WO2002034912A1 - Genomes participant a l'arthrite rhumatoide, procede de diagnostic de celle-ci, procede d'evaluation de la possibilite d'apparition de celle-ci, kit de diagnostic et methode et remedes therapeutiques destines a l'ar - Google Patents

Genomes participant a l'arthrite rhumatoide, procede de diagnostic de celle-ci, procede d'evaluation de la possibilite d'apparition de celle-ci, kit de diagnostic et methode et remedes therapeutiques destines a l'ar Download PDF

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Shunichi Shiozawa
Yoshitake Konishi
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Definitions

  • Genomes involved in rheumatoid arthritis methods for their diagnosis, methods for determining their onset, diagnostic kits for their detection, methods for treating rheumatoid arthritis, and therapeutic drugs
  • the present invention relates to a genome having mutations, their transcripts, a method for diagnosing human rheumatoid arthritis using the mutations, a method for determining the possibility of developing the disease, and a diagnostic kit for detecting them. Furthermore, the present invention relates to a method for treating rheumatism and a drug for treating the same. Background art
  • Rheumatoid arthritis is a systemic inflammatory disease of unknown cause that is characterized by multiple erosive arthritis, but also damages multiple organs. RA progresses chronically, with remissions and exacerbations repeated, and if left untreated, destruction and deformation of the joints, eventually leading to motor organ dysfunction. Sometimes life threatening. Therefore, RA patients suffer significant physical and mental distress over their lifetime. 'R. A has many different ways of onset, and the diagnostic criteria of the American College of Rheumatology are widely used for its diagnosis. However, the onset of RA is usually slow, ranging from weeks to months, and the presence of the rheumatoid factor as an objective indicator in the American College of Rheumatology diagnostic criteria.
  • NSAID non-steroidal anti-inflammatory drug
  • DMAR D disease-modifying rheumatic drug
  • RA arthritis and joint destruction
  • RA can only become ill if a number of causative factors including the living environment overlap. And development ⁇ A shame disease. Therefore, the proper nature of multifactor interactions must be clarified in order to correctly elucidate and properly treat diseases.
  • RA is a disease with an incidence of less than 1% worldwide (N. Engl. J. Med.), Volume 322, New England Journal 'Ob' Medicin. Pp. 1277-1289, 1990), but more than about 8% develop in sibs of the patient (Cell, Vol. 85, pp. 311-318, 1996). Some genetic factors are assumed.
  • knowing the likelihood of developing the disease in advance can be useful in daily life, for example, by paying attention to diet, viral infection, and stress. Onset can be delayed or prevented. Furthermore, early diagnosis and early appropriate treatment can delay the progression of RA, which is expected to improve prognosis.
  • RA apoptosis is induced in vitro by anti-Fas antibody (Arthritis rheuum. Arthritis rheum., Vol. 38, No. 485-). P. 491, 1995).
  • administration of an anti-Fas antibody to a transgenic mouse model of human type I T cell leukemia virus (HTLV-1) tax which is an RA model animal, suppresses edema and arthritis in the joints (Journal of Obv. NIKONORE's Investigation (J. Clin. Invest.), Vol. 98, pp.
  • a disease gene for rheumatoid arthritis located within ⁇ 1 centimorgan of the DNA sequence hybridized by the microsatellite markers DX, S1001 ', DXS1047, DXS1205, DXS1227 and Z or DXS1232 on the human X chromosome.
  • DR 3 disease gene of Death receptor 3
  • the present invention aims to elucidate the relationship between a genomic mutation in human DR3 and the onset or the likelihood of RA, and to diagnose the onset or the likelihood of RA using the mutation with high accuracy. The challenge is to provide a method that can do this.
  • the present invention provides a useful diagnostic kit for detecting a mutated genome of DR3 related to RA or a transcript mutated thereof, and further has a mutation in DR3. It provides an effective treatment method and therapeutic agent for RA patients. Disclosure of the invention
  • a method for determining the onset or possibility of onset of RA using the mutated DR3 genome and its transcript in cells obtained from a subject as an indicator (in other words, a method for diagnosing RA) ) And diagnostic kits for detecting these mutations are useful, and have completed the present invention. Furthermore, the present invention is also useful as a new method for preventing, treating and treating rheumatoid arthritis.
  • A, C, G and T represent each base of adenine, cytosine, guanine and thymine.
  • a transcript is a product resulting from the transcription and translation of a genome, and includes, for example, mRNA, cDNA, and protein. '
  • the base at position 1755 corresponds to the 564th base in the sequence (accession number NM-003790) registered in the gene bank as cDNA. Based on the base at the 3 'end of exon 5 of this genomic DNA, if the base at the end of the int after one base is the first, the deletion at positions 2443 to 2456 is This corresponds to the deletion of the bases 622 to 635 from the 3 'end.
  • the mutation at position 2531 is -538th
  • the mutation at position 2678 is The mutation corresponds to the -391 base
  • the mutation at position 2826 corresponds to the -243 base (see Figure 1).
  • T is 28 consecutive nucleotides (positions 2443 to 2470)
  • the number may increase or decrease by 3 nucleotides.
  • a genome and its transcripts for example, mRNA, cDNA, etc., can be used.
  • mRNA can be converted to cDNA, if necessary, and used.
  • genomic fragments containing one or more of these mutations Useful as a '
  • transcripts such as proteins expressed from the genome.
  • the transcripts of these genomes are also useful as reagents for determining the onset of RA or the likelihood of the onset, or as raw materials thereof.
  • identification of a mutant genome and diagnosis of RA (that is, determination of the onset of RA or the possibility of onset thereof) can be performed, for example, as follows.
  • the genome of the subject can be obtained from all cells of the human body by a conventional method. For example, it can be obtained from hair, organs, peripheral lymphocytes, synovial cells, and the like. Further, the obtained cells can be obtained by culturing and growing the cells. In addition, the obtained genomics can be analyzed by, for example, PCR Polymerase Cham Reaction), NASBA (Nucleic acid sequence based amplification), TMA (Transcription-mediated amplification), and SDA (Strand Displacement Amplification). It can be used after being amplified by a commonly used gene amplification method.
  • Examples of the method for detecting a mutation in the genome include, but are not limited to, an aryl-specific oligonucleotide probe method, an oligonucleotide-oligonucleotide ligation assay, an oligonucleotide ligation assay, and the like.
  • PGR-SSCP, PCR-CFLP, PCR-PHFA, Invader, RCA (Rolling Circle Amplification), Primer Oligo Base Extension (Primer Oligo Base Extension) Can be
  • the nucleotide sequence at positions 21 to 4825 of SEQ ID NO: 1 can be determined, for example, by the direct sequence of a PCR product amplified from the genome by the following primer combinations (1 to 3).
  • the nucleotide sequence at positions 1 to 20 of SEQ ID NO: 1 is a sequence registered in GeneBank as cDNA (session number NM-003790). '
  • the mutation used in the present invention is a substitution of the base at position 1755 of SEQ ID NO: 1 from A to G, a substitution of the base at position 2531 of SEQ ID NO: 1 from C to T, the base sequence of position 2678 of SEQ ID NO: 1
  • the substitution of the base at position 2826 of SEQ ID NO: 1 with the G from the sense primer at positions 1051 to 1078 of SEQ ID NO: 1 and the antisense primer at positions 4058 to 4085 of SEQ ID NO: 1 Can be detected by the direct sequence of the PCR product amplified by the primer, and the deletion of the nucleotides at positions 2443 to 2456 of SEQ ID NO: 1 can be detected.In other words, the mutation of the above five nucleotides can be detected. If they occur at the same time, they can be detected simultaneously by the above PCR product.
  • substitution of nucleotides C to T at position 921 of SEQ ID NO: 1 is amplified by the sense primers at positions 21 to 38 of SEQ ID NO: 1 and the antisense primers at positions 1517 to 1535 of SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of PCR products More detectable.
  • the above mutation can be detected by preparing a sense primer and an antisense primer for the region containing the mutation and direct-sequencing the PCR product amplified from the genome.
  • detecting one or more of the above mutations in the genome of SEQ ID NO: 1 it is possible to make a diagnosis (determination of onset or possibility of onset) of RA in a subject with high accuracy.
  • the primer used in the present invention can be prepared by a conventional method using a DNA synthesizer or the like.
  • These mutations can also be detected by using an appropriate restriction enzyme and detecting a difference in the size of the genomic fragment to be cleaved by Southern blotting or the like.
  • deletion of the nucleotides at positions 2443 to 2456 of SEQ ID NO: 1 can be detected by subcloning the PCR product into plasmid and sequencing it.
  • Use of the c (b) transcript which can also be detected by differences in the size of the PCR product amplified by the sense primer at positions 2369 to 2389 and the antisense primer at positions 2514 to 2535 of SEQ ID NO: 1 '
  • the diagnosis of RA (onset or the possibility of onset) of RA in a subject can be enhanced by detecting transcripts such as mRNA and protein that cause changes due to genomic mutation. It can be done with precision.
  • a transcript when mRNA is used, a sequence containing a mutated portion, for example, positions 1534 to 3306 of SEQ ID NO: 1 are recombined into an expression vector, and transfected into cells. Ratio of derived mRNA Mutation can be detected by, for example, a method of preparing cDNA from mRNA and a method of sequencing cDNA.
  • a vector having a substitution of the nucleotide at position 2678 of SEQ ID NO: 1 from A to D the vector having a mutation of the nucleotide at position 2826 of SEQ ID NO: 1 from A to G, position 2636 2792 of SEQ ID NO: 1 was retained.
  • mRNA is detected. A part of the nucleotide sequence of this mRNA is SEQ ID NO: 4, and the intron insertion causes a frame shift, which results in mutation of amino acid residue and termination codon. Appear.
  • the amino acid sequence of the protein expressed from this mRNA is shown in SEQ ID NO: 5.
  • a vector in which position 1534 3306 of SEQ ID NO: 1 has been recombined into an expression vector or a recombinant vector in which an A to G mutation has been introduced into the portion corresponding to position 1755 of SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1 with a C to T mutation at position 2531, SEQ ID NO: 1 with an A to T mutation at position 2678, SEQ ID NO: 1 at position 2826 with an A to G mutation
  • the amino acid residue at position 159 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is mutated from Asp to Gly.
  • a method for detecting the protein shown in SEQ ID NO: 5 caused by the above-described mRNA splicing abnormality, and the amino acid residue at position 159 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is Asp
  • a method for detecting a protein in which the amino acid residue at position 159 in SEQ ID NO: 2 has been mutated from Asp to Gly can be The detection of the mutant protein may be performed according to a normal protein sequencing method.For example, an antibody that recognizes only the mutant protein is prepared and detected by an ELISA method.
  • Methods for detecting mutations using enzymes and the like and cutting them using a protein sequencer methods for detecting mutations in the isoelectric point of amino acids, and methods for detecting differences in mass by mass spectrometry.
  • a method is provided in which an antibody that recognizes only the mutant protein is prepared and detected by ELISA.
  • Apoptosis is caused, for example, in the following order.
  • Death factors eg, Fas ligand, TNF, Apo3L (DR3 ligand) and TRIAL
  • DR3 ligand DR3 ligand
  • TRIAL binds to death receptors (Fas, TNF receptor and DR3 etc.)
  • adapter proteins eg, FADD and TRADD
  • caspase molecules ultimately causing apoptosis.
  • caspase-8 when stimulated, caspase-8 binds via the death receptor adapter protein to become activated caspase-8, further activates downstream force-spase3 and the like, and finally causes apoptosis
  • caspase 8 is known to be a variant such as caspase 8 / a and caspase 8 / b.
  • the protein expressed from the genome detected by the present invention has a mutation due to a splicing abnormality, and the mutation causes the expression of a mutant form of DR3 lacking the des domain region.
  • DR3 forms a trimer, and it is known that an adapter protein binds to the desdomain region of the trimer.
  • This mutant receptor also forms a complex with the normal 'receptor', but this complex cannot bind the adapter protein TRADD, resulting in activation of caspase-8. And apoptosis is not induced. '. Therefore, it is considered that mutant DR3 derived from the genome having the mutation detected in the present invention has no functional function and acts on dominant negative.
  • Cells used for diagnosis can be obtained from all cells of the human body by a conventional method.
  • the cells to be used preferably include peripheral blood mononuclear cells.
  • the obtained cells are stimulated with a reagent or the like.
  • the reagent used for stimulation is not particularly limited as long as it is a reagent used for normal stimulation.
  • Death receptor ligands such as Gand, TNF, DR 3 ligand, anti-Fas antibody, actinomycin D, radiation, darcocorticoid, honole ball 12—Miristate 13—Acetate (PMA ), Phytohemagglutinin (PHA) and the like, and one or more of these may be used together.
  • Preferable examples include DR3 ligand, PMA, and PHA (provided that stimulation by PMA and PHA is involved in various signal transduction systems including DR3).
  • R3 ligand and the like are examples of these.
  • the time for adding the reagent is not particularly limited, but may be, for example, about 1 to 72 hours, preferably 12 "to 48 hours.
  • the stimulated cells and control cells are lysed with, for example, a solubilization buffer or the like, and caspase 8 is detected.
  • force-spase 8 can be carried out by any method commonly used for protein detection, such as, but not limited to, by, for example, 'Western blotting'.
  • Western blotting includes, for example, a method in which, after electrophoresis on an SDS-polyacrylamide gel, the DNA is transferred to a PVDF membrane and detected with a labeled anti-caspase-3 antibody that binds to caspase-8.
  • caspase 8 In healthy subjects, the expression level of caspase 8 in stimulated cells is lower than that in unstimulated cells, but not in RA patients.
  • the measured caspase 8 concentration was compared before and after stimulation, and if the concentration did not decrease, the subject was diagnosed as RA, a patient, or was highly likely to develop RA. You can also judge. That is, by detecting other mutations affected by the genomic transcript, it is possible to diagnose that the patient is an RA patient or determine that the possibility of developing RA is high.
  • RA joints synovial cells contribute to proliferation and cause joint destruction. Therefore, an anti-Fas antibody capable of inducing apoptosis in synovial cells is considered to be effective as a therapeutic agent for RA. In fact, clinical trials of anti-Fas antibodies are currently underway as therapeutic agents for RA.
  • the above-mentioned mutant DR3 caused by mutation of the DR3 genome cannot induce apoptosis in cells, and this is considered to be the etiology of RA patients with a mutation in DR3.
  • DR3, like Fas belongs to the death receptor family and can induce apoptosis in cells.
  • the present invention provides the following methods and agents for treating RA.
  • Low DR 3 agonist A method for treating rheumatoid arthritis, which comprises supplementing a molecular compound.
  • ⁇ A therapeutic drug used for the treatment of patients with rheumatoid arthritis having a mutant DR3 which is a transcript of the genome according to the present invention, and which does not have the mutation.
  • 'Normal DR.3 or the normal DR A drug for treating rheumatoid arthritis which is mainly composed of DNA encoding 3 or a low molecular weight compound as an agonist of DR 3.
  • the method of complementing normal DR3 is not particularly limited.
  • known protein expression systems and gene transfer methods can be used. Specifically, when a protein is expressed in mammalian cells, A method using an expression vector, a virus vector, or the like used for the above is mentioned.
  • Apo3L as the low-molecular compound, Apo3L (carreto), which is known as DR3 ligand, is used.
  • Antibiotics (Curr. Biol.), Vol. 8, pp. 525-528, 1998, and anti-DR3 antibodies that may act as ago: .
  • Specific examples of the anti-DR3 antibody include immunity (Irntrmnity)
  • the 79-88 pages include such as polyethylene click polyclonal antibody according to I "7 years), they can be considered a method of administering into the body, such as by oral or intravenous.
  • low molecular weight compound also refers to a compound containing a protein such as a peptide.
  • the normal DR3 or the DNA encoding the normal DR3 and the low molecular weight compound as an agonist of the DR3 are used only selectively as therapeutic agents. Instead, they can be used in combination. Therefore, a therapeutic method using at least one of the normal DR3 or the DNA encoding the normal DR3 and a low-molecular compound as an agonist of the DR3 is also effective.
  • the kit for the diagnosis (onset or possibility of onset) of RA may be any reagent that can detect the above-mentioned genomic or transcript mutations, for example, primers, probes, antibodies, etc. It is not particularly limited, and can be obtained by further combining other reagents.
  • kits for expressing a genome may include a primer designed to amplify a genomic region containing one or more of the above mutations, and further comprise a 'genome containing one or more of the above mutations'.
  • One or more reagents needed to detect mutations such as probes designed to detect regions, restriction enzymes, and reagents used in sequencing methods such as the Maxam Gilbert and chain terminator methods Combined kits.
  • a kit containing a fluorescently-labeled dideoxynucleotide is included. '.' ..
  • kits for detecting a protein includes a kit containing an antibody that recognizes a mutant protein.
  • kits for detecting mRNA include primers designed to amplify the region containing the mutation, as well as probes, restriction enzymes, and restriction enzymes designed to detect the mutation.
  • Reagents used in nucleotide sequencing methods such as the Maxam-Gilbert method and the chain terminator method. Kits that combine one or more reagents required to detect mutations can be used. Also preferably, a fluorescently labeled dideoxynucleotide is used. Kits that include the password.
  • the diagnosis of RA (judgment of onset or possibility of onset thereof) can be made with high accuracy.
  • the diagnostic (judgment) kit of the present invention is, for example, a kit containing primers. If the primer can detect one or more mutations of the present invention, the primer is appropriately selected according to the detection method. However, preferably, a set of a sense primer at positions 2717 to 2736 of SEQ ID NO: 1 and an antisense primer at positions 3284 to 3306 of SEQ ID NO: 1 and a sense at positions 1051 to 1078 of SEQ ID NO: 1 Set of primer and antisense primer at positions 4058 to 4085 of SEQ ID NO: 1, sense primer at positions 21 to 38 of SEQ ID NO: and antisense primer at positions 1517 to 1535 of SEQ ID NO: 1 Set, more preferably, the position of SEQ ID NO: 1.Set with the sense primers 1534 to 1556 and the antisense primer at positions 3284 to 3306 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: The set includes a sense primer at positions 667 to 687 of position 1 and an antisense primer at positions 1517 to 1535 of sequence number
  • FIG. 1 shows the positions of the .5 mutations.
  • FIG. 2 is an electrophoresis photograph showing the electrophoresis patterns of normal and defective alleles.
  • Figure 3 is an X-ray film photograph in which splicing abnormalities due to five mutations were detected by Southern blotting.
  • FIG. 4 is an X-ray film photograph in which a splice abnormality caused by the mutation at position 2678 of SEQ ID NO: 1 was detected by Southern blotting.
  • FIG. 5 is an X-ray film photograph of the result of immunoprecipitation with an anti-GFP antibody, followed by Western blotting with an anti-Xpress antibody.
  • FIG. 6 is an X-ray film photograph of the result of immunoprecipitation with an anti-His antibody followed by Western blotting with an anti-Flag antibody.
  • lOxPfu buffer 200 mM Tris-HCl (pH 7.5), ⁇ lOOmM chloride rim, lOOraM ammonium sulfate, 20 mM magnesium sulfate, 1% triton X-100, lmg / ml serum albumin N
  • TAE buffer 0.04M Tris acetic acid, 0.002 Ethylenediaminetetraacetic acid
  • ⁇ Buffer 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), lOOm magnesium chloride, l QmM dithiothreitol, l OOOmM sodium chloride
  • lOxPCR II buffer 500 mM potassium chloride, lOOmM Tris-HCl (pH 8.3) lOxSSC: 1.5 M sodium chloride, 0.15 M sodium citrate (pH 7.0) Buffer A: lOOmM Ris hydrochloric acid (pH9.5), 300raM sodium chloride
  • FCS fetal serum
  • X-gal 5—promo to 4—chloro-3—indolinyl j3—D—galactoside
  • Solubilization buffer 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 150 rnM sodium chloride, 1 NP 0. 0.5% sodium deoxycholate, Protea ⁇ Zeinhibitor
  • TBS-T solution 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6), 137 mM sodium chloride, 0.05% Teen20
  • HRP Horseradish 'Nsperoxidase'
  • Washing buffer 50raM Tris-HCl (pH7.5), 1M NaCl, 0.1% '' NP40, 0.05% sodium deoxycholate, protease inhibitor cocktail
  • the genomic DNA was determined by the guanidine thiosocyanate method (Journal of the Japanese Society of Transfusion Society, Vol. 40, No. 2, pp. 413, 1994). Prepared from blood. That is, cell membrane lysate was added to 10 ml of peripheral blood sampled by EDTA, I solution: 0.32 M sucrose, 1% (v / v) Triton X-100, 5 mM magnesium chloride, 12 mM dris monohydrochloride ( ⁇ ⁇ 7.6)) We calmed 20 tnl, mixed by inversion and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect nuclei.
