WO2002002737A2 - High-throughput method for examining the effects of membrane-impermeable compounds that contain no gene - Google Patents

High-throughput method for examining the effects of membrane-impermeable compounds that contain no gene Download PDF

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WO2002002737A2
WO2002002737A2 PCT/DE2001/002418 DE0102418W WO0202737A2 WO 2002002737 A2 WO2002002737 A2 WO 2002002737A2 DE 0102418 W DE0102418 W DE 0102418W WO 0202737 A2 WO0202737 A2 WO 0202737A2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays

Definitions

  • the invention relates to a high-throughput method for examining the effect of biochemical or molecular biological compounds on predetermined target cells.
  • HTS high-throughput screening
  • HTS has so far only been able to test the action of those compounds which can easily pass through the cell membrane.
  • Charge-bearing molecules such as proteins, peptides or oligonucleotides, cannot easily pass through the cell membrane.
  • Charge-bearing molecules can be transported through the cell membrane using liposomes.
  • liposomes call on a large number of cell types toxic reactions. HTS using liposomes is only possible to a very limited extent.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a universal high-throughput method is to be specified with which the intracellular effect of non-membrane-permeable compounds can be investigated.
  • a high-throughput method for examining the effect is non-membrane permeable and not Gen-containing connections to predetermined target cells provided with the following steps:
  • the construct formed from the compound and the capsoid enables the investigation or testing of the effect of charge-bearing compounds, such as proteins, peptides or 01 nucleotides, on bioactive substances or targets by means of HTS.
  • charge-bearing compounds such as proteins, peptides or 01 nucleotides
  • the spectrum of compounds that can be examined is expanded to include compounds that cannot easily pass through the cell membrane.
  • Capsoid is understood here to mean a viral capsid or a synthetically produced capsid which is derived from a viral capsid. With such a derived capsid, individual amino acids or amino acid sequence sections can be replaced. Amino acid derivatives can also replace amino acids.
  • the cavities of a microtiter plate are expediently used as containers. In this case, conventional automated devices can be used to carry out the high-throughput method according to the invention. An optical change brought about by the reaction is expediently observed. This enables a particularly simple detection of a reaction possibly caused by the connection.
  • the detection of the change brought about by the connection in the target cell is preferably carried out by comparing it with a step (lit. a treated further target cell performed.
  • a step lit. a treated further target cell performed.
  • the detection of the reaction in step lit. d without removing or adding liquid from or to the containers. Contamination is avoided.
  • the process can be carried out easily and quickly.
  • the detection means is advantageously a DNA with a preferably pathologically relevant promoter and a reporter gene downstream in the reading direction.
  • the activity of the reporter gene preferably via the fluorescent or luminescent properties of its expressions or products, is observed.
  • the detection means can also be a substance that occurs naturally in the cell, for example a protein or gene, which triggers an optically observable reaction due to the influence of the compound. This enables optical detection. Such an optical detection is possible for a large number of samples at the same time.
  • the DNA is in the form of a plasmid.
  • the plasmid can have at least one of the following components: Epstein-Barr nuclear antigen, oriP, ori, selection marker.
  • the selection marker can be selected from the following group: amp gene, neomycin gene, hygromycin gene.
  • the Epstein-Barr nuclear antigen is used for replication in mammalian cells.
  • the oriP is used to start replication in mammalian cells, the ori is used for bacterial replication. Selection markers for bacteria and eukaryotic cells are particularly suitable here as selection markers.
  • the reporter gene is advantageously selected from the following group: green fluorescent protein (GFP), luciferase, secreted luciferase, alkaline phosphatase, secreted alkaline phosphatase, beta-lactamase.
  • GFP green fluorescent protein
  • luciferase secreted luciferase
  • alkaline phosphatase secreted alkaline phosphatase
  • beta-lactamase beta-lactamase.
  • the target cells can be lit before step lit.
  • b can be selected using hygromycin.
  • proteins, peptides, oligonucleotides, membrane-impermeable molecules or charged molecules come as a connection into consideration. Such connections are considered highly effective.
  • the method according to the invention allows the same to be examined with a high throughput.
  • capsoid has proven to be particularly advantageous to derive the capsoid from the polyoma virus.
  • Such a construct also shows a greatly improved property of passage through the cell membrane.
  • capsoids The production of capsoids and the binding of compounds to capsoids is described in DE 196 18 797 and DE 199 16 224.
  • the techniques used to make the construct and insert the construct are described in the handbook: Sambrock et al. , Molecular Cloning "A Laboratory Manual", (1989) ISNBN 0-87969-309-6.
  • the disclosure content of the aforementioned documents is hereby included.
  • Apoptosis leads to an inflammation-free destruction of cells.
  • the promoter of an apop tose-specific gene cloned in front of a reporter gene, eg GFP.
  • the corresponding plasmid is propagated in E. coli and purified therefrom.
  • the plasmid is then transfected into the target cells.
