DE202005009490U1

DE202005009490U1 - Device for enrichment / separation of DNA containing non-methylated CpG motifs

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Publication number: DE202005009490U1
Application number: DE200520009490
Authority: DE
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2005-06-16
Filing date: 2005-06-16
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2015-06-17
Also published as: WO2006133758A2; WO2006133758A3

Abstract

Vorrichtung zur Anreicherung und/oder Abtrennung von nicht-methylierte CpG-Motive enthaltender DNA, umfassend
a) ein Reaktionsgefäß mit mindestens einer Öffnung und
b) ein Protein, das nicht-methylierte CpG-Motive über eine Bindungsstelle spezifisch erkennt, wobei das Protein eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist und gegenüber diesem verkürzt ist, wobei
sich das Protein innerhalb des Reaktionsgefäßes befindet.Device for enrichment and / or separation of DNA containing non-methylated CpG motifs, comprising
a) a reaction vessel with at least one opening and
b) a protein that specifically recognizes non-methylated CpG motifs via a binding site, wherein the protein has a 25% to 35% homology to the wild-type CGPB protein and is truncated to it, wherein
the protein is inside the reaction vessel.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Anreicherung/Abtrennung von nicht-methylierte Cytidin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotide (CpG-Motive) enthaltender DNA, wobei die Vorrichtung ein Protein umfaßt, das nicht-methylierte CpG-Motive einer DNA spezifisch bindet.The The invention relates to a device for enrichment / separation of non-methylated cytidine-phosphate-guanosine dinucleotides (CpG motifs) containing DNA, the device comprising a protein comprising non-methylated CpG motifs specifically binds to a DNA.

Durch Bakterien verursachte Infektionen sind eine der häufigsten Ursachen für Entzündungskrankheiten. Zur Prognose des Krankheitsverlaufes sowie insbesondere zur rechtzeitigen Auswahl geeigneter therapeutischer Maßnahmen ist der frühzeitige Nachweis der bakteriellen Erreger von entscheidender Bedeutung.By Bacterial infections are one of the most common Reasons for Inflammatory diseases. To predict the course of the disease and in particular the timely Selection of appropriate therapeutic measures is early Proof of bacterial pathogens of vital importance.

Zum Nachweis bakterieller Erreger werden auch heute noch hauptsächlich verschiedene kulturabhängige Methoden angewendet. Aktuelle Studien verdeutlichen jedoch die mangelnde Eignung von kulturabhängigen Methoden zum Erregernachweis (Hellebrand W., König-Bruhns C., Hass W., Studie zu Blutkulturdiagnostik im Jahr 2002, Poster Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, Göttingen 2004; Straube E (2003) Sepsis – microbiological diagnosis. Infection 31:284). Demnach konnten nur bei ca. 15–16% aller untersuchten Blutkulturen die Erreger ermittelt werden. Die Nachteile dieser Methoden führten dazu, dass gerade in der letzten Dekade parallel zur stürmischen technologischen Entwicklung der Molekularbiologie verstärkt nach Alternativen gesucht wurde. Erste Berichte zum Einsatz kulturunabhängiger Nachweisverfahren bakterieller Erreger, welche auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR) beruhen, stammen vom Anfang der 90er Jahre. So konnten beispielsweise Miller und Kollegen (Miller N, Journal of Clinical Microbiology, 1994 Feb; 32(2): 393–7) zeigen, dass kulturunabhängige Verfahren den klassischen Kultivierungs- und Mikroskopietechniken beim Nachweis von Mycobacterium tuberculosis überlegen sind. In letzter Zeit haben aber weitere molekularbiologische Methoden, die auf dem Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren basieren, an Bedeutung gewonnen (z.B. M. Grijalva et al. Heart 89 (2003) 263–268; Uyttendaele M. et al. Lett Appl Microbiol. 2003, 37(5): 386–91; Saukkoriipi A et al. Moi Diagn. 2003 Mar 7(1): 9–15; Tzanakaki G. et al. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003 Oct 24; 39(1): 31–6;).To the Detection of bacterial pathogens are still mainly different today culture-specific Methods applied. However, recent studies illustrate the lack of Suitability of culture dependent Pathogen detection methods (Hellebrand W., König-Bruhns C., Hass W., Studie on blood culture diagnostics in 2002, poster annual meeting of the Germans Organisation for; society for; party for Hygiene and Microbiology, Göttingen 2004; Straube E (2003) Sepsis - microbiological diagnosis. Infection 31: 284). Accordingly, only about 15-16% of all could examined blood cultures, the pathogens are determined. The disadvantages led to these methods to that just in the last decade parallel to the stormy technological development of molecular biology strengthened after Alternatives was sought. First reports on the use of culture-independent detection methods bacterial pathogens which are based on the principle of polymerase chain reaction (PCR) are from the beginning of the 90s. For example Miller and colleagues (Miller N, Journal of Clinical Microbiology, 1994 Feb; 32 (2): 393-7) show that culture independent Procedures the classical cultivation and microscopy techniques are superior in the detection of Mycobacterium tuberculosis. Lately but have other molecular biology methods based on the evidence pathogen-specific nucleic acids are gaining in importance (e.g., M. Grijalva et al., Heart 89 (2003) 263-268; Uyttendaele M. et al. Lett Appl Microbiol. 2003, 37 (5): 386-91; Saukkoriipi A et al. Moi Diagn. 2003 Mar 7 (1): 9-15; Tzanakaki G. et al. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003 Oct 24; 39 (1): 31-6;).

