DE10036175A1

DE10036175A1 - Determining activity of nucleic acid, useful for optimizing therapeutic or diagnostic nucleic acids, by transforming organisms, in parallel, with many different sequences

Info

Publication number: DE10036175A1
Application number: DE10036175A
Authority: DE
Inventors: Peter Buckel; Ulrich Pessara
Original assignee: Xantos Biomedicine AG
Current assignee: Xantos Biomedicine AG
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2001-06-28

Abstract

Determining the biological activity of nucleic acid sequences (I) by: (i) inserting, in parallel, many expression vectors, each containing a test (I) linked to control sequences, into many separate populations of the same type of target organism; (ii) allowing expression of (I), and (iii) determining the activity of (I) in the individual populations. Only one, or a few, different (I) are present in any single population.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Nukleinsäuresequenzen und die Verwendung der auf diese Weise identifizierten Nukleinsäuresequenzen zur Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Mittel.The invention relates to a method for determining the activity of Nucleic acid sequences and the use of this way identified nucleic acid sequences to provide diagnostic and therapeutic agent.

Bisherige Verfahren zum Identifizieren der Aktivität von Nukleinsäure sequenzen beinhalten eine Expressionsklonierung, wobei im allgemeinen eine Genbibliothek, d. h. eine Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen, gemeinsam durch eine Transfektion bzw. Tranformation in eine Population von Zielorganismen eingebracht wird. Nach Expression der transfizierten bzw. transformierten Nukleinsäure werden einzelne Zielorganismen, die eine gesuchte Aktivität, z. B. die Expression eines Antigens für einen Antikörper etc. aufweisen, von den übrigen Zielorganismen physikalisch getrennt. Aus den auf diese Weise isolierten einzelnen Zielorganismen wird die transfizierte bzw. transformierte DNA, die häufig als extrachromosomales Plasmid vorliegt, isoliert und amplifiziert, z. B. durch Vermehrung in Bakterienzellen. Aus diesen Bakterienzellen wir die DNA dann erneut isoliert und in Säugerzellen transfiziert. Durch mehrere Runden dieses Vorgehens wird die gesuchte Nukleinsäure angereichtert. Nachteilig an diesen Verfahren ist, dass (a) pro Zelle mehrere Gene aufgenommen werden können (Mischung von Aktivitäten, Verlust einer klaren Aussage, Verminderung des spezifischen Signals etc); (b) nur wenige Zellen den gewünschten Effekt zeigen (keine statistischen Aussagen möglich); (c) nur schwer eine Automatisierung möglich ist, da kein linearer Weg vorhanden ist (zirkulierende Ansätze); (d) die DNA in den Zellen für eine spätere Isolierung intakt bleiben muß (bei z. B. Apoptose nicht durchführbar). Previous methods for identifying the activity of nucleic acid sequences include expression cloning, generally a gene library, d. H. a variety of different Nucleic acid sequences, together by transfection or Transformation is introduced into a population of target organisms. To Expression of the transfected or transformed nucleic acid individual target organisms that have a desired activity, e.g. B. Expression of an antigen for an antibody, etc., from the rest Target organisms physically separated. From those isolated in this way individual target organisms is the transfected or transformed DNA, the often present as an extrachromosomal plasmid, isolated and amplified, e.g. B. by multiplication in bacterial cells. From these bacterial cells we get the DNA was then isolated again and transfected into mammalian cells. Through several Rounding this procedure, the nucleic acid sought is enriched. The disadvantage of these methods is that (a) several genes per cell can be included (mix of activities, loss of a clear statement, reduction of the specific signal etc); (b) only a few Cells show the desired effect (no statistical statements possible); (c) Automation is difficult because there is no linear Path exists (circulating approaches); (d) the DNA in the cells for later isolation must remain intact (e.g. in the case of apoptosis not feasible).

Die deutsche Patentanmeldung 199 50 585.0 schlägt ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen vor, die in einer Zielzelle eine nichtselektionierbare Aktivität, insbesondere eine Apoptose-Aktivität aufweisen, wobei eine DNA-Bibliothek in Wirtszellen bereitgestellt wird, die einen Expressionsvektor in operativer Verknüpfung mit einer in einer Zielzelle aktiven Expressionkontrollsequenz enthalten, die Wirtszellen kultiviert werden, der Expressionsvektor aus den kultivierten Wirtszellen gewonnen wird, der Expressionsvektor und ein Reportervektor in eine Zielzelle eingebracht wird und die Aktivität des Reportervektors in den Zielzellen oder in deren Kulturüberstand als qualitatives oder quantitatives Maß für die nichtselektionierbare Aktivität der untersuchten Nukleinsäuresequenz bestimmt wird.German patent application 199 50 585.0 proposes a method for Identification of nucleic acid sequences prior to that in a target cell non-selectable activity, especially apoptosis activity which provide a DNA library in host cells which an expression vector in operative association with one in one Target cell contain active expression control sequence, the host cells be cultivated, the expression vector from the cultivated host cells is obtained, the expression vector and a reporter vector into one The target cell is introduced and the activity of the reporter vector in the Target cells or in their culture supernatant as qualitative or quantitative Measure of the non-selectable activity of the examined Nucleic acid sequence is determined.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Nukleinsäuresequenzen, welches auch Nukleinsäuresequenzen mit einer selektionierbaren Aktivität erfaßt.The present invention relates to a method for determination the activity of nucleic acid sequences, which also Detected nucleic acid sequences with a selectable activity.

Das Verfahren umfaßt die Schritte:
The process comprises the steps:

a) parallel introduction of a variety of expression vectors, the one nucleic acid to be examined in operative Link to an expression control sequence included in a Large number of separate populations of the same type Target organisms, each with only a single nucleic acid sequence or a small number of different nucleic acid sequences introduced into a separate population of similar target organisms becomes,
b) effecting expression of the nucleic acid sequence in the Target organisms and
c) determining the activity of the nucleic acid sequence in the individual Target organism populations.

Das Verfahren ist ein Screening-Ansatz zur parallelen Bestimmung einer Vielzahl von Nukleinsäuren. Aufgrund des Einbringens einer einzigen Nukleinsäuresequenz oder einer geringen Anzahl von Nukleinsäuresequenzen in jeweils separate Populationen von Zielorganismen entstehen Populationen von gleichbehandelten Zielorganismen, die eine sensitive Auswertung der Screens erlauben. Das Schicksal der in die Zielorganismen eingebrachten Nukleinsäuresequenzen ist dabei nicht relevant, da vorzugsweise nur ein Aliquot der zu untersuchenden Nukleinsäuresequenzen verwendet wird und der Rest für nachfolgende Untersuchungen zurückbehalten wird.The method is a screening approach for the parallel determination of a Variety of nucleic acids. Because of the introduction of one Nucleic acid sequence or a small number of nucleic acid sequences Populations arise in separate populations of target organisms of equally treated target organisms that have a sensitive evaluation of the Allow screens. The fate of those introduced into the target organisms Nucleic acid sequences are not relevant, since preferably only one Aliquot of the nucleic acid sequences to be examined is used and the rest will be retained for subsequent investigations.

Die zu untersuchenden Nukleinsäuresequenzen können grundsätzlich aus beliebigen Quellen stammen, z. B. aus Eukaryonten wie Pflanzen, Wirbeltieren z. B. Säugern, Pilzen, Parasiten etc., aber auch Bakterien, Archaea oder Viren oder aus synthetischen oder semisynthetischen Quellen. Sie werden beispielsweise aus genomischen Sequenzen, cDNA-Sequenzen, cDNA-Fragmenten oder Teilsequenzen oder auch aus synthetisch erzeugten Sequenzen wie etwa Antisense-Molekülen oder kombinatorisch modifizierten Nukleinsäuresequenzen beliebiger Herkunft oder für RNAi geeigneten Sequenzen ausgewählt.The nucleic acid sequences to be investigated can basically consist of any sources come from, e.g. B. from eukaryotes such as plants, Vertebrates z. B. mammals, fungi, parasites etc., but also bacteria, Archaea or viruses or from synthetic or semi-synthetic sources. For example, they are made up of genomic sequences, cDNA sequences, cDNA fragments or partial sequences or from synthetically generated Sequences such as antisense molecules or combinatorially modified Nucleic acid sequences of any origin or suitable for RNAi Sequences selected.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen mit beliebiger Aktivität, sofern diese in den mit den Nukleinsäuresequenzen transfizierten oder transformierten Zielorganismen bestimmt werden kann. Die Aktivität der Nukleinsäuresequenzen kann eine selektionierbare oder nichtselektionierbare Aktivität sein. Eine nicht selektionierbare Aktivität bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die betreffende Nukleinsäure nicht stabil in einem Zielorganismus rekombinant (über)-exprimiert werden kann, beispielweise weil sie das Wachstum der Zelle hemmt oder den Zelltod herbeiführt. Andererseits können selbstverständlich auch Nukleinsäuresequenzen mit einer selektionierbaren Aktivität bestimmt werden, wobei jedoch klargestellt werden muß, dass das erfindungsgemäße Verfahren keine Selektion, sondern eine Reihenuntersuchung an einer Vielzahl von transfizierten bzw. transformierten Zielorganismen umfaßt. Die Selektionierbarkeit drückt nur die theoretische Möglichkeit aus, den entsprechenden zellulären Effekt auch in einem Selektionsschema zur Isolation von Nukleinsäuren verwenden zu können. Vorteilhaft ist die Verwendung eines Screens, da dadurch die zuvor beschriebenen Nachteile einer Positiv-Selektion überwunden sind.The method according to the invention enables the determination of Nucleic acid sequences with any activity, provided that this in the with Nucleic acid sequences transfected or transformed target organisms can be determined. The activity of the nucleic acid sequences can be a selectable or non-selectable activity. Not one In this context, selectable activity means that the The nucleic acid in question is not recombinantly stable in a target organism (over) -expressed, for example because it is the growth of the Inhibits cell or causes cell death. On the other hand, you can of course also nucleic acid sequences with a selectable Activity must be determined, but it must be made clear that the The method according to the invention is not a selection but a Screening of a large number of transfected or transformed target organisms. The selectability only presses the theoretical possibility, the corresponding cellular effect too to use in a selection scheme for the isolation of nucleic acids can. It is advantageous to use a screen, as this is the previous one Disadvantages of positive selection described are overcome.

