WO2002016574A2 - Verfahren zur identifizierung spezifisch spaltbarer peptide und verwendung solcher peptide - Google Patents

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WO2002016574A2
WO2002016574A2 PCT/EP2001/009102 EP0109102W WO0216574A2 WO 2002016574 A2 WO2002016574 A2 WO 2002016574A2 EP 0109102 W EP0109102 W EP 0109102W WO 0216574 A2 WO0216574 A2 WO 0216574A2
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nucleic acid
peptide
sample
proteolytically
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Ralph Reimholz
Frank PLÖGER
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides

Definitions

  • the invention relates to methods for finding and identifying specifically cleavable peptides with a defined amino acid sequence using proteolytically acting solutions and the use of these peptides for the targeted release of chemical active substances and for diagnosis.
  • a method for the detection of specifically cleaved peptides using a specific protein construct which fluoresces upon proteolytic cleavage of the construct is described in US Pat. No. 5981200.
  • the method is based on the fluorescence resonance energy technique (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy technique
  • An advantage of this method is that it can also be used for the in vivo detection of protein cleavage events.
  • FRET fluorescence resonance energy technique
  • Proteins an exact assignment of the cleavage event to the respective sequence would be associated with great effort.
  • Another disadvantage of this method is that relatively large amounts of labeled substrates have to be used in order to obtain a detectable signal.
  • phage display Another method that can be used for the selective identification of enzyme substrates is the phage display (eg laid down in WO 97/47314).
  • a disadvantage of this method is that the phage display peptide libraries have a smaller number of possible different sequences than other surface-represented peptide libraries and that the subsequent one
  • the object of the present invention is to develop a method for finding and identifying specifically proteolytically cleavable peptides and to provide substances which allow a targeted release of chemical active substances.
  • the object is achieved by a method for identifying specifically proteolytically cleavable peptides, which comprises the following method steps: a) incubation of a library of fusion molecules containing a peptide and a nucleic acid encoding the peptide with a proteolytically active sample, b) isolation of the proteolytically cleaved components the fusion molecules, c) determining the sequence of the nucleic acid component of the isolated
  • the method according to the invention is based on the use of fusion molecules which have a phenotypic peptide part and a genotypic part
  • nucleic acid part which has a sequence coding the peptide part.
  • the peptide part is linked to the nucleic acid part via a suitable linker.
  • a protein acceptor e.g. B. Puromycin used, which is covalently bound to the nucleic acid part.
  • the linker can contain other components such as e.g. B. include a non-coding nucleic acid sequence, preferably a poly-A sequence.
  • the nucleic acid part contains further regions which are constant in sequence and which lie on one or both sides of the coding region. These constant nucleic acid regions can e.g. B. serve as primer binding sites for performing a PCR or as restriction enzyme interfaces.
  • the nucleic acid part of the fusion molecules contains a variable part which codes for at least two amino acids, preferably for at least four, particularly preferably for seven to twelve amino acids. For this purpose, further constant coding nucleotide sequences can occur.
  • the constant nucleic acid sequences can encode peptide sections which e.g. B. allow a simple fixation of the peptide part of the fusion molecule to a solid surface or generate the interesting structural elements. Such structural elements are e.g. B. epitopes for antibodies, tags for cleaning or for the detection of the constructs or elements that determine certain tertiary structures.
  • the preparation of such fusion molecules can, for. B. according to WO98 / 31700.
  • a system is described there in which a protein acceptor, for example a puromycin, is bound to the nucleic acid, preferably RNA, via a suitable linker.
  • a protein acceptor for example a puromycin
  • the synthesized protein can be covalently bound to its coding RNA and thus characterized in more detail.
  • Comparable systems that can be used for the present invention are described, for example, in DE19646372C1, WO98 / 16636, US 5843701 or WO94 / 13623.
  • the fusion molecules are fixed to a surface (support) via their peptide part.
  • carrier is understood to mean material which is in solid or gel-like form. Examples of suitable carrier materials are ceramic, metal, in particular semiconductors, noble metal,
  • Glasses, plastics, crystalline materials or thin layers of the carrier in particular the materials mentioned, or (bio) molecular filaments such as cellulose, framework proteins. Not only flat materials but also particles come into question as carriers, such as e.g. B. protein-loaded materials for column chromatography or beads made of organic polymers.
  • the carrier is generally covalent, quasi-covalent, supramolecular or physical.
  • the peptide part of the fusion molecules can e.g. B. via biotin - streptavidin bond to the support, but also specific domains of the peptide part of the fusion molecules, such as. B. metal-binding domains (z. B. His-Tag), terminals
  • Cysteine residues or domains that contain epitopes recognizable by specific antibodies can mediate such a fixation.
  • Preferred in the method according to the invention are libraries whose fusion molecules have all possible permutations with regard to the variable part of the
  • Recognition sequence of at least four amino acids are preferred libraries with a variable peptide part of at least four amino acids are preferred.
  • the library of fusion molecules is exposed to a proteolytically active sample either in solution or preferably fixed to a support.
  • Extracts in question are extracts from pathological tissue, such as. B. from carcinomas.
  • extracts which represent all or part of the proteolytic activity of an organism in particular viruses, microorganisms such as bacteria or protists, can also be used.
  • Known protease solutions can also be used as a proteolytically active sample, preliminary sample or comparative sample.
  • the library is incubated with the proteolytically active sample preferably under physiological conditions, preferably at temperatures between 0 ° C. and 45 ° C.
  • the extracts to be examined for their proteolytic activity can be used directly, or the extracts are in a suitable solvent, such as. B. a physiological saline solution and used for incubation.
  • Fusion molecules cleaved by the proteases contained in the sample.
  • the result is a specific proteolytic cleavage pattern that is characteristic of the sample extract used.
  • the split-off parts of the fusion molecules are encoded by the nucleic acid part.
  • proteolytically cleaved fusion molecule parts are isolated and the sample
  • the isolation of the cut fusion proteins after incubation of the library and proteolytically active extract in solution can be carried out as follows.
  • a constant structural feature e.g. a known epitope for an antibody, in which that part of the peptide is used which is no longer connected to the rest of the fusion molecule, including the nucleic acid part, by the proteolytic cleavage.
  • an affinity chromatography using z. B. said antibody The nucleic acid part of the cut fusion proteins cannot bind, is separated from the nucleic acids of the uncut fusion proteins, and is therefore in the
  • Other structural features such as e.g. B. His-Tag or Strep-Tag can be used for separation.
  • the fusion molecules remaining on the affinity matrix can be eluted and used further in solution or advantageously directly in the fixed state.
  • the cut fusion proteins can be isolated using different methods after incubation of the fixed library with extract.
  • the nucleic acid part of the cut fusion molecules is obtained directly in the eluate.
  • the sequences of the cleaved peptides can be identified directly by PCR amplification of the nucleic acid parts of the cleaved fusion proteins contained in the eluate with subsequent cloning and sequencing.
  • the sequence of the cleaved peptides can be carried out again by means of PCR, cloning and sequencing.
  • a number of other chromatographic or electrophoretic methods for isolating the proteolytically cleaved fusion molecule parts are possible.
  • the fusion molecules are marked or modified for easier identification.
  • Magnetic labeling of the nucleic acid part of the fusion molecules is particularly preferred; it can also be used in conjunction with a fluorescent label or a radioactive label.
  • the magnetic isolation of the split-off parts of the fusion molecule can be carried out very easily and selectively.
  • the proteolytic pattern is evaluated e.g. B. via a
  • Hybridization of the isolated nucleic acid sequences on a biochip as z. B. is available from Affymetrix or Nanogen. In this way, the isolated mixture of split-off fusion molecule parts containing different nucleic acid sequences can be analyzed directly.
  • the proteolytically active sample can be processed mechanically as follows: If necessary, the entire tissue is cleaned by external washing in cold buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT ; Dignam, JD, Preparation of Extracts from Higher Eukaryotes. From: Deutscher, MP (ed.) Guide to Protein Purification. Methods in Enzymology, Vol 182, Academic Press, (1990). Page 194-202). The tissue is crushed in the cold buffer and, if necessary, components such as. B. connective tissue, skin, blood vessels removed. The tissue pieces can be homogenized with Kobayashi et al.
  • Tissue homogenizer (see below) can be processed into a homogenate under ice cooling.
  • the method must be adapted to the desired tissue type.
  • Tissue homogenizers are e.g. E.g .: - Mixer: e.g. Liver can be easily made into porridge in a mixer, then rubbed through a tightly woven nylon net. It creates a fine one
  • the homogenized tissue is mixed with further homogenization buffer and shaken at 4 - 8 ° C for up to 45 min. Then that will
  • tissue is preferably pulverized with liquid nitrogen in a mortar with constant cooling and the powder freeze-dried in a lyophilizer overnight. The dry powder can then be used again.
  • Comparative sample can be used.
  • LP1 solution buffer 1
  • the glass potter is used for less material.
  • the homogenate can be centrifuged for 10 min at 1000 x g at 4 ° C. The supernatant is collected for further preparations.
  • the centrifugate (nuclear pellet) is resuspended in 12 ml LP1 and centrifuged as before.
  • the nuclear pellet is resuspended in LP2 (20mM Tris-HCl pH 7.5; 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40).
  • the collected supernatants can be used to isolate and purify a cytosolic fraction. They are centrifuged at 100,000 x g, 1 h, 4 ° C. The supernatant forms the extract containing cytosolic proteins.
  • the pellet is made from the cytosolic
  • the pellet from the membrane fraction separation is washed three times in LP2 and centrifuged at 100,000 x g, 1 h, 4 ° C. After the third washing step, the pellet is resuspended in LP3 (12.5 mM Tris-HCl pH 7.5; 0.4% SDS) and solubilized at 95 ° C. Final centrifugation at 20,800 x g, 15 min RT. The supernatant contains the
  • z. B human cells or cell lines in the cell culture as a monolayer. The cells are washed three times with cell culture medium. The medium is then replaced by fresh medium. The secretory proteases are secreted into the medium at 37 ° C. The suitable secretion period is 1 to 3 hours. The same procedure can be used with tissue pieces or tissue sections. To obtain tissue fluid from tissue associations, for. B. organs or tissues are carefully shredded with scissors and scalpel. The
  • tissue pieces are washed several times with tissue buffer.
  • the tissue pieces or small organs are incubated in physiological buffer or medium at 37 ° C for 1-3 hours. After the incubation, the tissue pieces are left in one
  • Sediment 15 ml pointed vessel the medium is removed and can be examined further.
  • the tissues can be transferred to centrifugation tubes and gently centrifuged.
  • the supernatant contains the proteases of the interstitial fluid from the spaces between the tissues.
  • protein extracts can also be obtained by the following method: Comminution of the tissue in ice-cold RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCI, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM NaF and 1 ⁇ g / ml aprotonin, leupeptin and pepstatin), freeze the shredded tissue and then crush it. To homogenize the tissue, RIPA buffer is added in a volume ratio of 1 to 2 and the batch is then thawed. After 15 min the lysate is centrifuged at 13,000 xg, 4 ° C for 10 min. The lysate can be aliquoted, snap frozen and stored in liquid nitrogen.
  • RIPA buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCI,
  • the proteolytic activity of an unknown sample compared to a comparison sample can be determined.
