WO2002044359A1 - Enzima con actividad proteolítica - Google Patents

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WO2002044359A1
WO2002044359A1 PCT/ES2001/000471 ES0100471W WO0244359A1 WO 2002044359 A1 WO2002044359 A1 WO 2002044359A1 ES 0100471 W ES0100471 W ES 0100471W WO 0244359 A1 WO0244359 A1 WO 0244359A1
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enzyme
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antifungal composition
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dna
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PCT/ES2001/000471
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Belén SUAREZ FERNANDEZ
Manuel Rey Barrera
Enrique Monte Vazquez
Antonio Llobell Gonzalez
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Newbiotechnic, S.A.
Universidad De Sevilla
Universidad De Salamanca
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • This invention relates to enzymes with proteolytic activity, to DNA constructs encoding said enzymes, to methods for the production of said enzymes, to compositions comprising said enzymes and to the use of said enzymes, DNA constructs and compositions.
  • Enzymes with proteolytic activity are enzymes capable of catalyzing the hydrolysis of a peptide bond (E.C. 3.4). This group of enzymes is characterized by its ubiquitous distribution in the different life forms, its variability in the cellular location and by the great variety of physiological processes in which they intervene.
  • peptidases are classified into exopeptidases [peptidases that require the presence of a free amino or carboxyl end in the substrate], and endopeptidases [peptidases that hydrolyse peptide bonds present within the chain].
  • exopeptidases peptidases that require the presence of a free amino or carboxyl end in the substrate
  • endopeptidases peptidases that hydrolyse peptide bonds present within the chain.
  • the different recognized catalytic mechanisms of these enzymes have given rise to four subgroups named according to the active site that is directly involved in the breaking of the peptide bond [aspartyl-endopeptidases, cysteine-endopeptidases, metallo-endopeptidases and serine-endopeptidases].
  • a review of the classification and characteristics of these enzymes can be found in the works of Rawlings and Barret [Rawlings ND & Barrett AJ (1994).
  • Peptidases can be acidic, basic or neutral depending on their activity at low, high or neutral pH, respectively. Peptidases are widely used in various industries, for example, in the manufacture of laundry detergents, in the leather industry, in the food industry, etc.
  • Trichoderma Although fungi of the genus Trichoderma have been studied for a long time (both for their cellulolytic activity and for their antagonistic properties of fungal pathogens of plants) and numerous enzymes have been identified (chitinases, ⁇ -1,3- and ⁇ - 1,6-glucanases, (X-1, 3-glucanases, etc.), only two proteases have been identified and characterized, a T. reesei aspartyl protease and a T. harzianum serine protease. denominated Prbl (Geremia, RA, Goldman, GH, Jacobs, D., Ardiles,., Vila, SB, van Motagu, M. and Herrera-Estrella, A.
  • the invention faces the problem of providing new enzymes with proteolytic activity.
  • the solution provided by this invention is based on The inventors have found a new enzyme with proteolytic activity, which has an acidic pl and belongs to the serine-peptidases family.
  • a characteristic of said enzyme, in addition to its proteolytic activity that allows it to degrade peptide bonds, is its affinity for structures comprising proteins or peptides, such as fungal cell walls (containing chitin and glucan polymers embedded in, and covalently bound to, a protein matrix), or structures composed of polysaccharides covalently bound to proteins, for example, insect cuticles, arachnids, etc., whereby said enzyme can intervene in the degradation or modification of said structures comprising proteins or peptides
  • the enzyme provided by the invention can also be used in the irreversible proteolytic inactivation of structural proteins or with enzymatic activity determining the virulence or pathogenesis of pathogens on animals or plants.
  • an object of this invention is an enzyme with proteolytic activity.
  • the process for obtaining said enzyme and compositions comprising said enzyme also constitute additional objects of this invention.
  • Additional objects of this invention are the use of said enzymes or compositions for the degradation or modification of materials containing peptide bonds, including structures comprising proteins or peptides, as well as in the irreversible proteolytic inactivation of structural proteins or enzymatic activity determinants of the virulence or pathogenesis of pathogens on animals or plants.
  • DNA Transgenic vectors, cells and plants comprising said DNA sequences constitute another object. Additional of this invention. The use of said DNA sequences for obtaining said enzymes or for the construction of transgenic plants is also an additional object of this invention.
  • the invention provides an enzyme with proteolytic activity, hereinafter enzyme of the invention, which has an amino acid sequence selected from: a) an amino acid sequence comprising the amino acid sequence shown in the SEC. ID. N °:
  • substantially homologous means that the amino acid sequences in question have a degree of identity, at the amino acid level, of at least 70%, preferably of at least 85%, and, more preferably of at least , 95%.
  • the term “functionally equivalent” means that the protein in question has at least proteolytic activity.
  • the enzyme of the invention in addition to its proteolytic activity, which can be tested both in gel, by casein-SDS-PAGE [Example 1.2], and in the liquid phase
  • section A of Example 3.3 may have affinity for structures comprising proteins or peptides, for example, fungal cell walls, insect and arachnid cuticles, etc., and / or the ability to irreversibly inactivate, by proteolysis , structural or enzymatic activity proteins involved in the attack of a pathogen on animals or plants.
  • the affinity of the enzyme of the invention for structures comprising proteins or peptides can be tested by a method of adsorption-digestion with purified cell walls of a fungus, for example, C. acutatum or Botrytis cinerea, such as that described in Example 1.3 where an assay to determine the adsorption of proteins to fungal cell walls is illustrated.
  • the enzyme of the invention has the amino acid sequence shown in the SEC. ID. N °: 1 or an active fragment thereof, that is, a fragment of said protein that maintains proteolytic activity.
  • the enzyme of the invention is an enzyme, or active fragment, derived from T. harzianum, which has the amino acid sequence shown in the SEC. ID. N °: 1, or a part thereof.
  • the enzyme of the invention is an enzyme derived from T. harzianum having the amino acid sequence shown in the SEC. ID. N °: 1 and has been called Pral in this description [Examples 1 and 2].
  • the Pral enzyme has a molecular weight of 28 kDa determined by SDS-PAGE, a pl of 4.7-4.9, an optimal pH of 7.5 (although it is more stable at an acidic pH), an optimum temperature between 35 ° C and 40 ° C (pH 7.5), belongs to the serine-peptidases family, it is a trypsin-like peptidase since it has the sequences of the amino end and an internal peptide has a high homology with other proteases Trypsin type, has specificity for N-acetyl-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA (a synthetic substrate specific for trypsin) but has no activity against other synthetic substrates for chymotrypsin or elastase [Example 3].
  • the enzyme of the invention can be obtained from a producer organism thereof, such as a fungus of the genus Trichoderma, by a method comprising the cultivation of the producer organism under appropriate conditions for the expression of said enzyme and, subsequently, recovering said enzyme.
  • the fungus used belongs to the species Trichoderma harzianum, specifically to the strain deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with the access number CECT 2413.
  • the culture of the producing organism can be done in two stages, as mentioned in Example 1.
  • spores of the fungus are inoculated in a culture medium supplemented with glucose as a carbon source and then the mycelium is collected , washed and cultivated in a suitable minimum medium supplemented with purified fungal cell walls, for example, from Colletotrichum ac ⁇ tatum, as the sole source of carbon to induce enzymes with proteolytic activity.
  • the isolation and purification of the enzyme of the invention can be carried out by conventional techniques comprising the separation of the proteins produced by chromato-focusing and gel filtration of the concentrated fractions that exhibited greater proteolytic activity [see Example 2].
  • the enzyme with purified proteolytic activity can be used for its characterization (Example 3). From the enzyme of the invention, the DNA sequence encoding said enzyme can be identified and isolated by a method comprising:
  • gDNA genomic DNA libraries
  • cDNA copy DNA
  • Example 4 the analysis and selection of positive clones. All these steps are described in more detail in Example 4 where the obtaining of a DNA sequence is illustrated. which encodes the Pral protease of T. harzianum.
  • the cDNA library can be obtained from the total RNA of the enzyme producing organism of the invention following a standard protocol [Chomczynski and Sacchi, 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorofom extraction. Anal. Biochem 162: 156-159] with slight modifications.
  • the enzyme producing organism of the invention is T. harzianum CECT 2413, which is grown in a minimal medium with fungal cell walls as the sole carbon source, the messenger RNA (mRNA) being isolated by affinity chromatography at oligo (dT) cellulose.
  • the cDNA is synthesized, for example, using a commercial kit, bound to a suitable vector and packaged in an appropriate host.
  • the amino acid sequencing of the enzyme of the invention and of internal fragments thereof can be performed by any conventional method, for example, by the method of Edmans Matsudaira [A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing. Academic press, Inc. New York, Edmans Matsudaira (eds.) 1989].
  • a set of oligonucleotides can be designed to amplify a specific sequence corresponding to the DNA sequence encoding the enzyme of the invention.
  • the direct oligonucleotide was designed from the amino end sequence of the Pral enzyme while the reverse oligonucleotide
  • Example 3 describes the sequences of the amino terminus and an internal fragment of the Pral enzyme that served to design the oligonucleotides used for the PCR.
  • Suitable fragments resulting from PCR amplification can be labeled and used as probes for scrutinize a library (cDNA or cDNA) in order to isolate the clones of interest by in situ hybridization.
  • the invention provides a DNA construct that encodes the enzyme of the invention comprising: a) a DNA sequence comprising the SEC. ID. N °: 2; or b) a DNA sequence analogous to the sequence defined in a) that i) is substantially homologous to the DNA sequence defined in a); and / or ii) encodes for a polypeptide that is substantially homologous to the protein encoded by the sequence of
  • analogue is intended to include any DNA sequence that encodes an enzyme with proteolytic activity having the properties i) -ii) mentioned above.
  • analog DNA sequence typically, the analog DNA sequence:
  • - is constructed based on the DNA sequence shown in the SEC. ID. N °: 2, for example, by the introduction of conservative nucleotide substitutions, that is, which do not give rise to another amino acid sequence of the protease encoded by said DNA sequence shown in SEQ. ID. N °: 2, but that corresponds to the use of codons of the host organism destined for the production of the enzyme, or by the introduction of nucleotide substitutions that give rise to a different amino acid sequence and, therefore, possibly, to a Different protein structure that could give rise to a mutant protease with properties different from those of the native enzyme.
  • analog DNA sequence may be a sub sequence of the DNA sequence shown in any of the sequences shown in the SEC. ID. N °: 2.
  • the analogous DNA sequence is substantially homologous to the DNA sequence encoding an enzyme with proteolytic activity of the invention, for example SEC. ID. N °: 2, that is, it has a nucleotide level homology of at least 70%, preferably at least 85%, or more preferably at least 95% with respect to any of the previously mentioned sequences .
  • the DNA sequence provided by this invention has the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. N °: 2, or a fragment thereof that encodes a protein that maintains proteolytic activity.
  • the DNA sequence provided by this invention, or fragment encoding a protein that maintains proteolytic activity is derived from T. harzianum and comprises the nucleotide sequence shown in SEQ. ID. N °: 2, or a part thereof.
  • said DNA sequence derived from T. harzianum has the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. N °: 2 and encodes the Pral protease of T. harzianum.
  • the DNA sequence encoding the enzyme of the invention can come not only from T. harzianum but from any other strain of Tri choderma or from any host organism transformed with said sequence, from DNA.
  • the DNA sequence encoding the enzyme of the invention can be isolated, by conventional techniques, from the -DNA of any organism by using probes or oligonucleotides prepared from the information on the DNA sequence. provided in this description, or by initiators (by PCR).
  • the DNA sequence encoding the enzyme of the invention, or the construction that contains it, can be inserted into an appropriate vector. Therefore, the invention also relates to a vector, such as an expression vector, comprising said DNA sequence, or a construct containing it.
  • a vector such as an expression vector
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of said cells and replicated together with the chromosome (or chromosomes) in which (in which) it has been integrated.
  • the DNA sequence encoding the enzyme of the invention must be operatively connected to a promoter and a terminator sequence.
  • the promoter can be any DNA sequence that shows a transcriptional activity in the chosen host cell and can be derived well from genes encoding homologous or heterologous proteins of the host cell.
  • the methods used to link the DNA sequence encoding the enzyme of the invention to the promoter and the terminator sequence, respectively, and to insert said construct into a vector are well known to those skilled in the art and have been described, for example. , by Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989].
  • the invention also provides a cell comprising a DNA sequence encoding the enzyme of the invention, or a DNA construct containing said sequence or said vector mentioned above.
  • the host cells that can be transformed with the DNA sequence encoding the enzyme of the invention can be prokaryotic cells or, preferably, eukaryotic cells, such as cells of plant tissues or fungal cells, for example, yeast or filamentous fungal cells.
  • the transformation of these cells can be carried out by conventional techniques, for example, by techniques that involve the formation of protoplasts and their transformation followed by the regeneration of the cell wall.
  • the transformation of plant tissue cells can be very interesting from various points of view, for example, to increase resistance to phytopathogenic fungi.
  • the enzyme of the invention optionally, has the ability to irreversibly inactivate, by proteolysis, structural proteins or enzymatic activity involved in the attack of pathogens to animals or plants and / or determinants of the virulence or pathogenesis of pathogens on animals or plants
  • the DNA construct provided by this invention which encodes the enzyme of the invention, can be used to reduce the virulence or pathogenesis of animal and plant pathogens, or to increase the resistance of animals and plants to pathogens, for example , to increase the resistance of plants against fungi of the genus Botrytis by inactivating the structural protein (s) or enzyme (s) involved in the attack of the pathogen to the plant.