  • the transfected target cells are selected via hygromycin and multiplied.
  • the target cells are then sown in microtiter plates.
  • the compound to be examined e.g. a substance from a library of proteins peptides, oligonucleotides or the like , is absorbed in polyoma capsoids.
  • the target cells are treated with the polyoma capsoids carrying the compound.
  • the change in the gene activity of the reporter gene is then monitored photometrically. Fluorescence indicates an increase in activity with the induction of apoptosis.
  • antisense oligonucleotides introduced into target cells are bound to a specific mRNA. This binding destroys the mRNA due to the activity of the RNAse H. The expression of the corresponding target gene is prevented. This enables diseases such as cancer and viral diseases to be treated.
  • the coding region of a virus-specific gene is cloned in front of a reporter gene, for example GFP.
  • the corresponding plasmid is propagated in E. coli, purified from it and then transfected into the target cells.
  • the transfected target cells are selected via hygromycin and multiplied.
  • the antisense oligonucleotides to be tested are associated with polyoma capsoids and then introduced into the target cells. Finally, the activity of the reporter gene is observed.
  • a reduction in activity indicates the binding of the antisense oligonucleotide to the mRNA.
  • Oligonucleotides or PNAs can bind to a gene whose expression is to be suppressed.
  • the binding is a triplex DNA binding.
  • a third DNA strand binds to the DNA double strand in a sequence-specific manner via a so-called Hoogsteeen base pairing.
  • the transcription is inhibited in the antigen strategy considered here.
  • Telomerase or other genes that are required for the immortalization or proliferation of cancer cells are possible targets for the suppression of gene activity.
  • the promoter of the telomerase is cloned in front of a reporter gene, for example GFP.
  • the corresponding plasmid is propagated in E. coli and purified therefrom. It is transfected into the target cells.
  • the transfi- decorated target cells are selected via hygromycin and multiplied. Finally, the target cells are sown in microtiter plates.
  • the change in the gene activity of the reporter gene is determined photometrically. A decrease in activity indicates a suppression of the transcription of the telomerase gene.

Abstract

The invention relates to a high-throughput method for examining the effects of membrane-impermeable compounds that contain no gene on predetermined target cells, comprising the following steps: (a) producing a construct containing the compound and a capsoid, (b) providing target cells in a plurality of containers (c) introducing the construct into the target cells, (d) detecting, in a substantially simultaneous manner, the reaction in the containers that is caused by the compound upon contact with a detecting agent contained in the target cell.

Description

Hoch-Durchsatz-Verfahren zur Untersuchung der Wirkung nicht- me branpermeabler und kein Gen enthaltender VerbindungenHigh-throughput method for examining the effect of non-branch permeable and no gene-containing compounds
Die Erfindung betrifft ein Hoch-Durchsatz-Verfahren zur Un- tersuchung der Wirkung biochemischer oder molekularbiologischer Verbindungen auf vorgegebene Zielzellen.The invention relates to a high-throughput method for examining the effect of biochemical or molecular biological compounds on predetermined target cells.
Nach dem Stand der Technik ist es bekannt, insbesondere zur Entwicklung pharmazeutischer Produkte, das Reaktionsverhalten bzw. die Wirkung einer Vielzahl von Verbindungen auf Zielzellen in Parallelversuchen zu prüfen. Solche Auswahl erfahren werden auch als sogenannte Screening-Verfahren bezeichnet. Auswahlverfahren mit einem hohen Durchsatz werden als High- Throughput-Screening (HTS) Verfahren bezeichnet. Die folgen- den Dokumente geben einen Überblick über den Stand der Technik beim HTS :According to the prior art, it is known to test the reaction behavior or the effect of a large number of compounds on target cells in parallel experiments, in particular for the development of pharmaceutical products. Experiencing such selections are also referred to as so-called screening methods. Selection procedures with a high throughput are referred to as high-throughput screening (HTS) procedures. The following documents provide an overview of the state of the art at HTS:
- Sittampalam, G.S., Kahl, S.D. und Janzen, W.P. 1997: Cur- rent Opinion in Chemical Biology, 1: 384-391.- Sittampalam, G.S., Kahl, S.D. and Janzen, W.P. 1997: Curent Opinion in Chemical Biology, 1: 384-391.
- Burbaum, J.J. und Sigal, N.H. 1997: Current Opinion in Chemical Biology, 1: 72-78.- Burbaum, J.J. and Sigal, N.H. 1997: Current Opinion in Chemical Biology, 1: 72-78.
