WO2002024875A1 - Solution de culture de cellules normales mures de foie humain - Google Patents

Solution de culture de cellules normales mures de foie humain Download PDF

Info

Publication number
WO2002024875A1
WO2002024875A1 PCT/JP2001/008168 JP0108168W WO0224875A1 WO 2002024875 A1 WO2002024875 A1 WO 2002024875A1 JP 0108168 W JP0108168 W JP 0108168W WO 0224875 A1 WO0224875 A1 WO 0224875A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
concentration
culture solution
culture
hepatocytes
solution according
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/008168
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshio Yamaoka
Iwao Ikai
Nagato Katsura
Toshihiro Mitaka
Original Assignee
Hokkaido Technology Licensing Office Co.,Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hokkaido Technology Licensing Office Co.,Ltd. filed Critical Hokkaido Technology Licensing Office Co.,Ltd.
Priority to JP2002529470A priority Critical patent/JPWO2002024875A1/ja
Priority to AU2001288072A priority patent/AU2001288072A1/en
Publication of WO2002024875A1 publication Critical patent/WO2002024875A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/148—Transforming growth factor alpha [TGF-a]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/85—Hormones derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C12N2501/855—Corticotropin [ACTH]

Definitions

  • the present invention relates to a culture medium for growing and maintaining normal human mature hepatocytes.
  • Hepatocytes have so many functions that they are called chemical factories in the body. Hepatocytes produce more than 90% of serum proteins, and hepatocytes metabolize and detoxify harmful substances taken up or produced in the body. For this reason, various methods have been used, such as culturing normal human mature hepatocytes and using their functions to detect harmful substances (biosensors), or to enable the production of substances necessary for humans outside the body. Research is being conducted on mature hepatocytes at research institutes.
  • liver transplantation In the medical field, securing a large amount of human hepatocytes is an urgent issue in establishing treatments to save people suffering from severe liver disease. Liver failure can occur for a variety of causes and is very fatal when it occurs. At present, the highest survival rate can be said to be liver transplantation alone.
  • a brain death transplant bill has been passed in Japan, and brain death liver transplantation has begun.
  • the vast majority of patients will receive transplants. It is clear that he will die without.
  • Creating an artificial liver, or artificial liver is considered the most appropriate way to save those patients, and at present there is no other alternative.
  • a hybrid artificial liver using bushus liver cells is only used as a clinical trial in the United States for the temporary treatment of patients with fulminant hepatitis. Even in that case, it can only withstand several hours of use, and its therapeutic effects are debatable.
  • human liver that can maintain hepatocyte function sufficiently Because a large number of cells cannot be secured, even such a hybrid type artificial liver must use the hepatocytes.
  • fulminant hepatitis, cirrhosis, and liver cancer are many cases of liver failure, but a small number of metabolic diseases are caused by congenital genetic defects.
  • hepatocyte transplantation has recently been considered as a treatment for these diseases, since it is predicted that the disease will not develop when a protein lacking each is replaced.
  • This method involves culturing the patient's own hepatocytes outside the body, incorporating the defective gene into the cells, and returning the cells back to the liver.
  • the cells incorporating the gene are mature hepatocytes, especially human hepatocytes, not only the efficiency of gene transfer is poor, but also the cells cannot be propagated in the liver. It is known that the expressing cells disappear within a short period of time.
  • normal human mature hepatocytes are difficult to culture, and when they are isolated from the liver and started culturing, they rapidly lose their function as hepatocytes, and subculture cannot be performed. Therefore, using the conventional culture medium and culture method, it is difficult to maintain the isolated normal human mature hepatocytes at a level that can be used in experiments for a period of about one week, and it is difficult to proliferate the cells.
  • human hepatocyte cell lines that can be subcultured have been established, they cannot be called normal human mature hepatocytes. Some of them require special culture conditions, such as the need for mixed culture with rat cells.
  • An object of the present invention is to provide a culture solution for growing and maintaining normal human mature hepatocytes while maintaining their functions, and to use the culture solution for culturing normal human mature hepatocytes. Use.
  • the culture solution of the present invention is a culture solution for normal human mature hepatocytes, characterized by containing human serum.
  • the culture medium of the present invention contains an essential amino acid, histidine, arginine or ornitis glycine, proline, glutamine, cystine, serine, human serum, nicotine amide, growth factor, insulin, and corticosteroids. It is a culture solution for hepatocytes.
  • Another culture solution of the present invention is a culture solution further containing transferrin and a trace element.
  • another culture medium of the present invention is a culture medium containing glucagon, thyroid hormone, growth hormone, and ascorbic acid in addition to the above components, and having a very low calcium concentration.
  • Another aspect of the present invention is the use of the culture solution for culturing human mature hepatocytes while maintaining their functions.
  • FIG. 1 compares the albumin production in mature hepatocytes from humans (55 years old) cultured in the culture medium of the present invention and the Williams' E (+ FCS) ( ⁇ ) culture medium.