  • nuclei contain nuclear membrane lysate (II solution: 4M guanidine thiosinate, 12mM EDTA, 375mM sodium chloride, 0.5% N-square sodium dodecanoyl sarcosine, 0.1M j3 -. Menorekapu Toeta Nord, 12 mM Application Benefits scan hydrochloric acid (pH 7.6)) 5 ml was added, 55 ° C shall be kept for 10 minutes to prepare a O Rigeno arm DNA ethanol precipitation c
  • the obtained PCR product was purified using a commercially available kit (QIAquic PCR Purification Kit: Qiagen).
  • the sense and antisense primers are Oligonucleotides corresponding to the nucleotide sequences at positions 1051 to 1078 and 4058 to 4085 in column number 1 were used.
  • Oligonucleotides corresponding to the nucleotide sequence at positions 1535 to 1552 of SEQ ID NO: 1 and oligonucleotides corresponding to the complementary strand at positions 2892 to 2912 of SEQ ID NO: 1 were used as primers.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of thermal denaturation at 95 ° C for 1 minute, annealing at 63 ° C for 1 minute, and extension reaction at 72 ° C for 1 minute for 35 cycles.
  • the sense and antisense primers used include an oligonucleotide corresponding to the nucleotide sequence at positions 1534 to 1556 of SEQ ID NO: 1, and an oligonucleotide corresponding to the nucleotide sequence at positions 3284 to 3306 of SEQ ID NO: 1, respectively. Nucleotides were used.
  • Electrophoresis was performed on agarose gel (1% Agarose S: manufactured by Futatsu Gene) in a TAE buffer together with the molecular weight (100bp ladder: manufactured by New England Biolabs (NEB)).
  • a PCR product of about 1.5 kbp was recovered from the gel and purified using a commercial kit (QIAq'uick Gel Extraction Kit: Qiagen). 50 ng of the obtained PCR product, TA clone vector (pT7BlueT vector: manufactured by Novagen) 25 ng T4 DNA ligase solution (solution I of DNA ligation kit Ver II: manufactured by Takara Shuzo) 31 The mixture was mixed and ligated at 16 ° C for 2 hours.
  • the precipitate was washed with 70% ethanol, dried, and dissolved in 50 ⁇ l of sterile distilled water.
  • the resulting lmg / mlRNase A (Sigma Co.) was added 0. 5 mu 1 was added, 3 after 1 hour Lee Nkigobe preparative 7 ° C, 20% polyethylene grayed recalled Z2.
  • 5M chloride Na Application Benefits ⁇ beam Solution 301 was added and left for 1 hour under ice cooling.
  • the resulting solution was centrifuged at I2000rp / n for 10 minutes, and the precipitate was washed with 70% ethanol, dried, and dissolved in 30 ⁇ l of sterile distilled water. .
  • Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit manufactured by Norkin Enorema Co., Ltd.
  • the obtained precipitate is dissolved in a formaldehyde / blue dextran (5: 1) solution 31 and heat-treated at 95 ° C for 2 minutes, using a sequencer (ABI PRISM377 DNA Sequencer: PerkinElmer). To determine the base sequence.
  • a sequencer (ABI PRISM377 DNA Sequencer: PerkinElmer).
  • the clone obtained by subcloning the PCR product obtained by amplifying the mutated genome had a deletion of the nucleotide sequence at positions 2443 to 2456 of SEQ ID NO: 1.
  • LOxPf'u buffer (Stratagene) 2.51, 2.5tnM Deoxynucleotide mixture 2 ⁇ l, 20 M sense, antisense primer to 50 ng of genome DNA 0.25 ⁇ 1, DN II polymerase reagent (Pfu DNA polymerase: manufactured by Stratagene) 1.
  • PCR was carried out by adding 25 U and adjusting the total volume to 25 using sterile distilled water. . The PCR reaction was performed at 95 for 1 minute, followed by thermal denaturation at 95 ° C for 1 minute, annealing at 55 ° C for 1 minute, and extension reaction 72. C was performed for 1 minute at 40 cycles.
  • Primers were used as sense and antisense primers, respectively, oligonucleotides corresponding to the nucleotide sequence at positions 2369 to 2389 of SEQ ID NO: 1. Oligonucleotide corresponding to the nucleotide sequence at positions 2514 to 2535 of SEQ ID NO: 1 was used.
  • the amplified PCR product was electrophoresed in TAE buffer on agarose gel (3% GTG Agarose: Takara Shuzo) together with a molecular weight marker (100bp ladder: manufactured by New England Biolabs (NEB)), and the mixture was mixed with a DNA buffer. And visualized with a solution.
  • Figure 2 shows the results.
  • Example 4 Detection of Splicing Abnormality due to Five Mutations of SEQ ID NO: 1
  • 50 ⁇ g of RA or healthy human genomic DNA was added to lOxLA buffer (trade name: Takara Shuzo) 2.5 ⁇ m, 25 mM magnesium chloride 2 ⁇ m 5 ⁇ l, 2.5 mM deoxynucleotide mixture 4 ⁇ l, 20 ⁇ sense, antisense primer 0.25 ⁇ l each, DNA polymerase reagent (LA Taq DNA polymerase: Takara Shuzo) 1.25 U And add 25 ⁇ l with sterile distilled water.
  • lOxLA buffer trade name: Takara Shuzo
  • DNA polymerase reagent LA Taq DNA polymerase: Takara Shuzo
  • PCR reaction was performed. The PCR reaction was performed at 95 ° C for 1 minute, followed by 35 cycles of heat denaturation at 95 ° C for 1 minute, annealing at 63 ° C for 1 minute, and extension reaction at 72 ° C for 2 minutes.
  • the primers used for this reaction are shown below.
  • Antisense primer A
  • the amplified 'PCR product was purified by ethanol precipitation.
  • 10 units of Kpn I (Takara Shuzo) and 3 ⁇ l of 10 ⁇ L buffer (Takara Shuzo) were added, and the total volume was made up to 30 l with sterile distilled water.
  • 10 units of Xho I (Takara Shuzo) and 4 ⁇ l of ⁇ buffer (Takara Shuzo) make the total volume to 40 ⁇ l with sterile distilled water, and further add 37 ° C For 4 hours.
  • This reaction solution was electrophoresed together with a molecular weight marker (lkbp ladder: manufactured by Fermentas) on agarose gel (1% Agarose S: manufactured by Futatsu Gene) in a TAE buffer.
  • a molecular weight marker (lkbp ladder: manufactured by Fermentas) on agarose gel (1% Agarose S: manufactured by Futatsu Gene) in a TAE buffer.
  • the obtained approximately 1.8 kbp PCR product was recovered from Genoretiki and purified using a commercial kit (QIAquick Gel Extraction Kit: manufactured by QIAGEN). '
  • This reaction solution was electrophoresed together with a molecular weight marker (lkbp ladder: manufactured by Fermentas) on an agarose gel (1% Agarose S: manufactured by Futaba Gene) in a TAE buffer.
  • a molecular weight marker (lkbp ladder: manufactured by Fermentas) on an agarose gel (1% Agarose S: manufactured by Futaba Gene) in a TAE buffer.
  • a 5.6 kbp DNA band was recovered from the gel and purified using a commercially available kit (QIAquick Gel Extraction Kit: Qiagen). '
  • the sequence reaction of the plasmid DNA was carried out using a commercially available kit (BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit: manufactured by Norn Enorema Co., Ltd.) by the die terminator method.
  • the resulting solution was centrifuged for 20 minutes at 15000rpm and precipitate was washed with 70% ethanol 125 / il, the dried c resulting precipitate formaldehyde Donoburu one dextrin preparative run-. (5: 1) 3 M 1 And heat-treated at 95 ° C for 2 minutes.
  • nucleotide sequence was determined using Sequencer-1 (ABI PRISM377 DNA Sequencer: PerkinElmer), substitution of the nucleotide at position ⁇ 55 of SEQ ID NO: 1 from A to G, and positions 2443 to 2456 of SEQ ID NO: 1 Base substitution, substitution of base C at position 2531 in SEQ ID NO: 1 with substitution of base A at position 2678 of SEQ ID NO: 1 with base, substitution of base A at position 2826 with SEQ ID NO: 1 from G to G Mutant vectors having the following substitutions and normal vectors having no mutation were constructed (see Fig. 1).
  • the obtained cells were collected, washed with a phosphate buffered saline, and then subjected to total guanidine thiocyanate phenol-clonal form (AGPC) method using Trizol reagent (trade name: Gibco).
  • AGPC total guanidine thiocyanate phenol-clonal form
  • the c total RNA from which the RNA was prepared was further treated with DNase (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), and 1 ⁇ of the obtained total RNA was subjected to a reverse transcription reaction kit (RNA PCR Kit: PerkinElmer Inc.). CDNA) was prepared by the usual reverse transcription reaction.
  • LOxPCR the resulting c DNA solution 5 mu 1 II buffer (Perkin Elmer Ltd. one company) 2 ⁇ 1, 25raM magnesium 1 mu 1 chloride, 20 Micromax sense, antisense primer, respectively 0. 25 / il, D 'NA Polymerase reagent (Ampli Taq Cold DNA polymerase: manufactured by Norkin Elma Co., Ltd.) 1.
  • a PCR reaction was performed using 25 U 'of calorie, and the total amount was adjusted to 25 ⁇ l with sterile distilled water. PCR reactions are 9 after at 5 ° C 10 min, 1 minute denaturation 95 ° C, 1 minute at Aniri ring 55 ° C, 40 cycles of 1 minute extension reaction 72 ° C, finally 72 ° C For 5 minutes.
  • the sense and antisense primers used in this reaction are as follows.
  • Sense primer B 5'-ATCCGCTTCCTGCCCC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Antisense primer B 5'-GGGGCCACCTCCAGTGCC-3 '
  • Each nucleotide sequence is an oligonucleotide corresponding to a part of the nucleotide sequence of the sense primer A and the antisense primer '1A.
  • RT-PCR solution was electrophoresed on agarose gel (2% Agarose S: Nippon Gene) in a TAE buffer along with a molecular weight marker (1 kbp ladder: manufactured by Pheno Rementas). Visualized with ethidium bromide solution.
  • the PCR product was cut out from the gel and purified using a commercially available kit (QIAquick Gel Extraction Kit: Qiagen).
  • the resulting PCR product 50 ng, TA click low Jung vector (P T7BlueT vectored one: Nova one Jen (Novagen) Co.) 25 ng of T4DNA ligase solution (DNA ligation kit Ver II of solution I: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 3 mu 1 And ligated at 16 ° C for 2 hours. . ' ⁇
  • Plasmid DNA was prepared in the same manner as in Example 2, and the nucleotide sequence was determined.
  • primers oligonucleotides represented by sense primer B and antisense primer B were used.
  • -As a result 'The nucleotide sequence at position 1755 of SEQ ID NO: 1 changes from A to G, the nucleotide sequence at positions 2443 to 2456 of SEQ ID NO: 1 is deleted, and the nucleotide sequence at position 2531 of SEQ ID NO: 1 changes from J to T
  • the mutation at position 2678 in SEQ ID NO: 1 has a mutation from A to T, and the nucleotide sequence at position 2826 in SEQ ID NO: 1 has a mutation from A to G.
  • Positions 2636 to 2792 of SEQ ID NO: 1 were retained: mRNA was detected.
  • the DNA in the gel was transferred to a nylon membrane (Hybond-N +: manufactured by Amersham Armacia) by the capillaries method and transferred to a UV loss linker (B: Genetic). More DNA was immobilized on the membrane. LOxSSC was used as a buffer solution for cabillaries. The detection of hybridization and DNA fragments was carried out using a Gene Images 3 'mono-oligobelling' CDP-Star detection system (Amersham Pharmacia) as follows. The DNA-immobilized membrane was mixed with hybridization buffer (5 X SS (: 0.1% (w / v) SDS,
  • the oligonucleotide containing the salt' group at positions 2715 to 2736 of SEQ ID NO: 1 is fluoresced. It was labeled and used as a probe. This probe was added to the prehybridization solution so that the probe concentration became lOng / tnl, and hybridization was performed at 59 ° C for 2 hours with further shaking. Wash twice with a buffer solution (5xSSC, 0.1% (w / v) SDS) for 5 minutes, and then wash twice with a buffer solution (lxSSC, 0.1% (w / v) SDS) previously heated to 50 ° C for 15 minutes.
  • 5xSSC 0.1% (w / v) SDS
  • the membrane was lightly rinsed with buffer A, and the kit was diluted 1:10 with buffer "A” and the kit was blocked with the blocking reagent for 1 hour at room temperature.
  • the membrane was lightly rinsed with buffer A.
  • Antibody dilution solution Alkaline phosphatase labeled anti-fluorescein supplied with the kit
  • Antibody was diluted 5000 times with buffer A containing 0.5% (w / v) BSA) and incubated for 1 hour at room temperature. Washing was performed three times with buffer solution A containing 0.3% (v / v) Tween20 for 10 minutes while shaking at room temperature.
  • a mutation from A to G in the nucleotide sequence of 1755 a mutation from C to T in the nucleotide sequence at position 2531 in SEQ ID NO: 1, a mutation from A to T in the nucleotide sequence at position 2678 in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1
  • a mutation from A to G in the nucleotide sequence at position 2826 was prepared using a commercially available kit (QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis kit: manufactured by Stofane (Stratagene)) in the following manner.
  • Sense primer 5'-GGTTCCCGCAGAGGTACTGACTGTGGGA-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Antisense primer 5'-TCCCACAGTCAGTACCTCTGCGGGAACC-3 '(Torumi column number 11).
  • Sense primer 5 '-CTTGGCTCACTATAACCTCTGCTGCCTGGG-3' (SEQ ID NO: 12) '
  • Antisense primer 5'-CCCAGGCAGCAGAGGTTATAGTGAGCCAAG-3 '(SEQ ID NO: 3 )'
  • Anti-antisense primer
  • Antisense primer 5'-CAGGGATTTTGCCTATTCTGTCCCCTGTTGC-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • Example 4 (3) The mutant vector prepared in the same manner as in Example 4 (6) was transfected into Jurkat cells, and RT-PCR was performed under the same conditions as in Example 4 (6). Was done. Further, Southern plotting was performed in the same manner as in the method shown in Example 5. Fig. 4 shows the results. Only in the vector in which the A to T mutation was introduced at position 2678 of SEQ ID NO: 1, a band binding to the probe was detected, and it was revealed that this mutation causes splice aberration.
  • RA pedigree 6 out of 60 RA patients and 4 out of 31 healthy RA-affected patients in a group of patients who had RA affected relatives other than the patient themselves (hereinafter referred to as RA pedigree) Mutations were observed in 11 out of 494 RA patients and 3 out of 481 normal healthy subjects in a group of patients without relatives who had no RA, and mutations were found to be extremely high in RA families. Most of the observed mutations were heterozygotes.
  • PCR reaction was performed at 95 ° C for 10 minutes, followed by a thermal denaturation reaction at 95 ° C for 1 minute, an annealing reaction at 60 ° C for 1 minute, an extension reaction at 72 ° C for 2 minutes, and finally an extension reaction. This was performed at 72 ° C for 5 minutes.
  • the obtained PCR product was purified by multi-screen PCR (trade name: manufactured by Millipore) using an automatic dispensing robot (Biomec 2000: manufactured by Beckman Coulter).
  • oligonucleotides corresponding to the nucleotide sequences at positions 2138 and 1517 1535 of SEQ ID NO: 1, respectively were used. .
  • PCR product (Terminator Ready Reaction Mix: PerkinElmer) 4 / il, add 1.6 pmol of primer, and add sterile distilled water
  • the volume was made up to 10 l. Sequence reaction, 96. C for 10 seconds, 50 ° C for 5 seconds, 60 ° C for 4 minutes, 25 cycles.
  • the unreacted deoxynucleotide is removed from the sample after the sequence reaction using Sephadex G-50 (manufactured by Amersham Pharmacia) and Manoletis Clean-HV (product name: manufactured by Millipore). The gel filtration method was used.
  • the base at position 921 is based on the base at the 5 'end of exon 3 of the sequence (accession number NM-003790) registered in the gene bank as cDNA, and is one base before the base. If the base number of the lon is -1st, it corresponds to the .53rd.
  • Genomic mutations were examined in RA patients in the same manner as in Examples (1) to (3).
  • RNA PCR Kit manufactured by Perkin-Dulmer
  • the extension reaction was performed under the conditions of 40 cycles of 1 minute at 55 ° C and 2 minutes of extension at 72 ° C, and finally 5 minutes at 72 ° C.
  • the sense and antisense primers used in this reaction are as follows.
  • the obtained RT-PCR solution was electrophoresed in TAE buffer with 1% Agarose S (Nippon Gene) together with a molecular weight marker (100 bp ladder: Fermentas) in a TAE buffer solution. Visualized by 'Mide solution'.
  • the PCR product was cut out of the gel and purified using a commercially available kit (QIAquick Gel Extraction Kit: Qiagen). 50 ng of the obtained PCR product and 25 ng of a TA cloning vector (pT7BlueT vector 1: Novagen) were mixed with 3 ⁇ l of T4 DNA ligase solution (solution I of DNA ligation kit Ver II: Takara Shuzo). The ligation was performed at 16 ° C for 2 hours.
  • Example 2 [Plasmid DNA was prepared in the same manner as in the method described here, the nucleotide sequence was determined, and cDN'A at positions 21 to 1342 of SEQ ID NO: 2 or position 21 of SEQ ID NO: 4 A plasmid in which ⁇ 731 cDNA was cloned was obtained.
  • the D ⁇ . ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ was recovered from the gel force and purified using a commercially available quint (QIAquick Gel Extraction Kit: Qiagen).
  • (6) 2 units of pcDNA3.1 / His vector (trade name: manufactured by Invitrogen) contain 5 units of BamH I (manufactured by Takara Shuzo), 5 units of Xba I (manufactured by Takara Shuzo), and ⁇ buffer solution (manufactured by Takara Shuzo) 1.25 / JI was added, and the total volume was adjusted to 25 l with sterile distilled water.
  • Plasmid 2 ⁇ in which positions 21 to 1342 of SEQ ID NO: 2 obtained in Reference Example 1 (4) were cloned was also Sal I (Takara Shuzo) 5 units, EcoR I (Takara Shuzo) 5 units, ⁇ 2.5 1 buffer solution (Takara Shuzo) was added, and the total volume was adjusted to 25 with sterile distilled water. After incubating the reaction solution at 37 ° C for 4 hours, agarose gel (1%) was added together with a molecular weight marker (lkbp ladder: manufactured by Fermentas).
  • Plasmid DNA was prepared in the same manner as described in Example 2, and an EGFP (Enhanced green fluorescent protein) -tagged expression vector in which L342 was recombined with position 21 to Was built.
  • EGFP Enhanced green fluorescent protein
  • A-knowledge was collected from Genoreka and purified using a commercial kit (QIAquick Gel Extraction Kit: Agen).
  • Plasmid DNA was prepared in the same manner as in Example 2, and an EGFP-tagged expression vector in which positions 21 to 731 of SEQ ID NO: 4 were recombined was constructed.