Nachteiligerweise kann mittels HTS bisher nur die Wirkung solcher Verbindungen geprüft werden, welche die Zellmembran ohne weiteres passieren können. Ladungstragende Moleküle, wie Proteine Peptide oder Oligonukleotide, können die Zellmembran nicht ohne weiteres passieren. Ladungstragende Moleküle können mittels Liposomen durch die Zellmembran geschleust wer- den. Bei einer Vielzahl von Zeiltypen rufen Liposome jedoch toxische Reaktionen hervor. HTS unter Verwendung von Liposo- men ist nur stark eingeschränkt möglich.Disadvantageously, HTS has so far only been able to test the action of those compounds which can easily pass through the cell membrane. Charge-bearing molecules, such as proteins, peptides or oligonucleotides, cannot easily pass through the cell membrane. Charge-bearing molecules can be transported through the cell membrane using liposomes. However, liposomes call on a large number of cell types toxic reactions. HTS using liposomes is only possible to a very limited extent.
Aus Henke et al . (1999) Arch. Pharm. 332, Suppl .2 , 15 ist es bekannt, daß Polyoma Kapsoide zum Transport von Wirkstoffen in Zielzellen geeignet sind. Weiterhin ist aus Pugazhenthi et al., (1999) Journal of Biological Chemistry 274, 27529-27535 bekannt, daß ein Fusionskonstrukt aus dem bei-Promotor und dem Luciferase-Gen zum Auffinden von Apoptose-regulierenden Faktoren genutzt werden kann. Dazu werden Zielzellen mit dem Fusionskonstrukt und weiteren Genen kotransfiziert oder nach der Transfektion mit dem Fusionskonstrukt mit Faktoren behandelt. Die Beeinflussung des bcl-Promotors wird anhand der Lu- ciferase-Aktivität bestimmt. Mit dem bekannten Verfahren kön- nen nur solche Faktoren untersucht werden, die ihre Wirkung ohne ein künstlich herbeigeführtes Einschleusen in die Ziel- zellen entfalten. Dabei handelt es sich um Faktoren wie z.B. IGF.From Henke et al. (1999) Arch. Pharm. 332, Suppl. 2, 15 it is known that polyoma capsoids are suitable for the transport of active substances in target cells. Furthermore, it is known from Pugazhenthi et al., (1999) Journal of Biological Chemistry 274, 27529-27535 that a fusion construct from the bei promoter and the luciferase gene can be used to find apoptosis-regulating factors. For this purpose, target cells are co-transfected with the fusion construct and other genes or treated with factors after the transfection with the fusion construct. The influence of the bcl promoter is determined on the basis of the luciferase activity. With the known method, only those factors can be investigated which have their effect without artificially induced introduction into the target cells. These are factors such as IGF.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein universelles Hoch-Durchsatz-Verfahren angegeben werden, mit dem die intrazelluläre Wirkung von nicht-membranpermeable Verbindungen untersucht werden kann.The object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art. In particular, a universal high-throughput method is to be specified with which the intracellular effect of non-membrane-permeable compounds can be investigated.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 17.This object is solved by the features of claim 1. Appropriate configurations result from the features of claims 2 to 17.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Hoch-Durchsatz-Verfahren zur Untersuchung der Wirkung nicht-membranpermeabler und kein Gen enthaltender Verbindungen auf vorgegebene Zielzellen mit folgenden Schritten vorgesehen:According to the invention, a high-throughput method for examining the effect is non-membrane permeable and not Gen-containing connections to predetermined target cells provided with the following steps:
a) Herstellung einer die Verbindung und ein Kapsoid enthal- tenden Konstrukts,a) preparation of a construct containing the compound and a capsoid,
b) Bereitstellen von Zielzellen in einer Vielzahl von Behältern,b) providing target cells in a multiplicity of containers,
c) Einbringen des Konstrukts in die Zielzellen,c) introducing the construct into the target cells,
d) im wesentlichen gleichzeitiges Erfassen einer durch die Verbindung auf ein in der Zielzelle enthaltenes Detektions- mittel bewirkten Reaktion in den Behältern.d) essentially simultaneous detection of a reaction in the containers caused by the connection to a detection means contained in the target cell.
Das aus der Verbindung und dem Kapsoid gebildete Konstrukt, ermöglicht die Untersuchung bzw. Prüfung der Wirkung ladungstragender Verbindungen, wie Proteine, Peptide oder 01i- gonukleotide, auf bioaktive Substanzen bzw. Targets mittels HTS. Das Spektrum der untersuchbaren Verbindungen wird auf Verbindungen erweitert, welche die Zellmembran nicht ohne weiteres passieren können.The construct formed from the compound and the capsoid enables the investigation or testing of the effect of charge-bearing compounds, such as proteins, peptides or 01 nucleotides, on bioactive substances or targets by means of HTS. The spectrum of compounds that can be examined is expanded to include compounds that cannot easily pass through the cell membrane.
