WO2002055721A2 - Modulare transfektionssysteme auf der basis von nukleoproteinfilamenten - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transfektion von Zellen mit Hilfe zumindest eines zur Nukleoproteinfilamentbildung fähigen Proteins, bei dem das Protein zunächst mit mindestens einer funktionellen Komponente, welche einen oder mehrere Schritte der Transfektion beeinflusst, modifiziert wird, die zu transfizierende Nukleinsäure und das Protein einen fadenförmigen Komplex bildenm, und dieser Komplex schliesslich auf die zu transfizierenden Zellen gegeben wird. Die Erfindung betrifft berner ein Transfektionsagens aus Nukleoproteinfilamenten (NPF), wobei mindestens ein nukleoproteinfilamentbildendes Protein mit mindestens einer funktionellen Komponente für die Transfektion modifiziert ist. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemässen Transfektionsagens zur Herstellung eines Medikaments zur gentherapeutischen Behandlung von MEnschen und Tieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch entsprechende pharmazeutische Zubereitungen, insbesondere zur Verwendung in der Gentherapie sowie die Verwendung solcher Transfektionsagenzien als Komponente in Kits.

Description

  



     Modulare Transfektionssysteme    Hintergrund der Erfindung Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der nicht-viralen Transfektion von Nukleinsäuren. Unter dem Begriff Transfektion versteht man allgemein die Einbringung fremder Substanzen in Zellen. Die vorliegende Erfindung betrifft dabei ein Verfahren zur Transfektion von Zellen mit Hilfe zumindest eines zur Nukleoproteinfilamentbildung fähigen Proteins. Die Erfindung betrifft ferner ein Transfektionsagens enthaltend ein Nukleoproteinfilament (NPF), gebildet aus mindestens einer zu transfizierenden Nukleinsäure und mindestens einem zur Nukleoproteinfilamentbildung fähigen Protein.

   Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemässen Transfektionsagens, eine entsprechende pharmazeutische Zubereitung, insbesondere zur Verwendung in der Gentherapie, einen Kit zur Transfektion von Zellen mit Nukleinsäuren sowie besondere Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemässen Transfektionsagens.



  Stand der Technik Die bekannten nicht-viralen Transfektionsagenzien sind einer Reihe von Beschränkungen unterworfen. Bei der nicht-viralen Nukleinsäuretransfektion stellt meist sowohl die Grösse der globulären und oft einseitig geladenen Nukleinsäurekomplexe wie auch die mangelnde Steuerbarkeit einzelner oder mehrerer Transfektionsschritte ein grosses Problem dar. Letzteres ist unter anderem bedingt durch ihre mangelhafte Fähigkeit, die äussere Zellmembran oder innere Kompartimentmembranen zu durchdringen, mangelnden Schutz vor enzymatischem Abbau, geringe Bioverfügbarkeit sowie ungenügend kontrollierbare biologische Effekte nicht-biologischer Moleküle in der Zelle. Nukleinsäuren sind sterisch meist sehr ausladend, enzymatisch leicht abbaubar und assozieren durch ihren einseitigen Ladungsüberschuss leicht mit basischen Zellstrukturen.

   Die dadurch bedingte ungenügende Fähigkeit zur Kernpassage führt dazu, dass derzeitige Nukleinsäuretransfektionstechnolbgien fast ausschliesslich auf die Verwendung krebsartig entarteter Zellen, wie beispielsweise Zelllinien, beschränkt sind, da sich bei diesen Zellen die Kernmembran während der Zellteilung vorübergehend auflöst und ein Eintritt in den Kern möglich ist. Entartete Zellen sind aber mit dem ursprünglichen physiologischen Zustand primärer Zellen nicht vergleichbar, so dass aus entsprechenden Erkenntnissen mit solchen Zellen nicht ohne weiteres auf das Verhalten primärer transfizierter Zellen geschlossen werden kann.



  Es sind bereits eine Reihe von Transfektionsagenzien bekannt, von denen die weitaus meisten durch elektrostatische Interaktion mit Nukleinsäuren globuläre Komplexe ausbilden, oft mit einem Durchmesser von deutlich mehr als 50 nm (Tang und Szoka, 1997). Diese Komplexe   assoziieren    meist mit hoher   Überschussladung    an der Zelloberfläche und werden endozytotisch aufgenommen. Sie verlassen die Endosomen entweder durch Abpuffern der endosomalen Ansäuerung bis sie platzen (z. B. mit Polyethylenimin, Starburst Dendrimeren (Kukowska-Latello et   al.    1996) oder Zugabe von   Chloroquin)    oder durch die Wirkung membranaktiver Gruppen, Lipide oder lipophiler Peptide.

   Die Komplexe können jedoch erst bei der nächsten Zellteilung in den Zellkern gelangen, um dort nach der   Nukleinsäurefreisetzung    die gewünschte Wirkung zu entfalten.



  Das Problem der teilungsabhängigen Kernpassage kann durch Verwendung von NLS-Peptiden   (NLS = nuclear localization signal = Kernlokalisationssignal)    umgangen werden, vor allem, wenn der Problematik der   Signalmaskierung    und der unspezifischen DNA-Bindung Rechnung getragen wird (WO 00/40742, Amaxa).



  Im US-Patent Nr. 5,468,629 wird die Verwendung des RecA-Proteins sowie die mögliche Verwendung weiterer RecA-funktionshomologer Proteine zur Transfektion von Zellen mit ssDNA   (Einzelstrang-DNA)    beschrieben. Das Protein RecA unterstützt dabei in offenbar katalytischer Weise den Vorgang der homologen Rekombination der transportierten ssDNA mit der Zell-DNA durch Beeinflussung der Strangpaarung und des anschliessenden Strangaustausches. Die hier verwendeten Komplexe aus ssDNA von maximal 700 Nukleotiden und RecA-Protein sind als"RecA-coated" (mit RecA-Protein überzogene) Komplexe ausgeführt. Solche ssDNA-Protein-Komplexe werden durch DNA unter Zugabe von RecA in Anwesenheit von ATP-y-S ausgebildet, wobei stabile helikale präsynaptische Filamente ausgebildet werden.



  Diese Komplexe werden beispielhaft zur Transfektion von Zellinie, d. h. für teilungsaktive Zellen, insbesondere entartete Zellen mit geringem Erfolg eingesetzt.



  Zusammenfassung der Erfindung Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und ein Transfektionsagens zur Transfektion von Nukleinsäuren jeder Art in Zellen jeder Art zur Verfügung zu stellen, die eine verbesserte Aufnahme in Zellen ermöglichen und gleichzeitig eine Steuerung des Transfektionsvorgangs erlauben. Das Transfektionsagens sollte dabei sowohl während des Transfektionsvorgangs ausreichend stabil sein, als auch eine ausreichende Freisetzung der zu transfizierenden Nukleinsäuren im   Zielkompartiment    gewährleisten.



  Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, bei dem das Protein zunächst mit mindestens einer funktionellen Komponente, welche einen oder mehrere Schritte der Transfektion   beeinflusst,    modifiziert wird, die zu transfizierende Nukleinsäure dann mit dem modifizierten Protein beladen wird, wobei die Nukleinsäure und das Protein einen fadenförmigen Komplex bilden, und dieser Komplex schliesslich auf die zu transfizierenden Zellen gegeben wird.



  Die Aufgabe wird erfindungsgemäss ferner durch ein Transfektionsagens der eingangs genannten Art gelöst, bei dem das zur   Nukleoproteinfilamentbildung    fähige Protein mit mindestens einer funktionellen, die Transfektion beeinflussenden Komponente modifiziert ist. 



  Durch die Modifikation einzelner oder mehrerer Nukleoproteinfilament (NPF)bildender Proteine mit einzelnen oder mehreren gleichen oder verschiedenen zusätzlichen funktionellen Komponenten können einzelne Schritte des komplexen Transfektionsvorgangs in besonders vorteilhafter Weise individuell für die zu transfizierende Nukleinsäure und die   Zielzelle    gesteuert werden. Durch das erfindungsgemässe Verfahren bzw. Transfektionsagens lässt sich ferner die Transfektionseffizienz gegenüber bekannten Verfahren deutlich steigern.



  Erfindungsgemäss werden NPF-bildende Proteine in vorteilhafter Weise über die reine Schutzfunktion für die DNA hinaus, vor allem als modulares Trägersystem für funktionelle Gruppen eingesetzt. Es zeigt in zweierlei Hinsicht eine extrem geringe Raumausdehnung : es ist filamentös-nicht globulär-und es enthält nur ein Nukleinsäuremolekül pro Filament. Aufgrund des Aufbaus, der zu einem stöchiometrischen Verhältnis von wenigen Nukleotiden pro Trägerprotein führt, ist eine extrem hohe Dichte an funktionellen Signalen für die Transfektion möglich, deutlich mehr als bei globulären Komplexen.

   Die Signaldichte sowie Kombinationen verschiedener Signale sind durch Mischung verschiedener funktionalisierter Trägerproteine und Proteine ohne funktionelle Gruppen individuell einstellbar, so dass das erfindungsgemässe Transfektionsagens als modulares System auf unterschiedlichste Transfektionsbedingungen ausgerichtet werden kann. Die geringe Raumausdehnung und die hohe Signaldichte ermöglichen es zudem, zusätzlich zelleigene, auf kleine Moleküle ausgelegte Transportsysteme für die Transfektion zu nutzen. Aufgrund seines   filamentösen    Charakters, seines einfachen Aufbaus, seines geringen Durchmessers und seiner einstellbaren, extrem hohen Signaldichte ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren bzw. ist das erfindungsgemässe Transfektionsagens in der Lage, auch grosse Nukleinsäuremoleküle, wie z. B.



  Expressionsvektoren, unter Ausnutzung   zelleigener    Mechanismen gezielt zu transportieren.



  Die zusätzlichen funktionellen Komponenten können dabei beispielsweise direkt an die NPF-Proteine gebunden werden oder über einen Spacer, einen nicht funktionellen Abstandshalter. Solche Spacer bewirken einen grösseren Abstand von NPF-Protein und funktioneller Komponente, der eine gegenseitige sterische Hinderung vermeidet und eine bessere räumliche Verfügbarkeit des NPF-Proteins und der funktionellen Komponente gewährleistet. Die Struktur der erfindungsgemässen Agenzien verhindert dabei weitgehend eine Maskierung der funktionellen Komponenten.



  NPF-bildende Proteine bilden mit Nukleinsäuren meist durch kooperative Bindung Nukleoproteinfilamente, in denen Proteine und Nukleinsäuren einen Komplex eingehen, dessen Grösse bzw. Durchmesser im Vergleich zu den bekannten globulären Transfektionsagenzien erheblich verringert ist. Ein solches NPF kann z. B. von den Proteinen der RecA-Familie, die DNA-abhängige ATPasen sind, in Gegenwart von Nukleosidtriphosphaten wie ATP (Adenosintriphosphat) gebildet werden, bei vollständiger Beladung mit einer Dichte von z.   B.    einem Protein pro drei Basenpaaren bei doppelsträngiger DNA (Bianco et   al.,    1998). Diese hohe Proteindichte bietet einen ausgezeichneten Schutz gegenüber der enzymatischen Hydrolyse der Nukleinsäure, da enzymatische Angriffspunkte stark reduziert werden.



  Die NPF vermitteln zum einen eine ausreichende Stabilität des Komplexes und ermöglichen zum anderen eine genügende Freisetzung der transportierten Nukleinsäuren, z. B. im Kern. Durch Verwendung nicht-oder schwer hydrolysierbarer Analoga von Nukleosidtriphosphaten, beispielsweise von ATP und/oder GTP, wie z.



  B.   ATP-y-S    oder GTP-y-S, besteht zudem die Möglichkeit, NPFs, die mit Hilfe ATPbindender Proteine, wie die der RecA-Familie gebildet werden, zusätzlich zu stabilisieren.



  Erfindungsgemäss umfassen die zur NPF-Bildung fähigen Proteine auch derivatisierte NPF-Proteine. Beispielsweise können Fusionsproteine hergestellt werden. Des weiteren können die NPF-bildenden Proteine verkürzt oder verlängert werden, einzelne Abschnitte oder Aminosäuren deletiert, eingefügt oder kovalent chemisch modifiziert werden, solange sie ihre erfindungswesentliche Funktion, die strukturelle Ausbildung von NPF mit Nukleinsäuren, wahrnehmen können. 



  Ein besonderer Vorteil ist erfindungsgemäss in der räumlichen Struktur der NPFs zu sehen, die es möglich macht, die natürlichen Kerntransportmechanismen auszunutzen. Der durch die Kernporengrösse bedingte maximale Durchmesser des Transfektionsagens wird auch bei sehr langen Nukleinsäuren nicht überschritten, d. h.



  NPFs können unabhängig von der Länge der zu transfizierenden Nukleinsäure als Transfektionsagens eingesetzt werden. Es ist gezeigt worden, dass die Grössenbegrenzung für den Transport durch die Kernpore bei ca. 25 nm (Feldherr und Akin, 1997) bzw. 50 nm (SV40-Virus) liegt (Yamada und Kasamatsu, 1993).



  Nukleinsäuren, denen der Kernmembrandurchtritt mit herkömmlichen Transfektionsagenzien mit globulären Strukturen und/oder unspezifischer Bindung von mehreren Nukleinsäuremolekülen pro Transfektionskomponente versperrt ist, können eine solche Grenze mit Transfektionsagenzien im Sinne der vorliegenden Erfindung leicht unterschreiten. Die Struktur der erfindungsgemässen Transfektionsagenzien ermöglicht erstmals sogar Durchmesser von    <  11    nm, je nach verwendetem NPF-bildendem Protein. Eine durch Verwendung von NPF-Proteinen fadenförmig aufgebaute Struktur ist daher auch geeignet für den Transport längerer Nukleinsäuren von mehreren Kilobasen Länge.

