WO2002042476A1 - Sistema de expresion de proteinas en la rizosfera de plantas y procedimiento para su construccion - Google Patents

Sistema de expresion de proteinas en la rizosfera de plantas y procedimiento para su construccion Download PDF

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WO2002042476A1
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protein
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Juan Luis Ramos Martin
Manuel Espinosa Urgel
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Newbiotechnic, S.A.
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Definitions

  • the invention relates, in general, to the expression of proteins in the rhizosphere of plants, in particular, to effective systems of protein expression in the rhizosphere of plants comprising a nucleic acid sequence with functionality in response to root and seed exudates.
  • control of plant diseases has been carried out through the use of chemical compounds.
  • the unreasonable use of this system has favored in recent years the development of pathogenic strains resistant to fungicides and bactericides. Due to these resistances, chemical compounds must be used at increasingly high doses.
  • Biological control of pathogens with antagonistic microorganisms offers an attractive alternative to chemical pesticides for the control of plant diseases.
  • microorganisms are able to colonize, multiply and reach a high population density at the root of the plant and the surrounding soil regions (rhizosphere), thus providing more lasting protection. This is due to the release by the plant of root exudates, which contain abundant nutrients capable of promoting bacterial growth.
  • bacterial strains including strains of the Pseudomonas putida species, have great metabolic versatility, which includes the ability to tolerate and degrade organic toxins often present as pollutants in the environment.
  • the possibility of combining both characteristics, rhizosphere colonization and biodegradation, has given rise to the concept of rhizorremediation, that is, taking advantage of the settlement of stable bacterial populations thanks to the nutrients released by the roots, for processes of biological decontamination of soils.
  • the invention faces the problem of providing a system capable of effectively expressing proteins in the plant rhizosphere.
  • the solution provided by this invention is based on the fact that the inventors have identified a DNA sequence whose expression responds to Usina, ⁇ -aminovaleric acid and / or plant root exudates. Said DNA sequence can be used to build effective protein expression systems in plant rhizosphere.
  • a protein expression system in the rhizosphere of plants such as that provided by this invention allows the expression of proteins of interest, such as proteins of interest in agriculture, biological control of pests, or biodegradation processes of contaminants, in the rhizosphere in response to root and seed exudates.
  • An object of this invention is a DNA molecule whose expression responds to plant exudates.
  • a further object of this invention is a DNA construct comprising said DNA molecule and, at least, a DNA sequence encoding a protein.
  • Another additional object of this invention is a vector comprising said molecule or DNA construct.
  • Another additional object of this invention is a rhizosphere protein expression system comprising said molecule or construction of DNA or said vector.
  • Another additional object of this invention is a process for the construction of said protein expression system in the plant rhizosphere.
  • Another additional object of this invention is a seed of a plant totally or partially coated with said protein expression system in the plant rhizosphere.
  • Another additional object of this invention is a method for biologically controlling a pest that affects a plant, which comprises applying a crop comprising said protein expression system in the plant rhizosphere that expresses a useful protein on the rhizosphere of said plant. for the biological control of said pest.
  • Another additional object of this invention is a method for decontaminating a contaminated soil by means of rhoremediation which comprises applying on said contaminated soil a culture of a protein expression system in the rhizosphere of plants that expresses a protein useful for the biodegradation of the contaminant or contaminants. present in said contaminated soil.
  • Other objects of this invention will be avoidant for a person skilled in the art in view of the description of this invention.
  • FIG. 1 Expression of davT :: luxCDABE in the absence (-) or in the presence of the amino acids glycine (gly), valine (val), proline (pro), Usine (lys), and arginine (arg).
  • Figure 3 Photography (left panel) and autoradiography (right panel) showing the expression of davTr. luxCDABE in Pseudomonas putida in the presence of corn seeds.
  • Figure 4. Expression of davTr.luxCDABE in the rhizosphere of a corn plant 15 days after sowing. The autoradiographic film image has overlapped with the root photograph to show that bioluminescence occurs specifically in the regions adjacent to the root as a result of the davT promoter's response to the release of exudates by it.
  • Figure 5 A is a graph showing the evolution of ⁇ -galactosidase activity (in Miller units) of cultures of P.
  • FIG. 5B is a graph showing the evolution of ⁇ -galactosidase activity (in Miller units) of cultures of P. putida KT2440 carrying the pMPl plasmid, in minimal medium in the presence or absence of 1 mM ⁇ -aminovaleric inducer. The arrow indicates the moment at which the inductor was added to the culture medium.
  • the invention provides an isolated DNA molecule, hereinafter DNA molecule of the invention, selected from: a) a DNA molecule comprising the nucleotide sequence identified as SEC. ID. N °: 1; b) a DNA molecule comprising the nucleotide sequence identified as SEC. ID. N °: 2; and c) a DNA molecule analogous to the molecule defined in a) or in b) that i) is substantially homologous to the DNA molecule defined in a) or in b); and / or ii) encodes a polypeptide that is substantially homologous to the protein encoded by the DNA molecule defined in a) or in b).
  • the DNA molecule of the invention allows the expression of the nucleic acid to which it is operably linked or fused in response to Usina, ⁇ -aminovaleric acid and / or in response to plant and seed root exudates.
  • analogous is intended to include any DNA molecule that has the same function, as the DNA molecules defined in a) or b), that is, that allows the expression of the acid nucleic to which it is operatively linked or fused in response to Usina, ⁇ -aminovaleric acid and / or in response to plant root and seed exudates.
  • Said analogous DNA molecule may contain conservative or non-conservative nucleotide substitutions, or it may contain one or more additional nucleotides at any end of the sequence, or it may lack one or more nucleotides at either end or inside sequence.
  • the analogous DNA molecule is substantially homologous to the nucleotide sequence identified as SEC. ID.
  • nucleotide sequences in question have a homology or degree of identity of at least 60%, preferably of at least 80%, or more preferably of at least 95%.
  • the DNA molecule of the invention may come from any organism that contains it natively, for example, P. putida KT2440, or from a host organism transformed with said DNA molecule.
  • the DNA molecule of the invention can be isolated, by conventional techniques, from the DNA of any other organism that contains it by using probes or oligonucleotides prepared from the information on its DNA sequence provided therein. description.
  • the DNA molecule of the invention comprises, or is constituted by, the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. N °: 1.
  • a sequence as identified in the SEC. ID. N °: 1 comprises all of the davD and davT genes of P.
  • the E. putida davT gene encodes the ⁇ -aminovalerate aminotransferase protein.
  • the davD gene of E. putida probably encodes the protein glutarate semialdehyde dehydrogenase.
  • the davD gene encompasses nucleotides 628-2067 of the S ⁇ C. ID. N °: 1.
  • the davT gene encompasses nucleotides 2253-3527 of the S ⁇ C. ID. N ° 1.
  • the intergenic region between davD and davT comprises nucleotides 2070 to 2252 of the S ⁇ C. ID. N °: 1.
  • the upstream sequence of davD, between nucleotides 1-627 of the S ⁇ C. ID. N °: 1 includes the promoter / operator and sequences involved in the regulation of the expression of davD and davT.
  • the DNA molecule of the invention comprises the nucleotide sequence shown in the S ⁇ C. ID. N °: 2.
  • the S ⁇ C. ID. N °: 2 identifies a region of 486 base pairs (bp) within the S ⁇ C. ID. N °: 1, from nucleotide 139 to 625, sufficient for induction of the expression of the nucleic acid to which it is operatively linked or fused in response to Usina and / or ⁇ -aminovaleric acid and in response to root exudates and plant seeds The region identified by the S ⁇ C. ID.