Unter Kapsoid wird hier ein virales Kapsid oder ein synthe- tisch hergestelltes Kapsid verstanden, welches von einem vi- ralen Kapsid abgeleitet ist. Bei einem solchen abgeleiteten Kapsid können einzelne Aminosäuren oder Aminosäuresequenzabschnitte ersetzt sein. Es können auch Aminosäurederivate anstelle von Aminosäuren treten. Zweckmäßigerweise werden als Behälter die Kavitäten einer Mi- krotiterplatte benutzt. In diesem Fall können zur Durchführung des erfindungsgemäßen Hoch-Durchsatz-Verfahrens herkömmliche automatisierte Vorrichtungen verwendet werden. Zweckmä- ßigerweise wird eine durch die Reaktion bewirkte optische Veränderung beobachtet. Das ermöglicht ein besonders einfaches Erfassen einer durch die Verbindung ggf. bewirkten Reaktion.Capsoid is understood here to mean a viral capsid or a synthetically produced capsid which is derived from a viral capsid. With such a derived capsid, individual amino acids or amino acid sequence sections can be replaced. Amino acid derivatives can also replace amino acids. The cavities of a microtiter plate are expediently used as containers. In this case, conventional automated devices can be used to carry out the high-throughput method according to the invention. An optical change brought about by the reaction is expediently observed. This enables a particularly simple detection of a reaction possibly caused by the connection.
Die Erfassung der durch die Verbindung in der Zielzelle bewirkten Veränderung wird vorzugsweise durch Vergleich mit einer unter Weglassung des Zusatzes der Verbindung im Schritt lit. a behandelten weiteren Zielzelle durchgeführt. Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal kann das Erfassen der Re- aktion beim Schritt lit. d ohne Entnahme oder Hinzufügen von Flüssigkeit aus bzw. zu den Behältern erfolgen. Kontaminationen werden vermieden. Das Verfahren ist einfach und schnell durchführbar .The detection of the change brought about by the connection in the target cell is preferably carried out by comparing it with a step (lit. a treated further target cell performed. According to a further design feature, the detection of the reaction in step lit. d without removing or adding liquid from or to the containers. Contamination is avoided. The process can be carried out easily and quickly.
Bei dem Detektionsmittel handelt es sich vorteilhafterweise um eine DNA mit einem, vorzugsweise pathologisch relevanten Promotor und einem in Leserichtung nachgeschalteten Reporter- Gen. In diesem Fall kann beim Schritt lit. d die Aktivität des Reporter-Gens, vorzugsweise über die fluoreszenten oder lumineszenten Eigenschaften seiner Exprimate oder Produkte, beobachtet werden. Bei dem Detektionsmittel kann es sich auch um einen in der Zelle natürlicherweise vorkommenden Stoff handeln, z.B. ein Protein oder Gen, welches durch den Einfluß der Verbindung eine optisch beobachtbare Reaktion auslöst. Das ermöglicht eine optische Detektion. Eine solche optische Detektion ist bei einer Vielzahl von Proben gleichzeitig möglich.The detection means is advantageously a DNA with a preferably pathologically relevant promoter and a reporter gene downstream in the reading direction. In this case, at step lit. d the activity of the reporter gene, preferably via the fluorescent or luminescent properties of its expressions or products, is observed. The detection means can also be a substance that occurs naturally in the cell, for example a protein or gene, which triggers an optically observable reaction due to the influence of the compound. This enables optical detection. Such an optical detection is possible for a large number of samples at the same time.
Nach einer weiteren Ausgestaltung ist die DNA in Form eines Plasmids ausgebildet . Das Plasmid kann mindestens einen der folgenden Bestandteile aufweisen: Epstein-Barr-Nuklear- Antigen, oriP, ori, Selektionsmarker . Der Selektionsmarker kann aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein: amp-Gen, Neomycin-Gen, Hygromycin-Gen.According to a further embodiment, the DNA is in the form of a plasmid. The plasmid can have at least one of the following components: Epstein-Barr nuclear antigen, oriP, ori, selection marker. The selection marker can be selected from the following group: amp gene, neomycin gene, hygromycin gene.
Das Epstein-Barr-Nuklear-Antigen dient zur Replikation in Säuger-Zellen. Der oriP dient dem Replikationsstart in Säuger-Zellen, der ori einem bakteriellen Replikationsstart. Als Selektionsmarker kommen hier insbesondere Selektionsmarker für Bakterien und eukaryotische Zellen in Betracht.The Epstein-Barr nuclear antigen is used for replication in mammalian cells. The oriP is used to start replication in mammalian cells, the ori is used for bacterial replication. Selection markers for bacteria and eukaryotic cells are particularly suitable here as selection markers.
Das Reporter-Gen ist vorteilhafterweise aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Grün fluoreszierendes Protein (GFP) , Luci- ferase, sezernierte Luciferase, alkalische Phosphatase, se- zernierte alkalische Phosphatase, beta-Lactamase .The reporter gene is advantageously selected from the following group: green fluorescent protein (GFP), luciferase, secreted luciferase, alkaline phosphatase, secreted alkaline phosphatase, beta-lactamase.