   Das erfindungsgemässe Verfahren und die erfindungsgemässen Transfektionsagenzien eignen sich folglich besonders gut zur Transfektion von Zellen mit grösseren   Nukleotidsequenzen.    Bevorzugt sind die erfindungsgemässen Transfektionsagenzien, die mindestens eine zu transfizierende Nukleinsäure von mindestens 700 Nukleotiden enthalten.



  Die vorliegende Erfindung kann vorteilhafterweise als solche zur Transfektion von Nukleinsäuren eingesetzt werden oder auch in Kombination mit anderen Transfektionsmethoden und Mitteln. Der hohe Beladungsgrad mit NPF-bildenden Proteinen erhöht die Hydrolysebeständigkeit und der geringe Durchmesser der NPF ermöglicht die Ausnutzung   zelleigener    Transportsysteme, die nur ausreichend kleinen Molekülen zugänglich sind, wie z. B. des Kerntransportsystems. Zudem ist die ausreichende Freisetzung der zu transfizierenden Nukleinsäuren in den   Zelikompartimenten,    vorzugsweise im Kern, gewährleistet. 



  Der erfindungsgemässe Begriff"Transfektionsagens"ist als Transportvehikel für Nukleinsäuren bzw. deren Derivate zu verstehen, das die zu transfizierende Nukleinsäure bereits enthält. Ein Transfektionsagens im Sinne dieser Erfindung führt mindestens einen einzelnen Schritt des komplexen Transfektionsvorgangs aus.



  Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff"Nukleoproteinfilament" (NPF) eine molekulare Struktur, bestehend aus Nukleinsäure (n) oder   Nukleinsäurederivaten    und Proteinen, die durch nicht-kovalente, meist kooperative Bindung einen filamentösen bzw. fadenförmigen Komplex bilden, der bevorzugt nur ein einziges Nukleinsäuremolekül oder Derivat davon enthält. Besonders bevorzugt sind helikate Nukleoproteinfilamente, wie sie z. B. von RecA mit einzel-oder doppelsträngiger DNA gebildet werden (Di Capua et   al.,    1982).



  Die zu"transfizierende Nukleinsäure"kann sowohl eine doppel-oder einzelsträngige DNA, eine doppel-oder einzelsträngige RNA sowie eine doppelsträngige DNA mit einzelsträngigen Enden sein, ein DNA/RNA-Hybrid, eine Antisense-DNA, Antisense RNA oder chemisch modifizierte Nukleinsäurederivate, bei denen beispielsweise die Hydrolysebeständigkeit erhöht wurde (peptide nucleic acid, PNA), oder in die reaktive Molekülgruppen zur kovalenten Bindung und/oder Veränderung von Zielnukleinsäuren eingefügt wurden. Unter Derivaten der transfizierbaren Nukleinsäuren wird auch die Modifizierung der verwendeten Nukleinsäure durch ein sequenzspezifisch oder kovalent gebundenes Protein verstanden. Die bevorzugte Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist DNA, insbesondere doppelsträngige DNA.

   NPF-bildende Proteine wurden bisher zumeist im Zusammenhang mit   einzelsträngiger    DNA, beispielsweise zur Rekombination, verwendet.



  Überraschenderweise hat sich aber im Rahmen der Erfindung herausgestellt, dass viele NPF-bildende Proteine unter geeigneten Bedingungen auch mit   doppelsträngiger    DNA stabile Komplexe bilden und zur erfindungsgemässen Transfektion von   doppelsträngiger    DNA verwendet werden können. In der Möglichkeit auch doppelsträngige DNA effizient zu transfizieren, liegt daher ein weiterer Vorteil der Erfindung. 



  In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung werden mit funktionellen Komponenten modifizierte NPFs durch Modifikation ursprünglicher NPF-bildender Proteine oder Derivaten davon hergestellt. Die Modifikation kann dabei durch die Deletion oder Insertion von Aminosäuren und/oder Proteindomänen erfolgen. Die Modifikation kann auch durch chemische Änderung von Aminosäuren und/oder anderen Molekülgruppen und/oder durch die chemische Kopplung von Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden oder anderen Molekülen an das NPF-bildende Protein oder dessen Derivat erfolgen. Diese Modifikationen können   ggf.    unter Verwendung eines Spacers (Abstandhalters) erfolgen.



  Die erste Hürde einer Transfektion besteht in der Assoziation des Transfektionskomplexes an die Zelloberfläche. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens und Transfektionsagens verwendet daher mindestens ein zur NPF-Bildung fähiges Protein, das mit mindestens einer funktionellen Gruppe modifiziert ist, die die Assoziation des Komplexes bzw. Agens an die Zelloberfläche bewirkt. Diese kann zelltypspezifisch erfolgen über Bindung an zelltypeigene Oberflächenstrukturen, die auf einem Zelltyp bzw. auf wenigen Zelltypen exprimiert werden oder unspezifisch z. B. über Ladungsinteraktion.

   Für die zelltypspezifische Bindung können sämtliche natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Substanzen Verwendung finden, die an Rezeptoren der Zelloberfläche binden, wie beispielsweise Rezeptoren, die von Viren oder Bakterien für den Eintritt in die Zelle benutzt werden z. B. der Epstein Barr Virus Rezeptor CD21 (Delcayre, 1991) oder Listeria monocytogenes Rezeptor E-Cadherin (Mengaud, 1996). Weitere Beispiele für verwendbare Liganden-Rezeptorpaare sind das Transferrinrezeptor/Transferrin-System für Zellen, die viel Eisen benötigen, Asialoglycoproteinrezeptor/Galaktose für Hepatozyten,   Integrin/lntegrin-bindende    Peptide, wie RGD (Harbottle 1998) bzw. Molossin (Collins 2000) oder Hormone, die an Hormonrezeptoren binden, wie z. B.

   Insulin (Rosenkranz 1992) EGF (epidermal growth factor) oder Insulin-like growth factor   I    (Feero, 1997) u. a. sowie Oligosaccharide, die an Lektine binden (Midoux et   al.,    1993). Ebenfalls verwendbar sind zelltypspezifische Antikörper (Fominaya, 1996) bzw. Protein A oder dessen   IgG-    bindende Domäne (Ohno, 1997), sowie biotinylierte Proteine (entweder auf der Zelloberfläche biotinylierte Proteine oder biotinylierte monoklonale Antikörper) in Kombination mit Streptavidin (Schoeman, 1995). Besonders geeignet im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung ist das"Epitop-tagging", d. h. die zelltypspezifische Transfektion unter Verwendung bispezifischer Antikörper, die einerseits ein Epitop erkennen, nämlich kurze Peptide, wie z.

   B. vom   Influenza-Hämagglutinin    (Surdej, 1994) oder vom c-myc-Protein (Evan, 1985), die an die NPF-bildenden Proteine oder deren Derivate entweder gekoppelt oder gentechnisch fusioniert sind, zum anderen spezifische   Zelloberflächenstrukturen.    Zur zellunspezifischen Interaktion des   Transfektionskomplexes    durch Ladungsinteraktion können z. B. positive Ladungen z.



  B. über zusätzliche Aminosäuren (Lysin, Arginin ; Histidin) eingeführt werden.



  In weiterer besonders bevorzugter Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens und Transfektionsagens ist jeweils vorgesehen, dass die funktionelle Komponente den nicht-endosomalen Durchtritt des Komplexes bzw. Agens durch die Zellmembran bewirkt. Der nicht-endosomale Membrandurchtritt hat den Vorteil, dass das Agens gleich im Zytosol verfügbar ist und nicht der hydrolytisch aktiven Umgebung der Lysosomen ausgesetzt ist. Ein solcher Membrandurchtritt kann durch membranaktive Moleküle erreicht werden. Diese können natürlich vorkommende, veränderte oder synthetische Peptide sein, die meist aliphatisch oder amphiphil sind, wie beispielsweise virale Peptide, z. B. HIV tat, VP22, HBV Oberflächenantigen ; Peptide von Transkriptionsfaktoren wie z. B. der Homeodomäne von Antennapedia (Thoren et al 2000), engrailed, HOXA-5 ; Peptide von Zytokinen, z. B.

   IL-1 ss, FGF-1, FGF-2 ; Peptide von zellulären Signalsequenzen, z. B. dem Kaposi-Fibroblasten Wachstumsfaktor, monoklonale Antikörper, die lebende Zellen penetrieren, z. B. mab 3E10 (Weisbart et al 2000), synthetische oder chimäre Peptide, z.   B.    amphiphile Modellpeptide oder Transportan (Pooga et al. 1998).



  Weiterhin ist in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung zumindest eine erfindungsgemässe funktionelle Komponente vorgesehen, die den Austritt des Komplexes bzw. Agens aus Endosomen/Lysosomen bewirkt. Ein Durchtritt durch die  Zellmembran kann beispielsweise durch Endozytose erfolgen.   Im Anschluss    an die Endozytose müssen die Nukleoproteinkomplexe aus den Endosomen freigesetzt werden. Hierzu können alle endosomolytisch wirkenden Substanzen verwendet werden. Solche können beispielsweise von Bakterien oder Viren stammende Peptide bzw. deren Derivate oder synthetische Analoga oder andere, dem Fachmann bekannte synthetische Substanzen sein. Zu den endosomolytischen Substanzen aus Bakterien gehören z. B. Streptolysin   O,    Pneumolysin, Staphylococcal alpha-Toxin, Listeriolysin O (Provoda, 2000). Virale Peptide sind z.

   B. das N-terminale Hämagglutinin HA-2-Peptid des Influenza Virus (Steinhauer et   al.,    1995), der N Terminus des   VP-1-Proteins    des Rhinovirus HRV2 (Zauner et   al.,    1995) oder die Kapsid-Komponente Ad2 des Adenovirus (Hong, 1999). Zu den synthetischen Substanzen gehören z. B. amphipathische Peptide (GALA, KALA, EGLA, JTS1) (Wagner, 1999) oder Imidazol- (Pack, 2000) bzw.   Poly-Amidoamin-modifizierte    Polymere (Richardson, 1999).



  Eine besondere Hürde stellt für alle Transfektionsagenzien der Import in den Kern dar, welcher gewöhnlich abhängig von der Zellteilung, ggf. nach Zellstimulation erfolgt. In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist daher eine funktionelle Komponente vorgesehen, die den Transport des Komplexes bzw. Agens in den Zellkern bewirkt. Wesentlich für den Kerntransport sind zum einen der limitierende Kernporendurchmesser, zum anderen die für den Transport verwendeten Signalmoleküle. Als Signale für den Kerntransport im Rahmen der Erfindung dienen   nukleare    Liganden, die an einen nuklearen Rezeptor binden. Besonders geeignete nukleare Liganden sind NLS (nuclear   localization    signals,   Kernlokalisationssignale)    oder andere Komponenten der Kerntransportmaschinerie.

   Bevorzugt finden als Kernlokalisationssignale solche   Signalsequenzen    Anwendung, die entweder als solche   und/oder    zusammen mit ihren flankierenden Regionen keinen oder nur einen geringen positiven Ladungsüberschuss aufweisen, da ein Ladungsüberschuss zu unspezifischer Nukleinsäurebindung und somit zur Maskierung des Signals führen kann. Gut geeignet sind erweiterte Sequenzen sogenannter klassischer NLS, wenn die Summenladung des Peptids durch flankierende negativ geladene Aminosäuren zumindest annähernd ausgeglichen werden kann. Diese Aminosäuren können im Peptid/Protein an diesen Positionen natürlicherweise vorkommen oder aber aufgrund struktureller Überlegungen dort eingeführt werden. Auch sogenannte nichtklassische-NLS, wie z.

   B. ein NLS aus dem Influenza Virus"nucleoprotein" (Wang et   al.,    1997, Neumann et   al.,    1997) oder die Sequenz   M9    aus dem heterogenen nuklearen RNP (hnRNP) A1 Protein, die keinen grossen Überschuss an positiven Ladungen besitzen oder nicht über den klassischen Transportweg in den Kern gelangen, können Verwendung finden. Eine nicht vollständige, aber gute Übersicht über NLS, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können, gibt T.   Boulikas    (1993,1996,1997). Annähernd ladungsneutrale Sequenzen sind z.



  B. die NLS aus dem grossen T-Antigen des Simian Virus 40 mit flankierenden natürlich vorkommenden oder künstlich eingeführten negativ geladenen Aminosäuren (siehe auch WO 00/40742 Amaxa).



  Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt daher in der deutlichen Verbesserung der Transfektion von schwach oder nicht-teilungsaktiven eukaryontischen Zellen, insbesondere primären eukaryontischen Zellen mit Nukleinsäuren. Gerade die zuletzt genannten Zellen, die ihre biologische und medizinische Aussagekraft noch nicht eingebüsst haben, da sie beispielsweise unmittelbar aus einem Körper mittels Blutprobe oder Gewebebiopsie entnommen wurden, sind von entscheidender Bedeutung für den Fachmann. Bei der anstehenden Analyse der fast vollständigen Entschlüsselung des menschlichen Genoms liefert letztendlich nur die gezielte Expression des zu untersuchenden Gens in   Zellsystemen    mit ausreichender physiologischer Aussagekraft klare Hinweise auf eine mögliche technische Nutzbarkeit.

   Zudem ist die Transfektion primärer Zellen eine essentielle Voraussetzung für die nicht-virale Gentherapie ex vivo und in vivo.