  • Example 6 Reference Example 1 was made in the same manner as in (1) and (2).
  • Mutagenesis was performed on the plasmid cloned from the cDNA at positions 21 to 1342 of SEQ ID NO: 2 or the cDNA at positions 21 to 731 of SEQ ID NO: 4 obtained in (4).
  • Each of the mutation-introduced salts was the 564th base of SEQ ID NO. 4 or 2 (corresponding to position 1755 of SEQ ID NO: 1), and this base A was replaced with G.
  • G By this mutagenesis, Gly replaces Asp at position 159 in all proteins.
  • the primer sets used at this time are as follows.
  • Antisense primer 5'—TCCCACAGTCAGTACCTCTGCGGGAACA—3 '
  • the obtained sample (20 ⁇ ) was subjected to ordinary SDS-PAGE using a 7.53 ⁇ 4 SDS-PAGE gel together with a protein marker (Brested Marker, Broad: manufactured by Apro Science). After electrophoresis, proteins were transferred to a PVDF membrane (Millipore) using a semi-dry blotting device.
  • the transfer buffer used was 100 mM Tris, 192 mM glycine, and 10% methanol.
  • Fig. 5 shows the results. It was found that proteins expressed from vectors B, C, D, and E all bind to proteins expressed from vector A. That is, the normal DR3 protein forms a complex with the normal protein, and also forms a complex with the mutant proteins expressed from vectors c , D, and E. It became clear that we would do it.
  • cDNA solution Human testis Marathon-Ready cDNA: trade name, manufactured by Klontec
  • lOxLA buffer trade name: manufactured by Takara Shuzo
  • S ⁇ 1 2.5 ⁇ M deoxynucleotide mixture 4 ⁇ l
  • Antisense primer 5'-GGTTCAGCAATAGCCGCAGA-3 '(system number 21).
  • Plasmid DNA was prepared in the same manner as in the method described in Example 2, the nucleotide sequence was determined, and a plasmid in which TRADD cDNA was cloned was obtained.
  • P CMV-Tag2 vector data one (trade name: be sampled La data Gene Co., Ltd.) I ⁇ g to EcoR I (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 5unit, Sal I (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 5unit, ⁇ buffer (Takara Shuzo Co., Ltd. 3 / i 1 was added, and the total amount was adjusted to 30 ⁇ l with sterile distilled water.
  • Reference Example 2 30 ng of the DNA fragment purified in (4) and 30 ng of the pCMV-Tag2 vector purified in Reference Example 2 (5) were combined with a T4 DNA ligase solution (solution I of DNA ligation kit Ver II: Takara Shuzo) 2 5 ⁇ l and ligated at 16 ° C for 2 hours.
  • a T4 DNA ligase solution solution I of DNA ligation kit Ver II: Takara Shuzo
  • vector F a TRADD expression vector with a Flag tag was constructed.
  • this vector is referred to as vector F.
  • Vector A 0.2 / g, Vector E 0.2 ig, Vector F 0.lfg Vectors A and E are shown in Reference Example 1.
  • Vector A has a His tag in addition to an Xpress tag.
  • the total amount of the vector was determined to be lg by pcDNA3.1 (trade name: manufactured by Invitrogen). 6 / i1 of a lipofection reagent (plus reagent: Gibco) was added to 1-4 above, and the whole amount was ⁇ with DMEM, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
  • Libofectamine reagent manufactured by Gibco 41 and DMEM961 were added, and after standing at room temperature for 15 minutes, 800 ⁇ l of DMEM was added to make the total volume 1 ml. Cells The supernatant was removed from the plates seeded, the solution e total amount of pressure to, for 3 hours at the 37 ° C, 5% C0 2 conditions. After removing the supernatant, 3 ml of DMEM / 10% FCS was added, and after further culturing for 24 hours, the cells were collected. After resulting cells washed with PBS, suspended in solubilization buffer 2 5 0 1, was crushed Le Ri by the ultrasound. The cell lysate of this l 5 000 rpm, centrifuged 10 min, the supernatant was subjected to experiments with a cell lysate.
  • washing the supernatant was 20 minutes overturning stirred at 4 ° C and suspended in solubilization buffer 500 1. After performing this operation twice, the same washing was further performed twice with 500 ⁇ l of the washing buffer, and finally, the washing was performed again with the solubilizing buffer 500 / ⁇ 1.
  • the precipitate was suspended in 2 ⁇ sample buffer 301 and heated at 95 ° C for 5 minutes to prepare a sample for SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). (10)
  • the obtained sample 201 was subjected to ordinary SDS-PAGE using a 9% SDS-PAGE gel together with a protein marker (pressed marker, broad: manufactured by Aproscience). After electrophoresis, the proteins were transferred to a PVDF membrane using a semi-dry plotting device.
  • the transfer buffer used was lOOtnM Tris, 192 mM glycine, and 10% methanol.
  • the protein-transferred PVDF membrane was immersed in a 5% skim milk powder-containing TBS solution and shaken at room temperature for 1 hour. Next, the TBS solution was immersed in a solution in which an anti-Flag antibody (manufactured by Sigma) was added at a ratio of 1/1000 (volume ratio to the solvent), and reacted at room temperature for 30 minutes. After washing the PVDF membrane three times for 1 to 2 minutes with TBS solution, immerse in TBS solution containing HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Amershamfa / Remashia) in 1/1000 (volume ratio to solvent). The reaction was performed at room temperature for 30 minutes. After washing with a TBS solution three times for 15 minutes, the plate was immersed in a detection reagent (ECL system: manufactured by Amersham Fanolemasia) and exposed to an X-ray film.
  • ECL system manufactured by Amersham Fanolemasia
  • Fig. 6 shows the results. Normal type DR3 and mutant DR3, when the simultaneous expression, the amount of TRADD bound to dose-dependent manner normal type DR3 variant DR 3 is reduced (Lane 3 ', 4). That is, mutant DR3 inhibited the binding between normal DR3 and TRADD.
  • Peripheral blood l Ornl from 5 RA patients and 4 healthy subjects from which heparin was collected was mixed with an equal volume of PBS, and this was overlaid with 20 ml of Lymphoprep (Daiichi Pure Chemicals). l 5 After centrifugation for 30 minutes at rpm, the layer of peripheral blood mononuclear cells were collected and washed in PBS.
  • Cells 5x l (J s ce 11 s / ml and by bovine suspended becomes medium (RPM1 16 4 0/10% FCS) were plated the cell suspension 10ml to 10 cm phi dish, PMA (Shi Damasha) With or without stimulation at 20 ng / ml and PHA (Difco) 1 g / ml Under stimulation, 37 ° C, ' 5D /. C0 2 in the cells were cultured for 48 hours. 'The cells were collected, washed with PBS, suspended in 150 ⁇ l of lysis buffer, and incubated for 30 minutes under ice-cooling. This solution was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was separated and used as a cell lysate.
  • the protein-transferred PVDF membrane was immersed in a 5% skim milk-containing TBS-T solution and shaken at room temperature for 1 hour. Then, the plate was immersed in a solution of anti-caspase-8 antibody (manufactured by Medical Biology Laboratories) at a ratio of 1 / 1,000 (volume ratio to the solvent) added to a 1% skim milk powder-containing TBS-T solution, and the solution was incubated at 4 ° C —Reacted.
  • anti-caspase-8 antibody manufactured by Medical Biology Laboratories
  • band concentrations of caspase 8 / a and caspase 8 / b were quantified using NIH Image software, and the results were shown as relative values obtained by dividing the values under stimulation with PMA and PHA by the values under non-stimulation. The results are shown below as the average soil standard deviation.
  • RA patients 1.33 + 0, 23 Caspase 8 (caspase 8 / a, caspase 8 / b) is reduced or degraded in healthy subjects by cell stimulation, whereas degradation of caspase 8 is observed in RA patients. was not observed.
  • Agarose S electrophoresed in TAE buffer using Nippongen ⁇ ..
  • a DNA band of about 1.3 kbp was recovered from gel; ⁇ , and commercially available kit (QIAquick Gel Extraction Kit: Qiagen) And purified.
  • Plasmid DNA was prepared in the same manner as in Example 2, and a normal DR3 expression vector in which positions 21 to i342 of SEQ ID NO: 2 were recombined was constructed.
  • Plasmid DNA was prepared in the same manner as described in Example 2, and a plasmid having a mutation from A to G at position 564 of SEQ ID NO: 3 was prepared. A mutant expression vector in which 73731 was recombined was constructed.
  • Cells were harvested Li After washing with phosphate buffered saline, the cells were solubilized in 100 ⁇ l of cell lysate (Passive Lysis Buffer: manufactured by Promega) and 20 ⁇ l of this solution and luciferase substrate 50 (Stop & Glo substrate: Promega) Were mixed, and the luminescence was measured using a Luminometer (Luminoskan: manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the cell lysate emits chemiluminescence.
  • the amount of luminescence is considered to decrease due to a decrease in the number of cells. That is, this test detects the induction of cell death using the amount of luminescence as an index.
  • the luminescence of cells into which the mutant DR3 was introduced was almost the same as that of the control. showed that. That is, while apoptosis is not induced in these cells, the amount of luminescence of cells into which normal DR3 and mutant DR3 are introduced in equal amounts is equal to that of cells into which only normal DR3 has been introduced. Similarly, it showed a low value, and cell death was induced. Thus, complementation of normal DR3 is considered to be useful as a treatment for RA.
  • the present invention relates to a method for diagnosing human rheumatoid arthritis using mutations in the genome or protein having the mutation (in other words, a method for determining the onset or possibility of onset), and a diagnosis (determination) for detecting the mutation.
  • the present invention relates to a kit, a method for treating rheumatism and a therapeutic drug. According to the present invention, the onset or possibility of the onset of rheumatoid arthritis can be performed easily and reliably with high accuracy, and is useful. Furthermore, the present invention is also useful as a new method for preventing, treating and treating rheumatoid arthritis.

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明 細 書
'I曼性関節リ ウマチに関与するゲノム、 その診断方法、 その発症可能性の 判定方法、 それらの検出用診断キッ トおよび、 慢性関節リ ウマチの治療 方法ならびに治療薬剤 技術分野
本発明は、 変異を有するゲノム、 それらの転写産物およびそれらの変 異を利用したヒ ト慢性関節リ ウマチの診断方法、 その発症可能性の判定 方法およびそれらの検出用の診断キッ トに関し、 さ らに、 当該リ ウマチ の治療方法およびその治療薬剤に関するものである。 背景技術
慢性関節リ ウマチ （rheumato i d arthr i t i s。 以下 「R A」 と もいう） は、 多発するびらん性関節炎を主徴とするが、 同時に多臓器を障害する 原因不明の全身性炎症疾患である。 R Aは寛解と増悪とを操り返しなが ら慢性に進行し、 無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、 やがて 運動器の機能障害を呈してく る。 時には生命をも脅かす。 したがって、 R A患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘つて背負う こと になる。 . ' R. Aは、 その発症の仕方も多種多様であり、 その診断には、 アメ リ カ リ ウマチ学会の診断基準が広く利用されている。 しかしながら、 R Aの 発症は、 通常、 緩徐で数週間から数ケ月にわたり、 アメ リ カリ ウマチ学 会の診断基準における客観的な指標 してのリ ゥマ トイ ド因子の存在 は、 その陽性率が 3 ヶ月以内で 33%、 12 ヶ月以上においても 88%程度 (治療、 第 73 巻、 第 3号、 第 23〜27 頁、 1991 年） であり、 R Aと確 実に診断するには至っていない。 そこで、 組換え抗原と反応する患者血 清中のリ ゥマチ性関節炎関連抗体 IgM抗体を検出し、 リ ゥ.マチ性関節炎 を診断しょ う とする試みなどがなされている （特開平 10 - 513257 号参 照） 。 - また、 R Aの治療は、 R A病態の病状の進行過程によって選択すべき 治療手段は異なるのが通常である。 一般的に確定診断が下せない初期で は、 非ステロイ ド抗炎症薬 （N S A I D) を投与し、 確定診断が下せた 場合は、 N S A I Dに加えて疾患修飾性リ .ゥマチ薬 （DMAR D) を投 与する。 特に R A発症 初期には、 確定診断を下すことは困難であり、 現状では、 N S A I Dを投与し、 経過を慎重に観察しながら膠原病を含 む他のリ ウマチ疾患との鑑別を同時に行っている。 さ らに症状が進行し た場合は、 ステロイ ド薬の投与を行う場合もあり、 疼痛のための薬物療 法と共に関節機能の維持 · 回復に対して理学療法 ■ 装具療法を行う。 ま た、 関節破壊に'より 日常生活が不自由になった場合には、 手術療法を行 う場合も る。 ，
R Aの原因である関節炎と関節破壊の様相、 特にそれらの病理過择 は、 種々の研究を通じて次第に明らかになりつつあるが、 R Aは生活環 境を含めた多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展 ■ 憎悪 する疾患である。 そのため、 疾患の正しい解明と適切な治療とを行うに は、 多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。 R Aは、 世界的には罹患率 1 %以下の疾患であるが （ニュー . イ ングラ ン ド . ジャーナル ' ォブ ' メデイ シン （N. Engl. J. Med. ) 、 第 322 卷、 第 1277〜 1289 頁、 1990 年） ，、 患者の同胞では約 8 %以上が発症する (セル （Cell) 、 第 85 卷、 第 311〜318 頁、 1996 年） ことから、 その '原因因子と して何らかの遺伝的要因が想定されている。 また、 環境が原 因因子の 1つと考えられていることから、 あらかじめ発症可能性を知る ことによ り、 日常生活において、 例えば、 食餌、 ウィルス感染およびス ト レス等に注意することによ り発症を遅らせたり防ぐことが可能である。 さ らに、 診断を早め、 早期に適切な治療を行う ことによって R Aの進行 を遅らせることが可能であり、 予後の改善が期待される。