Insbesondere zur Untersuchung Apoptose-induzierender Faktoren hat es sich als zweckmäßig erwiesen, stromaufwärts des Re- porter-Gens einen Promotor eines Apoptose-spezifischen Gens oder den Promotor der Telomerase zu klonieren. Die Zielzellen können in diesem Fall vor dem Schritt lit. b mittels Hy- gromycin ausgewählt werden.In particular for the investigation of apoptosis-inducing factors, it has proven expedient to clone a promoter of an apoptosis-specific gene or the promoter of the telomerase upstream of the reporter gene. In this case, the target cells can be lit before step lit. b can be selected using hygromycin.
Als Verbindung kommen insbesondere Proteine Peptide, Oligonu- kleotide, Membran-impermeable Moleküle oder geladene Moleküle in Betracht. Solche Verbindungen gelten als hochwirksam. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine Untersuchung derselben mit einem hohen Durchsatz.In particular, proteins, peptides, oligonucleotides, membrane-impermeable molecules or charged molecules come as a connection into consideration. Such connections are considered highly effective. The method according to the invention allows the same to be examined with a high throughput.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, das Kapsoid vom Polyoma-Virus abzuleiten. Je nach Anwendung kann es auch von Vorteil sein, das Kapsoid synthetisch aus dem VP1 und/oder VP2 des Polyoma-Virus herzustellen. Es ist auch möglich, einzelne Kapsomere an die zu transportierende Verbin- düng zu koppeln. Auch ein solches Konstrukt zeigt eine stark verbesserte Eigenschaft des Durchgangs durch die Zellmembran. Schließlich ist es zweckmäßig das Kapsoid aus rekombinanten Virusproteinen herzustellenIt has proven to be particularly advantageous to derive the capsoid from the polyoma virus. Depending on the application, it may also be advantageous to produce the capsoid synthetically from the VP1 and / or VP2 of the polyoma virus. It is also possible to couple individual capsomeres to the connection to be transported. Such a construct also shows a greatly improved property of passage through the cell membrane. Finally, it is expedient to produce the capsoid from recombinant virus proteins
Die Herstellung von Kapsoiden und die Bindung von Verbindungen an Kapsoide ist in der DE 196 18 797 und der DE 199 16 224 beschrieben. Die zur Herstellung des Konstrukts und die zum Einbringen des Konstrukts verwendeten Techniken sind in dem Handbuch: Sambrock et al . , Molecular Cloning "A Laboratory Manual", (1989) ISNBN 0-87969-309-6 zu entnehmen. Der Offenbarungsgehalt der vorgenannten Dokumente wird hiermit einbezogen.The production of capsoids and the binding of compounds to capsoids is described in DE 196 18 797 and DE 199 16 224. The techniques used to make the construct and insert the construct are described in the handbook: Sambrock et al. , Molecular Cloning "A Laboratory Manual", (1989) ISNBN 0-87969-309-6. The disclosure content of the aforementioned documents is hereby included.
Beispiele :Examples:
1. Auffinden von Apoptose-induzierenden Verbindungen1. Finding apoptosis-inducing compounds
Die gezielte Auslösung der Apoptose ist von großem medizinischem Interesse. Die Apoptose führt zu einer entzündungsfrei- en Zerstörung von Zellen. Zum Auffinden Apoptose-induzieren- der Verbindungen bzw. Faktoren wird der Promotor eines Apop- tose-spezifischen Gens vor ein Reporter-Gen, z.B. GFP, klo- niert . Das entsprechende Plasmid wird in E. coli vermehrt und daraus gereinigt. Dann wird das Plasmid in die Zielzellen transfiziert . Die transfizierten Zielzellen werden über Hy- gromycin selektioniert und vermehrt. Anschließend werden die Zielzellen in Mikrotiterplatten ausgesät.The targeted triggering of apoptosis is of great medical interest. Apoptosis leads to an inflammation-free destruction of cells. To find apoptosis-inducing compounds or factors, the promoter of an apop tose-specific gene cloned in front of a reporter gene, eg GFP. The corresponding plasmid is propagated in E. coli and purified therefrom. The plasmid is then transfected into the target cells. The transfected target cells are selected via hygromycin and multiplied. The target cells are then sown in microtiter plates.
Die zu untersuchende Verbindung, z.B. eine Substanz aus einer Bibliothek von Proteinen Peptiden, Oligonukleotiden oder dgl . , ist in Polyoma-Kapsoiden aufgenommen. Die Zielzellen werden mit den die Verbindung tragenden Polyoma-Kapsoiden behandelt. Anschließend wird die Veränderung der Gen-Aktivität des Reporter-Gens photometrisch beobachtet. Eine Fluoreszenz zeigt eine Steigerung der Aktivität damit die Induktion der Apoptose an.The compound to be examined, e.g. a substance from a library of proteins peptides, oligonucleotides or the like , is absorbed in polyoma capsoids. The target cells are treated with the polyoma capsoids carrying the compound. The change in the gene activity of the reporter gene is then monitored photometrically. Fluorescence indicates an increase in activity with the induction of apoptosis.