  • the method for the differential determination of the proteolytic activity comprises the following steps: a) incubation of a library of fusion molecules, containing a peptide and a nucleic acid encoding the peptide, with a proteolytically active sample, b) incubation of the same library of fusion molecules in at least one parallel approach , with at least one proteolytically active comparison sample, c) isolation of the proteolytically cleaved components of the fusion molecules, d) creation of a differential nucleic acid bank e) determination of the sequence of the nucleic acids determined.
  • the differential determination of the proteolytically cleaved nucleic acid parts of the fusion molecules can, for. B. by applying an excess single-stranded nucleic acid parts isolated from the comparison sample are carried out on a suitable support, saturation of the free binding sites of the support and subsequent hybridization with single-stranded nucleic acid parts isolated from the sample.
  • the separable, non-hybridized nucleic acid parts represent only those cut in the sample
  • the proteolytic activity of a sample against at least one pre-sample is determined.
  • the differential proteolytic activity can be determined by successively incubating the fusion molecule library with the preliminary sample and sample.
  • the method comprises the following process steps: a) incubation of a library of fusion molecules containing a peptide and a nucleic acid encoding the peptide with at least one proteolytically active preliminary sample, b) removal of the split-off components of the fusion molecules, c) incubation of the library thus prepared with a proteolytically active Sample, d) isolation of the proteolytically cleaved components of the fusion molecules, e) determination of the sequence of the nucleic acid component of the separated fusion molecules.
  • nucleic acid parts of the proteolytically cleaved and isolated fusion molecule parts are reproduced by means of PCR.
  • fusion molecules are used, the nucleic acid part of which is on both sides of the coding
  • Nucleic acid sequence have constant nucleic acid sequences as primer binding sites.
  • the isolated nucleic acid of the cleaved fusion proteins is preferably amplified by means of PCR and transcribed in vitro in the method according to the invention. Starting from the RNA produced in this way, methods described above are used again new library of fusion proteins was prepared and incubated with the same extract containing proteolytic activities. This cycle can be repeated several times.
  • PCR, in vitro transcription and / or in vitro translation can be carried out in one or more of the described cycles with a higher than normal error rate. This increases the available peptide sequences to be tested (in vitro protein evolution).
  • the variant of the directed in vitro protein evolution makes it possible to change known cleavage sequences quickly and easily in such a way that other kinetic properties with regard to the cutting proteases result.
  • the proteolytically active sample can contain other additives, such as. B. specifically acting protease inhibitors or nuclease inhibitors or non-specific RNA and / or DNA to saturate possible nucleases.
  • the sample extracts used contain non-specific cutting lysosomal or endosomal proteases (acidic peptidases, such as aspartate peptidases), the addition of one which acts specifically against these proteases is necessary
  • Inhibitors such as B. the addition of pepstatin A, recommended.
  • the specific inhibition of exoproteases can also be advantageous in order to prevent the breakdown of the proteins contained in the sample, comparative sample or preliminary sample, in particular those of other proteases and their peptide cofactors.
  • the fixed fusion molecules themselves do not have to be protected against exoproteases, since there are no free N- or C-terminal peptide ends.
  • the breakdown of the peptide portion of the proteolytically cleaved fusion molecules is irrelevant for the further course of the process.
  • Nucleic acid parts of the fusion molecules can be obtained in the freshly prepared tissue homogenate already during tissue processing and the subsequent steps by treatment with RNAse or DNAse inhibitors.
  • the nuclease inhibitors be covalently coupled to particles or suitable column materials. Nucleases that bind to surface-coupled nuclease inhibitors are thus separated from the remaining tissue homogenate.
  • Nucleases is the protection of the nucleic acid content of the fusion molecules by auxiliary substances.
  • the auxiliary substances surround the DNA and RNA, form a complex and thus protect them from nucleases (Katayose, S. (1998) J. Pharm. Sei., 87: 160-163).
  • These auxiliaries are in particular polyethyleneimine or PEG-PLL, but can also be proteins or chaparones. Protection against nucleases is also conceivable by using artificial nucleic acids in the fusion molecule, such as. B. PNA.
  • the nucleic acids can also be chemically modified to increase stability, e.g. B. by methylation.
  • the incubation times of library and extract depend on the proteolytic activity of the sample used.
  • the methods according to the invention are carried out repeatedly with variation of the incubation times. This has the advantage that kinetic statements regarding the sample and its peptide substrates, which contain the library of fusion molecules, can be made. Peptide substrates that are proteolytically cleaved at short incubation times have a high rate constant compared to proteolytically active components of the sample.
  • Another simple way of being able to make kinetic statements about the proteolytic activity of the sample is either by varying the concentration of the fusion molecules of the library which form the peptide substrates, or preferably by varying the concentration of the sample intended for incubation.
  • a great advantage of the method according to the invention is that the proteolytic activity of the sample examined is phenomenological, that is to say without complete
  • proteolytic active components of the sample can be described. When comparing different samples, it is irrelevant whether a different proteolytic activity is due to the presence of different proteases or to a direct mutation of a protease, which is rarely the case, or for a malregulation of a protease gene or a protease inhibitor or
  • a cell's cytosol can be altered.
  • the degree of phosphorylation plays a decisive role in the regulation of enzyme activities in the cells and thus also has a decisive influence on the protease activity.
  • a deregulated intracellular phosphatase and, coupled to it, the protease activity plays e.g. B. play a crucial role in the development of cancer.
  • sequences of peptides can furthermore be determined quickly and easily, which are cut, in particular specifically cut, by the examined sample.
  • sequences can also be found which are not subject to proteolytic cleavage by the examined sample.
  • the methods described above can also be used to find inhibitors or activators with a specific effect, without the proteases to be inhibited having to be known in individual cases.
  • a potential inhibitor or activator is simply added to the sample solution and the differential proteolytic activity between the sample and samples containing potential inhibitors or activators is determined. The number of split is reduced
  • Sequences are inhibitors; if the number of cleaved sequences increases, they are activators. In a preferred embodiment, a preselected library of fusion molecules is used to identify inhibitors
  • protease inhibitors also offers the possibility of combining many effective inhibitors in a mixture of active substances in order to prevent the occurrence of resistance.
  • Another object of the present invention are proteolytically cleavable substances, which are those obtainable by one of the methods described
  • the specific proteolytically cleavable peptide sequences can be used for the synthesis of inhibitors with a specific action.
  • z. B chemical modifications to the peptide sequence or one or more ⁇ -amino acids of the peptide are exchanged for ⁇ -amino acids or L-amino acids for D-amino acids in order to prevent proteolysis (see e.g. Werder M. & Hauser H (1999) Helvetica Chimica Acta, 82, 1774-1783).
  • the specific proteolytically cleavable peptides that can be identified with the present methods can be used for the construction of drug delivery systems in order to achieve a selective release of active substance at the target site. It can be at the destination z. B. to a certain organ, tissue, a certain cell type, a subcellular compartment or to sick versus healthy tissue or to microbially infected versus unaffected tissues or cells.
  • the specifically proteolytically cleavable substances can be used as covalently bound inhibitors.
  • the specific proteolytically cleavable peptides can also be used as Linkers can be used to target a drug with a ligand, such as.
  • the variant of the directed in vitro protein evolution makes it possible to change known peptide cleavage sequences so that other cleavage kinetics result.
  • the time profile of the active ingredient release can thus be controlled.
  • diseases can be combated more efficiently by means of a target-controlled release of active substances, in which proteolytic activities have changed at the desired site of action compared to the healthy state or which are due to an incorrect regulation or mutation of specific proteases or their activators or inhibitors .
  • diseases with disturbed protease activity are e.g. B. asthma,
  • Osteoporosis cancer, such as leukemia, breast cancer, colon cancer, stroke, neuronal diseases, such as Alzheimer's, arthritis, pancreatitis, high blood pressure, thrombosis, colds or schistosmiasis.
  • the targeted release of active ingredients can minimize the side effects of these active ingredients and the amount of active ingredient to be used can be reduced due to the changed distribution profiles in the organism.
  • Pharmaceutical active ingredients are particularly interesting. B. against bacteria, fungi, viruses or against diseased tissue cells, but also herbicides, fungicides or insecticides can be used.
  • the assay can e.g. B. on a comparison of the profile of the proteolytic activity of extracts against a library of fusion molecules defined in their composition between diseased tissue, e.g. B. from cancer cells, and based on a sample to be examined.
  • assays which are based on peptides which can only be proteolytically cleaved by pathological tissue compared to a comparison or preliminary sample.
  • the separated parts of the Fusion molecules provided sequencing step are omitted.
  • the presence of a specific disease-specific protease activity can be identified using a hybridization probe.
  • Such a method can be highly integrated by using many cleavable peptides identified as disease-specific markers in such an assay.
  • the specifically cleavable peptides identified with the methods according to the invention can also be used directly for the screening of inhibitors, such as, for. B. in a FRET assay.
  • the specifically cleavable sequences can also be used in vivo as a substrate for FRET assays.
  • Another use of the peptides which can be specifically cleaved from a proteolytically active sample is for isolating the protease which cleaves this peptide sequence (see, for example, Li Y.M. (2000) Nature, 405: 689-694).
  • Serine proteases are protein enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds within proteins.
  • the target protein is often selectively cut due to the specific peptide linkage within the substrate.
  • the serine proteases include, among others
  • Tissue plasmino activator Tissue plasmino activator, tr ⁇ psin, elastase, chymotrypsin, thrombin and plasmin.
  • Many stages of the disease can be treated with serine protease inhibitors, such as blood clotting disorders.
  • Elastase inhibitors can reduce the clinical progression of emphysema.
  • the specific proteolytically cleavable peptides determined according to the methods described above can be used e.g. B. coupled with standard methods on column material and an affinity chromatography of the proteolytically active samples can be carried out on it.
  • the buffer used during the binding cycles must not be denaturing so that the protease is not inactivated.
  • the proteases interacting with the peptides can be used e.g. B. coupled with standard methods on column material and an affinity chromatography of the proteolytically active samples can be carried out on it.
  • the buffer used during the binding cycles must not be
  • Example 1 Preparation of fusion molecules containing a peptide with known ones
  • Protease interface and a nucleic acid encoding the peptide.
  • fusion molecules that contain a peptide sequence that is specifically cleaved by the protease thrombin (“thrombin fusion molecules”).
  • thrombin fusion molecules fusion molecules which contain a peptide sequence which is specifically cleaved by the matrix metalloprotease-3 (MMP-3) (“MMP-3 fusion molecules”).
  • MMP-3 fusion molecules matrix metalloprotease-3
  • the fusion molecules produced in this way have protease interfaces for MMP-3 or for thrombin.
  • the MMP-3 protease cuts between Glu and Leu
  • the thrombin protease cuts between Arg and Ser.
  • the peptide sequences used and the corresponding nucleotide sequence are given below.
  • DNA (bp): AGA CCA AAA CCC GTT GAG CTC TGG AGA AAG (Seq. ID No. 2)
  • Fig. 1 shows the PCR products on 2% agarose-ethidium bromide gel. Lane 1: 50 bp DNA marker, Lane 2: MMP-3 DNA, Lane 3: Thrombin DNA,
  • the MMP-3 DNA and the thrombin DNA could be successfully amplified.
  • the PCR products have the expected molecular weight of 199 bp for the MMP-3 DNA and 89 bp for the thrombin DNA.