  • K SMF HS (+) (garden) means KSFM medium containing human serum
  • KSFM HS (-) ( ⁇ ) means KSFM medium without human serum.
  • FIG. 2 compares albumin production in mature hepatocytes from human (56 years old) cultured in the culture solution of the present invention and the Williams' E (+ FCS) ( ⁇ ) culture solution.
  • HS (+) (garden) means KSFM medium containing human serum
  • HS (-) (old) means KSFM medium without human serum.
  • FIG. 3 shows a comparison of albumin production by mature human hepatocytes in a culture solution containing 10% human serum and 10% fetal bovine serum.
  • Hepatocytes were isolated and cultured from 55-year-old human liver.
  • Hata indicates a KSFM medium containing 10% fetal calf serum
  • ⁇ indicates a KSFM medium containing 10% human serum.
  • the culture solution of the present invention is characterized by containing essential amino acids, histidine, arginine or ordinine, glycine, proline, glutamine, cystine, serine, human serum, nicotinamide, growth factors, insulin, and corticosteroids.
  • the culture solution of the present invention has a higher concentration of essential amino acids, a higher concentration of histidine, a higher concentration of arginine or orditin, a higher concentration of glycine, and a higher concentration as compared with a culture solution for normal human cultured cells. It preferably contains proline, high concentration of glutamine, high concentration of cysteine, high concentration of serine, and more preferably further includes transferrin and trace elements.
  • the essential amino acids differ slightly depending on the species.For example, in humans, there are eight types: palin, leucine, isoleucine, threonine, fenylalanine, triptophan, methionine, and lysine. It is known that this is 10 species with the addition of glycine and 10 species with the addition of glycine in birds. Also, can hepatocytes use orditin instead of arginine? In the culture solution of the present invention for culturing mature hepatocytes, arginine and ornithine can be used interchangeably.
  • essential amino acids specifically means palin, leucine, isoleucine, threonine, phenylalanine, tryptophan, methionine, and lysine. Further, in the present specification, amino acids are in L-form unless otherwise specified.
  • the culture solution of the present invention contains glucagon, thyroid hormone, growth hormone (GH) or insulin-like growth factor (IGF-1), vitamins, and has a low calcium concentration, for example, a calcium concentration of 0. More preferably, it is not more than lmM.
  • the concentration of essential amino acids and histidine, arginine or ordinine, glycine, proline, glutamine, cysteine, and serine in the culture solution of the present invention may be a culture solution generally used for culturing human cells, such as Williams' E (Williajns 5). GM and Gunn, JM (1974), Exp.
  • the minimum concentration of essential amino acids, histidine, arginine or ordinine, glycine, proline, glutamine, cysteine, and serine contained in L-15 The concentration is preferably about 1.5-fold to the maximum concentration for each amino acid, and more preferably the essential amino acids, histidine, arginine or ordinine, glycine, proline, and guanidine in these culture solutions.
  • Glutamic about half of the maximum concentration for Shisuti emissions, about 1.5 times to each of the amino acids of the minimum concentration for each serine.
  • “high concentration” refers to Williams' E, DMEM, MCDB and the like exemplified in Tables 1 to 4 below.
  • the concentration ranges from about 1.5 times the value in the culture medium with the lowest concentration to the maximum concentration in these four culture mediums.
  • arginine and ordinine can be used interchangeably in the culture solution of the present invention. Therefore, when arginine is used instead of arginine, its concentration is the same as that of arginine.
  • a high concentration of essential amino acids a high concentration of histidine, a high concentration of arginine or ordinine, a high concentration of glycine, a high concentration of proline, a high concentration of glutamine, as defined above, It preferably contains high concentrations of cysteine and high concentrations of serine, more preferably the essential amino acids, histidine, arginine or ordinine, glycine, proline, glutamine, cysteine, and serine, in terms of the concentration of each of these amino acids. Concentrations from about 1.5 times the lowest value in each culture of Williams' E, DMEM, MCDB and L-15 shown in Tables 1 to 4 to about half of the highest values in these four cultures Include in range.
  • the concentration of human serum added to the present invention is 5% to 20%, preferably 5% to 15%.
  • the growth factors that can be used in the culture medium of the present invention include, for example, EGF, HGF, TGF-H, or a combination thereof. EGF and / or HGF are particularly preferred.c
  • the culture medium of the present invention is nicotinamide. At a concentration of preferably 5 mM to 15 mM, more preferably 5 mM to 10 mM.
  • the concentration of the growth factor in the culture solution of the present invention is preferably 1 ng / ml to 50 ng / ml in total, and more preferably 5 ng / ml to 50 ng / ml in total. Insulin concentration in the culture solution of the present invention is preferably 50 nM to 1 M, more preferably 100 nM to 0.5 M.
  • Adrenocortical hormones that can be used in the culture solution of the present invention include, for example, cortisone, hydrocortisone, dexamethasone, and combinations thereof, with hydrocortisone and / or dexamethosone being preferred.
  • Adrenocortical hormone levels Is preferably 10 nM to 1MM in total, and more preferably 50 nM to 200 nM in total.
  • the concentration of transferrin that can be used in the culture medium of the present invention is preferably from 1 ⁇ g / ml to L5 ⁇ g / ml, more preferably 5 g / ml. Get on at 15 ⁇ / 1111.
