WO2002002770A1 - Nouvelle proteine receptrice couplee a une proteine g et adn associe - Google Patents

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WO2002002770A1
WO2002002770A1 PCT/JP2001/005647 JP0105647W WO0202770A1 WO 2002002770 A1 WO2002002770 A1 WO 2002002770A1 JP 0105647 W JP0105647 W JP 0105647W WO 0202770 A1 WO0202770 A1 WO 0202770A1
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receptor protein
salt
coupled receptor
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Masanori Miwa
Takashi Ito
Yasushi Shintani
Nobuyuki Miyajima
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein derived from human spleen or a salt thereof, and a DNA encoding the same.
  • G protein-coupled receptor protein seven-transmembrane receptor protein (7 TMR).
  • G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells of living cells and organs, and are physiologically targeted as molecules that regulate the functions of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters and bioactive substances. Plays an important role.
  • the receptor transmits a signal into the cell via binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
  • physiological functions are regulated under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • physiologically active substances exist in various parts of the body, and regulate their physiological functions through the corresponding receptor proteins.
  • hormones, neurotransmitters, and other physiologically active substances have not been reported on the structure of their receptor protein.
  • the G protein-coupled receptor is used to search for a new physiologically active substance (ie, ligand) using its signal transduction as an index. It is useful for searching for strikes or angry ghosts. On the other hand, even if a physiological ligand is not found, by analyzing the physiological action of the receptor from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor, an agonist or an agonist at the receptor can be identified. It is also possible to produce.
  • These ligands, agonists, antagonists, and the like for the receptor are expected to be used as preventive and therapeutic agents for diseases associated with dysfunction of the G protein-coupled receptor.
  • a decrease or enhancement of the function of the receptor in the living body based on the gene mutation of the G protein-coupled receptor may cause some disease.
  • the nucleotide sequence of the receptor is essential information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the receptor gene is involved in the dysfunction of the receptor. Disease prevention It can also be applied to therapeutic and diagnostic agents.
  • the present invention provides a novel G protein-coupled receptor protein useful as described above. That is, a novel G protein-coupled receptor protein or its partial peptide or a salt thereof, a polynucleotide encoding the G protein-coupled receptor protein or its partial peptide (DNA, RNA and derivatives thereof) A polynucleotide (DNA, RNA and derivatives thereof), a recombinant vector containing the polynucleotide, a transformant carrying the recombinant vector, a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof.
  • the present inventors have isolated a cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor Yuichi protein derived from human spleen and succeeded in analyzing the entire nucleotide sequence thereof. Then, when this nucleotide sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh transmembrane regions were confirmed on the hydrophobicity plot, and the protein encoded by these cDNAs was a seven-transmembrane G protein-coupled receptor. It was confirmed that it was one protein. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • G protein-coupled receptor protein or salt thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6. ,
  • the antibody according to (11) which is a neutralizing antibody that inactivates signal transduction of the G protein-coupled receptor protein according to (1);
  • the G protein-coupled receptor protein according to (1) or a salt thereof which can be obtained by using the G protein-coupled receptor protein according to (1) or the partial peptide according to (3) or a salt thereof.
  • a ligand obtainable by using the screening method according to (17) or the screening kit according to (18) and the G protein according to (1).
  • a medicament comprising a compound that alters sex or a salt thereof,
  • (22) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide of (4) or a part thereof,
  • the protein is: (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 9) Amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted, and 2 or more (preferably about 1 to 30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1. More preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids; 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ( Preferably, about 1 to 30 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, and still more preferably several pieces (1 to 5 pieces)
  • the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to the above (1) which is a protein containing an amino acid sequence in which the amino acid of
  • the ligand is, for example, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, new peptide ⁇ , opioid, purine, vasoprescin, oxitocin, PACAP (eg, ⁇ ACAP 27, PACAP 38) , Secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (passoactive intestinal polypeptide), somatos evening, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcito-ningene relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, kekaine superfamily (eg IL-18, GRO, GRO ⁇ , GR ⁇ , NAP—2 ,
  • the labeled ligand is a G protein-coupled receptor according to (1) above.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that alters the sex (39) culturing a compound that activates the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof described in (1) above by culturing the transformant described in (9) above.
  • the G protein-coupled receptor protein expressed in the cell membrane of the transformant by contact with the transformant, and the compound and test for activating the G protein-coupled receptor protein or the salt thereof described in (1) above.
  • the compound is cultured by culturing the transformant described in (9) above.
  • the compound that activates the G protein-coupled receptor protein according to (1) is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, dalzymin, serotonin, melatonin, neuropeptide Y , Opioids, pudding, vasopleucine, oxitosine, PACAP (e.g., PACAP 27, PACAP 38), secretin, glucagon, calcitonin, adorenomeziulin, somato sugin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (pasoacte) Eve intestinal polypeptide), somatostin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin diretinated peptide), leukotriene, pancreatastatin, prostaglandin, trompoxane, adenosine, adrenaline, chemokine super H Milliichi (eg, CX
  • C chemokine subfamily such as fracta 1 kine), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA) or The screening method according to the above (38) or (39), which is sphingosine monophosphate,
  • a medicament characterized by:
  • test solution and the antibody of (11) insolubilized on the carrier and the labeled antibody of (11) are reacted simultaneously or continuously, and then the labeling agent on the insolubilized carrier is reacted.
  • a medicament comprising a compound or a salt thereof that alters the expression level of the G protein-coupled receptor protein according to (1), which can be obtained by using the screening method according to (26).
  • a medicament comprising the compound or a salt thereof, which alters the amount of the G protein-coupled receptor protein according to (1) in the cell membrane obtainable by using the screening method according to (27);
  • a ligand obtainable by using the screening method according to (17) or the screening kit according to (18) and a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to (1).
  • Prevention and treatment of central disease, inflammatory disease, circulatory disease, cancer, diabetes, immune system disease or digestive system disease characterized by administering an effective amount of a compound that changes the binding of Method,
  • FIG. 1 is a hydrophobicity plot of hTGR11.
  • FIG. 2 is an analysis of the expression distribution of hTGR11 in human tissues.
  • the expression level in the CLONTECH Human Multiple Tissue cDNA Panel is shown.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as receptor protein) may be a receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is. In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 16th Xaa and the 160th Xaa both represent Ser or Gly.
  • Examples of the receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; : A receptor protein containing the amino acid sequence represented by 4, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 And a receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the receptor protein of the present invention can be used, for example, in any cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, etc.) of human mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, bushes, sheep, horses, monkeys, etc.).
  • human mammals eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, bushes, sheep, horses, monkeys, etc.
  • kidney 3 cells of the kidney, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, na Natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or Stromal cells, or their precursors, stem cells or cancer cells), blood cells, or any tissue in which these cells are present, such as , Brain, various parts of the brain (e.g., olfactory bulb, acrosomal nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe,
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 examples include, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • an amino acid sequence having homology of preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • Examples of the protein of the present invention having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A protein having substantially the same activity as that of the above is preferred.
  • substantially the same activity examples include a ligand binding activity and a signal transduction activity.
  • substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 20 times).
  • the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction can be measured according to a method known per se. For example, it can be measured according to a ligand determination method or a screening method described later.
  • the receptor protein of the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30; more preferably, 1 to 10; Amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted, and 2 or more (preferably 1 to 3) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1. About 0 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, still more preferably several (1 to 5) amino acids; 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence in which two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids have been substituted with another amino acid, or ⁇ Combination of these is also used for proteins containing amino acid sequences Can be.
  • 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, 4, 5, or 6;
  • 1 or 2 or more (preferably, 1 to 3) About 0, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids;
  • 3 represented by SEQ ID NO: 3, 4, 5 or 6 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are replaced with other amino acids Amino acid sequence, or A protein containing an amino acid sequence obtained by combining them is used.
  • the receptor protein in the present specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (capilloxy terminus) at the right end.
  • the receptor protein of the present invention including the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has carboxyl groups (one COOH), carboxylate (one COO-), and amides at the C-terminus. (1 C (NH 2 ) or ester (1 C ⁇ R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, Shikuropen chill, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, C 6 _ 12 7 aryl group, such as ⁇ - naphthyl, for example, benzyl, phenyl, such as phenethyl - C M alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc.
  • - Nafuchiru ( ⁇ _ 2 C 7 _ 14 Ararukiru such alkyl Le group
  • piva methoxymethyl group which is widely used as an oral ester, is used.
  • the receptor protein of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • the receptor protein of the present invention also includes those in which the lipoxyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the receptions evening one protein of the present invention is the protein mentioned above, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, etc. Ashiru groups such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru) ,
  • the N-terminal side is cleaved in vivo and the formed daltamyl group is pyroglutamic acid-substituted, and the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, amino) group, imidazole group, indole group, Guanijino group, etc.) a suitable protecting group (e.g., formyl group, ⁇ C 2 such as cetyl - also are protected by like 6 Arukanoiru d-6 Ashiru groups such as groups) of
  • a specific example of the receptor protein of the present invention also includes a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention may be any peptide as long as it is the partial peptide of the receptor protein of the present invention described above.
  • the receptor protein molecules of the present invention those which are exposed outside the cell membrane and have receptor binding activity are used.
  • a partial peptide of the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was analyzed to be an extracellular region (hydrophilic site) in hydrophobicity plot analysis.
  • a peptide comprising a peptide partially containing a hydrophobic site can also be used.
  • a peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention has at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the receptor protein of the present invention. Peptides and the like are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, further preferably about 80% or more, and particularly preferably Represents an amino acid sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
  • the partial peptide of the present invention has one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence deleted. Or one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are replaced with other amino acids. May be.
  • the C-terminus may be any of a hydroxyl group (—CO OH), a carboxylate (—COO—), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—CO ⁇ R). .
  • the partial peptide of the present invention has a N-terminal methionine residue whose amino group is protected by a protecting group, and a N-terminal side which is cleaved in vivo as in the receptor protein of the present invention.
  • a substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called sugar peptide to which a sugar chain is bound, etc. Is also included.
  • Examples of the salt of the receptor protein or its partial peptide of the present invention include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or mammalian cell or tissue by a method for purifying a receptor protein known per se, or the receptor protein of the present invention described later. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding a protein. Also, the protein can be produced by the protein synthesis method described later or according to it.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, —Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4-( 2 ′, 4 ′ dimethoxyphenyl hydroxymethyl) phenoxy resin, and 41 (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl Fmoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid having an appropriately protected amino group and side chain functional group is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or an amide thereof.
  • various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and 'carposimides' are particularly preferable.
  • the carbopimides include DCC, N, N'-diisopropyl carbopimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide.
  • protected amino acids may be added directly to the resin along with racemization inhibitors (eg, HOBt, HOOBt) or symmetrical acid anhydrides or HOBT esters or HOOBt esters.
  • the t-ester can be added to the resin after the protected amino acid has been activated in advance.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or for condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof. .
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • protecting group for the amino group examples include Z, Boc, Yuichi Sharipentyloxycarbonyl, Isopolnyloxycarponyl, 4-methoxybenzyloxycarponyl, CutZ, Br-Z, a Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, a linear or branched alkyl ester ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.).
  • a linear or branched alkyl ester ester eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • cyclic alkyl esterification aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl ester Protection, benzyloxycarbonyl hydrazide, short-lived butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl ester Protection benzyloxycarbonyl hydrazide, short-lived butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group and the like are used.
  • the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, a t_butyl group, and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B zl, C l 2 -B zl, 2- two Torobenjiru, B rZ, evening, such as single-tertiary butyl is used.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated raw oxypoxy groups include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HON B, N-hydroxysuccinimide, N -Esters with hydroxyphthalimide and HO B t)].
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol
  • Phenol cyanomethyl alcohol
  • paranitrophenol HON B
  • N-hydroxysuccinimide N-Esters with hydroxyphthalimide and HO B t
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or the like.
  • Can be The elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • a cation capture agent such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tributanphan is replaced with 1,2-ethanedithiol, 1
  • it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein for example, first, amidation of the carboxy-terminal amino acid is protected by amidation, and then a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length. After the elongation, a protein was prepared by removing only the protecting group of the ⁇ -amino group at the N-terminus of the peptide chain, and a protein was obtained by removing only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus. In such a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. This crude protein is purified using various known purification methods, and the main fraction is purified. By freeze-drying, an amide of the desired protein can be obtained.
  • an ester of a protein for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of the amino acid at the carboxy terminal with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein is converted in the same manner as the amide of the protein. Obtainable.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention with the remaining portion, and if the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5. '
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and the like.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained as a salt, it is converted to a free form by a known method. be able to.
  • any polynucleotide may be used as long as it contains the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the receptor protein of the present invention. Is also good.
  • the polynucleotide include DNA encoding the receptor protein of the present invention, mRNA and the like. RNA and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • the method of the present invention can be obtained by the method described in the well-known experimental medical special edition “New PCR and its application” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto.
  • MRNA of receptor protein can be quantified.
  • Examples of the DNA encoding the receptor protein of the present invention include genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA. Good.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. It is also possible to directly amplify by direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention is, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a highly stringent DNA with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the 46th, 478th, and 915th Rs represent A or G.
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 13.
  • Examples of the DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Has about 95% or more homology A DNA having a base sequence having the same is used, and more specifically, a base sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 13 and about 70% or more,
  • Hybridization can be carried out by a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Etc. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringency conditions.
  • the high stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 70 ° C.
  • the conditions at 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like are used.
  • the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 includes a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, and a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 DNA or the like is used.
  • Examples of the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12. And the like containing DNA.
  • the DNA encoding the receptor protein and white matter containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is SEQ ID NO: DNA containing the base sequence represented by 9; the nucleotide represented by SEQ ID NO: 10 DNA containing a sequence or the like is used.
  • DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and the like are used.
  • a polynucleotide comprising a part of the nucleotide sequence of the DNA encoding the receptor protein of the present invention or a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA includes the following partial peptides of the present invention. It is used to include not only the DNA to encode, but also RNA.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of a G protein-coupled receptor protein gene is cloned or a G protein-coupled receptor protein determined. It can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence information of the DNA to encode.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the G protein-coupled receptor protein gene, and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or, in other words, can inhibit the G protein.
  • the expression of the G protein-coupled receptor protein gene can be regulated and controlled through the interaction with the coupled receptor protein protein-associated RNA.
  • Polynucleotides complementary to the selected sequence of the G protein-coupled receptor protein-related RNA and polynucleotides capable of specifically hybridizing to the G protein-coupled receptor protein-related RNA are in vivo. It is useful for regulating and controlling the expression of G protein-coupled receptor protein gene in vitro and in vitro, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) in the direction derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • the 3′-end untranslated region, the 3′-end palindrome region, and the 3′-end hairpin loop can be selected as preferred regions of interest, but any region within the G protein-coupled receptor protein gene can be selected as the region of interest.
  • the relationship between the nucleic acid of interest and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be "antisense" with the polynucleotide capable of hybridizing with the target.
  • Antisense polynucleotide 2-deoxy D-report-containing polydeoxynucleotides, D-report-containing polydeoxynucleotides, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, Alternatively, other polymers having a non-nucleotide skeleton (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (eg, such polymers are found in DNA or RNA) Base pairing or nucleotides having a configuration that allows base attachment).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or non-modified polynucleotides).
  • Modified oligonucleotides and those with known modifications, for example, those with labels known in the art, capped, methylated, and one or more natural nucleotides
  • Substituted with a compound, modified with an intramolecular nucleotide for example, has an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), has a charged bond or contains sulfur
  • Those having a bond for example, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • protein nuclease, nuclease'inhibitor, toki.
  • nucleic acid may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and decorated nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups are replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Make sense nucleic acid less toxic.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes or increase nucleic acid uptake (eg, , Phospholipid, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acid can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups are cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. No.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as polyethylene glycol and dalicol such as tetraethylene dalicol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid is examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the G protein-coupled receptor protein. be able to.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the above-described partial peptide of the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • the mRNA can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell 'tissue.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (2) SEQ ID NO: 2 Has a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by, and has substantially the same activity as the receptor protein of the present invention (eg, ligand binding activity, signal signal transduction action, etc.) DNA having a partial base sequence of DNA encoding the receptor protein is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a partial base of DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13.
  • a DNA having a partial base sequence of a DNA encoding a receptor protein having substantially the same activity as the protein may be used.
  • the DNA capable of hybridizing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, about 70% or more, preferably about .80% of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of at least about 90% or more, most preferably at least about 95% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 13 include, for example, SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 10, 11, 12, or 13.
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with the nucleotide sequence represented by the DNA is used.
  • the receptor protein of the present invention As a means of cloning a DNA that completely encodes the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter, sometimes abbreviated as the receptor of the present invention), the receptor protein of the present invention is used. Amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of SEQ ID NO: 1, or a DNA encoding a partial or entire region of the receptor protein of the present invention by incorporating DNA into an appropriate vector. Selection can be performed by hybridization with the fragment labeled with the A fragment or synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). You. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • DNA base sequence substitution can be performed by PCR or a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc. It can be carried out according to a known method such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned receptor protein can be used as it is depending on the purpose, or it can be digested with a restriction enzyme, if desired, or added with a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the receptor protein of the present invention is, for example, (a) the receptor of the present invention.