2. Auffinden von Antisense-Oligonukleotiden zur Unterdrük- kung viraler Erkrankungen.2. Finding antisense oligonucleotides to suppress viral diseases.
Im Rahmen der Antisense-Therapie werden in Zielzellen eingeführte Antisense-Oligonukleotide an eine spezifische mRNA gebunden. Durch diese Bindung wird die mRNA aufgrund der Aktivität der RNAse H zerstört. Die Expression des entsprechenden Zielgens wird verhindert . Dadurch können Krankheiten wie Krebs und Viruserkrankungen therapiert werden.As part of the antisense therapy, antisense oligonucleotides introduced into target cells are bound to a specific mRNA. This binding destroys the mRNA due to the activity of the RNAse H. The expression of the corresponding target gene is prevented. This enables diseases such as cancer and viral diseases to be treated.
Zur Ermittlung effektiver Antisense-Oligonukleotide wird der kodierende Bereich eines Virus-spezifischen Gens vor ein Reporter-Gen, z.B. GFP, kloniert . Das entsprechende Plasmid wird in E. coli vermehrt, daraus gereinigt und anschließend in die Zielzellen transfiziert . Die transfizierten Zielzellen werden über Hygromycin selektiert und vermehrt.To determine effective antisense oligonucleotides, the coding region of a virus-specific gene is cloned in front of a reporter gene, for example GFP. The corresponding plasmid is propagated in E. coli, purified from it and then transfected into the target cells. The transfected target cells are selected via hygromycin and multiplied.
Die zu prüfenden Antisense-Oligonukleotide werden mit Polyo- ma-Kapsoiden assoziiert und anschließend in die Zielzellen eingebracht. Schließlich wird die Aktivität des Reporter-Gens beobachtet .The antisense oligonucleotides to be tested are associated with polyoma capsoids and then introduced into the target cells. Finally, the activity of the reporter gene is observed.
Eine Verringerung der Aktivität zeigt die Bindung des Anti- sense-Oligonukleotids an die mRNA an.A reduction in activity indicates the binding of the antisense oligonucleotide to the mRNA.
3. Auswahl von Antigen-Oligonukleotiden für die Krebstherapie.3. Selection of antigen oligonucleotides for cancer therapy.
Oligonukleotide oder PNAs können an ein Gen binden, dessen Expression unterdrückt werden soll. Bei der Bindung handelt es sich um eine Triplex-DNA-Bindung. Dabei bindet ein dritter DNA-Strang sequenzspezifisch über ein sogenannte Hoogsteeen- Basenpaarung an den DNA-Doppelstrang. Im Gegensatz zum Bei- spiel 2 wird bei der hier betrachtenden Antigen-Strategie die Transkription inhibiert.Oligonucleotides or PNAs can bind to a gene whose expression is to be suppressed. The binding is a triplex DNA binding. A third DNA strand binds to the DNA double strand in a sequence-specific manner via a so-called Hoogsteeen base pairing. In contrast to example 2, the transcription is inhibited in the antigen strategy considered here.
Als Ziele für die Unterdrückung der Gen-Aktivität kommen hier die Telomerase oder andere Gene in Frage, die für die Immor- talisierung oder Proliferation von Krebszellen erforderlich sind.Telomerase or other genes that are required for the immortalization or proliferation of cancer cells are possible targets for the suppression of gene activity.
Zur Durchführung des AuswahlVerfahrens wird der Promotor der Telomerase vor ein Reporter-Gen, z.B. GFP, kloniert . Das ent- sprechende Plasmid wird in E. coli vermehrt und daraus gereinigt. Es wird in die Zielzellen transfiziert . Die transfi- zierten Zielzellen werden über Hygromycin selektiert und vermehrt. Schließlich werden die Zielzellen in Mikrotiterplatten ausgesät .To carry out the selection process, the promoter of the telomerase is cloned in front of a reporter gene, for example GFP. The corresponding plasmid is propagated in E. coli and purified therefrom. It is transfected into the target cells. The transfi- decorated target cells are selected via hygromycin and multiplied. Finally, the target cells are sown in microtiter plates.
Eine aus einer Bibliothek von Proteinen Peptiden, Oligonu- kleotiden und dgl . ausgewählte Verbindung wird mit einem Po- lyoma-Kapsoid assoziiert. Das entsprechend beladene Polyoma- Kapsoid wird in die Zielzelle eingebracht.One from a library of proteins, peptides, oligonucleotides and the like. selected compound is associated with a polyoma capsoid. The correspondingly loaded polyoma capsoid is introduced into the target cell.
Es wird die Veränderung der Gen-Aktivität des Reporter-Gens photometrisch bestimmt. Eine Verringerung der Aktivität zeigt eine Unterdrückung der Transkription des Telomerase-Gens an. The change in the gene activity of the reporter gene is determined photometrically. A decrease in activity indicates a suppression of the transcription of the telomerase gene.