  • N °: 2 corresponds to the promoter zone of the davD gene, the gene that is immediately upstream of the davT gene and with which it appears to constitute an operon, since the intergenic region does not have relevance promoting activity in the presence or absence of lysine .
  • a transcriptional fusion of this region (called with the lacZ reporter gene, which encodes the enzyme ⁇ -galactosidase.
  • ⁇ n bacterial cells carrying this fusion in a plasmid, ⁇ -galactosidase activity is detected in response to the presence of Usine or ⁇ -aminovaleric in the culture medium (see Example 6), which demonstrates the usefulness of said sequence for the construction of systems of protein expression.
  • the DNA molecule of the invention can be obtained using conventional methods, for example, by isolation and identification techniques of nucleic acids from any organism that contains it or from a host organism transformed with said DNA molecule.
  • the DNA molecule of the invention can be isolated, by conventional techniques, from the DNA of any other organism by using probes or ohgonucleotides prepared from the information on its DNA sequence provided in this description.
  • a P. putida strain called rei-2 strain
  • rei-2 strain has been obtained by random mutagenesis with a transposon, in which a gene inducible by corn root exudates has been identified; said rei-2 mutant strain has been characterized and the gene interrupted in said rei-2 mutant strain has been identified by complementation and sequencing (see Example 1). Additional tests have allowed us to identify a sequence (SEQ. ID. N °: 2) whose expression responds to Usina, ⁇ -aminovaleric acid and / or exudates from roots and seeds of seeds.
  • DNA constriction of the invention which comprises the ioadness of the DNA molecule of the invention or a functional fragmentation thereof and a DNA sequence encoding a protein proiein of of interest, said DNA sequence encoding an operatively infected protein linked to said DNA molecule of the invention.
  • protein of interest any protein of interest in agriculture is included, including, but not limited to, any protein that promotes plant growth and / or increases the productive yield of the seedlings, as well as any prolein involved in the biological pyrol conirol and / or in processes of biodegradation of conlaminan ⁇ es.
  • ⁇ laga refers to any organism, procarious or eukaryotic, that causes diseases or damage to the platteries or that affects their growth and / or their productive performance.
  • proteins with activity against pests are constituted by the synine proieins of the antibiotic 2,4-diacellylchloroglucinol from Pseudomonas fluorescens or the delia-endoloxins insecticides produced by Bacillus thuringiensis.
  • the term “operably linked” refers to the orientation of the promoter present in the DNA molecule of the invention with respect to the DNA sequence encoding the protein of interest. Said promoter is positioned in such a way that it is capable of controlling or regulating the expression of said DNA sequence, that is, the expression of said DNA sequence encoding the protein of interest is directed by the DNA molecule of the invention.
  • the DNA molecule of the invention or the DNA construct of the invention can be inserted into a broad-spectrum host vector, for example, a plasmid or a transposon.
  • the invention also relates to a vector comprising said DNA construct of the invention.
  • the choice of the neighbor will depend on the host cell in which it will be introduced later.
  • the neighbor where said DNA molecule or cons ⁇ ruction of the invention is inroduced can be a neighbor that, when introduced into a host cell, integrates into the genome of said cell and replicates along with the chromosome (or chromosomes) in which (or in which) it has been integrated, or a vector not integrated into the genome of said cell, whose replication can be autonomous or dependent on the host.
  • the inroduction of said vector in the host cell is carried out by conventional methods.
  • the DNA molecule of the invention or the DNA construct of the invention can be inserted into the bacterial chromosome by recombination.
  • the invention also relates to a plating rhizosphere protein expression system comprising said DNA molecule or construct of the invention or said vector comprising said DNA molecule or construct of the invention, together with all or part of the elements necessary for DNA transcription and for protein translation.
  • said prolein expression system in plant rhizosphere is an organism, eukaryotic or prokaryotic, capable of colonizing the rhizosphere of plants and / or the root system of plants, and / or capable of adhering to seeds, which contains the DNA construct of the invention, ungrateful or not, on the chromosome of said organism.
  • said plant rhizosphere protein expression system is P. putida KT2440 containing a DNA construct of the invention, integrated or not, in the chromosome of said bacterium.
  • the obmen of said system of expression of proteins in rhizosphere of plants is realized by conventional methods, for example, by means of transfer of the vectors suitable, for example, plasmids, transposons, ele, or by recombination with the chromosome.
  • the invention provides a seed of a plant totally or partially coated with said protein expression system in the plant rhizosphere provided by this invention.
  • Said seed allows the expression of the protein of interest encoded by the DNA sequence present in said expression system, for example, an inert protein in agriculture or involved in the biological control of pests that affect the plant in question.
  • the seed provided by this invention can be easily obtained by conventional methods comprising applying a suspension of a culture comprising said protein expression system in the plant rhizosphere provided by this invention, by any conventional method, on the seeds to be coated under conditions. which allow the adhesion of said expression system on the seeds.
  • the seeds provided by this invention can be obtained by immersing the seeds to be coated in a suspension of a crop comprising said protein expression system in the plant rhizosphere provided by this invention under conditions that allow adhesion of said systemic of expression on the seeds to be coated.
  • the seeds provided by this invention are corn seeds coated by P. putida KT2440, or by a microorganism producing insecticidal delta-endoloxins under the control of the expression system of this invention.
  • the invention also relates to a method for promoting the growth of a platter and / or increasing the productive yield of a plant, which comprises applying a crop comprising a protein expression system in the rhizosphere of slabs on the rhizosphere of said plant.
  • this invention which expresses a protein useful for promoting the growth of a plant and / or for increasing the productive yield of a plant.
  • said protein useful for promoting the growth of a plant and / or for increasing the productive yield of a plant is a protein involved in the synthesis of indoleacetic acid [Beyeler et al, FEMS Microbio !. Ecol. 28: 225-233, 1999].
  • the application of said expression system on the rhizosphere of the plant can be carried out by any conventional method.
  • the application can be performed by inoculating a bacterial suspension in the soil before, during or after planting of the plants or seeds.
  • the invention also relates to a method for biologically controlling a pest that affects a plant, which comprises applying a crop comprising a protein expression system in the rhizosphere of plains provided by this invention, which expresses on the rhizosphere of said plant, which expresses a useful protein for the biological control of said pest.
  • the application of said expression system on the rhizosphere of the plant can be carried out by any conventional method. In a particular embodiment, the application can be done by inoculating a bacterial suspension in the soil before, during or after planting of the plants or seeds.
  • the invention also relates to a method for decontaminating a coniaminated soil by means of rhoremediation which comprises applying on said coniaminated soil a culture of a prolein expression system in the rhizosphere of slabs that expresses a protein useful for biodegradation of the coniamine or coniaminants present in said floor conminated.
  • the expression system is used for the biodegradation of oluene or related slurry molecules.
  • the invention also provides a prolein, in addition to the proiein of the invention, which has an amino acid sequence selected from: a) an amino acid sequence comprising the amino acid sequence shown in the SEC. ID.
  • N °: 3 b) an amino acid sequence comprising the amino acid sequence deduced from the nucleicide sequence shown in the SEC. ID. N °: 2, and c) a substantially homologous and functional amino acid sequence equivalent to the amino acid sequences defined in a) or in b).
  • substantially homologous means that the amino acid sequences in question have a degree of identity, at the amino acid level, of at least 70%, preferably of at least 85 %, and, more preferably, at least 95%.
  • the term “functionally equivalent” means that the protein in question has an identical or similar functionality to that of the proieins whose amino acid sequences are defined in sections a) or in b) above.