Neben der hohen Spezifität solcher molekularbiologischer Methoden ist der geringe Zeitbedarf als wesentlicher Vorteil gegenüber konventionellen kulturabhängigen Methoden zu nennen. Allerdings ist die Sensitivität des Nachweises prokaryonter DNA direkt aus Körperflüssigkeiten und nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial im Vergleich zur Kultur der Mikroorganismen bislang viel zu gering. Eine für den direkten Erregernachweis aus nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial ausreichende Menge an Nukleinsäuren von Bakterien wird auch im Bereich der 16S-rRNA- Analyse, mittels PCR der 16S Region auf dem bakteriellen Chromosom und der anschließenden Sequenzanalyse des PCR Fragmentes, trotz mehrerer Kopien im Genom nur eingeschränkt erreicht. Der direkte spezifische Erregernachweis mittels 16S-rRNA Sequenzanalyse setzt voraus, dass sich nur eine Erreger-Spezies in der zu untersuchenden Probe befindet. Befinden sich verschiedene Erreger-Spezies in der Probe, ist ein spezifischer Nachweis über Sequenzzierung der 16S-rRNA Region nur begrenzt möglich, da sich die Sequenzen der ausgewerteten Gene oft überlagern.Next high specificity Such molecular biological methods is the short time required as a significant advantage over conventional culture-dependent To name methods. However, the sensitivity of the proof is prokaryotic DNA directly from body fluids and non-pretreated specimens compared to Culture of microorganisms far too low. One for the direct Pathogen detection from non-pretreated examination material sufficient Amount of nucleic acids Bacteria is also used in the field of 16S rRNA analysis, by means of PCR of the 16S region on the bacterial chromosome and subsequent sequence analysis of the PCR fragment, despite limited copies in the genome only partially reached. The direct specific pathogen detection by means of 16S rRNA sequence analysis sets advance that only one pathogen species in the examined Sample is located. Are different pathogen species in the Sample, is a specific proof of sequencing of the 16S rRNA region only limited possible since the sequences of the evaluated genes often overlap.

Am häufigsten erfolgt der erregerspezifische Nukleinsäurenachweis durch Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT), wie beispielsweise die Vervielfältigung der prokaryonten DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bzw. der Ligase-Kettenreaktion (LCR). Der hohen Spezifität und schnellen Verfügbarkeit der Ergebnisse stehen die Störanfälligkeit durch Kontaminationen oder stark reaktionshemmende Faktoren in klinischen Proben gegenüber.At the common the pathogen specific nucleic acid detection is performed by nucleic acid amplification techniques (NAT), such as the amplification of prokaryotic DNA by means of the polymerase chain reaction (PCR) or the ligase chain reaction (LCR). The high specificity and fast availability the results are the susceptibility due to contamination or strong reaction inhibiting factors in clinical Samples opposite.

Bei einem herkömmlichen PCR-Nachweisverfahren muß für eine erfolgreiche Detektion von Erregern im Blut theoretisch mindestens 1 Target-DNA des Erregers in 10 μl Blut vorhanden sein. Das entspricht ca. 100 Targets in 1 ml Blut bzw. 1000 Targets in 10 ml Blut. Anders verhält es sich bei der Blutkultur zum Nachweis von Erregern einer Infektion. Hier liegt die untere Nachweisgrenze bei etwa 3–5 Bakterien pro 10 ml Blut. Diese Nachweisgrenze wird derzeit mit PCR-Verfahren noch nicht erreicht, auch nicht mit solchen, die ihre Zielsequenz im Bereich der 16S-rRNA Region auf dem Chromosom haben. Obwohl mehrere die 16S-rRNA kodierende Regionen auf dem bakteriellen Chromosom lokalisiert sind, meist 3 bis 6, bleibt die Voraussetzung, daß sich mindestens ein Molekül der Template-DNA im PCR-Reaktionsgemisch befindet, unerfüllt.at a conventional one PCR detection must be successful Detection of pathogens in the blood theoretically at least 1 target DNA of the pathogen in 10 μl Blood be present. This corresponds to about 100 targets in 1 ml of blood or 1000 targets in 10 ml of blood. The situation is different with the blood culture to detect pathogens of an infection. Here lies the lower one Detection limit at about 3-5 Bacteria per 10 ml of blood. This limit of detection is currently in use PCR method has not been achieved, even with those who have their Target sequence in the region of the 16S rRNA region on the chromosome have. Although several regions coding for 16S rRNA on the bacterial Chromosome are localized, usually 3 to 6, the prerequisite remains that yourself at least one molecule the template DNA is in the PCR reaction mixture, unfulfilled.