Bevorzugte Beispiele für die Aktivität von Nukleinsäuresequenzen sind die DNA-Reparatur, die transkriptionelle Aktivierung von Genen, die Aktivierung bzw. Hemmung der Sekretion von Proteinen oder der Aktivität von Proteasen, die Aktivierung oder Hemmung der Telomeraseaktivität, die Generation bzw. Aufhebung von Protein/Protein- oder Protein/DNA- Interaktionen etc.Preferred examples of the activity of nucleic acid sequences are DNA repair, the transcriptional activation of genes, the activation or inhibition of the secretion of proteins or the activity of Proteases, the activation or inhibition of telomerase activity, the Generation or abolition of protein / protein or protein / DNA Interactions etc.

Schritt (a) des Verfahrens besteht darin, eine Vielzahl von Expressionsvektoren bereitzustellen, die jeweils eine zu untersuchende Nukleinsäuresequenz in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz enthalten, und diese Vielzahl von Expressionsvektoren jeweils separat in eine Vielzahl von Populationen gleichartiger Zielorganismen einzubringen. Die Vielzahl von Expressionsvektoren kann eine DNA-Bibliothek sein.Step (a) of the process consists of a variety of To provide expression vectors, each one to be examined Nucleic acid sequence operatively linked to a Expression control sequence included, and this variety of Expression vectors each separately in a variety of populations to introduce similar target organisms. The multitude of Expression vectors can be a DNA library.

Diese DNA-Bibliothek ist vorzugsweise - insbesondere wenn es sich um eine cDNA-Bibliothek handelt - eine normalisierte Bibliothek, d. h. eine Bibliothek, die an abundanten Spezies abgereichert ist. Die Herstellung solcher normalisierten Bibliotheken wurde von Sasaki et al. (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 9987-9992) beschrieben. Die Abreicherung abundanter Spezies in einer Population von mRNA-Molekülen wird durch Zugabe von beispiels weise auf Latexbeads immobilisierten cDNA Molekülen, gegebenenfalls in mehreren Hybridisierungsrunden erreicht. Es können jedoch auch nicht normalisierte DNA-Bibliotheken als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, z. B. Bibliotheken, die eine Kollektion von definierten Nukleinsäuren wie etwa Genen enthalten.This DNA library is preferred - especially if it is one cDNA library is a normalized library, i.e. H. a library, which is depleted in abundant species. The production of such normalized libraries were developed by Sasaki et al. (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 9987-9992). The depletion of abundant species in A population of mRNA molecules is created by adding examples cDNA molecules immobilized on latex beads, optionally in achieved several rounds of hybridization. However, neither can normalized DNA libraries are used as starting material, e.g. B. Libraries that have a collection of defined nucleic acids such as Genes included.

Dabei ist es möglich - nach Feststellung der weitgehenden oder vollständigen genomischen Sequenzen oder aller exprimierten Sequenzen eines Organismus - Genbibliotheken zu verwenden, die jedes Gen nur ein einziges Mal beinhalten. Anstatt abundante Gene abzureichern, geht man hier von der Kollektion aller transkribierten Sequenzen aus und stellt die Bibliothek entsprechend zusammen. Solche Genbibliotheken werden gerade aufgebaut und sollen jedes Gen einer Spezies in einer exprimierbaren Form enthalten (Strausberg et al., Science 286 (1999), 455-457).It is possible - after determining the extensive or complete genomic sequences or all expressed sequences of an organism - to use gene libraries that contain only one gene include only once. Instead of depleting abundant genes, you go here from the collection of all transcribed sequences and presents the Library together accordingly. Such gene libraries are just now and are designed to express each gene of a species in an expressible form included (Strausberg et al., Science 286 (1999), 455-457).

Die zu untersuchenden Nukleinsäuresequenzen befinden sich in einem Expressionsvektor, der in dem jeweils gewünschten Zielorganismus, vorzugsweise einer eukaryontischen Zelle oder einem eukaryontischen Organismus, und insbesondere einer Säugerzelle aktiv ist, d. h. die zu untersuchende Nukleinsäure steht auf dem Expressionsvektor in operativer Verknüpfung mit einer im Zielorganismus konstitutiv oder regulierbar aktiven Expressionskontrollsequenz. Da eine Selektion des Expressionsvektors im Zielorganismus nicht durchgeführt werden muß, ist das Vorhandensein von Elementen, die eine Selektion im Zielorganismus erlauben, nicht notwendig. In manchen Ausführungsformen ist das Fehlen von Elementen, die eine Selektion im Zielorganismus erlauben, sogar bevorzugt.The nucleic acid sequences to be examined are in one Expression vector, which is in the desired target organism, preferably a eukaryotic cell or a eukaryotic cell Organism, and in particular a mammalian cell, d. H. the too Examining nucleic acid is operational on the expression vector Link with an active or constitutively active in the target organism Expression control sequence. Since a selection of the expression vector in Target organism does not need to be carried out is the presence of Elements that allow selection in the target organism are not necessary. In some embodiments, the lack of elements is one Allow selection in the target organism, even preferred.

Der Expressionsvektor ist zweckmäßigerweise ein extrachromosomaler Vektor und insbesondere ein transient transfizierbares Plasmid. Alternativ kann jedoch auch ein stabiler episomaler Expressionsvektor eingesetzt werden. Derartige Expressionsvektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt und beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder in anderen Standardlehrbüchern beschrieben. The expression vector is expediently an extrachromosomal one Vector and in particular a transiently transfectable plasmid. Alternatively however, a stable episomal expression vector can also be used become. Such expression vectors are known to those skilled in the art known in molecular biology and for example in Sambrook et al., Molecular cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, or described in other standard textbooks.

Die Expressionsvektoren können auf beliebige Weise erzeugt werden, beispielsweise durch Kultivierung in Wirtszellen, bei denen es sich vorzugsweise um Bakterienzellen, insbesondere um gramnegative Bakterien und besonders bevorzugt E.coli Zellen handelt. In diesem Fall enthält der Expressionsvektor zweckmäßigerweise Elemente, die eine Replikation und Selektion in der Wirtszelle ermöglichen. Die Kultivierung der Wirtszellen erfolgt vorzugsweise einzeln, beispielsweise durch Ausplattieren von einzelnen Klonen einer Nukleinsäurebibliothek auf festen Kulturplatten oder entsprechende Verdünnung flüssiger Kulturmedien. Gegebenenfalls können auch mehrere Wirtszellen, z. B. kleine Pools von maximal bis zu zehn verschiedenen Klonen gemeinsam kultiviert werden, obwohl dies in den meisten Fällen weniger bevorzugt ist.The expression vectors can be generated in any way, for example, by culturing in host cells that are preferably around bacterial cells, in particular around gram-negative bacteria and particularly preferably E.coli cells. In this case, the Expression vector expediently elements that require replication and Enable selection in the host cell. The cultivation of the host cells is preferably carried out individually, for example by plating out individual clones of a nucleic acid library on solid culture plates or appropriate dilution of liquid culture media. If necessary, you can also several host cells, e.g. B. small pools of up to ten different clones are cultivated together, although this is in the is less preferred in most cases.

Zur Gewinnung der DNA aus Wirtszellen können aus dem Stand der Technik bekannte Methoden zur Isolierung extrachromosomaler DNA (siehe z. B. Sambrook et al., supra) eingesetzt werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die aus der Wirtszelle isolierte DNA eine ausreichende Reinheit aufweisen sollte, um die spätere Transfektion des Zielorganismus mit hoher Effizienz zu ermöglichen. Bei bakteriellen Wirtszellen wird vorzugsweise eine alkalische Lyse durchgeführt. Die Qualität der erhaltenen Plasmid-DNA kann durch Adsorption an eine feste Matrix, insbesondere eine Silika- Adsorptionsmatrix, Waschen mit organischen Lösungsmitteln und anschließende Elution verbessert werden. Die Expressionsvektoren können in zirkulärer oder in linearer Form in die Zellen eingeführt werden.To obtain the DNA from host cells can from the prior art Known methods for isolating extrachromosomal DNA (see e.g. Sambrook et al., Supra) can be used. However, it should be noted that the DNA isolated from the host cell is of sufficient purity should have to the later transfection of the target organism with high Enable efficiency. In bacterial host cells, one is preferred performed alkaline lysis. The quality of the plasmid DNA obtained can by adsorption on a solid matrix, especially a silica Adsorption matrix, washing with organic solvents and subsequent elution can be improved. The expression vectors can are introduced into the cells in circular or linear form.

Alternativ können die Expressionsvektoren auch durch in vitro Amplifikation in ausreichender Menge erzeugt werden, z. B. durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR) oder Rolling-Circle- Amplifikation.Alternatively, the expression vectors can also be amplified in vitro are generated in sufficient quantity, e.g. B. by polymerase Chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR) or rolling circle Amplification.