  • the proiein of the invention has an amino acid sequence that comprises, or is constituted by, the amino acid sequence shown in the SEC. ID. N °: 3.
  • SEC. ID. N °: 3 corresponds to the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the SEC. ID. N °: 1 and includes the produelo of expression of the davT gene of P. putida which, as previously mentioned, is a ⁇ -aminovalerate aminotransferase.
  • the protein of the invention is a prolein that comprises, or is constituted by, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. N °: 2.
  • the protein of the invention can be obtained by means of a method comprising culturing a suitable host cell containing the DNA molecule of the invention, or a DNA construct of the invention, under conditions that allow prolein production and recover it from the middle of cul ⁇ ivo.
  • the protein of the invention can be obtained from a producer organism thereof by measuring a process comprising the culture of the producer organism, for example, P. putida, under appropriate conditions for the expression of said enzyme, and subsequently recover said enzyme.
  • Example 1 describes the isolation and characterization of a mutant in a gene inducible by corn root exudates and identification of the interrupted gene.
  • Examples 2 to 5 describe the expression of the transcriptional fusion davTr.luxCDABE in response to Usina, ⁇ -aminovaleraio, root exudates, in the presence of corn seeds and in the rhizosphere of pla ⁇ as.
  • Example 6 describes the expression of the transcriptional fusion P dav :: lacZ in the presence of Usina and in the presence or absence of ⁇ -aminovaleric acid.
  • the rei-2 strain has the same morphological characteristics and growth rate in rich medium LB (10% w / v tryptone, 5% w / v yeast extract, %aCl 5% w / v ) and M9 medium supplemented with 15 mM benzoaio or 20 mM glucose than parenchymal spirits.
  • LB rich medium
  • M9 medium supplemented with 15 mM benzoaio or 20 mM glucose than parenchymal spirits.
  • rei-2 was unable to grow in minimal M9 when the amino acid Usina was added as the sole source of carbon. This, together with the fact that the Usina acts as an inducer of the transcriptional fusion present in this mutant area, indicated that the mutation had affected a gene involved in Usina's metabolism. This hyposis was confirmed with the data given below.
  • the mixture of icarconjugan ⁇ es oblenida was plated in plates of minimum medium with Usina as the only carbon source, so that only those transconjugan ⁇ es carrying a cosmid that contained a silves ⁇ re copy of the muted gene in rei-2 would be able to grow and give rise to colonies From one of said intraconjugates, cosmid DNA was obtained, which was digested with the Pstl resynthesis endonuclease. The resulting fragmenia mixture was subcloned into the plasmid pGBl, described by Bloemberg et al. (Appl Environ. Microbe!
  • this mixture of plasmids being used to transform rei-2.
  • a new selection process was carried out by complementation in a minimal medium with Usina, identifying a clone capable of growing in this medium thanks to the presence of a plasmid containing a silvester copy of the muted gene in rei-2.
  • This plasmid was called pLYS24 and consisted of a 2.1 kb DNA fragmenio, from which its sequence was partially defined. The nucleotide sequence obtained was compared with the genome databank of P.
  • KT2440 of the Institute for Genomic Research, which allowed to unequivocally identify a genome sequence of KT2440 (SEQ ID NO: 1) that included the gene cloned in pLYS24, which has been called davT by the inventors.
  • SEQ ID NO: 1 a genome sequence of KT2440 (SEQ ID NO: 1) that included the gene cloned in pLYS24, which has been called davT by the inventors.
  • the insertion of the transposon into this gene in the rei-2 strain was confirmed by means of a "Sou ⁇ hern blo ⁇ " analysis and by sequencing from the transposon (Sambrook et al.: Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd edition. Cold Spring Harbor Labor atory, Cold Spring Harbor, NT, 1989).
  • davD Upstream of davT an open reading frame was identified, which has been called davD by the inventors.
  • the comparison of the sequence of davD with the banks of dalos made it possible to establish as a possible function of the protein encoded by davD the glutarate-semialdehyde dehydrogenase activity.
  • the functionality of the DNA molecule identified by the inventors for the consiruction of proiein expression systems, in particular, in rhizosphere of plains, is reflected in the following Examples.
  • DavT luxCDABE transcriptional fusion expression in response to lysine
  • the strain rei-2, carrier on its chromosome of the davTr.luxCDABE fusion was cultured in M9 liquid medium with benzoate, without supplementation and supplemented with different amino acids: glycine, valine, proline, lysine and arginine.
  • the expression of the fusion is analyzed by recording the emission of bioluminescence by exposure lasting 2 minutes of an autoradiographic film on which the icons conniving the different cultures are located. In this way, higher or lower levels of expression are reflected by a greater or lesser inertity of film printing. As seen in Figure 1, the inlensity is much higher in cultures in the presence of Usina than in the presence of amino acid reslanles, or in the absence of a supplement.
  • Rei-2 cultures are used to inoculate corn seeds, as follows. Culivores grown overnight in liquid medium LB are centrifuged and washed twice in a row with M9. A 1: 1000 dilution of the bacterial culture thus prepared is introduced into a container containing M9, in which the seeds are subsequently inoculated. After 1 hour of incubation at lemperaiura ambienie, the seeds are collected and sown at 1 cm deep in maceias conlen vermiculi ⁇ a. These are kept in a greenhouse with natural light / dark cycles and the appropriate irrigation regime. At different times, the plains are excised, shaking the roots to eliminate vermiculi, and placed on absorbent paper moistened with double-distilled water.
  • the conjunction is wrapped in a transparent plastic film and an autoradiographic film is placed on it, which reveals 16 hours of exposure.
  • the printing inlensity ( Figure 4) reflects the expression of the davTrlux fusion in baths that are in the rhizosphere, ianium attached to the root as to vermiculiia particles in direct contact with it.
  • the plasmid pMPl was constructed.
  • the fragmenio indicated in the SEC was amplified by PCR. ID. N °: 2, which has been referred to as P ⁇ , modified for the inroduction of 2 res ⁇ riction sites at both ends to allow its cloning in the plasmid ⁇ MP220 (Spaink et al. PlantMol. Biol. 9: 27-39, 1987 ).
  • Said plasmid carries the lacZ reporter gene without its promoter and preceded by multiple restriction targets that allow the cloning of DNA fragments and the analysis of their promoter activity.
  • the oligonucleotides were designed:
  • ⁇ -galaciosidase activity was measured according to the Miller period (Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y., 1972). As can be seen in Figure 5A, practically no ⁇ -galaciosidase activity is reported in the strains carrying pMP220 although said enzymatic activity was detected in response to the presence of lysine in the strains carrying pMPl.
  • Figure 5B shows the evolution of ⁇ -galaciosidase activity (in Miller units) of P. putida KT2440 culinary carriers of the pMPl plasmid, in minimal medium in the presence or absence of ⁇ -aminovaleric as inducer.
  • the arrow indicates the moment at which the inducer was added to the culture medium. Similar results were obtained using 1 mM lysine as an inducer (damage not shown).

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Abstract

El sistema de expresión contiene una construcción de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico con funcionalidad en respuesta a exudados de raíces y semillas y una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés, estando dicha secuencia de ADN que codifica una proteína de interés operativamente enlazada a dicha molécula de ADN. El sistema de expresión permite expresar la proteína de interés en la rizosfera de las plantas. De aplicación en Agricultura, en biocontrol de plagas y en rizorremediación de suelos contaminados.

