箇所のアミノ酸置換と関連しているので、 このタイプの対立 遺伝子は、 NF-Bのシグナル伝達を促進または抑制したり、 構成蛋白としての ΙΚΑΡ蛋白の働きを変化させる可能性が考えられる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒトの子孫に先天 性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する変異を含む遺伝子多型を検出 する方法であって：
(a) 検体からヒト I κ )3関連蛋白をコードする遺伝子を含む核酸を得、
(b) 当該核酸の DNA配列を決定して、 ヒト I K j8関連蛋白遺伝子の多型を検 出する、 気管支喘息発症危険因子の検出方法。
2. 気管支喘息が小児気管支喘息である請求項 1に記載の気管支喘息発症危険因 子の検出方法。
3. 遺伝子の多型が、.配列番号 1に記載のヒト I κ ]3関連蛋白のアミノ酸配列番 号 816番目の lieの Leuへの変異、 830番目の lieの Metへの変異、 1072番目の Cysの Serへの変異および 1158番目の Proの Leuへの変異からなる群から選ば れる少なくとも 1種のアミノ酸変異を伴うものである請求項 1に記載の気管支 喘息発症危険因子の検出方法。
4. 遺伝子の多型が、 配列番号 1に記載のヒト I κ /3関連蛋白のアミノ酸配列番 号の 1072番目の Cysの Serへの変異および/または 1158番目の Proの Leuへの 変異を伴うものである請求項 2に記載の小児気管支喘息発症危険因子の検出 方法。
5. 気管支喘息が成人気管支喘息である請求項 1に記載の気管支喘息発症危険因 子の検出方法。
6. 遺伝子の多型が、 配列番号 1に記載のヒト I κ ]3関連蛋白のアミノ酸配列番 号の 1072番目の Cysの Serへの変異を伴うものである請求項 5に記載の成人気 管支喘息発症危険因子の検出方法。
7. 遺伝子の多型が、 配列番号 2に記載のヒト I κ 3関連蛋白遺伝子のコード領 域の 819番目の Tの Cへの変異、 2295番目の Gの Aへの変異、 2446番目の Aの C への変異、 2490番目の Aの Gへの変異、 3214番目の Tの Aへの変異および 3473 番目の Cの Tへの変異からなる群から選ばれる少なくとも 1種の核酸変異を有 するものである請求項 1に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。
8. 配列番号 2に記載のヒト I κ 3関連蛋白遺伝子のコ一ド領域の 819番目、 2295番目、 2446番目および 2490番目の核酸がそれぞれ丁、 G、 Aおよび Aであ り且つ 3214番目の Tの Aへの変異および 3473番目の Cの Tへの変異を有する TGAAAT八プロタイプを検出する請求項 2記載の小児気管支喘息発症危険因 子の検出方法。
9. 遺伝子の多型の検出が、 ヌクレオチド直接配列決定法、 PCR-対立遺伝子特 異的ォリゴヌクレオチド (ASO)とドットプロットハイブリダイゼーション分 析、 一塩基伸長法、 PCR-単鎖高次構造多型 (SSCP)分析、 PCR-制限酵素断片 長多型 (RFLP)分析、 インベーダー法および定量的リアルタイム PCR検出法か らなる群から選ばれる少なくとも一つを含む方法によって行われる請求項 1 に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。
10. 遺伝子の多型の検出が、 制限酵素 Nla lVを用いた PCR-RFLP分析により行 われる請求項 9に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。
11. 請求項 1から 8のいずれかに記載の検出方法に用いられる PCR反応用ブラ ィマーまたはプローブとしてのオリゴヌクレオチド。
12. 配列番号 19から 36のいずれかから選択される請求項 11に記載の PCR反応 用プライマ一またはプローブとしてのオリゴヌクレオチド。
13. 請求項 11または 12に記載のォリゴヌクレオチドを有効成分として含有す る、 請求項 1に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法のための検出キッ 卜。
14. 制限酵素 Nla IVを有効成分として含有する、 請求項 10に記載の気管支喘息 発症危険因子の検出方法のための検出キット。
15. 配列番号 1に記載のヒト I κ ]3関連蛋白のアミノ酸配列番号の 816番目の lieの Leuへの変異、 830番目の lieの Metへの変異、 1072番目の Cysの Serへの 変異および 1158番目の Proの Leuへの変異からなる群から選ばれる少なくとも 1種のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコ一ドするヒト I κ 3関連蛋白
¾伝子。
16. 配列番号 2に記載のヒト I κ β関連蛋白遺伝子のコード領域の 819番目の Τ の Cへの変異、 2295番目の Gの Αへの変異、 2446番目の Aの Cへの変異、 2490 番目の Aの Gへの変異、 3214番目の Tの Aへの変異および 3473番目の Cの丁への 変異からなる群から選ばれる少なくとも 1種の核酸変異を有するヒト I K ^ 関連蛋白遺伝子。
17. 配列番号 2に記載のヒト I κ 関連蛋白遺伝子のコード領域の 819番目、 2295番目、 2446番目および 2490番目の核酸がそれぞれ丁、 G、 Aおよび Aであ り且つ 3214番目の Tの Aへの変異および 3473番目の Cの Tへの変異を有する TGAAATハプロタイプであるヒト I κ 3関連蛋白遺伝子。
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