  • the trace elements that can be used in the culture solution of the present invention include those generally used for culturing cultured cells, particularly for primary culturing of human hepatocytes, and include, for example, selenium, manganese, silicon, molybdenum, vanadium, nickel, and tin. , Zinc, iron, magnesium, copper, and combinations thereof.
  • the minor component selenium about 20nM ⁇ 30nM (NaSe0 3), about 0.5 nm to; InM manganese (MnCl 2), Ke I containing about 400nM ⁇ 500nM (N Si0 3), about 0.5 nm to; molybdenum LnM ((NH 4) 6 Mo 7 0 24), about 2nM ⁇ 5nM the banner Jiumu (NH 4 V0 3), second about 0. 1NM ⁇ 0.5NM characterize (NiS0 4), tin of approximately 0. 1NM ⁇ 0.5NM
  • Thyroid hormones that can be used in the culture solution of the present invention include triothyronine (T 3 ) and thyroxine (T 4 ), with ⁇ 3 being particularly preferred.
  • growth hormone and insulin-like growth factor can be used interchangeably, and their concentrations are preferably about lng / ml to 20ng / ml in total, more preferably Is a total of 5 ng / ml to 15 ng / ml. If glucagon is added, its concentration is similar to that of insulin.
  • bieminin to be added to the culture solution of the present invention include ascorbic acid and / or retinoic acid, and a bieminin B complex containing choline, with ascorbic acid being particularly preferred.
  • concentration of these vitamins is preferably between 0.5 and 1.5 m, more preferably between 0.5 and 1.0 mM.
  • the culture of the present invention optionally comprises 0.1 mM to 0.5 mM ethanolamine, and 0.1 mM M-0.5 mM phosphoethanolamine may be further included.
  • the culture solution of the present invention may contain other components usually used in the cell culture solution, such as non-essential amino acids other than those described above, inorganic salts such as sodium phosphate and sodium chloride, various vitamins other than the above, and lactic acid. Buffers such as D-glucose, D-galactose, Hepes, pH indicators, appropriate antibiotics, and the like.
  • the culture medium of the present invention may be a known culture medium or a commercially available culture medium such as Williams'E, RPMI, MEM, MCDB (Peehl, DM. And Ham, RG, (1980), I n vitro, 16: 526; Bettger, WJ et al. (1981) m Prcx; Natl. Acad. Sci. USA, 78: 9, 5588-5592)), KSFM (Serum-Free Keratinocyte Mediui, GIBCo BRL), etc. If necessary, it can be prepared by adding the above-mentioned components so as to have the above-mentioned concentrations. In particular, KSFM, which is considered to have an increased amino acid concentration in MCDB, is advantageous for preparing the culture solution of the present invention.
  • KSFM which is considered to have an increased amino acid concentration in MCDB
  • One embodiment of the present invention the following solutions A, and 5-20% human serum, EGFs insulin, hydrocortisone, trace elements, transferrin, T 3, Rechinoi phosphate, Asukorubin acid, in a culture solution containing choline .
  • Such a solution A and the above-mentioned reagent solutions can be sterilized after mixing, but can also be sterilized separately.
  • each solution is stored as a stock solution, it is preferable to store each solution after sterilization. Sterilization is usually performed by sterilization by filtration using an autoclave or a filter. However, filtration sterilization is preferred for a solution containing a component which is easily decomposed or thermally denatured. Filters and filters for sterilization by filtration Units and autoclave equipment are well known to those skilled in the art and are commercially available.
  • the culture solution of the present invention can be stored after sterilization by mixing all the components. However, it is preferable that some components are separately sterilized and stored, and aseptically mixed at the time of use.
  • amino acids and salt solutions such as solution A described above, human serum, growth factors such as EGF and HGF, insulin, dexamethasone, and corticosteroids such as hydrocortisone; Transferrin, a trace element mixture, thyroid hormone, GH and / or IGF-1, glucagon, ascorbic acid, etc. may be stored separately and mixed aseptically when used.
  • the method of storing each component may be in accordance with the conditions usually used for each component.
  • the prepared culture solution is stored at a low temperature, for example, at about 1 ° C to about 10 ° C, preferably at about 2 ° C to about 4 ° C.
  • Serum, growth factors and hormone-free solutions can be stored after sterilization in the dark, at low temperatures, preferably at 2 ° C to 4 ° C, usually for at least one year.
  • the preservation method and storage period of the basic culture solution can vary to some extent depending on the composition of the basic culture solution used.
  • Each component may be sterilized before storage, or immediately before or after mixing, but is preferably sterilized before storage.
  • the culture solution of the present invention prepared or stored in this way may be further added with components generally used for cell culture as necessary, and then appropriately added in the same manner as a normal medium. It can be transferred to a culture vessel and used. For example, various antibiotics may be added to the culture solution of the present invention as needed.
  • the culture solution of the present invention is most suitable for culturing normal human mature hepatocytes.
  • the culture solution of the present invention is also suitable for culturing cells other than normal human mature hepatocytes, in particular, liver-derived cells having liver function, for example, small human hepatocytes.
  • liver-derived cells having liver function for example, small human hepatocytes.
  • small hepatocytes refers to a special type of small cells derived from the liver that have been discovered and named by the present inventors and have characteristics as hepatocytes but can be distinguished from mature cells (Mitaka, T. et al., Hepatology, 29, 111-1355 (1999)).
  • Normal mature human hepatocytes cultured in the culture solution of the present invention may be obtained by any method, and can be prepared, for example, as follows.