  • the DNA construct provided by this invention is used in obtaining transgenic plants capable of expressing the enzyme of the invention to improve resistance to pathogens by irreversibly inactivating enzymes and proteins responsible for the attack on plant.
  • the invention also provides a cell transgenic of a plant comprising a DNA construct of the invention having a promoter, functional in said plant, operably linked to a DNA construct of the invention, or a fragment thereof.
  • a transgenic plant comprising at least one of said transgenic cells constitutes a further object of this invention.
  • said transgenic plant is a strawberry plant.
  • the invention also provides a method for the production of an enzyme of the invention, comprising culturing a suitable host cell that contains the DNA sequence encoding the enzyme of the invention under conditions that allow the production of the enzyme and recovering the enzyme from the culture medium.
  • the medium used to grow the transformed host cells can be any suitable means to grow the host cells in question.
  • the expressed peptidase can, advantageously, be secreted into the culture medium and can be recovered by a procedure such as that described in Example 2 or by any other conventional protein isolation procedure comprising the separation of the cells from the culture medium, the protein precipitation and separation by chromatographic methods.
  • the invention also provides an enzymatic preparation comprising at least one enzyme with proteolytic activity of the invention.
  • This enzymatic preparation is useful for the degradation or modification of materials containing peptide bonds, that is, materials containing proteins, peptides or amino acid residues linked by peptide bonds, such as cell walls of prokaryotic or eukaryotic organisms, for example, cell walls of fungi, since said cell walls contain chitin and / or glucan polymers embedded in, and covalently bound to, a protein matrix, or cuticles of insects or arachnids comprising polysaccharide-based structures covalently bound to proteins.
  • the enzyme preparation provided by this invention may contain between 0.01% and 100% by weight of the enzyme with proteolytic activity of the invention.
  • the enzyme preparation provided by this invention is a single component enzyme preparation and mostly contains an enzyme with proteolytic activity of the invention.
  • the enzyme preparation provided by this invention comprises multiple enzyme activities, for example, different enzyme activities required for the modification or degradation of microbial cell walls.
  • said enzymatic preparation may include lithic enzymes, in particular of microbial origin (fungal or bacterial), for example, derived from various species of the genera Trichoderma, Oerskovia, Arthrobacter, Rhizotocnia,
  • Staphylococcus or Streptomyces may also contain one or more enzymes capable of modifying or degrading cell walls, for example, enzymes with cellulolytic, mannanolytic, chitinolytic or proteolytic activity, such as cellulases, ⁇ - (1, 6) - glucanases, ⁇ - (1, 3) -glucanases, mannanas, endo- or exoquitinases, chitosanase, proteases, ⁇ - or ⁇ -mannosidases, mutanases, etc.
  • enzymes can come from any organism producing them, such as various species of the Aspergill us genus or those mentioned above in relation to lithic enzymes.
  • the enzyme preparation of the invention can be prepared by conventional methods and can be presented in liquid or solid form, for example, in the form of a granulate.
  • the enzyme preparation may contain additives, for example, stabilizers that prolong its stability.
  • the enzyme with proteolytic activity provided by this invention may also have affinity for fungal cell walls, or for cuticles of insects and arachnids, therefore, it can contribute to the degradation of fungal cell walls, for example, phytopathogenic fungi, such as C. ac ⁇ ta tum, B. cinérea, etc., or in the degradation of insect cuticles, arachnids, etc. Therefore, the invention also provides an antifungal composition comprising at least one enzyme of the invention together with at least one fungicide, for example, a chemical fungicide.
  • any of the commonly used, preferably, a chemical fungicide selected from the group consisting of chemical fungicides that affect the membrane, chemical fungicides that affect the synthesis of the cell wall and mixtures thereof can be used.
  • the antifungal composition of the invention may also contain at least one protein with degrading enzymatic activity of the cell wall. Any enzyme with cell wall degrading activity can be used, if desired, in the antifungal composition of the invention.
  • the antifungal composition of the invention which may contain between 0.01% and 99.99% by weight of the enzyme of the invention, may be prepared by conventional methods and may be presented in liquid or solid form, for example, in the form of a granulated.
  • the antifungal composition of the invention may also contain additives, for example, stabilizers in order to prolong the stability thereof.
  • the enzyme of the invention can be used to degrade or modify materials containing peptide bonds, for example, the proteins present in microbial cell walls, the enzyme of the invention can be used as a biofungicide against various harmful organisms, for example , against phytopathogenic fungi
  • fungi including fungi that cause damage to crops and fruit-contaminating fungi . pre- and post-harvest
  • animal pathogenic fungi including human pathogenic fungi
  • food contaminant fungi surfaces and equipment, and, in general, any fungus that causes economic losses in any industrial, agricultural or livestock sector.
  • the enzyme of the invention can also be used to break or use the cell walls of various microorganisms to recover products of interest produced by said microorganisms.
  • the enzyme preparation of the invention can be designed at will with a composition specifically adapted for the cell wall to be broken or used.
  • the cell wall to be broken contains a protein-mannan complex and a glucan
  • the enzyme preparation could advantageously contain a mixture of protease, mannanase, chitinase activities. and ⁇ -glucanase, in order to efficiently break said cell wall.
  • Other applications of the enzyme of the invention include, by way of illustration, not limitation, the extraction of hand-proteins from the outer layer of yeast cell walls; the production of protoplasts from yeasts or fungi; the preparation of yeast and fungus extracts; the improvement of filtration operations in processes for the production of wines, musts and juices; the production of wines with altered organoleptic properties by overexpression of the gene in wine yeasts; the preparation of compositions for cleaning teeth and dentures; the preparation of compositions for cleaning contact lenses; the elimination of fungi on coatings; tissue treatment, for example, removal of excess dye in tissues; the preparation of compositions for removing dental plaque; the preparation of compositions for removing biological films (biofilms) deposited on surfaces, for example on the surface of a contact lens; the manufacture of detergents for washing clothes and / or dishes, etc.
  • the enzyme or enzymatic preparation or antifungal composition provided by this invention can be used. in the control of pernicious organisms, for example, against phytopathogenic fungi (including fungi that cause damage to crops and contaminating fungi of pre- and post-harvest fruits), pathogenic fungi of animals (including human pathogenic fungi), fungi food contaminants, surfaces and equipment, and, in general, any fungus that causes economic losses in any industrial, agricultural or livestock sector.
  • control includes the reduction or paralysis of growth and / or germination that may result in the elimination of such pernicious organisms or in the reduction of damage caused by them. Therefore, in a particular embodiment of this invention said enzymatic preparations or antifungal compositions will be pharmaceutical compositions or compositions for application in the agricultural sector.
  • the enzyme, enzyme preparation or antifungal composition of the invention can also be used to disinfest, prevent and / or treat infection caused by pathogenic fungi of animals in livestock facilities, which are susceptible to being infested by pathogenic fungi of animals that grow and they develop on substrates that are in contact with the animals, for example, the straw used in the beds of the animals, or in the conditions of animal housing, with which there is a risk that said animals are infested by such pathogens .
  • test samples for analysis for example, biological, food samples, etc.
  • the invention provides a solution to said problem consisting in the use of an enzyme, enzyme preparation or antifungal composition of the invention to control fungal contamination in said test samples for analysis, by application to said samples.
  • the antifungal composition of the invention can be used to control all types of pernicious fungi, such as those mentioned previously, by means of the control mechanism known as integrated control.
  • the dosage of the enzyme preparation and the antifungal composition provided by this invention and its conditions of use can be determined based on the methods known in the art.
  • enzyme of the invention include its use to combat the pathogenesis due to insects, arachnids, etc., by destroying or modifying its cuticle, as well as its use to reduce the virulence or pathogenesis of animal or plant pathogens by the irreversible proteolytic inactivation of structural proteins and / or enzymes involved in the attack of said pathogens on animals and plants.
  • the flasks were inoculated with a final concentration of 10 spores / ml, and incubated at 200 rp at 25 ° C for 48 hours.
  • the mycelia were collected, under sterile conditions, by filtration in kitasate through filter paper, washed thoroughly with 2% MgCl 2 solution (w / v) and with sterile water, and immediately used for Inoculate new crops.
  • Detection of proteolytic activity in the culture supernatants of T. harzianum was carried out after the samples were subjected to SDS-PAGE with the substrate copolymerized on the gel.
  • the preparation of the gels was carried out normally but including in the separation gel the casein substrate, specifically 600 ⁇ l of renaturation buffer [Tris / HCl 50 M pH 8.0, casein (Sigma) 1% (w / v ), 2 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) and 0.05% (w / v) sodium azide].
  • the samples to be tested were prepared in loading buffer containing the sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing agent but not the reducing agent 2- mercaptoethanol [0.25 M Tris / HCl pH 6.8; 40% glycerol; 8% SDS and 0 / 05% bromophenol blue]. Electrophoresis was performed at 4 ° C to reduce enzyme activity during the run. Subsequently, the gel was incubated in renaturation buffer at room temperature under stirring for 1 hour, with two changes of the buffer. This step is intended to eliminate the SDS contained in the gel and allow the renaturation of enzymes.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the gel was incubated at 37 ° C in 50 mM sodium acetate buffer for 6 hours to allow proteases to act. After staining and fading the gels, the proteolytic activity is visualized as an unstained area on a dark blue background.
  • T. harzianum CECT 2413 The affinity on fungal cell walls of enzymes with proteolytic activity secreted by T. harzianum CECT 2413 was tested following a conventional adsorption-digestion method. To do this, 2 ml aliquots of the T. harzianum culture supernatants, concentrated and dialyzed, were incubated under stirring at 4 ° C for 20 minutes with an equal volume of a 1% (w / v) suspension of cell walls purified fungi. Subsequently, the samples were centrifuged at 12,000 rpm in a Sorvall RC5-C centrifuge with SS34 rotor for 10 minutes.
  • the collected supernatants were re-incubated with new cell wall suspensions two more times. Finally, the cell walls were combined and washed three times with 5 ml of 70 mM potassium phosphate buffer pH 6.0 supplemented with 1 M NaCl. Proteins not adsorbed to the cell walls (which remained in the supernatants) were precipitated and dialyzed. The cell walls with the adsorbed proteins were resuspended in 1 ml of 50 mM sodium acetate buffer pH 5.5 and incubated in Eppendorf tubes at 37 ° C for 24 hours to allow digestion of the cell walls and release of the adsorbed proteins .
  • the cells were broken in mortar in the presence of liquid nitrogen, and washed numerous times with 2M NaCl and then with distilled water, centrifuging for 5 minutes at 8,000 rpm in Sorvall centrifuge model RC5-C with GSA rotor, and collecting the precipitate in each washed. Subsequently, the walls obtained were collected by kitasate filtration, frozen at -80 ° C and lyophilized for 12 hours in a Virtis Centry TM lyophilizer, stored at room temperature until use. The degree of purification was determined by observing the absence of cytoplasmic and plasma membrane material under an optical microscope.
  • Example 1.4 2 ml aliquots of the culture supernatant maintained 48 hours in the presence of cell walls were subjected to an adsorption-digestion process with purified cell walls of C. acutatum or Botrytis cinerea, as described in Example 1.3. In the fraction adsorbed to the cell walls of C. acutatum or B. cinérea a single band of activity was detected, while the other isoenzymes remained only in the non-adsorbed fraction.
  • the purification of enzymes with proteolytic activity obtained by the protocol . described in Example 1 was made from the supernatant of a culture of T. harzianum CECT 2413 maintained for 48 hours in MM medium with walls Acutatum cell phones as a carbon source. To do this, 2 ml of the dialyzed and concentrated supernatant 75 times were subjected to chromato-focus to separate proteins based on their isoelectric point. The elution profiles obtained show 2 peaks of proteolytic activity on azocasein, one eluted at basic pH, coinciding with the majority protein peak, and another at acidic pH.
  • the fractions were mixed, concentrated in Centricon-10 (Amicon) and subjected to gel filtration chromatography. The fractions that presented the highest proteolytic activity, were collected and concentrated again in Centricon-10. The subsequent analysis by SDS-PAGE and casein-SDS-PAGE ' allowed to verify the homogeneity of the preparation obtained, in which a single band of protein and proteolytic activity was observed respectively.
  • the purified enzyme with proteolytic activity and acidic acid has been called Pral and has been used for its characterization.
  • the sequencing of the amino-terminal end and internal peptides of Pral was performed by the Eurosequence bv sequencing service (Groningen, The Netherlands). For each of the sequences, 1 nmol of purified protein was split and subsequently trimmed from the gel after SDS-PAGE and Coomasie blue staining. The internal peptides were obtained by enzymatic digestion of the protein with trypsin, and subsequent extraction and purification by RP-HPLC. The sequencing process was carried out following the Edman degradation method in a model 494 Applied Biosistems automatic sequencer connected in phase with an RP-HPLC apparatus for the identification of the released PTH-amino acids.
  • Table 1 shows the sequences obtained from the amino-terminal peptide and an internal Pral peptide. Both showed similarity with amino acid sequences of proteases such as trypsins (or trypsin-type) mostly, kalikrein, or plasminogen activator. All these enzymes are part of the SI family of serine peptidases whose representative enzyme is chymotrypsin and which is made up of enzymes with endopeptidase activity.