R Aは、 その直接の原因の一つと して、 アポ トーシスの過剰の抑制が ある。 これに関して、 以下のよ うな報告がある。 R A患者の滑膜細胞は、 in vitro において抗 Fas 抗体によ り アポ トーシスが誘導される （ァー ス リ テ イ ス . アン ド ' リ ウマテイ ズム （Arthritis rheum. ) 、 38 巻、 第 485〜491 頁、 1995 年） 。 また、 R Aのモデル動物であるヒ ト I 型 T 細胞白血病ウィルス （HTLV- 1) tax トランスジエニックマウスに抗 Fas 抗体を投与すると、 関節の浮腫および関節炎が抑制され （ジャーナル - ォブ ' ク リ ニカノレ ' イ ンべスティ ゲーシ ヨ ン （J. Clin. Invest. ) 、 98 巻、 第 271〜278 頁、 1996 年） 、 さ らに SCID マウスの背部に移植され た R Aの滑膜組織は抗 Fas 抗体の投与によ り消失するとの報告がある (アース リ テイ ス ' アン ド ' リ ウマテイ ズム （Arthritis rheum. ) 、 41 巻、 第 1251〜1257頁、 1998年） 。 - 国際公開 W098 51791号には、 本願発明者らが、 マイクロサテライ ト マーカ一を用いた連鎖解析を R A患者およびその血縁者に対して実施す ることにより、 慢性関節リ ゥマチの疾患遺伝子が位置する 3力所の遺伝 子座を特定し、 以下の疾患遺伝子を同定している。 ( 1 ) ヒ ト第 1 染色体の、 マイクロサテライ トマーカー D1S214 および または D1S253 がハイブリ ダィズする D N A配列から ±1 センチモル ガン以内に位置する慢性関節リ ゥマチの疾患遺伝子。
( 2 ) ヒ ト第 8 染色体の、 マイク ロサテライ トマーカー D8S556 がハイ ブリ ダィズする D N A配列から土 1 センチモルガン以内に位置する慢性 関節リ ウマチの疾患遺伝子。
' ( 3 ) ヒ ト X染色体の、 マイク ロサテライ トマーカー DX、S1001'、 DXS1047、 DXS1205、 DXS1227 および Zまたは DXS1232 がハイブリ ダィズする D N A配列から ±1 センチモルガン以内に位置する慢性関節リ ゥマチの疾患 遺伝子。
また、 リ ウマチ、 第 39 号、 第 2号、 第 444頁および第 445頁には、 本願発明者らが、 前記先願堯明の各疾患遺伝子について、 前記 （ 1 ) の 疾患遺伝子に関係するマーカー D1S214および D1S253 の疾患遺伝子と し て、 デス レセプター 3 (death receptor 3 : 以下 「D R 3」 と もレヽう） を挙げ'、 健常人と R A患者との間に D R 3の制限断片長多型を確認し、 D R 3が R Aにおける疾患感受性遺伝子である可能性を示唆している.。 本発明は、 ヒ ト D R 3におけるゲノムの変異と R Aの発症またはその 発症可能性との関係を解明し、 その変異を利用 して R Aの発症またはそ の発症可能性を高精度に診断することのできる方法を提供するこ とを課 題と している。 また、 本発明は、 R Aに関する D R 3の変異したゲノム またはそれらの変異した転写産物'を検出するための有用な診断キッ トを 提供するものであり、 さ らには、 D R 3に変異を持つ R A患者に対する 有効な治療方法および治療薬剤を提供するものである。 発明の開示
このよ うな状況下において、 本願発明者'らは銳意研究を'行った結果、 . 被験者から得られた細胞において、 D R 3の配列番号 1のゲノ ムに下記 の変異を有するゲノムを見出した。 ' ( 1 ) 位置 921 の塩基がシ ト シン （ C ) からチミン （丁） への置換
( 2 ) 位置 1755 の塩基がアデニン （A) からグァニン （ G) への置換
( 3 ) 位置 2443〜2456の塩基の欠損
(Λ ) 位置 2δ31 の塩基がシ トシン （ C ) からチミン （ Τ ) への置換 ' ( 5 ) 位置 2678 の塩基がアデニン （Α) からチミン （； Τ ) への置換 ( 6 ) 位置 2826 の塩基がアデニン （Α) からグァニン （ G) への置換 また、 位置 1755'の塩基は、 D R 3 ゲノ ムのェク ソ ン領域内にあり、 配列審号 3にァミノ酸配列が示される D R 3タンパク質においては、 位 置 1δ9のアミ ノ酸のァスパラギン酸からグリ シンへの変異を意味する。 —方、 上記 （ 1 ) および （ 3 ) 〜 （ 6 ) の変異は、 D R 3ゲノ ムのイン ト ロ ン領域にある。 "
R Αの発症に関与するゲノムは従来から複数存在することが知られて いるが、 本発明の変異したゲノムは、 これらの R A発症原因の一部を構 成するものである。 '
これらの知見よ り、 被験者から得られた細胞における D R 3の変異し たゲノムおよびその転写産物を指標と した R Aの発症またはその発症可 能性の判^方法 （換言すれば、 R Aの診断方法） 、 およびこれらの変異 を検出する診断キッ トが有用である'ことを見出し、 本発明を完成するに 至った。 さ らに、 本発明は、 慢性関節リ ウマチの新たな予防法、 治療法 および治療薬剤と しても有用である。 以下、 本発明について詳述する。 ' 本明細書において、 特に断ら'ない限り、 A、 C、 Gおよび Tは、 アデ ニン、 シ トシン、 グァニンおよびチミ ンの各塩基を示す。 また、 ァ ミ ノ 酸およびアミ ノ酸残基は、 I U P A Cおよび I UBの定める 1文字表記 または 3文字表記を使用する。 また、 転写産物とは、 ゲノムが転写およ び翻訳される結果生じる産物であり、 たとえば、 mRNA、 c DNAお よびタンパク質などが挙げられる。'
また、 位置 1755 の塩基は、 c D NAと してジーンバンクに登録され ている配列 （ァクセッ ショ ン番号 NM— 003790) の 564番目の塩基に相当 する。 このゲノム D NAのェク ソン 5の 3 ' 末端の塩基を基準と し、 一 塩基後のィ ン ト 口ンの塩基を 1 番目 とする と位置 2443〜2456 の欠損は、 ェク ソン 5の 3 ' 末端から 622〜635番目の塩基の欠損に相当する。また、 ェク ソン 6の 5 ' 末端の塩基を基準と し、 一;^基前のイン トロ ンの塩基, 番号を- 1 番目 とすると、 位置 2531 の変異は、 -538 番目、 位置 2678 の 変異は- 391番目、 位置 2826の変異は- 243番目の塩基に相当する （図 1 参照） 。 なお、 Tが 28塩基連続する領域 （位置 2443〜2470) において は、 その数が 3塩基分増減する可能性があり、 変異型ゲノ ムの丁が 14 塩基連続する領域も同様にしてその,数が 3塩基分増減する可能性がある c 本発明に係る R Aの発症またはその発症可能性の判定方法 （換言すれ ば、 R Aの診断方法） および判定キッ ト （換言すれば、 R Aの診断キッ ト） において、 ゲノムおよびその転写産物、 たとえば、 mR NA、 c D N Aなどが利用でき、 たとえば、 m R N Aは、 必要に応じて c D N Aに 変換して利用すること もできる。 これらのゲノムは、 たとえば、 R Aの 発症またはその発症可能性の判定用のプローブと しても有用 ある。 さ らに、 たとえば、 これらの変異を 1つ以上含むゲノム断片も同様にプロ ブと して有用である。 '
また、 ゲノムから発現されるタンパク質などの転写産物についても変 異を検出.することができる。 ，これらのゲノムの転写産物についても R A の発症またはその発症可能性の判定用の試薬またはそれらの原料と して 有用である。
( a ) ゲノムの利用
本発明において、 ゲノ ムを利用する場合、 変異ゲノムの同定、 および R Aの診断 （即ち、 R Aの発症またはその発症可能性の判定） は、 たと えば、 '以下のようにして実施できる。
被験者のゲノムは、 常法によ り人体の全ての細胞よ り得ることが可能 であるが、 たとえば、 毛髪、 各臓器、 末梢リ ンパ球、 滑膜細胞などから 得るこ とができる。 また、 得られた細胞を培養し、 増殖したものから得 る こ と も でき る。 さ ら に、 得 られた ゲノ ム は、 例えば、 P C R Polymerase Cham Reaction ) 法 、 N A S B A ( Nucleic acid sequence based amplification) 法、 T M A (Transcription-mediated amplification ) 法 お よ び S D A ( Strand Displacement Amplification) 法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して使 用することができる。
ゲノムの'変異の検出方法と しては、 たとえば、 特に限定さ ないが、 ァリ ル特異的オリ ゴヌ ク レオチドプローブ法、 オリ ゴヌ ク レオチ ドライ ゲーシ ヨ ンア ツセィ (Oligonucleotide Ligation Assay) 法、 P G R— S S C P法、 P C R— C F L P法、 P C R— P H F A法、 イ ンベーダー 法、 R C A (Rolling Circle Amplification) 法、 プライマーオリ ゴべ ースエク ステ ンシ ョ ン (Primer Oligo Base Extension) 法など力 S挙げ られる。
.配列番号 1 の位置 21〜 4825 の塩基配列は、 たとえば、 以下のプライ マーの組み合わせ （ 1 〜 3 ) によ りゲノムから増幅される P C R産物の , ダイ レク トシークェンスにより決定できる。 尚、 配列番号 1の位置 1〜 20 の塩基配列は、 c D N Aと してジーンバンクに登録されている配列 (ァクセッショ ン番号 NM— 003790) である。 '
1 ： 配列番号 1 の位置 21〜 38 のセンスプライマーと配列番号 1 の位置 1517〜 1535のアンチセンスプライマー。
2 ： 配列番号 1 の位置 1051〜 1078 のセンスプライマーと配列番号 1 の —位置 4058〜4085 のアンチセンスプライマー。
3 ： '配列番号 1 の位置 4023〜 4043 のセンスプライマーと配列番号 1 の 位置； 1809〜 4825 のアンチセンスプライマー。
本発明で利用される変異は、 配列番号 1の位置 1755 の塩基の Aから Gへの置換、 配列番号 1 の位置 2531 の塩基の Cから Tへの置換、 配列 番号 1の位置 2678 の塩基配列の Aから Tへの置換、 配列番号 1の位置 2826 の塩基の Aから Gへの置換は、 配列番号 1の位置 1051〜 1078 のセ ンスプライマーと配列番号 1 の位置 4058〜 4085 のアンチセンスプライ マーによ り増幅される P C R産物のダイ レク トシークェンスによ り検出 でき、 さ らに配列番号 1の位置 2443〜 2456 の塩基の欠損が検出できる, 言い換えれば、 上記した 5つの塩基の変異が同時に生じている場合、 上 記 P C R産物によ り同時に検出できる。
' また、 配列番号 1 の位置 921 の塩基 Cから Tへの置換は、 配列番号 1 の位置 21〜 38 のセンスプライマーと配列番号 1 の位置 1517〜 1535 のァ ンチセンスプライマーとによ り増幅される P C R産物のシークェンスに より検出することができる。
つま り、 上記変異の検出は、 変異を含んだ領域に対するセンスプライ マーおよびアンチセンスプライマーを作製し、 ゲノ ムから増幅される P C R産物をダイ レク トシークェンスすることによ り検出できる。 配列番 号 1 のゲノムの 1つ以上の上記変異を検出することによ り、 被験者の R Aの診断 （発症またはその発症可能性の判定） を高精度に行う こ とがで さる。
'本発明で使用されるプライマーは、 常法によ り、 D N Aシンセサイザ 一などによ り作製することができる。
また、 これらの変異は、 適当な制限酵素を使用し、 切断されるゲノム 断片のサイズの違いをサザンブロ ッティ ングなどで検出することによつ ても検出することができる。
上記の変異のう ち、 配列番号 1 の位置 2443〜2456 の塩基の欠損は、 P C R産物をプラス ミ ドにサブクローニングし、 これをシークェンスす るこ とによつても検出できる し、 配列番号 1の位置 2369 ~ 2389 のセン スプライマーと配列番号 1'の位置 2514〜2535 のアンチセンスプライマ —とによ り増幅される P C R産物のサイズの相違によっても検出できる c ( b ) 転写産物の利用
本発明において、 ゲノムの変異によ り、 変化を生じる m R N A、 タン パク質などの転写産物を検出するこ とによつても被験者の R Aの診断 (発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行う ことができる。
たとえば、 転写産物と して; m R N Aを利用する場合、 変異の部分を含 む配列、 たとえば、 配列番号 1 の位置 1534〜3306 を発現ベクターに組 み換え、 細胞に トランスフエクシヨ ン し、 ベクター由来の m R N Aを比 較する方法及び mR NAから c D NAを作製し、 c DNAをシークェン スする方法などによって変異を検出できる。
具体的には、 配列番号 1の位置 1755 の塩基の Aから Gへの置換、 配 列番号 1 の位置 2443 2456の塩基の欠損、 配列番号 1の位置 2531 の塩 基の Cから Tへの置換、 配列番号 1 の位置 2678 の塩基の Aから丁への 置換、 配列番号 1 の位置 2826 の塩基の Aから Gへの変異を有するべク ターにおいて、 配列番号 1の位置 2636 2792 が保持された m R NAが 検出される。 この m R N Aの塩基配列の一部は、 配列番号 4であり、 ィ ン ト ロ ンの揷入によ り フ レームシフ トが生じ、 これが原因でア ミ ノ酸残 基の変異および終止コ ドンが出現する。 また、 この mR NAから発現さ れるタンパク質のァミ ノ酸配列は、 配列番号 5に示される。
また、 たとえば、 配列番号 1の位置 1534 3306 を発現ベクターに組 み換えたベクタ一、 組み'換えたベク ターで配列番号 1の位置 1755 に相 当する部分に Aから Gの変異を導入したもの、 配列番号 1 の位置 2531 に Cから Tの変異を導入しだもの、 配列番号 1 の位置 2678 に Aから T の変異を導入したもの、 配列番号 1の位置 2826 に Aから Gの変異を導 入したベクターをそれぞれ細胞に ト ラ ンスフエクシヨ ンし、 ベクター由 来の mR NAを比較する。
その結果、 配列番号 1の位置 2678 に Aから Tの変異を導入したべク ターのみで配列番号 1の位置 2636 2792 が保持された m R N Aが増幅 され、 この変異がスプライス異常を引き起こすことが確認でき、 これを 検出するこ と もできる。
たとえば、 転写産物と してタンパク質を利用する場合、 配列番号 2 の ァミ ノ酸配列において位置 159のァミ ノ酸残基が Aspから Gly 変異し たタンパク質を検出する方法、 上記の m R N Aのスプライシング異常が 原因で生じる配列番号 5 に示すタンパク質を検出する方法、 配列番号 5 のァミ ノ酸配列において位置 159のァミ ノ酸残基が Aspから Gl y へ変異 したタンパク質を検出する方法などが挙げられ、 好ま しく は、 配列番号 ' 2において位置 159 のアミ ノ酸残基が Aspから Gl y へ変異したタンパク ' 質を検出する方法が挙げられる。 この変異型タンパク質の検出は、 通常 のタンパク質のシークェンス方法に準ずればよいが、 たとえば、 変異型 タンパク質のみを認識する抗体を作製し、 E L I S A法で検出する方法、 タンパク質を単離し、 直接または必要に応じ、 酵素等で切断し、 プロテ インシークェンサ一を利用して変異を検出する方法、 アミ ノ酸の等電点 の変異を検出する方法および質量分析によ り質量の差を検出する方法が 挙げられ、 好ましく は、 変異型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、 E L I S A法で検出する方法が挙げられる。
' 一方、 R Aの直接原因の一つに、 アポ トーシスの過剰の抑制があるが、 . アポ ト一シスは、 たとえば、 以下の順で引き起こされる。
デス因子 （たとえば、 F a s リガン ド、 T N F、 A p o 3 L ( D R 3 リガン ド） および T R I A Lなどが挙げられる） がデスレセプター （ F a s、 T N F レセプターおよび D R 3などが挙げられる） に結合し、 さ らに、 アダプタータンパク質 （たとえば、 F A D Dおよび T R A D Dな ど） が結合し、 さ らにカスパーゼ分子群が関与し、 最終的にアポ トーシ スを引き起こす。
たとえば、 カスパーゼ 8は、 刺激によ り、 デスレセプター アダプタ 一タンパク質を介して結合し、 活性化カスパーゼ 8 となり、 さ らに下流 の力スパーゼ 3などを活性化させ、 最終的にアポトーシスを引き起こす, また、.カスパーゼ 8には、 カスパーゼ 8/aおよびカスパーゼ 8/b といつ たバリアントが知られている。
本発明で検出されるゲノムから発現するタンパク質は、 スプライシン グ異常によ り変異を有しており、 この変異によ り、 デス ドメイ ン領域を 欠損した D R 3の変異型が発現する。 D R 3は、 3量体を形成しており、 この 3量体のデス ドメイ ン領域にアダプタータンパク質が結合すること が'知られている。 この変異型レセプタ一も同様に正常型'レセプターと複 合体を形成す.るが'、 この複合体には、 アダプタ一タンパク質である T R A D Dが結合できず、 結果と してカスパーゼ 8が活性化されず、 アポト 一シスが誘導されない。 ' . よって、 本発明で検出される変異を有するゲノムから誘導される変異 型 D R 3は、 機能的な働きはなく 、 ドミナン トネガティ ブに作用すると 考えられる。
こ'れらは、 たとえば、 以下の'よ うな手順 （ 1 ) 〜 （4 ) で確認するこ とができる。
( 1 ) 被験者からの細胞の取得 · . , ' 診断に使用ずる細胞は、 常法により人体の全ての細胞より得ることが 可能であるが、 たとえば、 末梢リ ンパ球、 滑膜細胞、 各臓器などから得 ることができる。 これらの得られた細胞は、 適宜、 培養し、 増殖して利 用することもできる。
使用する細胞は、 好ましく は、 末梢血単核球が挙げられる。
( ( 2 ) 細胞の刺激
得られた細胞を試薬など.で刺激する。 刺激に利用する試薬は、 通常の 刺激に利用する試薬であれば特に限定されないが、 たとえば、 F a s リ ガン ド、 T N F、 D R 3 リ ガン ドな どのデス レセプタ一の リ ガン ド、 抗 F a s抗体、 ァクチノマイシン D、 放射線、 ダルコ コルチコイ ド、 ホノレ ボール 1 2— ミ リ ステー ト 1 3—アセテー ト （ PMA) 、 フ イ トへマ グルチニン （ P HA) などが挙げられ、 これらを 1種以上合わせて利甩 してもよい。 また、 好ま しく は、 D R 3 リ ガンド、 PMA、 P HAなど が挙げられ （ただし、 P M A、 P H Aによる刺激は D R 3を含めた様々 なシグナル伝達系に関与する） 、 よ り好ま しく は、 D R3 リ ガン ドなど が挙げられる。
試薬を添加する時間は、 特に限定されないが、 例えば、 1時間〜 72時 間程度添加すればよく、 好ま しく は、 12"〜48時間であればよい。
また、 別途、 刺激を与えない対照となる細胞を用意する。
( 3 ) 刺激した細胞および対照の細胞は、 たとえば、 可溶化緩衝液等で 溶解し、 カスパーゼ 8を検出する。
力スパーゼ 8の,検出は、 通常行われるタンパク質の検出方法であれ'ぱ. 特に限定されないが、 たとえば、' ウェスタンブロ ッテイ ングなどによ り' 実施するこ とができる。
ウェスタンブロ ッテイ ングは、 たと えば、 SDS—ポリ アク リルアミ ド ゲルによる電気泳動後、 PVDF 膜に転写し、 カスパーゼ 8に結合する標 識された抗カスパーゼ 3抗体で検出する方法が挙げられる。
( 4 ) 結果
健常者においては、 刺激した細胞でのカスパーゼ 8の発現量は、 刺激 をしない細胞でのカスパーゼ 8の発現量に対し、 低下するのに対し、 R A患者においては、 低下しない。
以上よ り、 RA患者において D R 3の異常によるアポ ト一シスの誘導 の阻害が示された。 これは、 R Aの発症要因であり、 すなわち、 ゲノム およびその転写産物の変異が R Aの診断 （発症または発症可能性の判 定） に利用できることが裏付けられた。
また、 上記の結果よ り、 測定されたカスパーゼ 8の濃度を刺激前後で 比較し、 その濃度が低下しない場合に被験者は、 R A,患者であるとの診 断または R Aの発症可能性が高いと判断すること もできる。 すなわち、 ゲノ ムの転写産物が影響する他の変異を検出することでも R A患者であ るとの診断または R Aの発症可能性が高いと判断することができる。
( c ) R Aの治療方法および治療薬剤と しての正常型 D R 3の利用
R Aの関節では、 滑膜細胞が増殖の一因となって関節破壊が引き起こ される。 したがって、 滑膜細胞にアポ トーシスを誘導するこ とのできる 抗 Fas抗体は、 R Aの治療薬と して有効であると考えられる。 実際、 現 在 R Aの治療薬と して抗 Fas抗体の臨床試験が進められている。 一方、 D R 3ゲノ ムの変異に起因した上記の変異型 D R 3は、 細胞にアポ トー シスを誘導することができないため、 これが D R 3に変異を持つ R A患 者の病因である と考えられる。 D R 3は Fa s と同様、 デスレセプターフ ア ミ リーに属し、 細胞にアポトーシスを誘導することができる。 したが つて、 D R 3に上記の変異を持つ R A患者に正常型 D R 3 を補完する と . 細胞にアポ トーシスが誘導されると考えら'れ、 抗 Fas抗体と同様、 R A の治療法と して有効であると考えられる。 そこで、 本発明は、 以下の R Aの治療方法および治療薬剤を提供するものである。 ' - 本発明に係るゲノ ムの転写産物である変異型 D R 3を持つ慢性関節リ ゥマチ患者に、 その変異を持たない正常型 D R 3または当該正常型 D R 3 をコー ドする D N A、 あるいは、 この D R 3のァゴニス ト と しての低 分子化合物を補完することを特徴とする慢性関節リ ゥマチの治療方法。 ■ 本発明に係るゲノムの転写産物である変異型 D R 3を持つ慢性関節リ ゥマチ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、 その変異を持たない . ' 正常型 D R .3または当該正常型 D R 3をコー ドする DNA、 あるいは、 この D R 3のァゴニス ト と しての低分子化合物を主成分とする慢性関節 リ ゥマチの治療薬剤。
実際、 後の実施例 1 0にて詳述するとおり、 正常型 D R 3の補完は R Aの治療法と して有用であるこ とが実験により認められた。
正常型 D R 3の補完方法は特に限定されるものではなく 、 たとえば、 , 公知のタンパク質発現系や遺伝子導入方法などを用いるこ とができ、 具 体的には、 哺乳細胞にタンパク質を発現させる場合に用いる発現べク タ 一やウィルスベクタ一などを用いた方法があげられる。 また、 D R 3の ァゴニス ト と して作用する低分子化合物を補完する場合、 当該低分子化 合物と して具体的に'は、 D R 3 リ ガン ドと して公知である Apo3L (カ レ ン トバイオロジー （Curr. Biol. ) 、 第 8卷、 第 525〜 528 頁、 1998 年） や、 ァゴ: iス ト と して作用する可能性のある抗 D R 3抗体などが挙げら れる。 抗 D R 3抗体と して具体的には、 イ ミ ュニティー （Irntrmnity)
〈第 6卷、 第 79〜88 頁、 I"7 年） に記載のポリ ク ローナル抗体などが 挙げられ、 これらは経口または静注などによって体内に投与する方法が 考えられる。 なお、 こ こでいう低分子化合物とは、 ペプチドなどのタン パク質を含めた化合物も示す。
' また、' 上記正常型 D R 3または当該正常型 D R 3をコードする D N A と、 上記 D R 3のァゴニス ト と しての低分子化合物は、 治療薬剤と して 択一的に使用されるだけでなく 、 組み合わせて使用すること もできる。 従って、 上記正常型 D R 3または当該正常型 D R 3をコー ドする D N A および、 上記 D R 3 のァゴニス ト と しての低分子化合物の少なく とも一 方を用いた治療方法も有効である。
( d Ϊ 慢性関節リ ゥマチの診断キッ ト
本発明に係る R Aの診断 （発症または発症可能性の判定） キッ トは、 上記のゲノ ムまたは転写産物の変異を検出できる試薬、 たとえば、 ブラ イマ一、 プローブ、 抗体などを含むものであれば特に限定されず、 さ ら にその他の試薬を組み合わせることにより得ることができる。
たとえば、 ゲノムを挨出するキッ ト と しては、 上記の変異を 1つ以上 含むゲノム領域を増幅 きるよ うに設計されたプライマーを含み、 さ ら に、 '上記の変異を 1つ以上含むゲノム領域を検出できるように設計され たプローブ、 制限酵素、 マクサムギルバー ト法およびチェーンターミネ —ター法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、 変異を検出する ために必要な試薬を 1つ以上組み合わせたキッ トが挙げられる。 また、 好ま しく .は、 蛍光標識されたダイデォキシヌク レオチドを含むキッ トが 挙げられる。 ' . ' ..