  • the DNA was incubated with 5 ⁇ T7 buffer, rNTPs and T7 RNA polymerase for 4 hours at 37 ° C.
  • RNA was purified by means of phenol-chloroform extraction and on a 6%
  • Lane 2 shows the RNA obtained after transcription on 6% urea gel. Lane 1: MMP-3 RNA, Lane 2: thrombin RNA
  • RNA can be detected as expected after the transcription reaction.
  • the RNA shows no degradation.
  • the ligation efficiency was checked on a 5% urea-agarose gel.
  • Lane 3 shows the analysis of the ligation reaction on a 5% urea TBE gel.
  • Lane 1 MMP-3 RNA
  • Lane 2 MMP-3 RNA with puromycin linker
  • Lane 3 thrombin RNA
  • Lane 4 thrombin RNA with puromycin linker. (The signal L comes from the dye marker.) After ligation of the puromycin linker to the RNA, a clear increase in molecular weight can be seen, which indicates the successful linkage of the thrombin RNA and the MMP-3 RNA with the puromycin.
  • RNA 8 ⁇ l of linked RNA were mixed with 200 ⁇ l of reticulocyte lysate, (Promega, Madison, USA L416X), 5 ⁇ l of 35 S-methionine (Hartmann, 10.8 ⁇ M, specific activity: the specific activity is 72181 dpm / pmol), 6 ⁇ l amino acid mix (without methionine 1 mM, Promega) and 80 ⁇ l H 2 O mixed and then incubated at 30 ° C for 30 minutes. After adding 130 ⁇ l 2 M KCI and 75 ⁇ l MgC, the mixture was incubated again at 30 ° C. for 30 minutes.
  • oligo dT-cellulose Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany
  • the purified 200 ⁇ l fusion molecules were mixed with 2.5 ⁇ l 100 ⁇ M reverse primer and incubated for 5 minutes at 80 ° C. After cooling the
  • Reaction mixture on ice 50 ul 5x beach buffer, 20 ul dNTP 's (each 10 mM), 2.5 ul RT-Superscript II (all Promega, Madison, USA) were added and incubated at 42 ° C for 40 minutes
  • the fusion molecules produced were incubated with the corresponding proteases and the reaction products were analyzed (FIG. 4).
  • 10 nM MMP-3 (Sigma, Deisenhofen, Germany) was added to 5 pmol fusion molecule containing the MMP-3 interface and added in MMP-3 buffer (50 mM Tris pH 7, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 ) Incubated 37 ° C in a total volume of 15 ul for 45 minutes.
  • Thrombin buffer 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl at 37 ° C in one
  • the “MMP-3 or thrombin fusion molecules” produced were proteolytically cleaved by the protease MMP-3 or the protease thrombin.
  • Step 1 Coupling of the Fusion Molecules to Streptactin-Sepharose (Carrier Material) via an N-Terminal Strep Tag Step 2. Proteolytic cleavage of the "thrombin fusion molecules" on Streptactin-Sepharose (Carrier Material) via an N-Terminal Strep Tag Step 2. Proteolytic cleavage of the "thrombin fusion molecules" on Streptactin-Sepharose (Carrier Material) via an N-Terminal Strep Tag Step 2. Proteolytic cleavage of the "thrombin fusion molecules" on Streptactin-Sepharose (Carrier Material) via an N-Terminal Strep Tag Step 2. Proteolytic cleavage of the "thrombin fusion molecules" on Streptactin-Sepharose (Carrier Material) via an N-Terminal Strep Tag Step 2. Proteolytic cleavage of the "thrombin fusion molecules" on
  • Carrier material with thrombin Carrier material with thrombin.
  • Step 3 Isolation of the cleaved C-terminal fusion molecule fragments
  • the isolated fragments can optionally be purified via their His tag using affinity chromatography on nickel particles.
  • Streptactin-Sepharose washed 5 times in Streptactin buffer (150 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8) and then incubated for 2 hours at 4 ° C. Unbound fusion molecules were removed by washing five times with Streptactin buffer.
  • the fusion molecules bound to Sterptactin-Sepharose were resuspended in 80 ⁇ l water and incubated with 10 ⁇ l 10 ⁇ thrombin buffer (1.5 M NaCl, 500 mM Tris pH 8) and 10 ⁇ l 100 U / ⁇ l thrombin at 37 ° C. for 45 minutes. As a control, the same approach was carried out without thrombin.
  • reaction mixture was centrifuged (1 minute at 3000 rpm).
  • streptactin-Sepharose containing the N-terminal fragment of the cleaved fusion molecules, was washed three times with streptactin buffer and then resuspended in 80 ⁇ l water.
  • Control batch or the bound N-terminal fragments after incubation with thrombin were separated by SDS-PAGE and visualized by means of phosphoimaging (FIG. 6).
  • thrombin fusion molecules or fragments of the fusion molecules bound to streptactin-Sepharose.
  • 15 ⁇ l of the resuspended streptactin Sepharose was mixed with 5 ⁇ l Lämmli application buffer each, heated for 5 min at 82 ° C. and separated using 4-20% Tris-Glycine SDS-PAGE. The gel was then dried at 80 ° C. for 2 hours and visualized using phosphoimaging.
  • Lane 1 "Thrombin fusion molecules” after incubation with thrombin.
  • Lane 2 “Thrombin fusion molecules” without incubation with thrombin (control).
  • band ii comes from peptide by-products
  • band iii comes from the N-terminal fusion molecule fragment.
  • the streptactin-Sepharose After the streptactin-Sepharose had been separated off, 15 ⁇ l of the supernatant or 15 ⁇ l of the resuspended streptactin-Sepharose were used for the PCR. In addition to the 15 ⁇ l samples, the 50 ⁇ l PCR batches also contained 5 ⁇ l 5 ′ and 3 ′ thrombin primers (5 pmol / ⁇ l), 10 mM dNTPs, 5 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer and 5 U / ⁇ l Taq DNA
  • Lane 3 "Thrombin fusion molecules” + thrombin; bound to Streptactin-Sepharose.
  • Lane 4 "Thrombin fusion molecules” without thrombin; bound to streptactin-sepharose. Consequently, it can be shown that "thrombin fusion molecules" are cut by the incubation with thrombin. After separation of the N-terminal fragment which contains no nucleic acid part, the C-terminal part remains in the supernatant Lane 1, Fig. 7) a strong PCR
  • Lane 2 Fig. 7 is only very weak.

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Abstract

Die Erfinding betrifft Verfahren zum Auffinden und Identifizieren spezifisch spaltbarer Peptide mit einer definierten Aminosäuresequenz basierend auf einer Bibliothek aus Nukleinsäure-Peptid-Fusionsmolekülen, bei denen der variable Teil der Peptide von der jeweiligen damit fusionierten Nukleinsäure codiert wird, unter Einsatz proteolytisch wirkender Lösungen und die Verwendung dieser Peptide zur Diagnostik.

Description

Verfahren zur Identifizierung spezifisch spaltbarer Peptide und Verwendung solcher Peptidsequenzen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Auffinden und Identifizieren spezifisch spaltbarer Peptide mit einer definierten Aminosäuresequenz unter Einsatz proteolytisch wirkender Lösungen und die Verwendung dieser Peptide zur gezielten Freisetzung von chemischen Wirkstoffen und zur Diagnostik.
Ein Verfahren zum Nachweis von spezifisch gespaltenen Peptiden unter Verwendung eines spezifischen Proteinkonstruktes, das bei proteolytischer Spaltung des Konstruktes fluoresziert, ist in US 5981200 beschrieben. Die Methode beruht auf der Fluoreszenz-Resonanzenergie-Technik (FRET). Ein Vorteil dieser Methode ist, dass sie auch zum in vivo-Nachweis von Proteinspaltungsereignissen eingesetzt werden kann. Nachteilig ist demgegenüber, dass nur spezifische Peptide markiert werden können oder im Falle einer Untersuchung von unterschiedlichen markierten
Proteinen eine genaue Zuordnung des Spaltungsereignisses zu der jeweiligen Sequenz mit hohem Aufwand verbunden wäre. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist, dass relativ große Mengen an markierten Substraten eingesetzt werden müssen, um ein detektierbares Signal zu erhalten.
Ein weiteres Verfahren, das zur selektiven Identifizierung von Enzymsubstraten verwendet werden kann, ist das Phage-Display (z. B. niedergelegt in WO 97/47314). Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass die Phage-Display Peptidbibliotheken gegenüber anderen Oberflächen-repräsentierten Peptidbibliotheken eine geringere Zahl möglicher verschiedener Sequenzen aufweisen und das die anschließende
Aufarbeitung der Phagenpartikel und die Bestimmung der identifizierten Substrate relativ aufwendig ist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Auffinden und Identifizieren von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden zu entwickeln sowie Substanzen bereitzustellen, die eine zielgerichtete Freisetzung von chemischen Wirkstoffen erlaubt.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden gelöst, das folgende Verfahrensschritte umfaßt: a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit einer proteolytisch aktiven Probe, b) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, c) Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäurebestandteils der isolierten
Fusionsmoleküle.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Verwendung von Fusionsmoiekülen, die einen phänotypischen Peptidteil und einen genotypischen
Nukleinsäureteil enthalten, der eine den Peptidteil codierende Sequenz besitzt. Der Peptidteil ist dabei über einen geeigneten Linker mit dem Nukleinsäureteil verk nüpft. Als Linker wird bevorzugt ein Proteinakzeptor, z. B. Puromycin verwendet, der kovalent am Nukleinsäureteil gebunden ist. Der Linker kann weitere Bestandteile wie z. B. eine nicht kodierende Nukleinsäuresequenz, bevorzugt eine poly-A-Sequenz, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Nukleinsäureteil weitere in seiner Sequenz konstante Regionen, die ein oder beidseitig der codierenden Region liegen. Diese konstanten Nukleinsäureregionen können z. B. als Primerbindungsstellen zur Durchführung einer PCR oder als Restriktionsenzymschnittstellen dienen. Die codierende Region des
Nukleinsäureteils der Fusionsmoleküle enthält einen variablen Teil, der für mindestens zwei Aminosäuren, bevorzugt für mindestens vier, besonders bevorzugt für sieben bis zwölf Aminosäuren codiert. Dazu können weitere konstante codierende Nukleotidsequenzen treten. Die konstanten Nukleinsäuresequenzen können Peptidabschnitte codieren, die z. B. eine einfache Fixierung des peptidischen Teils des Fusionsmoleküls an einer festen Oberfläche erlauben oder die interessante Strukturelemente erzeugen. Solche Strukturelemente sind z. B. Epitope für Antikörper, Tags zur Reinigung oder zum Nachweis der Konstrukte oder Elemente die bestimmte Tertiärstrukturen determinieren. Die Herstellung solcher Fusionsmoleküle kann z. B. gemäß WO98/31700 erfolgen. Dort ist ein System beschrieben, bei dem an die Nukleinsäure, vorzugsweise RNA, über einen geeigneten Linker ein Proteinakzeptor, beispielsweise ein Puromycin, gebunden ist. Hierdurch wird erreicht, dass kurz vor Ende der in vitro Translation der RNA in das entsprechende Protein, das synthetisierte Protein kovalent an seine kodierende RNA gebunden und so näher charakterisiert werden kann. Vergleichbare Systeme, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in DE19646372C1 , WO98/16636, US 5843701 oder W094/13623 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausfertigung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Fusionsmoleküle über ihren peptidischen Teil an eine r Oberfläche (Träger) fixiert. Unter dem Begriff „Träger" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung Material, das in fester oder auch gelartiger Form vorliegt. Als Trägermaterialien eignen sich beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Halbleiter , Edelmetall,
Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien bzw. dünne Schichten des Trägers, insbesondere der genannten Materialien, oder (bio)molekulare Filamente wie Cellulose, Gerüstproteine. Als Träger kommen aber nicht nur flächige Materialien sondern auch Partikel in Frage, wie z. B. mit Proteinen beladbare Materialien zur Säulenchromatographie oder Beads aus organischen Polymeren. Die Trägerung erfolgt im allgemeinen kovalent, quasi -kovalent, supramolekular oder physikalisch.