  • proteases such as trypsins (or trypsin-type) mostly, kalikrein, or plasminogen activator. All these enzymes are part of the SI family of serine peptidases whose representative enzyme is chymotrypsin and which is made up of enzymes with endopeptidase activity.
  • Table 1 Peptide sequences ⁇ two
  • the amino-terminal peptide sequences and the Pral internal peptides are collected within the SEC. ID. N °: 1 containing the complete putative amino acid sequence of Pral.
  • the proteolytic activity of the enzyme can be assayed using azocasein as a substrate.
  • the reaction mixture consists of 250 ⁇ l of 100 mM sodium acetate buffer pH 5.5 containing the enzyme sample, 125 ⁇ l of 0.1% Brij 35 and 125 ⁇ l of azocasein (Sigma). The reaction mixture is incubated at
  • Phe-pNA N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
  • the enzyme solution 75 ng was prepared in 90 ⁇ l of 100 mM sodium phosphate buffer and pre-incubated for 5 minutes at 30 ° C.
  • the reactions were started by adding 10 ⁇ l of preheated 10 mM substrate solution (prepared from 100 mM solutions in DMSO stored at -20 ° C). After 20 minutes of incubation the reactions were stopped by adding 50 ⁇ l of 2% acetic acid (v / v).
  • the lytic activity of Pral on the Arg-pNA peptide confirmed its endopeptidase identity, and also showed the preference of this protease for an apolar residue (Arg) in the P lf position characteristic of trypsin-like enzymes.
  • the specific activity of Pral on this substrate was 94,800 U / mg under optimal conditions of activity (30 ° C and pH 7.5). Values of K ⁇ , K cat , and K ⁇ K m of 0.22 mM, 39.64 s "1 and 180.18 mM " 1 s "1 were calculated respectively.
  • the substrate was prepared in 0.99 ml of 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.5 and pre-incubated at 30 ° C. Then the reaction began by adding 10 ⁇ l of the Pral purified protease (2.5 ppm) preheated at the same temperature. The activity was monitored for 10 minutes on a Shimadzu UV-160A spectrophotometer at 405 nm thermostat at 30 ° C. One unit of activity represented the release of 1 nmol p-NA per minute under the test conditions.
  • enzyme solutions without substrate and substrate without enzyme were prepared. The standard line was constructed with solutions of p-NA (Sigma) at known concentrations (0-200 ⁇ M), prepared as indicated above. The kinetic parameters were calculated by representations of double reciprocals or Lineweaver-Burk (1 / V vs 1 / S).
  • the enzymatic test was carried out in a temperature range between 30 ° C and 85 ° C.
  • the effect of temperature on the stability of Pral was determined by preincubating the enzyme solution in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.5 for 20 minutes at different temperatures (30-85 ° C).
  • the substrate used in these tests was the synthetic peptide N-acetyl-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA, specific for trypsins.
  • the assay was carried out in the following buffer systems: 100 mM sodium acetate (pH 3-5.5), 100 mM sodium phosphate (pH 6-7), and Tris / 100 mM HCl (pH 7.5-9).
  • PH effect on the stability of Pral it was determined by pre-incubating the enzymatic solution (750 ng) for 24 hours at 4 ° C in 10 ⁇ l of the previous buffers. Subsequently, 10 ⁇ l aliquots were taken to perform the test under standard conditions.
  • the results obtained show that the optimum pH of Pral activity is between 7.0 and 8.0.
  • the activity decreased rapidly when the assay was performed in buffers with pH greater than 8.5 or less than 6.5.
  • the activity decreased as the preincubation pH increased, with a 40% reduction at pH 7. No proteolytic activity was detected after preincubation at pH 9.
  • EXAMPLE 4 Cloning of a cDNA sequence encoding Pral Cloning of the gene encoding Pral protease from T. harzianum was performed from a cDNA library representative of the population of mRNA molecules that are transcribed into T. harzianum CERT 2413 when grown under conditions of simulated mycoparasitism (for 9 hours in the presence of fungal cell walls as the sole source of carbon).
  • RNA extraction was performed from 50 mg of Trichoderma mycelium sprayed in mortar in the presence of liquid nitrogen.
  • the mycelium was transferred to 10 ml tubes to which 4 ml of "yellow RNA" lysis solution [20 ml of solution D (4M guanidinium isothiocyanate, 25 mM sodium citrate pH 7.0, sarcosyl 0,] was added. 5% (w / v), autoclave and add 2-mercaptoethanol at a final concentration of 0.7% (v / v)], 2 ml of 2M sodium acetate and 20 ml of acid phenol]. The samples were homogenized by vortexing and mixing with micropipette.
  • RNA precipitation were subsequently incubated at room temperature for 5 minutes and transferred to Eppendorf tubes in 1 ml aliquots. 0.2 ml of chloroform was added to each tube, stirring in vortex for 15 seconds, and incubating at room temperature for 2-3 minutes. They were then centrifuged at 12,000 g at 4 ° C for 15 minutes. To the collected supernatant was added 1 volume of isopropyl alcohol, incubating at room temperature for 15 minutes to allow RNA precipitation.
  • RNA was collected by centrifugation at 12,000 g at 4 ° C for 10 minutes, washed with 1 ml of 70% ethanol while stirring in vortex until the precipitate was separated from the tube, and centrifuged at 4,000 g at fC for 5 minutes. The ethanol was then removed by inversion, and the precipitate was allowed to air dry and resuspended in 40 ⁇ l of water.
  • the RNA obtained was quantified by spectrophotometry, and its integrity was checked by 1% agarose gel electrophoresis. It was stored at -80 ° C. From 1 mg of total RNA extracted from mycelium grown under the aforementioned conditions, 7.8 ⁇ g of mRNA affinity chromatography was purified and used to construct the library in the Uni-ZAP ® XR vector (Stratagene).
  • the ZAP-cDNA ® Gigapack ® III Gold Cloning Kit cloning system designed by Stratagene (Ref. 200450) was used. The experimental procedure was carried out, for the most part, following the indications of the protocol provided by the commercial firm both for the construction and for the manipulation of the library.
  • cDNA was bound to 1 ⁇ g of vector DNA (predigested with EcóKllXhol restriction enzymes) in a recommended reaction volume of 5 ⁇ l, of which 2 ⁇ l was used for the final DNA encapsidation process inside the phage particles following the indications of the commercial firm.
  • the encapsidation efficiency was 4.9.10 6 recombinant phages / ⁇ g of vector, and the primary library title of 4.10 6 plaque forming units (pfu) / ml (2.10 6 in total), with only 0.3 % of non-recombinant phages.
  • the primary library, resulting from the described process, was kept at 4 ° C for less than 1 month before amplification.
  • the process was carried out by infecting 600 ⁇ l of E. coli XLl-Blue cells with volumes corresponding to 50,000 pfu (plaque forming units) of the primary library.
  • the infection mixture was incubated at 37 ° C for 15 minutes to allow phage attack and subsequently added to tubes with 7 ml NZY (bacterial culture medium suitable for phage growth) of preheated covert at 48 ° C .
  • the tubes were vortexed and the contents were immediately extended in 15 c Petri dishes with solid NZY medium.
  • the plates were incubated at 37 ° C until that confluent lysis halos were observed.
  • SM buffer [100 mM NaCl, 10 mM MgS0 4 , 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.01% (w / v) gelatin] were added and incubated again at 4 ° C in gentle rocking to allow diffusion of bacteriophages to the buffer.
  • the buffer of the different plates was collected and mixed, washing each of them with an additional 2 ml of buffer.
  • the collected mixture was vigorously stirred in the presence of 5% chloroform (v / v), and incubated for 15 minutes at room temperature. After centrifuging at 500 g for 10 minutes, the supernatant with bacteriophages free of cell debris was transferred to a glass vessel.
  • the cDNA library was ready to be used. It was titrated, and stored at 4 ° C in the presence of 0.3% (v / v) chloroform, as well as at -80 ° C in the presence of 7% DMSO.
  • the 1 million pfu amplification provided a 2.5.10 amplified library 6 times, with a titer of 1.6.10 10 pfu / mi.
  • the search for the cDNA clone corresponding to the Pral protease in the amplified library was performed by hybridization using a DNA probe previously obtained by PCR from the pBluescript SK (-) phagemid library derived from the mass cleavage of 20.10 6 pfu Said library in pGluescript phagemid SK (-) presented a title of 3.3.10 6 phagemids / ml (66.10 6 in total).
  • reaction mixture was prepared in a final volume of 25 ⁇ l containing PCR buffer IX, prepared from 10X buffer, provided with the enzyme, 1.5 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M dNTPs, 1.25 units of Taq polymerase ( Ecotag), 4 ⁇ M of each oligonucleotide initiator, and approximately 10 ng of phagemid DNA.
  • the amplification conditions consisted of an initial cycle of denaturation at 95 ° C for 3 minutes, followed by 35 cycles at 95 ° C (denaturation) for 1 minute, 55 ° C (initiator hybridization) for 1 minute and 72 ° C (extension) for 1 minute, ending with a final extension cycle at 72 ° C for 5 minutes.
  • the amplified products were analyzed by 1.2% agarose gel electrophoresis and the fragments of interest were extracted from the gel and subcloned into E. coli using plasmid pGEM ® -T as a vector, for subsequent sequencing.
  • the membranes were carefully removed from the plates (which were stored at 4 ° C) and treated with Southern I Denaturation Solution for 2 minutes, then with Southern II Neutralization Solution for 5 minutes, and finally with 2X SSC buffer, prepared at Starting from SSC 20X, for 5 minutes. These treatments were performed by depositing the membranes, with the face that was in contact with the phages upwards, on 3MM hatman paper soaked with the corresponding solution. Subsequently, the membranes were allowed to air dry and the transferred DNA was covalently fixed to the membrane.
  • the membranes were incubated at 65 ° C, with constant agitation, in hybridization solution [SSPE 5X (SSPE 20X: NaCl 3.6 M, NaH 2 P0 4 0.2 M, EDTA 20 mM pH 7.7), Denhardt 5X Solution (Denhardt 100X Solution: BSA 2% (p / v), Ficoll TM 2% (p / v), PVP 2% (p / v)), SDS 0.5% (p / v)] for 2 hours.
  • hybridization solution SSPE 5X (SSPE 20X: NaCl 3.6 M, NaH 2 P0 4 0.2 M, EDTA 20 mM pH 7.7), Denhardt 5X Solution (Denhardt 100X Solution: BSA 2% (p / v), Ficoll TM 2% (p / v), PVP 2% (p / v)), SDS 0.5% (p / v)] for 2 hours.
  • the radioactively labeled DNA probe was
  • the probe was removed, and the membrane was washed with wash solution [SSPE 2X, 1% SDS (w / v)] at room temperature for 15 minutes, and then twice more at 65 ° C. Finally, the membranes were wrapped with a transparent plastic film to prevent them from drying out, and were exposed with amplifying screens for the detection of positive clones.
  • the cloned cDNA had a size of 954 bp, including the 3 'end polyA tail, with a 777 bp open reading pattern encoding a protein of 258 amino acids and theoretical molecular weight of 25,784 Da.
  • This deduced amino acid sequence contains the peptides (amino-terminal and internal) sequenced from the purified Pral protease, confirming that the cloned cDNA is the one that encodes this protein.
  • the known sequence of the Pral amino-terminal peptide indicates that the mature protein begins at residue I 1 , from which it follows that Pral is synthesized as a precursor with an amino-terminal extension of 29 amino acids.
  • the molecular weight calculated from the mature protein sequence (I ⁇ -G 228 ) is 25,023 Da, slightly lower than that determined by SDS-PAGE from the purified Pral protein (this divergence between the theoretical weight and the weight determined seems to be due to possible post-translational modifications, such as glycosidations).
  • the isoelectric point estimated from the mature protein sequence is 4.91, coinciding with that observed by preparative isoelectric focusing (4.7-4.9).

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Abstract

Esta invención se refiere a enzimas con actividad proteolítica derivadas del hongo T. hartianum y pertenecientes a la familia de las Serin - peptidasas, a construcciones de ADN que condifican dichas enzimas, a métodos para la producción de dichas enzimas y al empleo de dichas enzimas y preparaciones enzimáticas para degradar materiales que contienen enlaces peptidicos, especialmente las paredes celulares de los hongos.

Description

Serin-proteasa obtenida a partir del hongo Trichoderma harzianum
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a enzimas con actividad proteolitica, a construcciones de ADN que codifican dichas enzimas, a métodos para la producción de dichas enzimas, a composiciones que comprenden dichas enzimas y al empleo de dichas enzimas, construcciones de ADN y composiciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las enzimas con actividad proteolitica, conocidas como proteasas, peptidasas o péptido-hidrolasas, son enzimas capaces de catalizar la hidrólisis de un enlace peptidico (E.C. 3.4) . Este grupo de enzimas se caracteriza por su distribución ubicua en las distintas formas de vida, su variabilidad en la localización celular y por la gran variedad de procesos fisiológicos en los que intervienen.