  • liver-derived cells can be obtained by excising normal liver tissue from a liver tissue excised together with a lesion from a cancer patient or the like having a few metastatic foci in the liver, and using a normal liver perfusion method or a puncture perfusion method.
  • preperfusion with Hanks buffer containing about 0.5 ⁇ of EGTA perfusion with a buffer containing enzymes such as collagenase-dispase, and then mesh After passing through to remove unnecessary tissue fragments, the cells can be obtained by low-speed centrifugation. Centrifugation may be performed under conditions sufficient to separate non-parenchymal cells and parenchymal cells. For example, centrifugation at 50 ⁇ g for 1 minute and resuspension may be repeated several times.
  • Normal human mature hepatocytes prepared by such a method or another appropriate method can be immediately transferred to the culture medium of the present invention and cultured.
  • the initial cell concentration is generally not particularly limited within a range suitable for culturing adherent cells, but is preferably not very low in order to maintain the differentiation ability of the cells, particularly l.OxlO 5 cells / m 5.0 ⁇ 10 approximately 5 cells / ml are preferred.
  • the exchange of the culture medium depends on the state of the cells, but it is usually preferable to exchange the culture medium once every two days.
  • the other conditions other than the culture solution are the same as those for general human cells, especially the conditions conventionally used for primary culture of human hepatocytes. Can be adopted.
  • both 5% C0 2, 37 ° C and the culture solution of the present invention, Isseki general C0 2 incubator Bae was set at 95% humidity can be utilized device of one such culture vessel is also limited Instead, containers of various shapes and sizes used for cell culture can be used according to the purpose.
  • culture vessels coated with collagen or fibronectin are used for cultivation. Such culture vessels are well known to those skilled in the art, and may be prepared in-house, and may be commercially available together with the apparatus for culture.
  • human mature hepatocytes or small hepatocytes cultured in the culture solution of the present invention to maintain their function as hepatocytes depends on various markers, such as albumin, transferrin, and glucose metabolism secreted into the medium.
  • Glucose-6-phosphoric acid which is involved in glucose, can be used. These can be confirmed by well-known methods such as ELISA and Western plate analysis.
  • cell proliferation was measured by a dye exclusion method using a dye such as trypan blue, an MTT method using MTT conversion, a BrdU method using the degree of MA synthesis using BrdU and anti-BrdU antibody as an index, or It can be confirmed by a flow cytometry method that directly measures the amount of DNA. All of these can be performed by standard methods well known to those skilled in the art.
  • the normal human mature hepatocytes grown and maintained or maintained using the culture medium of the present invention in this manner can be used as cultured cells for research, or can be used for artificial liver.
  • Informed consent was obtained from a liver resection operation case without infectious diseases such as metastatic liver cancer and biliary tract cancer, and a normal liver section of about 3 g was obtained.
  • the subjects were 6 metastatic liver cancers from colorectal cancer, 2 gallbladder cancers or cholangiocellular carcinomas, and 2 liver localizations conducted at Kyoto University Hospital and related hospitals from February 1999 to April 2000.
  • Focal Nodular Hyperplasia (2 cases) and hepatic hemangioma (1 case) totaled 11 cases, with an average age of 45.9 ⁇ 5.2 years. The youngest was 17 years old and the oldest was 82 years old.
  • Keratinocyte Stimulant Factor Medium (KSMF) (GIBCO BRL), which is commercially available as a serum-free culture solution for human keratinocytes (Marcelo, CL et al., (1978), J. Cell Biology, 79, 360; Price, FM (1980), In vitro, 16, 147, etc.) by adding 10% human serum, lOmM nicotinamide, 10 ng / ml EGF, ImM ascoflavinic acid, and 30 mg / l proline to each reagent. Prepared.
  • Example 3 Culture of mature human hepatocytes
  • the obtained parenchymal cell fraction was seeded on a type I collagen-coated culture dish at a cell concentration of 2.0 ⁇ 10 5 viable cells / ml.
  • the cells were cultured using the above culture solution of the present invention in an incubator at 5% CO 2 , 37 ° C. and 95% humidity.
  • the culture medium was changed about once every two days.
  • the cells cultured in this manner are subjected to morphological observation with an optical microscope or an electron microscope, measurement of albumin production by ELISA, and mRNA expression of liver-specific proteins (albumin, transferrin) by RT-PCR. Detection and measurement of the BrdU label index by immunohistological staining were performed.
  • the culture solution was replaced with the above culture solution from which the serum had been removed, and cells cultured for 2 hours in a serum-free state were used.
  • Electron microscopic observation also revealed that when cultured in the culture solution of the present invention, formation of peroxisomes, evening junctions, and bile canaliculi was observed in the culture 8 weeks after the start of the culture.
  • the amount of albumin secreted into the medium was measured by ELISA over a period of 12 weeks from the start of the culture of the mature human hepatocytes.
  • Williams'E was used as a control culture. In the system using Williams' E, albumin production reached a maximum in 5 to 7 days, then gradually decreased to below the detection limit in about 2 weeks (Fig. 1, Fig. 2).
  • albumin production continued to beak for one to three weeks. After the peak, albumin production gradually decreases, but around 5 to 6 weeks, there is a time when the decrease in albumin production stops, and at least 2 Over the month, significantly higher albumin production was seen compared to the conventional medium.