Der Peptidteil der Fusionsmoleküle kann z. B. über Biotin - Streptavidinbindung an den Träger fixiert sein, aber auch spezifische Domänen des Peptidteils der Fusionsmoleküle, wie z. B. metallbindende Domänen (z. B. His-Tag), terminale
Cysteinreste oder Domänen, die von spezifischen Antikörpern erkennbare Epitope enthalten, können eine solche Fixierung vermitteln.
Bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren sind Bibliotheken deren Fusionsmoleküle alle möglichen Permutationen bezüglich des variablen Teils der
Peptidsequenz enthalten. Praktisch noch handhabbare Bibliotheken solcher Fusionsproteine haben eine Größe von ca. 1013 verschiedener Sequenzen und sind damit im Vergleich zu anderen, bekannten Peptidbibliotheken um das 103-104 fache (z. B. Phage Display) bzw. 106-107 fache (klassische, chemisch synthetisierte Bibliotheken) größer. Um alle Permutationen abzudecken ist ein variabler Peptidteil von unter 11 Aminosäuren bevorzugt, besonders bevorzugt sind variable Peptidteile aus sieben oder acht Aminosäuren. Es können natürlich auch Bibliotheken erstellt werden, die längere variable Peptidteile in ihren Fusionsmolekülen enthalten, dann ist aber eine vollständige Abdeckung der Sequenzvielfalt nicht mehr möglich. Da die bisher bekannten, spezifische Peptidbindungen spaltenden Proteasen , eine
Erkennungssequenz von mindestens vier Aminosäuren benötigen sind Bibliotheken mit einem variablen Peptidteil von mindestens vier Aminosäuren bevorzugt.
Die Bibliothek aus Fusionsmolekülen wird entweder in Lösung oder bevorzugt fixiert an einen Träger einer proteolytisch aktiven Probe ausgesetzt. Als proteolytisch aktive Probe, Vorprobe oder Vergleichsprobe kommen vor allem gewebespezifische Extrakte tierischen, menschlichen oder pflanzlichen Ursprungs, Extrakte bestimmter Zellkompartimente, wie z. B. zytosolische Extrakte, subzelluläre Extrakte, Extrakte von Membranbestandteilen, extrazelluläre Extrakte oder Mischungen solcher
Extrakte in Frage. Von besonderem Interesse sind auch Extrakte aus krankhaftem Gewebe, wie z. B. aus Karzinomen. Aber auch Extrakte, die die gesamte oder Teile der proteolytischen Aktivität eines Organismus, insbesondere von Viren, Mikroorganismen, wie Bakterien oder Protisten, repräsentieren, können verwendet werden. Als proteolytisch aktive Probe, Vorprobe oder Vergleichsprobe können auch bekannte Proteasen enthaltende Lösungen eingesetzt werden.
Die Inkubation der Bibliothek mit der proteolytisch aktiven Probe erfolgt bevorzugt unter physiologischen Bedingungen, bevorzugt bei Temperaturen zwischen 0 °C und 45 °C. Dazu können die auf ihre proteolytische Aktivität zu untersuchenden Extrakte direkt verwendet werden oder die Extrakte werden in einem geeigneten Lösemittel, wie z. B. einer physiologischen Kochsalzlösung aufgenommen und zur Inkubation verwendet.
Während der Inkubation werden die variablen Peptidbestandteile der
Fusionsmoleküle durch die in der Probe enthaltenden Proteasen gespalten. Es ergibt sich ein spezifisches, für den verwendeten Proben -Extrakt charakteristisches, proteolytisches Spaltungsmuster. Dabei sind die abgespaltenen Teile der Fusionsmoleküle durch den Nukleinsäureteil codiert. Nach der Inkubation der Bibliothek mit der zu untersuchenden, proteolytisch aktiven
Probe werden die proteolytisch abgespaltenen Fusionsmolekülteile isoliert und die
Sequenz des codierenden Nukleinsäureteils bestimmt. Damit sind die durch die
Probe spaltbaren Peptidsequenzen identifiziert.
Die Isolierung der geschnittenen Fusionsproteine nach Inkubation von Bibliothek und proteolytisch aktivem Extrakt in Lösung kann wie folgt durchgeführt werden. Zur Isolierung der Nukleinsäurebereiche der geschnittenen von den ungeschnittenen Fusionsproteinen kann z.B. ein konstantes Strukturmerkmal, z.B. ein bekanntes Epitop für einen Antikörper, in demjenigen Peptidteil ausgenutzt werden, welches durch die proteolytische Spaltung nicht mehr mit dem Rest des Fusionsmoleküls, beinhaltend den Nukleinsäureteil, verbunden ist. Dazu wird mit dem Ansatz eine Affinitätschromatographie, ausnutzend z. B. besagten Antikörper, durchgeführt. Der Nukleinsäureteil der geschnittenen Fusionsproteine kann nicht binden, wird von den Nukleinsäuren der ungeschnittenen Fusionsproteinen getrennt, und ist somit im
Eluat enthalten. Es können auch andere Strukturmerkmale wie z. B. ein His-Tag oder Strep-Tag zur Abtrennung verwendet werden. Die an der Affinitätsmatrix verbleibenden Fusionsmoleküle können eluiert und in Lösung oder vorteilhaft direkt im fixierten Zustand weiter verwendet werden.
Die Isolierung der geschnittenen Fusionsproteine nach Inkubation von fixierter Bibliothek mit Extrakt kann mit unterschiedlichen Methoden erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach Inkubation der fixierten Bibliothek mit dem Extrakt der Nukleinsäureteil der geschnittenen Fusionsmoleküle direkt im Eluat erhalten.
Die Identifizierung der Sequenzen der gespaltenen Peptide kann im einfachsten Fall direkt durch PCR-Amplifizierung der im Eluat enthaltenen Nukleinsäureteile der gespaltenen Fusionsproteine mit anschließender Klonierung und Sequenzierung erfolgen. Es ist aber auch möglich zunächst durch eine weitere Affinitätschromatographie unter Ausnutzung spezifischer Strukturen im Peptid- oder Nukleinsäureteil der gespaltenen Fusionsproteine zunächst eine Reinigung der gespaltenen Fusionsproteine gegenüber weiteren im Eluat vorhandenen Bestandteilen durchzuführen. Nach Elution der gespaltenen Fusionsproteine vom chromatographischen Material, z. B. durch Inkubation mir einer KOH Lösung, kann die Sequenz der gespaltenen Peptide wieder mittels PCR, Klonierung und Sequenzierung erfolgen.
Daneben sind eine Reihe weiterer chromatographischer oder elektrophoretischer Methoden zur Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Fusionsmolekülteile möglich. Dazu ist es vorteilhaft, wenn die Fusionsmoleküle zur leichteren Identifizierung markiert oder modifiziert sind. So kann z. B. der Nukleinsäureteil der Fusionsmoleküle z. B. fluoreszenzmarkiert oder radioaktiv markiert sein. Eine magnetische Markierung des Nukleinsäureteils der Fusionsmoleküle ist besonders bevorzugt, sie kann auch in Verbindung mit einer Fluoreszenzmarkierung oder einer radioaktiven Markierung verwendet werden. Die magnetische Isolierung der abgespaltenen Fusionsmolekülteile kann sehr einfach und selektiv durchgeführt werden. Die Auswertung des proteolytischen Musters erfolgt z. B. über eine
Hybridisierung der isolierten Nukleinsäuresequenzen auf einem Biochip wie er z. B. von Affymetrix oder Nanogen erhältlich ist. So kann direkt die isolierte Mischung aus abgespaltenen Fusionsmolekülteilen enthaltend unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen analytisch untersucht werden.
Bei der Herstellung der zu untersuchenden Extrakte muss darauf geachtet werden, dass die Proteasen in ihrer aktiven Form isoliert werden. Gleichzeitig sollen aber DNA-abbauende Nukleasen möglichst inaktiviert werden.
Die proteolytisch aktive Probe kann dazu mechanisch wie folgt aufgearbeitet werden: Das komplette Gewebe wird ggf. durch äußeres Waschen in kaltem Puffer gereinigt (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 2 mM EDTA, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT; Dignam, J.D., Preparation of Extracts from Higher Eukaryotes. Aus: Deutscher, M.P. (ed.) Guide to Protein Purification. Methods in Enzymology, Vol 182, Academic Press, (1990). Seite 194-202). Das Gewebe wird im kalten Puffer zerkleinert, und gegebenenfalls von Komponenten wie z. B. Bindegewebe, Haut, Blutgefäße entfernt. Die Gewebestückchen können mit Homogenisierungspuffer nach Kobayashi et al. (Kobayashi, H., Fujishiro, S., Terao, T., Cancer Res. (1994) 54, 6539-6548): 0.01 M HEPES-Puffer, pH 7,2, 0,25 M Sucrose, 0.5 % Triton X-100 im Volumenverhältnis 1 :2 bis 1 :5 (w/w) versetzt und in einem entsprechend geeigneten
Gewebehomogenisator (s.u.) unter Eiskühlung zum Homogenat verarbeitet werden.
Die Methode muss auf den gewünschten Gewebetyp angepaßt werden. Geeignete
Gewebehomogenisatoren sind z. B.: - Mixer: Z.B. Leber läßt sich gut in einem Mixer zu Brei verarbeiten, dann weiter durch ein engmaschiges Nylonnetz reiben. Es entsteht ein feines
Gewebehomogenat.
- Homogenisator 'Potter': rotierender Glasstab, der eng in einem passenden Gefäß eingeführt ist, so dass das Gewebe zwischen der Gefäßwand und dem Glasstab zerrieben wird. Dabei muss auf ständige Kühlung geachtet werden.
- Dispergiermaschinen: Homogenisatoren mit rotierenden Messern in einem Schaft.
Das homogenisierte Gewebe wird mit weiterem Homogenisierungspuffer versetzt und bei 4 - 8 °C bis zu 45 min geschüttelt. Anschließend wird das
Gewebehomogenat bei 4 °C mit 16.000 g zentrifugiert und der Überstand direkt oder, z. B. über Säulenchromatographie oder Dialyse, weiter aufgereinigt und zur Analyse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
Wird statt frischem Gewebe gefrorenes Material verwendet, sollte die Methode abgewandelt werden. Gefrorenes Gewebe nicht einfach auftauen lassen, da sonst aus Lysosomen freigesetzte Proteasen die Enzyme inaktivieren. Das Gewebe wird bevorzugt unter ständiger Kühlung mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser pulverisiert und das Pulver über Nacht in einem Lyophylisator gefriergetrocknet. Das trockene Pulver läßt sich dann weiter verwenden.