  Das erfindungsgemässe Verfahren und Transfektionsagens können in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung jeweils mindestens ein zur   Nukleoproteinfilamentbildung    fähiges Protein, das mit mehreren funktionellen Komponenten unterschiedlicher Funktion modifiziert wird bzw. ist und/oder unterschiedliche Proteine, welche jeweils mit Komponenten unterschiedlicher Funktion modifiziert werden bzw. sind, umfassen.



  Die erfindungsgemässen Transfektionsagenzien können, wie oben beschrieben, durch eine Vielzahl von zur   NPF-Bildung    fähigen Proteinen oder Derivaten davon realisiert werden, die wiederum in ursprünglicher oder funktionell modifizierter Form vorliegen können. Es können entweder nur ein oder mehrere verschiedene zur NPF Bildung fähige Proteine verwendet und diese, je nach transfektionsspezifischer Anforderung, mit einem oder mehreren funktionellen Komponenten gleicher oder unterschiedlicher Funktion modifiziert werden. Je nach schwerpunktmässiger Zielsetzung können vom Anwender auf diese Art und Weise verschiedene Module zusammen gestellt werden.

   So entsteht ein Baukastensystem, dem   unmodifizierte    und modifizierte NPF-Proteine gleicher oder verschiedener Modifikation entnommen werden können, um eine Transfektionsstrategie optimal an die zu transfizierende Nukleinsäure und die Zielzellen anzupassen.



  In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Protein mit einer Vielzahl funktioneller Komponenten beladen wird bzw. ist. Hierdurch kann die Signaldichte insgesamt noch weiter erhöht werden, so dass verbesserte   Transfektionseffizienzen    und eine bessere Steuerung der Transfektion ermöglicht werden.



  Ein grosser Teil der NPF-bildenden Proteine bildet die NPF-Struktur in Anwesenheit von Nukleosidtriphosphaten wie ATP als Kofaktor aus. Die Zugabe von Nukleosidtriphosphaten bewirkt dabei eine Stabilisierung der NPF. Beim erfindungsgemässen Verfahren können daher in vorteilhafter Weise durch Nukleosidtriphosphate und/oder nicht-hydrolysierbare Analoga davon, insbesondere durch ATP (Adenosintriphosphat)   und/oder    GTP (Guanosintriphosphat) und/oder deren nicht-hydrolysierbare Analoga ausgebildet bzw. stabilisiert werden. Dies geschieht gegebenenfalls durch kovalente Bindung nach photochemischer Reaktion.



  Nicht-hydrolysierbare Nukleosidtriphosphat-Analoga sind beispielsweise   ATP-y-S    (Adenosin 5'-0-3-thiotriphosphat) und   GTPyS    (Guanosin 5'-0-3-thiotriphosphat)   (Ellouze,    1999). Mögliche ATP-Analoga, die NPF-ATPasen nach photochemischer  Reaktion modifizieren, sind 8N3ATP (8-Azidoadenosin 5'-triphosphat) bzw.   5'FSBA    (5'-p-Fluorosulfonylbenzoyladenosin) (Knight, 1985).



  In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens wird dieses in Kombination mit anderen biologischen und/oder chemischen und/oder physikalischen Transfermethoden für biologisch aktive Moleküle wie beispielsweise Liposomenvermittelter Transfer, Mikroinjektion, Elektroporation, Immunoporation, ballistische Methode, Transfer mit Hilfe kationischer Lipide,   Kalziumphosphat,    DEAE-Dextran, Polyethylenimin oder   pH-sensitivem    Hydrogel angewendet. Solche Transfermethoden, insbesondere die Elektroporation, können vorteilhaft einzelne Schritte des Transfektionsprozesses wie z. B. den Eintritt in das Zytoplasma der Zelle unterstützen.



  Bevorzugte erfindungsgemässe Transfektionsagenzien enthalten als NPF-bildendes Protein ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe der Proteine RecA, RadA, ScRad51, RAD51,   hDmc1,    SASP,   ICP8,    vorzugsweise UvsX, besonders bevorzugt hRAD51oder eine Mischung aus mindestens 2 der aufgezählten Proteine oder ein oder mehrere Derivate dieser Proteine. NPF-bildende Proteine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise RecA aus Escherichia coli sowie seine Funktionshomologen aus Viren, Prokaryonten und Eukaryonten, wie z. B. UvsX aus dem Bakteriophagen T4 (Mosig, 1987) RadA aus Archaebakterien (Seitz et   al.,    1998), ScRad51 aus Saccharomyces cerevisiae, RAD51 aus Säugern und insbesondere hRad51 des Menschen.

   Homologe Proteine zu RecA sind in mindestens 60 verschiedenen Bakterienarten (Roca und Cox, 1990, Karlin und Brocchieri, 1996, Karlin et   al.,    1995), in Archaea (Sandler et al. 1996), in allen untersuchten Eukaryonten (Ogawa et al. 1993) sowie in Mitochondrien (Thyagarajan et   al.,    1996) und Plastiden (Cerutti et   al.,    1992) nachgewiesen worden. RecA und seine Homologen bilden mit   einzel-und/oder      doppelsträngiger    DNA helikale NPF mit einem Durchmesser von ca. 11 nm. Die Bindung von RecA erfolgt kooperativ und führt zu einer teilweisen Entwindung der DNA-Helix.

   RecA, UvsX, ScRad51 und hRad51 bilden NPF mit einer   Bindungsstöchiometrie    von drei Basenpaaren pro  Monomer (doppelsträngige DNA) bzw. 3-6 Nukleotiden pro Monomer (einzeisträngige DNA) (Bianco et al. 1998, Baumann und West 1998). Bevorzugt ist auch die Meiose-spezifische Rekombinase hDMC1, die mit doppelsträngiger DNA Filamente bildet, die aus einer linearen Reihe aus gestapelten Proteinringen besteht (Masson et   al.,    1999). Des weiteren ist auch die Gruppe der SASP-Proteine (small acid-soluble spore proteins) aus Sporen von Bacillus und Clostridium Arten bevorzugt. Auch die SASP binden an doppelsträngige DNA und bilden dabei helikale NPF mit einem Durchmesser von ca. 6,6 nm aus (Griffith et al. 1994). Auch virale Proteine, die mit einzel-und/oder doppelsträngiger DNA Filamente bilden können, wie z.

   B. das Protein ICP8 aus Herpes simplex, sind bevorzugte NPF-bildende Proteine (Lee  &  Knipe, 1985).



  Für die NPF-bildenden Proteine UvsX, Rad51 und RecA wurde bei einer vollständigen Beladung von doppelsträngiger DNA eine Bindungsstöchiometrie von einem Monomer dieser Proteine pro 3 Basenpaaren gezeigt (Bianco et al 1998). Für UvsX z. B. kann solch ein vollständiger Beladungsgrad abhängig vom verwendeten Bindungspuffer, der Konformation der verwendeten Nukleinsäure und der Temperatur bei einem 3-bis 5-fachen Überschuss von Protein erreicht werden (Yu und Egelman 1993), beim   a/ss    Typ SASP aus Bacillus subtilis bei einem Protein : DNA Verhältnis von ca. 5 : 1 (Griffith et al 1994). Ein solcher möglichst vollständiger Beladungsgrad der Nukleinsäuren mit Protein, der spezifisch für jedes der bevorzugten NPF-bildenden Proteine definiert ist, ist im Rahmen dieser Erfindung besonders bevorzugt.

   Aber auch eine Beladung der Nukleinsäuren unterhalb des höchstmöglichen Beladungsgrades für ein spezielles NPF-bildendes Protein ist im Rahmen der Erfindung möglich. Eine geringere Beladung der Nukleinsäuren mit NPF-bildenden Proteinen ist beispielsweise dann bevorzugt, wenn zusätzlich spezifisch an DNA bindende Proteine für definierte Schritte der Transfektion eingesetzt werden oder wenn für spezielle Anwendungen Pufferbedingungen gewählt werden müssen, die für eine vollständige Beladung der Nukleinsäure mit NPFbildenden Proteinen nicht optimal sind. 



  Erfindungsgemäss sind unter NPF-bildenden Proteinen sowohl natürliche NPFbildende Proteine wie auch deren Derivate zu verstehen. Unter Derivaten von zur NPF-Bildung fähigen Proteinen versteht der Fachmann zum einen die Modifikation durch die Deletion oder Einführung zusätzlicher   Aminosäureabfolgen    bzw.



  Proteindomänen bei rekombinanten Proteinen und/oder die Einführung funktioneller Gruppen durch chemische Modifikation bereits vorhandener Molekülgruppen und/oder die chemische Kopplung von Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Lipiden oder anderen Molekülen.



  Das erfindungsgemässe Transfektionsagens kann in vorteilhafter Weise auch zur Herstellung von Medikamenten zur gentherapeutischen Behandlung von Mensch und Tier verwendet werden. Die therapeutisch nutzbaren Nukleinsäuren können in Form der erfindungsgemässen Transfektionagenzien auch primären Zellen und komplexen Transfektionsverläufen zugänglich gemacht werden.



  Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher pharmazeutische Zubereitungen, die ein erfindungsgemässes Transfektionsagens, gegebenenfalls neben üblichen Hilfs-und Trägerstoffen enthalten.



  Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Kits, die zur Transfektion von Zellen mit Nukleinsäuren geeignet sind und mindestens ein erfindungsgemässes NPF-bildendes Protein und zumindest eine erfindungsgemässe funktionelle Komponente sowie mindestens eine der folgenden Komponenten umfassen : a) Nukleosidtriphosphat und/oder Nucleosidtriphosphat-Analoga b) mindestens eine zu transfizierende Nukleinsäure   c)    Hilfs-und Zusatzstoffe Solche Kits können individuell auf verschiedene Bedürfnisse von Fachleuten ausgerichtet sein, beispielsweise für bestimmte Nukleinsäuren, Zielzellen oder Stablitätsanforderungen durch die Auswahl spezifischer NPFs, spezifischer NPF Modifikationen und einzelner   Hilfs-und    Zusatzstoffe optimiert sein.

   Dabei kann das  Protein bereits mit der (den) funktionellen Komponente (n) beladen sein oder Proteine und funktionelle Komponenten können im Kit separat enthalten sein.



  Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemässen Transfektionsagenzien zum   Zellscreening,    sprich zur Identifizierung von Aktivatoren oder Inhibitoren des oder der Expressionprodukt (e) des Transfektionsagens in mitotisch nicht oder schwach   teilungsaktiven    Zellen, primären Zellen und anderen Zellen mit begrenzter Lebensspanne. Solche Screening stellen ein grundsätzliches Verfahren zur Identifizierung von Aktivatoren oder Inhibitoren validierter und nicht-validierter Targetproteine zur Wirkstofffindung in der pharmazeutischen Industrie dar.

   Diese Screeningverfahren sind meist so ausgestaltet, dass stabil mit   Fremdnukleinsäuren    transfizierte Zellen potentiellen Inhibitoren und/oder Aktivatoren ausgesetzt werden und deren Einfluss auf die Physiologie der Zellen, gegebenenfalls im Vergleich zu   Vergleichszellen,    bestimmt wird. Das erfindungsgemässe Transfektionsagens ist geeignet, die Fremdnukleinsäure kurz vor der Zugabe der   Aktivatoren/lnhibitoren    auch in mitotisch nicht oder schwach aktive Zellen, primäre Zellen und andere Zellen mit begrenzter Lebenspanne einzuführen und so diese Zellen als   Testzellen    zugänglich zu machen.



  Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemässen Transfektionsagenzien zur Identifizierung von physiologisch aktiven Nukleinsäuren. Dies ist insbesondere für die schnelle und physiologisch relevante Auswertung der Genomdatenmengen von Bedeutung, die der wissenschaftlich-pharmazeutischen   Fachgemeinschaft    zur Verfügung stehen.



  Dadurch, dass mit dem erfindungsgemässen Transfektionsagens die Transfektion unabhängig von der Zellteilung und/oder der Endozytose wird, wird die Zeit zwischen Transfektion und Analyse erheblich verkürzt. Das ermöglicht einen deutlich höheren Probendurchsatz. Auch schwer transfizierbare, sogar nicht-teilungsaktive primäre Zellen sind mit Hilfe der erfindungsgemässen Transfektionsagenzien zugänglich. Die so erreichte Transfektion und die physiologische Auswertung von Veränderungen im  Vergleich zu   Kontrolizellen    ermöglicht die Identifizierung physiologisch aktiver Nukleinsäuren.



  Abkürzungen : Ausser den im Duden gebräuchlichen, wurden folgende Abkürzungen verwendet : AMP-PCP   Adenylyl- (ss, g-methylen)-diphosphonat    AMP-PNP   S'-Adenylylimido-diphosphat    DEAE Diethylaminoethan DNA Desoxyribonukleinsäure dYT double Yeast-Trypton FACScan Fluorescence activated cell scanning FCS foetales Kälberserum FL   Fluoreszenz    FSC Forwardscatter GMP-PNP   S'-Guanylylimido-diphosphat    GTP Guanosintriphosphat H6 Histidin-Hexamer Ig Immunglobulin kb Kilobasen mi Milliliter mM   Mittimot    msec Millisekunde   NCBI    National Center for Biology Information ng Nanogramm nm   nanomolar    PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion Pi  <RTI  

   ID=17.9> Natriumdihydrogenphosphat/Dinatriumhydrogenphosphat     RNA Ribonukleinsäure RPMI Roswell Park Memorial Institute SDS Natriumdodecylsulfat SV40 Simian Virus 40 TAE Tris Acetat Ethylendiamintetraacetat U/mg Einheiten/Milligramm upm Umdrehungen pro Minute   ZI-Puffer    Zellinjektions-Puffer pg Mikrogramm pI Mikroliter Kurze Beschreibung der Abbildungen Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Expressionsplasmide Abb. 1 zeigt die schematische Darstellung des Aufbaus und der Herstellung der in den Beispielen beschriebenen   NPF-bildenden    Proteine.