Weiterhin beinhaltet Schritt (a) das Einbringen eines Expressionsvektors in eine Population von gleichartigen Zielorganismen, wobei vorzugsweise jeweils nur ein einziger Expressionsvektor in eine solche Population von Zielorganismen eingebracht wird. Bevorzugt werden als Zielorganismus eukaryontische Zellen wie etwa Säugerzellen, insbesondere humanen Zellen, aber auch Pilze wie Hefen, Parasiten wie Trypanosomen etc. verwendet. Vorteilhaft ist die Verwendung von intakten Organismen gegenüber Zellkulturen, da sich viele Krankheiten und zelluläre Effekte erst in dem Zwischenspiel vieler verschiedenen Zelltypen in einem höheren Organismus beobachten lassen. Auch Zielorganismen prokaryontischen Ursprungs, z. B. Bakterienzellen können eingesetzt werden. Von prokaryontischen Organismen werden vorzugsweise Pathogene verwendet, deren Physiologie sich durch diesen Screen untersuchen lässt, vor allem auch im Hinblick auf therapeutische Eingriffe. Dazu können z. B. einzelne Schritte im Vermehrungszyklus untersucht werden, wie die Ausbildung von Oberflächenstrukturen zum Anheften und Eindringen in die Wirtszelle. Mit diesem Screen sind Nukleinsäuren für Proteine isolierbar, die hemmend auf die Ausprägung des jeweiligen zellulären Effekts der (pathogenen) Organismen wirken. Dies ist vor allem von Vorteil, wenn Vorgänge bei Zellen untersucht werden, die keinem starken Selektionsdruck unterliegen, da sie für deren Überleben nicht essentiell sind (z. B. Anheftungsrezeptoren). Ebenso können komplexere Organismen mit Ausnahme des Menschen als Zielorganismus eingesetzt werden, z. B. Zebrafische, Mäuse, Drosophila oder Nematoden wie C. elegans. Dabei kann die Quelle der zu untersuchenden Nukleinsäuren und der Zielorganismus gleich oder verschieden, z. B. unterschiedliche Säugerspezies, sein.Step (a) also includes the introduction of an expression vector into a population of similar target organisms, preferably only a single expression vector in such a population of Target organisms are introduced. Are preferred as the target organism eukaryotic cells such as mammalian cells, especially human cells, but also fungi such as yeasts, parasites such as trypanosomes etc. are used. The use of intact organisms is advantageous compared to Cell cultures, since many diseases and cellular effects only Interplay of many different cell types in a higher organism watch. Target organisms of prokaryotic origin, e.g. B. Bacterial cells can be used. From prokaryotic Organisms are preferably used pathogens, their physiology can be examined using this screen, especially with regard to therapeutic interventions. For this, e.g. B. individual steps in Propagation cycle will be examined as the training of Surface structures for attaching and penetrating into the host cell. With This screen isolates nucleic acids for proteins that are inhibitory the expression of the respective cellular effect of the (pathogenic) Organisms work. This is especially beneficial when doing operations at Cells are examined that are not subject to strong selection pressure, since they are not essential for their survival (e.g. attachment receptors). Likewise, more complex organisms with the exception of humans than Target organism are used, e.g. B. zebra fish, mice, Drosophila or Nematodes such as C. elegans. The source can be examined Nucleic acids and the target organism are the same or different, e.g. B. different mammalian species.

Die Zielorganismen können gegebenenfalls mutiert oder genetisch manipuliert sein, d. h. sie können - im Vergleich zu einem entsprechenden Wildtyporganismus - eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, gegebenenfalls organismusfremde Nukleinsäuresequenzen, überexprimieren. Alternativ können auch Zielorganismen verwendet werden, bei denen - gegenüber dem Wildtyp - eine Nukleinsäuresequenz nur im verringerten Ausmaß, nur im geringen Ausmaß, gar nicht oder in einer mutierten Form exprimiert wird. Hefe, C. elegans und Drosophila sind in der Genetik als Modellorganismen seit langem etabliert. Es kann daher auf viele Mutationen zurückgegriffen werden, die man in den Screen einsetzen kann (Hartwell et al., Science 248 (1997), 1064-1068). Diese entsprechen zum Teil Mutationen, die als ursächlich für humane Krankheiten erkannt sind. Alternativ können solche Mutationen in diesen Modellorganismen erzeugt werden. Diese genetisch bedingten Defekte lassen sich durch die Einbringung von komplementierenden Nukleinsäuren mit dem hier beschriebenen Screen beheben. Dies kann zu einer raschen Aufklärung der für bestimmte Mutationen verantwortlichen Gene führen. Andererseits können auch Nukleinsäuren isoliert werden, die die ursprünglichen Defekte korrigieren, ohne selbst das ursprünglich mutierte Gen zu sein ("Kompensation"). Vorteilhaft ist die Verwendung dieses Screens, da die disregulierte Expression von vielen Genen - und damit auch von solchen, die Mutationen komplementieren können - für Organismen in späteren Entwicklungsstadien oft lethal und damit nicht durch eine konventionelle positive Selektion isolierbar ist.The target organisms can optionally be mutated or genetic be manipulated, d. H. they can - compared to a corresponding one Wild type organism - one or more nucleic acid sequences, if necessary, overexpress nucleic acid sequences foreign to the organism. Alternatively, target organisms can be used in which - compared to the wild type - a nucleic acid sequence only in the reduced Extent, only to a small extent, not at all or in a mutated form is expressed. Yeast, C. elegans and Drosophila are considered to be genetics Model organisms have long been established. It can therefore be due to many mutations that can be used in the screen (Hartwell et al., Science 248 (1997), 1064-1068). These correspond in part Mutations that are recognized as the cause of human diseases. Alternatively, such mutations can be generated in these model organisms become. These genetic defects can be caused by the Introduction of complementary nucleic acids with the here Fix the described screen. This can lead to a quick clarification of the genes responsible for certain mutations. On the other hand can also isolate nucleic acids that are the original defects correct without being the originally mutated gene itself ("Compensation"). It is advantageous to use this screen because the disregulated expression of many genes - and thus also those that Can complement mutations - for organisms in later Developmental stages often lethal and therefore not by a conventional one positive selection can be isolated.

In mehreren Organismen wurde "RNA Interference (RNAi)" beschrieben. Dabei wird das endogene Gen durch Expression von doppelsträngiger RNA inaktiviert (Bosher and Labouesse, Nat. Cell. Biol. 2 (2000), E31-36). Der hier beschriebene Screen eignet sich besonders gut für die Durchführung einer genetischen Detektion von Genen, deren Inaktivierung zu detektierbaren Veränderungen führt. Dies kann sowohl in intakten Organismen als auch in Zelllinien durchgeführt werden. Geeignet sind auch Organismen und Zelllinien, die genetisch so manipuliert worden sind, dass RNAi möglich ist. C. elegans eignet sich für solche Untersuchungen besonders, da die entsprechenden Gensequenzen nur durch Verfüttern von Bakterien, die die Klone aus einer Genbibliothek enthalten, in diesem Organismus exprimiert werden können. Dies geschieht offensichtlich durch Aufnahme der Bakterien im Darm der Tiere und durch den Aufschluß und die Freisetzung der DNA in C. elegans (Timmons and Fire, Nature 395 (1998), 854). RNAi benötigt Doppelstrang-RNA. In dem hier vorgeschlagenen Screen wird aber nur die sense-RNA von dem jeweiligen Plasmid generiert. Um RNAi für diesen Screen zu adaptieren, ist es daher notwendig, Plasmide zu verwenden, die die cDNAs mit zwei flankierenden (5' und 3') Promotoren enthalten. Dadurch sollten statistisch gleiche Mengen von sense- und antisense-RNA gebildet werden, die über RNAi zum Knock out des entsprechenden endogenen Gens führen. Der Read-Out kann anschließend durch digitale Hochdurchsatz-Bildverarbeitungssysteme wie z. B. dem "HTS Cell Imaging System" von Becton Dickinson erreicht werden."RNA Interference (RNAi)" has been described in several organisms. The endogenous gene is expressed by expression of double-stranded RNA inactivated (Bosher and Labouesse, Nat. Cell. Biol. 2 (2000), E31-36). The the screen described here is particularly suitable for implementation a genetic detection of genes, the inactivation of which leads to detectable changes. This can be both intact Organisms can also be carried out in cell lines. Are also suitable Organisms and cell lines that have been genetically engineered so that RNAi is possible. C. elegans is suitable for such examinations especially since the corresponding gene sequences can only be obtained by feeding Bacteria that contain the clones from a gene library in this one Organism can be expressed. This obviously happens through Absorption of the bacteria in the intestine of the animals and by the digestion and the release of the DNA in C. elegans (Timmons and Fire, Nature 395 (1998), 854). RNAi requires double-stranded RNA. In this one The proposed screen is only the sense RNA of the respective one Plasmid generated. It is therefore to adapt RNAi for this screen necessary to use plasmids that flank the cDNAs with two (5 'and 3') promoters included. This should result in statistically equal amounts of sense and antisense RNA are formed, which via RNAi to knock lead out of the corresponding endogenous gene. The read-out can then through high throughput digital imaging systems such as e.g. B. the "HTS Cell Imaging System" from Becton Dickinson.

In bestimmten Fällen ist die Verwendung von Zielorganismen bevorzugt, die einen Reportervektor enthalten. Alternativ kann ein Reportervektor auch zusammen mit dem Expressionsvektor in den Zielorganismus eingebracht werden.In certain cases, the use of target organisms is preferred contain a reporter vector. Alternatively, a reporter vector can also be used introduced into the target organism together with the expression vector become.