Im folgenden wird als Beispiel eine geeignete Aufarbeitung von Gehirngewebe und dessen Trennung in Kernfraktion, zytosolische Fraktion, Membranfraktion und Zytoskelettfraktion gegeben. Die erhaltenen Extrakte können direkt oder unter Zusatz von weiteren Hilfsstoffen als proteolytisch aktive Probe, Vorprobe oder
Vergleichsprobe verwendet werden.
Gehirne, z. B. aus Mäusen, aus mehreren Präparationen (ca. 50 Stück) werden in ca. 25 ml Lösungspuffer 1 (LP1 ) gegeben (20 mM Tris-HCI pH 7,5; 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) und mit dem Ultraturrax 1 min bei maximaler Geschwindigkeit homogenisiert. Alternativ wird bei weniger Material der Glaspotter eingesetzt.
Zur Isolierung einer Kernfraktion kann das Homogenat 10 min bei 1000 x g bei 4°C zentrifugiert werden. Der Überstand wird für weitere Präparationen gesammelt. Das Zentrifugat (Zellkernpellet) wird in 12 ml LP1 resuspendiert und wie zuvor zentrifugiert. Das Zellkernpellet wird in LP2 (20 mM Tris-HCI pH 7,5; 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 % NP-40) resuspendiert.
Die gesammelten Überstände können zur Isolierung und Reinigung einer zytosolischen Fraktion verwendet werden. Dazu werden sie bei 100.000 x g, 1 h, 4°C zentrifugiert. Der Überstand bildet den zytosolische P roteine enthaltende Extrakt.
Zur Isolierung der Membranfraktion wird das Pellet aus der zytosolischen
Abtrennung dreimal in LP1 gewaschen und bei 100.000 x g, 1 h, 4°C zentrifugiert. Nach dem dritten Waschschritt wird das Pellet in 15 ml LP2 resuspendiert und über Nacht solubilisiert. Anschließend wird bei 100.000 x g, 1 h, 4°C zentrifugiert. Der Überstand bildet die Membranfraktion.
Zum Erhalt einer Zytoskelettfraktion wird das Pellet aus der Membranfraktionabtrennung dreimal in LP2 gewaschen und bei 100.000 x g, 1 h, 4°C zentrifugiert. Nach dem dritten Waschschritt wird das Pellet in LP3 (12,5 mM Tris- HCI pH 7,5; 0,4 % SDS) resuspendiert und bei 95°C solubilisiert. Abschließende Zentrifugation bei 20.800 x g, 15 min RT. Der Überstand enthält die
Zytoskelettfraktion.
Zur Gewinnung von proteolytisch aktiven Extrakten aus Zellen und Geweben, die sezemierte Proteasen enthalten, werden z. B. humane Zellen oder Zelllinien in der Zellkultur als Monolayer kultiviert. Die Zellen werden mit Zellkulturmedium dreimal gewaschen. Anschließend wird das Medium gegen frisches Medium ersetzt. Dabei werden die sekretorischen Proteasen bei 37°C in das Medium sezemiert. Die geeignete Sezernierungsdauer liegt bei 1 bis 3 h. In gleicher Weise kann mit Gewebestücken oder Gewebeschnitten verfahren werden. Zur Gewinnung von Gewebeflüssigkeit aus Gewebeverbänden können z. B. Organe bzw. Gewebe mit Schere und Skalpell vorsichtig zerkleinert werden. Die
Gewebestücke werden mehrfach mit Gewebepuffer gewaschen. Die Gewebestücke oder auch kleine Organe werden in physiologischem Puffer oder Medium bei 37°C für 1-3 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation läßt man die Gewebestücke in einem
15 ml Spitzgefäß sedimentieren, das Medium wird abgenommen und kann weiter untersucht werden.
Alternativ können die Gewebe in Zentrifugtionsgefäße überführt und schonend zentrifugiert werden. Der Überstand enthält die Proteasen der interstitiellen Flüssigkeit aus den Gewebezwischenräumen.
Alternativ können Proteinextrakte auch nach folgender Methode gewonnen werden: Zerkleinerung des Gewebes in eiskaltem RIPA Puffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4; 1 % NP-40, 0,25% Natriumdeoxycholat, 150 mM NaCI, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF und je1 μg/ ml Aprotonin, Leupeptin und Pepstatin), einfrieren des zerkleinerten Gewebes und anschließendem zermörsern. Zur Homogenisierung des Gewebes wird RIPA Puffer im Volumenverhältnis 1 zu 2 zugegeben und der Ansatz wird danach aufgetaut. Nach 15 min wird das Lysat bei 13.000 x g, 4°C, 10 min lang zentrifugiert. Das Lysat kann aliquotiert, schock-gefroren und in Flüssigstickstoff gelagert werden.
In einem weiteren abgewandelten Verfahren kann die proteolytische Aktivität einer unbekannten Probe gegenüber einer Vergleichsprobe bestimmt werden. Das Verfahren zur differenziellen Bestimmung der proteolytischen Aktivität umfaßt dabei folgende Verfahrensschritte: a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure, mit einer proteolytisch aktiven Probe, b) Inkubation der gleichen Bibliothek aus Fusionsmolekülen in mindestens einem parallelen Ansatz, mit mindestens einer proteolytisch aktiven Vergleichsprobe, c) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, d) Erstellen einer differenziellen Nukleinsäurebank e) Bestimmung der Sequenz der ermittelten Nukleinsäuren.
Die differenzielle Bestimmung der proteolytisch abgespaltenen Nukleinsäureteile der Fusionsmoleküle kann z. B. durch Aufbringung eines Überschusses an einzelsträngigen Nukleinsäureteilen, die a us der Vergleichsprobe isoliert wurden, auf einem geeigneten Träger, Absättigung der freien Bindungsstellen des Trägers und anschließender Hybridisierung mit einzelsträngigen Nukleinsäureteilen, die aus der Probe isoliert wurde, erfolgen. Die abtrennbaren, nicht hybridisierten Nukleinsäureteile, repräsentieren spezifisch nur in der Probe geschnittenen
Peptidsequenzen.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren wird die proteolytische Aktivität einer Probe gegenüber mindestens einer Vorprobe ermittelt. Durch das sukzessive Inkubieren der Fusionsmolekülbibliothek mit Vorprobe und Probe kann deren differenzielle proteolytische Aktivität bestimmt werden. Das Verfahren umfaßt folgende Verfahrensschritte: a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit mindestens einer proteolytisch aktiven Vorprobe, b) Entfernen der abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, c) Inkubation der so präparierten Bibliothek mit einer proteolytisch aktiven Probe, d) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, e) Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäurebestandteils der abgetrennten Fusionsmoleküle.
In bevorzugten Ausführungsformen aller drei erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten werden die Nukleinsäureteile der proteolytisch gespaltenen und isolierten Fusionsmolekülteile mittels PCR vervielfältigt. Dazu werden Fusionsmoleküle verwendet, deren Nukleinsäureteil beidseitig von der codierenden
Nukleinsäuresequenz konstante Nukleinsäuresequenzen als Primerbindungsstellen besitzen.
Um sowohl die Menge an Fusionsmolekül, welches im untersuchten Extrakt geschnitten wird, als auch die Spezifität des Selektionsschrittes (Spaltung im proteolytische aktiven Extrakt) stark zu erhöhen wird bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren die isolierte Nukleinsäure der gespaltenen Fusionsproteine mittels PCR amplifiziert und in vitro transkribiert. Ausgehend von der so hergestellten RNA wird wieder durch bereits beschriebene Methoden eine neue Bibliothek von Fusionsproteinen hergestellt und mit demselben Extrakt enthaltend proteolytische Aktivitäten inkubiert. Dieser Zyklus kann mehrfach wiederholt werden.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens können PCR, in vitro Transkription und/oder in vitro Translation in einem oder mehreren der beschriebenen Zyklen mit einer höheren als normal auftretenden Fehlerrate durchgeführt werden. Dadurch wird eine Erhöhung der verfügbaren, zu testenden Peptidsequenzen erreicht (in vitro Protein -Evolution).
Ebenso ist es durch die Variante der gerichteten in vitro Protein -Evolution schnell und einfach möglich bekannte Spaltsequenzen so zu verändern, dass sich andere kinetische Eigenschaften bezüglich der schneidenden Proteasen ergeben.
Der proteolytisch aktiven Probe können weitere Zusatzstoffe, wie z. B. spezifisch wirkende Proteaseinhibitoren oder Nukleaseinhibitoren bzw. unspezifische RNA und/oder DNA zur Absättigung möglicher Nukleasen, hinzugefügt werden. Insbesondere wenn die verwendeten Proben-Extrakte unspezifisch schneidende lysosomale oder endosomale Proteasen (saure Peptidasen, wie Aspartatpeptidasen) enthalten ist die Zugabe eines spezifisch gegen diese Proteasen wirkenden
Inhibitors, wie z. B. die Zugabe von Pepstatin A, empfehlenswert. Auch die spezifische Hemmung von Exoproteasen kann von Vorteil sein, um den Abbau der in der Probe, Vergleichsprobe oder Vorprobe enthaltenden Proteine, insbesondere der anderer Proteasen und deren peptidischen Cofaktoren zu verhindern. Die fixierten Fusionsmoleküle selbst müssen nicht gegen Exoproteasen geschützt werden, da keine freien N- oder C-terminalen Peptidenden vorhanden sind. Der Abbau des Peptidanteils der proteolytisch gespaltenen Fusionsmoleküle ist für den weiteren Verfahrensablauf unerheblich.
Die Entfernung von Nukleaseaktivitäten aus Gewebeextrakten zum Schutz der
Nukleinsäureteile der Fusionsmoleküle kann im frisch präparierten Gewebehomogenat schon während der Gewebeaufarbeitung und den nachfolgenden Schritten durch Behandlung mit RNAse- bzw. DNAse-lnhibitoren erreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform können die Nukleaseinhibitoren kovalent an Partikel oder geeignete Säulenmaterialien gekoppelt sein. Nukleasen, die an Oberflächen-gekoppelte Nukleaseinhibitoren binden, werden so von dem übrigem Gewebehomogenat abgetrennt. Eine Alternative zur Inhibition der
Nukleasen, ist der Schutz des Nukleinsäureanteils der Fusionsmoleküle durch Hilfsstoffe. Die Hilfsstoffe umgeben die DNA und RNA, bilden einen Komplex und schützen sie so vor Nukleasen (Katayose, S. (1998) J. Pharm. Sei., 87: 160-163). Diese Hilfsstoffe sind insbesondere Polyethylenimin oder PEG-PLL, können aber auch Proteine oder Chaparone sein. Ein Schutz vor Nukleasen ist ebenfalls denkbar, indem artifizielle Nukleinsäuren im Fusionsmolekül verwendet werden, wie z. B. PNA. Die Nukleinsäuren können auch zur Erhöhung der Stabilität chemisch modifiziert werden, z. B. durch Methylierung.
Die Inkubationszeiten von Bibliothek und Extrakt hängen von der proteolytischen Aktivität der eingesetzten Probe ab. In einer erweiterten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren, bei Variation der Inkubationszeiten, wiederholt durchgeführt. Das hat den Vorteil, dass kinetische Aussagen betreffend der Probe und deren peptidischen Substrate, die die Bibliothek aus Fusionsmolekülen beinhalten, getroffen werden können. Peptidische Substrate die bei kurzen Inkubationszeiten proteolytisch gespalten werden, weisen eine hohe Geschwindigkeitskonstante gegenüber proteolytisch aktiver Bestandteile der Probe auf.