Claims

Patentansprüche claims
1. Hoch-Durchsatz-Verfahren zur Untersuchung der Wirkung nicht-membranpermeabler und kein Gen enthaltender Verbindun- gen auf vorgegebene Zielzellen mit folgenden Schritten:1. High-throughput method for examining the effect of non-membrane permeable and no gene-containing compounds on predetermined target cells with the following steps:
a) Herstellung einer die Verbindung und ein Kapsoid enthaltenden Konstrukts,a) preparation of a construct containing the compound and a capsoid,
b) Bereitstellen von Zielzellen in einer Vielzahl von Behältern,b) providing target cells in a multiplicity of containers,
c) Einbringen des Konstrukts in die Zielzellen,c) introducing the construct into the target cells,
d) im wesentlichen gleichzeitiges Erfassen einer durch die Verbindung auf ein in der Zielzelle enthaltenes Detektionsmittel bewirkten Reaktion in den Behältern.d) essentially simultaneously detecting a reaction in the containers caused by the connection to a detection means contained in the target cell.
2. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Be- hälter die Kavitaten einer Mikrotiterplatte benutzt werden.2. High-throughput method according to claim 1, wherein the cavities of a microtiter plate are used as containers.
3. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine durch die Reaktion bewirkte optische Veränderung beobachtet wird.3. High-throughput method according to claim 1 or 2, wherein an optical change caused by the reaction is observed.
4. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Erfassung der durch die Verbindung in der Zielzelle bewirkten Veränderung durch Vergleich mit einer unter Weglassung des Zusatzes der Verbindung im Schritts lit. a behandelten weiteren Zielzelle durchgeführt wird. 4. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein the detection of the change caused by the connection in the target cell by comparison with a while omitting the addition of the connection in step lit. a treated further target cell is carried out.
5. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erfassen der Reaktion beim Schritt lit. d ohne Entnahme oder Hinzufügen von Flüssigkeit aus bzw. zu den Behältern erfolgt.5. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein the detection of the reaction in step lit. d without removing or adding liquid from or to the containers.
6. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detektionsmittel eine DNA mit einem Promotor und einem in Leserichtung nachgeschalteten Reporter-Gen ist .6. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein the detection means is a DNA with a promoter and a reporter gene downstream in the reading direction.
7. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. d die Aktivität des Reporter-Gens, vorzugsweise über die fluoreszenten oder lumines- zenten Eigenschaften seiner Exprimate oder Produkte, beobach- tet wird.7. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein in step lit. d the activity of the reporter gene, preferably via the fluorescent or luminescent properties of its expressions or products, is observed.
8. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die DNA in Form eines Plasmids ausgebildet ist.8. High-throughput method according to claim 6 or 7, wherein the DNA is in the form of a plasmid.
9. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach Anspruch 8, wobei das9. The high-throughput method according to claim 8, wherein the
Plasmid mindestens einen der folgenden Bestandteile aufweist: Epstein-Barr-Nuklear-Antigen, oriP, Ori, Selektionsmarker.Plasmid has at least one of the following components: Epstein-Barr nuclear antigen, oriP, Ori, selection marker.
10. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Se- lektionsmarker aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: a p-10. The high-throughput method according to claim 9, wherein the selection marker is selected from the following group: a p-
Gen, Neo ycin-Gen, Hygromycin-Gen.Gene, neoycin gene, hygromycin gene.
11. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reporter-Gen aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Grün fluoreszierendes Protein (GFP), Lucife- rase, sezernierte Luciferase, alkalische Phosphatase, sezer- nierte alkalische Phosphatase, beta-Lactamase .11. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein the reporter gene is selected from the following group: green fluorescent protein (GFP), Lucife- rase, secreted luciferase, alkaline phosphatase, secreted alkaline phosphatase, beta-lactamase.
12. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei stromaufwärts des Reporter-Gens, ein Promotor eines Apoptose-spezifischen Gens oder der Promotor der Telomerase kloniert wird.12. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein upstream of the reporter gene, a promoter of an apoptosis-specific gene or the promoter of telomerase is cloned.
13. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zielzellen vor dem Schritt lit. b mittels Hygromycin ausgewählt werden.13. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein the target cells before step lit. b can be selected using hygromycin.
14. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Verbindung Peptide, Oligonukleotide, Membran-impermeable Moleküle oder geladene Moleküle verwendet werden .14. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein peptides, oligonucleotides, membrane-impermeable molecules or charged molecules are used as the compound.
15. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kapsoid vom Polyoma-Virus abgeleitet ist.15. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein the capsoid is derived from the polyoma virus.
16. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kapsoid synthetisch aus dem VPl und/oder VP2 des Polyoma-Virus hergestellt wird.16. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein the capsoid is produced synthetically from the VPl and / or VP2 of the polyoma virus.