Description

SISTEMA DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN LA RIZOSFERA DE PLANTAS Y PROCEDIMIENTO PARA SU CONSTRUCCIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en general, con la expresión de proteínas en la rizosfera de plantas, en particular, con sistemas eficaces de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas que comprenden una secuencia de ácido nucleico con funcionalidad en respuesta a exudados de raíces y semillas.
ANTECEDENTES DE LAINVENCIÓN
Las enfermedades de plantas juegan un papel muy importante en la disminución de los recursos agrícolas naturales. La pérdida en las cosechas a consecuencia de las enfermedades alcanza un 25% del rendimiento en los países desarrollados (Europa y Norte América) y casi un 50% en los países en vías de desarrollo. Durante muchos años, el control de las enfermedades de plantas se ha realizado mediante el empleo de compuestos químicos. El uso poco racional de este sistema ha favorecido en los últimos años el desarrollo de estirpes patógenas resistentes a fungicidas y bactericidas. Debido a estas resistencias, los compuestos químicos deben ser utilizados a dosis cada vez más elevadas. El control biológico de patógenos con microorganismos antagonistas ofrece una alternativa atractiva a los pesticidas químicos para el control de enfermedades de plantas. La principal ventaja del control biológico frente a los pesticidas químicos, además de evitar esparcir xenobióticos que en muchos casos son recalcitrantes y tóxicos, es que los microorganismos son capaces de colonizar, multiplicarse y alcanzar una alta densidad de población en la raíz de la planta y las regiones de suelo circundantes (rizosfera), proporcionando así una protección más duradera. Esto es debido a la liberación por parte de la planta de exudados radiculares, los cuales contienen abundantes nutrientes capaces de promover el crecimiento bacteriano.
Además, algunas estirpes bacterianas, entre ellas cepas de la especie Pseudomonas putida, presentan una gran versatilidad metabólica, que incluye la capacidad de tolerar y degradar tóxicos orgánicos a menudo presentes como contaminantes en el medio ambiente. La posibilidad de combinar ambas características, colonización de la rizosfera y biodegradación, ha dado lugar al concepto de rizorremediación, es decir aprovechar el asentamiento de poblaciones bacterianas estables gracias a los nutrientes liberados por las raíces, para procesos de descontaminación biológica de suelos.
El uso de microorganismos para las aplicaciones arriba citadas, presenta actualmente una importante limitación. Para que este uso sea eficaz, es imprescindible garantizar la expresión de las funciones deseadas en condiciones medioambientales. Construcciones y sistemas que son funcionales en el ambiente controlado y estable del laboratorio, distan de ser eficientes en condiciones naturales. Dicha problemática ha sido revisada entre otros por De Lorenzo (Trends Biotechnol. 12: 365-371, 1994). Por tanto, el desarrollo de sistemas bacterianos de expresión génica de probada funcionalidad en la rizosfera, resulta esencial para una óptima utilización de cepas bacterianas en procesos de control biológico o descontaminación de suelos por rizorremediación.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta con el problema de proporcionar un sistema capaz de expresar eficazmente proteínas en la rizosfera de plantas.
La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han identificado una secuencia de ADN cuya expresión responde a Usina, ácido δ-aminovalérico y/o a exudados radiculares de plantas. Dicha secuencia de ADN puede utilizarse para construir sistemas eficaces de expresión de proteínas en rizosfera de plantas. Un sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas como el proporcionado por esta invención permite la expresión de proteínas de interés, tales como proteínas de interés en agricultura, control biológico de plagas, o procesos de biodegradación de contaminantes, en rizosfera en respuesta a exudados de raíz y semillas.
Un objeto de esta invención lo constituye una molécula de ADN cuya expresión responde a exudados radiculares de plantas.
Un objeto adicional de esta invención lo constituye una construcción de ADN que comprende dicha molécula de ADN y, al menos, una secuencia de ADN que codifica ψe una proteína.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un vector que comprende dicha molécula o construcción de ADN.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un sistema de expresión de proteínas en rizosfera que comprende dicha molécula o construcción de ADN o dicho vector. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un procedimiento para la construcción de dicho sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye una semilla de una planta recubierta total o parcialmente con dicho sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para controlar biológicamente una plaga que afecta a una planta, que comprende aplicar sobre la rizosfera de dicha planta un cultivo que comprende dicho sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas que expresa una proteína útil para el control biológico de dicha plaga. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para descontaminar un suelo contaminado mediante rizorremediación que comprende aplicar sobre dicho suelo contaminado un cultivo de un sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas que expresa una proteína útil para la biodegradación del contaminante o contaminantes presentes en dicho suelo contaminado. Otros objetos de esta invención resultarán evidantes para un experto en la materia a la vista de la descripción de esta invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Expresión de davT::luxCDABE en ausencia (-) o en presencia de los aminoácidos glicina (gly), valina (val), prolina (pro), Usina (lys), y arginina (arg).
Figura 2. Expresión de davTr.luxCDABE en presencia (izquierda) o ausencia (derecha) de exudados.
Figura 3. Fotografía (panel izquierdo) y autorradiografia (panel derecho) mostrando la expresión de davTr. luxCDABE en Pseudomonas putida en presencia de semillas de maíz. Figura 4. Expresión de davTr.luxCDABE en la rizosfera de una planta de maíz 15 días después de la siembra. La imagen de la película autorradiográfica se ha solapado con la fotografía de la raíz para mostrar que la bioluminiscencia se produce específicamente en las regiones adyacentes a la raíz como consecuencia de la respuesta del promotor de davT a la liberación de exudados por parte de la misma. Figura 5. La Figura 5 A es una gráfica que muestra la evolución de la actividad β- galactosidasa (en unidades Miller) de cultivos de P. putida KT2440 portadoras del plásmido p Pl (que contiene la fusión V_jav::lacZ), en medio mínimo en presencia de Usina; como control negativo, se utilizó un cultivo portador del plásmido pMP220, que contiene el gen lacZ sin promotor. La Figura 5B es una gráfica que muestra la evolución de la actividad β- galactosidasa (en unidades Miller) de cultivos de P. putida KT2440 portadoras del plásmido pMPl, en medio mínimo en presencia o ausencia de δ-aminovalérico 1 mM como inductor. La flecha indica el momento en el que se añadió el inductor al medio de cultivo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una molécula de ADN aislada, en adelante molécula de ADN de la invención, seleccionada entre: a) una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEC. ID. N°: 1; b) una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEC. ID. N°: 2; y c) una molécula de ADN análoga a la molécula definida en a) o en b) que i) es sustancialmente homologa a la molécula de ADN definida en a) o en b); y/o ii) codifica un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la molécula de ADN definida en a) o en b). La molécula de ADN de la invención permite la expresión del ácido nucleico al que está operativamente enlazada o fusionada en respuesta a Usina, ácido δ-aminovalérico y/o en respuesta a exudados de raíces y semillas de plantas.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análogo/a" pretende incluir a cualquier molécula de ADN que presente la misma funcionaUdad que las moléculas de ADN definidas en a) o en b), es decir, que permita la expresión del ácido nucleico al que está operativamente enlazada o fusionada en respuesta a Usina, ácido δ-aminovalérico y/o en respuesta a exudados de raíces y semillas de plantas. Dicha molécula de ADN análoga puede contener sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, o bien puede contener uno o más nucleótidos adicionales en cualquiera de los extremos de la secuencia, o bien puede carecer de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. En general, la molécula de ADN análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos identificada como SEC. ID. N°: 1 o SEC. ID. N°: 2. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa", apUcada a secuencias de nucleótidos, significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen una homología o grado de identidad de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 80%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La molécula de ADN de la invención puede proceder de cualquier organismo que la contenga de forma nativa, por ejemplo, P. putida KT2440, o bien de un organismo hospedador transformado con dicha molécula de ADN. Alternativamente, la molécula de ADN de la invención, puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier otro organismo que la contenga mediante el empleo de sondas u oligonucleótidos preparados a partir de la información sobre su secuencia de ADN proporcionada en esta descripción. En una realización particular, la molécula de ADN de la invención comprende, o está constituida por, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1. Una secuencia como la identificada en la SEC. ID. N°: 1 comprende la totalidad de los genes davD y davT de P. putida e incluye tanto el marco de lectura abierto como las regiones necesarias para su expresión y regulación. Esos 2 genes se encuentran separados entre sí por una pequeña secuencia intergénica. El gen davT de E. putida codifica la proteína δ-aminovalerato aminotransferasa. Εl gen davD de E. putida probablemente codifica la proteína glutarato semialdehído deshidrogenasa. Εl gen davD abarca los nucleótidos 628-2067 de la SΕC. ID. N°: 1. Εl gen davT abarca los nucleótidos 2253-3527 de la SΕC. ID. N°: 1. la región intergénica entre davD y davT comprende los nucleótidos 2070 a 2252 de la SΕC. ID. N°: 1. La secuencia aguas arriba de davD, entre los nucleótidos 1-627 de la SΕC. ID. N°: 1 incluye el promotor/operador y secuencias implicadas en la regulación de la expresión de davD y davT.