Das Einbringen von Expressionsvektor und gegebenenfalls Reportervektor in die Zielorganismen erfolgt nach grundsätzlich aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zur (Co)transfektion, (Co)transformation oder (Co)infektion von Zellen. Dabei sollte jedoch eine Methode gewählt werden, die eine hohe Effizienz des Einbringens von Fremdnukleinsäuren in den Zielorganismus erlaubt, z. B. eine Effizienz von mindestens 1%.The introduction of expression vector and, if necessary, reporter vector into the target organisms is basically done from the state of the art known methods for (co) transfection, (co) transformation or (Co) infection of cells. However, a method should be chosen which are highly efficient in introducing foreign nucleic acids into the Target organism allowed, e.g. B. an efficiency of at least 1%.

Bei eukaryontischen Zielzellen erfolgt die Transfektion bzw. Cotransfektion vorzugsweise durch Calciumphosphat-Copräzipitation, Lipofektion, Elektroporation, Partikelbeschuß, Verwendung von Bakterienproteinen oder virale Infektion (Retroviren, Adenoviren, Sendaiviren etc.). In den durch Transfektion oder Cotransfektion erzeugten Zielzellen kann der Expressionsvektor transient, der Reportervektor transient oder stabil exprimiert werden. Eine transiente Expression ist bevorzugt.In eukaryotic target cells, transfection or cotransfection takes place preferably by calcium phosphate coprecipitation, lipofection, Electroporation, particle bombardment, use of bacterial proteins or viral infection (retroviruses, adenoviruses, Sendai viruses etc.). In the through Transfection or cotransfection can be generated by the target cells Expression vector transient, the reporter vector transient or stable be expressed. Transient expression is preferred.

Bei der bevorzugten Cotransfektion wird der Expressionsvektor günstigerweise in einem molaren Überschuß bezüglich des Reportervektors eingesetzt. Besonders bevorzugt beträgt das Molverhältnis zwischen Reportervektor und Expressionsvektor 1 : 2 bis 1 : 20. Bei Verwendung des Expressionsvektors im molaren Überschuß kann die Anwesenheit des Reportervektors im Zielorganismus als Marker für das gleichzeitige Vorhandensein des Expressionsvektors im Zielorganismus dienen, da Organismen bei einer Cotransfektion die eingesetzten Plasmide entsprechend ihrem Molverhältnis im Cotransfektionsansatz aufnehmen.In the preferred cotransfection, the expression vector conveniently in a molar excess with respect to the reporter vector used. The molar ratio is particularly preferably between Reporter vector and expression vector 1: 2 to 1: 20. When using the Expression vector in molar excess can the presence of Reporter vector in the target organism as a marker for the simultaneous Presence of the expression vector in the target organism serve as Organisms in a cotransfection the plasmids used according to their molar ratio in the cotransfection batch.

Der Reportervektor wird vorzugsweise so gewählt, dass kein unmittelbarer funktioneller Zusammenhang zwischen Reporter- und Expressionsvektor besteht, d. h. dass ein von dem Expressionsvektor kodiertes Genprodukt nicht direkt auf die Aktivität des Reportervektors wirkt, sondern dass ein vom Expressionsvektor kodiertes Genprodukt nur mittelbar, d. h. über eine Beeinflußung des Metabolismus des Zielorganismus auf die Aktivität des Reprotervektors wirkt. Es sind jedoch auch Ausführungsformen des Screens möglich, welche eine Detektion von direkten Interaktionen zwischen Reportervektor und Expressionsvektor erlauben.The reporter vector is preferably chosen so that no immediate one functional relationship between reporter and expression vector exists, d. H. that a gene product encoded by the expression vector does not directly affect the activity of the reporter vector, but that one Gene product encoded by the expression vector only indirectly, d. H. over a Influencing the metabolism of the target organism on the activity of the Protector vector works. However, there are also embodiments of the screen possible, which is a detection of direct interactions between Allow reporter vector and expression vector.

Der zusammen mit dem Expressionsvektor cotransfizierte oder bereits im Zielorganismus vorhandene Reportervektor enthält im allgemeinen eine für ein nachweisbares Genprodukt kodierende Nukleinsäuresequenz in einer im Zielorganismus exprimierbaren Form. Der Reportervektor ist vorzugsweise ein extrachromosomaler Vektor, besonders bevorzugt ein transient transfizierbares Plasmid. Andererseits kann auch ein stabiler episomaler oder chromosomaler Reportervektor eingesetzt werden. In diesem Fall enthält der Reportervektor Elemente, die eine Selektion und gegebenenfalls eine Replikation in dem Zielorganismus ermöglichen. Die Expression des nachweisbaren Genprodukts kann über eine konstitutive oder regulierbare Expressionskontrollsequenz, vorzugsweise über eine konstitutive Expressionskontrollsequenz erfolgen. The one co-transfected with the expression vector or already in the Target organism present reporter vector generally contains one for a detectable gene product encoding nucleic acid sequence in an im Target organism expressible form. The reporter vector is preferred an extrachromosomal vector, particularly preferably a transient transfectable plasmid. On the other hand, a stable episomal or chromosomal reporter vector can be used. In this case, the Reporter vector elements that include a selection and possibly a Allow replication in the target organism. The expression of the Detectable gene product can be constitutive or regulatable Expression control sequence, preferably via a constitutive Expression control sequence take place.

Das vom Reportervektor kodierte Genprodukt ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein sezerniertes Enzym, d. h. ein Enzym, welches vom Zielorganismus sekretiert wird. Beispiele für solche Enzyme sind die Sezernierte Alkalische Phosphatase (SEAP) (Berger et al., Gene 66 1988), 1-10)) sowie die Luziferase (Lui et al., Gene 202 (1977), 141-148). Besonders bevorzugt wird die SEAP als sezerniertes Enzym verwendet. Bei Verwendung sezernierter Genprodukte als Reportersystem erfolgt die Bestimmung der Aktivität im Kulturüberstand von Zielzeilen. Andererseits kann das vom Reportervektor kodierte nachweisbare Genprodukt auch ein nicht sekretiertes Polypeptid sein, welches intrazellulär in einer intakten Zelle nachweisbar ist, beispielsweise ein Fluoreszenzprotein wie GFP. Ebenso kann das vom Reportervektor exprimierte nachweisbare Genprodukt auch ein membranständiges, z. B. durch Inkubation mit Antikörpern oder Affinitätsliganden nachweisbares Polypeptid sein.The gene product encoded by the reporter vector is special in one preferred embodiment a secreted enzyme, d. H. an enzyme which is secreted by the target organism. Examples of such enzymes are the secreted alkaline phosphatase (SEAP) (Berger et al., Gene 66 1988), 1-10)) and luciferase (Lui et al., Gene 202 (1977), 141-148). The SEAP is particularly preferably used as a secreted enzyme. At The secreted gene products are used as a reporter system Determination of activity in the culture supernatant from target lines. On the other hand the detectable gene product encoded by the reporter vector can also be used non-secreted polypeptide, which is intracellular in an intact cell is detectable, for example a fluorescent protein such as GFP. As well the detectable gene product expressed by the reporter vector can also a membrane, e.g. B. by incubation with antibodies or Affinity ligand detectable polypeptide.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt im übrigen auch die Verwendung mehrerer Reportervektoren, von denen einer bereits (chromosomal oder extrachromosomal) im Zielorganismus vorliegt und ein anderer mittels Co transfektion zusammen mit dem Expressionsvektor in den Zielorganismus eingeführt wird. Dadurch wird vermieden, dass zuviel DNA als Reporterplasmid eingesetzt werden muss und nicht genug DNA der zu testenden Gene aus der Bibliothek. So kann z. B. das cotransfizierte Plasmid für eine nukleäre GFP-Variante kodieren, die verwendet wird, um die transfizierten Zellen zu identifizieren. In den Zellen wird bereits ein Fusionsprotein mit einer anderen spektralen Variante von GFP stabil exprimiert, das im Cytoplasma lokalisiert ist. Entsprechende Varianten von GFP sind in der einschlägigen Literatur beschrieben (Haseloff, Meth. Cell. Biol. 58 (1999), 139-151). Kann eines der Gene aus der Bibliothek dazu führen, dass das Fusionsprotein in den Kern transloziert wird, so ist das durch die Überlagerung der verschiedenen Emissionen der beiden GFP Varianten durch entsprechende Bildverarbeitungsprogramme zu detektieren. The method according to the invention also allows use several reporter vectors, one of which is already (chromosomal or extrachromosomal) is present in the target organism and another by means of Co transfection together with the expression vector into the target organism is introduced. This prevents too much DNA from being Reporter plasmid must be used and not enough DNA too testing genes from the library. So z. B. the cotransfected plasmid encode a nuclear GFP variant used to generate the identify transfected cells. One is already in the cells Fusion protein stable with another spectral variant of GFP expressed, which is localized in the cytoplasm. Corresponding variants of GFP are described in the relevant literature (Haseloff, Meth. Cell. Biol. 58 (1999), 139-151). Can add one of the genes from the library cause the fusion protein to be translocated into the nucleus, that is it by superimposing the different emissions of the two CFPs Detect variants using appropriate image processing programs.