  • the target DNA fragment is excised from the DNA encoding the Yuichi protein, and (DNA) the DNA fragment is ligated downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
  • vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (Eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., ⁇ A1-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I / Neo and the like are used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110,
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRCK promoter overnight when animal cells are used as host, SRCK promoter overnight, SV40 promoter overnight, LTR mouth motor, CMV promoter, HS V-TK promoter overnight, etc. It is preferable to use an SR promoter or the like.
  • trp promoter mono-, 1 ac flop port motor, r e cA promoter primary, AP L promoter, and l pp promoter of all, when the host is Bacillus, spol promoter one
  • yeast such as the SP02 promoter, the penP promoter, etc., the PH5 promoter, the PGK promoter, the GAP promoter, the ADH promoter, etc.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired. Anything can be used.
  • selection markers include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp 1 ) ), Neomycin resistance Gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne ⁇ " ⁇ , G418 resistance).
  • a signal sequence suitable for the host may be added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention, if necessary, if the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia. , PhoA * signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, a monoamylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., if the host is yeast, MFo! If the host is an animal cell, such as the sequence, SUC2 signal sequence, etc., if the host is an animal cell, insulin signal sequence, hyaluronan interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. It can be used, respectively.
  • a transformant can be produced using the vector containing DNA encoding the receptor protein of the present invention thus constructed.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia coli examples include Escherichia coli.
  • Bacillus species include, for example, Bacillus subtilis MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal Journal of Biochemistry, 95, 87 (1 984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris Pichia pastor is).
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of the night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and eggs derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra b rassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • the virus is BmNPV
  • a cell line derived from silkworm Boombyx mori N; BmN cell
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)). Used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dh fr ”) cell).
  • CHO cell Chinese hamster cell CHO
  • dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO
  • Mouse L cells mouse AtT-20, mouse myeloid cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Escherichia coli For example, to transform a genus of the genus Swissichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ), 69, 2110 (1972) and Gene (17), 107 (1982). For example, to transform Bacillus sp. Nore Genetics (Molecular & General Genetics), 168, 111 ( 1979).
  • Insect cells or insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells can be performed, for example, by the methods described in Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). It can be performed according to the method.
  • a liquid medium is suitable as the medium used for the culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like.
  • the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Obesperimentin in Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3j8-indolyl acrylate can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the medium used is Grace's Insect Medium (Grace, T., Nichia (Nature), 195,788 (1962)) to which immobilized additives such as 10% serum are added as appropriate, etc.
  • the ⁇ of the culture medium is adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and / or agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959) 3, RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association] The Journal of the American Medical Association at 199, 519 (1967) And 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine], 73, 1 (1950).
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually about 3 Q ° C to 40 ° C For about 15 to 60 hours with aeration and / or agitation as needed.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be produced in the transformant, in the cell membrane, or outside the cell.
  • the isolation and purification of the receptor protein of the present invention from the above culture can be performed, for example, by the following method.
  • the receptor protein of the present invention When the receptor protein of the present invention is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and Z or frozen. After disrupting the cells or cells by thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the receptor protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • Purification of the receptor protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method using difference in charge, such as ion exchange chromatography, method using specific novelty such as affinity chromatography, reverse phase high-speed liquid chromatography For example, a method using a difference in hydrophobicity such as a method using isoelectric point difference such as an isoelectric focusing method is used.
  • the receptor protein thus obtained when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a method known per se Alternatively, it can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the receptor protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • Proteins include Chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the receptor protein of the present invention or a salt thereof thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzymimnoassay using a specific antibody, or the like.
  • the antibody against the receptor protein or its partial peptide or its salt of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the receptor protein or its partial peptide or its salt of the present invention. You may.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof may be a known antibody using the receptor protein or the like of the present invention as an antigen. Alternatively, it can be produced according to a method for producing an antiserum.
  • the receptor protein or the like of the present invention is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • mammals to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and mice and rats are preferably used. .
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from the mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by reacting the labeled receptor protein or the like described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation is performed in a known manner, for example, [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP 2/0 and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • PEG preferably PEG1000 to PEG6000
  • the hybridoma is immobilized on a solid phase (eg, a microplate) onto which an antigen such as a receptor protein is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, a microplate
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, the selection can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPM11640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or hybridoma culture
  • a serum-free medium SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 t, preferably about 37 ° C.
  • the culturing period is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • On hybridoma culture The antibody titer of the serum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies (e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchange).
  • Adsorption / desorption method using body e.g., DEAE
  • ultracentrifugation method e.g., ultracentrifugation method
  • gel filtration method e.g., antigen-bound solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G to collect only antibody, dissociate, and release antibody Specific Purification Method Obtained].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a receptor protein) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • a complex between an immunizing antigen and a carrier-protein used for immunizing mammals which can be produced by collecting antibody-containing substances and separating and purifying the antibody, the carrier-protein and the carrier-hapten
  • the mixing ratio of any one of these may be any one as long as an antibody can be efficiently cross-linked to a hapten immunized by cross-linking with a carrier. Cycloprolin, keyhole, lindet, hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 0.1 to 20 with respect to 1 hapten About 1-5 how to The couple at the rate is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the receptor protein or its salt, its partial peptide or its salt, and the DNA encoding the receptor protein or its partial peptide of the present invention are: (1) a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention ( (2) a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the G protein-coupled receptor protein of the present invention, (3) a gene diagnostic agent, (4) a present invention (5) A method for screening a compound that changes the expression level of a protein or a partial peptide thereof, (5) prevention of various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof, and Z Or a therapeutic agent; (6) a method for quantifying a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention; (7) a G protein-coupled receptor protein of the present invention; Screening method for compounds (eg, agonists, antagonists, etc.) that alter the binding between ligands and ligands, (8) Compounds that alter
  • a G protein specific to humans and mammals can be obtained.
  • Compounds that alter the binding of ligands to white matter-conjugated receptor eg, agonist, antagonist, etc.
  • the agonist or antagonist can be used to prevent or treat various diseases It can be used as such.
  • DNA encoding the receptor protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention
  • the receptor protein of the present invention or the partial peptide thereof hereinafter referred to as the present invention.
  • the use of an antibody against the receptor protein or the like of the present invention (sometimes abbreviated as DNA) and the use of the antibody (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) of the present invention will be specifically described below.
  • the receptor protein of the present invention or its salt or the partial peptide or its salt of the present invention is useful as a reagent for searching or determining a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or its salt. is there.
  • the present invention provides a method for determining a ligand for a receptor protein of the present invention, which comprises contacting the receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound. I do.
  • Test compounds include known ligands (e.g., angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxytocin, ⁇ ACAP (e.g., PACAP27, PACAP 38), secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (passoactive intestinal and related polypeptide), somatos, dopamine, motilin, Amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene-related peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, chemokine one-part family One (eg, IL-8, GROa, GROj3, GROr, NAP
  • tissue extracts of humans or mammals eg, mice, rats, pigs, horses, higgins, monkeys, etc.
  • cell culture supernatants, and the like are used.
  • the tissue extract, the cell culture supernatant, and the like are added to the receptor protein of the present invention, and fractionated while measuring the cell stimulating activity, etc., to finally obtain a single ligand. .
  • the ligand determination method of the present invention uses the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant receptor protein, and uses the expression system.
  • the receptor-binding Atsei system which binds to the receptor protein of the present invention, cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular CAMP production, cells) C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. , Non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof.
  • cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular CAMP production, cells
  • C GMP production inositol phosphate production
  • cell membrane potential fluctuation intracellular protein phosphorylation,
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is brought into contact with a test compound, for example, the amount of the test compound bound to the receptor protein or the partial peptide, It is characterized by measuring irritation activity.
  • the present invention provides
  • the labeled test compound When a labeled test compound is brought into contact with the receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof, the labeled test compound A method for determining a ligand to the receptor protein or a salt thereof of the present invention, which comprises measuring the amount of the compound bound to the protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof;
  • a method for determining a ligand to the receptor protein of the present invention which comprises measuring the amount of binding to the receptor protein or a salt thereof.
  • cell stimulating activity via the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, Activities that promote or inhibit intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • a method for determining a ligand for the receptor protein or a salt thereof according to the present invention and
  • a receptor protein in a probe contacting a test compound with a receptor protein expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention Cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein release
  • Cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein release
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof characterized in that the activity of the receptor or its salt is measured.
  • the receptor protein used in the ligand determination method may be any protein containing the above-described receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention. Recept Yuichi protein expressed in large amounts is suitable.
  • the expression method described above is used to produce the receptor protein of the present invention, but it is preferably carried out by expressing DNA encoding the receptor protein in mammalian cells or insect cells.
  • a complementary DNA is usually used as a DNA fragment that encodes a target protein portion, but is not necessarily limited to this.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce the DNA fragment encoding the receptor protein of the present invention into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment must be expressed in a nuclear polyhedrosis virus belonging to baculovirus using an insect as a host.
  • Nuclear polyhedros is virus (NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallotionin promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, downstream of SRa promoter, etc.
  • NPV nuclear polyhedros is virus
  • SV40-derived promoter SV40-derived promoter
  • retrovirus promoter metallotionin promoter
  • human heat shock promoter cytomegalovirus promoter
  • cytomegalovirus promoter downstream of SRa promoter, etc.
  • SRa promoter downstream of SRa promoter
  • the receptor protein or its partial peptide or its partial peptide purified according to a method known per se may be used as the receptor protein or its partial peptide or a salt thereof of the present invention. It may be a salt, or a cell containing the receptor protein or a cell membrane fraction thereof may be used.
  • the cell When a cell containing the receptor protein of the present invention is used in the method for determining a ligand of the present invention, the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the receptor protein of the present invention refers to a host cell expressing the receptor protein of the present invention.
  • the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, Insect cells and animal cells are used.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em homogenizer, crushing with a Pelling Blender ⁇ polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, narrowing the nozzles while applying pressure with a French press, etc. Crushing caused by erupting from the ground.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (1500 rpm to 30000 rpm). Centrifuge for 1 minute to 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipid / membrane proteins.
  • the amount of the receptor protein in the cells containing the receptor protein and the membrane fraction thereof is preferably 10 3 to 10 s molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. .
  • receptor protein fraction a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • CXC chemokine subfamily MCAFZMCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eot ax in, RANTES, MIP-1, MIP-1 j3, HCC-1, MIP-3 Q! / LARC , MI P-3 ⁇ / ELC, 1-309, TARC, MI PF-1, MI PF-2 / eota xin-2, M DC, DC-CK1 / PARC, SLC and other CC chemokine subfamilies; 1 One of C chemokine subfamily such as ymp otactin; CX3 C chemokine subfamily such as fractalkine Li Chief), endothelin, Ente port gastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic tick Po Ripepu evening Ido, galanin, lysophosphatidic acid (LPA), including Sufuingoshin 1 monophosphate is preferred.
  • C chemokine subfamily such as y
  • a ligand for the receptor protein or a salt thereof of the present invention first, cells or a membrane fraction of the cell containing the receptor protein of the present invention are suspended in a buffer suitable for the determination method.
  • a buffer suitable for the determination method such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris-monohydrochloride buffer.
  • various proteins such as detergents such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and deoxycholate, serum albumin, and gelatin are used as buffers.
  • protease inhibitors such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by proteases.
  • a quantity of (5000 c pm ⁇ 500000 c pm) [3 H], [125 1], [ “C] labeled with a [35 S] The test compound is used together.
  • test compound having a count (B-NSB) exceeding 0 cpm obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) is used as a ligand (agonist) for the receptor Yuichi protein or its salt of the present invention.
  • the cell stimulating activity through the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation) , Inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation
  • Inositol phosphate production cell membrane potential fluctuation
  • intracellular protein phosphorylation activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • the assay Prior to ligand determination, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant.
  • the products generated are quantified according to the respective method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in a cell, the assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. Good. In addition, activities such as inhibition of cAMP production can be detected as production inhibitory effects on cells whose basic production has been increased with forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • activities such as inhibition of cAMP production can be detected as production inhibitory effects on cells whose basic production has been increased with forskolin or the like.
  • the kit for determining a ligand that binds to the receptor protein of the present invention or a salt thereof includes the receptor protein of the present invention or a salt thereof, the partial peptide of the present invention or a salt thereof, a cell containing the receptor protein of the present invention, or It contains the membrane fraction of cells containing the receptor protein of the invention.
  • Examples of the kit for determining a ligand of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , and 95% air for 2 days.
  • the same as the labeled compound is prepared at a concentration 100 to 1000 times higher.
  • Examples of the ligand capable of binding to the receptor protein of the present invention or a salt thereof include, for example, substances specifically present in the brain, pituitary gland, heart, spleen, testis, and the like. Specifically, angiotensin, bombesin, canapinoids, cholecystokinin, g ⁇ / evening min, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioids, purines, vasoprescin, oxotosine, PACAP (eg, ACAP 27 , PACAP 38), secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Rerated Polypeptide), somatostin, dopamine, motilin, amylin, Bradykinin, CGRP (calcitonin gene-related peptide) ), Leukotriene,
  • Endothelin enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophos Fatidic acid (LPA), sphingosine 1-phosphate and the like are used.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention or the DNA encoding the receptor protein is determined according to the action of the ligand.
  • the receptor protein of the present invention It can be used as a medicament such as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of Z.
  • the receptor protein of the present invention when there is a patient who cannot expect the physiological action of the ligand because the receptor protein of the present invention is reduced in the living body (deficiency of the receptor protein protein), there are (1) the receptor protein of the present invention. Is administered to the patient to supplement the amount of the receptor protein, or (ii) the DNA encoding the receptor protein of the present invention is administered to the patient for expression, or After inserting and expressing the DNA encoding the receptor protein of the present invention into target cells, and then transplanting the cells into the patient, the amount of the receptor protein in the body of the patient is increased.
  • the effect of the ligand can be sufficiently exerted. That is, the DNA encoding the receptor protein of the present invention is useful as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the safe and low toxic receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is a G protein-coupled receptor protein MAS, (Cell 45, 711-719 (1986), NATURE 335, 437-440 (1988)) at the amino acid sequence level, It is a novel seven-transmembrane receptor protein with approximately 29% homology.
  • the receptor protein of the present invention or the DNA encoding the receptor protein may be used for central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (eg, allergy, asthma, rheumatism, etc.), circulation Organ diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach 'cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, Colon cancer, rectal cancer, etc.), metabolic disease (eg, diabetes, diabetic complications, obesity, arteriosclerosis, gout, cataract, etc.), immune system disease (eg, autoimmune disease, etc.), digestive system disease (Eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, gastritis, reflux esophagitis, etc.) and the like, and are useful for prevention and / or treatment.
  • central diseases eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.
  • inflammatory diseases eg, allergy, asthma,
  • the receptor protein of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention when used as the above-described prophylactic / therapeutic agent, the DNA of the present invention may be used alone or in a retroviral vector. After insertion into an appropriate vector such as an adenovirus vector or an adenovirus associated virus vector It can be carried out according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with adjuvants for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. '
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the receptor protein may be orally administered as sugar-coated tablets, capsules, elixirs, microcapsules, or the like, if necessary. It can be used parenterally in the form of injectable solutions, such as sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or suspensions.
  • injectable solutions such as sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or suspensions.
  • a known carrier, a flavoring agent, an excipient, a vehicle, a preservative, a stabilizer which is a physiologically acceptable carrier for the receptor protein of the present invention or the DNA encoding the receptor protein of the present invention; It can be manufactured by mixing with a binder and the like in a unit dosage form generally required for the practice of the preparation.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • Swelling agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like.
  • Agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), non-ionic surfactant (eg, polysorbate 80 TM, HCO-50) Is also good.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • the prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.).
  • the dose of the receptor protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a patient with cancer (as 60 kg), it is generally required to be administered per day. It is about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • injection it is usually used, for example, for cancer patients (60 kg).
  • About 0.0 :! It is convenient to administer about 3 to Omg, preferably about 0.1 to 20mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg. '
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, the target organ, the condition, the administration method, and the like. From about 0.1 mg to about 100 mg, preferably from about 1.0 to 5 Om'g, more preferably from about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually, for example, a cancer patient (as 6 O kg)
  • it is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg, by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe for humans or mammals. (Eg, in rats, mice, rabbits, rabbits, sheep, bush, birds, cats, dogs, monkeys, etc.) abnormalities in DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention or its partial peptide (genetic abnormalities). ) Can be detected, and thus is useful as a gene diagnostic agent for, for example, damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, and increase or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the well-known Northern Hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989 )).
  • the DNA of the present invention can be used for screening for a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or its partial peptide when used as a probe.
  • the present invention relates to, for example, (i) a non-human mammal's (2) blood, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant of the present invention.
  • the measurement of the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide is specifically performed as follows.
  • non-human mammals for example, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits
  • a cancer-bearing mouse, etc. to a drug (for example, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (for example, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.)
  • a specific organ eg, brain, liver, kidney, heart, Teng spleen, testis, etc.
  • tissue or cell isolated from the organ is obtained.