たとえば、 タンパク質を検出するキッ ト と しては、 変異型タンパク質 を認識する抗体を含むキッ トなどが挙げられる。
たとえば、 m R N Aを検出するキッ トと しては、 変異を含む領域を増 幅できるよ うに設計されたプライマーを含み、 さ らに、 変異を検出でき るよ うに設計されたプローブ、 制限酵素、 マクサムギルバー ト法および チェーンターミネーター法などの塩基配列決定法に利用される試薬など. 変異を検出するために必要な試薬を 1つ以上、 組み合わせたキッ トが拳 げられる。 また、 好ましく は、 蛍光標識されたダイデォキシヌク レオチ ドを含むキッ トが挙げられる。
これらの診断 （判定） キッ トを使用するこ と によ り 、 R Aの診断 （発 症またはその発症可能性の判定） を高精度に行うことができる。
本発明の診断 （判定） キッ トは、 たとえば、 プライマーを含むキッ ト の場合、 プライマーは、 本発明の変異の 1つ以上を検出できるものであ ' れば、 検出方法に応じて適宜選択することができるが、 好ましく は、 配 列番号 1 の位置 2717〜 2736 のセンスプライマーと配列番号 1 の位置 3284〜 3306 のアンチセンスプライマーと のセ ッ トおよび配列番号 1 の 位置 1051〜 1078,のセンスプライマーと配列番号 1 の位置 4058〜4085 の アンチセンスプライ マーとのセ ッ ト、 配列番号 ] の位置 21〜 38 のセン スプライマーと配列番号 1 の位置 1517〜 1535 のアンチセンスブライマ 一とのセッ ト、 さ らに好ま しく は、 配列番号 1 の位置. 1534〜 1556 のセ ンスプライマーと配列番号 1 の位置 3284〜3306 のアンチセンスプライ マーとのセッ ト、 配列番号 1の位置 667〜687 のセンスプライマーと配 列番号 1 の位置 1517〜 1535 のアンチセンスプライマーとのセ ッ トが挙 げられる。 さ らに、 プライマー成分に加えて、 本発明にかかる変異の存 在の検出に応じた一乃至数個の試薬を組み合わせたものであってもよい, なお、 かかる試薬は、 採用される検出方法に応じて適宜選択採用される が、 例えば制限酵素 A p a I 、 d A T P、 d U T P 、 d T T P 、 d G T P 、 D N A合成酵素、 R N A合成酵素等を挙げることができる。 さ らに 変異の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれて.)/、 てもよい。 図面の簡単な説明 図 1は、 .5つの変異の位置を示した図である。
図 2は、 正常型および欠損型の対立遺伝子の電気泳動パターンを示し た電気泳動写真である。 ' 図 3は、 サザンブロ ッテイ ングによ り 5つの変異によるスプライシン グ異常を検出した X線フィルム写真である。
図 4は、 サザンブロ ッテイ ングによ り配列番号 1 の位置 2678 の変異 が引き起こすスプライス異常を検出した X線フィルム写真である。
図 5 'は、 抗 GFP抗体で免疫沈降を行った後に、 抗 Xpre s s 抗体でゥェ スタ ンプロ ッ トを行つた結果の X線フイルム写真である。
図 6は、 抗 Hi s 抗体で免疫沈降を行った後に、 抗 Fl ag抗体でウェス タンブロ ッ トを行った結果の X線フイルム写真である。 発明を実施するための最良の形態
つぎに、 本発明を実施例および参考例によ り説明する。 尚、 実施例お よび参考例で使用される略号は、 以下の意昧を有する。
lOxPfu 緩衝液 ： 200mM ト リ ス塩酸 （pH7. 5 ) 、 ■ l OOmM 塩化力 リ ゥ ム、 l OOraM 硫酸アンモニゥム、 20mM 硫酸マグネシウム、 1 % ト ライ ト ン X— 100、 lmg/m l ゥシ血清アルブミ ン
TAE緩衝液 ： 0. 04M ト リ ス酢酸、 0. 002 エチレンジアミ ン四酢酸
10 L 緩衝液 ： l OOmM ト リ ス塩酸 （pH7. 5) 、 lOOm 塩化マグネシウム、 10mMジチ ^ス レイ トーノレ
ΙΟχΗ 緩衝液 ： 500mM ト リ ス塩酸 （pH7. 5 ) 、 lOOm 塩化マグネシウム、 l QmMジチオス レィ トール、 l OOOmM塩化ナ ト リ ウム
ΙΟχΚ 緩衝液 ： 200tnM ト リ ス塩酸 （pH8. 5 ) 、 lOOmM .塩化マグネシウム、 lOmMジチォス'レイ ト一.ル、 lOOOmM塩化カ リ ウム '
lOxPCR II緩衝液 ： 500mM塩化カリ ウム、 lOOmM ト リ ス塩酸 (pH8.3) lOxSSC： 1.5M塩化ナ ト リ ウム、 0. 15M クェン酸ナ ト リ ウム （pH7.0) 緩衝液 A ： lOOmM ト リ ス塩酸 （pH9.5) 、 300raM塩化ナ ト リ ウム
FCS ： ゥシ胎児血清
SDS ： ドデシル硫酸ナ ト リ ウム
BSA ： ゥシ血清了ルブミ ン
EDTA ： エチレンジァミ ン四酢酸
IPTG ： イ ソプロ ピルチオ一 |3 — D—ガラク トシ ド
X-gal ： 5 —プロモ 〜 4 —ク ロ ロ ー 3 —イ ン ド リ ル一 j3 — D—ガラ ク ト シド
PMA : ホルボーノレ 1 2 — ミ リ ステー ト 1 3 —アセテー ト
■ PHA ： フ ィ トへマグゾレチニン
可溶化緩衝液 ： 50mM ト リ 'ス塩酸 （pH7.5) 、 150rnM 塩化ナ ト リ ウム、 1 NP 0. 0.5%デォキシコール酸ナ ト リ ウム、 プロテア ^ゼイ ンヒ ビター カクテノレ
2x サンプル緩衝液 ： 50mM ト リ.ス塩酸 （ρΗ6· 8) 、 10%グリ セロール、 2% SDS、 2% /3 -メ ゾレカプ トエタノール、 0.1 %ブロモフエノールブルー TBS溶液 ： 20mM トリ ス塩酸 （pH7.6) 、 137mM塩化ナト リ ウム
Tween 20 ： ポリ オキシエチレン （ 2 0 ) ソノレビタンモノ ラウレー ト
TBS-T 溶液 ： 20mM ト リ ス塩酸 （pH7.6) 、 137mM 塩化ナ ト リ ゥ ム、 ϋ.05%T een20
HRP ： ホースラディ 'ンシュペルォキシダーゼ
洗浄緩衝液 ： 50raM ト リ ス塩酸 （pH7.5) 、 1M 塩化ナ ト リ ウム、 0.1% ' NP40、 0.05%デォキシコール酸ナ ト リ ウム、 プロテアーゼインヒ ビター カクテル
また、 M は mol/L を、 mM は、 rnmolVL を ； 各溶液は特に記載がない限り、 水溶液を意味する。
実施例 1 D R 3ゲノ ムの変異した塩基配列の検出
( 1 ) ゲノ ム D NAは、 グァニジンチオシァネー ト法 （ョ本輸血学会雑 誌、 第 40巻、 第 2号、 第 413頁、 1994年） によ り健常者および R A患 者の末梢血から調製した。 すなわち、 EDTA探血した末梢血 10ml に細胞 膜溶解液 く I液 ： 0.32Mシ ョ糖、 1% (v/v) トライ ト ン （Triton) X- 100、 5mM塩化マグネシウム、 12mM ドリ ス一塩酸 (ρΗ7.6) ) 20tnl をカロえ、 転 倒混和後 3000rpm で 10 分間遠心し、 核を回収した。 回収した核に核膜 溶解液 （II 液 ： 4M'グァニジンチオシァネー ト、 12mM'EDTA、 375mM塩化 ナ ト リ ウム、 0.5 % N广 ドデカノィルサルコシン酸ナ ト リ ウ'ム、 0.1M j3 —メノレカプ トエタ ノール、 12mM ト リ ス塩酸 （pH7.6) ) 5ml を加え、 55°Cで. 10 分間保温し、 エタノール沈殿によ りゲノ ム DNAを調製した c
( 2 ') 得られたゲノ ム D NA50ng に iLOxLA 緩衝液 （商品名 ： 宝酒造社. 製） 2.5 i l、 25tnM 塩化マグネシウム 2.5μ 1、 2.5mM デォキシヌク レオ チド混合液 4 l、 20 /i センス、 アンチセンスプライマ一をそれぞれ 0.25 μ U' D NAポリ メラーゼ試薬 (LA Taq DNA polymerase ： 酒造社 製） 1.25U を加え、 滅菌蒸留水によ り全'量を 25μ 1 と し、 P C R反応を おこなった。 P C R反応は、 熱変性 98°Cで 20 秒間、 アニーリ ング . 伸 長反応 68DCで 5 分間、 35 サイクルの条件で行った。 得られた P C R産 物は、 市販のキ ッ 卜 （QIAquic PCR Purification Kit ： キアゲン社 製） により精製した。 セ ンス、 アンチセンスプライマーは、 それぞれ配 列番号 1 の位置 1051〜 1078および 4058〜 4085 の塩基配列に対応するォ リ ゴヌク レオチ ドを使用した。
( 3 ) 精製 した P C R産物のシー ク ェ ンス反応は、 市販のキ ッ .ト ( BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 一キ ンエルマ一社製） を用いてダイターミネータ一法で実施した。
P C R産物 50ng 4こ混合試薬 (Terminator Ready Reaction Mix 一 キンエルマ一社製） 4μ 1、 プライマー l. Spmol を加え、 滅菌蒸留水で全 量を 10 μ ΐ にした。 シークェンス反応は、 96°Cで 10秒間、 50°Cで 5秒 間、 60°Cで 4分間、 25 サイ クルでおこなった。 反応液に 3M酢酸ナ ト リ ゥム （酢酸で pH5.2 に調整） 1 1 および 95%エタノール 25/i 1 を加え、 氷冷下に 15 分間冷却した。 反応液を 15000rpmで 20 分間遠心した後、 沈殿を 70%エタノール 125· 1 で洗浄し、 乾燥した。 得られた沈殿をホ レムアルデヒ ドノブル一,デキス ト ラ ン （5 : 1) 溶液 3 μ 1. に溶解し、 95 °Cで 2 分間加熱処理 し、 シー ク ェ ンサ一 （ ABI PRISM377 DNA Sequencer： パーキンエルマ一社製） を用いて塩基配列を決定した。
プライマーには、 配列番号 1 の位置 1535〜1552 の塩基配列に対応す るオリ ゴヌ ク レオチ ド、 および配列番号 1 の位置 2892〜2912 の相補鎖 に対応するオリ ゴヌク レオチドを使用した。
その結果、 R A患者の D R 3ゲノムには、 配列番号 1 に示した健常者 ゲノ ムにおけ.る以下の （ 1 ) 〜 ( 5 ) に示す一塩基多型および塩基の欠 損が見出された。 '
( 1 ) 位置 1755の塩基のアデニン （A) からグァニン （G) への置換
( 2 ) 位置 2443〜2456の塩基の欠損
( 3 ) 位置 2531 の塩基のシ トシン （C) からチミン （T) への置換 (4 ) 位置 2678の塩基のアデニン （A) からチミ ン （T) への置換
( 5 ) 位置 2826の塩基のアデ ン （A) からグァニ ン （G) への置換 実施例 2 配列番号 1の位置 2443〜2456の塩基配列の欠損の検出'
( 1 ) ゲノ ム D NA50ng に lOxLA緩衝液 （商品名 ： 宝酒造社製） 2: n 1、 25mM塩化マグネシウム 2.5 1、 2.5mMデォキシヌク レオチ ド混合液 4 μ 1、 20 μ センス、 アンチセンスプライマ一それぞれ 0.25 μ し D Ν Αポリ メ ラーゼ試薬 （LA Taq DMA polymerase ： 宝酒造社製） 1.25U を 加え、 滅菌蒸留水により全量を 25μ 1 と し、 P C R反応をおこなつた。 P C R反応は、 熱変性 95°Cで 1 分間、 ァニーリ ング 63°Cで 1 分間、 伸 長反応 72°Cで 1 分問、 35 サイ クルの条件で行った。 用いたセンス、 了 ンチセンスプライマ一には、 それぞれ配列番号 1 の位置 1534〜1556 の 塩基配列に対応するオリ ゴヌ ク レオチ ド、 配列番号 1 の位置 3284〜 3306 の塩基配列に対応するオリ ゴヌ ク レオチ ドを使用した。 分子量マ 一力一 （ lOObp ladder ： ニューイ ングラ ン ドバイオラボ （NEB) 社製） と共にァガロースゲル （1% Agarose S ： 二ツボンジーン社製） にて TAE 緩衝液中で電気泳動した。 約 1.5kbp の P C R産物をゲルかち回収 し、 巿販キッ ト （QIAq'uick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） によ り 精製した。 得られた P C R産物 50ng、 TA ク ローニ ングベク タ一 (pT7BlueT ベク ター ： ノノく一ジェン (Novagen) 社製） 25ng T4DNA リ ガーゼ溶液 (DNA ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） 3 1 と混合し、 16°Cで 2時間ライゲーシヨ ンをおこなった。
( 2 ) 得られたラィゲーショ ン液全量にコンビテン ト細胞 DH5aを混合 し、 氷冷下に 30 分間イ ンキュベー ト した。 次いで、 42°Cのウォーター バスに 20 秒問浸けてヒー トショ ックを加えた後、 水冷下に 2 分間冷却 した。 これに SOC培地 900 μ 1 加え.、 37°Cで 1 時間振と う培養した。 こ の培養液を X- gal 0. lmM、 IPTGO. ImMおよびアンピシリ ン 50 μ g/ml を含 む L Bプレー トに接種し、 37°C、 終夜培養してコ ロニーを形成させた。
( 3 ) 形成したシングルコ ロニーを ピックア ッ プし、 アンピシ リ ン 50 μ g/ml を含む L B培地 1.5 l に植え継ぎ、 37°Cで終夜培養した。 培養 液を遠心 し、 上清を除去した菌体を溶液 1 ( 50tnM グルコース、 lOraM EDTAs 25mM ト リ ス塩酸 （pH8. 0) ) 100 1· に懸濁した。 アルカ リ溶液
(0. 2M 水酸化ナ ト リ ウム、 1%SDS) 200 1 を加え、 穏やかに混和後、 氷冷下に 5 分間ィンキュベー ト し、 さ らに 3Μ 酢酸力 リ ゥム溶液 （酢酸 で ρΗ5. 5 に調整） 150 1 を加え、 氷冷下に 5 分間イ ンキュベート した。 得られた溶液を 12000rpm で 5 分間遠心した後、 上清にフエノ ルノク ロ ロホルム （ 1 ： 1 ) 溶液 400 / l を加え、 12000rPniで 5分間遠心した。 水層にエタノール 800 / 1 を加え、 12000rpmで 5分間遠心した後、 上清 を除去した。 沈殿を 70%エタ ノールで洗浄後、 乾燥させ、 滅菌蒸留水 50 μ 1 に溶解させた。 得られた溶液に lmg/mlRNase A (Sigma社製） 0. 5 μ 1 を加え、 37°Cで 1 時間イ ンキゴベー ト した後、 20%ポリエチレング リ コール Z2. 5M 塩化ナ ト リ ゥム溶液 30 1 を加え、 氷冷下に 1 時間放 置した。 得られた溶液を I2000rp/n で 10 分間遠心し、 沈殿を 70%エタ ノールで洗浄し、 乾燥させ、 滅菌蒸留水 30 μ 1 に溶解させた。 .