Atendiendo a su modo de acción las peptidasas se clasifican en exopeptidasas [peptidasas que requieren la presencia de un extremo amino o carboxilo libre en el sustrato] , y endopeptidasas [peptidasas que hidrolizan enlaces peptidicos presentes dentro de la cadena] . Los distintos mecanismos catalíticos reconocidos de estas enzimas han dado lugar a cuatro subgrupos denominados según el sitio activo que interviene directamente en la ruptura del enlace peptidico [aspartil-endopeptidasas, cistein-endopeptidasas, metalo- endopeptidasas y serin-endopeptidasas] . Una revisión de la clasificación y características de estas enzimas puede encontrarse en los trabajos de Rawlings y Barret [Rawlings N.D. & Barrett A.J. (1994) . Families of serine peptidases. Methods in Enzymology, 244:19-61; Rawlings N.D. & Barrett A.J. (1994). Families of cysteine peptidases. Methods in Enzymology, 244:461-486; Rawlings N.D. & Barrett A.J. (1995). Families of aspartic peptidases, and those of unknown catalytic mechanism. Methods in Enzymology, 248:105-120; Rawlings N.D. & Barrett A.J. (1995). Evolutionary families of metallopeptidases . Methods in Enzymology, 248:183-228). Las peptidasas pueden ser acidas, básicas o neutras dependiendo de su actividad a pH bajo, alto o neutro, respectivamente. Las peptidasas se utilizan ampliamente en diversas industrias, por ejemplo, en la fabricación de detergentes para el lavado de la ropa, en la industria del cuero, en la industria alimentaria, etc.
Aunque los hongos del género Trichoderma se llevan estudiando desde hace mucho tiempo (tanto por su actividad celulolitica como por sus propiedades antagonistas de los patógenos fúngicos de las plantas) y se han identificado numerosas enzimas (quitinasas, β-1,3- y β-1, 6-glucanasas, (X- 1, 3-glucanasas, etc.), tan solo se han identificado y caracterizado dos proteasas, una aspartil-proteasa de T. reesei y una serin-proteasa de T. harzianum. Esta última, denominada Prbl (Geremia, R.A., Goldman, G.H., Jacobs, D., Ardiles, ., Vila, S.B., van Motagu, M. and Herrera-Estrella, A. (1993). Molecular characterization of the proteinase-encoding gene, prbl, related to mycoparasitism by Trichoderma harzianum. Molecular Microbiology 83: 603-613), se ha relacionado con el micoparasitismo, tiene un peso molecular de 31 kDa, un punto isoeléctrico (pl) básico y pertenece a la familia de las subtilisinas . Aunque se han descrito numerosas enzimas con actividad proteolitica, su importancia en la industria junto con la enorme variedad existente en cuanto a los mecanismos de acción, afinidad a sustrato, especificidad, capacidad litica, etc., justifican la necesidad de incrementar el arsenal de enzimas con capacidad proteolitica.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevas enzimas con actividad proteolitica. La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han encontrado una nueva enzima con actividad proteolitica, que tiene un pl ácido y pertenece a la familia de las serin-peptidasas . Una característica que presenta dicha enzima, además de su actividad proteolitica que le permite degradar enlaces peptidicos, es su afinidad por estructuras que comprenden proteínas o péptidos, tales como las paredes celulares de los hongos (que contienen quitina y polímeros de glucano embebidos en, y covalentemente unidos a, una matriz proteica) , o estructuras compuestas por polisacáridos covalentemente unidos a proteínas, por ejemplo, cutículas de insectos, arácnidos, etc., por lo que dicha enzima puede intervenir en la degradación o modificación de dichas estructuras que comprenden proteínas o péptidos. Además, la enzima proporcionada por la invención también puede ser utilizada en la inactivación proteolitica irreversible de proteínas estructurales o con actividad enzimática determinantes de la virulencia o patogénesis de patógenos sobre animales o plantas.
Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye una enzima con actividad proteolitica. El procedimiento para la obtención de dicha enzima y composiciones que comprenden dicha enzima también constituyen objetos adicionales de esta invención.
Objetos adicionales de esta invención lo constituyen el empleo de dichas enzimas o composiciones para la degradación o modificación de materiales que contienen enlaces peptidicos, incluyendo estructuras que comprenden proteínas o péptidos, asi como en la inactivación proteolitica irreversible de proteínas estructurales o con actividad enzimática determinantes de la virulencia o patogénesis de patógenos sobre animales o plantas.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye el aislamiento y caracterización de secuencias de ADN que codifican dicha enzima y la clonación de dichas secuencias de
ADN. Los vectores, células y plantas transgénicas que comprenden dichas secuencias de ADN constituyen otro objeto adicional de esta invención. El empleo de dichas secuencias de ADN para la obtención de dichas enzimas o para la construcción de plantas transgénicas también constituye un objeto adicional de esta invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una enzima con actividad proteolitica, en adelante enzima de la invención, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: a) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° :
1, Y b) una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° : 1.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión
"sustancialmente homologa" significa que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de aminoácidos, de, al menos, un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%.
Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "funcionalmente equivalente" significa que la proteina en cuestión tiene, al menos, actividad proteolitica.
La enzima de la invención, además de su actividad proteolitica, que puede ensayarse tanto en gel, mediante el ensayo caseina-SDS-PAGE [Ejemplo 1.2], como en fase liquida
[apartado A del Ejemplo 3.3], puede tener afinidad por estructuras que comprenden proteínas o péptidos, por ejemplo, las paredes celulares de los hongos, las cutículas de insectos y arácnidos, etc., y/o la capacidad de inactivar irreversiblemente, mediante proteolisis, proteínas estructurales o con actividad enzimática implicadas en el ataque de un patógeno sobre animales o plantas. La afinidad de la enzima de la invención por estructuras que comprenden proteínas o péptidos puede ensayarse mediante un procedimiento de adsorción-digestión con paredes celulares purificadas de un hongo, por ejemplo, C. acutatum o Botrytis cinérea, tal como el descrito en el Ejemplo 1.3 donde se ilustra un ensayo para determinar la adsorción de proteínas a paredes celulares fúngicas.
En una realización particular, la enzima de la invención tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° : 1 o un fragmento activo de la misma, es decir, un fragmento de dicha proteína que mantiene la actividad proteolitica. En otra realización particular, la enzima de la invención es una enzima, o fragmento activo, derivada de T. harzianum, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° : 1, o una parte de la misma. En una realización concreta, la enzima de la invención es una enzima derivada de T. harzianum que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° : 1 y ha sido denominada Pral en esta descripción [Ejemplos 1 y 2] .
La enzima Pral tiene un peso molecular de 28 kDa determinado por SDS-PAGE, un pl de 4,7-4,9, un pH óptimo de 7,5 (aunque es más estable a un pH ácido) , una temperatura óptima comprendida entre 35°C y 40°C (pH 7,5), pertenece a la familia de las serin-peptidasas, es una peptidasa de tipo tripsina ya que presenta las secuencias del extremo amino y de un péptido interno presenta una elevada homología con otras proteasas de tipo tripsina, tiene especificidad por N-acetil-Ile-Glu-Ala- Arg-pNA (un sustrato sintético especifico para tripsina) pero no tiene actividad frente a otros sustratos sintéticos para quimotripsina o elastasa [Ejemplo 3] .
La enzima de la invención puede obtenerse a partir de un organismo productor de la misma, tal como un hongo del género Trichoderma, mediante un procedimiento que comprende el cultivo del organismo productor bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha enzima y, posteriormente, recuperar dicha enzima. En una realización particular de esta invención, el hongo utilizado pertenece a la especie Trichoderma harzianum, concretamente a la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 2413.
El cultivo del organismo productor puede hacerse en dos etapas, tal como se menciona en el Ejemplo 1. En una primera etapa se inoculan esporas del hongo en un medio de cultivo suplementado con glucosa como fuente de carbono y, a continuación, se recoge el micelio, se lava y se cultiva en medio mínimo adecuado suplementado con paredes celulares fúngicas purificadas, por ejemplo, de Colletotrichum acυtatum, como única fuente de carbono para inducir enzimas con actividad proteolítica.
El aislamiento y purificación de la enzima de la invención se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales que comprenden la separación de las proteínas producidas mediante cromatoenfoque y la filtración en gel de las fracciones concentradas que presentaron mayor actividad proteolítica [véase el Ejemplo 2] . La enzima con actividad proteolitica purificada se puede utilizar para su caracterización (Ejemplo 3) . A partir de la enzima de la invención se puede identificar y aislar la secuencia de ADN que codifica para dicha enzima mediante un procedimiento que comprende:
- la creación de genotecas de ADN genómico (ADNg) o de ADN copia (ADNc) de organismos productores de la enzima de la invención;
- la secuenciación del extremo amino de la enzima de la invención y de fragmentos trípticos de la misma;
- el diseño de oligonucleótidos adecuados para amplificar, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , una región del clon genómico de los organismos productores de la enzima de la invención que sirva para obtener sondas destinadas a escrutar dichas genotecas; y
- el análisis y selección de los clones positivos. Todas estas etapas se describen con más detalle en el Ejemplo 4 donde se ilustra la obtención de una secuencia de ADN que codifica la proteasa Pral de T. harzianum.
La genoteca de ADNc puede obtenerse a partir del ARN total del organismo productor de la enzima de la invención siguiendo un protocolo estándar [Chomczynski y Sacchi, 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol- chlorofom extraction. Anal. Biochem. 162:156-159] con ligeras modificaciones. En una realización particular, el organismo productor de la enzima de la invención es T. harzianum CECT 2413, que se cultiva en un medio mínimo con paredes celulares fúngicas como única fuente de carbono, aislándose el ARN mensajero (ARNm) mediante cromatografía de afinidad a oligo (dT) celulosa. Posteriormente, se sintetiza el ADNc, por ejemplo, utilizando un kit comercial, se liga a un vector adecuado y se empaqueta en un hospedador apropiado. La secuenciación del extremo amino de la enzima de la invención y de fragmentos internos de la misma se puede realizar mediante cualquier procedimiento convencional, por ejemplo, mediante el método de Edmans Matsudaira [A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing. Academic press, Inc. New York, Edmans Matsudaira (eds.) 1989].
A partir de la información obtenida de la secuencia del extremo amino y de los fragmentos internos de la enzima de la invención se puede diseñar un conjunto de oligonucleótidos destinados a amplificar una secuencia específica correspondiente a la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención. En una realización particular, el oligonucleótido directo se diseñó a partir de la secuencia del extremo amino de la enzima Pral mientras que el oligonucleótido inverso
(antisentido) se diseñó a partir de la secuencia del fragmento interno de la enzima Pral. En el Ejemplo 3 se describen las secuencias del extremo amino y de un fragmento interno de la enzima Pral que sirvieron para diseñar los oligonucleótidos utilizados para la realización de la PCR.
Los fragmentos adecuados resultantes de la amplificación mediante PCR se pueden marcar y utilizar como sondas para escrutar una genoteca (de ADNg o de ADNc) con el fin de aislar los clones de interés mediante hibridación in situ .
Por tanto, la invención proporciona una construcción de ADN que codifica para la enzima de la invención que comprende: a) una secuencia de ADN que comprende la SEC. ID. N° : 2; o b) una secuencia de ADN análoga a la secuencia definida en a) que i) es sustancialmente homologa a la secuencia de ADN definida en a) ; y/o ii) codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteina codificada por la secuencia de
ADN definida en a) .
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análogo/a" pretende incluir a cualquier secuencia de ADN que codifica para una enzima con actividad proteolítica que tiene las propiedades i)-ii) arriba mencionadas. Típicamente, la secuencia de ADN análoga:
- se puede aislar de cualquier organismo que produce la enzima con actividad proteolitica en base a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. N° : 2, o
- se construye en base a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. N° : 2, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas, es decir, que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la proteasa codificada por dicha secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. N° : 2, pero que corresponde al empleo de codones del organismo hospedador destinado a la producción de la enzima, o bien mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que dan lugar a una secuencia de aminoácidos diferente y, por tanto, posiblemente, a una estructura proteica diferente que pudiera dar lugar a una proteasa mutante con propiedades diferentes a las de la enzima nativa. Otros ejemplos de posibles modificaciones incluyen la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. Por ejemplo, la secuencia de ADN análogo puede ser una subsecuencia de la secuencia de ADN mostrada en cualquiera de las secuencias mostradas en la SEC. ID. N°: 2.
En general, la secuencia de ADN análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de ADN que codifica para una enzima con actividad proteolítica de la invención, por ejemplo SEC. ID. N° : 2, es decir, presenta una homología a nivel de nucleótidos de, al menos, un 70%, preferentemente, al menos un 85%, o más preferentemente, al menos, un 95% respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas previamente.
En una realización particular, la secuencia de ADN proporcionada por esta invención tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N° : 2, o un fragmento de la misma que codifica una proteina que mantiene la actividad proteolítica.
En otra realización particular, la secuencia de ADN proporcionada por esta invención, o fragmento que codifica una proteína que mantiene la actividad proteolítica, procede de T. harzianum y comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N° : 2, o una parte de la misma. En una realización preferida, dicha secuencia de ADN deriva de T. harzianum, tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N° : 2 y codifica la proteasa Pral de T. harzianum.
La secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención puede proceder no solo de T. harzianum sino de cualquier otra cepa de Tri choderma o de cualquier organismo hospedador transformado con dicha secuencia ,de ADN.
Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención, puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir del -ADN de cualquier organismo mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos preparados a partir de la información sobre la secuencia de ADN proporcionada en esta descripción, o mediante iniciadores (por PCR) .
La secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención, o la construcción que la contiene, puede ser insertada en un vector apropiado. Por tanto, la invención también se refiere a un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia de ADN, o una construcción que la contiene. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha células y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (en los que) se ha integrado. En el vector proporcionado por esta invención, la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención debe estar conectada operativamente a un promotor y a una secuencia terminadora. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra una actividad transcripcional en la célula hospedadora elegida y puede derivar bien de genes que codifican para proteínas homologas o heterólogas de la célula hospedadora. Los procedimientos utilizados para ligar la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención al promotor y a la secuencia terminadora, respectivamente, y para insertar dicha construcción en un vector son bien conocidos por los técnicos en la materia y han sido descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989] .