17. Hoch-Durchsatz-Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kapsoid aus rekombinanten Virusproteinen hergestellt wird. 17. High-throughput method according to one of the preceding claims, wherein the capsoid is produced from recombinant virus proteins.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1576121A2 (en) * 2002-05-17 2005-09-21 Automated Cell Inc. Determination of protein function

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19618797A1 (en) * 1996-05-10 1997-11-13 Bertling Wolf Prof Dr Vehicle for the transport of molecular substances
WO1998048841A1 (en) * 1997-04-26 1998-11-05 Rpms Technology Limited Use of papovavirus capsid protein for delivery of genetic material
US5837464A (en) * 1996-01-29 1998-11-17 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
WO1999025324A1 (en) * 1997-11-13 1999-05-27 November Ag Gesellschaft Für Molekulare Medizin Administering active substances by using the capsid produced out of the polyoma virus vp1 protein
US6046173A (en) * 1994-07-26 2000-04-04 Caduceus Limited Polyoma virus pseudocapsids and method to deliver material into cell

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6046173A (en) * 1994-07-26 2000-04-04 Caduceus Limited Polyoma virus pseudocapsids and method to deliver material into cell
US5837464A (en) * 1996-01-29 1998-11-17 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
DE19618797A1 (en) * 1996-05-10 1997-11-13 Bertling Wolf Prof Dr Vehicle for the transport of molecular substances
WO1998048841A1 (en) * 1997-04-26 1998-11-05 Rpms Technology Limited Use of papovavirus capsid protein for delivery of genetic material
WO1999025324A1 (en) * 1997-11-13 1999-05-27 November Ag Gesellschaft Für Molekulare Medizin Administering active substances by using the capsid produced out of the polyoma virus vp1 protein

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRAUN H ET AL: "Oligonucleotide and plasmid DNA packaging into polyoma VP1 virus-like particles expressed in Escherichia coli." BIOTECHNOLOGY AND APPLIED BIOCHEMISTRY. ENGLAND FEB 1999, Bd. 29 ( Pt 1), Februar 1999 (1999-02), Seiten 31-43, XP002225098 ISSN: 0885-4513 *
FORSTOVA J ET AL: "POLYOMA VIRUS PSEUDOCAPSIDS AS EFFICIENT CARRIERS OF HETEROLOGOUS DNA INTO MAMMALIAN CELLS" HUMAN GENE THERAPY, XX, XX, Bd. 6, Nr. 3, 1. M{rz 1995 (1995-03-01), Seiten 297-306, XP000645479 ISSN: 1043-0342 *
GILLOCK E T ET AL: "Polyomavirus major capsid protein VP1 is capable of packaging cellular DNA when expressed in the baculovirus system" JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, Bd. 71, Nr. 4, April 1997 (1997-04), Seiten 2857-2865, XP002100672 ISSN: 0022-538X *
GOLDMANN C ET AL: "PACKAGING OF SMALL MOLECULES INTO VP1-VIRUS-LIKE PARTICLES OF THE HUMAN POLYOMAVIRUS JC VIRUS" JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, AMSTERDAM, NL, Bd. 90, Nr. 1, Oktober 2000 (2000-10), Seiten 85-90, XP001006271 ISSN: 0166-0934 *
HENKE S ET AL: "Polyoma virus capsid proteins as potential carriers of drugs into mammalian cells." PHARMAZIE, [Online] Bd. 53, Nr. 3 SUPPL. 1, März 1998 (1998-03), Seite 16 XP002225097 European Graduate Student Meeting of the European Federation of Pharmaceutical Sciences;Frankfurt/Main, Germany; February 20-22, 1998 ISSN: 0031-7144 Gefunden im Internet: <URL:http://www.biozentrum.uni-frankfurt.d e/DPhG/doktorandentagung/abstracts/Henke.h tml> [gefunden am 2002-12-16] *
PRABHAVATHI B FERNANDES: "TECHNOLOGICAL ADVANCES IN HIGH-THROUGHPUT SCREENING" CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY, CURRENT BIOLOGY LTD, LONDON, GB, Bd. 2, Nr. 5, Oktober 1998 (1998-10), Seiten 597-603, XP001088395 ISSN: 1367-5931 *
STOKROVA J ET AL: "Interactions of heterologous DNA with polyomavirus major structural protein, VP1" FEBS LETTERS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, Bd. 445, Nr. 1, 19. Februar 1999 (1999-02-19), Seiten 119-125, XP004259860 ISSN: 0014-5793 *
WEI-CHIH OU ET AL: "The major casid protein, VP1, of human JC virus expressed in Escherichia coli is able to self-assemble into a cpsid-like particle and deliver exogenous DNA int human kdney cells" JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, READING, GB, Bd. 80, 1999, Seiten 39-46, XP002164832 ISSN: 0022-1317 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1576121A2 (en) * 2002-05-17 2005-09-21 Automated Cell Inc. Determination of protein function
EP1576121A4 (en) * 2002-05-17 2008-04-23 Automated Cell Inc Determination of protein function

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