Darüber hinaus können Zellen verwendet werden, in die Reporterplasmide an definierten Positionen im Genom stabil integriert werden. Durch solche "knock-in" Experimente wird ein endogenes Gen durch das Reporterplasmid ersetzt (Elefanty et al., PNAS USA 95 (1998), 11897-11902). Dessen Aktivität spiegelt dann die transkriptionelle Aktivierung des ersetzten Gens wieder. Stabil transfizierte Zellen können auch zum Test auf Telomeraseaktivität benutzt werden. Dazu kann ein Reporterplasmid in die Telomere stabil integriert werden. Wenn die Länge der Telomere verringert wird, so sollte auch die Aktivität des Reporterplasmids verringert oder (wenn nur eines vorliegt) ganz reduziert werden. Weiter können Zelllinien verwendet werden, die GFP-Fusionsproteine von sezernierten Proteinen exprimieren. Da die Proteine sezerniert werden, ist keine Fluoreszenz in den Zellen zu beobachten. Werden die Zellen mit Genen transfiziert, die zur Hemmung der Sekretion führen, so ist das durch eine Zunahme der GFP- Fluoreszenz zu beobachten. Dies wurde durch die physikalische Hemmung des Transportes von einem GFP-Fusionsprotein bereits gezeigt (Kaether and Gerdes, FEBS Lett. 369 (1995), 267-271). Mehrere Krankheiten beruhen auf einer erhöhten Sekretion von Proteinen (z. B. Alzheimer Krankheit). Umgekehrt können Gene identifiziert werden, die zur Reifung von sezernierten Proteinen führen: die Aktivität des Proteins kann dann durch geeignete Methoden im Medium detektiert werden. Dabei kann es sich um Fusionsproteine mit katalytischen Eigenschaften handeln. Alternativ kann auch die Abnahme der Fluoreszenz von GFP-Fusionsproteinen im Cytoplasma der Zellen bestimmt werden.In addition, cells can be used in the reporter plasmids be stably integrated at defined positions in the genome. Through such "Knock-in" experiments become an endogenous gene through the reporter plasmid replaced (Elefanty et al., PNAS USA 95 (1998), 11897-11902). Whose Activity then reflects the transcriptional activation of the replaced gene again. Stably transfected cells can also be used for testing Telomerase activity can be used. A reporter plasmid can be used in the Telomeres can be integrated stably. When the length of the telomeres decreases the activity of the reporter plasmid should be reduced or (if there is only one) can be reduced completely. Cell lines can continue used the GFP fusion proteins from secreted proteins express. Since the proteins are secreted, there is no fluorescence in the To watch cells. Are the cells transfected with genes that are used for Inhibition of secretion, this is due to an increase in GFP To observe fluorescence. This was due to the physical inhibition transport of a GFP fusion protein has already been shown (Kaether and Gerdes, FEBS Lett. 369 (1995), 267-271). Several diseases are based on an increased secretion of proteins (e.g. Alzheimer's disease). Conversely, genes can be identified that are responsible for the maturation of secreted proteins: the activity of the protein can then by suitable methods can be detected in the medium. It can be Act fusion proteins with catalytic properties. Alternatively, you can also the decrease in fluorescence from GFP fusion proteins in Cytoplasm of the cells can be determined.

Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet die Expression der Nukleinsäuresequenz in den Zielorganismen. Hierzu werden - abhängig von den jeweils verwendeten Expressionsvektoren - Zielorganismen unter geeigneten Bedingungen kultiviert, die eine Expression der mit der Expressionskontrollsequenz des Expressionsvektors operativ verknüpften, zu testenden Nukleinsäuresequenz erlauben. Durch die bevorzugte Expression von nur einer einzigen Nukleinsäureart pro Population von Zielorganismen kann eine besonders effiziente Expressionsleistung erzielt werden.Step (b) of the method according to the invention includes the expression of the Nucleic acid sequence in the target organisms. For this - depending on the expression vectors used in each case - target organisms under suitable conditions cultivated, the expression of which with the Expression control sequence of the expression vector operatively linked, allow nucleic acid sequence to be tested. By the preferred Expression of only one nucleic acid type per population of Target organisms can achieve particularly efficient expression performance become.

Schritt (c) des Verfahrens beinhaltet die Bestimmung der Aktivität der Nukleinsäuresequenz in den einzelnen Populationen von Zielorganismen. Die Bestimmung beinhaltet jeweils eine separate Untersuchung einzelner Zielorganismuspopulationen, vorzugsweise von jeweils mehreren Zielorganismen und besonders bevorzugt im wesentlichen allen Zielorganismen der Gesamtpopulation. Die Größe der Gesamtpopulation ist von der jeweiligen Zielorganismen abhängig. Wenn es sich bei den Zielorganismen um Zellen handelt, beträgt die Populationsgröße vorzugsweise von etwa 10² bis 10⁶ bei Eukaryontenzellen und vorzugsweise von etwa 10⁵ bis 10¹⁰ bei Prokaryontenzellen. Bei komplexeren Zielorganismen ist die Populationsgröße selbstverständlich geringer und sollte etwa 2 bis 10° betragen.Step (c) of the method involves determining the activity of the nucleic acid sequence in the individual populations of target organisms. The determination includes a separate examination of individual target organism populations, preferably of several target organisms in each case, and particularly preferably essentially all target organisms of the total population. The size of the total population depends on the target organism. When the target organisms are cells, the population size is preferably from about 10 ² to 10 ⁶ for eukaryotic cells and preferably from about 10 ⁵ to 10 ¹⁰ for prokaryotic cells. With more complex target organisms, the population size is of course smaller and should be about 2 to 10 °.

Die Bestimmung der biologischen Aktivität der Nukleinsäuresequenz kann grundsätzlich die Bestimmung beliebiger phänotypisch erkennbarer Effekte, z. B. morphologische Veränderungen, verändertes Wachstumsverhalten, etc. umfassen. Falls der Zielorganismus einen Reportervektor enthält, können Änderungen in der Aktivität des Reportervektors, d. h. insbesondere des vom Reportervektor kodierten Genprodukts, als Maß für die Aktivität der untersuchten Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Diese Bestimmungsmethode beruht darauf, dass die auf dem Expressionsvektor befindliche zu untersuchende Nukleinsäuresequenz im Zielorganismus nach Expression einen Einfluß auf den Zellmetabolismus aufweist, der wiederum die Aktivität des Reportervektors bzw. des von ihm kodierten nachweisbaren Genprodukts auf meßbare Weise beeinflußt. Dabei kann die Aktivität des Reportervektors an mindestens zwei Punkten nach der Transfektion oder Cotransfektion bestimmt werden, wobei der erste Zeitpunkt so gewählt wird, dass eine Expression der auf dem Expressionsvektor enthaltenen Nukleinsäuresequenz noch keinen Einfluß auf die Aktivität des Reportervektors hat, und somit dazu dienen kann, eine Basisaktivität für den jeweils untersuchten Zielorganismus festzulegen. Der zweite Zeitpunkt wird so gewählt, dass eine Expression der auf dem Expressionsvektor enthaltenen Nukleinsäuresequenz bereits einen meßbaren Einfluß auf die Aktivität des Reportervektors hat - sofern die im jeweiligen Organismus vorhandene Nukleinsäuresequenz die untersuchte Aktivtät aufweist. Auf diese Weise kann unabhängig von der Basisaktivtät des Reportervektors, die von der Transfektionseffizienz bei der Transfektion oder Cotransfektion abhängt, die Aktivität einer in einen bestimmten Organismus eingeführten Nukleinsäuresequenz bestimmt werden.The biological activity of the nucleic acid sequence can be determined basically the determination of any phenotypically recognizable effects, e.g. B. morphological changes, changed growth behavior, etc. include. If the target organism contains a reporter vector, Changes in the activity of the reporter vector, d. H. especially that of Reporter vector encoded gene product, as a measure of the activity of the investigated nucleic acid sequence can be used. This Determination method is based on that on the expression vector located nucleic acid sequence to be examined in the target organism Expression has an impact on cell metabolism, which in turn the activity of the reporter vector or the code encoded by it detectable gene product in a measurable way. The Activity of the reporter vector at at least two points after the Transfection or cotransfection can be determined, the first Time is chosen so that an expression of the on the Expression vector contained nucleic acid sequence still have no effect has the activity of the reporter vector, and can thus serve one Determine the basic activity for the target organism examined. The second point in time is chosen so that an expression of the on the Expression vector already contain a measurable nucleic acid sequence Has influence on the activity of the reporter vector - if that in the respective The nucleic acid sequence present in the organism is the investigated activity having. In this way, regardless of the basic activity of the Reporter vector by the transfection efficiency in transfection or Cotransfection depends on the activity of a particular organism introduced nucleic acid sequence can be determined.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Nuklein säuresequenzen eingesetzt wird, die einen Einfluß auf sekretorische Eigenschaften der Zielzelle haben, ist die Messung der Aktivität des Reportervektors im Zellüberstand zur Identifizierung der gewünschten Nukleinsäuresequenzen ausreichend. In anderen Ausführungsformen des Verfahrens kann das vom Reportervektor kodierte nachweisbare Genprodukt, z. B. ein Fluoreszenzprotein wie GFP, intrazellulär zur Markierung der transfizierten Organismen exprimiert werden. Diese Markierung kann gegebenenfalls mit der Detektion zusätzlicher zellulärer Parameter, z. B. Detektion von Oberflächenmarkern mit Antikörpern oder Rezeptorliganden, kombiniert werden. Zur Detektion dieser zusätzlichen Parameter können fluoreszierende Reagenzien eingesetzt werden. Das Vorhandensein, die subzelluläre Verteilung oder/und die Intensität der Markierung(en) auf den Organismen können dann durch Fluoreszenzcytometrie, z. B. mittels FACS (Fluorescence activated cell sorting) oder Imaging Assays bestimmt werden.If the method according to the invention for the identification of nuclein acid sequences is used, which has an influence on secretory Have properties of the target cell is the measurement of the activity of the Reporter vector in the cell supernatant to identify the desired Nucleic acid sequences sufficient. In other embodiments of the The method that can be detected by the reporter vector can be detected Gene product, e.g. B. a fluorescent protein such as GFP, intracellular to Labeling of the transfected organisms are expressed. This Labeling may be additional with the detection of cellular Parameters, e.g. B. detection of surface markers with antibodies or Receptor ligands can be combined. To detect this additional Parameters can be used with fluorescent reagents. The Presence, subcellular distribution and / or intensity of Marking (s) on the organisms can then by Fluorescence cytometry, e.g. B. using FACS (Fluorescence activated cell sorting) or imaging assays.