  • the mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the obtained cells can be determined, for example, by extracting mRNA from cells or the like by the method described in, for example, and then using, for example, a technique such as TaQManPCR.
  • the analysis can also be performed by performing a Northern blot by a means known per se.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the above method, and the mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the transformant is similarly prepared. Can be quantified and analyzed.
  • Screening for a compound that alters the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention comprises:
  • a given time before drug or physical stress is applied to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered simultaneously with the target stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours It can be performed by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cells.
  • the test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to Three days later), the amount can be determined by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof contained in the transformant.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an effect of changing the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention.
  • the present invention By increasing the expression level of the receptor protein or its partial peptide, G-protein-coupled receptors Vesicle stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein Phosphorylation, activation of c-fos, activity of suppressing or reducing pH, etc.), and (mouth) decreasing the expression level of the receptor protein of the present invention or its partial peptide.
  • Vesicle stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein Phosphorylation, activation of c-fos, activity of suppressing or reducing pH, etc.
  • Vesicle stimulating activity eg
  • Such a compound having an effect of changing the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof may be a central disease (e.g., Alzheimer's disease, dementia, eating disorder, etc.), an inflammatory disease (e.g., allergy, asthma, Rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, uterus) Cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc., metabolic diseases (eg, diabetes, diabetic complications, obesity, arteriosclerosis, gout, cataract, etc.), immune system diseases (eg, autoimmune diseases, etc.), It is useful for the prevention and / or treatment of gastrointestinal diseases (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, gastritis, reflux esophagitis, etc.).
  • gastrointestinal diseases eg, gastric ulcer, duodenal ulcer
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for reducing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, cats, dogs, animals). For example).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a cancer patient (as 60 kg), About 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • it is usually used, for example, in a cancer patient (as 6 Ok). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. is there.
  • the amount converted per 60 kg can be administered
  • a prophylactic, Z or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo such as central function. Therefore, a compound that alters the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof may be a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention [central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders).
  • central diseases eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders.
  • Inflammatory diseases e.g., allergy, asthma, rheumatism, etc.
  • cardiovascular diseases e.g., hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis, etc.
  • cancer e.g., non-small cell lung cancer, Ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.
  • metabolic diseases e.g, diabetes, diabetic complications, obesity, arterial sclerosis, gout, cataract, etc.
  • Immune system diseases eg, autoimmune diseases, etc.
  • digestive system diseases eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, gastritis, reflux esophagitis, etc.
  • the compound when used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to conventional means.
  • the compound may be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., if necessary, It can be used parenterally in the form of a sterile solution with a pharmaceutically acceptable liquid, or in the form of an injection such as a suspension.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by The amount of active ingredient in these preparations should be adjusted so that an appropriate dosage in the specified range can be obtained.
  • Excipients that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cell mouth, corn starch, gelatin, Swelling agents such as alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharine, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cell mouth
  • corn starch gelatin
  • Swelling agents such as alginic acid
  • lubricants such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharine
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing pudose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium salt, etc.) and the like are used.
  • solubilizers such as alcohols (eg,, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene dalicol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM, HCO-50) May be.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity. It can be administered to animals (eg, rats, mice, egrets
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a patient with cancer (as 60 kg)
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand concentration in the subject can be measured by bringing the subject into contact with the receptor protein or the like of the present invention. Specifically, for example, it can be used in accordance with the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • a method for screening a compound (agonist, antagonist, etc.) that changes the binding property between a G protein-coupled receptor protein and a ligand of the present invention A compound that alters the binding between the ligand and the receptor protein of the present invention by constructing an expression system for Yuichi protein or the like and using a receptor binding assay system using the expression system (for example, a peptide or protein) , Non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be efficiently screened.
  • Such compounds include (a) cell stimulating activity via G protein-coupled receptors (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, PH reduction, etc.
  • G protein-coupled receptors eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, PH reduction, etc.
  • ligand against the receptor protein of the present invention (Agonist against the receptor protein of the present invention), (mouth) a compound not having the cell stimulating activity (so-called antagonist against the receptor protein of the present invention), (8) ligand and G protein-coupled receptor of the present invention A compound that enhances the binding force to Yuichi protein, or (2) a compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
  • the compound (a) is preferably screened by the ligand determination method described above.
  • the present invention relates to (i) the case where the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand, and (ii) the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its partial peptide.
  • a method for screening a salt is provided.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the receptor protein, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared. I do.
  • the present invention provides
  • a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention eg, a ligand for the receptor protein or the like of the present invention
  • a cell containing the receptor protein of the present invention or the like e.g., a cell containing the receptor protein of the present invention or the like.
  • Cell stimulating activity via receptor receptor eg, arachidonic acid release, etc.
  • a compound activating one protein or the like and a test compound are brought into contact with cells containing the receptor protein of the present invention.
  • a compound that alters the binding between the ligand and the receptor protein of the present invention which is characterized by measuring and comparing the activity of promoting or suppressing the decrease in H Other screening methods for salt thereof, and
  • a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention for example, a ligand for the receptor protein or the like of the present invention
  • a test compound were expressed on the cell membrane by contacting with the receptor protein or the like of the present invention or by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding property between a ligand and a receptor protein of the present invention, which is characterized by measuring and comparing the activity of promoting or suppressing thyroid.
  • a receptor cell stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH
  • a receptor cell stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH
  • the present invention provides a method
  • the receptor protein or the like of the present invention Prior to obtaining the receptor protein or the like of the present invention, when screening for G protein-coupled receptor agonists or antagonists, first, cells, tissues or cell membrane fractions containing G protein-coupled receptor proteins such as rats are used. It is necessary to obtain a candidate compound (primary screening) and then conduct a test (secondary screening) to confirm whether the candidate compound actually inhibits the binding between human G protein-coupled receptor protein and ligand. there were. If the cell, tissue or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins are also mixed, and it has been difficult to actually screen for an agonist or antagonist against the target receptor protein.
  • the use of the human receptor protein of the present invention eliminates the need for primary screening, and efficiently screens for a compound that inhibits the binding of a ligand to a G protein-coupled receptor protein. be able to. Furthermore, whether the screened compound is an agonist or an engonist can be easily evaluated.
  • the receptor protein or the like of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-mentioned receptor of the present invention.
  • a cell membrane fraction of a mammalian organ containing one protein or the like is preferred.
  • human-derived receptor proteins and the like that are expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening.
  • the method described above is used for producing the receptor protein and the like of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells and insect cells.
  • Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • a DNA fragment encoding the receptor protein of the present invention is ligated to a host animal.
  • the DNA fragment is used as a polyhedrin promoter of nuclear polyhedros is virus (NPV) belonging to baculovirus using an insect as a host, It is preferable to incorporate the promoter into downstream, such as an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metamouth protein promoter, a human heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, and an SRo! Promoter.
  • NPV nuclear polyhedros is virus
  • downstream such as an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metamouth protein promoter, a human heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, and an SRo! Promoter.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the method is performed according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry, 267, 19555-19559, 1992]. be able to.
  • the protein containing the receptor protein or the like of the present invention may be a receptor protein or the like purified according to a method known per se, or a cell containing the receptor protein or the like.
  • a membrane fraction of cells containing the receptor protein or the like may be used.
  • the cells When cells containing the receptor protein or the like of the present invention are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • Cells containing the receptor protein or the like of the present invention include host cells that express the receptor protein or the like.
  • Examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like. Is preferred.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Warlinda blender or a polytron (Kineraa Uca), crushing with ultrasonic waves, pressing the cells while pressing with a French press, etc. And crushing by jetting from a thin nozzle.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (150 rpm to 300 rpm).
  • the mixture is centrifuged usually at 0,000 rm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction the expressed receptor protein and the like and cell-derived phosphorus were contained. It is rich in membrane components such as lipids and membrane proteins.
  • the amount of receptions evening one protein of a cell or membrane fraction containing the receptions evening over proteins like, and even preferably from 1 0 3 to 1 0 8 molecules per cell, in 1 0 5-1 0 7 molecules It is preferred that there be.
  • the higher the expression level the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which not only enables the construction of a highly sensitive screening system, but also enables the measurement of a large number of samples in the same lot. Become.
  • a suitable receptor protein fraction and a labeled ligand are required. It is.
  • receptor protein fraction a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto is preferable.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal information transduction action, etc.
  • labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound or the like is used. For example [3 H], [125 I], [14 C], etc. Ligands-labeled, etc. [35 S] used.
  • a cell or a membrane fraction of the cell containing the receptor protein of the present invention is first suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer containing tris-HCl, which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and deoxycollate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leptin, E-644 (manufactured by Peptide Research Institute), and peptide suptin can be added for the purpose of suppressing receptor degradation and degradation of the ligand by proteases.
  • 0.0 to 1 m 1 ⁇ 1 0 m 1 of the receptor first solution was added a fixed amount (5 0 0 0 cpm ⁇ 5 0 0 0 0 0 cpm) of the labeled ligand concurrently 1 0- 4 ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ test compound Coexist.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper and the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or an counter.
  • the specific binding amount (B—NSB) becomes For example, a test compound having a concentration of 50% or less can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
  • a cell stimulating activity through a receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, 'inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos Activity, activity for promoting or suppressing pH reduction, etc.
  • a cell stimulating activity through a receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, 'inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos Activity, activity for promoting or suppressing pH reduction, etc.
  • cells containing the receptor protein or the like of the present invention are cultured on a multi-well plate or the like.
  • replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to the cells, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, extract the cells, or collect the supernatant.
  • the products produced are quantified according to the respective method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of the cell stimulating activity is difficult to be assayed by a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. Is also good.
  • activities such as inhibition of cAMP production can be detected as production inhibitory effects on cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • Cells expressing an appropriate receptor protein are required.
  • Cells expressing the receptor protein or the like of the present invention include a cell line having the natural receptor protein or the like of the present invention and the above-mentioned recombinant type.
  • a cell line expressing a receptor protein or the like is desirable.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic conjugates, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal and tissue extracts, etc. are used. Or a known compound.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property of the ligand to the receptor protein or the like of the present invention may be a cell containing the receptor protein or the like of the present invention, the receptor protein or the like of the present invention, or the present invention. And those containing the membrane fraction of cells containing receptor proteins and the like.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention 12-well plates and passaged 5 X 10 5 cells / six, 37 ° C, 5% C_ ⁇ 2, those that have been cultured for 2 days at 95% air 3 labeled Ligand
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between a ligand and the receptor protein of the present invention.
  • G protein-coupled receptor Cell stimulating activity through the receptor eg arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphoric acid production, cell membrane
  • a so-called agonist against the receptor protein of the present invention a so-called agonist against the receptor protein of the present invention
  • Mouth a compound having no cell stimulating activity (so-called antagonist against the receptor protein of the present invention)
  • ligand Compound increasing strong binding force between G protein-coupled receptor protein of the present invention or (d) is a compound that reduces the binding force between G protein-coupled receptions evening over ⁇ white matter of the ligand and the present invention.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the agonist against the receptor protein or the like of the present invention has the same activity as the physiological activity of the ligand for the receptor protein or the like of the present invention. Useful.
  • the antagonist to the receptor protein of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention, so that it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the ligand activity. is there.
  • the compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention or the like. It is.
  • the compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention or the like. is there.
  • the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg, rats, mice, egrets, higgs, bushes, cats, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, egrets, higgs, bushes, cats, cats, dogs, dogs, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method and the like. It is about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. It is. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg. (8) A preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, antagonist) that alters the binding between a G protein-coupled receptor protein diet and a ligand of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important roles in vivo, such as central functions, circulatory functions, and digestive functions. Therefore, compounds that alter the binding between the receptor protein of the present invention and the ligand (agonist, antennae gonist) and ligands for the receptor protein of the present invention are associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases.
  • the compound or ligand When used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to conventional means.
  • the compound or ligand can be sterilized with tablets or capsules, elixirs, microcapsules, etc., as required, or sugar-coated, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the above type of material can further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection are formulated according to normal pharmaceutical practice, such as by dissolving or suspending the active substance in a vehicle, such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil.
  • a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium salt, etc.) and the like are used.
  • suitable solubilizers such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene daricol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50) You may.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic and therapeutic agents examples include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent can be used in combination with an appropriate drug, for example, as a DDS preparation specifically targeting an organ or tissue in which the
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a patient with cancer (as 60 kg)
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the present invention provides, for example, (i) reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled receptor protein in a competitive manner, and measuring the ratio of the labeled receptor protein bound to the antibody.
  • a method for quantifying the receptor protein of the present invention in a test solution
  • the present invention provides a method for quantifying the receptor protein of the present invention in a test solution.
  • one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal of the receptor protein of the present invention or the like, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the receptor protein or the like of the present invention. Is preferred.
  • the receptor protein of the present invention can be measured using a monoclonal antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and the detection can be performed by tissue staining or the like. You can also.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the assay method using an antibody against the receptor protein or the like of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen corresponding to the antigen amount (for example, the amount of the receptor protein) in the test solution.
  • any measurement method may be used as long as the amount of the complex is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competition method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, however, in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a San Germanti method described later.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], and the like are used [14 C].
  • the above enzyme For example, those which are stable and have a large specific activity are preferable.
  • 3-galactosidase,] 3-darcosidase, alkaline phosphatase, passoxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the agent, the amount of the receptor protein of the present invention in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is an antibody having a different binding site to the receptor protein and the like. Is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the receptor protein, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • BZF separation Measure the amount of any of B and F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the above antibody or an immobilized antibody is used as the first antibody.
  • a solid-phase method using a soluble first antibody and a solid-phase antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the receptor protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the receptor protein of the present invention, detection of the receptor protein of the present invention in each fraction at the time of purification, and receptor protein of the present invention in test cells It can be used for the analysis of the behavior of an object.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt, a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane Can be used for screening. '
  • Non-human mammal 1) Blood, 2) Specific organs, 3) Tissues or cells isolated from the organs are destroyed, the cell membrane fraction is isolated, and the receptor of the present invention contained in the cell membrane fraction
  • the present invention provides a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining.
  • the present invention provides a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane by confirming the protein on the cell membrane.
  • the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically determined as follows.
  • non-human mammals for example, mice, rats, rabbits, puppies, higgies, bushus, puppies, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, demented rats, obese mice, Drugs (eg, anti-dementia drugs, anti-hypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.)
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, anti-hypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • blood or specific organs eg, brain, liver, kidney, spleen, testis, etc.
  • tissues or cells isolated from the organs are obtained.
  • the obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.), and the organ, tissue or cell is suspended.
  • the cell membrane fraction is obtained by using a surfactant (eg, Triton XI 00 TM, Twin 20 TM, etc.) and centrifugation, filtration, and column fractionation. .
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Warlinda blender-Polytron (Kinematica), crushing by ultrasonic waves, pressurizing with a French press, etc. Crushing by ejecting the cells from a thin nozzle while performing the treatment.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a high speed (150 rpm to 300 rpm). The mixture is centrifuged at 0,000 rpm for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, a sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by a means known per se. '
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or its partial peptide is prepared according to the above-mentioned method, and the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is quantified. be able to.
  • Screening for a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane is performed by:
  • a given time before drug or physical stress is applied to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered simultaneously with the target stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cell membrane
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 to 3 days) After a day), it can be performed by quantifying the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane.
  • the confirmation of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • non-human mammals for example, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • blood or a specific organ eg, brain, liver, kidney, heart, kidney, spleen, testis, etc.
  • tissue or cells isolated from the organ is obtained.
  • the obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostained using the antibody of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention or a portion thereof in the cell membrane can be quantitatively or qualitatively determined.
  • the amount of the peptide can be confirmed.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an effect of changing the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane.
  • the receptor of the present invention by increasing the amount of the protein or its partial peptide, the cell stimulating activity via G protein-coupled receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular C AMP production, intracellular c-GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.)
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular C AMP production, intracellular c-GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-
  • the compound examples include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein of the present invention or the like.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for reducing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to conventional means.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • a daily dose is required.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the dose can be administered in terms of 6 Okg.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo such as central function. Therefore, a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane can be used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the compound is used for preventing a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention and When used as a therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
  • the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like as needed, orally, or aseptic solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally or in the form of injections such as suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like.
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50) You may use together.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agents examples include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride). ), Stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride
  • Stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg, rats, mice, egret
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a patient with cancer (as 60 kg)
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the neutralizing activity of the antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof against the receptor protein or the like means that the activity of inactivating the signal transduction function related to the receptor protein. means. Therefore, when the antibody has a neutralizing activity, signal transmission involving the receptor protein, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity that promotes or suppresses release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, etc. Etc.) can be deactivated. Therefore, it can be used for prevention and Z or treatment of diseases caused by overexpression of the receptor protein.
  • cell stimulating activity via the receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity that promotes or suppresses release, intracellular c
  • mice Preparation of animal having DNA encoding G protein-coupled receptor protein of the present invention Using the DNA of the present invention, a transgenic animal that expresses the receptor protein of the present invention or the like can be prepared.