  • Figures 1 and 2 show typical examples of the measurement results. Although there were differences in the absolute values of the concentrations in the two cases, similar results were obtained for the time course of albumin production.
  • BrdU (5-bromo-2'-doxydiridine) (Sigma) was added to cells cultured on 35 thigh culture dishes to a final concentration of 40 ⁇ M, and after 48 hours, fixed with 100% ethanol. Stored in ethanol at -20 ° C until use. At the time of measurement, the DNA double-strand was unbound with 2N HC1, blocking endogenous peroxidase, blocking with skim milk, ABC method using mouse monoclonal anti-BrdU antibody (Amersham DAK0) Stained. Cells having BrdU (+) nuclei were counted as positive cells, and the number of positive cells for a total of 1,000 cells was expressed as a percentage (%) and recorded as a BrdU labeling index.
  • a culture solution containing human serum (culture solution A) and a culture solution containing pepsin serum (culture solution B) having the following compositions were prepared.
  • Antibiotic culture solution B KSFM + 10% ⁇ fetal serum
  • the secretion level gradually increased for 2 weeks after the start of the culture, and gradually decreased thereafter.
  • the amount of secretion in the system using fetal bovine serum gradually decreased from immediately after the start of culture, and fell below the measurement limit in 4 to 5 weeks.
  • normal human mature hepatocytes can be proliferated and / or maintained for a long period of time while maintaining their functions, and cultured while maintaining hepatocyte functions for at least 2 months. be able to.
  • normal human mature hepatocytes that maintain liver function can be prepared in large quantities and can be maintained for a long period of time. It can be used for research on viruses and production of human hepatocyte-derived proteins that are difficult to produce with microorganisms.
  • the normal human mature hepatocytes grown and / or maintained in large amounts using the culture solution of the present invention can be effectively used for liver transplantation or production of artificial liver.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明細書
正常ヒト成熟肝細胞用培養液 発明の背景
本発明は、 正常なヒト成熟肝細胞の増殖および維持のための培養液に関する。 肝細胞は体内における化学工場と言われるくらいに多彩な機能を持っている。 血清タンパク質の 90%以上は肝細胞が産生しており、 肝細胞は、 体内に取り込ま れたり産生された有害物質を代謝し解毒している。 そのため、 正常なヒト成熟肝 細胞を培養し、 その機能を使って有害物質を検出 （バイオセンサー） する、 ある いは、 ヒトに必要な物質の生産を体外で可能にしょうとするなど、 様々な研究機 関で成熟肝細胞に関する研究がなされている。
また、 医学の分野においてはヒト肝細胞を大量に確保するということは重篤な 肝疾患に苦しむ人々を救う治療法を確立する上で緊急な課題である。 肝不全は様 々な原因で起こり、 発症すると非常に致命率の高い疾患である。 現在最も救命率 の高 、治療法は肝移植のみと言ってもよい。
日本においても脳死移植法案が成立し、 脳死肝移植が始まっている。 しかしな がら、 ドナーの数は限られており、 一つのドナー肝を一人ないし二人のレシピエ ントに移植する方法を行なっているという現在のような状況では、 大多数の患者 が移植を受けられないまま死を迎えるのは明らかである。 それらの患者を救うた めには人工的に肝臓を作る、 すなわち人工肝臓を作るのが最も適切と考えられ、 かつ、 現状ではそれ以外の選択肢が無いに等しい。 そのような人工肝臓としては、 現在のところ、 劇症肝炎の患者の一時的な治療にブ夕肝臓細胞を使ったハイプリ ヅト型人工肝臓が米国において治験として使われているに過ぎない。 その場合も 数時間の使用に耐えられるのみであって、 その治療効果については議論のあると ころである。 さらに、 これまでのところ、 肝細胞機能を充分に維持し得るヒト肝 細胞を大量に確保できていないため、 そのようなハイブリツド型人工肝臓におい てもプ夕肝細胞を使わざるを得ない。
また、 肝不全を起こす疾患には、 劇症肝炎、 肝硬変、 肝癌などが症例的には多 いが、 先天的な遺伝子欠損により起こる代謝疾患も少数ながら存在する。 それら の代 ϋ性疾患では、 それそれ欠損しているタンパク質を補充すると発症をしない と予測されることから、 近年、 肝細胞移植がそれらの疾患の治療法として考えら れるようになってきた。 患者本人の肝細胞を体外で培養し欠損している遺伝子を その細胞内に組み込んで、 再び肝臓に戻すという方法である。 しかしながら、 こ のような場合、 遺伝子を組み込む細胞は成熟肝細胞、 特にヒトの成熟肝細胞であ るため、 遺伝子の導入効率が悪いばかりでなく、 肝臓内で増殖させることが未だ できず、 比較的短期間のうちに発現細胞が消失することが知られている。
このような種々の目的のために、 正常なヒト成熟肝細胞をその機能を維持した まま大量に調製する手段が望まれてきた。 しかしながら、 正常ヒト成熟肝細胞は 培養が困難であり、 肝臓から単離されて培養が開始されると急速に肝細胞として の機能を失い、 かつ、 継代培養は (まとんど不可能であった。 従って、 従来の培養 液および培養方法を用いた場合は、 分離された正常ヒト成熟肝細胞を実験に使用 し得るレベルに 1週間程度の期間維持することすら難しく、 細胞を増殖させるこ とは更に困難であった。 これに対して、 継代培養可能なヒト肝細胞株もいくつか 樹立されてはいるものの、 これらは正常なヒト成熟肝細胞とは呼べないものであ り、 更に、 そのいくつかはラット細胞との混合培養を必要とするなど、 特殊な培 養条件を必要とするものである。
正常なヒト成熟肝細胞の初代培養のために、従来 L-15/Ham F- 12= 1： 1混合培 養液、 Willi lams' E/Ham F-12= 1 ： 1混合培養液、 アルギニンフリー Willilams' E、 RPMIに微量元素を加えた培養液、 DMEM、 およびこれらにトランスフェリン、 ィンシュリンゃ甲状腺ホルモン等のホルモンや HGF等の増殖因子等を加えた培養 液等が考えられてきた。 しかしながら、 これらの培養液を用いた場合であっても、 前述したように、 正常ヒト成熟肝細胞を 1週間以上の長期にわたって維持するこ とは事実上不可能であり、 増殖はほとんど認められなかつた。 発明の開示
本発明の目的は、 ヒトの正常な成熟肝細胞をその機能を維持したまま増殖およ び維持するための培養液を提供すること、 および、 その培養液の正常ヒト成熟肝 細胞の培養への使用である。
本発明の培養液は、 ヒト血清を含むことを特徴とする、 正常ヒト成熟肝細胞用 の培養液である。
本発明の培養液は、 必須アミノ酸、 ヒスチジン、 アルギニンまたはオルニチス グリシン、 プロリン、 グルタミン、 システィン、 セリン、 ヒト血清、 ニコチンァ ミ ド、 増殖因子、 インシュリン、 副腎皮質ホルモンを含むことを特徴とする正常 ヒト成熟肝細胞用培養液である。
また、 本発明の別の培養液は、 更に、 トランスフェリン、 微量元素を含む培養 液である。
さらに、 本発明の別の培養液は、 上記成分に加えて、 グルカゴン、 甲状腺ホル モン、 成長ホルモン、 および、 ァスコルビン酸を含み、 カルシウム濃度が極めて 低いことを特徴とする培養液である。
また、 本発明の別の側面は、 ヒト成熟肝細胞をその機能を維持したまま培養す るための前記培養液の使用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の培養液および Williams' E (+FCS) (▲) 培養液で培養したヒ ト （55歳）からの成熟肝細胞におけるアルブミン生産量を比較したものである。 K SMF HS (+) (園） はヒト血清を含む KSFM培地、 KSFM HS (-) (♦)はヒト血清を含まな い KSFM培地を意味する。
図 2は、 本発明の培養液および Williams' E (+FCS) (▲) 培養液で培養した ヒト （56歳） からの成熟肝細胞におけるアルブミン生産量を比較したものである。 HS (+) (園） はヒト血清を含む KSFM培地、 HS (-) (令）はヒト血清を含まない KSFM培 地を意味する。
図 3は、 1 0 %ヒト血清及び 1 0 %牛胎児血清を含む培養液におけるヒト成熟 肝細胞のアルブミン産生量を比較したものである。 5 5歳ヒト肝臓から肝細胞を 分離培養した。 秦は 1 0 %牛胎児血清を含む KSFM培地、 〇は 1 0 %ヒト血清を含 む KSFM培地を表す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の培養液は、 必須アミノ酸、 ヒスチジン、 アルギニンまたはオル二チン、 グリシン、 プロリン、 グルタミン、 システィン、 セリン、 ヒト血清、 ニコチンァ ミド、 増殖因子、 インシュリン、 副腎皮質ホルモンを含むことを特徴とする。 特 に、 本発明の培養液は、 通常のヒト培養細胞用の培養液に比較して高濃度の必須 アミノ酸、 高濃度のヒスチジン、 高濃度のアルギニンまたはオル二チン、 高濃度 のグリシン、 高濃度のプロリン、 高濃度のグルタミン、 高濃度のシスティン、 高 濃度のセリンを含むことが好ましく、 より好ましくは、 更に、 トランスフェリン、 および微量元素を含む。
必須アミノ酸は生物種によって若干異なることが知られており、 例えば、 ヒト ではパリン、 ロイシン、 イソロイシン、 スレオニン、 フエ二ルァラニン、 トリプ トフアン、 メチォニン、 リジンの 8種であり、 ラヅトでは更にヒスチジン、 アル ギニンを加えた 1 0種、 トリでは更にグリシンを加えた 1 1種であることが知ら れている。 また、 肝細胞はオル二チンをアルギニンの代わりに利用できることか ら、 成熟肝細胞の培養を目的とした本発明の培養液においては、 アルギニンとォ ルニチンは互換的に使用することができる。 寧ろ、 オル二チンを利用できない他 の細胞、 例えば、 線維芽細胞などの増殖を抑えるため目的でアルギニンの代わり にオル二チンを使用するのが好ましい場合もある。 本明細書ではヒトにとって必 須である前述の 8種のアミノ酸を 「必須アミノ酸」 と称する。 すなわち、 本明細 書においては、 用語「必須アミノ酸」 とは、 具体的には、 パリン、 ロイシン、 ィ ソロイシン、 スレオニン、 フエ二ルァラニン、 トリプトファン、 メチォニン、 リ ジンを意味する。 また、 本明細書においては特に断りのない限りアミノ酸は L-体 である。