Das Verfahren kann als zumindest teilweise automatisierter Reihenscreen durchgeführt werden, wobei vorzugsweise die Schritte (a) bis (c) an mindestens 50 Populationen von Zielorganismen jeweils parallel durchgeführt werden. The method can be an at least partially automated row screen are carried out, steps (a) to (c) preferably being carried out at least 50 populations of target organisms each in parallel be performed.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren als Mehrstufen-Protokoll durchgeführt. Dabei werden insbesondere Nukleinsäuresequenzen bestimmt, die die Ausprägung einer bestimmten physiologischen Reaktion des Zielorganismus verhindern bzw. hemmen oder verstärken bzw. auslösen können. Hierzu wird den Zielorganismen ein Stimulus, z. B. ein Pharmacon oder therapeutischer Wirkstoff, zugegeben, dessen Aktivität durch die zu untersuchende Nukleinsäure beeinflusst werden kann. Die Zugabe des Stimulus, bei dem es sich um eine oder mehrere physiologisch wirksame Substanzen, z. B. Rezeptorliganden, Arzneimittel, Cytokine etc. handeln kann, kann vor, während oder nach dem Einbringen der zu untersuchenden Nukleinsäuresequenz in die Population von Zielorganismen erfolgen. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren zusätzlich einen Screen zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen den biologischen Aktivitäten von zu untersuchenden Nukleinsäuren und Stimuli darstellen.In a preferred embodiment, the invention Procedure carried out as a multi-stage protocol. In doing so especially nucleic acid sequences that determine the expression of a prevent certain physiological reaction of the target organism or inhibit or amplify or trigger. For this, the Target organisms a stimulus, e.g. B. a pharmacon or therapeutic Active ingredient added, its activity by the investigated Nucleic acid can be influenced. The addition of the stimulus at which it is one or more physiologically active substances, e.g. B. Receptor ligands, drugs, cytokines etc. can act before during or after the introduction of the to be examined Nucleic acid sequence in the population of target organisms. Consequently can the method according to the invention additionally a screen Determination of interactions between biological activities of nucleic acids and stimuli to be examined.

Das hier beschriebene Verfahren kann daher zur Optimierung von therapeutischen Reagenzien dienen. So können Gene bestimmt werden, die den Effekt des Therapeutikums hemmen können. Werden diese Gene später durch einen entsprechenden Eingriff bei Zugabe des Therapeutikums gehemmt, kann dessen Effekt verstärkt werden.The method described here can therefore be used to optimize serve therapeutic reagents. This is how genes can be determined can inhibit the effect of the therapeutic. These genes will later by an appropriate intervention when adding the therapeutic agent inhibited, its effect can be enhanced.

Beispielsweise kann der induzierbare Transkriptionsfaktor NF-xB durch Natriumsalicylsäure (Aspirin) gehemmt werden (Kopp and Ghosh, Science 265 (1994), 956-959). Dies wird durch die Hemmung einer Kinase erreicht, die den spezifischen Inhibitor IκB phosphorylieren kann und dadurch zu dessen Abbau führt (Yin et al., Nature 396 (1998), 77-80). Die Hemmung durch Aspirin sollte durch die Transfektion und nachfolgende Überexpression der transaktivierenden Untereinheit p65 (relA) aufgehoben werden können. Dadurch ist ein Gen identifiziert, das nicht direkter Angriffspunkt des Therapeutikums ist und dessen Hemmung den Effekt von Aspirin verstärken kann. For example, the inducible transcription factor NF-xB by Sodium salicylic acid (aspirin) can be inhibited (Kopp and Ghosh, Science 265 (1994), 956-959). This is achieved by inhibiting a kinase which can phosphorylate the specific inhibitor IκB and thereby whose degradation leads (Yin et al., Nature 396 (1998), 77-80). The inhibition by aspirin should by transfection and subsequent Overexpression of the transactivating subunit p65 (relA) abolished can be. This identifies a gene that is not more direct The point of attack of the therapeutic agent and its inhibition is the effect of Can intensify aspirin.

Der Screen lässt sich auch dazu einsetzen, Gene zu bestimmen, die die Aktivität von Pharmaka verstärken, z. B. kann die Cotransfektion von IκB die Hemmung des induzierbaren Transkriptionsfaktors NF-κB durch Aspirin verstärken. Auch hier ist das identifizierbare Gen nicht dasjenige, auf das das Pharmacon selbst wirkt.The screen can also be used to determine genes that Enhance pharmaceutical activity, e.g. B. IκB cotransfection can Inhibition of the inducible transcription factor NF-κB by aspirin reinforce. Again, the identifiable gene is not the one to which the Pharmacon itself works.

Sowohl durch die Verstärkung des Effekts eines Pharmacons als auch durch dessen Hemmung, lassen sich neue Ansätze für therapeutische Eingriffe in der Zelle bestimmen.Both by enhancing the effect of a pharmacon and by its inhibition, new approaches for therapeutic interventions can be found in of the cell.

In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Population von Zielorganismen nach dem Einbringen der zu untersuchenden Nukleinsäuresequenz zusammen mit weiteren Organismen (Testorganismen), z. B. einer weiteren Zelllinie, kultiviert werden und die Reaktion der Testorganismen auf die zu untersuchende Nukleinsäuresequenz untersucht werden. Der Testorganismus kann einen Reportervektor wie zuvor beschrieben enthalten. Auf diese Weise lassen sich nicht nur sezernierte Proteine detektieren, sondern auch solche, die membranständig sind und über direkte Zell-Zell-Interaktionen gegebenenfalls in Kombination mit Oberflächenmarkern des Testorganismus wirken können.In yet another embodiment of the invention, the population of target organisms after the introduction of the to be examined Nucleic acid sequence together with other organisms (test organisms), e.g. B. another cell line, are cultivated and the reaction of Test organisms examined for the nucleic acid sequence to be examined become. The test organism can use a reporter vector as before described included. This way you can not only secrete Detect proteins, but also those that are membrane-bound and via direct cell-cell interactions, possibly in combination with Surface markers of the test organism can act.

Die Zielorganismen können vor, während oder nach dem Einbringen der zu untersuchenden Nukleinsäuresequenz mit Viren infiziert werden und der Einfluß der zu untersuchenden Nukleinsäuresequenz auf das Verhalten der Zielorganismen gegenüber den Viren, z. B. Hemmung oder Aktivierung der Replikation oder des Eintritts des Virus in die Zellen bestimmt werden.The target organisms can be before, during or after the introduction of the investigating nucleic acid sequence are infected with viruses and the Influence of the nucleic acid sequence to be examined on the behavior of the Target organisms against the viruses, e.g. B. inhibition or activation of Replication or the entry of the virus into the cells can be determined.

Anstelle von Viren können aber auch andere pathogene Organismen, wie z. B. Bakterien verwendet werden. Im Unterschied zu der, zuvor beschriebenen Anwendung des Screens wird hier die Auswirkung der durch die transfizierte Gene verursachten Veränderungen in den Zielorganismen auf den Vermehrungszyklus der Wirtsorganismen (Viren, Bakterien) und nicht der direkte Effekt auf die Zielorganismen. In dieser Anwendung kann man z. B. erwarten, Gene zu isolieren, die Rezeptoren für den Eintritt der Viren in die Zellen herunterregulieren.Instead of viruses, other pathogenic organisms, such as e.g. B. bacteria can be used. Unlike the one before application of the screen described here is the impact of by the transfected genes caused changes in the target organisms on the multiplication cycle of the host organisms (viruses, bacteria) and not the direct effect on the target organisms. In this application can you e.g. B. expect to isolate genes that enter receptors the viruses downregulate into the cells.

So kann z. B. eine weitere Zelllinie zu den transfizierten Zellen gegeben werden, die ein Reporterplasmid enthält, das eine DNA-Bindungsstelle für einen definierten Transkriptionsfaktor (z. B. NF-κB) aufweist und daher von ihm aktiviert wird.So z. B. added another cell line to the transfected cells that contains a reporter plasmid that contains a DNA binding site for has a defined transcription factor (e.g. NF-κB) and therefore from him activated.

Auf diese Art können sezernierte oder membranständige Proteine durch den Screen detektiert werden, die zur Aktivierung eines Transkriptionsfaktors führen. Z. B. kann der induzierbare Transkriptionsfaktor NF-κB (Baeuerle and Baltimore, Cell 87 (1996), 13-20) in den Testorganismen detektiert werden, nachdem Gene für Aktivatorproteine wie z. B. TNF (Baldwin, Annu. Rev. Immunol. 14 (1996), 649-683) in die Zellen transfiziert worden sind.In this way, secreted or membrane-bound proteins can be Screen can be detected to activate a transcription factor to lead. For example, the inducible transcription factor NF-κB (Baeuerle and Baltimore, Cell 87 (1996), 13-20) can be detected in the test organisms, after genes for activator proteins such. B. TNF (Baldwin, Annu. Rev. Immunol. 14 (1996), 649-683) have been transfected into the cells.