  Abbildung   2    : Bindung von UvsX an doppelsträngige DNA Abbildung 2 zeigt Ansätze von jeweils 200 ng eines gereinigten 1 kb-PCR-Fragments mit den dargestellten Mengen an H6UvsX in 76 mM   K2HPO4,    17mM   KH2P04,    14mM   NaH2P04,    pH=7,2,5mM   MgCl2    und 0 bzw. 1 mM   ATP-y-S,    die in einem Endvolumen von 15 ul für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschliessend auf ein 0,8 % iges TAE/Agarose-Gel, das nachträglich mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, aufgetragen wurden.



  Abbildung 3 : Bindung von NLS-modifiziertem UvsX an doppelsträngige DNA in
Gegenwart verschiedener ATP-Analoga 250 ng eines gereinigten 1 kb-PCR-Fragments wurden mit 15 ug UvsXH6N2 in 76 mM   K2HPO4,      17mM      KH2P04,    14mM   NaH2P04,    pH=7,2,5 mM   MgCl2    und 0,5 bzw. 2 mM der angegebenen Nukleotid-Analoga in einem Endvolumen von 20 pI für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend wurden die Ansätze geteilt und zu einer Hälfte (B) 220 ng eines 1,7 kb-PCR-Fragmentes hinzugefügt, für weitere 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschliessend alle Ansätze auf ein 0,8% iges   TAE/Agarose-Gel,    das mit Ethidiumbromid nachträglich gefärbt wurde, aufgetragen.



     Abbildung 4    : Bindung einer Mischung aus UvsX und modifiziertem UvsX an doppelsträngige DNA Jeweils 200 ng eines gereinigten 1 kb PCR-Fragments wurden in 76 mM   K2HP04,    17mM   KH2P04,    14mM   NaH2P04,    pH=7,2,5mM   MgCl2    und 1 mM ATP-Y-S mit den angegeben Mengen an gereinigtem H6UvsX bzw. UvsXH6N2 für 30 min bei RT inkubiert und anschliessend alle Ansätze auf ein 0,8 % iges TAE/Agarose-Gel, das mit Ethidiumbromid nachträglich gefärbt wurde, aufgetragen. Um artifizielles Laufverhalten der DNA durch Salz, Imidazolspuren oder Glyzerin auszuschliessen, wurde in Spalte 8 und 9 noch zusätzlich Elutions-bzw.

   Dialysepuffer hinzugefügt (Endkonzentration : 1/10 vol Elutionspuffer mit 500 mM Imidazol, 3/20 vol Dialysepuffer mit   50%    Glyzerin).



  Abbildung 5 : FACScan-Analyse der Transfektion von   NlH3T3-Zellen    in
Kombination mit   Elektroporation    Abb. 5 a-d zeigt eine FACScan-Analyse : 5a) Elektroporation ohne DNA, 5b) Elektroporation von Vektor-DNA ohne UvsX, 5c) mit in UvsX verpackter Vektor-DNA, 5d) mit in UvsX-NLS verpackter Vektor-DNA.



  Abbildung 6 : Eine weitere FACScan-Analyse der Transfektion von NIH3T3
Zellen in Kombination mit Elektroporation  Abb. 6 zeigt ein Balkendiagramm der Ergebnisse einer FACScan-Analyse der Transfektion mit in UvsX-NLS (UvsXH6N2-2) verpackter Vektor-DNA und in UvsX  "scrambled"-NLS    (UvsXH6N2sc) verpackter Vektor-DNA.



  Abbildung 7 : Eine   fluoreszenzmikroskopische    Analyse der Transfektion von
NlH3T3-Zellen in Kombination mit Mikroinjektion.



  Gezeigt ist die Expression eines fluoreszierenden Markerproteins (linke Seite) in mikroinjizierten   NIH3T3-Zellen. Als Injektionsmarker    diente   BSA-Cy5,    das im entsprechenden   Fluoreszenzfilter    sichtbar gemacht wurde (rechte Seite). Die Bilder 1 und 2 zeigen Zellen, die mit DNA und UvsXH6N2sc ins Zytoplasma injiziert wurden, die Bilder 3 und 4 solche, die mit DNA und UvsXH6N2-2, die Bilder   5    und 6 solche, die nur mit DNA injiziert wurden.



  Abbildung 8 : Schematische Darstellung der   Expressionsplasmide    für SASP
Proteine Abb. 8 zeigt eine schematische Darstellung des Aufbaus und der Herstellung der in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen SASP-Proteine Abbildung 9 : (A) Aufreinigung von SASP-Protein  (B) DNA-Bindungsfähigkeit von SASP-Protein Abb. 9 A zeigt ein SDS-Gel mit gereinigtem SASP-Protein. Abb. 9 B zeigt die Bindung von DNA durch SASP-Protein in einer DNA-shift-Analyse.



  Abbildung 10 : (A) Aufreinigung von SASP-NLS-Protein  (B) DNA-Bindungsfähigkeit des SASP-NLS-Proteins  Abb. 10 A zeigt ein SDS-Gel mit gereinigtem SASP-NLS-Protein (SASP-H6N2). Abb.



  10 B zeigt die Bindung von DNA durch SASP-NLS-Protein in einer DNA-shift Analyse.



  Abbildung 11 : Kopplung eines Peptids mit RGD-Motiv an H6UvsX Abb. 11 zeigt die elektrophoretische Auftrennung von H6UvsX-Protein mit und ohne chemisch gekoppeltes Peptid RGD2. Gezeigt sind zwei unabhängig voneinander hergestellte Präparationen von H6UvsX*   (RGD2). In    jeder Spur wurde etwa 1 pg Protein eingesetzt.



  Abbildung   12    : Bindung von unterschiedlich modifizierten UvsX-Proteinen an doppelsträngige DNA Abb. 12 zeigt in einem Agarose-Gel aufgetrennte NPFs bestehend aus einem doppelsträngigen DNA-Fragment und einem Gemisch aus H6UvsX* (RGD2) und UvsXH6N2-2 (Spur 1), oder aus UvsXH6N2-2 allein (Spur 2) oder aus H6UvsX* (RGD2) allein (Spur 3).



  Abbildung 13 : DNA-Shift-Analyse der Bindung von UvsXH6N2 und
UvsXH6N2NIT-2 an Fluoreszein-markierte DNA Abb. 13 zeigt einen DNA-Shift von DNA-UvsXH6N2 und DNA-UvsXH6N2NIT-2.



  Die Proteine wurden mit einem   AlexaFluor488-markierten    DNA-Fragment inkubiert wie in Beispiel   10    beschrieben.



  Abbildung 14 : Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Aufnahme von NPFs in    NlH3T3-Zellen    durch Endozytose Abb. 14a und 14b zeigen   fluoreszenzmikroskopische    Bilder von   NlH3T3-Zellen.   



  Gezeigt sind jeweils eine Aufnahme im   Hellfeld    (unten) und eine in  Auflichtfluoreszenz (oben). Zu erkennen sind im Hellfeld vesikuläre intrazelluläre Kompartimente, die im   Fluoreszenzlicht    aufgrund der endozytierten, Fluoreszeinmarkierten DNA aufleuchten.



  Abbildung 15 : Prozentualer Anteil von Zellen mit   endocytierten    NPFs Abb. 15 zeigt in einem Balkendiagramm den prozentualen Anteil der Zellen, die mindestens ein fluoreszierendes vesikuläres Kompartiment besitzen.



  Abbildung 16 : Schematische Darstellung der   Expressionsplasmide    Abb. 16 zeigt die schematische Darstellung des Aufbaus der Expressionsplasmide zur Herstellung von hRad51-Fusionsproteinen.



  Abbildung 17 : Bindung von NLS-modifiziertem hRad51   (hRad51 H6N2)    an doppelsträngige DNA Abb. 17 (A) zeigt ein SDS/Coomassie-Gel mit hRad51 H6N2 (12,7   ug)    und hRad51 H6   (11 ut)    nach der Reinigung über   Nickel-Chelat-Affinitätschromatografie.    Abb.

     17    (B) zeigt Ansätze von jeweils 100 ng eines gereinigten 0,9 kb-PCR-Fragments mit den dargestellten Mengen an hRad51 H6N2 in 38 mM   K2HP04,    8,5 mM   KH2P04,    7 mM   NaH2 ? 04,    pH=7,2,15 mM   MgCiz,    2,5 mM ATP und 25% Glycerin, die in einem Endvolumen von 30   lul    für 10 min bei   37 C    inkubiert und anschliessend auf ein 1 % iges TAE/Agarose-Gel, das nachträglich mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, aufgetragen wurden.



  Abbildung 18 Bindung einer Mischung aus verschieden modifizierten UvsX  (UvsX-NLS-VP22 und UvsX-NLS) an doppelsträngige DNA Abb. 18 (A) zeigt ein SDS/Coomassie-Gel mit UvsXH6N2VP22c50. 



  Abb. 18 (B) : Jeweils 140 ng eines gereinigten 1,7 kb PCR-Fragments wurden in 96 mM   K2HPO4,    21,5 mM   KH2P04,    18mM   NaH2P04,    pH=7,2,5mM   MgCI2    und 1,3 mM ATP-Y-S mit den angegeben Mengen an gereinigtem UvsXH6N2VP22c50 bzw.



  UvsXH6N2-2 für 30 min bei RT inkubiert und anschliessend alle Ansätze auf ein 0,8 % iges   TAE/Agarose-Gel,    das mit Ethidiumbromid nachträglich gefärbt wurde, aufgetragen.



  Abbildung 19 : Transfizierte   NIH3T3    Zellen nach Behandlung mit Komplexen aus DNA und einer Mischung aus UvsX-NLS-VP22 und UvsX
NLS   Fluoreszenzmikroskopische    Aufnahme von   NIH3T3 Zellen,    24 h nach der Behandlung mit Komplexen aus 1 lug Expressionsvektor-DNA und einer Mischung aus 19 ug UvsXH6N2VP22c50 und 39 ug UvsXH6N2-2.



  Abbildung 20 : Schematische Darstellung des prinzipiellen Aufbaus des erfindungsgemässen Verfahrens und Transfektionsagens basierend auf Nukleoproteinfilamenten Beschreibung der Erfindung Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung, ohne diese jedoch auf die beispielhaft offenbarten Stoffe und Verfahren zu beschränken.



  Beispiel 1 : Herstellung von rekombinanten UvsX als   NPF-bildende    Proteine Als   NPF-bildende    Proteine wurden die Proteine UvsXH6, UvsXH6-2, H6UvsX und H6UvsX-2 verwendet (siehe. Abb. 1). 



  Aufbau der Proteine : UvsXH6 (400 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-391 : UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391), Aminosäuren 392-394 : Linker aus den Aminosäuren   G392GS394,    Aminosäuren 395-400 :   H395HHHHH400    für die Aufreinigung über Nickel-Chelat-Affinitätschromatografie, Aminosäureaustausch :   L43oP.   



  UvsXH6-2 (403 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-391 : UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391), Aminosäuren   392-394 :    Linker aus den Aminosäuren   S392YG394, Aminosäuren    395-400 :   H395HHHHH400,    Aminosäuren 401403 : C-Terminus aus den Aminosäuren   M401YS403.   



  H6UvsX (404 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-4 : N-Terminus aus den Aminosäuren   M1SYS4,    Aminosäuren 5-10 :   H5HHHHH' (),    Aminosäuren 11-13 : Linker aus den Aminosäuren   S11YG13,    Aminosäuren 14-404 : UvsX aus dem Phagen T4   (NCBI-Protein    Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren   1-391),    Aminosäureaustausch :   Q340oL.   



  H6UvsX-2 (404 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-4 : N-Terminus aus den Aminosäuren   M1GYS4,    Aminosäuren 5-10 :   H5HHHHH10,    Aminosäuren   11-13    : Linker aus den Aminosäuren   S11YG13,    Aminosäuren 14-404 : UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391).



     Klonierung    der Expressionsplasmide Für die Expression der oben genannten Proteine in geeigneten Escherichia coli Zellen wurden Plasmide konstruiert, die eine kodierende Sequenz für UvsXH6, UvsXH6-2, H6UvsX bzw. H6UvsX-2 unter der Kontrolle des lac-Promoters enthalten  (pExH-UvsXH6, pExH-UvsXH6-2,   pExH-H6UvsX    bzw. pExH-H6UvsX-2, siehe Abb.



  1). Die Plasmide wurden durch Ligation zweier PCR-Produkte hergestellt. Das erste PCR-Produkt wurde von pMCS5 (MoBiTec, Göttingen, Deutschland) amplifiziert. pMCS5 ist ähnlich aufgebaut wie   pBluescript    SK (-) (Stratagene) und unterscheidet sich von diesem nur im 5'-Bereich der kodierenden Sequenz für das   lacZa-Fragment.    pMCS5 besitzt daher den lac-Promoter und nachgeschaltet den lac-Operator, wodurch die Expression einer eingefügten kodierenden Sequenz von der Abwesenheit von aktivem lac-Repressor abhängt. Um in jedem Fall eine konstitutive Expression zu erreichen, wurden die Amplifikationsprimer so gewählt, dass der lac Operator im PCR-Produkt nicht mehr enthalten ist. Das resultierende PCR-Produkt entsprach pMCS5 von Position 992 bis 664 zuzüglich Restriktionsüberhängen.