( 4 ) ' プラス ミ ド D N Aのシークェンス反応は、 市販キッ ト （BigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ： ノ ーキンエ ノレマ—— 社製） を用いたダイターミネーター法で実施した。
プラ ス ミ ド D N A 300ng に混合試薬 ( Terminator Ready Reaction Mix ： パーキンエルマ一社製） 4 1.、 プライマー 1. 6pmol を加え、 滅菌 蒸留水で全量を ΙΟ μ Ι にした。 シークェンス反応は、 96°Cで 10 秒間、 50°Cで 5秒間、 60°Cで 4 分間、 25 サイクルでおこなった。 反応液に 3M 酢酸ナ ト リ ウム （酢酸で pH5. 2 に調整） 1 μ 1 および 95%ェタノール 25 1 を加え、 氷冷下に 15分間冷却した。 得られた溶液を I5000rpraで 20 分間遠心した後、 沈殿を 70%エタノール 125 /2 1 で洗浄し、 乾燥した。 得られた沈殿をホルムアルデヒ ド /ブルーデキス トラン （5 : 1) 溶液 3 1 に溶解 し、 95 °Cで 2 分間加熱処理 し、 シーク ェンサ一 .（ ABI PRISM377 DNA Sequencer ： パーキンエルマ一社製） を用いて塩基配列を 決定した。 プライマーは、 配列番号 1 の位置 2892〜2912 の相補鎖の塩 基配列に対応す,るオリ ゴヌク レオチ ドを使用した。 . ,
.その結果、 変異を有するゲノ ムを増幅した P C R産物をサブク ロー二 ングしたク ローンは、 配列番号.1の位置 2443〜2456 の塩基配列を欠損 していた。
実施例 3 電気泳動による配列番号 1 の位置 2443〜2456 の塩基配列の 欠損の検出
ゲノ ム D N A50ng に lOxPf'u緩衝液 （ス トラ タジーン （Stratagene) 社製） 2. 5 1、 2, 5tnM デォキシヌク レオチ ド混合物 2 μ 1、 20 M のセン ス、 アンチセンスプライマーをそれぞれ 0. 25 μ 1、 D N Αポリ メ ラーゼ 試薬 ( Pfu DNA polymerase ： ス ト ラ タ ジー ン ( Stratagene ) 社製） 1. 25U を加え、 滅菌蒸留水によ り全量を 25 と し、 P C R反応をおこ なった。 P C R反応は、 95でで 1 分間の後、 熱変性 95°Cで 1 分間、 ァ ニーリ ング 55°C,で 1 分間、 伸長反応 72。Cで 1 分間、 40 サイ クルの条件 で行った。 プライマーは、 センス、 アンチセンスプライマーと して、 そ れぞれ配列番号 1 の位置 2369〜2389 め塩基配列に対応するオリ ゴヌク レオチ ド、 配列番号 1の位置 2514〜2535 の塩基配列に対応するオリ ゴ ヌ ク レオチ ドを使用 した。 増幅した P C R産物は、 分子量マーカ一 (lOObp ladder： ニューイ ングラ ン ドバイオラボ （NEB) 社製） と共に ァガロースゲル （3%GTG Agarose ： 宝酒造社製） にて TAE緩衝液中で電 気泳動し、 ェチジゥムブ口マイ ド溶液にて可視化した。 結果を図 2 示 す。
正常型と欠損型の対立遺伝子を保有する検体では、 分子量の異なる 2 つの増幅産物が検出されるが、 正常型の対立遺伝子のみ保有する検体で は分子量の大きい産物のみが検出された。
実施例 4 配列番号 1の 5つの変異によるスプライシング異常の検出 . ( 1 ) R Aまたは健常者のゲノ ム D N A 50ng に lOxLA 緩衝液 （商品 名 ： 宝酒造社製） 2· 5μ 1、 25mM 塩化マグネシウム 2·5μ 1、 2.5mM デォ キシヌク レオチ ド混合液 4μ 1、 20 Μセンス、 アンチセンスプライマー そ れ ぞ れ 0.25 μ 1 、 D N A ポ リ メ ラ ー ゼ 試薬 （ LA Taq DNA polymerase： 宝酒造社製） 1.25Uを加え、 滅菌蒸留水によ り全量を 25 μ
1 と し、 P C R反応をおこなった。 P C R反応は、 95°Cで 1 分間の後、 熱変性 95°Cで 1 分間、 ァニー リ ング 63°Cで 1 分間、 伸長反応 72°Cで 2 分間、 35 サイクルの条件で行った。 この反応に使用 したプライマーを 以下に示す。
センスプライマー A :
6 )
アンチセンスプライマー A ：
-3' (配列番 号 7 )
増幅した' P C R産物は、 エタ ノ ール沈殿によ り精製した。 得られた P C R産物に Kpn I (宝酒造社製） 10unit、 10xL 緩衝液 （宝酒造社製） 3 μ ΐ を加え、 滅菌蒸留水で全量を 30 l にした。 この反応液を 37°Cで 4 時間保温後、 Xho I (宝酒造社製） 10unit、 ΙΟχΗ 緩衝液 （宝酒造社製） 4μ 1 を加え、'滅菌蒸留水で全量を 40μ 1 にし、 さらに 37°Cで 4 時間保 温した。 この反応液を分子量マーカー （lkbp ladder ： フェルメ ンタス 社製）' と共にァガロースゲル （ 1 % Agarose S ： 二ツボンジーン社製） にて TAE 緩衝液中で電気泳動した。 得られた約 1.8kbp の P C R産物を ゲノレ力 ら回収.し、 販キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲ ン社製） によ り精製した。 '
( 2 ) pcDNA3.1 ベク ター （商品名 ： イ ンビ ト ロジェン社製） 3 g に pn I (宝酒造社製） 10unit、 10xL緩衝液，（宝酒造社製） 3μ 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 30μ 1 に.した。 この反応液を 37°Cで' 4 時間保温後、 Xho I '(宝酒造社製） 10unit、 ΙΟχΗ緩衝液 （宝酒造社製） 4μ 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 40 1 にし、 さ らに 37°Cで 4 時間保温した。 この 反応液を分子量マーカー （lkbp ladder ： フェルメ ンタ ス社製） と共に ァガロースゲル （1% Agarose S ： 二ツボンジーン社製） にて TAE 緩衝 液中で電気泳動した。 5.6kbp の D N Λバン ドをゲルから回収し、'市販 キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） によ り精製し た。 '
( 3 ) 実施例 4 ( 1 ) で精製した P C R産物 50ng と実施例 4 ( 2 ) で 精製した pcDNA3.1 べクター 35ng を T4DNA リ ガーゼ溶液 （DNA ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） 4μ 1 と混合し、 16°Cで 4時間 ライゲーシヨ ンをおこなった。
( 4 ) 実施例 2 ( 2 ) および （ 3 ) の方法と同様にして トランスフォー メーシヨ ンをおこない、 プラスミ ド D N Aを調製した。
( 5 ) プラ ス ミ ド D N Aのシーク ェンス反応は、 巿販キッ ト （ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ： ノヽー ンエノレマ一 社製） を用い、 ダイターミネータ一法で実施した。
プラ ス ミ ド D N A 300ng に混合試薬 ( Terminator Ready Reaction Mix ： パーキンエルマ一社製） 4/ 1、 プライマー 1.6ptnol を加え、 滅菌 蒸留水で全量を ΙΟμ Ι にした。 シークェンス反応は、 96°Cで 10 秒問、 50°Cで S秒間、 60°Cで 4分間、 25 サイクルで実施した。 反応液に 3M酢 酸ナ ト リ ウム （酢酸で pH5.2 に調整） 1 1 および 95%エタノール 25 1 を加え、 氷冷下に 15分間冷却した。 得られた溶液を 15000rpm で 20 分 間遠心した後、 沈殿を 70%エタノール 125/i l により洗浄し、 乾燥した c 得られた沈殿をホルムアルデヒ ドノブル.一デキス ト ラ ン （5 : 1) 3 M 1 に溶解させ、 95°Cで 2 分間加熱処理した。 ついで、 シークェンサ一 (ABI PRISM377 DNA Sequencer ： パーキンエルマ一社製） を用いて塩基 配列を决定し、 配列番号 1の位置 Π55 の塩基の Aから Gへの置換、 配 列番号 1 の位置 2443〜2456の塩基の欠損、 配列番号 1の位置 2531の塩 基の Cから T の置換、 配列番号 1の位置 2678 の塩基の Aから丁への 置換、 配列番号 1の位置 2826 の塩基の Aから Gへの置換を有する変異 型べク タ および変異を持たない正常型ベク ターを構築した （図 1 参 照） 。
( 6 ) 構築した正常型または変異型ベク ター 10 μ g および RPMI1640Z 20%FCS 0.25ml に懸濁した 1x10s個のジャーカ ッ ト （Jurkat) 細胞を 0. 4mm ギャ ップのキュベッ ト （ビーェム機器社製） にいれ、 室温で 10 分問静置した。 エレク ト口ポレーター （ジーンパルサー 11 ： バイオラ'ッ ド社製） を用い、 200V、 950 ix F の条件で ト ラ ンスフエク シヨ ンを実施 した。 電気ショ ック後、 氷冷下に 10 分間静置し、 KPMI1640Z 10%FCS , で全量を 4ml と し、 6 ゥエルプレー トで 37°C、 5% C02で 24時間培養し た。 この細胞に PMA (シグマ社製） 20ng/ml および PHA (ディ フコネ;! 製） 1 /i g/ml を加え、 さ らに 24時間培養した。
得られた細胞を回収 し、 リ ン酸緩衝食塩水で洗浄後、 Trizol 試薬 (商品名 ： ギブコ社製） を用いた、 チォシアン酸グァニジンフエノール + クロ 口ホルム （AGPC) 法によ り、 total RNA を調製した c total RNA は, さ らに DNase (二ッポンジ,ーン社製） で'処理した後、 得られた total RNA 1 μ κ を逆転写反応用キッ ト （ RNA PCRKit ： パーキンエルマ一社 製） を用い、 通常の逆転写反応によ り c D N Aを調製した。
得られた c D N A溶液 5 μ 1 に lOxPCR II 緩衝液 （パーキンエルマ一 社製） 2 μ 1、 25raM 塩化マグネシウム 1 μ 1、 20 Μ センス、 アンチセン スプライマーをそれぞれ 0. 25 /i l、 D 'N Aポリ メ ラーゼ試薬 （Ampli Taq Cold DNA polymerase ： ノ ーキンエルマ一社製） 1. 25U' をカロえ、 滅 菌蒸留水によ り全量を 25 μ 1 と し、 P C R反応をおこなった。 P C R反 応は、 95°Cで 10分間の後、 熱変性 95°Cで 1分間、 ァニーリ ング 55°Cで 1 分間、 伸長反応 72°Cで 1 分間を 40サイクル、 最後に 72°Cで 5分間の 伸長反応の条件で行った。 この反応に使用したセンス、 アンチセンスプ ライマーは、 以下のとおりである。
センスプライマー B ： 5' - ATCCGCTTCCTGCCCC - 3' (配列番号 8 )
アンチセンスプライマー B ： 5' -GGGGCCACCTCCAGTGCC-3' (酉己歹 U番号 9 ) なお各々の塩基配列は、 センスプライマー A、 アンチセンスプライマ '一 Aの一部の塩基配列に対応するォリ ゴヌク レオチドである。
( 7 ) 得られた R T— P C R溶液を分子量マーカー （1 kbp ladder ： フ エノレメ ンタス社製） と共にァガロースゲル （2% Agarose S ： 二 ツボン ' ジーン社製） にて TAE緩衝液中で電気泳動し、 ェチジゥムブロマイ ド溶 液にて可視化 した。 P C R産物をゲルから切 り 出 し、 市販キ ッ ト (QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） によ り精製した。 得 られた P C R産物 50ng、 TA ク ローユングベクター （PT7BlueT ベク タ 一： ノバ一ジェン （Novagen) 社製） 25ng を T4DNA リガーゼ溶液 （DNA ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） 3 μ 1 と混合し、 , 16°Cで 2時間ライゲーシヨ ンをおこなった。 .'·
( 8 ) 実施例 2に記載の方法と同様にしてプラスミ ド D N Aを調製し.、 塩基.配列を決定した。 プライマーは、 センスプライマー Bおよびアンチ センスブライマー Bで表わされるオリ ゴヌク レオチ ドを使用した。 - その結果、 '配列番号 1の位置 1755 の塩基配列が Aから Gへの変異、 配列番号 1 の位置 2443〜 2456 の塩基配列の欠損、 配列番号 1 の位置 2531 の塩基配列がじから Tへの変異、 配列番号 1 の位置 2678 の塩基配 列が Aから Tへの変異、 配列番号 1の位置 2826 の塩基配列が Aから G への変異を有する変異型べク タ一の: mR N Aに配列番号 1 の位置 2636 〜 2792が保持された： mR N Aを検出した。
実施例 5 サザンブロ ッテイ ングによるスプライス異常の検出
( 1 ) 実施例 4 ( 6 )、で得た R丁一 P C R溶液を分子量マーカー '（ 1 kbp' ladder： フェルメ ンタス社製） と共にァガロースゲル （2%Agarose S ： 二ツボンジーン社製） にて TAE 緩衝液中で電気泳動を行った。 ゲル を変性溶液 （0.5M水酸ナ ト リ ウム、 1.5M塩化ナ ト リ ウム） に 25分間浸 し、 さ らに中和溶液，（0.5M ト リ ス塩酸 （pH7.5) 、 1.5 塩化ナ ト リ ゥ ム） に 30 分間浸した。 キヤビラ リ一法によ り、 ゲル内の D N Aをナイ ロ ンメ ンブレン （ Hybond - N+ ： ァマシャ ムフアルマシア社製） にー晚 ト ラ ンスファーし、 U V ロス リ ンカー （ B本.ジェネティ ック社製） によ り D N Aをメ ンブレンに固定した。 キヤ ビラ リ一の緩衝液は、 lOxSSC を用いた。 ハイブリ ダィゼーシ.ヨ ンおよび D N A断片の検出は、 Gene Images 3 ' 一オリ ゴラベリ ング ' CDP-Star 検出システム （アマシャム フアルマシア社製） を用いて以下のとおり に行った。 DNAを固定した メ ンブレンをハイブリ ダィゼーシヨ ン緩衝液 （5XSS (：、 0.1% (w/v) SDS、
0.5% (w/v) デキス ト ラ ン硫酸分子量 50 万 （シグマ社製） 、 キッ トに 付属の 5% (v/v) プロ ッキング試薬） に浸し、 59。Cで 30分間振と う さ せながらプレハイプリ ダイゼーシヨ ンを行った。
( 2 ) 巿販キッ ト （Gene Images 3 ' —オリ ゴラベリ ングキッ ト ： アマ シャムフアルマシア社製） によ り、 配列番号 1 の位置 2715〜2736 の塩 '基配列を有するオリ ゴヌク レオチドをフルォレセィン標識してプローブ と して使用した。 このプローブを lOng/tnl となるよ うにプレハイプリ ダ ィゼーシヨ ン溶液に加え、 さ らに振と う させながら 59°Cで 2時間ハィ ブリ ダィゼーシヨ ンを行った。 緩衝液 （5xSSC、 0, 1% (w/v) SDS) で 5 分間 2 回洗浄後、 予め 50°Cにした緩衝液 （lxSSC、 0.1% (w/v) SDS) ' で 15 分間 2 回洗浄した。 メ ンブレンを緩衝液 Aで軽く リ ンス し、 緩衝 " 液 Aで 10 倍希釈したキッ トに付属のブロ ッキング試薬を用いて室温 1 時間ブロ ッキングした。 メ ンブレンを緩衝液 Aで軽く リ ンス し、 抗体希 釈溶液 （キッ トに付属のアルカ リ フォスファタ ゼ標識抗フルォレセィ ン抗体を 0.5% (w/v) BSA を含む緩衝液 A で 5000倍希釈した溶液） に ， 浸し、 室温で 1時間イ ンキュベー ト した。 0.3% (v/v) Tween20 含有緩 衝液 Aで 10 分間、 3 回の洗浄を室温で振と う させながら行った。 メ ン ブレンを緩衝液 Aで軽く リ ンス し、 キッ トに付属の検出試薬に浸した後、 X線フィルム （フジフィルム社製） に露光させた。 結果を図 3 に.示す。 変異型べクターのみでプローブと結合する転写産物が検出され、 5つ の変異によるス'プライス異常が検出された。
実施例 6 配列番号 1の位置 2678 の変異が引き起こすスプライス異常' の検出.
( 1 ) 実施例 4 ( 5 ) で調製した正常型ベクターに配列番号 1 の位置
1755 の塩基配列に Aから Gへの変異、 配列番号 1 の位置 2531 の塩基配 列に Cから Tへの変異、 配列番号 1 の位置 2678 の塩基配列に Aから T への変異、 配列番号 1 の位置 2826 の塩基配列に Aから Gへの変異を市 販キツ ト ( QuikChangeTMSite - Directed Mutagenesis kit ： ス ト フ タ ン ーン （Stratagene) 社製） を用いて以下の方法で作製した。
( 2 ) 正常型べクタ一 50ng に、 2.5mMデォキシヌ ク レオチ ド混合液 1 μ 1、 lOxPfu 緩衝液 2.5 μ 1、 D Ν Αポリ メ ラーゼ試薬' （P.fu Turbo DNA polymerase ： ス 卜 ラ タジーン (Stratagene) 社製） 2.5U、 センス、 アン チセンスプライマーそれぞれ 62.5ng を加え、 滅菌蒸留水で全量を 25μ 1 にした。 P C R反応は、 95°Cで 30秒間の後、 熱変性 95°Cで 30秒間、 ァニーリ ング 55°Cで 1 分間、 伸長反応 68°Cで 15分間を 12サイクルの 条件で行った。 増幅した産物を Dpn I で消化し、 この反応液 1 μ 1 とコ ンピテン ト細胞 XL- 1 ブルーを混合し、 水冷下に 30分間ィンキュベー ト した„ ついで、 42°Cのウォーターバスに 30 秒間浸け、 ヒー トショ ック を加えた後、 氷冷下に， 2分間冷却した。 これに 培地を加え、 37°Cで 1 時間振と う培養した。 この培養液をアンピシリ ン 50M g/mレを含む L Bプレー トに接種し、 37°C、 終夜培養してコロニーを形成させた。 実施 例 2 ( 3 〉 〜 （ 4 ) に記載の方法と同様にしてプラスミ ド D N Aを調製 し、 塩基配列を決定し、それぞれの部位に変異を導入した変異型べクタ 一を作製した。この反応に用いたプライマーは、. 以下に示すとおり であ る。 '
• 配列番号 1の位置 1755の塩基配列に Aから Gへの変異導入
センスプライマ一 ： 5' -GGTTCCCGCAGAGGTACTGACTGTGGGA-3' (配列番号 1 0 )
ァンチセンスプライマ一 ： 5' -TCCCACAGTCAGTACCTCTGCGGGAACC-3' (酉己 列番号 1 1 ) .
■ 配列番号 1 の位置 2531 の塩基配列にじから Tへの変異導入
センスプライマー ： 5' - CTTGGCTCACTATAACCTCTGCTGCCTGGG - 3' (配列番 号 1 2 ) '
ア ンチセ ンスプライ マー ： 5' -CCCAGGCAGCAGAGGTTATAGTGAGCCAAG-3' (配列番号丄 3 ) '
' 配列番号 1 の位置 2678 の塩基配列に Aから Tへの変異導入
センスプライマー ： 5' - GATGGTCTTGATCTCCTGACCTCGTGATCC - 3'· (配列番 号.1 4 )
アンチアンチセンスプライマー ：
5； -GGATCACGAGGTCAGGAGATCAAGACCATC-3' (配歹 I]番号 i 5 )
■ 配列番号 1 の位置 2826 の塩基配列に Aから Gへの変異導入
センスプライマー ： 5' -GCAACAGGGGACAGAATAGGCAAAATCCCTG-3' (酉己歹 lj 番号 1 6 )
アンチセ ンスプライ マー ： 5' -CAGGGATTTTGCCTATTCTGTCCCCTGTTGC-3' (配列番号 1 7 )
( 3 ) 実施例 4 ( 6 ) の方法と同様にして作製した変異型ベクターをジ ヤーカッ ト （Jurkat) 細胞に ト ラ ンスフエク シヨ ン し、 実施例 4 ( 6 ) と同様の条件で R T— P C Rをおこなった。 さ らに、 実施例 5に示す方 法と同様にしてサザンプロ ッティ ングをおこなった。 結果を図 4に示す。 配列番号 1 の位置 2678 に Aから Tの変異を導入したベクターのみに おいて、 プローブと結合するバン ドが検出され、，この変異がスプライ ス 異常を引き起こすことが明らかとなった。
実施例 7 R A患者に対して変異の検出
実施例 1 ( 1 ) 〜 （ 3 ) の方法と同様にして R A患者に対し、 ゲノ ム の変異を検討した。 ' ，
その結果、 患者本人以外の親族に R A発症者がいる患者群 （以下、 R A家系と称する） の R A患者で 60例中 6例、 R A家系の健常者で 31例 中 4例、 患者本人以外の親族に R A発症者がいない患者群の R A患者で 494 例中 11 例、 一般健常者で 481 例中 3 例においで変異が観察さ 、 R A家系において著しく高頻度に変異が'見出された。 なお、 観察された 変異の多く はへテロ接合体であった。
実施例 8 D R 3ゲノ ムの変異した塩基配列の検出
( L ) ゲノム D NAは、 グァニジンチオシァネー ト法 （日本輸血,学会雑 誌、 第 40卷、 第 2号、 第 413 頁、 1994年) によ り末梢血から調製した', すなわち、 EDTA 採血した丰梢血 10ml に細胞膜溶解液 （I 液 ： 0.32M シ ョ糖、 1% (v/v) トライ ト ン （Triton) X- 100、 5mM 塩化マグネシウム 12mM ト リ ス一塩酸 （pH7.6) ) 20ml を加え、 転倒麁和後' 3000rpm で 10 分間遠心し、 核を回収した。 回収した核に核膜溶解液 （II 液 ： 4M グァ 二ジンチオシァネー ト、 12mM EDTA 375taM. 塩化ナ ト リ ウム、 0.5% N— ドデカノィルサルコシン酸ナト リ ウム、 0.1MJ3—メルカプトェタノ一ノレ 12raM ト リ ス塩酸 （pH7.6) ) 5ml を加え、 55°Cで 10分間保温し、 エタ ノール'沈殿によ り ゲノム DN Aを調製じた。
( 2 ) 得られたゲノ ム D N A50ng に lOxPCR II 緩衝液 （商品名 ： パー キンエルマ一社製） 2.5/ l 25ra 塩化マグネシウム 2.5 μ 1 2mM デォ キシヌク レオチド混合液 5 μ 1 20/ι Μセンス、 アンチセンスプライマー をそれぞれ 0.25/i l D NAポリ メ ラーゼ試薬 (AmpliTaq GOLD .:
キンエルマ一社製） 1.25U を加え、 滅菌蒸留水によ り全量を 25 μ 1 と し、 P C.R反応を行った。 P C R反応は、 95°Cで 10 分間の酵素活性化反応 後、 熱変性反応 95°C1 分間、 アニー リ ング反応 60°C1 分間、 伸長反応 72°C2 分間を 40 サイ クル、 最後に伸長反応を 72°Cで 5 分間行った。 得 られた P C R産物は、 自動分注ロボッ ト （バイオメ ック 2000 ： ベック マンコールター社製） によ り マルチスク リ ーン PCR (商品名 ： ミ リ ポア 社製） を用いて精製した。 センス.、 アンチセンスプライマ一は、 それぞ れ配列番号 1の位置 21 38および 1517 1535の塩基配列に対応するォ リ ゴヌク レオチ ドを使用した。 .
( 3 ) 精製 した P C R産物のシー ク ェ ンス反応は、 市販のキ ッ ト
( BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ヽーキ ンエルマ一社製） を用いてダイターミネータ一法で実施した。
P C R産物 50ng【こ混合試薬 (Terminator Ready Reaction Mix： パー キンエルマ一社製） 4/i l、 プライマー 1.6pmol を加え、 滅菌蒸留水で全 量を 10 l にした。 シークェンス反応は、 96。Cで 10 秒間、 50°Cで 5秒 ' 間、 60°Cで 4 分間、 25 サイクルでおこなった。 シークェンス反応後の サンプルからの未反応デォキシヌ ク レオチ ドの除去は、 セフアデックス G - 50 (ア マシャムフ ア ルマシア社製） およびマノレチス ク リ ーン- HV (商 品名 ： ミ リ ポア社製） を用いたゲル濾過法によ り行った。 精製したシー クエンス産物に滅菌蒸留水を 10 μΊ添加し、 96°Cで 2分間加熱処理し、 シークェンサ一 (ABI PRIS 3700 DNA Analyzer ： ノ —キンエ ノレマ一社 製） を用いて塩基配列を決定した。 - シークェンスプライマーは、 配列番号 1の位置 1073-1102の相補鎖の 塩基配列に対応するオリ ゴヌク レオチ ドを使用した。
その結果、 R A患者の D R 3ゲノムに、 配列番号 1の位置 921 の塩基 Cから Tへの一塩基多型が見出された。 .