Εn otra realización particular, la molécula de ADN de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SΕC. ID. N°: 2. La SΕC. ID. N°: 2 identifica una región de 486 pares de bases (pb) dentro de la SΕC. ID. N°: 1, desde el nucleótido 139 al 625, suficiente para que se produzca inducción de la expresión del ácido nucleico al que está operativamente enlazada o fusionada en respuesta a Usina y/o ácido δ-aminovalérico y en respuesta a exudados de raíces y semillas de plantas. La región identificada mediante la SΕC. ID. N°: 2 corresponde a la zona promotora del gen davD, el gen que se encuentra inmediatamente aguas arriba del gen davT y con el que parece constituir un operón, ya que la región intergénica no posee actividad promotora de relevancia en presencia o ausencia de lisina. Se ha construido una fusión transcripcional de esta región (denominada
Figure imgf000006_0001
con el gen reportero lacZ, que codifica la enzima β-galactosidasa. Εn células bacterianas portadoras de esta fusión en un plásmido, se detecta actividad β-galactosidasa en respuesta a la presencia de Usina o δ-aminovalérico en el medio de cultivo (véase el Ejemplo 6), lo que pone de manifiesto la utilidad de dicha secuencia para la construcción de sistemas de expresión de proteínas. La molécula de ADN de la invención puede obtenerse utilizando métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de aislamiento e identificación de ácidos nucleicos a partir de cualquier organismo que la contenga o bien de un organismo hospedador transformado con dicha molécula de ADN. Alternativamente, la molécula de ADN de la invención, puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier otro organismo mediante el empleo de sondas u ohgonucleótidos preparados a partir de la información sobre su secuencia de ADN proporcionada en esta descripción. En una realización particular se ha obtenido mediante mutagénesis al azar con un transposón una estirpe de P. putida, denominada estirpe rei-2, en la cual se ha identificado un gen inducible por exudados radiculares de maíz; se ha caracterizado dicha estirpe muíante rei-2 y se ha identificado el gen interrumpido en dicha estirpe muíante rei-2 mediante complementación y secuenciación (véase el Ejemplo 1). Ensayos adicionales han permitido identificar una secuencia (SEC. ID. N°: 2) cuya expresión responde a Usina, ácido δ-aminovalérico y/o exudados de raíces y semillas de plañías.
La invención proporciona, además, una conslrucción de ADN, en adelante, conslrucción de ADN de la invención, que comprende la íoíaüdad de la molécula de ADN de la invención o un fragmenío funcional de la misma y una secuencia de ADN que codifica una proíeína de interés, estando dicha secuencia de ADN que codifica una proíeína de inferes operalivamenie enlazada a dicha molécula de ADN de la invención. Por "proíeína de interés", tal como se utiliza en esta descripción, se incluye a cualquier proteína de interés en agricultura, incluyendo, pero no limiíando, a cualquier proíeína que promueva el crecimienio vegeial y/o aumenle el rendimiento productivo de las plañías, así como cualquier proleína implicada en el conírol biológico de plagas y/o en procesos de biodegradación de conlaminaníes. El íérmino "ρlaga(s)", íal como se utiliza en esía descripción se refiere a cualquier organismo, procarioía o eucarioía, que provoca enfermedades o daños a las plañías o que afecía a su crecimiento y/o a su rendimiento productivo. Ejemplos de proteínas con actividad frente a plagas lo constiíuyen las proíeínas de síníesis del antibiótico 2,4- diacelilfloroglucinol de Pseudomonas fluorescens o las delía-endoloxinas insecticidas producidas por Bacillus thuringiensis. Asimismo, tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente enlazada" se refiere a la orieníación del promotor preseníe en la molécula de ADN de la invención respecío a la secuencia de ADN que codifica la proíeína de interés. Dicho promotor se coloca de tal manera que es capaz de controlar o regular la expresión de dicha secuencia de ADN, es decir, la expresión de dicha secuencia de ADN que codifica la proteína de interés está dirigida por la molécula de ADN de la invención.
La molécula de ADN de la invención o la consírucción de ADN de la invención, puede ser insertada en un vector de amplio espectro de huésped, por ejemplo, un plásmido o un transposón. Por lanío, la invención también se refiere a un vector que comprende dicha consírucción de ADN de la invención. La elección del veclor dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posíeriormeníe. A modo de ejemplo, el veclor donde se iníroduce dicha molécula o consírucción de ADN de la invención puede ser un veclor que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado, o bien un vector no integrado en el genoma de dicha célula, cuya replicación puede ser autónoma o dependiente del hospedador. La iníroducción de dicho vector en la célula hospedadora se realiza por métodos convencionales. Alternativamente, la molécula de ADN de la invención o la construcción de ADN de la invención, puede ser insertada en el cromosoma bacteriano por recombinación. La invención también se refiere a un sistema de expresión de proteínas en rizosfera de plañías que comprende dicha molécula o construcción de ADN de la invención o dicho vector que comprende dicha molécula o construcción de ADN de la invención, junto con la totalidad o parte de los elementos necesarios para la transcripción de ADN y para la traducción de proteínas. En una realización particular, dicho sistema de expresión de proleínas en rizosfera de plantas es un organismo, eucariota o procariota, capaz de colonizar la rizosfera de las plantas y/o el sistema radicular de las plantas, y/o capaz de adherirse a semillas, que contiene la construcción de ADN de la invención, iníegrada o no, en el cromosoma de dicho organismo. En una realización concrela, dicho sistema de expresión de proteínas en rizosfera de plantas es P. putida KT2440 conteniendo una construcción de ADN de la invención, integrada o no, en el cromosoma de dicha bacteria.
La obíención de dicho sisíema de expresión de proteínas en rizosfera de plantas se realiza por métodos convencionales, por ejemplo, mediante transferencia de los vectores apropiados, por ejemplo, plásmidos, transposones, ele, o mediante recombinación con el cromosoma.