   Vor der Position 992 (3'zum lac-Promoter) wurden die Nukleotide GAATTC (EcoR   I    Restriktionsschnittstelle) sowie TGTGTG und hinter der Position 664 die Nukleotide ACTAGT   (Spe I Restriktionsschnittstelle)    und CACACA angefügt, um die Ligation nach Restriktionsverdau mit EcoR   I    und Spe I zu ermöglichen. Die kodierende Sequenz für UvsXH6, UvsXH6-2 bzw. H6UvsX und H6UvsX-2 wurde durch PCR Amplifikation von T4-DNA mit Primern gewonnen, die die gewünschten Restriktionsschnittstellen, eine Ribosomenbindungsstelle und die zusätzlichen Codons enthalten. Die PCR-Produkte enthielten am 5'-Ende vor dem Startcodon die zusätzlichen Nukleotide   5'-CACACAGAATTCATAAAGGAAGATATCAT-3',    sowie am 3'-Ende nach dem Stopcodon die zusätzlichen Nukleotide 5'-ACTAGTTGTGTG-3'.



  Reinigung :   1,    5-3   I    dYT/Ampicillin (200pg/ml) wurden 1 : 1000 mit einer   Übernachtkultur von    pExH H6UvsX in DH5 angeimpft und über Nacht bei   37     C mit 250 UPM wachsen gelassen. Die bei 7000 x g geernteten Kulturen ergaben ca. 7-15 g Bakteriensediment. Dieses wurde für   1-3    Tage   bei-20  C    eingefroren. Das Sediment wurde auf Eis getaut und in 10-20 mi kaltem Start-Puffer resuspendiert. Die Lyse fand mit Hilfe von 10 mg Lysozym (Serva, 190.000 u/mg) und ca. 4 g Glaskügelchen (Sigma, G-8893) unter langsamem Rühren für 1 h bei   4     C statt. Anschliessend wurden 50 ul DNAse   I    (Serva, 2 mg/ml) hinzugefügt und für weitere 30 min inkubiert.



  Nach Abzentrifugieren des Lysats (45 min 11000 x g, 4    C)    wurde der Überstand durch einen Sterilfilter (Porengrösse 0,45 um) filtriert und auf eine mit Ni++-lonen beladene und   äquilibrierte,    1 ml HiTrapTM Chelating-Säule (Pharmacia) geladen. Die weiteren Aufreinigungsschritte erfolgten nach dem entsprechenden Pharmacia Protokoll für Proteine, die mit einem Histidin-Hexamer versehen wurden. Aliquots der verschiedenen Elutionsfraktionen wurden auf   SDS/Coomassie-Gelen    aufgetragen.



  Die jeweils saubersten Fraktionen wurden vereinigt und über Centriplus YM30 Säulen (Millipore) nach dem entsprechenden Protokoll weiter eingeengt. Danach erfolgte eine zweimalige Dialyse (Dialyseschlauch : Spectra/Por, MWCO : 25.000) gegen ein mindestens   eintausendfaches    Volumen ZI-Puffer für jeweils mindestens eine Stunde bei   4  C,    dann über Nacht bei 4  C gegen   ZI-Puffer/50    % Glyzerin. Das Dialysat wurde in 30-50 pi-Fraktionen aliquotiert und   bei-80     C aufbewahrt.



  Verwendete Puffer : ZI-Puffer : 76 mM   K2HPO4,    17 mM   KH2P04,    14 mM   NaH2P04,    pH=7,2 Startpuffer : 20 mM Pi, 0,5 M   NaCI,    10 mM Imidazol, pH=7,4 Waschpuffer : 20 mM Pi, 0,5 M NaCI, 20-50 mM Imidazol, pH=7,4 Elutionspuffer : 20 mM Pi, 0,5 M NaCI, 100-500 mM Imidazol, pH=7,4 Konzentrationsbestimmung : Die Konzentration der UvsX-Proteine wurde durch Messen der OD280 unter Einbeziehung des über das Programm Gene   InspectorTM    (Textco,   Inc.)    errechneten Extinktionskoeffizienten bestimmt. Bei H6UvsX betrug sie 2,5-3,5   pg/pl.   



  Versuchsbeschreibung : Über Ni++-Sepharose gereinigtes H6UvsX wurde mit jeweils 200 ng eines 1 kb PCR Fragmentes (mit und ohne 1 mM ATP-y-S) inkubiert. 



  Ein durch Proteinbindung verursachter Shift der DNA im Agarosegel zeigt, dass H6UvsX in Abhängigkeit von der Konzentration, doppelsträngige DNA bindet, und dass diese Bindung durch ATP-Y-S verstärkt wird.



  Mit   ATP-Y-S    entstehen Protein-DNA-Komplexe, die mit Ethidiumbromid stärker angefärbt werden als ohne   ATP-y-S,    was einen Hinweis auf eine topologische Veränderung des Nucleoproteinfilamentes durch das   Nukleotidanalogon    darstellt.



  Beispiel 2 : Herstellung eines Transfektionsagens, basierend auf UvsX als
NPF-bildendem Protein mit einem Kernlokalisationssignal als funktioneller Komponente In Analogie zu Beispiel 1 wurden Plasmide hergestellt, die die Expression der Fusionsproteine UvsXH6N2, UvsXH6N2-2, N2H6UvsX und N2H6UvsX-2 erlauben, die ausgehend von den im Beispiel 1 beschriebenen Proteinen zusätzlich ein Kernlokalisationssignal enthalten (siehe Abb. 1).



  Aufbau der Proteine : UvsXH6N2 (426 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-391 : UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391), Aminosäuren 392-394 : Linker aus den Aminosäuren   G392GS394,    Aminosäuren 395-400 :   H395HHHHH400, Aminosäuren    401403 : Linker aus den Aminosäuren   G401GS403,    Aminosäuren 404-417 : Kernlokalisationssignal   nis-2    (Aminosäuren 2-15, SEQ ID NO : 9 aus WO 00/40742), Aminosäuren 418-421 : C-Terminus von UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 388-391), Aminosäuren 422-426 : C Terminus aus den Aminosäuren   K422LVTG426,    Aminosäureaustausch :   Y233eV.   



  UvsXH6N2-2 (420 Aminosäuren) :  Aminosäuren 1-391 : UvsX aus dem Phagen T4   (NCBI-Protein    Accession-no. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391), Aminosäuren 392-394 : Linker aus den Aminosäuren   S392YG394, Aminosäuren    395-400 :   H395HHHHH4oo, Aminosäuren    401403 : Linker aus den Aminosäuren   M401YS403,    Aminosäuren 404-417 : Kernlokalisationssignal   nls-2    (Aminosäuren 2-15, SEQ ID NO : 9 aus WO   00/40742),    Aminosäuren 418-420 : C-Terminus aus den Aminosäuren   G413YP420.   



  N2H6UvsX (420 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-3 : N-Terminus aus den Aminosäuren   M1SY3,    Aminosäuren 4-17 :   Kernlokalisationssignal nls-2    (Aminosäuren 2-15, SEQ ID NO : 9 aus WO   00/40742),    Aminosäuren 18-20 : Linker aus den Aminosäuren   L 18yS20,    Aminosäuren 21-26 :   H21HHHHH26,    Aminosäuren 27-29 : Linker aus   den Aminosäuren S27YG29,    Aminosäuren 30-420 : UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391), Aminosäureaustausch :   Q356oL.   



  N2H6UvsX-2 (421 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-4 : N-Terminus aus den Aminosäuren   M'Gyp4,    Aminosäuren 5-18 : Kernlokalisationssignal nis-2 (Aminosäuren 2-15, SEQ ID NO : 9 aus WO 00/40742), Aminosäuren 19-21 : Linker aus den Aminosäuren   S19YS21,    Aminosäuren 22-27 :   H22HHHHH27,    Aminosäuren 28-30 : Linker aus den Aminosäuren   S23YG30,    Aminosäuren 31-421 : UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391).



     Kionierung    der   Expressionsplasmide    Für die Expression in geeigneten Escherichia coli Zellen wurden Plasmide konstruiert, die eine kodierende Sequenz für UvsXH6N2, UvsXH6N2-2, N2H6UvsX bzw. N2H6UvsX-2 unter der Kontrolle des lac-Promoters enthalten (pExH UvsXH6N2, pExH-UvsXH6N2-2, pExH-N2H6UvsX bzw. pExH-N2H6UvsX-2, s. Abb.



  1). Die Plasmide wurden wie im Beispiel 1 beschrieben durch Ligation zweier PCR Produkte hergestellt (s. Abbildung 1). 



  Reinigung : Die Reinigung von UvsXH6N2 erfolgte wie unter Beispiel 1) für H6UvsX beschrieben.



  Konzentration : 10-20   pg/pl.   



  Versuchsbeschreibung : UvsXH6N2 bindet an doppelsträngige DNA. Die Bindung wird durch   ATP-y-S    stabilisiert : Um den Einfluss verschiedener ATP-Analoga auf das Bindungsverhalten von UvsXH6N2 an DNA zu untersuchen, wurde das Protein zunächst mit einem 1 kb DNA-Fragment und verschiedenen ATP-Analoga inkubiert. Anschliessend wurde zur Kompetition ein 1,7 kb grosses DNA-Fragment zugegeben. Erfolgt durch Zugabe eines   ATP-Analogon    eine Stabilisierung der Bindung des Proteins an die DNA, so ist zu erwarten, dass ein kompetierendes DNA-Fragment mit geringerer Wahrscheinlichkeit von UvsXH6N2 gebunden wird, solange sich noch kein Gleichgewicht eingestellt hat.

   Wie in Abb. 3 zu erkennen, bleibt der Protein-DNA Komplex, der mit dem 1 kb grossen Fragment und UvsXH6N2 entsteht, in Anwesenheit von ATP-Y-S und dem 1,7 kb-Fragment im Vergleich zu allen anderen benutzten ATP-Analoga stabil, d. h. das 1,7 kb-Fragment wird offenbar nicht oder nur marginal innerhalb der beobachteten Zeit von freigewordenen UvsXH6N2-Molekülen besetzt.



  Beispiel 3 : Herstellung eines Transfektionsagens mit einer Mischung aus modifiziertem und nicht-modifiziertem NPF-bildendem Protein Versuchsbeschreibung : Verschiedene Verhältnisse von H6UvsX und UvsxH6N2 wurden mit einem 1 kb DNA Fragment inkubiert. Die zwei Proteine retardieren aufgrund ihres unterschiedlichen  Molekulargewichts die DNA unterschiedlich stark (siehe Spalte 2 und 3 von Abbildung 4). Mischt man die Proteine vor der Zugabe zur DNA, so entstehen je nach Verhältnis von H6UvsX zu UvsXH6N2 intermediäre Komplexe, die wiederum eine scharfe Bande ergeben und somit ein gleiches durchschnittliches Molekulargewicht haben. Dies zeigt, dass die DNA statistisch gleichmässig mit beiden Proteinen belegt ist.



  Beispiel 4 : Transfektion einer Zellinie   (NIH3T3)    mit UvsX-NLS in Kombination mit   Elektroporation      NlH3T3-Zellen    (adhärent, bis zur 70-80 % igen Konfluenz kultiviert) wurden mit einem Vektor, der für die schwere Kette des Maus MHC Klasse I Proteins   H-2KK    kodiert, transfiziert. 1   x    106 Zellen wurden mit 25 ng Vektor-DNA, die zuvor in Bindungspuffer (76 mM   K2HP04,    17 mM   KH2P04,    14 mM   NaH2P04,    5 mM   MgCl2    pH 7,21) mit 14   wog    UvsX bzw. UvsX-NLS sowie mit oder ohne 1 mM ATP-Y-S für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert wurde, elektroporiert.

   Dazu wurden die Zellen in Elektroporationspuffer (103 mM   NaCI,    5,36 mM KCI, 0,41 mM   MgCI2"23,    8 mM   NaHCO3,    5,64 mM   Na2HPO4,    11,2 mM Glucose, 0,42 mM Ca   (N03)      2,    20 mM HEPES, 3,25   p. M Gtuthathion)    in einem Gesamtvolumen von 100   J    aufgenommen und in einer Küvette mit 2 mm Elektrodenabstand elektroporiert. Die   Elektroporation    erfolgte über eine exponentielle Entladung bei einer Spannung von 240 V und einer Kapazität von   450      uF.    Die Halbwertzeit des Spannungsabfalls betrug typischerweise 12 msec.

   Unmittelbar nach der Elektroporation wurden die Zellen mit Kulturmedium (RPMI mit 10 % FCS) aus den Küvetten gespült, für 10 min bei   37  C    inkubiert und dann in einer Kulturschale mit vorgewärmtem Kulturmedium überführt. Nach 6 h Inkubation wurden die Zellen geerntet und nach zweimaligem Waschen in PBS mit einem   Cy5-gekoppelten-anti-H-2KK-Antikörper    inkubiert und   durchflusszytometrisch    (FACScan) analysiert. Durch Färbung mit Propidiumjodid wurde die Anzahl toter Zellen bestimmt.

   Sechs Stunden nach der   Elektroporation    exprimieren (abzüglich des Hintergrundes von durchschnittlich 0,25%) 7,4% bzw. 8,7% der mit freier Vektor-DNA transfizierten Zellen das   H-2KK-Protein.    Im Vergleich dazu liegt die Expressionsrate der Zellen, die mit Vektor-UvsX transfiziert wurden bei 2,9% bzw. 3,8%. Die Expressionsrate bei einer Transfektion mit Vektor-UvsX-NLS beträgt 19,2% bzw.



  18,9% (siehe Abbildungen 5a-5d).



  Zur Untersuchung des Kerntransportes wurde das physikalische Verfahren der Elektroporation gewählt, damit ausser UvsX keine weiteren biochemischen Komponenten einen Einfluss auf die Transfektion haben. Die feste Bindung von UvsX mit   ATP-y-S    an DNA beeinträchtigt allerdings die Beweglichkeit des Komplexes im elektrischen Feld und reduziert damit die Effizienz der Elektroporation um ca.