Eine weitere einfache Möglichkeit kinetische Aussagen über die proteolytische Aktivität der Probe treffen zu können besteht entweder in der Variation der Konzentration der Fusionsmoleküle der Bibliothek, die die peptidischen Substrate bilden, oder bevorzugt in der Variation der Konzentration der zur Inkubation vorgesehenen Probe.
Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die proteolytische Aktivität der untersuchten Probe phänomenologisch, das heißt ohne vollständige
Kenntnis über die proteolytische aktiven Bestandteile der Probe, beschrieben werden kann. Beim Vergleich verschiedener Proben ist es unerheblich, ob eine unterschiedliche proteolytische Aktivität auf dem Vorliegen verschiedener Proteasen, oder auf einer direkten Mutation einer Protease, was eher selten der Fall ist, beruht, oder auf eine Fehlregulation eines Proteasegens oder eines Proteaseinhibitors oder
-aktivators zurückgeht. Auch Veränderungen der proteolytischen Aktivität, die über extrazelluläre Signale induziert werden, können mit den vorliegenden Verfahren erfaßt werden. Es ist bekannt, dass z. B. durch die Bindung von Liganden, wie z. B. Hormone an Transmembranrezeptoren die Kinase und/oder Phosphataseaktivität im
Zytosol einer Zelle verändert werden kann. Der Phophorylierungsgrad spielt bei der Regulation von Enzym aktivitäten in den Zellen eine entscheidende Rolle und hat somit auch einen entscheidenden Einfluß auf die Proteaseaktivität. Eine deregulierte intrazelluläre Phosphatase- und, gekoppelt daran, der Proteaseaktivität spielt z. B. bei der Krebsentstehung eine entscheidende Rolle.
Vorteilhaft ist vor allem die differenzielle Bestimmung von spezifisch spaltbaren Peptiden im Hinblick auf Extrakte aus gesundem und krankhaftem Gewebe, sowie aus gesundem und mit Krankheitserregern infiziertem Gewebe. Ebenfalls von besonderem Interesse ist das Auffinden spezifisch spaltbarer Peptide im Vergleich einzelner Organismen.
Es können mit den erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin schnell und einfach Sequenzen von Peptiden ermittelt werden, die durch die untersuchte Probe geschnitten, insbesondere spezifisch geschnitten werden. Andererseits sind ebenfalls Sequenzen auffindbar, die keiner proteolytischen Spaltung durch die untersuchte Probe unterliegen.
Neben der Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptidsequenzen, können die oben beschriebenen Verfahren auch zur Auffindung von spezifisch wirkenden Inhibitoren oder Aktivatoren genutzt werden, ohne dass im Einzelfall die zu hemmenden Proteasen bekannt sein müssen. Dazu wird einfach der Probenlösung ein potentieller Inhibitor oder Aktivator hinzugesetzt und die differenzielle proteolytische Aktivität zwischen Probe und potentielle Inhibitoren oder Aktivatoren enthaltende Proben bestimmt. Verringert sich die Zahl der gespaltenen
Sequenzen handelt es sich um einen Inhibitor, erhöht sich die Zahl der gespaltenen Sequenzen handelt es sich um einen Aktivator. Zur Identifizierung von Inhibitoren wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine vorselektierte Bibliothek aus Fusionsmolekülen verwendet, die nach mehreren
Selektionszyklen mit der proteolytisch aktiven Probe erhalten wurde. Alternativ können auch die mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten, spezifisch spaltbaren Peptide direkt zum Screening von Inhibitoren, wie z. B. in einem FRET-
Assay, verwendet werden.
Somit steht ein schnell und einfach durchführbares Verfahren zum Screening von
Protease-Inhibitoren zur Verfügung.
Durch das schnelle und einfache Screening von Protease-Inhibitoren besteht auch die Möglichkeit viele wirksame Inhibitoren in einer Wirkstoffmischung zu verbinden, um das Auftreten von Resistenzen zu verhindern.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind proteolytisch spaltbare Substanzen, die eine mit einem der beschriebenen Verfahren erhältliche
Peptidsequenz enthalten.
Die spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptidsequenzen können zur Synthese von spezifisch wirkenden Inhibitoren verwendet werden. Dazu werden z. B. chemische Modifikationen an der Peptidsequenz vorgenommen oder es werden ein oder mehrere α-Aminosäuren des Peptids gegen ß-Aminosäuren oder L-Aminosäuren gegen D-Aminosäuren ausgetauscht, um eine Proteolyse zu verhindern (siehe z. B. Werder M. & Hauser H. (1999) Helvetica Chimica Acta, 82, 1774-1783). Die mit den vorliegenden Verfahren identifizierbaren spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden können zur Konstruktion von Drug-Delivery-Systemen verwendet werden, um eine selektive Wirkstofffreisetzung am Zielort zu erreichen. Dabei kann es sich beim Zielort z. B. um ein bestimmtes Organ, Gewebe, einen bestimmten Zelltyp, ein subzelluläres Kompartiment oder um krankes gegenüber gesundem Gewebe oder um mikrobiell befallene gegenüber unbefallenen Geweben oder Zellen handeln.
Im Falle eines durch Proteasespaltung aktivierbaren Wirkstoffes können die spezifisch proteolytisch spaltbaren Substanzen als kovalent gebundene Inhibitoren verwendet werden. Die spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptide können auch als Linker verwendet werden, um einen Wirkstoff mit einem Targeting Liganden, wie z.
B. einem spezifischen Antikörper oder einem spezifischen Rezeptor-Liganden, zu verbinden. Aber auch die Konstruktion von wirkstoffbeldadenen Systemen, die mit spezifisch proteolytisch spaltbaren Substanzen verschlossen werden, ist möglich (Minko T. et al., (2000) Int. J. Cancer, 86: 108-117).
Durch die Variante der gerichteten in vitro Protein -Evolution ist es möglich bekannte peptidische Spaltsequenzen so zu verändern, dass sich andere Spaltungskinetiken ergeben. Damit kann das zeitliche Profil der Wirkstofffreisetzung gesteuert werden.
Mit Hilfe der spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptide können folglich, über eine zielgesteuerte Wirkstofffreisetzung, Krankheiten effizienter bekämpft werden, bei denen gegenüber dem gesunden Zustand veränderte proteolytische Aktivitäten am gewünschten Wirkort auftreten oder die auf eine Fehlregulation oder Mutation von spezifischen Proteasen oder deren Aktivatoren oder Inhibitoren zurückzuführen sind. Beispiele für Krankheiten mit gestörter Proteaseaktivität sind z. B. Asthma,
Osteoporose, Krebserkrankungen, wie Leukämie, Brustkrebs, Darmkrebs, Schlaganfall, neuronale Erkrankungen, wie Alzheimer, Arthritis, Pancreatitis, Bluthochdruck, Thrombosen, Erkältungen oder Schistosmiasis.
Durch die zielgerichtete Freisetzung von Wirkstoffen können die Nebenwirkungen dieser Wirkstoffe minimiert und die einzusetzende Wirkstoffmenge kann aufgrund der veränderten Verteilungsprofile im Organismus reduziert werden. Interessant sind vor allem pharmazeutische Wirkstoffe z. B. gegen Bakterien, Pilze, Viren oder gegen erkrankte Gewebezellen, aber auch Herbizide, Fungizide oder Insektizide können eingesetzt werden.
Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren liegt in der Verwendung als diagnostischer Assay. Der Assay kann z. B. auf einem Vergleich des Profils der proteolytischen Aktivität von Extrakten gegenüber einer in ihrer Zusammensetzung definierten Bibliothek aus Fusionsmolekülen zwischen krankhaftem Gewebe, z. B. aus Krebszellen, und einer zu untersuchenden Probe basieren. Bevorzugt sind aber Assays, die gegenüber einer Vergleichs- oder Vorprobe auf ausschließlich von krankhaftem Gewebe proteolytisch spaltbaren Peptiden beruhen. Bei einem solchen selektiven Assay kann der nach Abtrennung der abgespaltenen Teile der Fusionsmoleküle vorgesehene Sequenzierungschritt entfallen. Die Identifizierung des Vorhandenseins einer bestimmten, krankheitsspezifischen Proteaseaktivität kann in diesem Falle unter Verwendung einer Hybridisierungssonde erfolgen. Ein solches Verfahren kann hoch integriert werden, indem viele als krankheitsspezifische Marker identifizierte spaltbare Peptide in einem solchen Assay verwendet werden.
Alternativ können auch die mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten spezifisch spaltbaren Peptide direkt zum Screening von Inhibitoren, wie z. B. in einem FRET-Assay, verwendet werden. Die spezifisch spaltbaren Sequenzen können auch in vivo als Substrat für FRET-Assays verwendet werden. Eine weitere Verwendung der spezifisch von einer proteolytisch aktiven Probe spaltbaren Peptide ist zur Isolierung der diese Peptidsequenz spaltende Protease (siehe z. B. Li Y.M. (2000) Nature, 405: 689-694).
Ein anwendbares Verfahren zur Isolation von Serin -Proteasen ist z. B. in US 5843701 beschrieben. Serin Proteasen sind Proteinenzyme, die die Hydrolyse von Peptidbindungen innerhalb von Proteinen katalysieren. Häufig wird das Zielprotein, aufgrund der spezifischen Peptidverknüpfung innerhalb des Substrats, selektiv geschnitten. Zu den Serin-Proteasen gehören unter anderem
Gewbeplasminogehaktivator, Trγpsin, Elastase, Chymotrypsin, Thrombin und Plasmin. Viele Krankheitsstadien können mit Serinproteaseinhibitoren behandelt werden, wie zum Beispiel Erkrankungen der Blutgerinnung. Elastase Inhibitoren können das klinische Fortschreiten von Emphysemen reduzieren. Zur Isolierung von Proteasen können die gemäß den oben beschriebenen Verfahren ermittelten spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptide z. B. mit Standardmethoden an Säulenmaterial gekoppelt und eine Affinitätschromatographie der proteolytisch aktiven Proben daran durchgeführt werden. Der Puffer der während den Bindungszyklen verwendet wird darf nicht denaturierend sein, damit die Protease nicht inaktiviert wird. Die mit den Peptiden wechselwirkenden Proteasen können bei
Bedarf durch gängige Crosslinking -Verfahren zusätzlich an die fixierten Peptide gebunden werden. Dazu können auch ß-Aminosäuren enthaltende Spaltsequenzen benutzt werden, die von Proteasen spezifisch erkannt, aber nicht gespalten werden können. lm folgenden werden zur Verdeutlichung der Erfindung einige Ausführungsbeispiele gegeben:
Beispiel 1 : Herstellung von Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid mit bekannter
Proteaseschnittstelle und eine das Peptid codierende Nukleinsäure.
Allgemeines:
Es wurden 2 Arten von Fusionsmolekülen hergestellt. Zum einen Fusionsmoleküle die eine Peptidsequenz enthalten, die spezifisch von der Protease Thrombin gespalten wird ("Thrombin-Fusionsmoleküle"). Zum anderen, Fusionsmoleküle, die eine Peptidsequenz enthalten, die spezifisch von der Matrix Metalloprotease-3 (MMP-3) gespalten wird, ("MMP-3-Fusionsmoleküle"). Die Herstellung derartiger Fusionsmoleküle ist z. B. in WO98/31700 beschrieben.