La invención también proporciona una célula que comprende una secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención, o una construcción de ADN que contiene a dicha secuencia o dicho vector mencionado más arriba. Las células hospedadoras que se pueden transformar con la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención pueden ser células procarióticas o, preferentemente, células eucarióticas, tales como células de tejidos vegetales o células fúngicas, por ejemplo, células de levadura o de hongos filamentosos. La transformación de estas células puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante técnicas que implican la formación de protoplastos y la transformación de los mismos seguido de la regeneración de la pared celular. La transformación de células de tejidos vegetales puede ser muy interesante desde diversos puntos de vista, por ejemplo, para aumentar la resistencia a hongos fitopatógenos . Debido a que la enzima de la invención, opcionalmente, tiene la capacidad de inactivar irreversiblemente, mediante proteolisis, proteínas estructurales o con actividad enzimática implicadas en el ataque de patógenos a animales o plantas y/o determinantes de la virulencia o patogénesis de patógenos sobre animales o plantas, la construcción de ADN proporcionada por esta invención, que codifica la enzima de la invención, se puede utilizar para reducir la virulencia o patogénesis de patógenos de animales y plantas, o para aumentar la resistencia de animales y plantas a patógenos, por ejemplo, para aumentar la resistencia de plantas frente a hongos del género Botrytis mediante la inactivación de la(s) proteína (s) estructural (es) o enzima (s) implicadas en el ataque del patógeno a la planta. Por consiguiente, en una realización particular, la construcción de ADN proporcionada por esta invención se utiliza en la obtención de plantas transgénicas capaces de expresar la enzima de la invención para mejorar la resistencia a patógenos mediante la inactivación irreversible de enzimas y proteínas responsables del ataque a la planta. Para la obtención de estas plantas transgénicas se puede proceder con las técnicas convencionales de ARNm antisentido y/o sobreexpresión (silenciamiento en sentido), u otras, por ejemplo, utilizando vectores binarios u otros vectores disponibles para las diferentes técnicas de transformación de plantas existentes en la actualidad. Por tanto, la invención también proporciona una célula transgénica de una planta que comprende una construcción de ADN de la invención que tiene un promotor, funcional en dicha planta, operativamente enlazado a una construcción de ADN de la invención, o a un fragmento de la misma. Una planta transgénica que comprende, al menos, una de dichas células transgénicas, constituye un objeto adicional de esta invención. En una realización particular, dicha planta transgénica es una planta de fresa.
La invención también proporciona un método para la producción de una enzima de la invención, que comprende cultivar una célula hospedadora adecuada que contiene la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención bajo condiciones que permiten la producción de la enzima y recuperar la enzima del medio de cultivo. El medio utilizado para cultivar las células hospedadoras transformadas puede ser cualquier medio adecuado para cultivar las células hospedadoras en cuestión. La peptidasa expresada puede ser, ventajosamente, secretada al medio de cultivo y puede ser recuperada mediante un procedimiento como el descrito en el Ejemplo 2 o por cualquier otro procedimiento convencional de aislamiento de proteínas que comprende la separación de las células del medio de cultivo, la precipitación de las proteínas y la separación por métodos cromatográficos .
La invención también proporciona una preparación enzimática que comprende, al menos, una enzima con actividad proteolitica de la invención. Esta preparación enzimática es útil para la degradación o modificación de materiales que contienen enlaces peptidicos, es decir, materiales que contienen proteínas, péptidos o restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, tales como paredes celulares de organismos procariotas o eucariotas, por ejemplo, paredes celulares de hongos, ya que dichas paredes celulares contienen quitina y/o polímeros de glucano embebidos en, y covalentemente unidos a, una matriz proteica, o cutículas de insectos o arácnidos que comprenden estructuras a base de polisacáridos unidos covalentemente a proteínas.
La preparación enzimática proporcionada por esta invención puede contener entre 0,01% y 100% en peso de la enzima con actividad proteolitica de la invención. En una realización particular, la preparación enzimática proporcionada por esta invención es una preparación enzimática de componente único y contiene mayoritariamente una enzima con actividad proteolitica de la invención.
En otra realización particular, la preparación enzimática proporcionada por esta invención comprende múltiples actividades enzimáticas, por ejemplo, diferentes actividades enzimáticas requeridas para la modificación o degradación de paredes celulares microbianas. A modo de ejemplo, dicha preparación enzimática puede incluir enzimas liticas, en particular de origen microbiano (fúngico o bacteriano), por ejemplo, derivadas de diversas especies de los géneros Trichoderma, Oerskovia , Arthrobacter, Rhizotocnia,
Staphylococcus o Streptomyces . También puede contener una o más enzimas capaces de modificar o degradar paredes celulares, por ejemplo, enzimas con actividad celulolítica, mananolítica, quitinolitica o proteolitica, tales como celulasas, β-(l,6)- glucanasas, β- (1, 3) -glucanasas, mananasas, endo- o exo- quitinasas, quitosanasas, proteasas, α- o β-manosidasas, mutanasas, etc. Estas enzimas pueden proceder de cualquier organismo productor de las mismas, tales como diversas especies del género Aspergill us o los mencionados más arriba en relación con las enzimas líticas.
La preparación enzimática de la invención puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. La preparación enzimática puede contener aditivos, por ejemplo, estabilizantes que prolonguen la estabilidad de la misma.
La enzima con actividad proteolítica proporcionada por esta invención también puede tener afinidad por paredes celulares fúngicas, o por cutículas de insectos y arácnidos, por lo que puede coadyuvar en la degradación de paredes celulares de hongos, por ejemplo, hongos fitopatógenos, tales como C. acυta tum, B. cinérea , etc., o en la degradación de cutículas de insectos, arácnidos, etc. Por tanto, la invención también proporciona una composición antifúngica que comprende, al menos, una enzima de la invención junto con, al menos, un fungicida, por ejemplo, un fungicida químico. Como fungicida químico puede utilizarse cualquiera de los usados habitualmente, preferentemente, un fungicida químico seleccionado del grupo formado por los fungicidas químicos que afectan a la membrana, los fungicidas químicos que afectan a la síntesis de la pared celular y sus mezclas. Opcionalmente, la composición antifúngica de la invención puede contener, además, al menos, una proteína con actividad enzimática degradadora de la pared celular. Cualquier enzima con actividad degradadora de paredes celularas puede utilizarse, si se desea, en la composición antifúngica de la invención.
La composición antifúngica de la invención, que puede contener entre 0,01% y 99,99% en peso de la enzima de la invención, puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. La composición antifúngica de la invención también puede contener aditivos, por ejemplo, estabilizantes con el fin de prolongar la estabilidad de la misma.
Puesto que la enzima de la invención puede ser utilizada para degradar o modificar materiales que contienen enlaces peptidicos, por ejemplo, las proteínas presentes en las paredes celulares microbianas, la enzima de la invención puede ser utilizada como biofungicida frente a diversos organismos perniciosos, por ejemplo, frente a hongos fitopatógenos
(incluyendo los hongos que causen daños en cultivos y los hongos contaminantes de frutos .pre- y post-cosecha) , hongos patógenos de animales (incluyendo hongos patógenos de humanos), hongos contaminantes de alimentos, superficies y equipamientos, y, en general, cualquier hongo que provoque pérdidas económicas en cualquier sector industrial, agrícola o ganadero.
La enzima de la invención también puede utilizarse para romper o Usar las paredes celulares de diversos microorganismos para recuperar productos de interés producidos por dichos microorganismos.
La preparación enzimática de la invención puede diseñarse a voluntad con una composición específicamente adaptada para la pared celular a romper o usar. Por ejemplo, si la pared celular a romper contiene un complejo proteína-manano y un glucano, la preparación enzimática podría contener, ventajosamente, una mezcla de actividades proteasa, mananasa, quitinasa . y β-glucanasa, con el fin de romper de forma eficiente dicha pared celular. Otras aplicaciones de la enzima de la invención incluyen, a modo ilustrativo, no limitativo, la extracción de mano- proteínas de la capa externa de las paredes celulares de levadura; la producción de protoplastos a partir de levaduras u hongos; la preparación de extractos de levaduras y hongos; la mejora de las operaciones de filtración en procesos para la producción de vinos, mostos y zumos; la elaboración de vinos con propiedades organolépticas alteradas mediante la sobreexpresión del gen en las levaduras vínicas; la elaboración de composiciones para la limpieza de dientes y dentaduras; la elaboración de composiciones para la limpieza de lentes de contacto; la eliminación de hongos sobre recubrimientos; el tratamiento de tejidos, por ejemplo, la retirada del exceso de colorante en los tejidos; la elaboración de composiciones para retirar la placa dental; la elaboración de composiciones para retirar películas biológicas (biofilms) depositadas en superficies, por ejemplo en la superficie de una lente de contacto; la fabricación de detergentes para el lavado de la ropa y/o la vajilla, etc.
La enzima o la preparación enzimática o la composición antifúngica proporcionadas por esta invención pueden utilizarse en el control de organismos perniciosos, por ejemplo, frente a hongos fitopatógenos (incluyendo los hongos que causen daños en cultivos y los hongos contaminantes de frutos pre- y post- cosecha) , hongos patógenos de animales (incluyendo hongos patógenos de humanos) , hongos contaminantes de alimentos, superficies y equipamientos, y, en general, cualquier hongo que provoque pérdidas económicas en cualquier sector industrial, agrícola o ganadero. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "controlar" incluye la reducción o paralización del crecimiento y/o de la germinación que puede resultar en la eliminación de dichos organismos perniciosos o en la disminución de los daños causados por éstos. Por tanto, en una realización particular de esta invención dichas preparaciones enzimáticas o composiciones antifúngicas serán composiciones farmacéuticas o composiciones para su aplicación en el sector agrario.
La enzima, preparación enzimática o composición antifúngica de la invención también puede ser utilizada para desinfestar, prevenir y/o tratar la infección causada por hongos patógenos de animales en instalaciones ganaderas, las cuales son susceptibles de estar infestadas por hongos patógenos de animales que crecen y se desarrollan en sustratos que están en contacto con los animales, por ejemplo, la paja utilizada en las camas de los animales, o en las condiciones de estabulación de los animales, con lo que existe el riesgo de que dichos animales sean infestados por tales patógenos.
Por otra parte, como es bien conocido, en ocasiones, las muestras de ensayos para análisis, por ejemplo, muestras biológicas, de alimentos, etc., presentan contaminaciones por hongos que dificultan o impiden el análisis de dichas muestras. La invención proporciona una solución a dicho problema que consiste en el empleo de una enzima, preparación enzimática o composición antifúngica de la invención para controlar la contaminación fúngica en dichas muestras de ensayo para análisis, mediante su aplicación a dichas muestras. La composición antifúngica de la invención puede ser usada para controlar todo tipo de hongos perniciosos, tales como los mencionados previamente, mediante el mecanismo de lucha conocido como control integrado. La dosificación de la preparación enzimática y de la composición antifúngica proporcionadas por esta invención y sus condiciones de uso pueden ser determinados en base a los métodos conocidos en la técnica.
Otras aplicaciones de la enzima de la invención incluyen su empleo para combatir la patogénesis debida a insectos, arácnidos, etc., mediante la destrucción o modificación de su cutícula, así como su empleo para reducir la virulencia o patogénesis de patógenos de animales o plantas mediante la inactivación proteolitica irreversible de proteínas estructurales y/o enzimas implicadas en el ataque de dichos patógenos sobre animales y plantas.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Producción de enzimas con actividad proteolitica por T. harzianura CECT 2413 en cultivo líquido con afinidad por paredes celulares fúngicas
1.1 Condiciones de cultivo de T. harzianum Se realizaron pre-cultivos de T. harzianum CECT 2413 en matraces Erlenmeyer de 500 L conteniendo 200 mi de medio mínimo para Trichoderma (MM) (15 g NaH2P04, 1 mi metales traza (FeS04-7H20 0,5 g, MnS04-H20 0,16 g, ZnS04-H20 0,14 g, CoCl2 0,37 g, H20 destilada en cantidad suficiente para (c.s.p.) 100 mi), glucosa al 2% como fuente de carbono. El pH del medio se ajustó a pH 5,5 con KOH 10 M y se añadió agua destilada en c.s.p. 973,5 mi. Una vez esterilizado el medio se añadieron 20 mi de (NH4)2S04 (250 mg/mL) , 4,1 mi de CaCl2 1 M y 2,4 mi de MgS04 1 M. Los matraces se inocularon con una concentración final de 10 esporas/ml, y se incubaron a 200 rp a 25°C durante 48 horas. A continuación, los micelios se recogieron, en condiciones de esterilidad, por filtración en kitasato a través de papel de filtro, se lavaron abundantemente con solución de MgCl2 al 2% (w/v) y con agua estéril, e inmediatamente se utilizaron para inocular nuevos cultivos.