位置 921 の塩基は、 c D NAと してジーンバンク に登録されている配 列 （ァクセッショ ン番号 NM- 003790) のェクソン 3 の 5' 末端の塩基を 基準と し、 一塩基前のイ ン ト ロ ンの塩基番号を- 1番目 とすると、 ，.53番 目に相当する。
実施例 9 R A患者に対しての変異の検出 '
実施例 （ 1 )から （ 3 ) の方法と同様にして R A患者に対して、 ゲノ ムの変異を検討した。
その結果、 R A家系の R A患者で 43 例中 6 例、 RA家系の健常者で
' 25例中 4例において変異が見出された。 これら変異が見出された 10 人 では配列番号 1 の位置 1755、 2531、 2678、 2826 の各一塩基変異および 位置 2443〜2456 の塩基欠損が同時に検出された。 言い換えれば、 上記 した 6つの塩基の変異または欠損が同時に生じている。 なお、 観察され た変異はいずれもへテロ接合体で つた。
参考例 1 ' 正常型および変異型 D R 3 タンパクの結合実験
( 1 ) D R 3 c D N Aの調製
へパ リ ン採血した R A患者の末梢血 10ml を等量の リ ン酸緩衝液 (PBS) と混和し、 これを Lymphoprep (第一化学薬品社） 20ml に重層し た。 1500rpmで 30分間遠心後、 末梢血単核球の層を'採取し、 PBSで洗浄 した。 細胞を培地 （RPM11640八 0%FCS) に 5xl05cellS/ml ,となるよ う懸 ' 濁し、 この.細胞懸濁液 10ml を 10cm dish に播き、 PMA (シグマ社） 20ng/ml および PHA (ディフコ社） l g/tnl の刺激下、 37°C、 5%C02の条 件で 48時間培養した。 得られた細胞に Trizol試薬 （商品名 ： ギブコ社 製） を 1ml 力！]え、 チォシアン酸グァニジンフ エ ノ ールク ロ 口 ホルム . (AGPC) 法によ り total 'RNA を調製した。 total RNA は逆転写反応用キ ッ ト （RNA PCR Kit ： パーキンヱルマー社製） を用い、 通常の逆転写反' 応により c D NAを調製した。
( 2 ) '得られた c D N A'溶液 5/11 に lOxPCR II 緩衝液 （パーキンエル マー社製） 2μ 1、 25raM 塩化マグネシウム 1μ 1、 20μΜ センス、 アンチ セ ン ス プラ イ マ ーをそれぞれ 0· 25 μ 1、 D N Aポ リ メ ラーゼ試薬 (Ampli Taq Cold DNA polymerase ： ノ、0 キンエルマ一社製） 1.25U を 加え、 滅菌蒸留水によ り全量を 25 1 と し、 P C R反応を行った。. P C R反応は、 95°Cで 10 分間の後、 熱変性 95°Cで 1 分間、 アニーリ ング
55°Cで 1分間、 伸長反応 72°Cで 2分間を 40サイクル、 最後に 72°Cで 5 分間の伸長反応の条件で行った。 この反応に使用したセンス、 ア ンチセ ンスプライマーは、 以下のとおりである。
配歹 番号 2の位置 21〜38 のセ ンスプライマーと、 配列番号 2の位置 1323〜1342のアンチセンスプライマ一
配列番号 4の位置 21〜38 のセンスプ'ライマ一と、 配列番号 4の位置 712〜731 のアンチセンスプライマー
( 3 ) 得られた R T— P C R溶液を分子量マーカー （100 bp ladder ： フェルメ ンタス社製） と共にァガロースゲノレ （ 1 % Agaro se S ： ニッポ ンジーン社製） にて TAE緩衝液中で電気泳動し、 ェチジゥムブ口マイ ド 溶液'にて可視化 した。 P C R産物をゲルか ら切 り 出 し、 市販キ ッ ト (QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） によ り精製した。 得 られた P C R産物 50ng、 TA ク ローニングベクター （pT7BlueT ベクタ 一 ： ノバ一ジェン （Novagen) 社製） 25ng を T4DNA リガーゼ溶液 （DNA ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） 3 μ .1 と混合し'、 16°Cで 2時間ライゲーシヨ ンを行った。
( 4 ) 実施例 2【こ記載の方法と同様にしてプラスミ ド D NAを調製し、 塩基配列を決定し、 配列番号 2の位置 21〜1342 の c D N'Aまたは配列 番号 4の位置 21〜731 の c DNAをクローン化したプラスミ ドを得た。
( 5 ) タグ付 D R 3発現ベクターの構築
得られた配列番号 2の位置 21〜1342 がク ローン化されたプラスミ ド 2 g t BamH I (宝酒造社製） 5unit、 Xba.I (宝酒造社製） 5imit、 ΙΟχ 緩衝液 （宝酒造社製） 1.25μ 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 25 / l に し た。 こ の反応液を 37 °Cで 4 時間保温後、 分子量マーカー （ lkbp ladder ： フ エ ノレメ ンタ ス社製） と共にァガロースゲノレ （1% Agarose S： -ツボンジーン社製） にて TAE緩衝液中で電気泳動した。 約 1.3kbp
ί
の D Ν. Αノく ン ド をゲル力 ら 回収 し、 巿販 キ ン ト （ QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） により精製した。 ( 6 ) pcDNA3.1/His ベク ター （商品名 ： イ ンビ ト ロ ジェン社製） 2 g に BamH I (宝酒造社製） 5unit、 Xba I (宝酒造社製） 5unit、 ΙΟχΚ緩衝 液 （宝酒,造社製） 1.25/J I を加え、 滅菌蒸留水で全量を 25 l にした。 この反応液を 37°Cで 4 時間保温後'、 分子量マーカー （lkbp ladder： フ エル.メ ンタス社製） と共にァガロースゲゾレ （1% Agarose S： 二ツボン ジーン社製） にて 'TAE 緩衝液中で電気泳動した。 5.5kbp の D NAバン ドをゲルから回収し、 巿販キッ ト （QIAquick Gel Extr ac t ionKi t ： キア ゲン社製） によ り精製した。 '
r
( 7 ) 参考例 1 ( 5 ) で精製した D N A断片 30ng と参考例 1 ( 6 ) で 精製した pcDNA3, l/His ベク ター 30ng を T4DNA リ ガーゼ溶液 （ DNA ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） 4 μ 1 と混合し、 16°Cで 2時間ライゲーショ ンを行った。
( 8 ) 実施例.2に記載の方法と同様にしてプラス ミ ド D N Aを調製し、 配列番号 2の位置 21〜13^2 が組み換えられたエクスプレス （Xpress) タグの付いた発現ベクターを構築した。
( 9 ) 参考例 1 ( 4 ) で得た配列番号 2の位置 21〜1342 がク ローン化 されたプラスミ ド 2 βも に Sal I (宝酒造社製） 5unit、 EcoR I (宝酒造 社製） 5unit、 ΙΟχΗ緩衝液 （宝酒造社製） 2.5 1 を加え、 滅菌蒸留水で 全量を 25 にした。 この反応液を 37°Cで 4 時間保温後、 分子量マー カー ( lkbp ladder ： フェルメ ンタス社製） と共にァガロースゲル （1%
Agarose S： 二ツボンジーン社製）. にて TAE 緩衝液中で電気泳動した。 約 1.3kbp の D N Aバン ドをゲルから回収し、 巿販キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） により精製した。
( 1 0 ) pEGEP-C2 ベク ター （商品名 ： クローンテック社製） 2μ g を参 考例 1 ( 9 ) と同様にして Sa 1 I および EcoR I で消化し、 4, 7iibp の D N Aノ ン ドをゲノレ力 ら回収し、 市 キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit : キアゲン社製） により精製した。
( 1 1 ) 参考例 1 ( 9 ) で精製した D N A断片 30ng および参考例 1 ( 1 0 ) で精製した pEGEP- C2 ベク タ一 30ng を T4DNA リ ガーゼ溶液
(D A ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） 4 μ 1 と混合 し、 16°Cで 2時間ライ'ゲ シヨ ンを行った。
( 1 2 ) 実施例 2に記載の方法と同様にしてプラスミ ド D N Aを調製し、 酉己列番号 2 の位置 21〜： L342 が組み換えられた EGFP (Enhanced green fluorescent protein) タグの付いた発現ベクターを構築した。
( 1 3 ) 参考例 1 ( 4 ) で得た配列番号 3 の位置 21〜731がク ローン化 されたプラス ミ ド 2 /1 gに Sal I (宝酒造社製） 5unit、 ΙΟχΗ緩衝液 （宝 酒造社製） 4 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 40 μ 1 にした。 この反応 液を.37°Cで 4 時間保温後、 フエノール/ク ロ 口ホルム （1 : 1) 溶液で 除タンパク し、 エタノール沈殿によ りプラスミ ドを回収した。 得られた プラスミ ドに BamH I (宝泡造社製） 5unit、. ΙΟχΚ緩衝液 （宝酒造社製） 4 / 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 40 μ 1 にした。 この反応液を 37°C'で 4 時間保温後、 分子量マ一力一 （ 100 bp ladder ： ニューイングラン ド バイオラボ （NEB) 社製） と共にァガロースゲル （1% Agarose S : ニッ ポシジー ン社製） にて TAE 緩衝液中で電気泳動した。 約 0. 8kbp の D N
A ノく ン ドをゲノレカ ら回収 し、 巿販キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit : アゲン社製） によ り精製した。
( 1 4 ) pEGEP-Cl ベクタ一 （商品名 ： クローンテック社製） 2 μ g を参 考例 1. ( 1 3 ) と同様に して Sal I および BamH I によ り 消ィ匕し、 4.7kbp の D N Aバン ドをゲルから回収し、 巿販キッ ト （QIAquick' Gel Extraction Kit： キアゲン社製） により精製した。
( 1 5 ) 参考例 1 ( 1 3 ) で精製した D N A断片 30ng と参考例 1 ( 1 4 ) で精製した pEGEP-Cl ベクター 30ng を T4DNA リ ガーゼ溶液 （ DNA ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製,） 4 μ 1 と混合し、 16°Cで 2時間ライゲーショ ンを行った。
( 1 6 ) 実施例 2に記載の方法と同様にしてプラスミ ド D NAを調製し、 配列番号 4の位置 21〜731 が組み換えられた EGFP タグの付いた発現べ クタ一を構築した。
( 1 7 ) 実施例 6 ( 1 ) および （ 2 ) の方法と同様にして、 参考例 1
( 4 ) で得た配列番号 2 位置 21〜1342 の c D N Aまたは配列番号 4 の ί 置 21〜731 の c D N Aをク ローン化したプラスミ ドに変異導入をお こなつた。 変異を導入した塩はいずれも配列番号.4または 2の 564番目 の塩基 （配列番号 1 の位置 1755 に相当する） であり、 この塩基 Aか ら Gに置換した。 この変異導入によ り いずれのタンパク も 159 番目の Asp が Gly に置換され'る。 なお、 このときに使用したプライマーセッ ト は以下のとおりである。
センスブライマー ： 5' -TGTTCCCGCAGAGGTACTGACTGTGGGA-3' (配歹 [j番号 1 8 )
アンチセンスプライマー ： 5'— TCCCACAGTCAGTACCTCTGCGGGAACA— 3' (酉己歹！] 番号 1 9 )
( 1 8 ) 得られたプラスミ ドを用い、 参考例 1 ( 9 ) 〜 （ 1 2 ) と同様 にして配列番号 2の位置 564 に Aから Gの変異を有する 21〜1342 が組 み換えられた EGFP タグの付いた発現ベク ターを構築した。 また参考例 1 ( 1 3 ) 〜 （ 1 6 ) と同様にして、 配列番号 4の位置 564に Aから G の変異を有する 21〜731 が組み換えられた EGFP タグの付いた発現べク ターを構築した。
以降、， これらタグを付けた発現べクターを以下のよ うに呼ぶ。
配列番号 2の位置 21〜1342 が組み換えられたエク スプレス （Xpress) タグの付いた発現べクター ： ベクター A
配列番号 2の位置 21〜 1342が組み換えられた EGFP タグの付いた発現べ クタ一：ベクター B
配列番号 2の位置 564 に Aから Gの変異を有する 21〜 1342 が組み換え られた EGFP ' タグの付いた発現べクタ一 ： ベクター C
配列番号 4の位置 21〜731 が組み換えられた EGFP タグの付いた発現べ クタ一 ： ベクター D
配列番号 4の位置 564に Aから Gの変異を有する 21〜731が組み換えら れた EGFP タグの付いた発現ベクター ： ベクタ一 Ε
( 1 9 ) トランスフエクシヨ ンを行う前日に、 DMEM/10%FCS に懸濁した 293T細胞'を 2xl05づっ 6穴プレー トに播いておく。 トランスフェクショ ンは、 ギブコ社のリ ポフエク トァミ ンプラス試薬を用いたリポフエクシ ヨ ン法によ り行つだ。 ベクター A0.5 g とベク ター B、 C、 D、 Eを それぞれ 0.5 g 混合し、 これにリポフエクシヨ ン試薬 （プラス試薬 ： ギブコ社製） を 6μ 1加え、 DME¾tで全量を 100/21 と し室温で 15分間放 置した。 この溶液にリ ボフヱク トアミ ン試薬 （商品名 ： ギブコ社製） 4 ' μ 1 および DMEM96/ 1 を加え、 さ らに 15 分間室温で放置後、 DMEM を 800 μ 1 添加し、 全量を 1ml にした。 細胞を播いたプレー トから上清を 除き、 この溶液を全量加え、 37°C、 5%C02 の条件で 3 時間培養した。 上 清を除き DMEM/10!¾FCS を 3tnl 加え、 さらに 48 時間培養後、 細胞を回収 した。 得られた細胞は PBS で洗浄後、 可溶化緩衝液 250 1 に懸濁し、 超音波によ り破砕した。 この細胞破碎液を 15000rpm、 10 分間遠心し、 この上清 細胞可溶化液と して実験に供した。
( 2 0 ) 得られた細胞可溶化液 200 1 に可溶化緩衝液を 300 1加え、 さ らにプロ テイ ン A—ァガロース溶液 （ロシュ社製） 25 μ 1 を加え、 4°Cで 4時間転倒撹拌した。 12000rpm20秒間遠心し、 採取した上清に抗 GFP抗体 （サ,ンタ クルーズ社製） を 1 μ g加え、 4°Cで 2時間転倒撹拌し た。 この溶液にプロテイ ン A—ァガロース溶液 （ロ シュ社製） を 25 μ ΐ 加え、 4°Cでー晚転倒撹拌した。 12000rpm20 秒間遠心し、 上清を除去後、 洗浄のため沈殿を可溶化緩衝液 500 μ ΐ に懸濁して 4°Cで 20分転倒撹拌 した。 この洗浄操作を計 3回行った後、 2x サンプル緩衝液 30 μ ΐ に懸 濁し、 95°C、 5 分間加熱し、 SDS—ポリ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 (PAGE) のサンプルと した。
( 2 1 ) 得られたサンプル 20 μ ΐ をプロテイ ンマーカー （ブレスティ ン ドマーカー、 ブロー ド ： ァプロサイ エンス社製） と と もに 7.5¾SDS - PAGE ゲルにて、 常法の SDS- PAGE を行った。 泳動後、 セミ ドライ式ブロ ッティ ング装置により タンパク質を PVDF 膜 （ミ リ ポア社製） に転写し た。 転写用緩衝液には、， lOOmM ト リ ス、 192mM グリ シン、 10%メ タ ノール を用いた。
( 2 2 ) タ ンパク質を転写した PVDF膜を 5%脱脂粉乳含有 TBS溶液に浸 し、 室温 1時間振と う した。 次いで TBS溶液に抗エク スプレス抗体 （ィ ンビ トロジェン社製） を 1000 分の 1 (溶媒に対する容量比） 加えた、溶 液に浸し、 室温でー晚反応させた。 PVDF膜を' 0.05%Tween- 20を含む TBS 溶液で 10分間 3回洗浄後、 0. l%Tween-20 を含む TBS溶液に HRP標識抗 マウス I gG 抗体 （アマシャムフアルマシア社製 Γを 1000 分の 1 (溶媒 に対する容量比） 加えた溶液に浸 し、 室温で 2 時問反応させた。 0. l%Tween-20 を含む TBS溶液で 10分間 3回洗浄後、 検出試薬 （ECしシ ステム ： アマシャムフアルマシア社製） に浸し、 X線フィ ルムに,露光さ せた。
結果を図 5に示す。 ベクター B、 C、 D、 Eから発現されるタンパク , ' 質はいずれもベクター A から発現されるタンパク質と結合することが明 らかとなつた。 すなわち、 正常型の D R 3 タ ンパクが正常型のタ ンパク と コ ンプレックスを形成することはもとよ り、 ベクター c、 D、 Eから 発現される変異型のタンパク と もコ ンプレックスを形成することが明ら かとなつた。
参考例 2 正常型 DR3 と TRADD との結合に対する変異型 DR3の効果 ' ( 1 ) TRADD c DNAの調製
c D N A溶液 （ヒ ト精巣 Marathon - Ready cDNA： 商品名、 ク ロ ンテ ツ ク社製） 0.5μ 1 に lOxLA 緩衝液 （商品名 ： 宝酒造社製） 2.5μ 1、 25m 塩化マグネシウム 2. S μ 1、 2.5mM デォキシヌク レオチ ド混合液 4 μ 1、
20 センス、 アンチセンスプライマーをそれぞれ 0· 25μ 1、 D NAポ リ メ ラーゼ試薬 （LA Taq DNA polymerase ： '宝酒造社製） 1.25U を加え, 滅菌蒸留水により全量を 25 1 と し、 P C R反応を行った。 P C R反応 は、 95。Cで 1 分間の後、 熱変性 95°Cで 1 分間、 ァ-ーリ ング 62。Cで 1 分間、 伸長反応 72°Cで 1分間を 35サイクル、 最後に 72°Cで 5分間の伸 長反応の条件で行った。 この反応に使用したセンス'、 アンチセンスプラ イマ一は、 以下のとおりである。
センスプヲイマ一 ： 5' - CGAGGCGGCCAGGAGGTG - 3' (配列番号 20)
アンチセ ンスプライマ一 ： 5' -GGTTCAGCAATAGCCGCAGA-3 ' (配歹 番号 21) .