En otro aspecto, la invención proporciona una semilla de una planta recubierta total o parcialmente con dicho sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas proporcionado por esta invención. Dicha semilla permite la expresión de la proteína de interés codificada por la secuencia de ADN presente en dicho sistema de expresión, por ejemplo, una proteína de iníerés en agricultura o implicada en el control biológico de plagas que afectan a la planta en cuestión. La semilla proporcionada por esta invención puede obtenerse fácilmente por méíodos convencionales que comprenden aplicar una suspensión de un cultivo que comprende dicho sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas proporcionado por esta invención, por cualquier método convencional, sobre las semillas a recubrir bajo condiciones que permiten la adhesión de dicho sistema de expresión sobre las semillas. En una realización particular, las semillas proporcionadas por esla invención pueden obtenerse sumergiendo las semillas a recubrir en una suspensión de un cultivo que comprende dicho sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas proporcionado por esta invención bajo condiciones que permiten la adhesión de dicho sisíema de expresión sobre las semillas a recubrir. En una realización concreta, las semillas proporcionadas por esta invención son semillas de maíz recubiertas por P. putida KT2440, o por un microorganismo productor de delta-endoloxinas insecticidas bajo el control del sistema de expresión de esta invención. La invención también se refiere a un método para promover el crecimiento de una plañía y/o aumentar el rendimiento productivo de una planta, que comprende aplicar sobre la rizosfera de dicha planta un cultivo que comprende un sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plañías proporcionado por esta invención, que expresa una proteína útil para promover el crecimiento de una plañía y/o para aumentar el rendimiento productivo de una planta. En una realización particular, dicha proteína útil para promover el crecimiento de una planta y/o para aumentar el rendimiento productivo de una planta es una proteína implicada en la síntesis del ácido indolacético [Beyeler et al, FEMS Microbio!. Ecol. 28:225-233, 1999]. La aplicación de dicho sistema de expresión sobre la rizosfera de la planta puede realizarse por cualquier método convencional. En una reaUzación particular, la aplicación puede realizarse por inoculación de una suspensión bacteriana en el suelo antes, durante o después de la siembra de las plantas o semillas. La invención también se refiere a un método para controlar biológicamente una plaga que afecta a una planta, que comprende aplicar sobre la rizosfera de dicha planta un cultivo que comprende un sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plañías proporcionado por esía invención, que expresa una proíeína útil para el control biológico de dicha plaga. La aplicación de dicho sistema de expresión sobre la rizosfera de la planta puede realizarse por cualquier método convencional. En una realización particular, la aplicación puede realizarse por inoculación de una suspensión bacteriana en el suelo antes, durante o después de la siembra de las plantas o semillas.
La invención íambién se refiere a un mélodo para descontaminar un suelo coníaminado medianíe rizorremediación que comprende aplicar sobre dicho suelo coníaminado un cultivo de un sisíema de expresión de proleínas en la rizosfera de plañías que expresa una proteína útil para la biodegradación del coníaminanle o coníaminantes presentes en dicho suelo coníaminado. En una realización particular, el sisíema de expresión se emplea para la biodegradación de íolueno o moléculas eslrucluralmeníe relacionadas. La invención íambién proporciona una proleína, en adelaníe proíeína de la invención, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada eníre: a) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos mosírada en la SEC. ID. N°: 3, b) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleólidos mosírada en la SEC. ID. N°: 2, y c) una secuencia de aminoácidos susíancialmenle homologa y funcionalmeníe equivaleníe a las secuencias de aminoácidos definidas en a) o en b).
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "susíancialmenle homologa" significa que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de aminoácidos, de, al menos, un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%.
Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "funcionalmente equivalente" significa que la proíeína en cuestión tiene una funcionalidad idéntica o similar a la de las proíeínas cuyas secuencias de aminoácidos se definen en los apartados a) o en b) aníeriores. En una realización particular, la proíeína de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, o esíá constiíuida por, la secuencia de aminoácidos mosírada en la SEC. ID. N°: 3. La SEC. ID. N°: 3 corresponde a la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. N°: 1 e incluye al produelo de expresión del gen davT de P. putida que, como se ha mencionado previameníe, es una δ-aminovalerato aminotransferasa.
En otra realización particular, la proteína de la invención es una proleína que comprende, o eslá constituida por, la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos moslrada en la SEC. ID. N°: 2. La proteína de la invención puede obtenerse mediante un método que comprende cultivar una célula hospedadora adecuada que contiene la molécula de ADN de la invención, o una conslrucción de ADN de la invención, bajo condiciones que permiíen la producción de la proleína y recuperarla del medio de culíivo. Alternativamente, la proteína de la invención puede obíenerse a partir de un organismo productor de la misma medíanle un procedimienío que comprende el cultivo del organismo productor, por ejemplo, P. putida, bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha enzima, y, posteriormente, recuperar dicha enzima.
Los siguientes ejemplos ilusíran la invención y no deben ser considerados limiíaíivos del alcance de la misma. El Ejemplo 1 describe el aislamiento y caracterización de un muíante en un gen inducible por exudados radiculares de maíz e identificación del gen interrumpido. Los Ejemplos 2 a 5 describen la expresión de la fusión íranscripcional davTr.luxCDABE en respuesla a Usina, δ-aminovaleraío, exudados radiculares, en presencia de semillas de maíz y en la rizosfera de plañías. El Ejemplo 6 describe la expresión de la fusión íranscripcional Pdav::lacZ en presencia de Usina y en presencia o ausencia de ácido δ-aminovalérico.
EJEMPLO 1
Aislamiento y caracterización de un imitante en un gen inducible por exudados radiculares de maíz e identificación del gen interrumpido
1. Aislamiento y caracterización de un muíante en un gen inducible por exudados radiculares de maíz 1.1 Aislamiento
Con el fin de identificar genes bacterianos cuya expresión se induce en respuesía a exudados de raíces de plañías de maíz (en adelaníe "exudados"), se procedió del siguiente modo. La cepa Pseudomonas putida KT2440, bacíeria de suelo descriía por Franklin et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:7458-7462, 1981) fue sometida a muíagénesis al azar con un íransposón portador de un gen de resislencia al antibiótico kanamicina y del operón luxCDABE de Photorhabdus luminescens sin promotor. Esle íransposón ha sido descriío por Winson et a! (FEMS Microbio! Lett. 163:193-202, 1998), y el proceso de muíagénesis empleado fue el descriío por Espinosa-Urgel et al. (J. Bacterio! 182:2363-2369, 2000). La inserción del íransposón en el cromosoma bacleriano permiíe que se generen fusiones íranscripcionales con el operón lux, las cuales pueden identificarse por la producción de bioluminscencia por parte de la cepa resultante. Con este sisíema se obíuvo una colección de 1.000 muíanles resislentes a kanamicina, los cuales fueron sembrados de forma ordenada y numerada en placas de medio M9, cuya composición se ha descrito por Abril et al. (J. Bacterio! 171:6782-6790, 1989), al que se adicionó benzoato 5 mM como fuente de carbono, y en placas del mismo medio a las cuales se adicionaron cantidades adecuadas de exudados radiculares, obíenidos según el método descrilo por Nílchez et al. (J. Bacterio! 182:91-99, 2000). Tras incubación de las placas a 30°C durante 16 horas, se analizó la emisión de luminiscencia. De esta forma se identificó un clon que preseníaba mayor inlensidad de luminiscencia en presencia de exudados que en su ausencia, indicando que la inserción del íransposón había interrumpido un gen dando lugar a una fusión íranscripcional inducible por exudados. Esíe clon se denominó rei-2.