1.2 Ensayo de la actividad proteolítica en geles de poliacrilamida: caseína-SDS-PAGE
La detección de actividad proteolítica en los sobrenadantes de cultivo de T. harzianum se llevó a cabo después de someter las muestras a SDS-PAGE con el sustrato copolimerizado en el gel. Para ello, la preparación de los geles se realizó normalmente pero incluyendo en el gel de separación el sustrato caseína, concretamente 600 μl de tampón de renaturalización [Tris/HCl 50 M pH 8,0, caseína (Sigma) 1% (p/v) , ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) 2 mM y azida sódica 0,05% (p/v)]. Las muestras a ensayar se prepararon en tampón de carga conteniendo el agente desnaturalizante dodecilsulfato sódico (SDS) pero no el agente reductor 2- mercaptoetanol [Tris/HCl 0,25 M pH 6,8; glicerol al 40%; SDS al 8% y azul de bromofenol al 0/05 %] . La electroforesis se realizó a 4°C para reducir la actividad enzimática durante la carrera. Posteriormente, el gel se incubó en tampón de renaturalización a temperatura ambiente en agitación durante 1 hora, con dos cambios del tampón. Este paso tiene la finalidad de eliminar el SDS contenido en el gel y permitir la renaturalización de las enzimas. Seguidamente, el gel se incubó a 37 °C en tampón acetato sódico 50 mM durante 6 horas para permitir la actuación de las proteasas. Después de teñir y desteñir los geles la actividad proteolitica es visualizada como una zona no teñida sobre fondo azul oscuro.
1.3 Ensayo de adsorción de proteínas a paredes celulares fúnqicas La afinidad sobre paredes celulares fúngicas de enzimas con actividad proteolitica secretadas por T. harzianum CECT 2413 se ensayó siguiendo un método de adsorción-digestión convencional. Para ello, alícuotas de 2 mi de los sobrenadantes de cultivo de T. harzianum, concentrados y dializados, se incubaron en agitación a 4°C durante 20 minutos con un volumen igual de una suspensión al 1% (p/v) de paredes celulares fúngicas purificadas. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm en una centrífuga Sorvall modelo RC5-C con rotor SS34 durante 10 minutos. Los sobrenadantes recogidos se volvieron a incubar con nuevas suspensiones de paredes celulares dos veces más. Finalmente se reunieron las paredes celulares y se lavaron tres veces con 5 mi de tampón fosfato potásico 70 mM pH 6,0 suplementado con NaCl 1 M. Las proteínas no adsorbidas a las paredes celulares (que permanecieron en los sobrenadantes) se precipitaron y dializaron. Las paredes celulares con las proteínas adsorbidas se resuspendieron en 1 mi de tampón acetato sódico 50 mM pH 5,5 y se incubaron en tubos Eppendorf a 37 °C durante 24 horas para permitir la digestión de las paredes celulares y la liberación de las proteínas adsorbidas. Posteriormente, la mezcla se centrifugó a 13.000 g durante 5 minutos, se recogió el sobrenadante, y se dializó frente a agua destilada. El análisis de las proteasas presentes en las distintas fraciones se realizó mediante un ensayo de actividad en gel caseína-SDS-PAGE [Ejemplo 1.2] .
1.4 Identificación de proteínas con actividad proteolitica Para la identificación de proteínas con actividad proteolítica secretadas por T. harzianum CECT 2413 se realizaron pre-cultivos del hongo en medio mineral mínimo (MM) suplementado con glucosa al 2% tal como se ha indicado en el Ejemplo 1.1. Una vez crecido el micelio, se recogió y se transfirió a medio MM conteniendo como única fuente de carbono paredes celulares purificadas de C. acutatum (condiciones de micoparasitismo simulado) o glucosa al 2% (condiciones de represión por fuente de carbono para otras enzimas descritas) . Las suspensiones de paredes celulares de C. acutatum y B. cinérea se prepararon a partir de micelio. Las células se rompieron en mortero en presencia de nitrógeno líquido, y se lavaron numerosas veces con NaCl 2M y seguidamente con agua destilada, centrifugando durante 5 minutos a 8.000 rpm en centrífuga Sorvall modelo RC5-C con rotor GSA, y recogiendo el precipitado en cada lavado. Posteriormente, las paredes obtenidas se recogieron por filtración en kitasato, se congelaron a -80°C y se liofilizaron durante 12 horas en un liofilizador Virtis Centry™, conservándose a temperatura ambiente hasta su utilización. El grado de purificación se determinó observando al microscopio óptico la ausencia de material citoplasmático y de membrana plasmática.
Los sobrenadantes de los cultivos de T. harzianum recogidos a las 9, 24, y 48 horas, concentrados y dializados, se analizaron mediante un ensayo de actividad proteolítica en gel caseina-SDS-PAGE [Ejemplo 1.2].
A partir de cultivos en presencia de paredes celulares se detectó una única banda de actividad a una altura inferior a la esperada para la proteasa Prbl de 31 kDa descrita en T. harzianum por Geremia y col. (Geremia, R.A., Goldman, G.H., Jacobs, D., Ardiles, ., Vila, S.B., van Motagu, M. and Herrera-Estrella, A. (1993) . Molecular characterization of the proteinase-encoding gene, prbl, related to mycoparasitism by Trichoderma harzianum. Molecular Microbiology 83: 603-613), y que con el tiempo de cultivo se mostró más intensa. En los cultivos mantenidos 24 ó 48 horas se observaron, además, otras zonas de actividad proteolitica que no siempre aparecían bien definidas. A partir de los sobrenadantes de cultivos con glucosa como fuente de carbono, no se detectaron bandas de actividad, a excepción de una banda muy tenue después de 48 horas de cultivo. La caseína empleada como sustrato en este tipo de ensayos de actividad proteolitica suele utilizarse para la detección, en principio, de todo tipo de proteasas; no obstante en la detección de metalo-proteasas se recomienda el uso de gelatina (Wang, K.K. ., 1999. Detection of proteolytic Enzymes using Protein substrates. En: Proteolytic Enzymes. Tools and Targest.PP. 49-62. Springer-Verlag Berlín Heidelberg, NY) . Ensayos mediante gelatina-SDS-PAGE de los sobrenadantes anteriores no revelaron nuevas bandas de actividad, y las ya observadas desaparecieron o aparecieron con menor intensidad.
Para conocer la afinidad por paredes celulares fúngicas de las enzimas con actividad proteolítica producidas por T. harzianum CECT 2413 mediante el protocolo descrito en el
Ejemplo 1.4, se sometieron alícuotas de 2 mi del sobrenadante del cultivo mantenido 48 horas en presencia de paredes celulares, a un proceso de adsorción-digestión con paredes celulares purificadas de C. acutatum o de Botrytis cinérea, tal y como se describe en el Ejemplo 1.3. En la fracción adsorbida a las paredes celulares de C. acutatum o de B. cinérea se detectó una única banda de actividad, mientras que las demás isoenzimas permanecieron únicamente en la fracción no adsorbida.
La afinidad de dicha enzima con actividad proteolítica por la estructura de la pared celular sugería que podía formar parte de la batería de enzimas implicadas en el micoparasitismo, por lo que se procedió a su purificación y caracterización.
EJEMPLO 2 Purificación de una enzima de T. harzianum con actividad proteolítica con afinidad a paredes celulares fúngicas
La purificación de enzimas con actividad proteolítica obtenida mediante el protocolo .descrito en el Ejemplo 1 se realizó a partir del sobrenadante de un cultivo de T. harzianum CECT 2413 mantenido durante 48 horas en medio MM con paredes celulares de C. acutatum como fuente de carbono. Para ello, 2 mi del sobrenadante dializado y concentrado 75 veces se sometieron a cromatoenfoque para separar proteínas en base a su punto isoeléctrico. Los perfiles de elución obtenidos muestran 2 picos de actividad proteolitica sobre azocaseína, uno eluído a pH básico, coincidiendo con el pico de proteína mayoritario, y otro a pH ácido. La isoenzima que coincidía en movilidad electroforética con la banda correspondiente a la proteasa con afinidad por paredes celulares de hongos y que era la de mayor interés, fue localizada en este segundo pico mediante el ensayo de actividad en gel caseína-SDS-PAGE (Ejemplo 1.2), lo que indica que se trataba de una proteasa acida de pl 4,7-4,9.
Las fracciones se mezclaron, se concentraron en Centricón- 10 (Amicon) y se sometieron a cromatografía de filtración en gel. Las fracciones que presentaron mayor actividad proteolítica, se reunieron y se concentraron de nuevo en Centricon-10. El posterior análisis mediante SDS-PAGE y caseína-SDS-PAGE' permitió comprobar la homogeneidad de la preparación obtenida, en la que se observó una única banda de proteina y de actividad proteolítica respectivamente. La enzima purificada con actividad proteolitica y pl ácido ha sido denominada Pral y ha sido utilizada para su caracterización.
EJEMPLO 3 Caracterización de la proteasa Pral
3.1 Peso molecular El peso molecular calculado después de SDS-PAGE y tinción con azul de Coomasie fue de 28,5 kDa aproximadamente [Laemmli, E.K. (1970) . Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage T4. Nature 227: 6]. Cuando al tampón de carga se le añadió el agente reductor 2-mercaptoetanol, no se observaron cambios en el peso molecular, lo que indica la inexistencia de sub-unidades asociadas por puentes disulfuro, al menos, de diferente peso molecular. 3.2 Microsecuenciación La secuenciación de péptidos obtenidos a partir de la proteasa Pral purificada se realizó con el doble fin de comparar las secuencias de aminoácidos con las contenidas en las bases de datos y de llevar a cabo el diseño de oligonucleótidos degenerados que permitiera clonar el gen que codifica Pral.
La secuenciación del extremo amino-terminal y de péptidos internos de Pral fue realizada por el servicio de secuenciación Eurosequence b.v. (Groningen, Holanda) . Para cada una de las secuencias se partió de 1 nmol de proteína purificada y posteriormente recortada del gel después de SDS-PAGE y tinción con azul de Coomasie. La obtención de péptidos internos se realizó por digestión enzimática de la proteína con tripsina, y posterior extracción y purificación mediante RP-HPLC. El proceso de secuenciación se llevó a cabo siguiendo el método de degradación de Edman en un secuenciador automático Applied Biosistems modelo 494 conectado en fase con un aparato de RP- HPLC para la identificación de los PTH-aminoácidos liberados. En la Tabla 1 se muestran las secuencias obtenidas del péptido amino-terminal y de un péptido interno de Pral. Ambos mostraron similitud con secuencias de aminoácidos de proteasas como tripsinas (o tipo-tripsina) mayoritariamente, kalikreina, o activador del plasminógeno. Todas estas enzimas forman parte de la familia SI de las serin-peptidasas cuyo enzima representativo es la quimotripsina y que está constituida por enzimas con actividad endopeptidasa. Tabla 1 Secuencias de pépt±dos
Péptidos de Proteínas Organismo (Reino*) Id. Pral (%)
Amino- Tripsina ALP1 Cochliobulus carbonum 84,6 terminal : ( Fungi )
IVGGTTAALGEFP Tripsina I Ascatus fluviatilis 84,6
(Metazoa)
Precursor de tripsina Pacifastus leniusculus 84,6
(Metazoa)
Proteasa tipo tripsina Phaeosphaeria nodorum 76,9
SNP-1 ( Fungi )
Precursor de proteasa Metarhizium anisopliae 76,9 tipo tripsina (Fungi)
Precursor de Streptomyces fradiae 76,9 tripsinógeno (Bacteria)
Precursor de tripsina Streptomyces griseus 76,9
(Bacteria)
Proteasa tipo tripsina Streptomyces exfoliatus 76,9 (Bacteria)
Precursor de serin Haliotis rufescens 76,9 proteasa tipo (Metazoa) quimotripsina
Serin-proteasa tipo Ctenophalides felis 76,9 tripsina SP-8 (Metazoa)
Precursor de kalikreina Mus musculus (Metazoa) 76,9 de plasma
Precursor de tripsina Fusari um oxysporum 69,2
( Fungi )
Interno : Precursor de tripsina Fusarium oxysporum 73,3
( Fungi )
DSXSGDSGGPIIDP Proteasa tipo tripsina Phaeosphaeria nodorum 73,3 SG SNP-1 ( ungi )
Precursor de proteasa Metarhizium anisopliae 66, 6 tipo tripsina (Fungi)
Serin proteasa Mycobacteri um 66,6
(tripsina) tuberculosis (bacteria)
Precursor de tripsina Phedom cocleariae 66, 6
(Metazoa)
Tripsina A P1 Cochliobulus carbonum 60, 0
(Fungi )
Activador del Scolopendra subspinipes 60, 0 plasminógeno (Metazoa)
Proteasas tipo tripsina Ctenocephalides felis 60,0
(SP-2, SP-6, SP-28, SP- (Metazoa) 40)
Id: Identidad
Las secuencias del péptido amino-terminal y de los péptidos internos de Pral están recogidas dentro de la SEC. ID. N° : 1 que contiene la secuencia putativa completa de aminoácidos de Pral.
3.3 Determinación del tipo de peptidasa mediante ensayos de especificidad para sustratos e inhibición de la actividad proteolítica
A. Ensayo de la actividad proteolitica en fase liquida
La actividad proteolítica de la enzima se puede ensayar utilizando azocaseína como sustrato. La mezcla de reacción consta de 250 μl de tampón de acetato sódico 100 mM pH 5,5 que contiene la muestra de enzima, 125 μl de Brij 35 al 0,1% y 125 μl de azocaseína (Sigma) . La mezcla de reacción se incuba a
30°C durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 3,5 horas, parándose la reacción por adición de 200 μl de TCA
(ácido tricloroacético) al 10%, y el sobrenadante se mide a 366 nrα. Una unidad de actividad representa la hidrólisis de 1 μg de azocaseína por minuto en las condiciones del ensayo.