  • animals include mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, bush, sea lions, cats, dogs, monkeys, etc.) (hereinafter sometimes abbreviated as animals). , Mice, egrets are preferred
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to a subject animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter that can be expressed in animal cells.
  • a promoter that can be expressed in animal cells.
  • a gene construct in which the DNA of the present invention derived from an animal having high homology to the DNA is linked to the downstream of various promoters capable of expressing in animal cells can be used, for example.
  • a DNA-transferred animal that highly produces the receptor protein of the present invention can be produced.
  • this promoter for example, ubiquitous expression promoters such as virus-derived promoter and meta-mouth thionein can be used, but NGF gene promoter and enolase gene promoter which are specifically expressed in the brain are preferably used. .
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the receptor protein etc. of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the receptor protein etc. of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. means.
  • the offspring of such animals that have inherited the gene have the receptor protein of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention After confirming that the DNA-transferred animal of the present invention stably retains the gene by mating, it can be reared in an ordinary breeding environment as the DNA-bearing animal. In addition, by crossing male and female animals having the target DNA, homozygous animals having the transgene on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing the male and female animals, all the offspring can obtain the DNA. Breeding to have Since the animal into which the DNA of the present invention has been transferred expresses the receptor protein of the present invention at a high level, it is useful as an animal for screening an agonist or an antagonist for the receptor protein of the present invention.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • the receptor of the present invention can be obtained.
  • One protein can be analyzed.
  • the cells of a tissue having the receptor protein of the present invention or the like are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to obtain cells from tissues that are generally difficult to culture, such as those derived from brain or peripheral tissues. Function can be studied.
  • the cells for example, it is possible to select a drug that enhances the function of various tissues.
  • the receptor protein of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art.
  • amino acids can have simple optical isomers, L-forms are indicated unless otherwise specified.
  • HONB trihydroxy-5-norpolene-2,3-dicarpoxyimide
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of a novel human-derived G protein-coupled receptor protein hTGR11 of the present invention.
  • the 16th and 160th Xaas represent Ser or Gly, respectively.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel human-derived G protein-coupled receptor-1 protein hTGR11 represented by SEQ ID NO: 1.
  • the 46th, 478th and 915th Rs represent A or G.
  • SEQ ID NO: 3 1 shows the amino acid sequence of the human-derived novel G protein-coupled receptor protein hTGR11 of the present invention.
  • the 16th amino acid residue is Ser
  • the 160th amino acid residue is Ser.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of the human-derived novel G protein-coupled receptor protein hTGR11 of the present invention.
  • the 16th amino acid residue is GIy and the 160th amino acid residue is Gly.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of the human-derived novel G protein-coupled receptor protein hTGR11 of the present invention.
  • the 16th amino acid residue is Ser
  • the 160th amino acid residue is Gly.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of the human-derived novel G protein-coupled receptor protein hTGR11 of the present invention.
  • the 16th amino acid residue is Gly and the 160th amino acid residue is Ser. '
  • the 46th base is A
  • the 478th base is A
  • the 915th base is G.
  • the 46th base is A
  • the 478th base is A
  • the 915th base is A.
  • the 46th base is A
  • the 478th base is G
  • the 915th base is G.
  • No human-derived novel G protein-coupled receptor protein hTG represented by SEQ ID NO: 5 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding R11.
  • the 46th base is A
  • the 478th base is G
  • the 915th base is A.
  • the 46th base is G
  • the 478th base is G
  • the 915th base is G.
  • the 46th base is G
  • the 478th base is A
  • the 915th base is A.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of Primer 12 used in the PCR reaction in Example 1 below.
  • SEQ ID NO: 18 shows the base sequence of primer 2 used in the PCR reaction in Example 2 below.
  • Example 2 The base sequence of the probe used in the PCR reaction in Example 2 below is shown.
  • the transformant Escherichia coli TOP10 / pC R2.1-hTGRllaa obtained in Example 1 below has been used since March 5, 2001 (Heisei 13) 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture No. (postal code 305-8566) deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) as F ERM BP-7483, Osaka from February 20, 2001 It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IF 0), 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka City (zip code 532-8686) under the deposit number IFO 16570.
  • IF 0 Fermentation Research Institute
  • 2-17-85 Jusanhoncho
  • Yodogawa-ku Osaka City
  • Example 2 The transformant obtained in Example 1 below, Escherichia coli TOP10 / pCR2. HTGRllgg, has been deposited on NI BH from March 5, 2001 (December 2001) under the accession number FERM BP-7484. 2001 (Heisei 13) Deposited with the IFO from February 20 as the deposit number IFO 16571.
  • Example 3 The transformant obtained in Example 1 below, Escherichia coli TOP10 / pCR2. HTGRllgg, has been deposited on NI BH from March 5, 2001 (December 2001) under the accession number FERM BP-7484. 2001 (Heisei 13) Deposited with the IFO from February 20 as the deposit number IFO 16571.
  • PCR reaction was performed using two primers, Primer 1 (SEQ ID NO: 14) and Primer 2 (SEQ ID NO: 15).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was as follows: the above cDNA was used as 1Z10 type III, 1/50 amount of Advantage-GC2 Polymerase Mix (CL0NTECH), primer 1 (SEQ ID NO: 14) and primer 2 (SEQ ID NO: 1). 5) was added to each of 0.5 M, dNTPs 200 ULM, and 1 Z5 of buffer attached to the enzyme, and 1 Z5 of GC Melt to make a 20 l solution.
  • the PCR reaction was performed at 94 ° C for 5 minutes, 94.
  • the PCR reaction product was subcloned into a plasmid vector PCR2.1 (Invitrogen) according to the prescription of TA cloning kit (Invitrogen). . This was introduced into E. coli TOP10, and clones having cDNA were selected in LB agar medium containing ampicillin. As a result of analyzing the sequence of each clone, a cDNA sequence (SEQ ID NO: 2) encoding a novel G protein-coupled receptor protein was obtained.
  • a novel G protein-coupled receptor protein containing these amino acid sequences (SEQ ID NO: 1) was named hTGRll. (When the 46th and 478th bases are changed from A to G, the 16th and 160th amino acids are changed. Gly changes from Ser. Amino acid remains unchanged even if base 915 changes from A to G.)
  • a transformant having the cDNA sequence (SEQ ID NO: 7) was transformed into Escherichia coli T0P10 / pCR2.1-hTGllaa, and a transformant having the cDNA sequence (SEQ ID NO: 11) was transformed into Escherichia coli TOP10. / pCR2. It was named hTGRllgg.
  • the expression distribution of hTGR11 in human tissues was analyzed by using TaqMan PCR.
  • type I use the Human Multiple Tissue cDNA Panel (Clontech), a probe having primers 1 (SEQ ID NO: 16) and primer 1 (SEQ ID NO: 17) as primers for PCR, and a probe having SEQ ID NO: 18 was used to perform TaqMan PCR.
  • the reaction solution composition for the reaction was as follows: TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan) was used for 12.5 1; 10 M primer 1 and primer 1; The PCR reaction is performed at 50 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 10 minutes, and then at 95 ° C for 15 seconds, 60 minutes for 1 minute. Was repeated 40 times.
  • FIG. 2 shows the results calculated as the number of copies per cDNA In based on the obtained results. This indicates that the expression level of hTGR11 is high in the ovary and placenta 'testis.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or Polynucleotides (eg, DNA, RNA and their derivatives) that encode the receptor protein or its partial peptide include (1) determination of ligand (agonite), (2) antibody and antiserum. Acquisition, 3 Expression of recombinant receptor protein; 4 Development of receptor-based binding assay system using the same expression system and screening of one candidate drug, 5 With structurally similar ligand ⁇ Comparison of drug design based on C, ⁇ ⁇ reagents for the preparation of probes and PCR schemes in genetic diagnosis, ⁇ ⁇ production of transgenic animals or 8gene prediction !? Can be used.

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Description

明 細 書 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質およびその D N A 技術分野
本発明は、 ヒト脾臓由来の新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩 およびそれをコードする D NAに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特異 的なレセプ夕一蛋白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプター 蛋白質のうち多くは共役している guanine nucleot ide-binding protein (以下、 G蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行な レ また、 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 G蛋 白質共役型レセプ夕一蛋白質あるいは 7回膜貫通型レセプター蛋白質 （7 TMR ) と総称される。
G蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在 し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えば、 ホルモン、 神経伝達物質 および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセプ夕 一は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシグナルに より細胞の賦活ゃ抑制といつた種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ ター蛋白質、 特には G蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにするこ とは、 各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、 それら機能と密接に関連した医薬 品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。 - 例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達 物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれて いる。 特に、 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し.、 それぞれに対応する レセプ夕一蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。 生体内には未だ未 知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、 それらのレセプ夕一 蛋白質の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに、 既知 のレセプ夕一蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かつ ていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一蛋白質との 関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセ プタ一蛋白質に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストを効率よくスクリーニングし 、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプ夕一蛋白質の遺伝子 の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。 近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 c D NAの配列を ランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D NAの断片配列が Expressed Sequence Tag ( E S T) としてデータベースに登録 され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能 を推定することは困難である。
従来、 G蛋白質共役型レセプターと生理活性物質 （すなわち、 リガンド） との 結合を阻害する物質や、 結合して生理活性物質 （すなわち、 リガンド） と同様な シグナル伝達を引き起こす物質は、 これらレセプターの特異的なアン夕ゴニスト またはァゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従 つて、 このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬品 開発の標的ともなりうる G蛋白質共役型レセプター蛋白質を新規に見出し、 その 遺伝子 （例えば c D NA) をクローニングすることは、 新規 G蛋白質共役型レセ プタ一蛋白質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストを見出す際に、 非常に重要な手段となる。
しかし、 G蛋白質共役型レセプ夕一はその全てが見出されているわけではなく 、 現時点でもなお、 未知の G蛋白質共役型レセプ夕一、 また対応するリガンドが 同定されていない、 いわゆるォーファンレセプターが多数存在しており、 新たな G蛋白質共役型レセプターの探索および機能解明が切望されている。
G蛋白質共役型レセプ夕一は、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新たな生 理活性物質 （すなわち、 リガンド） の探索、 また、 該レセプ夕一に対するァゴニ ストまたはアン夕ゴニス卜の探索に有用である。 一方、 生理的なリガンドが見出 されなくても、 該レセプターの不活化実験 （ノックアウト動物） から該レセプ夕 —の生理作用を解析することにより、 該レセプ夕一に対するァゴニストまたはァ ン夕ゴニストを作製することも可能である。 これら該レセプ夕一に対するリガン ド、 ァゴニストまたはアンタゴニストなどは、 G蛋白質共役型レセプ夕一の機能 不全に関連する疾患の予防 Z治療薬や診断薬として活用することが期待できる。 さらにまた、 G蛋白質共役型レセプ夕一の遺伝子変異に基づく、 生体での該レ セプ夕一の機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合も多 レ^ この場合には、 該レセプターに対するアン夕ゴニストやァゴニストの投与だ けでなく、 該レセプター遺伝子の生体内 （またはある特定の臓器） への導入や、 該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、 遺伝子治療に応用 することもできる。 この場合には該レセプタ一の塩基配列は遺伝子上の欠失や変 異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプ夕一の遺伝子は、 該 レセプ夕一の機能不全に関与する疾患の予防 Z治療薬や診断薬に応用することも できる。
本発明は、 上記のように有用な新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を提供す るものである。 すなわち、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその部 分べプチドまたはその塩、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチド （D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体） を含有するポリヌクレオチド （D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体） 、 該ポリ ヌクレオチドを含有する組換えベクター、 該組換えべクタ一を保持する形質転換 体、 該 G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造法、 該 G蛋白質共役 型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 該 G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物、 該 G蛋白質共役型 レセプ夕一に対するリガンドの決定方法、 リガンドと該 G蛋白質共役型レセプタ —蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） または その塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方 法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるリガンドと該 G蛋白質共役 型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アンタゴニスト、 ァゴニス ト） またはその塩、 およびリガンドと該 G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質との結 合性を変化させる化合物 （アンタゴニスト、 ァゴニスト） もしくは該 G蛋白質共 投型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる 医薬などを提供する。 _ 発明の開示
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒト脾臓由来の新規な G蛋白質共役型 レセプ夕一蛋白質をコードする cDNAを単離し、 その全塩基配列を解析するこ とに成功した。 そして、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、 第 1〜 第 7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、 これらの cDNAにコードされ る蛋白質が 7回膜貫通型の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質であることを確認し た。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに研究を重ねた結果、 本発明 を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプター蛋白質また はその塩、
(2) 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5または配列番号： 6で表わ されるアミノ酸配列を含有する上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白 質またはその塩、
(3) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまた はその塩、
(4) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) DN Aである上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(6) 配列番号： 2で表される塩基配列を有する上記 （4) 記載のポリヌクレ ォチド、
(7) 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列番 号： 11、 配列番号： 12または配列番号： 13で表される塩基配列を有する上 記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(8) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、
(9) 上記 （8) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
(10) 上記 （9) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載の G蛋白質共 役型レセプター蛋白質を生成せしめることを特徴とする上記 （1) 記載の G蛋白 質共役型レセプタ一蛋白質またはその塩の製造法、
(11) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （3 ) 記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(12) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質のシグナル伝達を 不活性化する中和抗体である上記 （11) 記載の抗体、
(13) 上記 （11) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(14) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （3 ) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られうる上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド、
(15) 上記 （14) 記載の G蛋白質共役型レセプターのリガンドを含有して なる医薬、 ，
(16) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （3 ) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、 (17) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （3
) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと上記 （ 1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(18) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3 ) 記載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと上記
(1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(19) 上記 （17) 記載のスクリーニング方法または上記 （18) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質 共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその 塩、
(20) 上記 （17) 記載のスクリーニング方法または上記 （18) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質 共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその 塩を含有してなる医薬、
(21) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェン卜な条件下 でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(22) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一 部を含有してなるポリヌクレオチド、
(23) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特 徵とする上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の mRNAの定量方 法、
(24) 上記 （11) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の定量方法、
(25) 上記 （23) または上記 （24) 記載の定量方法を用いることを特徴 とする上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一の機能が関連する疾患の診断 方法、
(26) 上記 （23) 記載の定量方法を用いることを特徴とする上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、
(27) 上記 （24) 記載の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜におけ る上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング方法、
(28) 上記 （26) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる上記 （1
) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはそ の塩、
(29) 上記 （27) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜に おける上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化させる化合物 またはその塩等に関する。
さらには、
(30) 蛋白質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列、 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度 、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のァミノ 酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1また は 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さ らに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列 番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個）
) のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み 合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記 （1) 記載の G蛋白質共役型 レセプタ—蛋白質またはその塩、
(31) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその塩ま たは上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させ ることを特徴とする上記 （16) 記載のリガンドの決定方法、
(32) リガンドが、 例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド 、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニュー ΰペプチド Υ、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP (例、 Ρ ACAP 27, PACAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 ァ ドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 P TH、 V I P (パソアクティブ インテスティナル ポリペプチド） 、 ソマトス 夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシト ニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ケ乇カイン スーパーファミリ一 （例、 I L一 8, GRO , GRO^, GR〇ァ， NAP— 2, ENA- 78, GCP- 2, PF 4, I P - 10， M i g, PBSF/SD F— 1などの CXCケモカインサブファミリー； MCAFZMCP— 1， MCP —2， MCP— 3， MCP-4, e o t ax i n, RANTES, MI P— 1 α 、 M I P- 1 j3, HCC- 1, M I P- 3 «/LARC、 M I P - 3 β/ELC , 1 - 309, TARC, MI PF— l, MI PF-2/e o t ax i n-2, MDC, DC-CK 1/PARC, S L Cなどの C Cケモカインサブファミリ一 ； 1 ymph o t a c t i nなどの Cケモカインサブファミリ一； f r a c t a 1 k i n eなどの CX3 Cケモカインサブファミリ一等） 、 エンドセリン、 ェン テロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティック ポリぺプタイド、 ガラニン、 リゾホスファチジン酸 （LPA) またはスフインゴ シン 1—リン酸である上記 （29) 記載のリガンドの決定方法、
(33) ( i) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはそ の塩または上記 (3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接触 させた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質もしく はその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドおよ び試験ィヒ合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記 （17 ) 記載のスクリーニング方法、
(34) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ
—蛋白質もしくはその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に 接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または上記 （3) 記載の部分 ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識したリガンドの上記 （ 1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または上記 （3) 記 載の部分べプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを特徴 とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその 塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(35) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試' 験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞に 接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二 ング方法、
(36) (i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕 一蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンド および試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有す る細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞の膜画分 に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載 の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング方法、
(37) (i) 標識したリガンドを上記 （9) 記載の形質転換体を培養するこ とによつて該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に 接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物 ¾上記 （9) 記載 の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質 共役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、 標識したリガンドの該 G蛋 白質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とす るリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(38) (i) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその 塩を活性化する化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含 有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 （1) 記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較すること を特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質また はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 (39) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を活 性化する化合物を上記 （9) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転 換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を活性化する化 合物および試験化合物を上記 （9) 記載の形質転換体を培養することによって該 形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場 合における、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕 一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(40) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性化する化合 物が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 ダル 夕ミン、 セロ卜ニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP (例、 PACAP 27, PACAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 ァドレノメジユリン、 ソマト ス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (パソァクテ イブ インテスティナル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチ リン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジ一ンリレーティッド ペプチド) 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロ ンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ケモカインスーパーファミリ一 (例、 I L- 8, GROa, GRO/3, GROァ， NAP— 2， ENA- 78, GCP -2, PF4, I P— 10, M i g, P B S FZS D F— 1などの C X Cケモカ インサブファミリー； MCAFZMCP— 1, MCP- 2, MCP— 3， MCP -4, e o t ax i n, RANTES, MI P— 1ひ、 MI P— l jS, HCC— 1, M I P— 3 «/LARC、 M I P— 3 /3/ELC, 1 - 309, TARC, MI PF— 1, M I PF-2/e o t a x i n- 2, MDC, DC - CK 1/P ARC, SLCなどの CCケモカインサブファミリ一； 1 ympho t a c t i nなどの Cケモカインサブファミリー； f r a c t a 1 k i n eなどの CX3 C ケモカインサブファミリ一等） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミ ン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニン 、 リゾホスファチジン酸 （LPA) またはスフインゴシン 1一リン酸である上記 (38) または （39) 記載のスクリーニング方法、
(41) 上記 （33) 〜 （40) 記載のスクリーニング方法で得られうるリガ ：記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合 性を変化させる化合物またはその塩、
(42) 上記 （33) 〜上記 （40) 記載のスクリーニング方法で得られうる リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(43) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞を 含有することを特徴とする上記 （18) 記載のスクリーニング用キット、
(44) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の 膜画分を含有することを特徴とする上記 （18) 記載のスクリーニング用キット
(45) 上記 （9) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の 細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有することを特徴とする 上記 （18) 記載のスクリーニング用キット、
(46) 上記 （43) 〜 （45) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはそ の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(47) 上記 （43) 〜 （45) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはそ の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医
(48) 上記 （11) 記載の抗体と、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを接触させる ことを特徴とする上記 （1) の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （ 3 ) 記載の部分べプチドまたはその塩の定量法、
(49) 上記 （11) 記載の抗体と、 被検液および標識化された上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドま たはその塩とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドま たはその塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載の G蛋 白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその 塩の定量法、
(50) 被検液と担体上に不溶化した上記 （11) 記載の抗体および標識化さ れた上記 （11) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化 担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたは その塩の定量法、
(51) 上記 （26) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる上記 （1 ) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはそ の塩を含有してなる医薬、
(52) 上記 （27) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜に おける上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物 またはその塩を含有してなる医薬、
(53) 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または 消化器系疾患の予防 ·治療剤である上記 （20) 、 （51) または （52) 記載 の医薬、 ，
(54) 哺乳動物に対して、 上記 （17) 記載のスクリーニング方法または （ 18) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消化器系疾患の予防 ·治療方法、
(55) 哺乳動物に対して、 上記 （.26) 記載のスクリーニング方法を用いて 得られうる上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化さ せる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性 疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消化器系疾患の予防 ·治療方 法、
(56) 哺乳動物に対して、 上記 （27) 記載のスクリーニング方法を用いて 得られうる細胞膜における上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量 を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患 、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消化器系疾患の予防 •治療方法、
(57) 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または 消化器系疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記 （17) 記載のスクリーニン グ方法または上記 （18) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるリ ガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結 合性を変化させる化合物またはその塩の使用、
(58) 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または 消化器系疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記 （26) 記載のスクリーニン グ方法を用いて得られうる上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の 発現量を変化させる化合物またはその塩の使用、 および
(59) 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または 消化器系疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記 （27) 記載のスクリーニン グ方法を用いて得られうる細胞膜における上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセ プ夕一蛋白質を変化させる化合物またはその塩の使用等を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は hTGRl 1の疎水性プロット図である。
図 2は hTGR l lのヒト組織における発現分布解析である。 CLONTECH Human M ultiple Tissue cDNA Panelでの発現量を示す。 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質 （以下、 レセプ夕一蛋白質と略記す る場合がある） は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。 配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列において第 16番目の Xaaおよび第 160番目の Xaaはいず れも Serまたは Glyを示す。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質としては、 例えば配列番号： 3で表わされる アミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質、 配列番号： 4で表わされるアミノ酸 配列を含有するレセプタ一蛋白質、 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列を含 有するレセプ夕一蛋白質、 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列を含有するレ セプ夕一蛋白質が挙げられる。