より好ましくは、 本発明の培養液は、 グルカゴン、 甲状腺ホルモン、 成長ホル モン（GH)またはインシュリン様成長因子（IGF-1)、 ビタミンを含み、カルシウム濃 度が低いこと、例えばカルシウム濃度が O. lmM以下であることが更に好ましい。本 発明の培養液における必須アミノ酸およびヒスチジン、 アルギニンまたはオル二 チン、 グリシン、 プロリン、 グルタミン、 システィン、 セリンの濃度は一般にヒ ト細胞の培養に使用される培養液、 例えば、 Williams' E(Williajns5 G.M.と Gunn, J.M. (1974), Exp. Cell Research, 89, 139-142)、 RPMK DMEM(Dulbecco, Rと F reeman, G(1959)Jirology. 8，396-397)、 MCDB (Poehl，D.M.と Ham,R.G.， (1980), In Vitro, 16 :528)、 L-15等に含まれる必須アミノ酸、 ヒスチジン、 アルギニン またはオル二チン、 グリシン、 プロリン、 グルタミン、 システィン、 セリンの各 々について最小濃度の約 1.5倍から〜各々のアミノ酸についての最大濃度である ことが好ましく、 更に好ましくは、 これらの培養液中の必須アミノ酸、 ヒスチジ ン、 アルギニンまたはオル二チン、 グリシン、 プロリン、 グルタミン、 システィ ン、セリンの各々について最小濃度の約 1.5倍〜各々のアミノ酸について最大濃度 の約半分である。 特に、 本発明の培養液中のアミノ酸濃度に関連して使用する場 合、 「高濃度」 とは、 以下の表 1〜表 4に例示した Williams' E、 DMEM、 MCDBおよ び L-15の各培養液に含まれる各アミノ酸について、 最も濃度の低い培養液中の値 の約 1.5倍からこれら 4種の培養液中における最大濃度の範囲にある濃度をいう。 前述したように、 本発明の培養液においてはアルギニンとオル二チンは互換的に 使用できるため、 アルギニンの代わりにオル二チンを使用する場合、 その濃度は アルギニンと同じである。
本発明の培養液中は、 上で定義した意味において高濃度の必須アミノ酸、 高濃 度のヒスチジン、 高濃度のアルギニンまたはオル二チン、 高濃度のグリシン、 高 濃度のプロリン、 高濃度のグルタミン、 高濃度のシスティン、 高濃度のセリンを 含むことが好ましく、 より好ましくは、 必須アミノ酸、 ヒスチジン、 アルギニン またはオル二チン、 グリシン、 プロリン、 グルタミン、 システィン、 セリンを、 これらの各アミノ酸の濃度に関して、 表 1〜表 4に示す Williams' E、 DMEM、 MCDB および L- 15の各培養液中の最も低い値の約 1.5倍からこれら 4種の培養液中にお ける最も高い値の半分程度までの濃度範囲で含む。
Williams' E、 DMEM、 MCDBおよび L-15はそのアミノ酸組成および濃度が若干異な る種々の改変培養液が知られているが、 これらの培養液に含まれる各アミノ酸濃 度の代表的例を以下の表 1〜表 4に示す。
1 . Willilams' E中のアミノ酸濃度
アミノ酸 Williams' Eにおける濃度
L -ァラニン 0.09 g/l(1.0mM)
L -アルギニン （塩基フリー） 0.05 g/l(0.3mM)
L -ァスパラギン ·¾0 0.02 g/l(0. )
L -ァスパラギン酸 0.03 g/l(0.2mM)
L-システィン （酸フリー） 0.04 g/l(0.3mM)
L-シスチン 0.02 g/l(0.08mM)
L-グル夕ミン酸 0.045 g/l(0.3mM)
L-グル夕ミン 0.3g/l(2.0mM) グリシン 0.05 g/l(0.7mM)
L-ヒスチジン 0.02 g/l(0.1mM)
L -ィソロイシン 0.05 g/l(0.4niM)
L-ロイシン 0.08 g/l(0.6mM)
L-リジン 'HC1 0.09 g/l(0.5mM)
L-メチォニン 0.015 g/l(0.10mM)
L-フエ二ルァラニン 0.025 g/l(0.15mM)
L-プロリン 0.03 g/l(0.3m )
L -セリン 0.01 g/l(0.1m )
L-スレオニン 0.04 g/l(0.3m )
L-トリブトファン 0.01 g/l(0.05EM)
L -チロシン ·2Ν&·2¾0 0.05 g/l(0.2mM)
L-バリン 0.05 g/l(0.4inM)
. DMEM中のアミノ酸濃度
アノ 、 ,ノ西 B祭 D丽 おけ
L-アルギニン 'HC1 0.084 g/l(0.4iM)
L-システィン '2HC1 0.063 g/l(0.4mM)
L-グル夕ミン 0.58 g/l(4.0m ) グリシン 0.03 g/l(0.4mM)
L-ヒスチジン 'HC1'¾0 0.042 g/l(0.2mM)
L-イソロイシン 0.11 g/l(0.8mM)
L-ロイシン 0.11 g/l(0.8mM)
L-リジン 'HC1 0.15 g/l(0.8mM)
L-メチォニン 0.03 g/l(0.2mM)
L-フエ二ルァラニン 0.066 g/l(0.40mM)
L -セリン 0.042 g/l(0.40mM)
L-スレオニン 0.095 g/l(0.8mM)
L一卜リフ卜ファン 0.016 g八（0.08 )
L -チロシン ·2Ν ·2Η20 0.10 g/l(0.4niM)
L -バリン 0.094 g/l(0.8mM)
. MCDB中のアミノ酸濃度の例
アミノ酸 MCDBにおける濃度
L-ァラニン 0.0089 g/l(0.1mM)
L -アルギニン 'HC1 0.2 g/l(1.0mM)
L-ァスパラギン ·Η20 0.015 g/l(0.1mM)
L-ァスパラギン酸 0.004 g/l(0.3mM)
L-システィン 'HC1'¾0 0.042 g/l(0.2mM)
L-グル夕ミン酸 0.015 g/l(0.1 M)
L-グル夕ミン 0.88 g/l(6.0 M) グリシン 0.0075 g/l(0.10mM)
L-ヒスチジン 'HC1'¾0 0.017 g/l(0.08mM)
L-イソロイシン 0.002 g/l(0.015niM)
L-ロイシン 0.066 g/l(0.5niM)
L-リジン 'HC1 0.018 g/l(0.10mM)
L-メチォニン 0.0045 g/l(0.025mM)
L-フエ二ルァラニン 0.005 g/l(0.03mM)
L-プロリン 0.012 g/l(0.1mM)
L -セリン 0.063 g/l(0.6mM)
L -スレオニン 0.01191 g/K lmM)
L -トリプトファン 0.0031 g/l(0.015mM)
L-チロシン ·2 ·2Η20 0.0039 g/l(0.015mM)
L -バリン 0.035 g/l(0.3iuM)
表 4 . L- 15のアミノ酸濃度例
Figure imgf000012_0001
本発明に添加されるヒト血清の濃度は、 5 %〜20%、 好ましくは 5 %~15%で ある。 本発明の培養液に使用し得る増殖因子としては、 例えば、 EGF、 HGF、 TGF- ひ、 またはこれらの組み合わせが含まれ、 特に EGFおよび/または HGFが好ましい c 本発明の培養液はニコチンアミ ドを、好ましくは 5 mM〜15mM、より好ましくは 5 m M〜10mMの濃度で含む。本発明の培養液中の増殖因子の濃度は、好ましくは合計と して lng/ml〜50ng/ml、 より好ましくは合計として 5 ng/ml〜50ng/mlである。また、 本発明の培養液中のィンシュリン濃度は、好ましくは 50nM〜 1 M、 より好ましく は 100nM〜0.5〃Mである。
本発明の培養液に使用し得る副腎皮質ホルモンには、 例えば、 コルチゾン、 ヒ ドロコルチゾン、 デキサメタゾン、 およびこれらの組み合わせが含まれ、 ヒドロ コルチゾンおよび/またはデキサメ夕ゾンが好ましい。 副腎皮質ホルモンの濃度 は、 好ましくは合計 10nM〜 1〃M、 より好ましくは合計 50nM〜200nMである。 本発 明の培養液に使用され得るトランスフェリンの濃度は、 好ましくは 1〃g/ml〜； L5 〃g/ml、 ょり好ましくは5
Figure imgf000013_0001
15 ^/1111でぁる。
本発明の培養液に使用し得る微量元素は、 一般に培養細胞の培養、 特にヒト肝 細胞の初代培養に使用されるものを含み、 例えば、 セレン、 マンガン、 ケィ素、 モリプデン、 バナジウム、 ニッケル、 スズ、 亜鉛、 鉄、 マグネシウム、 銅、 およ びこれらの組合せからなる群より選ぶことができる。 微量成分としては、 約 20nM 〜30nMのセレン （NaSe03) 、 約 0.5nM〜； InMマンガン (MnCl2)、 約 400nM〜500nMのケ ィ素 （N Si03) 、 約 0.5nM〜； LnMのモリブデン （（NH4)6Mo7024) 、 約 2nM〜5nMのバナ ジゥム （NH4V03) 、 約 0. 1nM〜0.5nMの二ヅケル （NiS04) 、 約 0. 1nM〜0.5nMのスズ
(SnCl2) 、 約 0.1 M〜3 /Mの亜鉛（ZnS04)、 約 1〃M〜10 Mの鉄 (FeS04) 、 約 0· 5nM~1.5mMのマグネシウム （MgCl2) 、 約 5nM〜： llnMの銅 （CuS04) 、 またはこれら の組み合わせを挙げることができる。
本発明の培養液に使用し得る甲状腺ホルモンには、 トリョードサイロニン（T 3)、 サイロキシン （T4 ) が含まれ、 特に Τ3が好ましい。 甲状腺ホルモンの濃度は、 Τ3 が用いられる場合、 好ましくは 5 ηΜ〜： 100ηΜ、 より好ましくは 10ηΜ〜50ηΜである。 本発明の培養液の作製のためには、 成長ホルモンとィンシュリン様成長因子は互 換的に使用することができ、 それらの濃度は、 好ましくは合計約 l ng/ml~20ng/ ml、 より好ましくは合計 5 ng/ml〜15ng/mlである。 更にグルカゴンが添加される 場合は、 その濃度はインシュリンと同様である。
本発明の培養液に添加するビ夕ミンとして使用し得るものには、 ァスコルビン 酸および/またはレチノィン酸、および、コリンを含むビ夕ミン B複合体が含まれ、 ァスコルビン酸が特に好ましい。 これらのビタミンの濃度は、 好ましくは 0.5 〜1.5m、 より好ましくは 0.5mM〜1.0mMである。
本発明の培養液は場合により、 0. 1mM〜0.5mMのエタノールァミン、 および 0.1m M〜0.5mMのホスホエタノールアミンを更に含んでいてもよい。
更に、 本発明の培養液は、 細胞培養液に通常用いられるその他の成分、 例えば 上記以外の非必須アミノ酸、 リン酸ナトリウムや塩ィ匕ナトリウム等の無機塩、 上 記以外の種々のビタミン、 乳酸、 D-グルコース、 D-ガラクト一ス、 Hepesのような 緩衝剤、 pH指示薬、 適切な抗生物質、 その他を含んでいてよい。
また、 本発明の培養液は、 公知の培養液、 あるいは商業的に入手可能な培養液、 例えば、 Williams' E、 RPMI、 MEM、 MCDB (Peehl, DM.と Ham, R. G. , (1980), I n vitro, 16:526、 Bettger, W. J.ら（1981 )m Prcx;. Natl . Acad. Sciつ USA, 78: 9, 5588-5592) ) 、 KSFM( Serum-Free Keratinocyte Mediui, GIBCo BRL)等に、 必 要に応じて上述した各成分が上述した濃度となるように添加して調製することも できる。 特に、 MCDB中のアミノ酸濃度を高めたと考えられる KSFMは本発明の培養 液を作製するために好都合である。
本発明の一つの実施態様は、 以下の溶液 A、 および 5 ~20%のヒト血清、 EGFs インシュリン、 ヒドロコルチゾン、 微量元素、 トランスフェリン、 T3、 レチノィ ン酸、 ァスコルビン酸、 コリンを含む培養液である。
溶液 Aの組成—
L -アルギニン 0.45mM~3.0mM
L-ヒスチジン 0.1mM~1.6mM
L-イソロイシン 0.02mM~2.0mM
L-ロイシン 0.7mM〜： L OmM
L-リジン 0.2mM〜0.80mM
L-メチォニン 0.04mM〜： LOmM
レフェニルァラニン 0.05mM〜1.5mM
L-スレオニン 0.45mM〜5.0mM
L-トリプトファン 0.02m〜0.1mM
L-チロシン 0.02mM~1.7mM
L-バリン 0.45mM〜1.7mM
L -セリン 0.15mM〜2m
L-プロリン 0.15mM〜0.3mM
L -グル夕ミン 3 . 0]DM~6. 0IDM
L -システィン 0.3mM〜； L OmM
グリシン 0.15m〜2.7mM
カルシウム 0.05mM〜0.1mM このような溶液 Aおよび、上述の各試薬溶液は混合後に滅菌することも可能であ るが、 別々に滅菌することも可能である。 各溶液をストック溶液として保存する 場合は、 各々滅菌して保存するのが好ましい。 滅菌は通常オートクレープまたは フィルターによる濾過滅菌によって行なうが、 熱分解または熱変性し易い成分を 含む溶液は濾過滅菌が好ましい。 濾過滅菌のためのフィルターおよびフィル夕一 ユニット、 およびオートクレープ装置は当業者によく知られており、 商業的に入 手可能である。
本発明の培養液は、 全ての成分を混合して滅菌後に保存することもできるが、 一部の成分を別々に滅菌後保存しておき、 使用時に無菌的に混合することが好ま しい。 一部の成分を別に保存する場合は、 例えば、 上述の溶液 Aのようなァミノ 酸および塩類溶液、 ヒト血清、 EGFや HGF等の増殖因子、 インシュリン、 デキサメ 夕ゾンゃヒドロコルチゾン等の副腎皮質ホルモン、 トランスフェリン、 微量元素 混合物、 甲状腺ホルモン、 GHおよび/または IGF-1、 グルカゴン、 ァスコルビン酸 等を別に保存しておき使用時に無菌的に混合してもよい。 この場合、 各成分の保 存方法はそれそれについて通常使用される条件に従えばよい。 全ての成分を混合 した場合は、あまり長期間保存しないことが好ましく、例えば 1ヶ月程度で新たに 調製するのが好ましい。この場合、調製された培養液は喑所、低温、例えば約 1 °C 〜約 10°C、 好ましくは約 2 °C〜約 4 °Cにて保存する。