B. Especificidad para sustratos
Las diferencias en la especificidad para el sustrato son, en general, más útiles en la caracterización y clasificación de las exopeptidasas . No obstante, se conoce la actividad catalítica preferencial por determinados residuos de aminoácidos de muchas endopeptidasas (Powers Powers, J.C. and Ka , C. (1995) Peptide Thioster substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases . En: Methods in Enzymology, 248. 3-18), y así, mediante ensayos de actividad sobre determinados péptidos sintéticos se puede analizar la naturaleza de éstas.
Teniendo en cuenta la información obtenida en el Ejemplo
3.2 se ensayó la actividad endopeptidasa de Pral sobre 3 péptidos sintéticos (Sigma) con los extremos amino y carboxilo bloqueados que permiten diferenciar distintos tipos de actividades dentro de la familia SI de peptidasas: N-acetil-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA (Arg-pNA) para tripsinas,
N-succinil-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA (Leu-pNA) para elastasas, y
N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Phe-pNA) para quimotripsinas/ subtilisinas (esta última perteneciente a la familia S8) . La solución enzimática (75 ng) se preparó en 90 μl de tampón fosfato sódico 100 mM y se preincubó durante 5 minutos a 30 °C. Las reacciones se iniciaron por adición de 10 μl de solución de sustrato 10 mM precalentado (preparado a partir de soluciones 100 mM en DMSO conservadas a -20°C) . Después de 20 minutos de incubación las reacciones se pararon por adición de 50 μl de ácido acético al 2% (v/v) . A continuación, se midió la absorbancia de 100 μl a 405 nm en microplacas de 96 pocilios (Inmunoplate Maxisorp, NUNC) utilizando un lector automático Titertek Multiskan Plus 311 A0 (Flow Laboratories), y se calcularon los n oles de p-nitroanilina (p-NA) liberados por minuto. En paralelo se llevaron blancos de enzima sin sustrato, y sustrato sin enzima. La recta patrón se construyó con soluciones de para-nitroanilina (p-NA) (Sigma) a concentraciones conocidas (0-1,25 mM) preparadas a partir de una solución inicial 5 M. Esta solución se preparó previa disolución de p-NA en un volumen mínimo de etanol.
La actividad lítica de Pral sobre el péptido Arg-pNA confirmó su identidad de endopeptidasa, y además mostró la preferencia de esta proteasa por un residuo apolar (Arg) en la posición Pl f característica de enzimas tipo tripsina. La actividad específica de Pral sobre este sustrato fue de 94.800 U/mg en condiciones óptimas de actividad (30°C y pH 7,5). Se calcularon valores de K^, Kcat, y K^ Km de 0,22 mM, 39,64 s"1 y 180,18 mM"1s"1 respectivamente. La determinación de los parámetros cinéticos Km, Kcat, y
Kcat/Km se realizó a partir de las velocidades iniciales calculadas en ensayos con distintas concentraciones de sustrato
(0,05-2 mM) . Para ello, el sustrato se preparó en 0,99 mi de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,5 y se preincubó a 30°C. Entonces la reacción comenzó por adición de 10 μl de la proteasa Pral purificada (2,5 ppm) precalentada a la misma temperatura. La actividad se monitorizó durante 10 minutos en un espectrofotómetro Shimadzu UV-160A a 405 mn termostatizado a 30°C. Una unidad de actividad representó la liberación de 1 nmol p-NA por minuto en las condiciones del ensayo. Como blancos de la reacción se prepararon soluciones de enzima sin sustrato, y sustrato sin enzima. La recta patrón se construyó con soluciones de p-NA (Sigma) a concentraciones conocidas (0- 200 μM) , preparadas como se indicó anteriormente. Los parámetros cinéticos se calcularon mediante representaciones de dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk (1/V vs 1/S) .
No se observó actividad litica de Pral sobre Leu-pNA ni sobre Phe-pNA, lo que indica la ausencia de actividad elastasa y quimotripsina/subtilisina respectivamente.
C. Inhibición de la actividad proteolítica
Para determinar el tipo catalítico al que pertenece Pral se emplearon inhibidores específicos de los distintos mecanismos catalíticos conocidos. El efecto de dichos inhibidores en la actividad de Pral se analizó preincubando la solución enzimática durante 30 minutos a 30°C en tampón fosfato' 100 mM pH 7,5 con dichos inhibidores específicos de los distintos mecanismos catalíticos conocidos:
- PMSF 1 mM (solución inicial 100 mM en isopropanol) , - EDTA lmM (solución inicial 100 mM en agua) ,
- Pepstatina 0,1 mM (solución inicial 10 mM en DMSO) ,
- Iodoacetamida 1 mM (solución inicial 100 mM en agua, preparada en el momento de uso) .
En paralelo al ensayo enz-imático se llevaron también controles en presencia del disolvente orgánico en el que se disolvió el inhibidor. La actividad residual se determinó como porcentaje de la actividad en ausencia del inhibidor.
Como cabía esperar para una serin-peptidasa, la actividad lítica de Pral se inhibió drásticamente en presencia de PMSF. Este inhibidor irreversible también puede actuar sobre cistein- peptidasas, sin embargo, el agente alquilante iodoacetamida, inhibidor específico de éstas, mostró un débil efecto sobre la actividad de Pral. Empleando inhibidores como pepstatina o EDTA, Pral también conservó más del 90% de su actividad.
Los resultados obtenidos permiten afirmar que Pral es una serin-endopeptidasa (EC 3.4.21). La pertenencia de Pral a la familia SI, y particularmente al grupo de enzimas tipo tripsina (EC 3.4.21.4), se confirmó al analizar la secuencia de aminoácidos completa de la proteína.
3.4 Efecto de la temperatura sobre la actividad y estabilidad de Pral
Para la determinación de la temperatura óptima de actividad de Pral el ensayo enzimático se llevó a cabo en un intervalo de temperaturas comprendido entre 30°C y 85°C. El efecto de la temperatura sobre la estabilidad de Pral se determinó preincubando la solución enzimática en tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,5 durante 20 minutos a distintas temperaturas (30-85°C) . El sustrato utilizado en estos ensayos fue el péptido sintético N-acetil-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA, específico para tripsinas.
El efecto de la temperatura sobre la actividad de la proteasa Pral puso de manifiesto que su temperatura óptima está próxima a 35°C. A 45°C la actividad se redujo drásticamente hasta el 16%, y a partir de 55°C no se detectó actividad. Puesto que a 30°C Pral mantiene el 95% de la actividad, y esta temperatura está próxima a las condiciones en las que se cultiva Tri choderma, se tomó como temperatura habitual para los ensayos de actividad.
3.5 Efecto del pH sobre la actividad y estabilidad de Pral
Para la determinación del pΗ óptimo de actividad de Pral se llevó a cabo el ensayo en los siguientes sistemas de tampones: acetato sódico 100 mM (pH 3-5,5), fosfato sódico 100 mM (pH 6-7), y Tris/HCl 100 mM (pH 7,5-9). El efecto del pH sobre la estabilidad de Pral se determinó pre-incubando la solución enzimática (750 ng) durante 24 horas a 4°C en 10 μl de los tampones anteriores. Posteriormente, se tomaron alícuotas de 10 μl para la realización del ensayo en las condiciones estándar.
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que el pH óptimo de actividad de Pral está comprendido entre 7,0 y 8,0. La actividad decreció rápidamente cuando el ensayo se realizó en tampones con pH superior a 8,5 o inferior a 6,5. El ensayo de actividad de Pral realizado en condiciones óptimas (30°C y pH 7,5) después de preincubar el enzima durante 24 horas en tampones a diferentes pH, puso de manfiesto que Pral es más estable a pH ácido. La actividad decreció al aumentar el pH de preincubación, con una reducción del 40% a pH 7. No se detectó actividad proteolítica después de preincubación a pH 9.
EJEMPLO 4 Clonación de una secuencia de ADNc que codifica Pral La clonación del gen que codifica la proteasa Pral de T. harzianum se realizó a partir de una genoteca de ADNc representativa de la población de moléculas de ARNm que se transcriben en T. harzianum CERT 2413 cuando se cultiva en condiciones de micoparasitismo simulado (durante 9 horas en presencia de paredes celulares fúngicas como única fuente de carbono) .
4.1 Obtención de ARN total de T. harzianum
La extracción de ARN se realizó a partir de 50 mg de micelio de Trichoderma pulverizado en mortero en presencia de nitrógeno líquido. El micelio se transfirió a tubos de 10 mi a los que se les añadió 4 mi de solución de lisis "ARNol yellow" [20 mi de solución D (isotiocianato de guanidinio 4 M, citrato sódico 25 mM pH 7,0, sarcosil 0,5% (p/v), autoclavar y añadir 2-mercaptoetanol a una concentración final de 0,7% (v/v) ] , 2 mi de acetato sódico 2M y 20 mi de fenol ácido] . Las muestras se homogeneizaron por agitación en vortex y mezclando con micropipeta. Posteriormente se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos y se transfirieron a tubos Eppendorf en alícuotas de 1 mi. A cada tubo se le añadió 0,2 mi de cloroformo, agitando en vortex durante 15 segundos, e incubando a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. Seguidamente se centrifugaron a 12.000 g a 4°C durante 15 minutos. Al sobrenadante recogido se le añadió 1 volumen de alcohol isopropílico, incubándose a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la precipitación del ARN. Posteriormente el ARN se recogió por centrifugación a 12.000 g a 4°C durante 10 minutos, se lavó con 1 mi de etanol 70% agitando en vortex hasta separar el precipitado del tubo, y se centrifugó a 4.000 g a fC durante 5 minutos. Seguidamente el etanol se eliminó por inversión, y el precipitado se dejó secar al aire y se resuspendió en 40 μl de agua. El ARN obtenido se cuantificó por espectrofotometría, y su integridad se comprobó por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se conservó a -80°C. A partir de 1 mg de ARN total extraído de micelio crecido en las condiciones anteriormente mencionadas se purificaron por cromatografía de afinidad 7,8 μg de ARNm que se utilizaron para la construcción de la genoteca en el vector Uni-ZAP® XR (Stratagene) .
4.2 Construcción y manipulación de una qenoteca de ADNc de T. harzianum CECT 2413 en el vector Uni-ZAP® XR
Se empleó el sistema de clonación ZAP-cDNA® Gigapack® III Gold Cloning Kit diseñado por Stratagene (Ref . 200450) . El procedimiento experimental se realizó, en su mayor parte, siguiendo las indicaciones del protocolo que proporciona la firma comercial tanto para la construcción como para la manipulación de la genoteca.
A partir del ARNm purificado de 1 mg de ARN total se llevaron a cabo los procesos de síntesis de la primera y segunda cadena de ADNc, el relleno de los extremos del ADNc bicatenario, el ensamblaje de éste a los adaptadores JScoRI, la fosforilación de los extremos, y la digestión con la endonucleasa de restricción Xhol, utilizando los reactivos que proporciona la firma comercial Stratagene, y siguiendo detalladamente las recomendaciones del protocolo adjunto, con la excepción de que no se incorporaron nucleótidos radiactivos para el seguimiento del proceso. La posterior separación del ADNc del exceso de adaptadores se realizó mediante cromatografía de filtración en gel utilizando columnas de la casa comercial Pharmacia. A continuación, 150 ng aproxirαadamante de ADNc se ligaron a 1 μg de ADN vector (predigerido con las enzimas de restricción EcóKllXhol ) en un volumen de reacción recomendado de 5 μl, de los cuales 2 μl se utilizaron para el proceso final de encapsidación del ADN en el interior de las partículas del fago siguiendo las indicaciones de la firma comercial. La eficiencia de encapsidación resultó de 4,9.106 fagos recombinantes/μg de vector, y el título de la genoteca primaria de 4.106 unidades formadoras de placas (u.f.p.)/ml (2.106 en total), con tan solo un 0,3% de fagos no recombinantes . La genoteca primaria, resultante del proceso descrito se conservó a 4°C durante un tiempo inferior a 1 mes antes de su amplificación.
Dada la inestabilidad de las genotecas primarias, se hace necesaria su amplificación a pesar de la pérdida de representatividad de los clones menos abundantes. El proceso se realizó infectando 600 μl de células E. coli XLl-Blue con volúmenes correspondientes a 50.000 u.f .p (unidades formadoras de placa) de la genoteca primaria. La mezcla de infección se incubó a 37 °C durante 15 minutos para permitir el ataque de los fagos y posteriormente se añadió a tubos con 7 mi NZY (medio de cultivo de bacterias adecuado para el crecimiento de fagos) de cobertera precalentado a 48°C. Los tubos se agitaron en vortex y el contenido se extendió inmediatamente en placas Petri de 15 c con medio NZY sólido. Las placas se incubaron a 37°C hasta que se observaron halos de lisis confluentes. A continuación, se añadieron 10 mi de tampón SM [NaCl 100 mM, MgS0410 mM, Tris- HCl 50 mM, pH 7,5, gelatina al 0,01% (p/v)] y se incubaron de nuevo a 4°C en balanceo suave para permitir la difusión de los bacteriófagos al tampón. Transcurridas 12 horas se recogió y se mezcló el tampón de las distintas placas, lavando cada una de ellas con 2 mi de tampón adicionales. La mezcla recogida se agitó vigorosamente en presencia de cloroformo al 5% (v/v) , y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 500 g durante 10 minutos, el sobrenadante con los bacteriófagos libres de restos celulares se transfirió a un recipiente de cristal. En este momento la genoteca de ADNc quedó lista para ser utilizada. Se tituló, y se almacenó a 4°C en presencia de cloroformo al 0,3% (v/v), así como a -80°C en presencia de DMSO al 7%. La amplificación de 1 millón de u.f.p. proporcionó una genoteca amplificada 2,5.106 veces, con un título de 1,6.1010 u.f.p /mi.