本発明のレセプター蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモット 、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （ 例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム 細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維 細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナ チュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは 間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球 系の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部 位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮 質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄 、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚 、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末 梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋な どに由来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であってもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましく は約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上 、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列などが挙げられ、 具体的には配列番号： 3、 4、 5または 6で 表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好まし くは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙げられ る。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の 分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方 法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガンドの決定方法や スクリーニング方法に従って測定することができる。
また、 本発明のレセプ夕一蛋白質としては、 ①配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァミノ 酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
具体的には例えば①配列番号： 3、 4、 5または 6で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0 個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列、 ②配列番号： 3、 4、 5または 6で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好 ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 3、 4、 5または 6で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 ( 1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④そ れらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などが用いられる。
本明細書におけるレセプター蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って、 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 (力ルポキシル末端) である。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質をはじめとする、 本発 明のレセプ夕一蛋白質は、 C末端がカルボキシル基 （一 C O O H) 、 カルボキシ レート（一 C O O -)、 アミド （一 C〇NH2) またはエステル （一C〇〇R) の何 れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナ フチルなどの C 6_127リール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル — C Mアルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの —ナフチルー（^_2アルキ ル基などの C 7_14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるピバ口 ィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキシ レート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されて いるものも本発明のレセプター蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては 、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のレセプ夕一蛋白質には、 上記した蛋白質において、 N末端の メチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2_6 アルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体 内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸ィ匕したもの、 分子内のァ ミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 — OH、 — S H、 アミノ基、 イミダゾール基 、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァ セチルなどの C2—6アルカノィル基などの d-6ァシル基など） で保護されているも の、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる 本発明のレセプター蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質などが用いられる。 具体的には配 列番号： 3、 4、 5または 6で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプター蛋 白質などが用いられる。
本発明のレセプター蛋白質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する場 合がある） としては、 上記した本発明のレセプター蛋白質の部分ペプチドであれ ば何れのものであってもよいが、 例えば、 本発明のレセプター蛋白質分子のうち 、 細胞膜の外に露出している部位であって、 レセプター結合活性を有するものな どが用いられる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプ夕一蛋白 質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロット解析において細胞外領域 （親水性 （ Hydrophi l ic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎 水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むぺプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含 む部分のペプチドでも良い。 '
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 上記した本発明のレセプター蛋白質 の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より 好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 % 以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性 を有するァミノ酸配列を示す。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0 個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。 また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （― C O OH) 、 カル ポキシレート （一 C O O—) 、 アミド （― C ONH2) またはエステル （一 C O〇 R) の何れであってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した本発明のレセプター蛋白質と同 様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端 側が生体内で切断され生成した Ginがピログルタミン酸化したもの、 分子内のァ ミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が 結合したいわゆる糖べプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはそ.の部分べプチドの塩としては、 酸または塩 基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸 、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオ ン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。 本発明のレセプタ一蛋白質またはその塩は、 上記したヒトゃ哺乳動物の細胞ま たは組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもで きるし、 後に記載する本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NAを含有する 形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後に記載す る蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはその アミド体の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 その ような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベン ズヒドリルァミン樹脂、 アミ.ノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコ ール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメ チルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4 - ( 2 ' , 4 ' ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 ' —ジメトキシフエ二ルー Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを 挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひ一ァミノ基と側鎖官能基を適当 に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方 法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時 に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応 を実嗨し、 目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性化 試薬を用いることができるが、 特に、'カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド 類としては、 D C C、 N， N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチル— N ' - ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これ らによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 HO O B t)とと もに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または HO B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を 行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 蛋白質縮合 反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリ ドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素 類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどの スルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテル類 、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチ ルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度 は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され 、 通常約— 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘 導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの 結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返す ことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が '得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未反応アミ ノ酸をァセチレ化することができる。
原料 ©ァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B oc、 夕一シャリーペンチル ォキシ力ルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベンジルォキ シカルポニル、 C卜 Z、 B r- Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロ ァセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエ二 ルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステルィヒ （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステ ル、 4—ニト口べンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルボニルヒドラジド化、 夕一シャリーブトキシカルボニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボニル 基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また 、 ェ一テル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル 基、 t_ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B zl、 C l2-B zl 、 2—二トロベンジル、 B r-Z、 夕一シャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 Tos、 4 -メトキシ - 2 , 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル、 B um、 B oc、 Trt、 Fmocなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 ， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2 , 4ージニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 HON B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N ーヒドロキシフタルイミド、 HO B t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d-黒あるいは P d -炭素などの 触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの 混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウム による還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C 〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエ ノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフィ ド、 1， 4一ブタンジチオール、 1 , 2—エタンジチオールなどのようなカチォ ン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用 いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 ト リブトフアンのインド一ル保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 _ エタンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保 護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によ つても除去される。 '
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端ァ ミノ酸の《—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド (蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端の α—ァミノ 基の保護基のみを除いた蛋白質と C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去し た蛋白質とを製造し、 この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護蛋白質を 精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗蛋白質を得るこ とができる。 この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を 凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の α—カル ポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 蛋白質の アミド体と同様にして、 所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
本発明の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、 自体公知のペプチドの合成法 に従って、 あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによつ て製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液 相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の蛋白質を構成し得る部分 ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場 合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。 公知 の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が 挙げられる。 '
®M. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t K ペプチド シンセシス （P印 t i de Synth es is) , Intersc ience Publ i shers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザペプチド（The Pept i de)， Academi c Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (19 77年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で 得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のレセプター蛋白質をコードするポリヌクレオチドとしては、 上記した 本発明のレセプター蛋白質をコードする塩基配列 （D NAまたは RNA、 好まし くは D NA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該ポリヌク レオチドとしては、 本発明のレセプター蛋白質をコードする D NA、 mR NA等 の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリッドでもよい。 一 本鎖の場合は、 センス鎖 （すなわち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （ すなわち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて、 例えば、 公知の実験医学増刊 「新 PCRとその応用」 15(7)、 1997記載の方法またはそれ に準じた方法により、 本発明のレセプター蛋白質の mRN Aを定量することがで きる。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノ ム DNAライブラリー、 上記した細胞 ·組織由来の cDNA、 上記した細胞 ·組 織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に 使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞 ·組織より totalRNAまた は mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT-P C R法と略称する） によって増幅することもで さる。
具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAとしては、 例えば 、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で 表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基 配列を有し、 本発明のレセプ夕一蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 リガンド結 合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプター蛋白質をコードする D NAであれば何れのものでもよい。 配列番号： 2で表わされる塩基配列において 第 46番目、 第 478番目および第 915番目の Rは Aまたは Gを示す。
配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては具体的には配列 番号： 7、 8、 9、 10、 11、 12または 13で表わされる塩基配列を含有す る DN Aが挙げられる。
配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を 有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられ、 より具体的には配列番号： 7 、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2または 1 3で表わされる塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー 'クローニング （Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al .， Cold Spr ing Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なう ことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に 記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン トな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °C の場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕 —蛋白質をコードする D N Aとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含 有する D N Aなどが用いられる。
また、 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質を コードする D NAとしては、 配列番号： 7で表わされる塩基配列を含有する D N A、 配列番号： 8で表わされる塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質をコード する D NAとしては、 配列番号： 1 1で表わされる塩基配列を含有する D NA、 配列番号： 1 2で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプター蛋,白質をコード する D NAとしては、 配列審号： 9で表わされる塩基配列を含有する D NA、 配 列番号： 1 0で表わされる塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。
配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質をコード する D NAとしては、 配列番号： 1 3で表わされる塩基配列を含有する D NAな どが用いられる。 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NAの塩基配列の一部、 または該 D N Aと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記の本 発明の部分べプチドをコードする D N Aを包含するだけではなく、 R N Aをも包 含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質遺伝子の複製または発現を 阻害することのできるアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） を、 クロ一ンィ匕 した、 あるいは決定された G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする D NA の塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド （核酸 · ) は、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の R NAとハイブリダィズするこ とができ、 該 R NAの合成または機能を阻害することができるか、 あるいば G蛋 白質共役型レセプ夕一蛋白質関連 R NAとの相互作用を介して G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 G蛋白質共役型レ セプター蛋白質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 およ び G蛋白質共役型レセプター蛋白質関連 R NAと特異的にハイブリダィズするこ とができるポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で G蛋白質共役型レセプ夕 一蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療ま たは診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを 意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「 対応する」 とは、 ヌクレオチド (核酸） の配列またはその相補体から誘導される 指令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6—ベースペア 'リピー ト、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳開始コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3， 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 G蛋白質共役型レセ プター蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 は、 対象物とハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、 「 アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチドは 、 2—デォキシー D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 D— リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩 基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌク レオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸および合成 配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （伹 し、 該ポリマ一は D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングや塩基 の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含 する） などが挙げられる。 それ らは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D N A： R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （ま たは非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例え ば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化された もの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオ チド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホス ホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を 有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一卜、 ホスホロジチォ エートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ'インヒ ビタ一、 トキ.シン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例 えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インタ一カレン ト化合物 （例えば、 ァクリジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 (例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有する もの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 ァ ノマ一型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチ ド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした 修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよ びピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌ クレオチドおよび絛飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。 ' 本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 ある いは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例として は核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミド やオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定 されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和 性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性 をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al .，
Pharm Tech Japan, Vol . 8， pp. 247, 1992 ; Vol . 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Cro oke et al . ed.， Ant i sense Research and Appl icat i ons, CRC Press, 1993 な どに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチォン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特 異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌ クレア一ゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用 の基としては、 ポリエチレングリコ一ル、 テトラエチレンダリコールなどのダリ コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それ に限定されるものではない。 ' アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の生体内や生体外 の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞 に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 上記した本発明の部分べ プチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ い。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 上記した細胞'組織由来 の cDNA、 上記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのい ずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 ブラ スミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記し 細 胞'組織より mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT- P CR法と略称する） によって増幅す ることもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 （ 1) 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 または （2) 配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイストリンジェン 卜な条件下でハィブリダイズする塩基配列を有し、 本発明のレセプター蛋白質と 実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有 するレセプ夕一蛋白質をコードする DNAの部分塩基配列を有する D N Aなどが 用いられる。
より具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば 、 （1) 配列番号： 7、 8、 9、 10、 11、 12または 13で表わされる塩基 配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 または （2) 配列番号： 7 、 8、 9、 10、 11、 12または 13で表わされる塩基配列とハイストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明のレセプター蛋白 質と実質的に同質の活性を有するレセプ夕一蛋白質をコードする DNAの部分塩 基配列を有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2で表わされる塩基配列ハイブリダィズできる DNAとしては、 例 えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約.80% 以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有 する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
また、 配列番号： 7、 8、 9、 10、 11、 12または 13で表わされる塩基 配列ハイプリダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 7、 8、 9、 1 0、 11、 12または 13で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同 性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のレセプタ —蛋白質と略記する場合がある） を完全にコ一ドする DNAのクローニングの手 段としては、 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分塩基配列を有する合成 DNAブラ イマ一を用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込ん だ DN Aを本発明のレセプター蛋白質の一部あるいは全領域をコ一ドする DN A 断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼ一シヨンによ つて選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキ ユラ一 ·クロ一ニンク (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法 に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の置換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutan™— super Express Km (宝酒造 （株） ) 、 Mutan™-K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA— LA PCR法、 gapped duplex法、 Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方 法に従って行なうことができる。
クローン化されたレセプ夕一蛋白質をコ一ドする DNAは目的によりそのまま 、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付カ卩したりして使用する ことができる。 該 DNAはその 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有 し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを 有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 D N Aアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のレセプ 夕一蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより 製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pCR4、 pCR2. 1、 pBR322、 pBR325、 pUC 12、 pUC 13) 、 枯草菌由来のプラス ミド （例、 pUB 110、 pTP 5、 pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSH19、 p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイ ルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρ A 1 - 1 1、 pXTl、 pRc/CMV、 pRc/RSV、 p cDNA I/Ne oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRCKプロモ一夕一、 SV40プロモ一夕一、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HS V-TKプロモ一夕一などが挙げられる これらのうち、 CMVプロモータ一、 SR プロモーターなどを用いるのが好 ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 1 a cプ 口モーター、 r e cAプロモータ一、 APLプロモーター、 l ppプロモータ一 などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモータ一、 SP02プ 口モーター、 p e nPプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH〇5プ 口モーター、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモータ一、 ADHプロモーターな どが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一カー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne ο"·と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 CHO (dh f r— ) 細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マ一カーとして 使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプタ一蛋白 質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA *シグ ナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ 一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母 である場合は、 MFo! ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動 物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 ひ一インターフェロン · シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DN Aを含 有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia coli
) K 12 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォ ブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. US A) , 60巻， 160 (1968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ ·リ サーチ， （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)〕 ， J A221 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー■バイオロジー （Journal of Molecular Bio logy) , 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャ一ナル ·ォブ ·モレ キュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネティ ックス （Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕 ， DH5 a (Inoue, Η. , Noj im a, H. and Okayama, H. , Gene, 96, 23-28 (1990) ] , DH10B 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 87巻， 4645— 4649 (1 990)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis ) M I 114 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207— 21 〔ジャーナ ル ·ォブ ·バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 (1 984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cere visiae) AH22, AH22R -， NA87 - 11 A, DKD— 5D、 20 B- 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1913, NCYC 2036, ピキア パストリス （Pichia pastor is) などが 用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra b rassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） な どが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン 'ヴィポ (In Vivo) ，13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) , 315卷， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Vero, チャイニーズハムス ター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r") 細胞と略記） 、 マウス L細 胞， マウス At T— 20、 マウスミエ口一マ細胞、 ラット GH3、 ヒト FL細胞 などが用いられる。
ェシ: iリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ •ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2110 ( 1972)やジーン （Gen e) , 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネラ ノレ ·ジエネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168巻， 111 ( 1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ ·イン ·ェンザィモ口ジー （Me t h ods in Enzymology) , 194巻， 182— 187 (1991) 、 プロシージン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ュ一エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978 ) などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 パイオノテクノロジー （Bi o/Technology) ,6， 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことができ る。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロト コール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジー （Virology ) ， 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする DNAを含有 する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナル'ォブ ·ェクスペリメンッ 'イン ·モレキュラー ·ジエネティックス (Journal of Experiments in Molecu lar Genetics) ， 431—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため に、 例えば、 3 j8—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる 宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43 °Cで約 3〜 24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー (Burkholder) 最小培地 CBostian, K. L. ら、 「プロシ一ジングズ · ォブ ·ザ .ナショナル ·アカデミー .ォブ .サイェンシィズ ·ォブ .ザ ·ユーェ スェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 「プロシージング ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ —エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻， 5330 (1984 ) 〕 が挙げられる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常 約 20 °C〜 35 °Cで約 24〜 72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace's Insect Medium (Grace, T. ，ネィチヤ一 (Nature) , 195,788(1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の ρΗは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122巻， 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 8巻， 396 (1959)3 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン - メティカル 'アソシエーション (The Journal of the American Medical Associ at ion) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング ·ォブ · ザ'ソサイエティ 'フォー ·ザ ·バイオロジカル 'メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 (1950)〕 などが 用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 Q°C〜40°C で約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のレセプ夕一蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記 の方法により行なうことができる。
本発明のレセプタ一蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりレセプター蛋白質の粗抽出液を得る方 など が適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にレセ プ夕ー蛋白質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体ぁ るいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるレセプター蛋 白質の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフ ィ一などの特異的新和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一など の疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方 法などが用いられる。
かくして得られるレセプ夕一蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の 方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得ら れた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するレセプター蛋白質を、 精製前または精製後に適当な 蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 蛋白.修飾酵素としては、 例えば、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコ シダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のレセプター蛋白質またはその塩の活性は、 標識した リガンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどに より測定することができる。 '
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであって もよい。
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のレセプター蛋白質等と略記する場合がある） に対する抗体は、 本発明のレ セプター蛋白質等を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従 つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕 ^
( a ) モノクロナ一ル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプター蛋白質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能 な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体 産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバ ントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行 なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが好 ましく用いられる。 .