  60%. Allein die Anbringung eines Kerntransportsignals führt in diesem System zu einer Steigerung der Expression kurz nach der Transfektion um einen Faktor von durchschnittlich 5,7. Die Steigerung der Expressionsrate durch UvsX-NLS im Vergleich zu UvsX zeigt also, dass bei Verwendung eines   Kerntransportsignals    als funktioneller Komponente DNA durch UvsX in den Kern befördert wird. Eine Analyse bereits kurze Zeit nach der Transfektion wird erheblich dadurch verbessert, dass auch solche Zellen zugänglich werden, die sich zwischen Transfektion und Analyse nicht geteilt haben.



  Beispiel 5 : Transfektion einer Zellinie   (NIH3T3)    mit   UvsX-scrambled-NLS    bzw.



   UvsX-NLS in Kombination mit Elektroporation Herstellung von   UvsX-scrambled-NLS    Um den Einfluss des   Kerntranslokalisationssignals    auf die Transfektion testen zu können, wurde für   Vergleichszwecke    ein UvsX-Derivat hergestellt, das in seiner Nettoladung einem UvsX-Protein mit einer NLS entspricht, selbst aber keine funktionelle NLS enthält. 



  Mit Hilfe von teilhomologen   Oligonukleotidprimern    wurde das UvsX-Gen aus Plasmid pExH-UvsXH6N2-2 (vergl. Abb. 1) dergestalt amplifiziert, dass am C-Terminus des entstehenden Proteins UvsXH6N2sc an Stelle der Aminosäure-Sequenz EEDTPPKKKRKVED   ("nls-2",    entspricht den Aminosäuren 2-15 von SEQ   ID    No : 9 aus WO 00/40742) die Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO : 1 ("scrambled", d. h. eine durchmischte NLS-Sequenz) exprimiert wird. Letztere Aminosäuren entsprechen in ihrer Zusammenstellung, nicht aber in ihrer Reihenfolge der beschriebenen   nls-2.    Die Nettoladungen von UvsXH6N2-2 und UvsXH6N2sc sind somit gleich, aber nur UvsXH6N2-2 enthält ein intaktes Kernlokalisationssignal.



  Das Protein UvsXH6N2sc wurde gereinigt wie für die Proteine in Beispiel 1 beschrieben.



     NlH3T3-Zellen    (adhärent, bis zur 70-80 % igen   Konfluenz    kultiviert) wurden mit einem Vektor, der für ein fluoreszierendes Markerprotein kodiert, transfiziert. Zu diesem Zweck wurden zunächst 25 ng Vektor-DNA in Bindungspuffer (siehe Beispiel 1) mit 1,5 mM ATP-Y-S sowie mit 16-18 ug der angegebenen Proteine für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Protein-DNA-Komplexe wurden zu jeweils 3 x   105      N) H3T3-Zellen,    resuspendiert in 80 ul Elektroporationspuffer (140 mM   Na2HP4/NaH2P04,    10 mM   MgCi2,    5 mM KCI, pH 7,2), gegeben.

   Die   Elektroporation    erfolgte in einer Küvette mit 2 mm Elektrodenabstand über eine exponentielle Entladung bei einer Spannung von 240 V und einer Kapazität von 450   pF.    Die Halbwertzeit des Spannungsabfalls betrug typischerweise 12 msec. Nach Zugabe von   400    ul Medium, zusammengesetzt aus   RPMI    1640 Fa. Gibco, 5 % FCS, 2 mM Glutamax (L-Alanyl-L-Glutamin, Fa.   Invitrogen),    100   U/ml      Penicillin/Streptomycin,    0,5 mM   ss-Mercaptoethanol,    wurden die Zellen in Kulturschalen (6-Loch-Platten) zu 1   ml    vorgewärmtem Medium gegeben und bei   37  C    und 5 % C02 inkubiert.

   Nach 6 h erfolgte die   durchflusszytometrische    Analyse (FACScan).



  Das Ergebnis ist in Abbildung 6 grafisch dargestellt : 9 % der mit freier Vektor-DNA transfizierten Zellen exprimieren das Markerprotein. Die Expressionsrate der Zellen, die mit Vektor-UvsX-NLS (DNA+UvsXH6N2-2) transfiziert wurden, liegt dagegen bei 21 %. Im Vergleich dazu beträgt die Expressionsrate der Zellen bei einer Transfektion mit Vektor-UvsX-scrambled-NLS (DNA+UvsXH6N2sc) lediglich 4 %.



  UvsX, modifiziert mit einem Kerntranslokalisationssignal, führt somit zu einer deutlich erhöhten Effizienz sowohl im Vergleich mit freier DNA als auch im Vergleich mit der Modifikation durch ein nicht-funktionelles Kerntranslokalisationssignal. Da es sich bei der letztgenannten Transfektion um die eigentliche Kontrolle handelt, ergibt sich hieraus, dass durch die Modifikation des UvsX die Transfektionseffizienz auf das 5fache gesteigert werden konnte. Durch das erfindungsgemässe Verfahren bzw.



  Transfektionsagens lässt sich also die Transfektionseffizienz deutlich steigern.



  Darüber hinaus ist durch die Modifikation des NPF-bildenden Proteins auch in vorteilhafter Weise eine gezielte Steuerung des Transfektionsvorgangs, hier beispielsweise ein Dirigieren in den   Zellkern,    möglich (siehe auch Beispiel 6).



  Beispiel 6 : Transfektion einer Zellinie   (NIH3T3)    in Kombination mit Mikroinjektion 140 ng eines 1,7 kb Expressionsvektor-DNA-Fragments wurden mit 9 ug modifiziertem UvsX-Protein wie oben beschrieben in Bindungspuffer und 1 mM ATP  y-S    in einem Endvolumen von 20 ul für 30 min bei RT inkubiert. Als   Injektionsmarker    diente BSA-Cy5, das unmittelbar vor der Injektion in einer Konzentration von ca. 1   pg/pl    eingesetzt wurde.



  Am Vortag auf CELLocate Coverslips (Eppendorf)   subkonfluent    ausgesäte   NIH3T3-    Zellen wurden mit Hilfe eines   Micromanipulators    und Transjektors (Eppendorf) unter einem inversen   Fluoreszenzmikroskop    (Leica   DMIL)    durch auf Femtotipps (Eppendorf) geladene Proben mikroinjiziert.



  Die Auswertung erfolgte fluoreszenzmikroskopisch (Olympus BX 60  Fluoreszenzmikroskop,    digitale S/W-Kamera SPOT-RT von Diagnostic Instruments Inc., Auswertungssoftware : Metaview Imaging System von Universal   Imaging    Corporation) nach 5 h weiterer Inkubation der Zellen bei   37  C    und 5 % C02. 



  Abbildung 7 zeigt mikroinjizierte   NlH3T3-Zellen.    Die Bilder 1 und 2 zeigen Zellen, die mit DNA und UvsXH6N2sc ins Zytoplasma injiziert wurden, die Bilder 3 und 4 solche, die mit DNA und UvsXH6N2-2, die Bilder 5 und 6 solche, die nur mit DNA injiziert wurden. Expression war nur zu beobachten, wenn die Protein-DNA-Komplexe UvsXH6N2-2, also mit einem Kerntranslokalisationssignal modifiziertes UvsX-Protein enthielten (Abb. 7, Bild 3). Selbst bei sehr langer Belichtung konnte in den Kontrollansätzen (Abb. 7, Bild 5 : nur DNA bzw. Abb. 7, Bild 1 : DNA mit UvsX  scrambled-NLS)    bei Zellen, die bei der Mikroinjektion eindeutig nur im Zytoplasma, nicht im Kern, getroffen wurden, keine Expression beobachtet werden.



  Beispiel 7 : Herstellung von rekombinanten SASP als NPF-bildende Proteine   Kionieruna, Expression    und Reinigung des SASP-Proteins aus   B.    subtilis Das SspC-Gen aus Bacillus subtilis, welches für ein SASP ("small acid-soluble spore protein") kodiert, wurde aus 8 Oligonukleotiden nach der Khorana-Methode (beschrieben in Bertram und Gassen : Gentechnische Methoden, Gustav Fischer Verlag, 1991, S. 212-213) synthetisiert und zwischen die Ncol-und   Bglll-Schnittstellen    des Plasmids pARA13 (Cagnon et   al.,    1991 ; Protein Engng. 4 : 843-847) ligiert. Dabei wurde die Proteinsequenz mit der NCBI-Protein Accession Nr.   : NP389876    zugrunde gelegt.

   Die reverse Translation in DNA erfolgte unter Verwendung der in (Andersson und   Kurland    1990 ; Microbiol. Rev. 54 : 98-210) beschriebenen Codon-Präferenzen von in   E.    coli stark exprimierten Genen. Das enstehende Plasmid pARA13-SASP diente als Matrize für die   Klonierung    von zwei weiteren Plasmiden, welche für SASP Proteine kodieren, die entweder N-terminal (H6-SASP) oder C-terminal (SASP-H6) eine Polyhistidinsequenz von 6 Histidinen tragen (Abb. 8). Die Plasmide wurden in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) pLysS (Novagen, Madison) transformiert und auf   LB/Ampicillin/Glucose    (0,2%) ausplattiert. 



  20   ml      M9-Minimalmedium    (0,2% Glucose) wurden jeweils mit Einzelkolonien beimpft und über Nacht bei 37  C und 220 Upm wachsen gelassen. Am nächsten Tag wurden die Kulturen bei einer   OD600 von    ca. 1,0 mit 0,2% Arabinose induziert und für weitere 6 Stunden wachsen gelassen. Rohextrakte (0,5 ml pelletierte Kultur in   PBS/Ladepuffer)    wurden auf hochauflösende   SDS-Gele    (nach Schägger und von Jagow 1987 ; Anal. Biochem. 166 : 368-79) aufgetragen und mit Coomassie-Blau gefärbt (Abb. 9 A).



  Zur präparativen Aufreinigung wurden 2   I    M9/Glucose 1 : 200 mit einer Übernachtkultur angeimpft. Bei einer OD600 von ca. 1,0 wurde wiederum mit 0,2% Arabinose induziert und für 6 h wachsen gelassen. Die Bakterien wurden dann pelletiert und   bei-20 C    eingefroren. Exemplarisch ist im Folgenden die Aufreinigung von SASP-H6 beschrieben. Nach Auftauen des Pellets (ca. 7 g) wurden diese in 14 ml Startpuffer (s. Beispiel 1), versehen mit einer Tablette Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail, Roche, Mannheim, resuspendiert und für 3 min bei 280 Watt (Labsonic U (Braun Biotech, Melsungen repeating duty puls ; 0,5 sec) auf Eis sonifiziert. Der Extrakt wurde bei   4  C    zentrifugiert.

   Die Aufreinigung erfolgte ansonsten wie für die UvsX-Proteine beschrieben über HiTrap Cheating Columns (Amersham Pharmacia, Uppsala). Die Fraktionen zwischen 200 mM und 500 mM Imidazol, die das Protein in hoher Konzentration enthielten, wurden vereinigt und mit Hilfe von Centriplus-Säulen (YM-3, Millipore, Eschborn) auf ca. 3 ml eingeengt. Das SASP-Protein wurde dann drei Mal gegen 1 x ZI-Puffer (siehe Beispiel 1) dialysiert und Aliquots in einer Konzentration von ca. 5   lug/pi      bei-80 C    eingefroren.



  Test der   DNA-Bindungsfähiakeit    des SASP-Proteins Jeweils 125 ng eines 1,7 kb-DNA-Fragments wurden mit verschiedenen Mengen SASP-H6-Protein in 1 x   ZI-Puffer    bzw. 1/10 x ZI-Puffer für 30 min. bei Raumtemperatur vorinkubiert und anschliessend auf ein 0,8 % iges TAE-Agarose-Gel aufgetragen. 



  Abbildung 9 B zeigt, dass die DNA vollständig vom Protein gebunden wird. Das diffuse Erscheinungsbild der DNA-Protein-Banden könnte darin begründet sein, dass die Proteine möglicherweise während des Gellaufs von der DNA dissoziieren.



  Beispiel 8 : Herstellung eines Transfektionsagens, basierend auf SASP als    NPF-bildendem    Protein mit einem Kernlokalisationssignal als
Modifizierung Zur Herstellung eines SASP mit einem Kernlokalisationssignal (NLS) als funktioneller Komponente wurde an den bereits vorhandenen Klon   pARA13-SASP-H6    (siehe Abb.



  8) C-terminal eine für ein Kernlokalisationssignal   ("nls-2",    Aminosäuren 2-15, SEQ ID NO : 9 aus WO 00/40742) kodierende DNA-Sequenz über PCR-Amplifikation angehängt. Dabei diente das oben genannte Plasmid als PCR-Matrize. Das entstehende Plasmid   pARA13-SASP-H6N2    (siehe Abb. 8) wurde wie in Beispiel   7    beschrieben, transformiert und das Protein SASP-H6N2 entsprechend aufgereinigt.



  Test der   DNA-Bindungsfähigkeit des SASP-NLS-Proteins    Jeweils 125 ng eines 1,7 kb-DNA-Fragments wurden mit verschiedenen Mengen SASP-H6N2-Protein in 1 x ZI-Puffer für 30 min. bei Raumtemperatur vorinkubiert und anschliessend auf ein 0,8 % iges TAE-Agarose-Gel aufgetragen.



  Abbildung 10 B zeigt, dass auch das NLS-modifizierte SASP die DNA retardiert. Die DNA-Protein-Banden erscheinen diffus.