1.2 Caracíerización de la cepa muíanle rei-2 La cepa rei-2 présenlo las mismas características morfológicas y tasa de crecimiento en medio rico LB (triptona 10% p/v, extracto de levadura 5% p/v, ΝaCl 5% p/v) y medio M9 suplementado con 15 mM benzoaío o 20 mM glucosa que la esíirpe pareníal. A diferencia de la esíirpe parenlal, rei-2 fue incapaz de crecer en medio mínimo M9 cuando se adicionó el aminoácido Usina como única fuente de carbono. Esto, unido al hecho de que la Usina acíúa como induclor de la fusión transcripcional presente en esíe muíante, indicó que la mutación había afectado a un gen implicado en el metaboüsmo de Usina. Esta hipóíesis fue confirmada con los dalos que se exponen a continuación.
2. Identificación del gen interrumpido en el mutante rei-2 El gen interrumpido por la muíación en rei-2 fue identificado por complemeníación. Para ello se íransformó por conjugación la cepa rei-2 con una genoíeca de la esíirpe pareníal consíruida en el cósmido pLAFR3, la cual ha sido descriía por Rodríguez-Herva et a! (J. Bacterio! 178: 1699-1706, 1996). La mezcla de íransconjuganíes oblenida se sembró en placas de medio mínimo con Usina como única fuente de carbono, de manera que solameníe aquellos íransconjuganíes portadores de un cósmido que contuviera una copia silvesíre del gen muíado en rei-2 serían capaces de crecer y dar lugar a colonias. A partir de uno de dichos íransconjuganíes, se obtuvo ADN del cósmido, el cual fue sometido a digestión con la endonucleasa de resíricción Pstl. La mezcla de fragmeníos resultante se subclonó en el plásmido pGBl, descrito por Bloemberg et al. (Appl Environ. Microbio! 63: 4543-4551), empleándose esta mezcla de plásmidos para íransformar a rei-2. Se procedió a un nuevo proceso de selección por complemeníación en medio mínimo con Usina, identificándose un clon capaz de crecer en esíe medio gracias a la presencia de un plásmido coníeniendo una copia silveslre del gen muíado en rei-2. Esle plásmido fue denominado pLYS24 y conienía un fragmenío de ADN de 2,1 kb, del cual se deíerminó parcialmeníe su secuencia. La secuencia nucleotídica obíenida fue comparada con el banco de datos del genoma de P. putida KT2440 del Instituto for Genomic Research, lo que permitió identificar de forma inequívoca una secuencia del genoma de KT2440 (SEC. ID. N°: 1) que incluía el gen clonado en pLYS24, que ha sido denominado davT por los inventores. La inserción del íransposón en esle gen en la cepa rei-2 fue confirmada medianíe un análisis de "Souíhern bloí" y por secuenciación a partir del íransposón (Sambrook et al. : Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Labor atory, Cold Spring Harbor, NT, 1989).
La comparación de la secuencia de davT con los bancos de daíos permiíió esíablecer que la proíeína codificada por esíe gen corresponde a una aminoíransferasa. El hecho de que el mutanle rei-2 sea incapaz de utilizar como fuente de carbono la Usina o el ácido δ- aminovalérico, unido a la inducción de la expresión de davT por ambos compuestos, permitió esíablecer que esía proteína es la δ-aminovaleraío aminotransferasa (SEC. ID. N°: 3).
Aguas arriba de davT se identificó un marco de lectura abierto, que ha sido denominado davD por los inventores. La comparación de la secuencia de davD con los bancos de dalos permitió establecer como posible función de la proteína codificada por davD la actividad glutarato-semialdehído deshidrogenasa. La funcionalidad la molécula de ADN identificada por los inventores para la consírucción de sisíemas de expresión de proíeínas, en particular, en rizosfera de plañías, viene reflejada en los siguientes Ejemplos.
EJEMPLO 2
Expresión de la fusión transcripcional davT::luxCDABE en respuesta a lisina
La estirpe rei-2, portadora en su cromosoma de la fusión davTr.luxCDABE fue cultivada en medio líquido M9 con benzoato, sin suplemeníar y suplemeníado con difereníes aminoácidos: glicina, valina, prolina, lisina y arginina. La expresión de la fusión se analiza regisírando la emisión de bioluminiscencia por exposición duraníe 2 minuíos de una película auíorradiográfica sobre la que se siíúan los íubos coníeniendo los distintos cultivos. De esía forma, mayores o menores niveles de expresión se ven reflejados por una mayor o menor iníensidad de impresión de la película. Como se observa en la Figura 1, la inlensidad es muy superior en cultivos en presencia de Usina que en presencia de los reslanles aminoácidos, o en ausencia de suplemento.
EJEMPLO 3 Expresión de la fusión transcripcional davTr.luxCDABE en respuesta a exudados
Células de un cultivo de rei-2 se siembran en placas de M9 en ausencia o en presencia de exudados radiculares. Tras incubación a 30°C duraníe 16 horas, se deíecla la expresión de la fusión íal como se describe más arriba, situando la película bajo la placa y exponiéndola duraníe 5 minulos. Se observa que la iníensidad de impresión es mayor en presencia que en ausencia de exudados (Figura 2).
EJEMPLO 4
Expresión de la fusión davTr.luxCDABE en presencia de semillas de maíz
Células provenieníes de un culíivo de rei-2 se siembran en una placa de Peíri coníeniendo agar al 0.3% (p/v) en agua bidesíilada estéril, sobre la que se sitúan 3 semillas de maíz. Tras 5 horas de incubación a 30°C, se detecla la expresión de la fusión transcripcional de la manera descrita más arriba, siluando la película bajo la placa y aumentando el tiempo de exposición a 1 hora. Tal como se refleja en la Figura 3, la película queda impresionada en las regiones adyacentes a las semillas, donde la liberación de exudados por parte de éstas induce la expresión en las bacterias del promotor de davT.
EJEMPLO 5 Expresión de la fusión davT::luxCDABE en rizosfera
Se utilizan cultivos de rei-2 para inocular semillas de maíz, de la siguiente forma. Culíivos crecidos duraníe toda la noche en medio líquido LB se centrifugan y lavan dos veces consecutivas con M9. Se introduce una dilución 1:1000 del cultivo bacteriano así preparado en un recipieníe coníeniendo M9, en el cual se iníroducen posíeriormeníe las semillas. Tras 1 hora de incubación a lemperaiura ambieníe, las semillas se recogen y se siembran a 1 cm de profundidad en maceías conleniendo vermiculiía. Ésías se mantienen en invernadero con ciclos naíurales de luz/oscuridad y el régimen apropiado de riego. A disliníos tiempos, se exíraen las plañías, sacudiendo las raíces para eliminar la vermiculiía, y se siíúan sobre papel absorbente humedecido con agua bidestilada. El conjunío se envuelve en "film" transparente de plástico y sobre él se siíúa una película auíorradiográfica, la cual se revela Iras 16 horas de exposición. Al igual que en los casos anteriores, la inlensidad de impresión (Figura 4) refleja la expresión de la fusión davTrlux en bacíerias que se encueníran en la rizosfera, íanío adheridas a la raíz como a partículas de vermiculiía en contacto directo con la misma.