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプター蛋白質等と 抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより 行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミルスタイン の方法 〔ネイチヤー （Nature), 256卷、 495頁 （1975年） 〕 に従い実 施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （ PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられ る。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0などが挙げら れるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間ィンキュベ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノク口一ナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 レセプター蛋白質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸 着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイブリド一マ培養上清を添加し、 次 に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられ る細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グ Πプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を 添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質等を加え、 固相に結 合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培 地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPM 1 1640培地、 1〜 10 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （ 株） ） またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株 ) ) などを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40t：、 好ましくは約 37°Cである。 培養 間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間であ る。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上 清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナ一ル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリク口一ナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にし たがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （レセプター蛋白質等の抗原 ) とキャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法 と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプター蛋白質等 に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造でぎる 哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合体 に関し、 キャリア一蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロプリン、 キ一ホール · リンぺット ·へモシァニン等を重量比でハ プテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方 法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイン卜アジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩、 その部分ペプチドまたはその塩、 お よび該レセプタ一蛋白質またはその部分べプチドをコードする D N Aは、 （ 1 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンド （ァゴ二スト） の決 定、 （2 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患 の予防および Zまたは治療剤、 （3 ) 遺伝子診断剤、 （4 ) 本発明のレセプ夕一 蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方 法、 （5 ) 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ せる化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤、 ( 6 ) 本発明の G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドの定量法、 （7 ) 本発明の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二 スト、 アンタゴニストなど） のスクリーニング方法、 （8 ) 本発明の G蛋白質共 役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 ,アンタゴニスト） を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、 （9 ) 本発 明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量、 （1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化さ せる化合物のスクリーニング方法、 ( 1 1 ) 細胞膜における本発明のレセプター 蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予 防および/または治療剤、 （1 2 ) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体による中和、 （1 3 ) 本発明の G蛋白質共役 型レセプター蛋白質をコードする D NAを有する非ヒト動物の作製などに用いる ことができる。
特に、 本発明の組換え型 G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用いたレ セプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な G蛋 白質共役型レセプ夕一に対するリガンドの結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴ 二スト、 アン夕ゴニストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ二スト またはアンタゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができ る。
本発明のレセプター蛋白質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発明 のレセプター蛋白質等と略記する場合がある） 、 本発明のレセプ夕一蛋白質また はその部分ペプチドをコードする DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合 がある） および本発明のレセプター蛋白質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体 と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明する。
(1) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド （ァゴニス ト） の決定
本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしく はその塩は、 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二 スト） を探索し、 または決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本発明 の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。
試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシ ン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 Ρ ACAP (例、 PACAP27, PACAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 AC TH、 GRP、 PTH、 VI P (パソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミ リン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン 、 アデノシン、 アドレナリン、 ケモカインス一パーファミリ一 （例、 I L— 8， GROa, GROj3, GROr, NAP- 2, ENA— 78， GCP— 2， PF 4, I P— 10, M i g, PBSF/SDF— 1などの CXCケモカインサブフ アミリー； MCAFZMCP— 1， MCP- 2, MCP— 3， MCP - 4， e o t a x i n, RANTES, MI P— l a、 MI P_l i3, HCC— l, M I P - 3 α/LARC, M I P- 3 β/ELC, 1— 309, TARC, MI PF— 1, MI PF-2/e o t ax i n-2, MDC, DC-CK 1/PARC, S LCなどの CCケモカインサブファミリ一； 1 ympho t a c t i nなどの C ケモカインサブファミリ一； f r a c t a 1 k i n eなどの CX 3 Cケモカイン サブファミリ一等） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニュー 口テンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニン、 リゾホス ファチジン酸 （LPA) 、 スフインゴシン 1一リン酸など） の他に、 例えば、 ヒ トまたは哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培 養上清などを本発明のレセプ夕一蛋白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しな がら分画し、 最終的に単一のリガンドを得ることができる。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明のレセプター蛋白質もしく はその部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、 または組換え型レセプター蛋白 質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプター結合アツセィ系を用いること によって、 本発明のレセプ夕一蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 CAM P生成、 細 胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質の リン酸化、 c一 f o s活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活 性） を有する化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化 合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である。
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプター蛋白質またはその 部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該レセプ夕ー蛋白質 または該部分べプチドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性などを測定 することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識した試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩または本 発明の部分べプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識した試験ィ匕 合物の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分べプチドもしくはその塩に対する 結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対 するリガンドの決定方法、
②標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞または該 細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞または該 膜画分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質ま たはその塩に対するリガンドの決定方法、
③標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NAを含 有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現したレセプター蛋白質 に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該レセプ夕一蛋白質またはそ の塩に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質に対 するリガンドの決定方法、
④試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接触させた場合 における、 レセプタ一蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離 、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプタ一蛋白質またはその塩に対するリ ガンドの決定方法、 および
⑤試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NAを含有する形 質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプタ一蛋白質に接触さ せた楊合における、 レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキド ン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞 内 c GM P生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリ ン酸化、 c一 : f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活 性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に 対するリガンドの決定方法を提供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明のレセプ夕一蛋白質に 結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。 まず、 リガンド決定方法に用いるレセプ夕一蛋白質としては、 上記した本発明 のレセプ夕一蛋白質または本発明の部分ペプチドを含有するものであれば何れの ものであってもよいが、 動物細胞を用いて大量発現させたレセプ夕一蛋白質が適 している。
本発明のレセプ夕一蛋白質を製造するには、 上記の発現方法が用いられるが、 該レセプ夕一蛋白質をコードする D NAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現するこ とにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分を ά—ドする D N A断片 には、 通常、 相補 D N Aが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではな い。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用いてもよい。 本発明のレセプター蛋白 質をコードする D NA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させ るためには、 該 D N A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角 体病ウィルス （nuclear polyhedros is virus； N P V) のポリヘドリンプロモー ター、 S V 4 0由来のプロモー夕一、 レトロウイルスのプロモーター、 メタロチ ォネインプロモーター、 ヒトヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィル スプロモーター、 S R aプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現 したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。 例え ば、 文献 CNambi, P. ら、 ザ■ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル 'ケミストリ 一 (J. Biol. Chei. ) ， 267巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行 うことができる。
したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有するものとしては、 それ自体公知 の方法に従って精製したレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩であってもよいし、 該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分 を用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細 胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化しても よい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞としては、 本発明のレセプター蛋白 質を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter—Elvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダーゃポリトロン (Kinematica社製） による破砕、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などが挙げられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （150 00 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を 膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプター蛋白質と細胞由来のリン脂 質ゃ膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプ夕一蛋白質を含有する細胞やその膜画分中のレセプター蛋白質の量は 、 1細胞当たり 103〜10s分子であるのが好ましく、 105〜107分子である のが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比 活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく 、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の① 〜③の方法を実施するためには、 適当なレセプター蛋白質画分と、 標識した試験 化合物が必要である。
レセプター蛋白質画分としては、 天然型のレセプター蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここで、 同等 の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識しこ試験化合物としては、 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで 標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グ ルタミン、 セロ卜ニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン 、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP (例、 PACAP 27, PACA Ρ 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマ トス夕チン、. GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソァク ティブ インテスティナル アンド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕 チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニ ンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プ ロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ケモカインス ーパ一ファミリ一 （例、 I L—8， GROa, GRO/S, GROァ， NAP- 2 , ΕΝΑ- 78, GCP-2, PF4, I P— 10， Μ i g， PBS F/SDF 一 1などの CXCケモカインサブファミリー； MCAFZMCP— 1, MCP— 2, MCP- 3, MCP-4, e o t ax i n, RANTES, MI P— 1 、 M I P- 1 j3 , HCC— 1， M I P— 3 Q!/LARC、 M I P- 3 β/ELC, 1 - 309, TARC, MI PF— 1, M I PF- 2/e o t a x i n- 2, M DC, DC-CK 1/PARC, S L Cなどの C Cケモカインサブファミリ一； 1 ymp o t a c t i nなどの Cケモカインサブファミリ一； f r a c t a l k i n eなどの CX3 Cケモカインサブファミリ一等） 、 エンドセリン、 ェンテ 口ガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポ リぺプ夕イド、 ガラニン、 リゾホスファチジン酸 （LPA) 、 スフインゴシン 1 一リン酸などが好適である。
具体的には、 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定 方法を行なうには、 まず本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞または細胞の 膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプタ一標品を 調製する。 バッファ一には、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バ ッファー、 卜リス一塩酸バッファーなどのリガンドとレセプ夕一蛋白質との結合 を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減さ せる目的で、 CHAPS、 Twe e n— 80™ (花王—アトラス社） 、 ジギトニ ン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼラチンなどの 各種蛋白質をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによるリ セプターやリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 ( ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することも できる。 0.0 lm 1〜10mlの該レセプター溶液に、 一定量 （5000 c pm 〜500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔1251〕 、 〔"C〕 、 〔35S〕 などで標識し た試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （N S B) を知るために大過剰の未 標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0 °C〜5 0 °C、 望 ましくは約 4 °C〜3 7でで、 約 2 0分〜 2 4時間、 望ましくは約 3 0分〜 3時間 行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファ一で洗浄した後 、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ一シヨンカウンタ一あるい はァーカウンターで計測する。 全結合量 （B) から非特異的結合量 （N S B ) を 引いたカウント （B— N S B ) が 0 c p mを越える試験化合物を本発明のレセプ 夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二スト） として選択することが できる。
本発明のレセプタ一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の④
〜⑤の方法を実施するためには、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c A M P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細 胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 P Hの低下などを促進する活性ま たは抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定す ることができる。 具体的には、 まず、 レセプ夕一蛋白質を含有する細胞をマルチ ゥエルプレート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮 な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物な どを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収 して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標と する物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によ つて検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なつ てもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなど で細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出 することができる。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩、 本発明の部分べプチドもしくはその 塩、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞、 または本発明のレセプター蛋白 質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。 本発明のリガンド決定用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1. リガンド決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 のフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプター蛋白質標品 .
本発明のレセプタ一蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個/穴で継代し、 37°C、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養したもの
③標識試験化合物
市販の 〔 〕 、 C1251 ) 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 または 適当な方法で標識化したもの
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 Mに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチルホル ムアミド、 DMS〇、 メタノール等に溶解する。
④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜1000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプター蛋白質発現 CH 〇細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を 各穴に加える。
②標識試験化合物を 5^ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験化合物を 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識試験化合物を 0.2 N Na〇H— l%SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定する。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドとし ては、 例えば、 脳、 下垂体、 心齓 塍臓、 脾臓、 精巣などに特異的に存在する物 質などが挙げられ、 具体的には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド 、 コレシストキニン、 グ^/夕ミン、 セロト-ニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP (例、 Ρ ACAP 27, PACAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 ァ ドレノメジュリン、 ソマトスタチン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 P TH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポ リペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニ ン、 CGRP (カルシトニンジーンリレ一ティッドペプチド） 、 ロイコトリェン 、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 ァ ドレナリン、 ケモカインス一パ一ファミリ一 （例、 I L—8， GROa, GRO β, GROァ， NAP- 2, ENA- 78, GCP— 2, PF4, I P— 10， M i g, PB S FZSDF— 1などの CXCケモカインサブファミリー； MCA F/MCP- 1, MCP- 2, MCP— 3， MCP— 4， e o t ax i n, RA NTES, MI P— 1 «、 MI P— 1 /9， HCC— 1, MI P-3 oi/LA C 、 M I P- 3 β/E C, 1— 309， TARC, MI PF— 1， MI PF— 2 /e o t ax i n-2, MDC, DC— CK 1/PARC, SLCなどの CCケ モカインサブファミリー； 1 ymp h o t a c t i nなどの Cケモカインサブフ ァミリ一； f r a c t a 1 k i n eなどの CX 3 Cケモカインサブファミリ一等 ) 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TR H、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニン、 リゾホスファチジン酸 （L PA) 、 スフインゴシン 1 _リン酸などが用いられる。
(2) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の 予防および/または治療剤
上記 （1) の方法において、 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドが明 らかになれば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明のレセプター蛋白質 または②該レセプ夕一蛋白質をコードする DNAを、 本発明のレセプター蛋白質 の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤などの医薬として使用す ることができる。
例えば、 生体内において本発明のレセプ夕一蛋白質が減少しているためにリガ ンドの生理作用が期待できない （該レセプ夕一蛋白質の欠乏症） 患者がいる場合 に、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質を該患者に投与し該レセプ夕ー蛋白質の量を補 充したり、 ② （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NAを該患者に投 与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明のレセプ 夕一蛋白質をコードする D NAを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植 することなどによって、 患者の体内におけるレセプタ一蛋白質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。 すなわち、 本発明のレセプ夕 —蛋白質をコードする D NAは、 安全で低毒性な本発明のレセプ夕一蛋白質の機 能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤として有用である。
本発明のレセプ夕一蛋白質は、 G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質である MA S , ( Cel l 45、 711-719 (1986) , NATURE 335、 437-440 (1988) ) にアミノ酸配列レベル で、 約 2 9 %程度の相同性が認められる新規 7回膜貫通型受容体蛋白質である。 本発明のレセプタ一蛋白質または該レセプタ一蛋白質をコ一ドする D N Aは中 枢疾患 (例えば、 アルツハイマー病、 痴呆、 摂食障害など)、 炎症性疾患 (例えば 、 アレルギー、 喘息、 リュウマチなど）、 循環器疾患 (例えば、 高血圧症、 心肥大 、 狭心症、 動脈硬化症等)、 癌 （例えば、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃 ' 癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌等） 、 代謝性疾患 （例えば、 糖 尿病、 糖尿病合併症、 肥満、 動脈硬化、 痛風、 白内障等） 、 免疫系疾患 （例えば 、 自己免疫性疾患等） 、 消化器系疾患 （例えば、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 胃炎、 逆流性食道炎等） などの予防およぴ/または治療に有用である。
本発明のレセプター蛋白質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手 段に従って製剤化することができる。
一方、 本発明のレセプター蛋白質をコードする D NA (以下、 本発明の D NA と略記する場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D N Aを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノ ウィルスァソシエーテッドウィルスベクタ一などの適当なベクターに挿入した後 、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D NAは、 そのままで、 あ るいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルの ようなカテーテルによって投与できる。 '
例えば、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質または②該レセプター蛋白質をコードす る D NAは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイ クロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許 容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用 できる。 例えば、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質または②該レセプ夕一蛋白質をコ ードする D NAを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル 、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される 単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤におけ る有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コ一ル） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0™、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液として 、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。 また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
本発明のレセプター蛋白質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 kgとして） にお いては、 一日につき約 0. 0：！〜 3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することが できる。 '
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 Okgとして） に おいては、 一日につき約 0. lmg〜； L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Om ' g、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 そ の 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O kgとして） においては、 一 日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より 好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である 。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D NAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば 、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまた は m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハ イブリダィゼーシヨンや PC R— SS CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5 巻， 874〜879頁 （1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスェ一 （Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することができ る。
(4) 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ る化合物のスクリーニング方法
本発明の DNAは、 プローブとして用いることにより、 本発明のレセプター蛋 白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用 いることができる。
すなわち、 本発明は、 例えば、 （i) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器 、 ③臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （ii) 形質転換体等に含まれる 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分べプチドの m R N A量を測定すること による、 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ る化合物のスクリーニング方法を提供する。 .