4.3 Rastreo de la qenoteca A. Obtención de la sonda de pral
La búsqueda del clon de ADNc correspondiente a la proteasa Pral en la genoteca amplificada se realizó por hibridación utilizando una sonda de ADN previamente obtenida por PCR a partir de la genoteca en fagémidos pBluescript SK(-) derivada de la escisión en masa de 20.106 u.f.p. Dicha genoteca en fagémidos pBluescript SK(-) presentó un titulo de 3,3.106 fagémidos/ml (66.106 en total).
Para la obtención de dicha sonda, se realizó una PCR a partir del ADN fagémido extraído de un millón de clones bacterianos, utilizando como iniciadores los oligonucleótidos degenerados :
PPral: 5'ACTGCIGC (G/T) TTIGGIGA(A/G) TT (T/C) CC-3' (sentido) [SEC. ID. N°: 3]; y PralIA: 5' -GGGTCTAT (T/G)ATIGGICCICC-3' (antisentido) [SEC. ID. N°: 4]
diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos de los péptidos amino-terminal e interno respectivamente de la proteasa Pral. La mezcla de reacción se preparó en un volumen final de 25 μl conteniendo tampón de PCR IX, preparado a partir de tampón 10X, proporcionado con el enzima, MgCl2 1,5 mM, dNTPs 200 μM, 1,25 unidades de Taq polimerasa (Ecotag) , 4 μM de cada oligonucleótido iniciador, y aproximadamente 10 ng de ADN fagémido. Las condiciones de amplificación consistieron en un ciclo inicial de desnaturalización a 95°C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos a 95°C (desnaturalización) durante 1 minuto, 55°C (hibridación de los iniciadores) durante 1 minuto y 72°C (extensión) durante 1 minuto, finalizando con un ciclo de extensión final a 72 °C durante 5 minutos. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% y los fragmentos de interés se extrajeron del gel y se subclonaron en E. coli utilizando el plásmido pGEM®-T como vector, para su posterior secuenciación.
Como resultado de la reacción se observó repetidamente un- producto de amplificación de aproximadamente 550 pb que, una vez recuperado del gel, se subclonó en el vector pGEM®-T (Promega) . La secuenciación de este fragmento permitió comprobar que contenia las secuencias que codificaban los péptidos conocidos de Pral, de manera que se utilizó como sonda para rastrear la genoteca en el vector Uni-ZAP® XR y aislar el ADNc completo de pral .
B. Transferencia de ADN de bacteriófagos a membranas
Se prepararon placas de Petri de 15 cm con 50.000 u.f.p, aproximadamente, procedentes .de la genoteca de ADNc amplificada. Una vez obtenidos los halos de lisis, las placas se dejaron enfriar para que el agar de cobertera adquiriera mayor consistencia. Se colocó una membrana de nylon (Hybond-N, Amersham) sobre la superficie del agar, evitando las burbujas. La membrana se dejó durante 5 minutos para permitir la transferencia de los fagos, y se marcó de forma asimétrica con una aguja para poder orientarla a la hora de recuperar de la placa el clon o clones de interés. Las membranas se retiraron cuidadosamente de las placas (que se almacenaron a 4°C) y se trataron con Solución de desnaturalización Southern I durante 2 minutos, seguidamente con Solución de neutralización Southern II durante 5 minutos, y finalmente con tampón SSC 2X, preparado a partir de SSC 20X, durante 5 minutos. Estos tratamientos se realizaron depositando las membranas, con la cara que estuvo en contacto con los fagos hacia arriba, sobre papel hatman 3MM empapado con la solución correspondiente. Posteriormente, las membranas se dejaron secar al aire y el ADN transferido se fijó covalentemente a la membrana. Posteriormente, las membranas se incubaron a 65°C, con agitación constante, en solución de hibridación [SSPE 5X (SSPE 20X: NaCl 3,6 M, NaH2P04 0,2 M, EDTA 20 mM pH 7,7), Solución Denhardt 5X (Solución Denhardt 100X: BSA 2% (p/v), Ficoll™ 2% (p/v), PVP 2% (p/v)), SDS 0,5% (p/v)] durante 2 horas. Seguidamente, se añadió la sonda de ADN marcada radiactivamente, y se continuó la incubación durante 12-18 horas. Transcurrido este tiempo, se retiró la sonda, y la membrana se lavó con solución de lavado [SSPE 2X, SDS 1% (p/v) ] a temperatura ambiente durante 15 minutos, y después dos veces más a 65°C. Finalmente, las membranas se envolvieron con una película de plástico transparente para evitar que se secaran, y se expusieron con pantallas amplificadoras para la detección de los clones positivos.
De un total de 2.105 clones escrutados se identificaron 3 bacteriófagos que mostraban señal de hibridación positiva, y que fueron aislados en dos rondas de hibridación sucesivas. Una vez recuperados como fagémidos pBluescript SK(-), se liberaron los insertos de cada uno por- digestión con las enzimas EcoRI/Xhol . Los tres clones presentaron un tamaño de inserto próximo a 1 kb. A partir de la secuencia obtenida de uno de estos clones (pSKPral) se obtuvo la secuencia deducida de aminoácidos. Esta secuencia de aminoácidos contenía los péptidos (aminoterminal e interno) secuenciados de la proteasa Pral purificada, confirmando que el ADNc clonado era el que codificaba a esta proteína.
4.4 Análisis de la secuencia
El ADNc clonado presentó un tamaño de 954 pb, incluyendo la cola de poliA del extremo 3' , con una pauta de lectura abierta de 777 pb que codifica una proteína de 258 aminoácidos y peso molecular teórico de 25.784 Da. Esta secuencia de aminoácidos deducida contiene los péptidos (amino-terminal e interno) secuenciados de la proteasa Pral purificada, confirmando que el ADNc clonado es el que codifica a esta proteína.
La secuencia conocida del péptido amino-terminal de Pral indica que la proteina madura comienza en el residuo I1, de lo que se deduce que Pral es sintetizada como un precursor con una extensión en el extremo amino-terminal de 29 aminoácidos. El peso molecular calculado a partir de la secuencia de la proteína madura (Iα-G228) es de 25.023 Da, ligeramente inferior al determinado mediante SDS-PAGE a partir de la proteina Pral purificada (esta divergencia entre el peso teórico y el peso determinado parece ser debida a posibles modificaciones post- traduccionales, tales como glicosidaciones) .
Por otro lado, el punto isoeléctrico estimado a partir de la secuencia de la proteína madura es de 4,91, coincidente con el observado mediante isoelectroenfoque preparativo (4,7-4,9).
Al analizar la secuencia de la región amino-terminal mediante el programa SignalP VI .1 se reconoció un punto de corte entre los aminoácidos G"10-A"9, sugiriendo la existencia de un péptido señal constituido por los primeros 20 aminoácidos, característico de proteínas secretadas. Los 9 aminoácidos existentes entre el péptido señal y la proteína madura corresponderían al pro-péptido característico de muchas proteasas, que en el caso de las serin-peptidasas de la familia Si varía de 6-9 aminoácidos, y que, una vez procesados, dan lugar a un nuevo extremo amino-terminal que generalmente comienza con un residuo hidrofóbico como valina, metionina, leucina, o isoleucina, lo que está en concordancia con el residuo isoleucina1 que presenta Pral.
La comparación de la secuencia completa de aminoácidos de Pral con las contenidas en los bancos de datos (EMLB y Swiss Prot) mostró la alta similitud de esta proteina con miembros de la familia SI de la serin-peptidasas como tripsinas y proteínas tipo tripsina de rata, cerdo, etc. La máxima homología (75-80%) con identidades iguales o inferiores al 50% la presentó con proteínas tipo tripsina de hongos filamentosos [Metharrizi um, Fusari um) . Las secuencias de proteasas fúngicas con las que se comparó fueron las siguientes:
Hongo N° de identificación EMBL/Swiss Prot
Chliobol us carbonum Q00344
Fusari um oxysporum P35049 Metharrizium anisocliae Q9Y7A9
Metharrizium anisocliae Q9Y842
Phaeosphaeria nodurum 074696
El alineamiento con estas secuencias permitió reconocer la triada catalítica (H-D-S) característica de la familia SI así como de las distintas familias que forman parte del clan PA, y que se asignó putativamente a los residuos H70 D118 y S213 de la secuencia deducida de Pral.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una enzima con actividad proteolitica caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: a) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° :
Figure imgf000038_0001
b) una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° : 1.
2. Enzima según la reivindicación 1, caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° : 1.
3. Enzima según la reivindicación 2, caracterizada porque tiene un peso molecular aparente determinado en condiciones desnaturalizantes de 28,5 kDa aproximadamente.
4. Enzima según la reivindicación 2, caracterizada porque tiene un punto isoeléctrico aparente comprendido entre 4,7 y 4,9.
5. Enzima según la reivindicación 2, caracterizada porque tiene una temperatura óptima comprendida entre 35°C y 40°C.
6. Enzima según la reivindicación 2, caracterizada porque es una serin-peptidasa.
7. Enzima según la reivindicación 2, caracterizada porque es una endopeptidasa de tipo tripsina.
8. Una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un fragmento de la misma.
9. Construcción de ADN según la reivindicación 8, caracterizada porque tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de ADN que comprende la SEC. ID. N° : 2; o b) una secuencia de ADN análoga a la secuencia definida en a) que (i) es sustancialmente homologa a la secuencia de ADN definida en a) ; y/o (ii) codifica un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de ADN definida en a) .
10. Un vector recombinante caracterizado porque contiene una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.
11. Una célula caracterizada porque contiene una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, o un vector según la reivindicación 10.
12. Una célula transgénica de una planta que comprende una construcción de ADN que tiene un promotor, funcional en dicha planta, operativamente enlazado a una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.
13. Una planta transgénica que comprende, al menos, una célula transgénica según la reivindicación 12.
14. Planta transgénica según la reivindicación 13, que expresa una enzima con actividad proteolítica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para mejorar la resistencia a patógenos mediante la inactivación irreversible de enzimas y proteínas responsables del ataque a la planta.
15. Un método para la producción de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende cultivar una célula según la reivindicación 11 bajo condiciones que permiten la producción de la enzima y recuperar la enzima del medio de cultivo.
16. Una preparación enzimática que comprende, al menos, una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
17. Preparación enzimática según la reivindicación 16, que comprende entre 0,01% y 100% en peso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
18. Preparación enzimática según la reivindicación 16, que contiene como único componente una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
19. Preparación enzimática según la reivindicación 16, que contiene más de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
20. Preparación enzimática según la reivindicación 16, que comprende, además, al menos una enzima seleccionada del grupo formado por celulasas, glucanasas, mananasas, quitinasas, proteasas y/o quitosanasas .
21. Una composición antifúngica que comprende, al menos, una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 junto con, al menos, un fungicida químico.
22. Composición según la reivindicación 21, en la que dicho fungicida químico se selecciona del grupo formado por un fungicida químico que afecta a la membrana, un fungicida químico que afecta a la síntesis de la pared celular y sus mezclas .
23. Composición según la reivindicación 21, que comprende, además, al menos, una proteina con actividad enzimática degradadora de la pared celular microbiana.
24. Empleo de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, o de una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, para degradar o modificar materiales que contienen enlaces peptidicos.
25. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicho material que contiene enlaces peptídicos comprende estructuras que comprenden proteínas o péptidos.
26. Empleo según la reivindicación 25, en el que dichas estructuras que comprenden proteínas o péptidos se seleccionan entre paredes celulares fúngicas y cutículas de insectos o arácnidos .
27. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza para la preparación de protoplastos.
28. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza para la preparación de extractos de levaduras.
29. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza en la extracción de manoproteínas .
30. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza en la producción de vinos, mostos y zumos.
31. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza en la elaboración de composiciones para retirar la placa dental.
32. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza en la elaboración de composiciones para la limpieza de dientes y dentaduras.
33. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza en la elaboración de composiciones para retirar películas biológicas (biofilms) depositadas en superficies.
34. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza en la elaboración de composiciones para la limpieza de lentes de contacto.
35. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza en la eliminación de hongos sobre recubrimientos.
36. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se utiliza para tratar y/o limpiar tejidos.
37. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica, se utiliza en el control de organismos patógenos de plantas, animales, incluido el hombre y contaminantes de cosechas o alimentos.
38. Empleo según la reivindicación 37, en el que el control de organismos patógenos de plantas, animales, incluido el hombre y contaminantes de cosechas o alimentos por dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica, se efectúa mediante inactivación proteolítica irreversible de enzimas y/o proteínas estructurales utilizadas por los patógenos en su ataque a las plantas y animales.
39. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica, se utiliza para desinfestar, prevenir y/o tratar la infección causada por hongos patógenos de animales en instalaciones ganaderas .
40. Empleo según la reivindicación 24, en el que dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica, se utiliza para controlar la contaminación fúngica en una muestra de ensayo para análisis.
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