( 2 ) 得られた溶液を分子量マーカー （100 bp ladder ： フェルメ ンタ ス社製） と 共にァガ ロースゲル （ 1。/。 Agarose S ： 二 ツ ボンジーン社 製） にて TAE緩衝液中で電気泳動し、 ェチジゥムブロマイ ド溶液にて可 視化した u P C R産物をゲルから切り 出し、 巿販キッ ト （QIAquick Gel xtraction Kit ： キアゲン社製） によ り精製した。 得られた P C R産物 25ng、 TA ク ロ一ニングベク ター （ pT7BlueT ベク タ一 ： ノ ノく一ジェン
(Novagen) 社製'） 25ng を T4DNA リ ガーゼ溶液 ( D A ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） 2.5μ 1 と混合し、 16°Cで 1 時間ライゲ ーショ ンを行つ 。
( 3 ) 実施例 2 に記載の'方法と同様にしてプラスミ ド D NAを調製し、 塩基配列を決定し、 TRADD cDNAをク ローン化したプラスミ ドを得た。
(4 ) タグ付 TRADD発現ベクターの構築
参考例 2 ( 3 ) で得た TRADD cDNA がク ローン化されたプラス ミ ド 2 β g に EcoR I (宝酒造社製） 5unit、 Sal I (宝酒造社製） 5unit、 10xH 緩衝液 （宝酒造社製） 3μ 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 30// 1 にした'。 この反応液を 37°Cで 4 時間保温後、 分子量マーカー （lkbp ladder ： フ エルメ ンタ ス社製） と共にァガロースゲル （1% Agarose S ·· 二ツボン ジーン社製） にて TAE 緩衝液中で電気泳動した。 約 lkbp の D NAバン ドをゲノレ力 ら回収し、 巿販キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit ： キ ァゲン社製） により精製した。 ( 5 ) PCMV-Tag2 ベク タ一 （商品名 ： ス ト ラ タ ジーン社製） I μ g に EcoR I (宝酒造社製） 5unit、 Sal I (宝酒造社製） 5unit、 ΙΟχΗ 緩衝液 (宝酒造社製） 3 /i 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 30 μ 1 にした。. この 反応液を 37°Cで 4 時間保温後、 分子量マーカー （Ikbp ladder ： フェル 'メ ンタ ス社製） と共にァガロースゲル （ 1 % Agarose S ： ニッボンジー ン社製） にて TAE.緩衝液中で電気泳動した。 4. 3kbp の D N Aバン ドを ゲノレ力 ら回収し、 市販キッ ト （QlAquick Gel Extraction Kit ： キアゲ ン社製） によ り精製した。
( 6 ) 参考例 2 ( 4 ) で精製した D N A断片 30ng と参考例 2 (5) で精 製した pCMV-Tag2 ベクター 30ng を T4DNA リガーゼ溶液 （DNA ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） 2. 5 μ 1 と混合し、 16°Cで 2時 間ライゲーショ ンを行つた。
( 7 ) 実施例 2に記載の方法と同様にしてプラス ミ ド D N Aを調製し、 フラ ッグ （Flag) タ グの付いた TRADD発現ベク ターを構築した。 以降、 このベクターをベクター F と記載する。
( 8 ) ト ラ ンスラエクシヨ ンを行う前日に、 DMEM/10¾FCS に懸濁した 293T細胞を 2xl05づっ 6 穴プレートに播いておく。 ト ランスフエクショ ンは、 ギブコ社の リ ボフェク トァミ ンプラス試薬を用いたリ ポフエク シ ヨ ン法により行った。 ベクターの組合せは以下のよ うにした。
1. pcDNA3. 1/His C (商品名 ： イ ンビ トロジェン社製） 0. 2 g、 ベク タ — F 0. 1 μ. g
2. ベクター A 0. 2 / g、 ベクター F 0. 1 g
3. ベクター A 0. 2 μ g ベクター Ε 0. 1 i g、 ベクター F 0. 1 μ g
4. ベクター A 0. 2 / g、 ベクター E 0. 2 i g、 ベク ター F 0. l f g ベク ター Aおよび Eは参考例 1 に示すものであり、 ベク ター Aにはェク スプレス （Xpress) タグに加え Hi s タグが付加されている。 なお、 べク ターの全量は pcDNA3. 1 (商品名 ： イ ンビトロジェン社製） により l g と した。 上記 1-4にリ ポフエク シヨ ン試薬 （プラス試薬 ： ギブコ社製） を 6 /i 1加え、 DMEMで全量を ΙΟΟ μ 1.と じ室温で 15分間放置した。 この 溶液にリ ボフェク トァ ミ ン試薬 （ギブコ社製） 4 1 および DMEM96 1 を加え、 さ らに 15 分間室温で放置後、 DMEM を 800 μ 1 添加し、 全量を lml にした。 細胞を播いたプレー トから上清を除き、 この溶液を全量加 え、 37°C、 5%C02の条件で 3 時間培養した。 上清を除き DMEM/10%FCS を 3ml加え、 さ らに 24時間培養後、 細胞を回収した。 得られた細胞は PBS で洗浄後、 可溶化緩衝液 250 1 に懸濁し、 超音波によ り破砕レた。 こ の細胞破砕液を l5000rpm、 10 分間遠心し、 上清を細胞可溶化液と して 実験に供した。
( 9 ) 細胞可溶化液 100 gに可溶化緩衝液を加え全量を 500 μ 1 と し、 さ らにプロ テイ ン Α —ァガロース溶液 （ロ シュ社製） 25〃 1 を加え、 4°Cで 4 時間転倒撐拌した。 12000rpm 20 秒間遠心し、 採取した上清に 抗 HisG 抗体 （商品名 ： インビトロジェン社製） を 1 μ g 加え、 4°Cで 2 時間転倒撹拌した。 この溶液にプロテイン A —ァガロース溶液を 25 1 加え、 4°Cでー晚転倒撹拌した。 12000rPtn20 秒間遠心し、 上清を除去後. 洗浄のため沈殿を可溶化緩衝液 500 1 に懸濁して 4°Cで 20分転倒撹拌 した。 この操作を 2 回行った後、 洗浄緩衝液 500 μ ΐ にてさらに同様の 洗浄を 2 回行い、 最後にも う一度可溶化緩衝液 500 /Ζ 1 にて洗浄をおこ なった。 沈殿を 2χ サンプル緩衝液 30 1 に懸濁し、 95°C、 5 分間加熱' し、' SDS—ポリ アク リ ノレアミ ドゲル電気泳動 （PAGE) のサンプルと した < ( 1 0 ) 得られたサンプル 20 1 をプロテイ ンマーカ一 （プレスティン ドマーカー、 ブロー ド ： ァプロサイ エンス社製） と と もに 9 % SDS- PAGE ゲルにて、 常法の SDS- PAGE を行った。 泳動後、 セミ ドライ式プロ ッティ ング装置によ り タンパク質を PVDF 膜に転写した。 転写用緩衝液 には、 lOOtnM ト リ ス、 192mM グリ シン、 10%メ タ ノールを用いた。
( 1 1 ) タンパク質を転写した PVDF膜を 5%脱脂粉乳含有 TBS溶液に浸 し、 室温 1 時間振とう した。 次いで TBS溶液に抗 Fl ag 抗体 （シグマ社 製） を 1000 分の 1 (溶媒に対する容量比） 加えた溶液に浸し、 室温で 30 分反応させた。 PVDF膜を TBS溶液で 1 -2 分間 3 回洗浄後、 TBS 溶液 に HRP 標識抗マウス I gG 抗体 （アマシャムファ /レマシア社製） を 1000 分の 1 (溶媒に対する容量比） 加えた溶液に浸し、 室温で 30 分反応さ せた。 TBS溶液で 15分間 3回洗浄後、 検出試薬 （ECL システム ： アマシ ャムファノレマシア社製） に浸し、 X線フィルムに露光させた。
結果を図 6に示す。 正常型 DR3 と変異型 DR3 ,を同時に発現させると、 変異型 DR3 の量依存的に正常型 DR3 に結合した TRADD の量が減少した (レーン' 3、 4) 。 すなわち、 変異型 DR3 は正常型 DR3 と TRADD と の結 合を阻害した。
参考例 3 末梢血単核球におけるカスパーゼ 8の発現
( 1 ) へパリ ン採血した R A患者 5 例およぴ健常人 4 例の末梢血 l Ornl を等量の PBS と混和し、 これを Lymphoprep (第一化学薬品社） 20ml に 重層した。 l500rpmで 30 分間遠心後、 末梢血単核球の層を採取し、 PBS で洗浄した。 細胞を培地 （RPM1 1640/ 10%FCS ) に 5x l(Jsce 11 s/ml となる よ う懸濁し、 この細胞懸濁液 10ml を 10cm φシャーレに播き、 PMA (シ ダマ社） 20ng/ml および PHA (ディ フコ社） 1 g/ml の刺激下または非 刺激下、 37°C、' 5D/。C02で 48 時間培養した。 '細胞を回収し、 PBS で洗浄後、 細胞を可溶化緩衝液 150 μ 1 に懸濁し、 氷冷下,に 30分間ィ ンキュベ一 ト した。 この溶液を. I 5000rpm、 10 分間遠心し、 上清を分取し、 細胞溶解 液と した。
( 2 ) 得られた細胞溶解液 10 /i gをプロテイ ンマーカー （プレスティ ン ドマー力一、 ブロー ド ： ァプロサイエンス社製） と と もに 7. 5 % SDS— PAGE ゲルにて、 常法の SDS- PAGE をおこなった。 泳動後、 セミ ドライ式 プロ ッティ ング装置によ り蛋白質を PVDF 膜 （ミ リ ポア社製） に転写し た。 転写用緩衝液は、 l OOraM 卜 リ ス、 192mM グリ シン、 10%メ タ ノールを 用いた。
( 3 ) タンパク質を転写した PVDF 膜を 5 %脱脂粉乳含有 TBS- T 溶液に 浸し、 室温で 1 時間振と う した。 ついで 1%脱脂粉乳含有 TBS- T 溶液に , 抗カスパーゼ 8 抗体 （医学生物学研究所社製） を 1000 分の 1 (溶媒に ' 対する容量比） 加えた溶液に浸し、 4 °Cでー晚—反応させた。 PVDF 膜を TBS-T溶液で 10分間 3回洗浄後、 TBS- T溶液に HRP標識抗マウス I gG抗 体 （アマシャムブアルマシア社製） を 1000 分の 1 (溶媒に対する容量 比） 加えた溶液に浸し、 室温で 1 時間反応させた。 TBS- T 溶液で 10 分 間 3 回洗浄後、 検出試薬 （ECL システム ： アマシャ ムフ アルマシア社 製） に浸し、 X線フィルムに露光させた。
NIH Ima ge ソフ トによ り カスパーゼ 8/a、 カスパーゼ 8/b のバン ドの 濃度を数値化し、 PMA、 PHA 刺激下の値を未刺激下の値で除した相対値 で結果を示した。 結果を平均値土標準偏差と して以下に示す。
健常者 ： 0. 72 ± 0. 19
R A患者 ： 1. 33 + 0 , 23 .細胞の刺激により健常者においては、 カスパーゼ 8 (カスパ一ゼ 8/a、 カスパーゼ 8/b) の减少、 すなわち分解が観察されるのに対して、 R A 患者においては力ス.パーゼ 8の分解が観察されなかった。
実施例 10 正常型 D R 3を補完することによる細胞死の誘導
( 1 ) 正常型 D R 3発現ベクターの構築
参考例 1 の （ 4 ) で得た配列番号 2 の位置 21~ 1342 がクローン化さ れたプラスミ ド に BairiH 1 (宝酒造社製） 5unit、 Xba I (宝酒造社 製） 5unit、 ΙΟχΚ 緩衝液 （宝酒造社製） 1. 25 μ 1 を加え、 滅菌蒸留水で 全量を 25 1 'にした。 こ.の反応液'を 37°Cで 4 時間保温後、 分子量マ一 カー ( lkbp ladder ： フェルメ ンタス社製） と共にァガロースゲル （1%
Agarose S ： ニッポンジ^ "ン社製） にて TAE 緩衝液中で電気泳動した。 約 1. 3kbp の D N Aバン ドをゲル;^ら回収し、 市販キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit： キアゲン社製） によ り精製した。
( 2 ) pcD A3. 1 (商品名 ： イ ンビ ト ロ ジェン社製） Ζ μ. に BarnH I (宝 酒造社製） 5unit、 Xba I (宝酒造社製） 5unit、 ΙΟχΚ 緩衝液 （宝酒造社 製） 1. 25 μ 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 25 μ 1 にした。 この反応液を 37°Cで 4 時間保温後、 分子量マーカー （Ikbp ladder ： フユルメ ンタス 社製） と共にァガロースゲル （1 % Agarose S ： 二ツボンジーン社製） にて TAE 緩衝液中で電気泳動した。 5.6kbp の D N Aバンドをゲルから 回収し、 市販キ ン ト （QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） によ り精製した。
( 3 ) 実施例 10 ( 1 ) で精製した DNA断片 30ng と実施例 10 ( 2 ) で精 製した pcDNA3. 1 ベクタ一 30ng を T4DNA リガーゼ溶液 （DNA ligation kit Ver II の solution I ： ¾酒造社製） と 4 μ 1 と混合し、 16°Cで 2時 間ライゲーショ ンをおこなった。
( 4 ) 実施例 2に記載の方法と同様にしでプラスミ ド D N Aを調製し、 配列番号 2の位置 21〜i342 が組み換えられた正常型 D R 3発現べクタ 一を構築した。
( 5 ) 変異型 D R 3発現ベクターの構築
参考例 1 ( 1 7 ) で得た配列番号 3 の位置 564に Aから Gの変異を有す る配列番号 4の位置 2]〜 731 がク ローン化されたブラ ^ミ ド 2 μ g に EcoRI (宝酒造社製） 5unit、 Hindlll (宝酒造社製） 5unit 、 ΙΟχΜ 緩衝 液 （宝酒造社製） 4μ 1 を加え、 滅菌蒸留水で全量を 40 にした。 こ の反応液を 37°Cで 4時間保温後、 分子量マーカー （100 bp ladder ： 二 ユーイ ングラ ン ドバイオラボ （NEB) 社製） と共にァガロースゲル （1% Agarose S ： 二ツボンジーン社製） にて TAE 緩衝液中で電気泳動した。 約 0. Skbp の D N Aバン ドをゲルから回収し、 巿販キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） により精製した。
( 6 ) pcDNA3. 1/V5- His (商品名 ： イ ンビ トロジェン社製） 2 μ g を実施 例 10 の （ 5 ) と同様にして EcoRI および Hindlll によ り 消化し、 5.5kbp の D N Aバン ドをゲルから回収し、 市販キッ ト （QIAquick Gel Extraction Kit ： キアゲン社製） により精製した。
( 7 ) 実施例 .10 の （ 5 ) で精製した DWA 断片 30ng と実施例 10 の ( 6 ) で精製した pcDNA3.1/V5 - His ベクター 30t g を T4DNA リガーゼ溶 液 （DNA ligation kit Ver II の solution I ： 宝酒造社製） と 4 μ 1 と 混合し、 16°Cで 2時間ライゲ一ショ ンをおこなった。
( 8 ) 実施例 2に記載の方法と同様にしてプラスミ ド D N Aを調製し、 配列番号 3 の位置 564 に Aから Gの変異を有する配列番号 4 の位置 21 〜731が組み換えられた変異型発現べクターを構築した。
( 9 ) 正常型、 変異型 D R 3発現ベク ター 4 g を pRい TK (商品名 ： プ 口メ ガ社製） ベクター と と もに、 実施例 4 ( 6 ) と同様にしてジ ヤーカッ ト （ Jurkat) '細胞に トランスフエクシヨ ンした。 なお、 ベクタ —の全量はコ ン ト ロールベクタ一 （pcDNA3.1、 商品名 ： イ ンビ トロジェ ン社製） によ り 11 と した。 電気ショ ック後、 氷冷下に 10 分間静置 し、 RPMI1640ZlO%FCS で全量を 4ral と し、 6 ゥエルプレー トで 37°C、 5%(02で 24 時間培養した。 細胞を回収しリ ン酸緩衝食塩水で洗浄後、 100 μ 1 の細胞溶解液 （Passive Lysis Buffer ： プロ メガ社製） に可溶 化した。 この溶液 20 μ ΐ とルシフユラーゼ基質 50 (Stop & Glo 基 質 ： プロメ ガ社製） を混合し、 ルミ ノ メータ一 （Luminoskan ： 大日本製 薬社製） を用いて発光量を測定しだ。
pRL-TK ベクタ一が導入された細胞ではルシフェラーゼ遺伝子が翻訳 されるため、 その細胞溶解液は化学発光を呈する。 一方、 D R 3の発現 によ りアポ トーシスが誘導されると、 細胞数の減少により発光量が低下 すると考えられる。 すなわちこの試験は、 細胞死の誘導を発光量を指標 と して検出するものである。
コ ン ト ロールベクター （PcDNA3.1) を導入した細胞溶解液の発光量を 100 と し、 各ベクターを導入した細胞溶解液の発光量を相対値で示した, 結果は以下のとおりである。
正常型 D R 3 : 11.1
変異型 D R 3 ： 101.7
正常型 D R 3 +変異型 D R 3 ： 10.3 .
変異型 D R 3を導入した細胞の発光量はコン トロールとほぼ同等の値 を示した。 すなわち、 この細胞にはアポ ト一シスが誘導されないのに対 して、 正常型 D R 3 と変異型 D R 3 を等量導入した細胞の発光量は、 正 常型 D R 3のみを導入した細胞と同様低値を示し、 細胞死が誘導された。 このように正常型 D R 3の補完は R Aの治療法と して有用であると考え られる。
尚、 発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実 施態様または実施 は、 あくまでも、 本発明の技術内容を明らかにする ものであって、 そのよ うな具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべき ものではなく 、 本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、 いろ いろと変更して実施することができるものである。 産業上の利用の可能性 '
本発明は、 変異を有するゲノム、 タンパク質、 それらの変異を利用 し たヒ ト慢性関節リウマチの診断方法 （換言すれば、 発症または発症可能 性の判定方法） 、 上記変異検出用の診断 （判定） 'キッ ト、 当 リ ウマチ の治療方法および治療薬剤に関する。 本癸明によれば、 慢性関節リ ウマ チの発病またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に行う ことがで き、 有用である。 さ らに、 本発明は、 慢性関節リ ウマチの新たな予防法, 治療法および治療薬剤と しても有用である。

Claims

求 の 範 囲
1 . 配列番号 1 のゲノムにおいて、 下記の変異 ：
( 1 ) 位置 921 の塩基がシトシン （C) からチミン （T) への置換
( 2 ) 位置 Πδ5 の塩基がアデニン （Α) からグァニン （G) への置換 '
( 3 ) 位置 2443〜2456の塩基の欠損
( 4 ) 位置 253Ί の塩基がシ トシン （C) からチミン （Τ) への置換
( 5 ) 位置 2δ78 の塩基がアデニン (Α) からチミ ン （Τ) への置換
( 6 ) 位置 2826 の塩基がアデニン （Α) からグァニン （G) への置換 の 1以上を有するこ とを特徴とする慢性関節リ ゥマチに関与する'ゲノ ム<
2 . 配列番号 3のアミ ノ酸配列からなるタンパク質において、 位置 159 のァスパラギン酸から'グリシンへの変異を有するタンパク質。 ，
3 . 請求の範囲第 1項記載のゲノムを検出することを特徴とする慢性関 節リ ゥマチの発症またはその発症可能性の判定方法。
4 . 請求の範囲第 1項記載のゲノムの転写産物を検出することを特徴と する慢性関節リ ゥマチの発症またはその'発症可能性の判定方法。
5. . ゲノムの転写産物がタンパク質である請求の範囲第 4項記載の慢性 関節リ ゥマチの発症またはその発症可能性の判定方法。 '
6 . 請求の範囲第 1項に記載のゲノム、 それらの転写産物またはそれら の変異を検出する方法を利用した慢性関節リ ウマチの発症またはその発 症可能性の判定キッ ト。
7 . 請求の範囲第 1項記載のゲノふの転写産物である変異型タンパク質 を持つ慢性関節リ ゥマチ患者に、 その変異を持たない正常'型タンパク質 または当該正常型タンパク質を.コードする D N A、 あるいは、 このレセ プタータンパク質のァゴニス ト と しての低分子化合物を補完することを 特徴とする慢性関節リ ウマチの治療方法。
8 . 請求の範囲第 1項記載のゲノ ムの転写産物である変異型タンパク質 を持つ慢性闋節リ ゥマチ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、 そ の変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコー ドする D N A、 あるいは、 このレセプタータ ンパク質のァゴニス ト と し ての低分子化合物を主成分とする慢性関節リ ゥマチの治療薬剤。
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