Die Optimierung der biologischen Aktivität von Nukleinsäuresequenzen stellt noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar. Hierzu kann eine gegebene Nukleinsäuresequenz einer Mutagenese, z. B. einer Mutagenese durch PCR, durch Random PCR (Cadwell and Joyce, PCR Methods Appl. 2 (1992), 28-33), durch "DNA shuffling" (Harayama, Trends Biotechnol. 16, 1998), 76-82) oder einer Fusion mit statistischen Nukleinsäuresequenzen (an den Enden oder im Inneren der gegebenen Nukleinsäuresequenz) unterzogen werden, um die für Schritt (a) des Verfahrens benötigte Vielzahl von Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen. Bevorzugte Beispiele für den Screen von derart mutagenisierten Nukleinsäurewechselwirkungen sind Nukleinsäuren, die für einen Rezeptor kodieren, und die auf eine optimierte Wechselwirkung mit einem oder mehreren Liganden getestet werden sollen. Umgekehrt können entsprechend Nukleinsäuresequenzen optimiert werden, die für einen an einen Rezeptor bindefähigen Peptid- oder Proteinliganden kodieren, und deren Wechselwirkung mit dem Rezeptor optimiert werden soll. Entsprechende Ansätze können durch Mutagenese von Cytokinen mittels "DNA shuffling" zur Optimierung ihres Effekts durchgeführt werden (Chang et al., Nat. Biotechnol. 17 (1999), 793-797).Optimizing the biological activity of nucleic acid sequences poses represents yet another embodiment of the invention given nucleic acid sequence of a mutagenesis, e.g. B. a mutagenesis by PCR, by Random PCR (Cadwell and Joyce, PCR Methods Appl. 2 (1992), 28-33), by "DNA shuffling" (Harayama, Trends Biotechnol. 16, 1998), 76-82) or a fusion with statistical nucleic acid sequences (at the ends or inside the given nucleic acid sequence) subjected to the variety required for step (a) of the process of nucleic acid sequences. Preferred examples of the Such mutagenized nucleic acid interactions are screened Nucleic acids that code for a receptor and that are optimized for one Interaction with one or more ligands should be tested. Conversely, nucleic acid sequences can be optimized accordingly, those for a peptide or protein ligand capable of binding to a receptor code, and their interaction with the receptor are optimized should. Appropriate approaches can be achieved by mutagenesis of cytokines using "DNA shuffling" to optimize their effect (Chang et al., Nat. Biotechnol. 17 (1999), 793-797).

Noch ein weiteres Beispiel ist die Mutagenese von Nukleinsäuresequenzen, die für Antigen-Binderegionen von Antikörpern, beispielweise von Einzelketten-Antikörpern kodieren, um die Bindefähigkeit der von den Sequenzen kodierten Genprodukte an bestimmte Antigene zu optimieren. Noch ein weiteres Beispiel ist die Mutagenisierung von Effektorsequenzen, z. B. der die Aufnahme von Proteinen in Zellen fördernden TAT-Sequenz. Hierzu kann die TAT-Sequenz an ein bestimmtes Gen fusioniert werden und durch Mutagenese der TAT-Sequenz die für das jeweilige Genprodukt optimale TAT-Variante zu bestimmen. In dieser Ausführungsform wird der Screen vorzugsweise nicht an unbekannten Nukleinsäuresequenzen, sondern an Varianten von bekannten Nukleinsäuresequenzen durchgeführt, die durch Mutagenese oder natürliche Mutation erzeugt worden sind. Diese Nukleinsäure-Optimierung kann über mehrere Zyklen erfolgen, wobei in einem ersten Zyklus identifizierte Nukleinsäuresequenzen mit einer gewünschten biologischen Aktivität in einem oder mehreren nachfolgenden Zyklen weiteren Mutageneseprozeduren unterzogen werden.Yet another example is the mutagenesis of nucleic acid sequences, those for antigen binding regions of antibodies, for example of Single chain antibodies encode the binding capacity of that of the Sequences encoded gene products to optimize certain antigens. Another example is the mutagenization of effector sequences, e.g. B. the uptake of proteins in cells promoting TAT sequence. For this purpose, the TAT sequence can be fused to a specific gene and by mutagenesis of the TAT sequence for the respective gene product to determine the optimal TAT variant. In this embodiment, the Preferably not on unknown nucleic acid sequences, but carried out on variants of known nucleic acid sequences, that have been generated by mutagenesis or natural mutation. This Nucleic acid optimization can take place over several cycles, whereby in a first cycle identified nucleic acid sequences with a desired biological activity in one or more subsequent Cycles are subjected to further mutagenesis procedures.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierten Gene können zur Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Mittel eingesetzt werden. So können bei Durchführung des Verfahrens unterschiedliche Zielzellen (normale Zellen, Tumorzellen) verwendet werden. Es können auch Zellen mit definierten genetischen Veränderungen wie z. B. Zellen mit aktivierten Onkogenen oder inaktivierten Tumorsuppressorgenen, sowie Virus-infizierte Zellen für den Sceen benutzt werden. Dadurch können Nukleinsäure sequenzen identifiziert bzw. isoliert werden, welche ihre Aktivität selektiv in bestimmten Zelltypen aufweisen, z. B. Gene, die selektiv in Tumorzellen oder virusinfizierten Zellen wirken. Diese Gene könnten dann beispielsweise zur gentherapeutischen Bekämpfung von Tumorerkrankungen oder Virus infektionen im Körper von Patienten exprimiert werden. The genes identified by the method according to the invention can be used for Provision of diagnostic and therapeutic agents can be used. Different target cells can be used when performing the method (normal cells, tumor cells) can be used. You can also use cells with defined genetic changes such as B. cells with activated Oncogenic or inactivated tumor suppressor genes, as well as virus-infected Cells are used for the scene. This allows nucleic acid sequences are identified or isolated, which selectively their activity have in certain cell types, e.g. B. Genes that are selective in tumor cells or virus-infected cells work. These genes could then, for example for gene therapy control of tumor diseases or virus infections are expressed in the body of patients.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist universell auf beliebige Arten von Zielorganismen anwendbar. So können bei Verwendung von Bakterienzellen als Zielorganismen Nukleinsäuresequenzen identifiziert werden, die für ein Antibiotikaresistenzprotein oder für ein Protein mit antibakterieller Wirkung kodieren. Sogenannte "Defensine" sind bei verschiedenen Organismen beschrieben worden (Hancock and Lehrer, Trends Biotechnol. 16 (1998), 82-88). Diese Peptide sind vorzugsweise für Bakterien toxisch, da sie zu einer Lyse der Bakterienmembran führen.The method according to the invention is universal in any type of Target organisms applicable. So when using bacterial cells nucleic acid sequences are identified as target organisms which are responsible for a Antibiotic resistance protein or for a protein with an antibacterial effect encode. So-called "defensins" are in different organisms (Hancock and Lehrer, Trends Biotechnol. 16 (1998), 82-88). These peptides are preferably toxic to bacteria because they are too lead to lysis of the bacterial membrane.

Bei Verwendung von Patientenzellen, die einen genetischen Defekt haben, als Zielorganismen, kann nach Nukleinsäuresequenzen gesucht werden, die in der Lage sind, diesen Defekt zu beheben. Weiterhin läßt sich das Screeningverfahren auf eine Transfektionsoptimierung für die Anwendung in der Gentherapie und die Identifizierung von Reporterplasmiden, die die Aktivierung von Kinasen detektieren können, ausweiten.When using patient cells that have a genetic defect, as target organisms, nucleic acid sequences can be searched for are able to fix this defect. Furthermore, that Screening procedure for a transfection optimization for the application in gene therapy and the identification of reporter plasmids that affect the Can detect activation of kinases, expand.

Zur Optimierung der Gentherapie werden die Zellen mit Genen einer Genbibliothek transfiziert, um die Nukleinsäuren zu bestimmen, die zur verbesserten Aufnahme von in der Gentherapie benutzten Vektoren führen.To optimize gene therapy, cells with genes become one Gene library transfected to determine the nucleic acids required for lead to improved uptake of vectors used in gene therapy.

Die Automatisierung des Verfahrens kann z. B. in einer Vorrichtung gemäß DE 199 50 585.0 erfolgen. Diese Vorrichtung enthält bevorzugt zwei Roboter: einen für die Isolation der Plasmid DNA aus den Wirtszellen und einen für die Transfektion von Zielzellen (Fig. 1 und 2). Der DNA Isolationsroboter umfaßt Mittel zur Kultivierung einer Vielzahl von Wirtszellen, beispielsweise einen Block oder eine Mikrotiterplatte. Die Kulturvolumina für die Wirtszellen liegen vorzugsweise im Bereich von 0,5- 2,5 ml, besonders bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 1 ml. Weiterhin umfaßt die Vorrichtung Mittel zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus einer Vielzahl von Wirtszellen, bei denen es sich beispielsweise um Mikrotiterplatten oder Blöcke handelt, die gegebenenfalls Minisäulen zur Aufreinigung der Plasmid- DNA enthalten können. Der Transfektionsroboter enthält Mittel zur Transfektion und Kultivierung einer Vielzahl von Zielzellen, bei denen es sich ebenfalls um Blöcke oder Mikrotiterplatten handeln kann. Schließlich enthält die Vorrichtung Mittel zur Bestimmung der Aktivität eines Reportervektors in Zielzellen, vorzugsweise ein spektrophotometrisches Meßgerät oder ein Fluoreszenzmeßgerät. Beide Roboter arbeiten mit Mehrkanalpipetten, wobei die jeweiligen Flüssigkeiten gleichzeitig pipettiert werden können, um einen entsprechenden Probendurchsatz zu erreichen.The automation of the process can e.g. B. in a device according to DE 199 50 585.0. This device preferably contains two robots: one for the isolation of the plasmid DNA from the host cells and one for the transfection of target cells ( FIGS. 1 and 2). The DNA isolation robot comprises means for culturing a large number of host cells, for example a block or a microtiter plate. The culture volumes for the host cells are preferably in the range from 0.5 to 2.5 ml, particularly preferably in the range from 0.5 to 1 ml. Furthermore, the device comprises means for obtaining plasmid DNA from a large number of host cells in which it is, for example, microtiter plates or blocks, which can optionally contain mini columns for the purification of the plasmid DNA. The transfection robot contains means for transfecting and cultivating a large number of target cells, which can also be blocks or microtiter plates. Finally, the device contains means for determining the activity of a reporter vector in target cells, preferably a spectrophotometric measuring device or a fluorescence measuring device. Both robots work with multi-channel pipettes, whereby the respective liquids can be pipetted at the same time in order to achieve a corresponding sample throughput.