  Beispiel 9 : Herstellung eines Transfektionsagens mit einem Integrinbindungs    motiv    für die Assoziation des Komplexes an die Zelloberfläche als funktioneller Komponente  Integrine sind membranverankerte Adhäsionsproteine auf der Zelloberfläche, von denen einige ein Peptidmotiv aus drei Aminosäuren (Arginin-Glycin-Asparaginsäure oder"RGD"-Motiv) als Bindungspartner erkennen. Die Bindung führt zur Clusterung mehrerer   Integrinmoleküle    auf der Zelloberfläche und zur Endozytose (Plow et   al.,    2001). Durch die Modifikation von UvsX als NPF-bildendem Protein mit einem RGD Motiv kann erreicht werden, dass das Transfektionsagens spezifisch über   Integrine    in die   endosomalen    Kompartimente der Zelle aufgenommen wird.



  Aufbau der Proteine Die verwendeten Proteine H6UvsX und UvsXH6N2-2 sind mit den in Abbildung 1 dargestellten und in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen identisch.



  Das Protein H6UvsX* (RGD2) wurde durch chemische Kopplung hergestellt. Das RGD2 genannte Peptid ist ein Nonapeptid (NITRGDTYI) aus dem Penton Base Protein des Adenovirus Typ7 (Bal et   al.,    2000), das so synthetisiert wurde, dass an der N-terminalen Aminogruppe eine chemisch aktive Gruppe (SMCC, Succinimidyl 4   [N-Maleimidomethyl]-Cyclohexan-1-Carboxylat)    steht, die die Kopplung an freie   Cystein-SH-Gruppen    im UvsX-Protein ermöglicht.



  Für die Kopplung wurden 6 nmol H6UvsX mit 60 nmol Peptid in 76 mM   K2HP04,    17mM   KH2P04,    14mM   NaH2P04,    pH=7,2, eine Stunde lang bei 37    C    inkubiert, anschliessend durch mehrmaliges Waschen mit   Inkubationspuffer    über einen MicroCon-Filter (10 kDa Ausschlussgrösse) von überschüssigem Peptid gereinigt. Die erfolgreiche Kopplung wurde durch ein verändertes Laufverhalten in einer SDS Polyacrylamidgelelektrophorese nachgewiesen. Abbildung 11 zeigt zwei unabhängig voneinander hergestellte Präparationen von H6UvsX* (RGD2) auf einem SDS Polyacrylamidgel. Das gekoppelte Peptid führt zu einer Erhöhung des Molekulargewichts und damit zur Änderung des Laufverhaltens in SDS-Gelen. 



  Versuchsbeschreibung : Bindung von UvsX-NLS und UvsX-RGD an doppelsträngige DNA und Bildung gemischter NPFs : Ansätze von jeweils 140 ng eines gereinigten 1.6 kb-PCR-DNA-Fragments mit einem Gemisch aus 15 pg H6UvsX* (RGD2) und 4 ug UvsXH6N2-2, mit 4 pg UvsXH6N2-2 allein und mit 15 pg H6UvsX* (RGD2) allein wurden in 76 mM   K2HPO4,    17 mM   KH2P04,    14 mM   NaH2P04,    pH=7,2,5 mM   MgCiz    und 1 mM ATP-Y-S in einem Endvolumen von 20 pI für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschliessend auf ein 0,8   % iges TAE/Agarose-Gel    aufgetragen, das nachträglich mit Ethidiumbromid gefärbt wurde. Die Elektrophorese erfolgte für 1 h bei 100 V.



  Abbildung 12 zeigt, dass die beiden unterschiedlich modifizierten Proteine mit der DNA jeweils NPFs bilden, die sich in ihrem Laufverhalten deutlich unterscheiden.



  NPFs, bestehend aus einem doppelsträngigen DNA-Fragment und einem Gemisch aus H6UvsX* (RGD2) und UvsXH6N2-2 (Spur 1), oder aus UvsXH6N2-2 allein (Spur 2) bzw. aus   H6UvsX*    (RGD2) allein (Spur 3), wurden in einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Da die Proteinmenge im Unterschuss vorhanden ist, liegt auch freies DNA-Fragment vor. Beide Proteine in einem Ansatz binden gemeinsam an das DNA-Fragment und führen zu einem gemischten NPF, das eine Molekularmasse zwischen den NPFs der reinen Proteine besitzt (Spur 1). Hieraus folgt also, dass UvsX-NLS und UvsX-RGD an doppelsträngige DNA binden und gemischte NPFs bilden können.



  Beispiel 10 :   Spezifische Aufnahme von NPFs in Zellen durch Integrin-    vermittelte Endozytose Aufbau der Proteine  In Analogie zu Beispiel 1 wurde Plasmid UvsXH6N2NIT-2 (Abb. 1), welches die Expression eines Fusionsproteins aus UvsX und einem Integrin-bindenden RGD Motiv erlaubt, rekombinant hergestellt.



  Aminosäuren 1-391 : UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391), Aminosäuren 392-394 : Linker aus den Aminosäuren   S392YG394,    Aminosäuren 395-400 :   H395HHHHH400,    Aminosäuren 401403 : Linker aus den Aminosäuren   M 40lyS403, Aminosäuren    404-417 : Kernlokalisationssignal nis-2 (Aminosäuren 2-15, SEQ   ID    NO : 9 aus WO 00/40742), Aminosäuren 418-420 : C-Terminus aus den Aminosäuren   G413YP420 und    Aminosäuren 421-432 :   RGD-Motiv"NIT": N4211TRGDTYIPYP432.   



  Versuchsbeschreibung : Bildung von NPFs aus Fluoreszein-markierter DNA und UvsX-Derivaten : Jeweils 1 pg eines gereinigten 1.6 kb PCR-DNA-Fragments, das   AlexaFluor488-    markiertes dUTP (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) anstelle von dTTP enthält, wurden in 76 mM   K2HPO4,    17 mM   KH2P04,    14 mM   NaH2P04,    pH=7,2,5 mM   MgCl2    und 1 mM   ATP-y-S    mit   100    ug gereinigtem UvsXH6N2 bzw. UvsXH6N2NIT-2 in einem Endvolumen von 200 ut für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.



  Anschliessend wurden 10 ul von jedem NPF-Ansatz auf ein 0,8 % iges TAE/Agarose Gel aufgetragen, das mit Ethidiumbromid nachträglich gefärbt wurde. Die Elektrophorese erfolgte für 1 Stunde bei 100 V. Abbildung 13 zeigt, dass die DNA vollständig retardiert wird. Die DNA-Bindung der Proteine wird durch die Fluoreszeinmarkierung der DNA also nicht behindert.



  Aufnahme der NPFs in   NlH3T3-Zellen    durch Endozytose :   NIH3T3 Zellen    wurden in 6-Loch-Platten (3x105 pro Loch) ausgesät, über Nacht bei 37    C    und 5 % C02 inkubiert und am nächsten Morgen mit vorgewärmtem FCSfreiem Medium gewaschen, dann mit 2 ml FCS-freiem Medium versetzt. Dazu wurden 190   ul    der NPF-Ansätze (s. o.) gegeben, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, der Überstand abgenommen, die Zellen gewaschen und mit 3 ml Medium (mit 10% FCS) überschichtet. Nach einer weiteren 1-stündigen Inkubation bei 37    C    im Brutschrank erfolgte die Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop. In den Abbildungen 14 a und 14 b sind jeweils eine Aufnahme im Hellfeld (unten) und eine in   Auflichtfluoreszenz    (oben) gezeigt.



  Zu erkennen sind im Hellfeld vesikuläre intrazelluläre Kompartimente, die im   Fluoreszenzlicht    aufgrund der endozytierten DNA aufleuchten (Abb. 14 a, b oben).



  Es wurden mehrere Aufnahmen von jedem Loch gemacht. Die Zellen wurden gezählt und der prozentuale Anteil von Zellen bestimmt, die mindestens ein fluoreszierendes vesikuläres Kompartiment enthielten (dargestellt in Abbildung 15). Jede Aufnahme zeigte durchschnittlich 35 Zellen. Neun Aufnahmen wurden von den Ansätzen mit   UvsXH6N2NIT-2    und fünf Aufnahmen von den Ansätzen mit UvsXH6N2-2 ausgewertet.



  Das Ergebnis zeigt, dass die Modifikation von UvsX mit einem Integrinbindungsmotiv als funktioneller Komponente (UvsXH6N2-NIT-2) im Vergleich zur Kontrolle (UvsXH6N2-2) eine deutlich erhöhte endozytotische Aufnahme des Transfektionsagens in die Zellen bewirkt.



  Beispiel 11 : Herstellung eines Transfektionsagens, basierend auf hRad51 als    NPF-bildendem    Protein Als   NPF-bildende    Proteine wurden die Proteine hRad51 H6, und   hRad51 H6N2    verwendet (siehe Abbildung 16).



  Aufbau der Proteine : hRad51 H6 (352 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-339 : humanes Rad51 (NCBI-Protein Accession-No. : Q06609, Aminosäuren 1-339), Aminosäuren 340-343 : Linker aus den Aminosäuren   Y340SYG343,    Aminosäuren 344-349 :   H344HHHHH349    für die Aufreinigung über Nickel  Chelat-Affinitätschromatografie,    Aminosäuren 350-352 : C-Terminus aus den Aminosäuren   M350ys352.    hRad51 H6N2 (369 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-339 : humanes Rad51 (NCBI-Protein Accession-No. : Q06609, Aminosäuren 1-339), Aminosäuren 340-343 : Linker aus den Aminosäuren   Y340SYG343, Aminosäuren    344-349 :   H344HHHHH349    für die Aufreinigung über Nickel  Chelat-Affinitätschromatografie,    Aminosäuren 350-352 :

   Linker aus den Aminosäuren   M350YS352,,    Aminosäuren 353-366 : Kernlokalisationssignal   nis-2    (Aminosäuren 2-15, SEQ ID NO : 9 aus WO 00/40742), Aminosäuren 367-369 : C-Terminus aus den Aminosäuren   G367YP369      Klonierung    der Expressionsplasmide Für die Expression der oben genannten Proteine in geeigneten Escherichia coli Zellen wurden Plasmide konstruiert, die eine kodierende Sequenz für   hRad51 H6,    bzw.   hRad51 H6N2 unter    der Kontrolle des lac-Promoters enthalten   (pExH-hRad51 H6    bzw. pExH-hRad51H6N2, siehe Abb. 16). Als Ausgangsplasmide wurden   pExH-    UvsXH6-2 und pExH-UvsXH6N2-2 verwendet (siehe Abb. 16).

   Die kodierende Region für UvsX wurde jeweils mit EcoR V und BsiW   I    herausgeschnitten und durch ein ebenso geschnittenes PCR-Fragment mit der kodierenden Region für hRad51 ersetzt. Diese wurde aus einer humanen   cDNA-Bibliothek    mt hRad51-spezifischen Primern amplifiziert, die die gewünschten   Restriktionsschnittstellen    enthalten. Die PCR-Produkte enthielten am 5'-Ende vor dem Startcodon die zusätzlichen Nukleotide 5'-CACACATCTAGACGTACGGATATCAT-3', sowie am 3'-Ende anstelle des Stopcodons die zusätzlichen Nukleotide 5'-TACTCGTACGGAGGTGGCGGCCGCTGTGTG-3'. 



  Reinigung : Eine Vorkultur von 5 ml dYT/Ampicillin   (1 00pg/ml)    wurde mit einer Kolonie von pExH  Rad51 H6 bzw. pExH-Rad51 H6N2    in DH5 angeimpft und 5 Stunden bei   37     C mit 250 Upm wachsen gelassen. 10   I    dYT/Ampicillin   (100pg/ml)    wurden mit dieser Vorkultur angeimpft und für weitere 24 Stunden bei   37     C mit 210 UPM wachsen gelassen. Die bei 7000 x g geernteten Kulturen ergaben ca. 30-50 g Bakteriensediment. Dieses wurde für 1-3 Tage   bei-20  C    eingefroren. Das Sediment wurde auf Eis getaut und in 100 mi kaltem Start-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden daraufhin mit Ultraschall unter Verwendung eines B.

   Braun Labsonic U aufgeschlossen (grosse Sonde, Parameter : 300W, 0,5 sec Pulsdauer pro Sekunde, 8 Minuten Beschallung).



  Anschliessend wurde bei   4'C mit    10 mg Lysozym (Serva, 190.000 u/mg) für 1 h und nach Zugabe von 50 ut DNAse   I    (Serva, 2 mg/ml) weitere 30 min unter langsamen Rühren inkubiert. Nach Abzentrifugieren des Lysats (45 min   18000    x g, 4    C)    wurde der Überstand durch Sterilfilter (Porengrösse 0,45 um und 0,2 um) filtriert und auf eine mit   Ni++-lonen    beladene und äquilibrierte 1   ml    HiTrapTM Chelating-Säule (Pharmacia) geladen. Die weiteren Aufreinigungsschritte erfolgten nach dem entsprechenden Pharmacia-Protokoll für Proteine, die mit einem Histidin-Hexamer versehen wurden. Aliquots der verschiedenen Elutionsfraktionen wurden auf SDS/Coomassie-Gelen aufgetragen.

   Die jeweils saubersten Fraktionen wurden vereinigt und über   Centriplus    YM30-Säulen (Millipore) nach dem entsprechenden Protokoll weiter eingeengt. Danach erfolgte eine zweimalige Dialyse   (Dialyseschlauch : Spectra/Por,    MWCO : 25.000) gegen ein mindestens eintausendfaches   Volumen ZI-Puffer    für jeweils mindestens eine Stunde bei   4     C, dann über Nacht bei   4     C gegen Zi-Puffer/50 % Glyzerin. Das Dialysat wurde in 3050 pI-Fraktionen aliquotiert und   bei-80     C aufbewahrt. Abb. 17 A zeigt die gereinigten hRad51-H6 und hRad51-H6N2 Proteine.