本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの m R N A量の測定は具体 的には以下のようにして行なう。
(i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット 、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗 痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例えば 、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過し ,た後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓、 心臓、 滕齓 脾 臓、 精巣など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの mR NAは、 例えば、 通常.の方法により細胞等から mR NAを抽出し、 例えば、 TaQManPCRなどの手法を用いることにより定量することができ、 自体公知の手段 によりノザンブロットを行うことにより解析することもできる。
(i i) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分べプチドを発現する形質転 換体を上記の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプター蛋 白質またはその部分ペプチドの m R N Aを同様にして定量、 解析することができ る。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合 物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （ 3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検ィヒ合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質また はその部分ペプチドの mR NA量を定量、 解析することにより行なうことができ
(i i) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましくは 2曰後〜 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはそ の部分ペプチドの mR NA量を定量、 解析することにより行なうことができる。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発明 のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用を有する 化合物であり、 具体的には、 （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分べ プチドの発現量を増加させることにより、 G蛋白質共役型レセプターを介する細 胞剌激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊 離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、 （口） 本発明のレ セプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させることにより、 該細 胞刺激活性を減弱させる化合物である。
このような本発明のレセプタ一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化 させる作用を有する化合物は中枢疾患 (例えば、 アルツハイマー病、 痴呆、 摂食 障害など)、 炎症性疾患 (例えば、 アレルギー、 喘息、 リュウマチなど)、 循環器 疾患 (例えば、 高血圧症、 心肥大、 狭心症、 動脈硬化症等)、 癌 （例えば、 非小細 胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌 等） 、 代謝性疾患 （例えば、 糖尿病、 糖尿病合併症、 肥満、 動脈硬化、 痛風、 白 内障等） 、 免疫系疾患 （例えば、 自己免疫性疾患等） 、 消化器系疾患 （例えば、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 胃炎、 逆流性食道炎等） などの予防および Zまたは治療 に有用である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の 化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等の生理活 性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等の生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤 、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることが できる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば、 癌患者 （6 0 k gと して） においては、 一日につき約 0 . 1〜1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は 、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なる が、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O k として） においては 、 一日につき約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる
( 5 ) 本発明のレセプタ一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ る化合物を含有する各種疾病の予防および Zまた 治療剤
本発明のレセプ夕一蛋白質は上記のとおり、 例えば、 中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えちれる。 したがって、 本発明のレセプ夕 —蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、 本発明のレセ プタ一蛋白質の機能不全に関連する疾患 〔中枢疾患 (例えば、 アルツハイマー病 、 痴呆、 摂食障害など)、 炎症性疾患 (例えば、 アレルギー、 喘息、 リュウマチな ど)、 循環器疾患 (例えば、 高血圧症、 心肥大、 狭心症、 動脈硬化症等)、 癌 （例 えば、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結 腸癌、 直腸癌等） 、 代謝性疾患 （例えば、 糖尿病、 糖尿病合併症、 肥満、 動脈硬 ィ匕、 痛風、 白内障等） 、 免疫系疾患 （例えば、 自己免疫性疾患等） 、 消化器系疾 患 （例えば、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 胃炎、 逆流性食道炎等） など〕 の予防およ び/または治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤にお る有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ う'にするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル 口一スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 プドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩ィ匕ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 , エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0™、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとし て） においては、 一日につき約 0.1〜： L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌症患者 （60 kgとして） においては 、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる
(6) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプター蛋白質等は、 リガンドに対して結合性を有しているので、 生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いることが できる。 すなわち、 被検体を本発明のレセプター蛋白質等と接触させることによ つて被検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば、 以 下の①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いること ができる。
①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 (講談社、 昭和 49年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
( 7 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化 させる化合物 (ァゴニス卜、 アンタゴニストなど） のスクリーニング方法 本発明のレセプタ一蛋白質等を用いるか、 または組換え型レセプ夕一蛋白質等 の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ ー結合アツセィ系を用いることに よって、 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物 (例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物な ど） またはその塩を効率よくスクリ一二ングすることができる。 このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細胞刺激活 性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞 内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変 動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一: f o sの活性化、 P Hの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一 蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆ る、 本発明のレセプター蛋白質に対するアンタゴニスト） 、 （八） リガンドと本 発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるいは (二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を減少さ せる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は、 上記したリガンド決 定方法によってスクリーニングすることが ましい） 。
すなわち、 本発明は、 （i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i) 本発明のレセプター 蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試験化合物と を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明のレセプ タ一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) と （i i) の場合における、 例 えば、 該レセプ夕一蛋白質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測 定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識したリガンドを、 本発明のレセプター蛋白質等に接触させた場合と、 標 識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場 合における、 標識したリガンドの該レセプ夕一蛋白質等に対する結合量を測定し 、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性 を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞または該 細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明 のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合に おける、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比 較することを特徼とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質等に接触させた場合と、 標識した リガンドおよび試験化合物を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養するこ とによって細胞膜上に発現した本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合に おける、 標識したリガンドの該レセプ夕一蛋白質等に対する結合量を測定し、 比 較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
④本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ ター蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明のレセプタ一蛋白質等を含有する 細胞に接触させた場合と、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物およ び試験化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合に おける、 レセプ夕一を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチ ルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下 fよどを促進する活性または抑制する活性など) を測定し 、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性 を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および
⑤本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ ター蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体を 培養することによつて細胞膜上に発現した本発明のレセプター蛋白質等に接触さ せた場合と、 本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物および試験化合物 を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現 した本発明のレセプター蛋白質等に接触させた場合における、 レセプターを介す る細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 ' 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下な どを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とす るリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のレセプター蛋白質等が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプ夕ーァ ゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする場合、 まずラットなどの G 蛋白質共役型レセプター蛋白質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を用いて 候補化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化合物が実際にヒト の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認 する試験 (二次スクリーニング) が必要であった。 細胞、 組織または細胞膜画分 をそのまま用いれば他のレセプ夕一蛋白質も混在するために、 目的とするレセプ タ一蛋白質に対するァゴニストまたはアンタゴニストを実際にスクリーニングす ることは困難であった。
しかしながら、 例えば、 本発明のヒト由来レセプ夕一蛋白質を用いることによ つて、 一次スクリーニングの必要がなくなり、，リガンドと G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングすることができ る。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニストかアン夕ゴニストかを簡 便に評価することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプター蛋白質等とし ては、 上記した本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有するものであれば何れのもの であってもよいが、 本発明のレセプタ一蛋白質等を含有する哺乳動物の臓器の細 胞膜画分が好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なこと から、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現さ せたヒト由来のレセプター蛋白質等などが適している。
本発明のレセプター蛋白質等を製造するには、 上記の方法が用いられるが、 本 発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい 。 目的とする蛋白質部分をコ一ドする D N A断片には相補 D NAが用いられるが 、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを 用いてもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白質をコ一ドする DNA断片を宿主動物細 胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を昆虫を宿主 とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuc lear polyhedros is v i rus； N P V) のポリヘドリンプロモーター、 S V 4 0由来のプロモーター、 レ トロウィルスのプロモー夕一、 メタ口チォネインプロモ一タ一、 ヒトヒートショ ックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモータ一、 S R o!プロモーターな どの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の検査はそれ自 体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi, P. ら、 ザ ·ジャーナ ル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリ一 （J. Biol. Chem. ) ， 267巻， 19555〜19 559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプター蛋白 質等を含有するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製したレセプター 蛋白質等であってもよいし、 該レセプター蛋白質等を含有する細胞を用いてもよ く、 また該レセプ夕一蛋白質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプター蛋白質等を含有す る細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化し てもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞としては、 該レセプ夕一蛋白質等 を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆 虫細胞、 動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Pot ter— Elvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダ一やポリトロン (KineraaUca社製） のよる破碎、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用い れる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を 膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプター蛋白質等と細胞由来のリン 脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプ夕ー蛋白質等を含有する細胞や膜画分中のレセプ夕一蛋白質の量は、 1細胞当たり 1 03〜1 08分子であるのが好ましく、 1 05〜1 07分子であるの が好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活 性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物をスク リーニングする上記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当なレセプター蛋 白質画分と、 標識したリガンドが必要である。
レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一蛋白質画分などが望ましい。 ここで 、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標 識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる 化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明のレセプター蛋白質等を含有 する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁する ことによりレセプ夕一蛋白質標品を調製する。 バッファーには、 p H 4〜1 0 ( 望ましくは p H 6〜8 ) のリン酸バッファー、 トリスー塩酸バッファーなどのリ ガンドとレセプタ一蛋白質との結合を阻害しないバッファ一であればいずれでも よい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 C HA P S、 Tween- 8 0™ ( 花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレ一トなどの界面活性剤をパッフ ァーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによるレセプ夕一やリガンド の分解を抑える目的で P M S F、 ロイぺプチン、 E—6 4 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0 . 0 1 m 1 ~ 1 0 m 1の該レセプタ一溶液に、 一定量 （5 0 0 0 c p m〜5 0 0 0 0 0 c p m) の標識したリガンドを添加し、 同時に 1 0—4Μ〜1 Ο ^Μの試験化合物を 共存させる。 非特異的結合量 （N S B) を知るために大過剰の未標識のリガンド を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0 °Cから 5 0 、 望ましくは約 4 °C から 3 7 °Cで、 約 2 0分から 2 4時間、 望ましくは約 3 0分から 3時間行う。 反 応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファ一で洗浄した後、 ガラス繊 維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターまたはァ—カウン ターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント（B。） から非特異的結合量 (N S B) を引いたカウント （B。一 N S B) を 1 0 0 %とした時、 特異的結合 量 （B— N S B ) が、 例えば、 5 0 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変ィヒさせる化合物スクリ 一二ングする上記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 レセプ夕一蛋白 質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 C a遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生成、'イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 : f o sの活性化、 p Hの 低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測 定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞をマルチゥェ ルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もつて新鮮な 培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物など を添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収し て、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とす る物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によつ て検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なって もよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで 細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す ることができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプ夕一蛋白 質を発現した細胞が必要である。 本発明のレセプター蛋白質等を発現した細胞と しては、 天然型の本発明のレセプター蛋白質等を有する細胞株、 上記の組換え型 レセプター蛋白質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性化合物、 合成ィ匕 合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物且織抽出液などが用いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプター蛋白質等、 本発明のレ セプ夕一蛋白質等を含有する細胞、 または本発明のレセプター蛋白質等を含有す る細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 xmのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプター標品
本発明のレセプター蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個/六で継代し、 37°C、 5%C〇2、 95%a i rで 2日間培養したもの ③標識リガンド
市販の 〔 〕 、 〔1251〕 、 〔l4C〕 、 〔35s〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20 にて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 Mに希釈する。
④リガンド標準液
リガンドを 0.1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む P B Sで 1 mM となるように溶解し、 一 20°Cで保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレー卜にて培養した本発明のレセプター蛋白質発現 C H 〇細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を 各穴に加える。
② 10一3〜： L 0 _IDMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化 物 の代わりに 10—3Μのリガンドを 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0.2 N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレ 一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB= [ (B - NSB) / (B。一 NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B。 ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変 化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ 夕一を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシト一ルリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆ る、 本発明のレセプター蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を 有しない化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するアンタゴニス卜 ) 、 （ハ） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を増 強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕ー蛋 白質との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の 化合物であってもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するァゴニストは、 本発明のレセプター蛋白 質等に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該リガ ンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するアンタゴニストは、 本発明のレセプ夕一 蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リ ガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を増強する化 合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を増強 するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を減少させる 化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を減 少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って 実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する 医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無 菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 0 k gとし て） においては、 一日につき約 0 . 1〜1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O k gとして） においては、 一日につき約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 よ り好ましくは約 0 . 1〜1 O m g程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。 ( 8 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白食とリガンドとの結合性を変化 させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニスト） を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤
本発明のレセプター蛋白質は上記のとおり、 例えば中枢機能、 循環機能、 消化 機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本 発明のレセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト 、 アン夕ゴニスト） や本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドは、 本発明の レセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤として 用いることができる。
該化合物やリガンドを本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の 予防および Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化する ことができる。
例えば、 該化合物やリガンドは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤 、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくは それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤 の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の 担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造する ことができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が 得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合に'は、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビト一ル、 D—マンニトール、 塩ィ匕ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコ一ル （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80™、 HCO-50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 さらに、 上記予防'治療剤は適当な薬剤と組み合わせて例えば本発明のレセプ ター蛋白質が高発現している臓器や組織を特異的なターゲットとした DDS製剤 として使用することもできる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとし て） においては、 一日につき約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
( 9 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の定 本発明の抗体は、 本発明のレセプター蛋白質等を特異的に認識することができ るので、 被検液中の本発明のレセプター蛋白質等の定量、 特にサンドイッチ免疫 測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、 ( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化レセプター蛋白質等とを競合的に 反応させ、 該抗体に結合した標識化レセプター蛋白質等の割合を測定することを 特徴とする被検液中の本発明のレセプ夕一蛋白質等の定量法、
( i i ) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を 測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプター蛋白質等の定量法を提 供する。
上記 （i i) においては、 一方の抗体が本発明のレセプ夕一蛋白質等の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のレセプター蛋白質等の C端部に反応する 抗体であることが好ましい。
本発明のレセプタ一蛋白質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のレセプ夕一蛋白質等の 測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目 的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明のレセプター蛋白質等に対 する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗 原量 （例えば、 レセプター蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原 複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む 標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法 を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィムノメトリック法および サンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後に記載するサン ドイツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔125 1〕 、 〔131 1〕 、 〔¾〕 、 〔14C〕 などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 3—ガラクトシダ一ゼ、 ]3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パ一ォキシダ一ゼ、 リンゴ酸 脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例え ば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられ る。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用い ることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方 法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂 、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ （2次反応） た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液 中の本発明のレセプ夕一蛋白質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なつ てもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるレセプ夕一蛋白質等の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノ.クロ一ナル抗体はレセプ夕一蛋白質等 の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応およ び 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 レセプ 夕一蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノク口一ナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることができる 。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原と（F) と抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し （ BZF分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する 。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B/F分離をポリエチレンダリ コール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体とし て固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプ夕一蛋白質または その塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については 、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノ アツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアッセィ 」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭 和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソッズ 'イン 'ェンジモノジー （Methods in ENZYMOLOGY) 」 Vol . 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol . 73 (Immunochemica 1 Techniques (Part B))、 同書 Vol . 74 (Immunochemical Techniques (Part 0 ) 、 同書 Vol . 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) ) 、 同書 Vol . 92 (Immunochemical Techniques (Part E :Monoclonal Ant ibodies a nd General Immunoassay Methods)) > 同書 Vol . 121 (Immunochemical Techniqu es (Part I： Hybridoma Technology and Monoc lonal Ant ibodies) ) (以上、 ァカデ ミックプレス社発行)など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプ夕一蛋白 質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプ夕一蛋白質またそ の塩を定量することによって、 本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する 各種疾患の診断をすることができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプ 夕一蛋白質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発明の レセプ夕一蛋白質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分 画中の本発明のレセプター蛋白質等の検出、 被検細胞内における本発明のレセプ ター蛋白質の挙動の分析などのために使用することができる。
( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプタ一蛋白質またはその部分ペプチドの 量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明のレセプタ 一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニングに用 いることができる。 '
すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もし くは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明の レセプター蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜におけ る本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物の スクリーニング方法、
(Π) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分べプチドを発現する形質転 換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセ プター蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜における本 発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスク リーニング方法、
(i i i) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織も しくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該 受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該蛋白質を確認 することによる、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ぺプ チドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
(iv) 本発明のレセプタ一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該受容体 蛋白質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該蛋白質を確認するこ とによる、 細胞膜における本発明のレセプタ一蛋白質またはその部分べプチドの 量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの定 量は具体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒ卜哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラッ卜、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット 、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癍マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗 痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例えば 、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過し た後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓、 脾臓、 精巣など ) 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織ま たは細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝 液、 へぺス緩衝液.など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壌し、 界面活 性剤 （例えば、 トリトン X I 0 0™、 ツイ一ン 2 0™など） などを用い、 さらに 遠心分離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Pot ter— Elvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン (Kinemat ica社製） のよる破砕、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などが挙げられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分) 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を 膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプター蛋白質等と細胞由来のリン 脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドは、 例えば、 本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、 ウエスタンプロット解 析などにより定量することができる。
かかるサンドィツチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、 ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。 '
( i i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体を上記の方法に従い作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白 質またはその部分べプチドを定量することができる。
細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化 させる化合物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （ 3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 ( 3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質また はその部分べプチドの量を定量することにより行なうことができ、
(ϋ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合きせ、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましくは 2日後〜 3日後） 、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分べ プチドの量を定量することにより行なうことができる。 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの確 認は具体的には以下のようにして行なう。
(i i i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラッ ト、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例え ば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過 した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓、 心臓、 塍臓、 脾臓、 精巣など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られ た臓器、 組織または細胞等を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を用いて 免疫染色を行う。 細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することに より、 細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞 膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を確認するこ とができる。
(iv) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞膜 における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる作 用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜における本発明のレセプ夕 —蛋白質またはその部分ペプチドの量を増加させることにより、 G蛋白質共役型 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシト ールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性 化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合 物、 （口） 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの 量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の 化合物であってもよい。 該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等の生理活 性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等の生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーエング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプタ一蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤 、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることが できる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60kgとし て） においては、 一日につき約 0.1〜： L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 6 Okg当たりに換算した量を投与することができる。
(11) 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの 量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤
本発明のレセプ夕一蛋白質は上記のとおり、 例えば、 中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 したがって、 細胞膜における本 発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物は、 本 発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤 として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および /または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコ一ル、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一ト 8 0™、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 保存剤 （例えば、.ベンジルアルコール、 フヱノールなど） 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとし て） においては、 一日につき約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜 10 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。
(12) 本発明のレセプ夕一蛋白質、，その部分ペプチドまたはそれらの塩に対 する抗体による中和
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体の、 それらレセプター蛋白質などに対する中和活性とは、 すなわち、 該レセプ タ一蛋白質の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。 従って 、 該抗体が中和活性を有する場合は、 該レセプ夕一蛋白質の関与するシグナル伝 達、 例えば、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸 遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸 化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性な ど） を不活性ィヒすることができる。 したがって、 該レセプター蛋白質の過剰発現 などに起因する疾患の予防および Zまたは治療に用いることができる。
(13) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする DNAを有す る動物の作製 本発明の D NAを用いて、 本発明のレセプター蛋白質等を発現するトランスジ エニック動物を作製することができる。 動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下 、 動物と略記する場合がある） が挙げられるが、 特に、 マウス、 ゥサギなどが好 適である
本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞で 発現させうるプロモー夕一の下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いる のが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D N Aを転移させる場合 、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D NAを動物細胞で発現させうる各種 プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥサギ受精卵 へマイクロインジェクションすることによって本発明のレセプター蛋白質等を高 産生する D NA転移動物を作出できる。 このプロモーターとしては、 例えば、 ゥ ィルス由来プロモー夕一、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモーター も使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺伝子プロモーターや ェノラーゼ遺伝子プロモータ一などが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D NAの転移は、 対象動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明のレセプタ一蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫が全て その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプ夕一蛋白質等を有することを 意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明のレセプタ一蛋白質等を有する。
本発明の D NA転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認し て、 該 D N A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さ らに、 目的 D NAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の D N Aが転移された動物は、 本発明のレセプター蛋白質等が高発現さ せられているので、 本発明のレセプター蛋白質等に対するァゴニストまたはアン タゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。 本発明の DNA転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもで きる。 例えば、 本発明の DNA転移マウスの組織中の DNAもしくは RNAを直 接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタ一蛋白質が存 在する組織を分析することにより、 本発明のレセプ夕一蛋白質等について分析す ることができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する組織の細胞を標準組織培 養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一 般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 また、 その細胞 を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能 である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明のレセプ夕一蛋白質等 を単離精製することも可能である。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号ある いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に簡し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。
DNA デォキシリポ核酸
cDNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
dATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP '三リン酸
dCTP '三リン酸
ATP '三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 バリン
Leu
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
Ph e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリブトファン
P r o
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
* 終止コドンに対応する
Me メチル基 '
E t ェチル基
Bu ブチル基
Ph フエニル基 。
TC チアゾリジン一 4 ( ) —カルボキサミド基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T o s P-トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
Cl2Bzl 2, 6—ジクロロべンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1 -Z 2—クロ口べンジルォキシカル ニル
B r -Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t—ブトキシカルポニル
D.NP ジニトロフエノール
T r t 卜リチル
Bum t一ブトキシメチル
Fmo c N— 9一フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t
HOOB t 3, 4ージヒドロー 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2， 3—べンゾトリアジン '
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2， 3 -ジカルポキシイミド 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
配列番号： 1
本発明のヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 hTGR 11のァミノ 酸配列を示す。 第 16番目および第 160番目の Xaaはそれぞれ Serまたは Glyを 示す。
配列番号： 2
配列番号： 1で示されるヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質 hTG R 11をコードする cDNAの塩基配列を示す。 第 46番目、 第 478番目およ び第 915番目の Rは Aまたは Gを示す。
配列番号： 3 本発明のヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 hTGR 11のァミノ 酸配列を示す。 第 16番目のアミノ酸残基は Ser、 第 160番目のアミノ酸残基 は Serである。
配列番号： 4
本発明のヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 hTGR 11のァミノ 酸配列を示す。 第 16番目のアミノ酸残基は GIy、 第 160番目のアミノ酸残基 は Glyである。
配列番号： 5
本発明のヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 hTGR 11のァミノ 酸配列を示す。 第 16番目のアミノ酸残基は Ser、 第 160番目のアミノ酸残基 は Glyである。
配列番号： 6
本発明のヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 hTGR 11のァミノ 酸配列を示す。 第 16番目のアミノ酸残基は Gly、 第 160番目のアミノ酸残基 は Serである。 '
配列番号： 7
配列番号： 3で示されるヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h T G Rl 1をコードする cDNAの塩基配列を示す。 第 46番目の塩基は A、 第 47 8番目の塩基は A、 第 915番目の塩基は Gである。
配列番号： 8
配列番号： 3で示されるヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 h T G R 11をコ一ドする cDNAの塩基配列を示す。 第 46番目の塩基は A、 第 47 8番目の塩基は A、 第 915番目の塩基は Aである。
配列番号： 9
配列番号： 5で示されるヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 hTG R 11をコ一ドする cDNAの塩基配列を示す。 第 46番目の塩基は A、 第 47 8番目の塩基は G、 第 915番目の塩基は Gである。
配列番号： 10
配列番号： 5で示されるヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 h T G R 11をコードする cDNAの塩基配列を示す。 第 46番目の塩基は A、 第 47 8番目の塩基は G、 第 915番目の塩基は Aである。
配列番号： 11
配列番号： 4で示されるヒ卜由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 hTG R 11をコードする cDNAの塩基配列を示す。 第 46番目の塩基は G、 第 47 8番目の塩基は G、 第 915番目の塩基は Gである。
配列番号： 12
配列番号： 4で示されるヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 hTG R 11をコードする cDNAの塩基配列を示す。 第 46番目の塩基は G、 第 47 8番目の塩基は G、 第 915番目の塩基は Aである。 ' 配列番号： 13
配列番号： 6で示されるヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 h T G R 11をコードする cDNAの塩基配列を示す。 第 46番目の塩基は G、 第 47 8番目の塩基は A、 第 915番目の塩基は Aである。
配列番号： 14
以下の実施例 1における P C R反応で使用したプライマー 1の塩基配列を示す 配列番号： 15
以下の実施例 1における P C R反応で使用したプライマ一 2の塩基配列を示す 。
配列番号： 16
以下の実施例 2における P C R反応で使用したプライマー 1の塩基配列を示す 配列番号： 17
以下の実施例 2における P C R反応で使用したプライマー 2の塩基配列を示す 配列番号： 18 ,
以下の実施例 2における P C R反応で使用したプローブの塩基配列を示す。 以下の実施例 1で得られた形質転換体、 大腸菌 （Escherichia coli) TOP10/pC R2.1- hTGRllaaは、 2001年 （平成 1 3年） 3月 5日から茨城県つくば市東 1 丁目 1番 3号 （郵便番号 305 - 8566) の経済産業省産業技術総合研究所生 命工学工業技術研究所 （N I B H) に寄託番号 F ERM BP— 7483として 、 2001年 （平成 13年） 2月 20日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 1 7-85 (郵便番号 532— 8686) の財団法人 '発酵研究所 （ I F 0) に寄 託番号 I FO 16570として寄託されている。
以下の実施例 1で得られた形質転換体、 大腸菌 （Escherichia coli) TOP10/pC R2.卜 hTGRllggは、 2001年 （平成 13年） 3月 5日から N I BHに寄託番号 FERM BP— 7484として、 2001年 （平成 13年） 2月 20日から I FOに寄託番号 I FO 16571として寄託されている。 実施例
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子は、 モレキュラー ' クローニング (Molecular cloning)に記載されている方法に従った。 実施例 1 ヒト脾臓の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする cDNAのク口 —ニングと塩基配列の決定
ヒト脾臓 cDNA (CL0NTECH社） を铸型とし、 2個のプライマ一、 プライマ一 1 ( 配列番号： 14) およびプライマー 2 (配列番号： 15) を用いて PCR反応を行 つた。 該反応における反応液の組成は上記 cDNAを 1Z10量铸型として使用し、 Advantage- GC2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） 1/50量、 プライマー 1 (配 列番号： 14) およびプライマー 2 (配列番号： 1 5) を各 0.5 M、 dNTPs 2 00 ULM, および酵素に添付のバッファ一を 1Z5量、 GC Meltを 1Z5量加え、 20 lの液量とした。 PCR反応は、 94°C · 5分の後、 94。C · 30秒、 60 • 30秒、 68°C · 2分のサイクルを 35回繰り返し、 最後に 68 · 5分の伸 長反応を行った。 該 PCR反応産物を TAクローニングキット （Invitrogen社） の 処方に従いプラスミドベクタ一 PCR2.1 (Invitrogen社） へサブクローニングした 。 これを大腸菌 TOP 10に導入し、 cDNAを持つクロ一ンをアンピシリンを含む LB寒 天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役 型レセプター蛋白質をコードする cDNA配列 （配列番号： 2) を得た。 また、 この 配列では 46番目、 478番目、 915番目の塩基が Aまたは Gの 2通り認めら れた。 これらのアミノ酸配列 （配列番号： 1) を含有する新規 G蛋白質共役型レ セプタ一蛋白質を hTGRllと命名した （46番目と 478番目の塩基が Aから Gに 替わると 16番目と 160番目のアミノ酸が Serから Glyに替わる。 915番目の 塩基が Aから Gに替わってもアミノ酸は不変。 ） 。 また、 cDNA配列 （配列番号： 7) を有する形質転換体を大腸菌 (Escherichia coli) T0P10/pCR2.1-hTG llaa 、 cDNA配列 （配列番号： 11) を有する形質転換体を大腸菌 （Escherichia coli ) TOP10/pCR2.卜 hTGRllggと命名した。
hTGR l lの疎水性プロット図を図 1に示す。 実施例 2 hTGR 11のヒト組織における発現分布解析
, hTGR l lのヒト組織における発現分布解析は TaqMan PCR法を用いることに より調べた。 铸型としては、 Human Multiple Tissue cDNA Panel (クロンテック 社） を用い、 PCR用プライマーとしてプライマー 1 (配列番号： 16) 及びブラ イマ一 2 (配列番号： 17) を、 また配列番号： 18を有するプローブを使用し て TaqMan PCRを行った。 該反応における反応液組成は、 TaqMan Universal PCR M aster Mix (アプライドバイオシステムズジャパン） を 12.5 1、 10 M のプラ イマ一 1とプライマ一 2を各 0.5^ 1、 5 Mのプローブを l i 1、 铸型を 1、 蒸留水を 8.5 1の合計 25 1であり、 PCR反応は、 50°C · 2分、 95°C · 10分 保持した後、 95°C ' 15秒、 60 · 1分のサイクルを 40回繰り返した。 得られた結 果を基に cDNA In 1当たりのコピー数として算出した結果を図 2に示す。 これよ り hTGR 11の発現量は、 卵巣 ·胎盤'精巣で高く発 ί!していることがわかつ た。 産業上の利用可能性
本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩、 該レセプ夕一蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオ ド （例えば、 D NA、 R NAおよびそれらの誘導体） は、 ①リガンド （ァゴニニ ト） の決定、 ②抗体および抗血清の入手、 ③組換え型レセプター蛋白質の発現； の構築、 ④同発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系の開発と医薬品候補化 1 物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似したリガンド ·レセプ夕一との比較にも C づいたドラッグデザィンの実施、 ⑥遺伝子診断におけるプローブや P C Rブラ マ一の作成のための試薬、 ⑦トランスジエニック動物の作製または⑧遺伝子予!? •治療剤等の医薬等として用いることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプター蛋白質または その塩。
2 . 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5または配列番号： 6で表わさ れるアミノ酸配列を含有する請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質ま たはその塩。
3 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分べプチドまたはそ の塩。
4. 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするポリヌクレ ォチドを含有するポリヌクレオチド。
5 . D NAである請求項 4記載のポリヌクレオチド。
6 . 配列番号： 2で表される塩基配列を有する請求項 4記載のポリヌクレオチ ド。
7 . 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番号 : 1 1、 配列番号： 1 2または配列番号： 1 3で表される塩基配列を有する請求 項 4記載のポリヌクレオチド。
8 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべク夕一。
9 . 請求項 8記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
1 0 . 請求項 9記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質を生成せしめることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共役型 レセプター蛋白質またはその塩の製造法。
1 1 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分べプチドまたはその塩に対する抗体。
1 2 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を不活 性化する中和抗体である請求項 1 1記載の抗体。
1 3 . 請求項 1 1記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 4. 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分べプチドまたはその塩を用いることにより得られうる請求項 1記載の G蛋 白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド。
1 5 . 請求項 1 4記載の G蛋白質共役型レセプターのリガンドを含有してなる
1 6 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質 共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法。
1 7 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと請求項 1記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング方法。
1 8 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質もしくは請求項 3記載 の部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと請求項 1記 載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 9 . 請求項 1 7記載のスクリーニング方法または請求項 1 8記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レ セプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
2 0 . 請求項 1 7記載のスクリーニング方法または請求項 1 8記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レ セプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有 してなる医薬。
2 1 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下で八 イブリダィズするポリヌクレオチド。
2 2 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を 含有してなるポリヌクレオチド。
2 3 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴と する請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の mR NAの定量方法。
2 4. 請求項 1 1記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白 質共役型レセプター蛋白質の定量方法。
2 5 . 請求項 2 3または請求項 2 4記載の定量方法を用いることを特徴とする 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断方法。
2 6 . 請求項 2 3記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項 1記載の G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩のス リーニング方法。
2 7 . 請求項 2 4記載の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜における ϋ i 求項 1記載の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質量を変化させる化合物またはそ 塩のスクリーニング方法。
2 8 . 請求項 2 6記載のスクリーニング方法を用いて得られうる請求項 1記寒 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩。
2 9 . 請求項 2 7記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜にお： る請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物また その塩。
3 0 . 請求項 2 6記載のスクリーニング方法を用いて得られうる請求項 1記章 の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩 ¾ 含有してなる医薬。
3 1 . 請求項 2 7記載のスグリーニング方法を用いて得られうる細胞膜にお る請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物また ½ その塩を含有してなる医薬。
3 2 . 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または^ 化器系疾患の予防 ·治療剤である請求項 2 0、 3 0または 3 1記載の医薬。
3 3 . 哺乳動物に対して、 請求項 1 7記載のスクリーニング方法または請求; g 1 8記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項 1記 * の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合^ またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性疾患、 循環 器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消化器系疾患の予防 ·治療方法。
3 4. 哺乳動物に対して、 請求項 2 6記載のスクリーニング方法を用いて得ら れぅる請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化 合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消化器系疾患の予防 ·治療方法。
3 5 . 哺乳動物に対して、 請求項 2 7記載のスクリーニング方法を用いて得ら れぅる細胞膜における請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化 させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症 性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消化器系疾患の予防 ·治療 方法。 ,
3 6 . 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消 化器系疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1 7記載のスクリーニング方 法または請求項 1 8記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるリガンド と請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩の使用。
3 7 . 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消 化器系疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 2 6記載のスクリーニング方 法を用いて得られうる請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量 を変化させる化合物またはその塩の使用。
3 8 . 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病、 免疫系疾患または消 化器系疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 2 7記載のスクリーニング方 法を用いて得られうる細胞膜における請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター 蛋白質を変化させる化合物またはその塩の使用。
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