Eine Vielzahl von möglichen Roboterausführungen ist möglich, um den Screen durchzuführen. Gezeigt sind in Fig. 1 und 2 zwei bevorzugte Ausführungsformen, bei denen die behandelten Platten mit den DNA Proben und den Wirtszellen bzw. die DNA-Proben und die Zielzellen auf einer Fläche ausgelegt werden und durch einen Pipettierkopf, der in x,y,z-Richtung beweglich ist, miteinander verbunden sind.A variety of possible robot designs are possible to carry out the screen. Are shown in Figs. 1 and 2, two preferred embodiments, in which the treated plates with the DNA samples and the host cells are designed and the DNA samples and the target cells on a surface and by a pipetting head, which in the x, y, z -Direction is movable, are interconnected.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgend beschriebenen Figuren näher erläutert. Es zeigen:The invention is further illustrated by the figures described below explained in more detail. Show it:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des DNA Isolationsroboters. Lagerungsplätze für Blöcke z. B. 96-well Blöcke mit Wirtszellen oder der daraus isolierten DNA und deren Zwischenstufen sind als A, B, C, d bezeichnet. Die für die DNA Gewinnung notwendigen Reagenzien sind zu beiden Seiten angeordnet. P1, P2, P4, SiOx (Siliciumoxid-Lösung) Acet. (Aceton-Lösung), und H₂O bezeichnen Reservoire mit entsprechenden Lösungen, die für die DNA-Gewinnung benötigt werden. Eine Waschstation ("washing") wird zum Reinigen der Spritzen des Pipettierkopfes benötigt. Mittel zum Zentrifugieren, ("centrifuge"), zum Anlegen eines Vakuums ("vacuum"), zum Schütteln (shaking) und Inkubationsstationen (inc.) dienen zur Bearbeitung der Platten für die Aufreinigung der DNA. Ein über die gesamte Fläche beweglicher Pipettierkopf mit Greifarm, der durch Antriebe (X, Y, Z) in verschiedene Richtungen bewegt werden kann, verbindet die Platten und die Bearbeitungs stationen untereinander. In der oberen Bildhälfte ist der Roboter in einer Seitenansicht gezeigt. Fig. 1 is a schematic representation of the DNA isolation robot. Storage spaces for blocks e.g. B. 96-well blocks with host cells or the DNA isolated therefrom and their intermediates are designated as A, B, C, d. The reagents required for DNA extraction are arranged on both sides. P1, P2, P4, SiOx (silicon oxide solution) Acet. (Acetone solution), and H ₂ O denote reservoirs with corresponding solutions that are required for DNA extraction. A washing station is required to clean the syringes of the pipetting head. Means for centrifuging ("centrifuge"), for applying a vacuum ("vacuum"), for shaking (shaking) and incubation stations (inc.) Serve to process the plates for the purification of the DNA. A pipetting head with a gripper arm that can move over the entire surface and can be moved in different directions by drives (X, Y, Z) connects the plates and the processing stations to one another. The robot is shown in a side view in the upper half of the picture.

Fig. 2 eine schematische Darstellung des Transfektionsroboters. Die Zielzellen für die Transfektion sind in vier übereinander angeordneten Reichen in Multiwell-Platten eingezeichnet. Die zu transfizierenden DNA-Proben sind in der obersten Reihe in 96-well Platten angeordnet. In der darunterliegenden Reihe werden die Transfektionsreaktionen angesetzt. Die dazu zusätzlich zur DNA benötigten Reagenzien sind als L1 und L2 bezeichnet. Eine Waschstation, ebenso wie eine Abfallstation (waste) dient der Säuberung der Spritzen des Pipettierkopfes ("Z"), der in X, Y, Z Richtung beweglich ist und durch entsprechende Schrittmotoren (X, Y, Z) angetrieben wird. Am oberen und rechten Bildrand ist eine seitliche Ansicht des Roboters bzw. des beweglichen Pipettierkopfes eingezeichnet. Fig. 2 is a schematic representation of the transfection robot. The target cells for the transfection are drawn in four superimposed areas in multiwell plates. The DNA samples to be transfected are arranged in the top row in 96-well plates. The transfection reactions are set up in the row below. The reagents required for this in addition to the DNA are designated as L1 and L2. A washing station, as well as a waste station (waste) serves to clean the syringes of the pipetting head ("Z"), which is movable in the X, Y, Z direction and is driven by corresponding stepper motors (X, Y, Z). A side view of the robot or the movable pipetting head is shown at the top and right edge of the picture.

Claims

1. A method for determining the biological activity of nucleic acid sequences, comprising the steps:

a) parallel introduction of a large number of expression vectors, each of which contains a nucleic acid sequence to be examined in operative linkage with an expression control sequence, into a large number of separate populations of the same target organism, only a single nucleic acid sequence or a small number of different nucleic acid sequences into a separate population similar target organisms are introduced,
b) effecting expression of the nucleic acid sequence in the target organisms, and
c) determining the activity of the nucleic acid sequence in the individual populations of target organisms.

2. The method according to claim 1, characterized, that the nucleic acid sequences from genomic sequences, cDNA sequences, cDNA fragments and antisense molecules of any origin can be selected.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that nucleic acids suitable for RNAi are used.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that the nucleic acid sequences from a normalized cDNA Library.

5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that the nucleic acid sequences from libraries that have a collection contain known sequences.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized, that the nucleic acid sequences from eukaryotes, bacteria, Archaea, viruses or from synthetic or semi-synthetic Sources come from.

7. The method according to claim one of claims 1 to 6, characterized, that the nucleic acid sequences have a non-selectable activity exhibit.

8. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized, that the nucleic acid sequences have selectable activity exhibit.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized, since a plasmid is used as the expression vector.

10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized, that the expression vector by culturing host cells and Extraction from the cultivated host cells is provided.

11. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized, that the expression vector by in vitro amplification provided.

12. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the target organisms were possibly genetically manipulated eukaryotic cells or organisms, possibly genetic manipulated prokaryotic cells, patient lines or natural Mutants used.

13. The method according to claim 12, characterized, that eukaryotic cells are used as target organisms and the introduction of the expression vector by calcium phosphate Coprecipitation, lipofection, electroporation, particle bombardment or viral infection occurs.

14. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the expression vector along with a reporter vector in the target organisms are introduced.

15. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the expression vector is introduced into target organisms which already contain a reporter vector.

16. The method according to claim 14 or 15, characterized, that the reporter vector is at a defined location in the genome is localized.

17. The method according to any one of claims 14 to 16, characterized, that the reporter vector is one for a detectable gene product contains coding nucleic acid sequence in expressible form.

18. The method according to claim 17, characterized, that the detectable gene product from secreted enzymes is selected.

19. The method according to claim 17, characterized, that the detectable gene product from intracellularly detectable Polypeptides is selected.

20. The method according to claim 17 or 18, characterized, that the detectable gene product from fluorescent proteins is selected.

21. The method according to claim 17, characterized, that the detectable gene product from membrane-bound detectable polypeptides is selected.

22. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that determining the activity of the nucleic acid sequence is a Examination of the target organisms for morphological Changes, changes in growth behavior or Changes in the activity of a reporter vector include.

23. The method according to any one of claims 1 to 22, characterized, that additional parameters of the target organisms are analyzed.

24. The method according to any one of claims 1 to 23, characterized, that determination by fluorescence cytometry or imaging Assays are performed.

25. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the implementation is at least partially automated.

26. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that steps (a) through (c) on at least 50 populations of Target organisms are carried out in parallel.

27. The method according to any one of the preceding claims, comprising adding a stimulus, the activity of which is stimulated by the investigating nucleic acid in the target organism can be influenced can.

28. The method according to claim 27, characterized, that the stimulus is generated by a pharmacon.

29. The method according to any one of the preceding claims, comprising adding a test organism in step (b) by the Target organism is different.

30. The method according to claim 29, characterized, that a cell line is used as the test organism.

31. The method according to claim 29, characterized, that a virus or a bacterium is used as the test organism becomes.

32. The method according to any one of claims 29 to 31, characterized, that in step (c) the effect of the investigated Nucleic acid sequence is determined on the test organism.

33. The method according to any one of the preceding claims Optimization of nucleic acid sequences.

34. The method according to claim 33, characterized, that you have a variety of variations of a known one Nucleic acid sequence tested.

35. The method according to any one of the preceding claims, further comprising the use of the identified nucleic acid sequences for the provision of diagnostic and therapeutic agents.