血清、 増殖因子、 ホルモンを含まない溶液 （基本培養液） は滅菌後暗所、 低温、 好ましくは 2 °C〜4 °Cにて、 通常少なくとも 1年は保存可能である。 しかしなが ら、 基本培養液の保存方法および保存可能期間は使用する基本培養液の組成によ つてある程度変動し得るものである。 各成分は保存前に滅菌してもよく、 混合直 前、 または混合後に滅菌してもよいが、 保存前に滅菌するのが好ましい。
このようにして調製した、 あるいは保存しておいた本発明の培養液は、 一般に 細胞培養に用いられることのある成分を必要に応じて更に添カ卩した上で、 通常の 培地と同様に適宜培養容器に移して使用することができる。 例えば、 必要に応じ て種々の抗生物質を本発明の培養液に加えて使用してもよい。
本発明の培養液は正常なヒト成熟肝細胞を培養するために最も適している。 し かしながら、 本発明の培養液は正常なヒト成熟肝細胞以外の細胞、 特に肝臓由来 の、 肝機能を有する細胞、 例えば、 ヒト小型肝細胞の培養にも適している。 ここ で 「小型肝細胞」 とは、 本発明者らによって発見され命名された、 肝細胞として の特徴を有するが成熟細胞とは区別し得る、 肝臓由来の特別な種類の小型細胞を いう (Mitaka, T.ら、 Hepatology, 29, 111-1355 (1999)) 。
本発明の培養液によつて培養される正常なヒト成熟肝細胞はどのような方法に よって入手してもよいが、 例えば以下のように調製することができる。 例えば、 肝臓に僅かの転移巣がある癌患者等から病巣と共に切除された肝組織から正常肝 臓組織を切り出し、 通常の肝灌流法又は穿刺灌流法によつて肝臓由来細胞を得る ことができる。例えば、 0.5ηι程度の EGTAを含むハンクス緩衝液で前灌流を行なつ た後、コラゲナ一ゼ -ディスパ一ゼ等の酵素を含む緩衝液を用いて灌流を行なった 後、 必要に応じてメッシュ等を通すことにより不要な組織破砕物を除去した後、 低速遠心によって実質細胞を得ることができる。 遠心は非実質細胞と実質細胞を 分離するために充分な条件であればよく、例えば 50xgにて 1分間の遠心、再懸濁 を数回繰り返すことによって得られる。
このような方法、 あるいは、 他の適切な方法により調製された正常ヒト成熟肝 細胞は、 直ちに本発明の培養液中に移して培養することができる。 初期細胞濃度 は一般的に接着細胞の培養に適切である範囲で特に限定されないが、 細胞の分化 能を維持するためにはあまり低濃度でないことが好ましく、 特に l. OxlO5細胞/ m 1〜5.0χ105細胞/ ml程度が好ましい。培養液の交換は、細胞の状態に依存するが、 通常は約 2日に 1回交換するのが好ましい。
本発明の培養液を用いてヒト成熟肝細胞を培養する場合、 培養液以外のその他 の条件に関しては一般的なヒト細胞に対する条件、 特に、 従来ヒト肝細胞の初代 培養に用いられてきた条件を採用することができる。 例えば、 本発明の培養液と 共に 5 %C02、 37°C、 湿度 95%に設定した一般的な C02インキュぺ一夕一等の装置 を利用することができ、 培養容器も特に限定されず、 細胞培養に利用される種々 の形状、 大きさの容器を目的に応じて利用することができる。 ヒト成熟肝細胞の 培養には、 一般にコラーゲンあるいはフアイブロネクチンでコートした培養容器 が使用されるが、 そのような培養容器は当業者によく知られており、 自家調製し てもよく、 培養のための装置と共に商業的に容易に入手することもできる。 本発明の培養液によつて培養されたヒト成熟肝細胞または小型肝細胞が肝細胞 としての機能を維持していることは種々のマーカー、 例えば、 培地中に分泌され るアルビミンやトランスフェリン、グルコース代謝に関与するグルコース- 6-フォ スファ夕一ゼゃグリコーゲンなどが利用できる。 これらは EL I SA、 Westernプ口ヅ ト解析等のよく知られた方法で確認することができる。 また、 細胞の増殖はトリ パンブル一等の色素を用いた色素排除法、 MTTの転換を利用した MTT法、 BrdUおよ び抗 BrdU抗体を用いた MA合成の程度を指標とした BrdU法、 あるいは、 直接 DNA量 を測定するフ口一サイ トメトリー法等によって確認することができる。 これらは いずれも当業者に良く知られた標準的な方法によって行なうことができる。 このようにして本発明の培養液を用いて増殖および Zまたは維持された正常な ヒト成熟肝細胞は、 研究用の培養細胞として利用することもでき、 人工肝臓に使 用することもできる。
(実施例）
実施例 1 . 正常なヒト成熟肝細胞の単離
転移性肝癌、 胆道系癌等の、 感染症を持たない肝切除手術症例より、 インフォ —ムドコンセントを取った上で、 3 g前後の正常肝臓切片を得た。 対象は 1999年 1 2月から 2000年 4月までに京都大学医学部付属病院およびその関連病院で行なわ れた、 大腸癌からの転移性肝癌 6例、 胆嚢癌または胆管細胞癌 2例、 肝限局性結 節性過形成 (Focal Nodular Hyperplasia) 2例、 肝血管腫 1例の計 11例で、平均 年齢は 45.9±5.2歳であった。 最若例は 17歳、 最高齢例は 82歳であった。
lOcc注射器による穿刺法にて、 0.5mM EGTA含有ハンクス緩衝液 (137 M NaCl， 2. 68m KC1, 0.7mM Na2P04-12¾05 lOmM Hepes, lOniM グルコース，pH7.4)250mlで前 灌流後、 同量の 0.1%コラゲナ一ゼ一 0.5%ディスパ一ゼ液によって二段めの灌流 を行ない、 メッシュを通して大きな組織片を除去した後、 50xgにて 1分間の遠沈 を 4回行なって実質細胞画分を得た。 実施例 2 . 培養液の調製
ヒト角化細胞用の無血清培養液として市販されている Keratinocyte Stimulati ng Factor Medium(KSMF)(GIBCO BRL) (Marcelo, C.L.ら、 (1978)、 J. Cell Bil ogy, 79, 360; Price, F.M.ら、 （1980)、 In vitro, 16、 147等参照)に 10%ヒト 血清、 lOmMニコチンアミ ド、 10ng/mlの EGF、 ImMァスコフレビン酸、 30mg/lプロリン になるように各試薬を加えることによって調製した。 実施例 3 . ヒト成熟肝細胞の培養
得られた実質細胞画分を I型コラーゲンコ一ティング培養皿上に 2.0 X 105生細 胞 /mlの細胞濃度で播種した。 この細胞を上記の本発明の培養液を使用し、 5 %C 02、 37°C、 湿度 95%の培養器内で培養した。培養液は約 2日に 1回の割合で交換し た。
このようにして培養された細胞について、 絰時的に光学顕微鏡、 電子顕微鏡に よる形態観察、 ELISA法によるアルプミン産生量測定、 RT-PCR法による肝臓特異的 タンパク質 （アルブミン、 トランスフェリン） の mRNA発現の検出、 免疫組織染色 による BrdUラベルインデックスの測定を行なつた。
なお、 測定の 2時間前に培養液を上記の培養液から血清を除いたものに交換し、 無血清状態で 2時間培養を行なつた細胞を使用した。
7 実施 4 . 本発明の培養液によって培養されたヒト成熟肝細胞の挙動
( 1 ) 対照として用いた Williams' E、 および本発明の培養液を用いて培養し たヒト成熟肝細胞を光学顕微鏡下で観察した。
Williams' Eを用いて培養すると、 光学顕微鏡観察において、 1週間前後で線維 芽細胞が優位に増殖し始めることが観察され、 2週間前後で肝細胞はほとんど認 められなくなった。 一方、 実施例 1に記載の本発明の培養液を用いた場合は、 同 様な光学顕微鏡観察において、 繊維芽細胞の増殖は抑制され、 最長 13週間、 平均 9週間にわたって正常成熟肝細胞が維持されることが観察された。 また、 コロニ 一状に増殖する小型肝細胞が認められ、 近傍の成熟肝細胞の中に一部分裂像を認 めた。 更に、 本発明の培養液による培養開始 2か月目の培養物に対して免疫組織 化学染色を行なったところ、 アルブミン陽性、 CK18P昜性、 CK19陰性の結果を得た c 即ち、 本発明の培養液によって 2か月間培養された後も、 肝細胞としての機能を 維持していることが示された。
電子顕微鏡観察においても、 本発明の培養液で培養した場合には、 培養開始後 8週間目の培養物においてペルォキシソーム、 夕イ トジャンクション、 毛細胆管 形成が確認された。
( 2 ) アルブミン産生量
ヒト成熟肝細胞の培養開始から 1 2週間にわたって、 培地中に分泌されたアル ブミンの量を ELISA法によって測定した。 対照培養液として Williams' Eを使用し た。 Williams' Eを用いた系では、 5日〜 7日でアルブミン産生が最大に達した後、 漸減して約 2週間で検出限界以下まで減少した （図 1、 図 2 ) 。 これに対して実 施例 1に記載の本発明の培養液を用いた場合は、 アルブミン産生は 1週間から 3 週間にわたりビークが持続した。 ピークの後、 アルブミン産生は漸減するが、 5 〜6週間後前後でアルブミン産生の低下が止まる時期が見られ、 少なくとも 2ケ 月間にわたって、 従来培地と比較して有意に高いアルブミン産生が見られた。 測 定結果の代表的な例を図 1および図 2に示した。 2つの例において濃度の絶対値 には相違が見られるものの、 アルブミン産生量の経時変化については同様な結果 が得られた。
( 3 ) BrdUラベリングインデヅクス
36歳、 52歳、 61歳のヒトに由来する正常ヒト成熟肝細胞を各々実施例 1に記載 の培養液で培養し、 BrdUラベルインデックスを選定した。
35腿培養皿上で培養中の細胞に最終濃度 40〃Mとなるよう BrdU (5-ブロモ -2' -デ ォキシゥリジン） （Sigma)を加え、 48時間後に 100%エタノールで固定した。 使用 時までエタノール中で- 20°Cにて保存した。 測定の際には、 2N HC1で DNAの二重鎖 をほどき、 内因性ペルォキシダ一ゼをブロッキングし、 更にスキムミルクでプロ ッキングした後、 マウスモノクローナル抗 BrdU抗体 (Amersham DAK0) を用い、 A BC法で染色した。 BrdU(+)の核を持つ細胞を陽性細胞としてその数を数え、 総数 1 000個の細胞に対する陽性細胞の数をパ一センテ一ジ（％)で表して BrdUラベリン グインデックスとして記録した。
その結果、 36歳の例で培養 5曰目 21.5%、 10日目 15.3%、 15日目 7.4%であった。 49歳の例では、 5日目 14.5%、 10日目 11.2%、 15日目 5.3%、 61歳の例では 5日目 1 0.6%、 10日目 7.8%、 15日目 4.2%であった。 すなわち、培養 1 0日目にあっても 約 10〜20%の細胞がなお MA合成を続け、増殖していることが強く示唆された。一 方、 対照として Williams' Eを用いた場合は、 BrdUラベリングインデックスは 5日 目においてもほとんど 0であり、 細胞は増殖していないことが示された。 実施例 5 . 培地中のゥシ血清およびヒト血清の成熟肝細胞培養に対する影響の比 輊
培養ヒト成熟肝細胞のアルブミン分泌に対するヒト血清添加の影響を調べた。 対照培養液としてヒト血清の代わりにゥシ胎仔血清を使用した。
( 1 ) 培養液の調製
以下の組成を有するヒト血清入り培養液（培養液 A)およびゥシ血清入り培養液 (培養液 B) を調製した。
培養液 A: KSFM+10% ヒト血清
10 mMニコチンアミ ド
lm Mァスコルビン酸
30 mg/ml プロリン
10 ng/ml EGF
0.5 mg/ml ィンシュリン
10— 7 Mデキサメ夕ゾン
抗生物質 培養液 B: KSFM+10% ゥシ胎仔血清
10 mMニコチンアミド
lm M ァスコルビン酸
30 mg/ml プロリン
10 ng/ml EGF
0.5 mg/ml インシュリン
10-7 Mデキサメタゾン
抗生物質 ( 2 ) 正常ヒト成熟肝細胞の培養
( 1 ) に示した培養液 Aおよび: Bを用いて、 実施例 3に記載したのと同様な条 件でヒト成熟 S干細胞を培養し、 アルブミン産生量を測定した。 アルブミンの産生 は培養開始から 8週間にわたって培地中に分泌されたアルブミン量を ELISA法に よって測定することによって評価した。 その結果を図 3に示す。
図 3で示すように、 ヒト血清を用いた系では、 培養開始から 2週間は分泌量が 漸増し、 以後緩やかに分泌量が減少するが、 培養 8週間目でもまだ培養開始直後 の 5 0 %程度の分泌量があるのに対して、 牛胎児血清を用いた系では、 培養開始 直後より、 漸減し 4〜 5週間目には測定限界以下になった。
これらのデ一夕は従来の牛胎児血清を使う場合と比較し、 ヒト血清を使用する とアルブミン産生能の維持が明らかに良いことを示している。 本発明の培養液を使用することにより、 正常なヒト成熟肝細胞をその機能を維 持しまま増殖および/または長期間維持させることができ、 少なくとも 2ヶ月間 肝細胞機能を維持したまま培養することができる。 本発明により、 肝機能を維持 した正常ヒト成熟肝細胞を大量に調製し、 長期間維持することができるため、 そ のような細胞を in vitroの実験系、 例えば主としてヒトにしか感染しない肝炎ゥ ィルスの研究や微生物では生産が困難なヒト肝細胞由来夕ンパク質の生産等に利 用することができる。 さらに、 本発明の培養液を使用して大量に増殖および/ま たは維持した正常ヒト成熟肝細胞は肝移植または人工肝臓の作製に有効に利用す ることができる。