EJEMPLO 6
Expresión de la fusión Vdav' acZ en presencia de lisina y de ácido δ-aminovalérico
6.1 Construcción del plásmido pMPl
Para analizar la posible actividad promotora de la región aguas arriba de davD, se procedió a la construcción del plásmido pMPl. Para ello, se amplificó por PCR el fragmenío indicado en la SEC. ID. N°: 2, al cual se le ha denominado P^, modificado para la iníroducción de 2 sitios de resíricción en ambos extremos para permitir su clonaje en el plásmido ρMP220 (Spaink et al. PlantMol. Biol. 9:27-39, 1987). Dicho plásmido porta el gen reportero lacZ sin su promotor y precedido de múltiples dianas de resíricción que permilen el clonaje de fragmeníos de ADN y el análisis de su actividad promotora. Con el fin de obtener una fusión íranscripcional eníre la mencionada región aguas arriba de davD y el gen lacZ en pMP220, se diseñaron los oligonucleótidos:
GTGAAíícGATCCCTTCAGTTGC [SEC. ID. N°: 4]; y CAACAATCAACAATTCGGGtAcCCG [SEC. ID. N°: 5] (en minúscula se indican las bases modificadas para dar lugar a las dianas de resíricción EcoRI y Kpnl, las cuales aparecen subrayadas).
Tras la amplificación [25 ciclos en las siguientes condiciones: 95°C duraníe 30 segundos; 56°C duraníe 30 segundos; y 72°C durante 30 segundos) y digestión con las enzimas de resíricción EcoRI y Kpnl, el fragmenío EcoRI/Kpnϊ se clonó en pMP220, dando lugar al plásmido pMPl, portador de la fusión íranscripcional Pdav'.'lacZ (obíenida fusionando la SEC. ID. N°: 2 (Prfav) al gen reportero lacZ, que codifica la enzima β-galacíosidasa, según se ha explicado). Dicho plásmido pMPl se inírodujo por elecíroporación en P. putida KT2440.
6.2 Expresión de la fusión P, JαcZ en presencia de lisina Las cepas portando los plásmidos pMPl o pMP220 se cultivaron en medio mínimo M9 modificado según Abril et al. (J. Bacterio! 171:6782-6790, 1989), al que se adicionó benzoato 5 mM como fuente de carbono y lisina 0,2 mM como inductor desde el inicio. Los cultivos se incubaron a 30°C y se lomaron mueslras a partir de la primera hora de incubación (tiempo 0 en la gráfica, Figura 5A) y durante varias horas. El control negativo fue el culíivo portador del plásmido pMP220, que contiene el gen lacZ sin promotor. La acíividad β- galacíosidasa se midió según el méíodo de Miller (Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y., 1972). Como se observa en la Figura 5A, práclicameníe no se deíecla actividad β-galacíosidasa en las cepas que portaban pMP220 aunque sí se detecía dicha acíividad enzimática en respuesla a la presencia de lisina en las cepas que portaban pMPl .
Estos experimeníos, unidos a la casi nula actividad promotora de la región iníergénica eníre davD y davT confirmaron la presencia del promotor inducible de davD y davT en la región comprendida deníro de la SEC. ID. N°: 2 (Pώ¡v), indicando además que ambos genes constituyen un operón.
6.3 Expresión de la fusión PATO. :lacZ en presencia de ácido δ-aminovalérico Dos cultivos de P. putida portadores de pMPl se dejaron crecer duraníe 2 horas, en las condiciones previameníe mencionadas (Ejemplo 6.2) aníes de añadir a uno de ellos δ- aminovalérico 1 mM como inductor. A partir de la primera hora de incubación (tiempo 0 en la gráfica 5B), se íomaron muestras antes y después de la adición de inducíor y se midió la actividad β-galactosidasa según el método de Miller ciíado supra.
La Figura 5B muesíra la evolución de la acíividad β-galacíosidasa (en unidades Miller) de culíivos de P. putida KT2440 portadoras del plásmido pMPl, en medio mínimo en presencia o ausencia de δ-aminovalérico como inductor. La flecha indica el momento en el que se añadió el induclor al medio de culíivo. Resulíados similares se obíuvieron utilizando lisina 1 mM como inducíor (daíos no moslrados).
Estos experimeníos confirmaron la respuesía a δ-aminovalérico y lisina del promotor del operón davDT (SEC. ID. N°: 2).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ADN aislada seleccionada eníre: a) una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEC. ID. N°: 1; b) una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleóíidos identificada como SEC. ID. N°: 2; y c) una molécula de ADN análoga a la molécula definida en a) o en b) que i) es suslancialmeníe homologa a la molécula de ADN definida en a) o en b); y/o ii) codifica un polipépíido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la molécula de ADN definida en a) o en b).
2. Molécula de ADN según la reivindicación 1, consíiíuida por la secuencia de nucleóíidos mosírada en la SEC. ID. N°: 1.
3. Molécula de ADN según la reivindicación 1, consliíuida por la secuencia de nucleóíidos mosírada en la SEC. ID. N°: 2.
4. Una consírucción de ADN que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento funcional de la misma, y una secuencia de ADN que codifica una proíeína de interés, esíando dicha secuencia de ADN que codifica una proíeína de iníerés operativamente enlazada a dicha molécula de ADN.
5. Construcción según la reivindicación 4, en la que dicha proíeína de interés se selecciona entre una proteína de interés en agricultura, una proteína implicada en el conírol biológico de plagas y una proíeína implicada en procesos de biodegradación de conlaminaníes.
6. Un vecíor que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una consírucción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.
7. Un vecíor según la reivindicación 6, seleccionado eníre un plásmido y un íransposón.
8. Un sisíema de expresión de proíeínas en rizosfera de plantas que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, o un veclor según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, y la íotalidad o parte de los elementos necesarios para la íranscripción de ADN y para la íraducción de proíeínas.
9. Sisíema de expresión según la reivindicación 8, que comprende un organismo capaz de colonizar la rizosfera de las plañías y/o el sisíema radicular de las plañías, y/o capaz de adherirse a semillas de plañías, en el que dicha consírucción de ADN o dicho vecíor eslá iníegrado en el cromosoma de dicho organismo.
10. Sisíema de expresión según la reivindicación 8, que comprende un organismo capaz de colonizar la rizosfera de las plañías y/o el sisíema radicular de las plañías, y/o capaz de adherirse a semillas de plañías, en el que dicha consírucción de ADN o dicho veclor no esíá integrado en el cromosoma de dicho organismo.
11. Sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que dicho organismo capaz de colonizar la rizosfera de las plantas y/o el sistema radicular de las plantas, y/o capaz de adherirse a semillas, que contiene dicha construcción de ADN o dicho vector, es Pseudomonas putida KT2440.
12. Una semilla de una planta recubierta total o parcialmente con un sistema de expresión de proleínas en la rizosfera de plantas según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
13. Un método para promover el crecimiento de una planta y/o para aumentar el rendimiento productivo de una planta, que comprende aplicar sobre la rizosfera de dicha planta un cultivo que comprende un sistema de expresión de proteínas en la rizosfera de plantas según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que expresa una proteína útil para promover el crecimienlo de una plañía y/o para aumeníar el rendimienío productivo de una plañía.
14. Un méíodo para controlar biológicameníe una plaga que afecía a una plañía, que comprende aplicar sobre la rizosfera de dicha plañía un culíivo que comprende un sisiema de expresión de proíeínas en la rizosfera de plañías según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que expresa una proleína útil para el control biológico de dicha plaga.
15. Un método para descontaminar un suelo contaminado mediante rizorremediación que comprende aplicar sobre dicho suelo coníaminado un cultivo de un sistema de expresión de proíeínas en la rizosfera de plañías según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que expresa una proíeína útil para la biodegradación del conlaminaníe o conlaminaníes presentes en dicho suelo contaminado.
16. Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: a) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 3, b) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 2, y c) una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente a las secuencias de aminoácidos definidas en a) o en b).
17. Proleína según la reivindicación 16, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 3 o la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 2.
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