Die so hergestellten Fusionsmoleküle besitzen Protease-Schnittstellen für MMP-3 oder für Thrombin.
Die MMP-3 Protease schneidet zwischen GIu und Leu, die Thrombin Protease schneidet zwischen Arg und Ser. Die verwendeten Peptidsequenzen und die entsprechende Nukleotidsequenz sind im Anschluss angegeben.
Protease-Schnittstellen:
MMP-3 Schnittstelle (Nagase, H., 1995, Methods Enzymol. 248, 449-470) Protein (AS): Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu- | Leu-Trp-Arg-Lys (Seq. ID No. 1)
DNA (bp): AGA CCA AAA CCC GTT GAG CTC TGG AGA AAG (Seq. ID No. 2)
Thrombin Schnittstelle (Le Bonniec, B.F., 1996, Biochemistry 35, 7114-7122) Protein (AS): Val-Pro-Arg- | Ser-Phe-Arg (Seq. ID No. 3) DNA (bp): GTT CCA AGA AGC TTC AGG (Seq. ID No. 4) 1.1 Herstellung der MMP-3- und Thrombin-Template DNA über PCR
In einem 50 μl Reaktionsansatz wurden 250 ng DNA Template, 25 pmol 5'- und 3'- Primer 10 mM dNTPs, 5 μl 10 x PCR-Puffer und 5 U/ μl Taq DNA Polymerase vereinigt (Puffer und Enzym von Promega, Madison, USA). Die PCR wurde unter den folgenden Bedingungen im Biometra T Gradient Cycler durchgeführt: 1 min 94 ° C, 21 x (0,5 min 94 °C, 0,5 min 55 ° C, 0,5 min 72 °C).
Primer und Template: 5'Strep-Tag Primer (90 bp):
5 '-taa tac gac tca cta tag gga caa tta cta ttt aca att aca atg tgg tcc cac ccc cag ttc gag aag agt ggc tca agc tca gga tca-3' (Seq. ID No. 5)
3' MMP-3 Primer (44 bp):
5 '-ttt taa ata gcg gat gct act agg cta gac cca gag cta ccc ga-3' (Seq. ID No. 6) 3' Thrombin Primer (44 bp):
5 '-ttt taa ata gcg gat gct act agg cta gac cca gag gat cct ga-3' (Seq. ID No. 7)
MMP-3 Template:
5 '-agt ggc tca agc tca gga tca gga tct ggt aga cca aaa ccc gtt gag ctc tgg aga aag cac cat cac cat cac cat gga agt ggc tcg ggt agc tct ggg tct agc-3' (Seq. ID No. 8) Thrombin Template:
5 '-agt ggc tca agc tca gga tca gga tct ggt gtt cca aga agc ttc agg cac cat cac cat cac cat gga agt ggc tca gga tcc tct ggg tct agc-3' (Seq. ID No. 9)
Fig. 1 zeigt die PCR-Produkte auf 2 % Agarose-Ethidiumbromid-Gel. Bahn 1 : 50 bp DNA-Marker, Bahn 2 : MMP-3 -DNA, Bahn 3 : Thrombin -DNA,
Bahn 4: 100 bp DNA-Marker
Wie Fig. 1 zeigt konnte die MMP-3-DNA und die Thrombin-DNA erfolgreich amplifiziert werden. Die PCR-Produkte haben das erwartete Molekulargewicht von 199 bp für die MMP-3 DNA undl 89 bp für die Thrombin DNA.
1.2 In vitro Transkription der MMP-3- und Thrombin-DNA Es wurden 100 pmol DNA in die Transkriptionsreaktion eingesetzt (Ribomax T7 /
Promega, Madison, USA). In einem 500 μl-Ansatz wurde die DNA mit 5x T7 Puffer, rNTPs und T7 RNA-Polymerase 4 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die RNA wurde mittels Phenol-Chlorofom Extraktion aufgereinigt und auf einem 6%
Harnstoff Gel (Novex Gel/ Invetrogen, Groningen, Niederlande) analysiert.
Fig. 2 zeigt die erhaltene RNA nach Transkription auf 6 % Harnstoff-Gel. Bahn 1 : MMP-3-RNA, Bahn 2: Thrombin-RNA
Wie aus Fig. 2 ersichtlich, ist nach der Transkriptionsreaktion wie erwartet RNA nachweisbar. Die RNA weist keine Degradation auf.
1.3 Ligation der RNA mit Puromycin-Linker über UV-Crosslinking
In einem 120 μl Ansatz wurden 3 nmol RNA, 4,5 nmol Puromycin (Pu) Linker (PEG Polyethylenglykol, Pso = Psoralen) mit der Sequenz
5*-(Pso)2^OMe -U AGC GGA UGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA PEG PEG CC- (Pu)-3' (die Nukleotide 1 bis 28 sind durch Seq. ID No. 10 wiedergegeben)
(Intreractiva/Ulm),12 μl 10x Ligase-Puffer (1 M NaCI, 250 mM Tris pH 7,5) vereinigt und 5 Minuten bei 85°C und anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das UV-Crosslinking wurde 15 Minuten bei 366 nm durchgeführt (UV-Handlampe von LTF-Labortechnik,12 W)
Die Ligationseffizienz wurde auf einem 5 % Harnstoff -Agarose Gel überprüft.
Fig. 3 zeigt die Analyse der Ligationsreaktion auf einem 5% Harnstoff -TBE Gel. Bahn 1 : MMP-3-RNA, Bahn 2: MMP-3-RNA mit Puromycin Linker, Bahn 3: Thrombin-RNA, Bahn 4: Thrombin-RNA mit Puromycin Linker. (Das Signal L rührt vom Farbstoff marker her.) Nach der Ligation des Puromycin Linkers an die RNA ist eine deutliche Molekulargewichtszunahme zu sehen, die die erfolgreiche Verknüpfung der Thrombin-RNA und der MMP-3-RNA mit dem Puromycin anzeigt.
1.4 In vitro Translation
8 μl gelinkerte RNA wurden mit 200 μl Retikulozyten-Lysat, (Promega, Madison, USA L416X), 5 μl 35S-Methionin (Hartmann, 10,8 μM, Spezifische Aktivität: die spezifische Aktivität ist 72181 dpm/pmol)), 6 μl Aminosäure-Mix (ohne Methionin 1 mM, Promega) und 80 μl H2O gemischt und anschließend 30 Minuten bei 30° C inkubiert. Nach Zugabe von 130 μl 2 M KCI und 75 μl MgC wurde erneut 30 Minuten bei 30° C inkubiert.
Die entstandenen Fusionsmoleküle wurden mit Oligo dT-Cellulose (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgereinigt (Entfernung aller Bestandteile des in vitro Translationsansatzes, die keine polyA RNA-Sequenzen enthalten).
1.5 Reverse Transkriptase Reaktion
Die aufgereinigten 200 μl Fusionsmoleküle wurden mit 2,5 μl 100 μM Reverse- Primer gemischt und 5 Minuten bei 80°C inkubiert. Nach Abkühlung des
Reaktionsansatzes auf Eis, wurden 50 μl 5x Strandbuffer, 20 μl dNTP's (jeweils 10 mM), 2,5 μl RT-Superscript II (alles Promega, Madison, USA) zugegeben und 40 Minuten bei 42 °C inkubiert
Beispiel 2:
Proteolytische Spaltung der Fusionsmoleküle mit Thrombin und MMP-3 in Lösung
Die hergestellten Fusionsmoleküle wurden mit den entsprechenden Proteasen inkubiert und die Reaktionsprodukte analysiert ( Fig. 4). Zu 5 pmol Fusionsmolekül, enthaltend die MMP-3 Schnittstelle, wurde 10 nM MMP-3 (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) gegeben und in MMP-3-Puffer (50 mM Tris pH 7, 150 mM NaCI, 10 mM CaCI2) bei 37 °C in einem Gesamtvolumen von 15 μl für 45 Minuten inkubiert. Zu 5 pmol Fusionsmolekül, enthaltend die Thrombinschnittstelle, wurde 1 U Thrombin (1 NIH Unit = 0.324 μg, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) gegeben und in
Thrombin-Puffer (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCI) bei 37 °C in einem
Gesamtvolumen von 15 μl für 45 Minuten inkubiert. Die Analyse der
Ausgangsfusionsmoleküle und der Fusionsmoleküle nach proteolytischer Spaltung erfolgte mit einem Phosphoimager nach SDS-PAGE (Fig. 4)
Fig. 4 zeigt den Verdau der Fusionsmoleküle mit Thrombin und MMP-3 in Lösung: Phosphoimager Bild nach 4-20% Tris-Glycin SDS-PAGE.
Bahn 1 „MMP-3-Fusionsmoleküle" vor Verdau; Bahn 2 „Thrombin-Fusionsmoleküle" vor Verdau; Bahn 3 „Thrombin-Fusionsmoleküle" + Thrombin Bahn 4 „Thrombin-Fusionsmoleküle" vor Verdau Bahn 5 „MMP-3-Fusionsmoleküle" + MMP-3 Bahn 6 „MMP-3-Fusionsmoleküle" vor Verdau. (Die Banden i zeigen Fusionsmoleküle, Die Banden ii zeigen peptidische
Nebenprodukte und die Banden iii rühren von N-terminalen Fusionsmolekülfragmenten her.)
Die hergestellten „MMP-3- bzw. Thrombin-Fusionsmoleküle" wurden durch die Protease MMP-3 bzw. die Protease Thrombin proteolytisch gespalten.
Beispiel 3
Isolierung und Detektion der proteolytisch gespaltenen „Thrombin -Fusionsmoleküle" und Amplifikation des Nukleinsäureanteils
Für die Isolierung und Identifizierung von spezifisch proteolytisch gespalten en Fusionsmolekülen wurden drei aufeinander folgende Verfahrensschritte durchgeführt. Fig. 5 zeigt die Verfahrensschritte gemäß diesem Beispiel zur Identifizierung spezifisch spaltbarer Peptide schematisch:
Schritt 1. Kopplung der Fusionsmoleküle über einen N-terminalen Strep-tag an Streptactin-Sepharose (Trägermaterial) Schritt 2. Proteolytische Spaltung der „Thrombin-Fusionsmoleküle" am
Trägermaterial mit Thrombin.
Schritt 3. Isolierung der gespaltenen C-terminalen Fusionsmolekül-Fragmente und
Detektion der Fragmente nach PCR-Amplifikation des Nukleinsäureanteils. Optional kann vor der Analytik eine Aufreinigung der isolierten Fragmente über deren His-tag mittels Affinitätschromatographie an Nickel Partikel erfolgen.
3.1 Kopplung von „Thrombin-Fusionsmoleküle" an Streptactin Sepharose
50 μl „Thrombin-Fusionsmoleküle" (entsprechend ca. 5 pmol) wurden mit 50 μl
Streptactin-Sepharose, 5x in Streptactin Puffer (150 mM NaCI, 100 mM Tris pH 8) gewaschen und anschließend für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Ungebundene Fusionsmoleküle wurden durch fünfmaliges Waschen mit Streptactin Puffer entfernt.