Claims

. ヒト血清を含むことを特徴とする、 正常ヒト成熟肝細胞用の培養液。
. 必須アミノ酸、 ヒスチジン、 アルギニンまたはオル二チン、 グリシン、 プロ リン、 グルタミン、 システィン、 セリン、 ヒト血清、 ニコチンアミド、 増殖因 子、 インシュリン、 および副腎皮質ホルモンを含むことを特徴とする、 正常ヒ 卜成熟肝細胞用の培養液。
. 以下の濃度のアミノ酸を含む、 請求項 1または 2に記載の培養液：
L-アルギニン 0.45mM〜3.0m
L-ヒスチジン O. lmM〜： L 6mM
L-ィソロイシン 0.02m〜2.0m
L-ロイシン 0.7iiM~1.0mM
L-リジン 0.2mM〜0.80mM
L-メチォニン 0.04mM~1.0mM
L -フエ二ルァラニン 0.05mM〜： L 5mM
L-スレオニン 0.45mM〜5.0mM
L-トリプトファン 0.02mM〜0.1m
L -チ口シン 0.02mM~1.7mM
L-バリン 0.45mM〜： L 7mM
L-セリン 0.15mM〜2mM
L-プロリン 0.15mM~0.3inM
L-グル夕ミン 3.0mM~6.0niM
L -システィン 0.3mM~1.0mM
グリシン 0.15mM~2.7m
. ヒト血清の濃度が 5 %~20%である、請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の培
5. ニコチンアミドの濃度が 5mM〜15mMである、 請求項 2〜4のいずれか 1項に記
6. 増殖因子が、 EGF、 HGFs TGF-ひ、 およびこれらの組み合わせからなる群より 選ばれる、 請求項 2〜 5のいずれか 1項に記載の培養液。
7. 増殖因子の濃度が lng/ml〜50ng/mlである、 請求項 2〜 6のいずれか 1項に 記載の培養液。
8.インシユリンの濃度が 50nM〜 1〃Mである、請求項 2 ~ 7のいずれか 1項に記 載の培養液。
9. 副腎皮質ホルモンが総濃度 ΙΟηΜ〜： l〃Mのデキサメタゾンおよび/またはヒド 口コルチゾンである、 請求項 2〜8のいずれか 1項に記載の培養液。
10. 更に、 トランスフェリン、 グルカゴン、 およびセレン、 マンガン、 ケィ素、 モリブデン、 バナジウム、 ニッケル、 スズ、 亜鉛、 鉄、 マグネシウム、 銅、 お よびこれらの組合せからなる群より選ばれる微量元素を含む、 請求項 1 ~ 9の いずれか 1項に記載の培養液。
11. トランスフェリンの濃度が l zg/ml〜15 g/mであり、 グルカゴンの濃度が 1 0ηΜ~1//Μであり、 および、 微量元素が 20nM〜30nMのセレン、 0.5nM〜1.0nMの マンガン、 400nM~500nMのケィ素の濃度、 0.5nM〜1.0nMのモリプデン、 2nM〜 5ηΜのバナジウム、 0.1ηΜ~0·5ηΜのニッケル、 0·1ηΜ〜0.5ηΜのスズ、 0.1 ^〜 3/ Μの亜鉛、 1 ζΜ〜； 10〃Μの鉄、 0.5mM〜； L5mMのマグネシウム、 5nM〜； nMの 銅またはこれらの組み合わせから選ばれる、 請求項 10に記載の培養液。
12.濃度 O.lmM以下のカルシウムを含む、請求項 1〜11のいずれか 1項に記載の
13. 更に、 甲状腺ホルモン、 成長ホルモンまたはインシュリン様成長因子、 ァス コルビン酸を含むことを特徴とする、 請求項 1〜12のいずれか 1項に記載の
14. 甲状腺ホルモンが 5 nM〜； ΙΟΟη の T3であり、成長ホルモンまたはインシュリン 様成長因子の濃度が 1〜20ng/mlであり、 ァスコルビン酸の濃度が O. lmM〜： LOm Mである、 請求項 1 3に記載の培養液。
15. 請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の培養液の、 正常ヒト成熟肝細胞の培 養における使用。
PCT/JP2001/008168 2000-09-22 2001-09-20 Solution de culture de cellules normales mures de foie humain WO2002024875A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002529470A JPWO2002024875A1 (ja) 2000-09-22 2001-09-20 正常ヒト成熟肝細胞用培養液
AU2001288072A AU2001288072A1 (en) 2000-09-22 2001-09-20 Culture liquor for normal human matured liver cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000288291 2000-09-22
JP2000-288291 2000-09-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002024875A1 true WO2002024875A1 (fr) 2002-03-28

Family

ID=18771899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/008168 WO2002024875A1 (fr) 2000-09-22 2001-09-20 Solution de culture de cellules normales mures de foie humain

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPWO2002024875A1 (ja)
AU (1) AU2001288072A1 (ja)
WO (1) WO2002024875A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006050943A (ja) * 2004-08-11 2006-02-23 Olympus Corp 培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法
JPWO2016010165A1 (ja) * 2014-07-16 2017-04-27 Ｈｅａｒｔｓｅｅｄ株式会社 新規未分化幹細胞除去および心筋純化精製培地

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10179148A (ja) * 1996-12-26 1998-07-07 Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養 および継代培養方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10179148A (ja) * 1996-12-26 1998-07-07 Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養 および継代培養方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NIPPON SEIKAGAKKAI: "Shin-seikagaku jikken kouta 18", 20 October 1990, SAIBOU BAIYOU GIJUTSU, TOKYO KAGAKU DOUJIN, XP002949797 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006050943A (ja) * 2004-08-11 2006-02-23 Olympus Corp 培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法
JP4624033B2 (ja) * 2004-08-11 2011-02-02 オリンパス株式会社 間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法
JPWO2016010165A1 (ja) * 2014-07-16 2017-04-27 Ｈｅａｒｔｓｅｅｄ株式会社 新規未分化幹細胞除去および心筋純化精製培地

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001288072A1 (en) 2002-04-02
JPWO2002024875A1 (ja) 2004-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20180155687A1 (en) Hormone responsive tissue culture system and uses thereof
US6692961B1 (en) Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
US20180282691A1 (en) Hormone responsive tissue culture system and uses thereof
CN103396989A (zh) 肝祖细胞
EP3892719A1 (en) Undifferentiated state-maintaining culture medium for pluripotent stem cells
KR20060076781A (ko) 세포 배양 배지
WO2016035816A1 (ja) 多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法、並びに該方法に好適な培地添加剤、分化誘導調節剤、培地、培地作製用キット、及び多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキット
US9243228B2 (en) Process for obtaining myofibroblasts
EP3963050B1 (en) Preparation of human allogeneic liver-derived progenitor cells
EP0939797B1 (en) Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
US20050019310A1 (en) Method for culturing and expansion of mammalian undifferentiated epidermal kerainocytes exhibiting stem cell characteristics
WO2002024875A1 (fr) Solution de culture de cellules normales mures de foie humain
JP2020533025A (ja) 肝疾患および機能不全を処置するための組成物および方法
US20220220445A1 (en) Preparation of human allogeneic liver-derived progenitor cells
Yamada et al. Establishment and characterization of an epithelial cell line, SGE1, from isolated rat renal glomeruli
WO2015046315A1 (ja) 細胞の培養法
JP2021126055A (ja) 魚類幹細胞の培養用培地
JP3066624B2 (ja) ヒト表皮細胞培養用培地
JP4398290B2 (ja) ヒト上皮細胞培養用培地
KR102359675B1 (ko) 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물
EP3554487A1 (en) Xenobiotic-free culture system to expand human limbal stem cells
JPH07184644A (ja) 血管内皮細胞培養方法および血管内皮細胞用培地
JPH07184645A (ja) 血管内皮細胞用無血清培地
MXPA98007554A (en) Cellular cultivation media for mamif cells

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002529470

Country of ref document: JP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

122 Ep: pct application non-entry in european phase