  Verwendete Puffer : Entsprechend Beispiel   1,    Elutionspuffer abweichend : 20 mM Pi, 0,5 M NaCI, 100-1000 mM Imidazol, pH=7,4   Konzentrationsbestimmunq :    Die Konzentration der hRad51-Proteine wurde durch Messen der OD280 unter Einbeziehung des über das Programm Gene InspectorTM (Textco,   Inc.)    errechneten Extinktionskoeffizienten bestimmt.



  Bei hRad51 H6 und   hRad51 H6N2    betrug sie 11-13   pg/pl.   



  Versuchsbeschreibung : Bindung von NLS-modifiziertem hRad51 an doppelsträngige DNA : Über Ni++-Sepharose gereinigtes   hRad51    H6N2 wurde mit jeweils 100 ng eines 0,9 kb PCR-Fragmentes inkubiert.



  Ein durch Proteinbindung verursachter Shift der DNA im Agarosegel zeigt, dass   hRad51 H6N2    in Abhängigkeit von der Konzentration, kooperativ doppelsträngige DNA bindet (Abb. 17B). Schon bei geringen Mengen an   hRad51 H6N2    werden einzelne DNA-Moleküle vollständig von   hRad51 H6N2    gebunden und daher maximal retardiert, so dass bei Erhöhung der   Proteinmenge    die Retardierung der DNA nicht noch weiter zunimmt. Hieraus folgt, dass hRad51 H6N2 an dsDNA bindet.



  Beispiel 12 : Herstellung eines Transfektionsagens, basierend auf UvsX, mit einem Signal für den nicht-endosomalen Membrandurchtritt und einem Kernlokalisationssignal als funktionelle Komponenten In Analogie zu Beispiel 1 wurde ein Plasmid hergestellt, das die Expression des   Fusionsproteins    UvsXH6N2VP22c50 (siehe Abb. 1) erlaubt, das ausgehend von den im Beispiel 2 beschriebenen Protein UvsXH6N2-2 zusätzlich ein Teilstück des Tegumentproteins VP22 (Gen UL49) aus dem humanen Herpesvirus 1 enthält. Das hier verwendete VP22-Peptid wirkt als Signal für den nicht-enodosomalen Durchtritt durch die Zellmembran. Das Fusionsprotein UvsXH6N2VP22c50 enthält also zusätzlich zu einem Kernlokalisationssignal (NLS) noch ein Membrantransduktionssignal.



  Aufbau des Proteins : UvsXH6N2VP22c50 (474 Aminosäuren) : Aminosäuren 1-391 : UvsX aus dem Phagen T4 (NCBI-Protein Accession-No. :   AAD42669,    Aminosäuren 1-391), Aminosäuren 392-394 : Linker aus den Aminosäuren   S392YG394,    Aminosäuren 395-400 :   H395HHHHH400,    Aminosäuren 401403 : Linker aus den Aminosäuren   M401YS403,    Aminosäuren 404-417 : Kernlokalisationssignal nis-2 (Aminosäuren 2-15, SEQ ID NO : 9 aus WO 00/40742), Aminosäuren   418-422    : Linker aus den Aminosäuren   G418YPGS422,    Aminosäuren 423-472 : Teilstück des Tegumentproteins VP22 (Gen UL49) des humanen Herpesvirus 1 (NCBI Protein Accession-No. :   NP044651,    Aminosäuren 252-301), Aminosäuren 473-474 :

   C-Terminus aus den Aminosäuren   P473R474.   



     Ktonieruno    des Expressionsplasmids Für die Expression in geeigneten Escherichia coli Zellen wurde pExHUvsXH6N2-2 (siehe Beispiel 1 und Abb. 1) durch Restriktionsverdauung mit Acc65 I und Spe   I    geöffnet und mit einem Acc65   I    und Nhe I geschnittenen PCR-Produkt ligiert, das zusätzlich zu der kodierenden Sequenz für die letzten 50 Aminosäuren aus dem Tegumentprotein VP22 (Gen UL49) des humanen Herpesvirus 1 (NCBI-Nucleotide Accession-No. :   NC 001806, Komplementärsequenz der Nukleotide    105486-106391), am 5'-Ende die zusätzlichen Nukleotide 5'-CACACAGGTACCCGGGATCC-3', sowie am 3'-Ende die zusätzlichen Nukleotide   5'-CCTAGGTAATAATAAGCGGCCGCGCTAGCTGTGTG-3'enthielt    (siehe Abbildung 1). 



  Reinigung : Die Reinigung von UvsXH6N2VP22c50 erfolgte wie unter Beispiel 1 für H6UvsX beschrieben (siehe Abb. 18A).



  Konzentration : 1,8   ug/, ul.   



  Versuchsbeschreibung : Bindung einer Mischung aus verschieden modifizierten UvsX (UvsX-NLS-VP22 und UvsX-NLS) an doppelsträngige DNA : Jeweils 140 ng eines gereinigten 1,7 kb PCR-Fragments wurden in 96 mM   K2HPO4,    21,5mM   KH2P04,    18mM   NaH2P04,    pH=7,2,5mM   MgCtz    und 1,3 mM ATP-Y-S mit den Mengen gemäss Abb. 18B an gereinigtem UvsXH6N2VP22c50 bzw. UvsXH6N22 für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschliessend alle Ansätze auf ein 0,8 % iges   TAE/Agarose-Gel,    das mit Ethidiumbromid nachträglich gefärbt wurde, aufgetragen.

   Die zwei Proteine unterscheiden sich in ihrem Molekulargewicht und ihrer Nettoladung und retardieren DNA daher unterschiedlich stark während der Elektrophorese, wobei der Komplex mit UvsXH6N2VP22c50 in der   Geltasche    hängenbleibt und gar nicht mehr wandert (siehe Spalten 1 und 7 von Abbildung 18B).



  Mischt man die Proteine vor der Zugabe zur DNA, so entstehen je nach Verhältnis von UvsXH6N2-2 zu UvsXH6N2VP22c50 intermediäre Komplexe, deren   Wanderungsverhalten    zwischen denen der ungemischten Komplexe liegt (Abb. 18B).



  Dies zeigt, dass die DNA mit beiden Proteinen beladen ist. Eine Mischung verschieden, ein-oder mehrfach modifizierter   NPF-bildender    Proteine ist also möglich.



  Beispiel 13 : Transfektion einer Zellinie   (NIH3T3)    mit Komplexen aus DNA und einer Mischung aus UvsX-NLS-VP22 und UvsX-NLS  Versuchsbeschreibung : 2,5 x   105    Zellen (NIH3T3) wurden in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte ausgesät und am Folgetag mit einem Vektor, der ein Gen für die Expression eines fluoreszenten Reporterproteins enthält, transfiziert.

   Hierzu wurde   0      ug-1    ug lineare bzw.   1    ug zirkuläre DNA mit 36 ug UvsXH6N2VP22c50 bzw. einer Mischung aus 19 ug UvsXH6N2VP22c50 und 39 ug UvsXH6N2-2 in Bindungspuffer (76 mM   K2HP04,    17 mM   KH2P04,    14 mM   NaH2P04,    5 mM   MgCtz,    1 mM   ATP-y-S,    pH 7,21) für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert und zusammen mit 1   ml    RPMI auf Zellen gegeben, die vorher einmal mit PBS/BSA gewaschen wurden. Nach 1 h Inkubation bei   37 C,      5%    C02 im Brutschrank wurde jeweils 1 ml   RPMI/20%    FCS hinzugegeben und weiter im Brutschrank inkubiert.

   Die Zellen wurden daraufhin nach 4 h bzw. 24 h im Fluoreszenzmikroskop analysiert.



  Dabei wurden Zellen beobachtet, die nach der Behandlung mit Komplexen aus linearer bzw. zirkulärer DNA und der Mischung aus UvsXH6N2VP22c50 und UvsXH6N2-2 das Reportergen exprimierten (siehe Abb. 19). Die Anzahl der transfizierten Zellen stieg dabei mit der Menge an eingesetzer DNA bzw. DNA Proteinkomplexen.



  Dagegen wurde keine Expression des Reportergens erzielt mit DNA-Komplexen, die nur UvsXH6N2VP22c50 enthielten, oder in Abwesenheit von DNA.



  Es zeigt sich also, dass durch die Modifikation eines   NPF-bildenden    Proteins, hier UvsX, mit einem membranaktiven Peptid, hier VP22, die Transfektion von Zellen und hier insbesondere der Membrandurchtritt, ermöglicht wird. Der modulare Charakter des erfindungsgemässen Verfahrens bzw. Transfektionsagens wird durch die Kombination unterschiedlich modifizierter Proteine, hier Modifikation mit VP22 und NLS, verdeutlicht (siehe auch Abb. 20). Während das mit VP22 modifizierte UvsX den nicht-endosomalen Membrandurchtritt ermöglicht, wird die transfizierte DNA durch das mit dem NLS modifizierte UvsX vom   Zytoplasma    in den Zellkern dirigiert und kann anschliessend dort exprimiert werden. 



  Es können also einzelne Schritte des komplexen Transfektionsvorgangs in besonders vorteilhafter Weise spezifisch, flexibel und mit hoher Effizienz gesteuert werden. 



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Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Transfektion von Zellen mit Hilfe zumindest eines zur Nukleoproteinfilamentbildung fähigen Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein zunächst mit mindestens einer funktionellen Komponente, welche einen oder mehrere Schritte der Transfektion beeinflusst, modifiziert wird, die zu transfizierende Nukleinsäure dann mit dem modifizierten Protein beladen wird, wobei die Nukleinsäure und das Protein einen fadenförmigen Komplex bilden, und dieser Komplex schliesslich auf die zu transfizierenden Zellen gegeben wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein durch Deletion oder Insertion von Aminosäuren und/oder Proteindomänen modifiziert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein durch chemische Änderung von Aminosäuren und/oder anderen Molekülgruppen modifiziert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein durch chemische Kopplung von Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden oder anderen Molekülen modifiziert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Komponente die Assoziation des Komplexes an die Zelloberfläche bewirkt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Komponente den nicht-endosomalen Durchtritt des Komplexes durch die Zellmembran bewirkt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Komponente den Austritt des Komplexes aus Endosomen/Lysosomen bewirkt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Komponente den Transport des Komplexes in den Zellkern bewirkt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit mehreren funktionellen Komponenten unterschiedlicher Funktion modifiziert wird und/oder dass unterschiedliche Proteine jeweils mit Komponenten unterschiedlicher Funktion modifiziert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit einer Vielzahl funktioneller Komponenten beladen wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex durch Zugabe von Nukleosidtriphosphaten und/oder nicht hydrolysierbaren Analoga davon, insbesondere durch ATP (Adenosintriphosphat) und/oder GTP (Guanosintriphosphat) und/oder deren nicht-hydrolysierbarer Analoga, stabilisiert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass dieses in Kombination mit anderen biologischen und/oder chemischen und/oder physikalischen Transfektionsmethoden für Nukleinsäuren, insbesondere in Kombination mit Elektroporation, angewendet wird.

13. Transfektionsagens enthaltend ein Nukleoproteinfilament, gebildet aus mindestens einer zu transfizierenden Nukleinsäure und mindestens einem zur Nukleoproteinfilamentbildung fähigen Protein, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Nukleoproteinfilamentbildung fähige Protein mit mindestens einer funktionellen, die Transfektion beeinflussenden Komponente modifiziert ist.

14. Transfektionsagens nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit mehreren funktionellen Komponenten unterschiedlicher Funktion modifiziert ist und/oder dass unterschiedliche Proteine jeweils mit Komponenten unterschiedlicher Funktion modifiziert sind.

15. Transfektionsagens nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit einer Vielzahl funktioneller Komponenten beladen ist.

16. Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es als filamentbildendes Protein ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe der Proteine RecA, RadA, RAD51, hDmc1, SASP, ICP8, vorzugsweise UvsX, besonders bevorzugt hRAD51 oder eine Mischung aus mindestens 2 der aufgezählten Proteinen enthält.

17. Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Komponente die Assoziation des Agens an die Zelloberfläche bewirkt.

18. Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Komponente den nicht-endosomalen Durchtritt des Agens durch die Zellmembran bewirkt.

19. Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Komponente den Austritt des Agens aus Endosomen/Lysosomen bewirkt.

20. Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Komponente den Transport des Agens in den Zellkern bewirkt.

21. Verwendung eines Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 20 zur Herstellung eines Medikaments zur gentherapeutischen Behandlung von Menschen und Tieren.

22. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch den Gehalt an einem Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 21.

23. Kit, geeignet zur Transfektion von Zellen mit Nukleinsäuren, umfassend mindestens ein zur Nukleoproteinfilamentbildung fähiges Protein und zumindest eine funktionelle Komponente nach einem der Ansprüche 13 bis 20 sowie mindestens eine der folgenden Komponenten : a) Nukleosidtriphosphat und/oder Nukleosidtriphosphat-Analoga b) mindestens eine zu transfizierende Nukleinsäure c) Hilfs-und Zusatzstoffe 24. Verfahren zur Identifizierung von Aktivatoren oder Inhibitoren des oder der Expressionsprodukt (e) des Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle mit dem Transfektionsagens transfiziert wird und potentiellen Inhibitoren oder Aktivatoren ausgesetzt wird.

25. Verfahren zur Identifizierung von physiologisch aktiven Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen mit dem Transfektionsagens nach einem der Ansprüche 13 bis 20 transfiziert werden und physiologische Veränderungen im Vergleich zu nicht transfizierten Kontrolizellen bestimmt werden.