3.2 Proteolytischer Verdau der „Thrombin-Fusionsmoleküle" mit Thrombin
Die an Sterptactin-Sepharose gebundenen Fusionsmoleküle wurden in 80 μl Wasser resuspendiert und mit 10 μl 10x Thrombin Puffer (1 ,5 M NaCI, 500 mM Tris pH 8) und 10 μl 100 U/μl Thrombin für 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle wurde der gleiche Ansatz ohne Thrombin durchgeführt.
3.2.1 Isolierung und Detektion der gebundenen „Thrombin-Fusionsmoleküle"
Nach der Inkubationszeit wurde der Reaktionsansatz zentrifugiert (1 Minute bei 3000 rpm). Die pelettierte Streptactin-Sepharose, enthaltend das N-terminale Fragment der gespaltenen Fusionsmoleküle, wurde dreimal mit Streptactin-Puffer gewaschen und anschließend in 80 μl Wasser resuspendiert.
Die an Streptactin-Sepharose gebundenen „Thrombin-Fusionsmoleküle"
(Kontrollansatz) bzw. die gebundenen N-terminalen Fragmente nach Inkubation mit Thrombin wurden durch eine SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Phosphoimaging visualisiert (Fig. 6).
Fig. 6 zeigt „Thrombin-Fusionsmoleküle" bzw. Fragmente der Fusionsmoleküle gebunden an Streptactin-Sepharose. 15 μl der resuspendierten Streptactin- Sepharose wurden mit jeweils 5 μl Lämmli-Auftragspuffer vermischt, 5 min bei 82°C erwärmt und mittels 4-20% Tris-Glycin SDS-PAGE aufgetrennt. Anschließend wurde das Gel 2 Stunden bei 80°C getrocknet und mittels Phosphoimaging visualisiert. Bahn 1 : „Thrombin-Fusionsmoleküle" nach Inkubation mit Thrombin. Bahn 2: „Thrombin-Fusionsmoleküle" ohne Inkubation mit Thrombin (Kontrolle).
(Die Bande i zeigt das intakte Fusionsmolekül, die Banden ii stammen von peptidischen Nebenprodukten und die Bande iii rührt vom N-terminalen Fusionsmolekülfragment her.)
Nach Inkubation der „Thrombin-Fusionsmoleküle" mit Thrombin sind nur noch die N- terminalen Fragmente (markiert mit35S-Methionin) an Streptactin-Sepharose gebunden.
3.2.2 Nachweis der Nukleinsäureanteile der „Thrombin-Fusionsmoleküle" mittels PCR-Analyse
Nach Abtrennung der Streptactin-Sepharose wurden 15 μl des Überstandes bzw. 15 μl der resuspendierten Streptactin-Sepharose für die PCR eingesetzt. Die 50 μl PCR-Ansätze enthielten neben den 15 μl Proben noch 5 μl 5'- und 3'-Thrombin- Primer (5 pmol/μl), 10 mM dNTPs, 5 μl 10 x PCR-Puffer und 5 U/ μl Taq DNA
Polymerase (Puffer und Enzym von Promega, Madison, USA). Die Amplifikation erfolgte unter folgenden Bedingungen: 1 min 94 ° C, 21 x (0,5 min 94 °C, 0,5 min 55 °C, 0,5 min 72 °C). Die erhaltenen PCR-Produkte sind in Fig. 7 abgebildet.
Fig. 7 zeigt die PCR-Produkte der „Thrombin-Fusionsmoleküle" nach 2% Agarose-
Gelelektrophorese. In den Bahnen 1 und 2 sind die Produkte als schwarze Signale auf hellem Hintergrund, in den Spuren 3 und 4, auf Grund einer anderen Abbildungstechnik, als weiße Signale auf dunklem Hintergrund zu sehen. Bahn 1 : „Thrombin-Fusionsmoleküle" + Thrombin; Überstand. Bahn 2: „Thrombin-Fusionsmoleküle" ohne Thrombin (Kontrolle); Überstand.
Bahn 3: „Thrombin-Fusionsmoleküle" + Thrombin; gebunden an Streptactin- Sepharose. Bahn 4: „Thrombin-Fusionsmoleküle" ohne Thrombin; gebunden an Streptactin- Sepharose. Folglich kann gezeigt werden, dass „Thrombin-Fusionsmoleküle" durch die Inkubation mit Thrombin geschnitten werden. Nach Abtrennung des N-terminalen Fragments, der kein Nukleinsäureanteil enthält, verbleibt der C-terminale Anteil im Überstand. Folglich wird im Überstand (siehe z. B. Bahn 1 , Fig. 7) ein starkes PCR-
Amplifikat, im Pellet dagegen nur ein sehr schwaches PCR-Amplifikat (z. B. Bahn 3, Fig. 7) erhalten. In der Kontrollreaktion wurden die „Thrombin-Fusionsmoleküle" nicht mit Thrombin inkubiert. Folglich bleiben die Fusionsmoleküle an der Streptactin-Sepharose gebunden und man erhält ein starkes PCR-Amplifikat im Pellet (z. B. Bahn 4, Fig. 7) während das PCR-Amplifikat des Überstandes (z. B.
Bahn 2, Fig. 7) nur sehr schwach ist.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden umfassend die Verfahrensschritte: a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen , enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit einer proteolytisch aktiven Probe, b) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der
Fusionsmoleküle, c) Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäurebestandteils der abgetrennten Fusionsmoleküle.
2. Verfahren zur Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden umfassend die Verfahrensschritte: a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit einer proteolytisch aktiven Probe, b) Inkubation der gleichen Bibliothek aus Fusionsmolekülen in einem parallelen Ansatz, mit mindestens einer proteolytisch aktiven Vergleichsprobe, c) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, d) Erstellen einer differenziellen Nukleinsäurebank e) Bestimmung der Sequenz der ermittelten Nukleinsäuren.
3. Verfahren zur Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden umfassend die Verfahrensschritte: a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit mindestens einer proteolytisch aktiven Vorprobe, b) Abtrennung der abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, c) Inkubation der so präparierten Bibliothek mit einer proteolytisch aktiven
Probe, d) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, e) Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäurebestandteils der abgetrennten
Fusionsmoleküle.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass eine Bibliothek aus Fusionsmolekülen enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure, die ein- oder beidseitig von bekannten
Nukleotidsequenzen flankiert ist, verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass eine Bibliothek aus Fusionsmolekülen bestehend aus einem Peptid das über ein Puromycin an eine Poly-A-Nukleinsäuresequenz geknüpft ist an die sich die das Peptid codierende Region und eine oder mehrere bekannte Nukleinsäuresequenzen anschließen, verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle enthaltend Peptide aus mindestens 4 variablen
Aminosäuren verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle enthaltend Peptide aus 7 bis 1 1 variablen Aminosäuren verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle verwendet werden, die Peptide enthalten, die neben dem variablen Sequenzbereich mindestens einen konstanten Sequenzbereich besitzen.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle mit markiertem Nukleinsäurebestandteil und/oder Peptidbestandteil verwendet werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle mit einer magnetischen Markierung, einer radioaktiven Markierung, einer Fluoreszenzmarkierung des Nukleinsäurebestandteils und/oder Peptidbestandteils oder einer Markierung mit einer spezifischen bekannten
Nukleinsäuresequenz und/oder einer bekannten spezifischen Aminosäuresequenz verwendet werden.
11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Fusionsmoleküle der Bibliothek auf einer festen Oberfläche fixiert werden.
12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Fusionsmoleküle der Bibliothek auf festen Partikeln fixiert werden.
13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die bekannten Nukleinsäuresequenzen mit Restriktionsenzymen geschnitten werden und nur der ab- oder ausgeschnittene Nukleinsäureteil weiter verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass nach Isolierung der von der proteolytisch aktiven Probe geschnittenen Fusionsmolekülbestandteile zur Vervielfältigung der Nukleinsäurebestandteile eine PCR durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14 dadurch gekennzeichnet, dass die amplifizierte Nukleinsäure zur Erstellung einer neuen Bibliothek aus Fusionsmolekülen verwendet wird und mit dieser Bibliothek erneut ein Verfahrenszyklus gemäß der Ansprüche 1 bis 3 durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 zur in vitro Protein-Evolution, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR, die in vitro Transkription und/oder die i n vitro Translation mit erhöhter Fehlerrate abläuft.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass als proteolytisch aktive Probe, Vorprobe und Vergleichsprobe ein Gesamtzellextrakt, ein zytosolischer Extrakt, ein Membranextrakt, ein extrazellulärer Extrakt, ein subzellulärer Extrakt, eine Kombination dieser Extrakte oder eine Lösung aus bekannten Proteasen verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass als Probe, Vorprobe oder Vergleichsprobe krankheitsspezifische und/oder gewebespezifische und/oder oganspezifische und/oder organismusspezifische Extrakte verwendet werden.
19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die proteolytisch aktive Probe und/oder Vorprobe unter physiologischen Bedingungen im Verfahren verwendet werden.
20. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass der Probe und/oder Vorprobe weitere Hilfsstoffe zugegeben werden.
21. Verfahren nach Anspruch 20 dadurch gekennzeichnet, dass als Hilfsstoffe spezifisch wirkende Proteaseinhibitoren und/oder Nukleaseinhibitoren zugesetzt werden.
22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass der Probe potentielle Proteaseinhibitoren oder -aktivatoren zugesetzt werden.
23. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte wiederholt oder bei unterschiedlicher Inkubationsdauer und/oder unterschiedlicher Probenkonzentration wiederholt durchgeführt werden.
24. Verwendung der gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 23 ermittelten Nukleinsäuresequenzen zur Herstellung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Substanzen.
25. Spezifisch proteolytisch spaltbare Substanzen enthaltend einen Peptid erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23.
26. Spezifisch proteolytisch spaltbare Substanz gemäß Anspruch 25 enthaltend einen chemischen Wirkstoff.
27. Spezifisch proteolytisch spaltbare Substanz gemäß Anspruch 26 dadurch gekennzeichnet, dass der chemische Wirkstoff durch proteolytische Freisetzung aktivierbar ist.
28. Spezifisch proteolytisch spaltbare Substanz nach einem der Ansprüche 25 bis 27 dadurch gekennzeichnet, dass der Substanz weitere Hilfs- und Zusatzstoffe zugesetzt werden.
29. Verwendung der spezifisch proteolytisch spaltbaren Substanzen gemäß Ansprüche 25 bis 28 zur Herstellung von Medikamenten gegen Asthma, Osteoporose, Krebserkrankungen, Schlaganfall, neuronale Erkrankungen, Arthritis, Pancreatitis, Bluthochdruck, Thrombosen, Erkältungen oder Schistosmiasis.
30. Diagnostische Marker enthaltend proteolytisch spaltbare Peptide erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23.
31. Verfahren zum Nachweis spezifisch wirkender Proteasen gemäß Anspruch 1 bis 23 enthaltend diagnostische Marker gemäß Anspruch 30.
32. Verwendung von Substanzen enthaltend spezifisch proteolytisch spaltbare Peptide ermittelt nach einem Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 23 zur Identifizierung der diese Peptide spaltenden Proteasen.
33. Verwendung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden ermittelt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 23 zur Identifizierung von Proteaseinhibitoren.
4. Verwendung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptidsequenzen ermittelt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 23 zur Herstellung von Inhibitoren.
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