Eine verbesserte diagnostische Sicherheit ist von PCR-Verfahren zu erwarten, deren spezifische Zielsequenzen für speziesspezifische Proteine kodieren, entweder im Chromosom oder auf Plasmiden der Mikroorganismen. Auch hier ist die Nachweisgrenze im oben angegebenen Bereich. Gerade unter dem Einfluß einer laufenden Antibiotikatherapie kann das Wachstum der Erreger stark verlangsamt, eingeschränkt oder blockiert sein, auch wenn das eingesetzte Antibiotikum letztlich nicht optimal wirksam ist. Diese Situation ist gerade bei solchen Patienten häufig anzutreffen, die bereits unter Antibiotikatherapie stehen und bei denen aus diesem Grund keine krankheitsverursachenden Bakterien aus den Blutkulturen oder anderen Proben (wie z.B. Trachealabstrichen, bronchoalveolären Lavagen (BAL) etc.) angezüchtet werden können.Improved diagnostic certainty is expected from PCR methods whose specific target sequences encode species-specific proteins, either in the chromosome or on microorganism plasmids. Again, the detection limit in the above range. Especially under the influence of ongoing antibiotic therapy, the growth of pathogens can be severely slowed down, restricted or blocked, even if the antibiotic used is ultimately not optimally effective. This situation is especially common in those patients who are already on antibiotic therapy and who are suffering from it Reason no disease-causing bacteria from the blood cultures or other samples (such as tracheal swabs, bronchoalveolar lavage (BAL), etc.) can be grown.

Wegen der unzureichenden Sensitivität hat der erregerspezifische Nukleinsäurennachweis ohne Amplifikationsschritt durch direkten Nachweis der prokaryonten DNA (Sondentechnik, FISH-Technik) nur bei ausreichend hoher Keimzahl im Untersuchungsmaterial diagnostische Bedeutung.Because of of insufficient sensitivity has the pathogen specific nucleic acid detection without amplification step by direct detection of prokaryotic DNA (probe technique, FISH technique) only at a sufficiently high number of germs in the examination material diagnostic Importance.

Die wesentliche Problematik des Nachweises prokaryonter DNA zur Identifikation bakterieller Erreger in Körperflüssigkeiten besteht neben den PCR-hemmenden Bestandteilen im Untersuchungsmaterial vor allem in der geringen Konzentration prokaryonter DNA und dem damit einhergehenden Überschuß eukaryonter gegenüber prokaryonter DNA. Hierbei sind insbesondere kompetitive Prozesse bei der DNA-Analyse sowie die geringe Menge an prokaryonter DNA als hinderlich für einen qualitativen und quantitativen Erregernachweis anzusehen.The essential problem of the detection of prokaryotic DNA for identification bacterial pathogen in body fluids exists in addition to the PCR-inhibiting components in the test material especially in the low concentration of prokaryotic DNA and the concomitant excess eukaryotic versus prokaryotic DNA. In particular, competitive processes are involved in DNA analysis and the low level of prokaryotic DNA as a hindrance to one qualitative and quantitative pathogen detection.

Die üblichen Methoden zur DNA-Isolierung reichern die Gesamt-DNA einer Körperflüssigkeit an, so daß das Verhältnis von Wirts-DNA zu mikrobieller DNA zwischen 1:10^–6 und 1:10^–8 betragen kann. Aus diesem Unterschied ist die Schwierigkeit des Nachweises mikrobieller DNA in Körperflüssigkeiten gut nachzuvollziehen.The usual methods for DNA isolation enrich the total DNA of a body fluid so that the ratio of host DNA to microbial DNA can be between 1:10 ^-6 and 1:10 ^-8 . From this difference, the difficulty of detecting microbial DNA in body fluids is easy to understand.

Im Ergebnis werden dem klinisch tätigen Arzt durch die mangelnde Eignung von kulturabhängigen Methoden sowie aufgrund der oben genannten Probleme durch Nukleinsäuretestverfahren für den Erregernachweis fälschlicherweise negative Befunde übermittelt. Dadurch kann eine gezielte antibiotische Therapie entweder gar nicht oder nur viel zu spät eingeleitet werden. Der Arzt ist in solchen Fällen auf sein Erfahrungswissen und allgemeine Richtlinien (wie z.B. der Paul-Ehrlich-Gesellschaft) angewiesen und wird daher viel zu allgemein antibiotisch behandeln. Der nicht zielgenaue Einsatz von Antibiotika birgt eine Reihe von Risiken nicht nur für den einzelnen Patienten (wie z.B. unnötige Nebenwirkungen in Form von Nierenschäden etc.), sondern auch für die gesamte Gesellschaft (z.B. die Entwicklung zusätzlicher Antibiotikaresistenzen wie MRSA (Methicillinresistente Staphylocuccus aureus, etc.). Der Nachweis der klinisch bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren und Resistenzen von Bakterien auf chromosomaler und Plasmid-Ebene, also letztendlich auf DNA-Ebene, bietet für die Diagnose vieler Infektionserkrankungen, aber auch der Sepsis, erhebliche Vorteile. Dies gilt um so mehr, da auf dieser Ebene auch eine Unterscheidung zwischen pathogenen und kommensalen Bakterien getroffen werden kann. Es wäre demnach eine Vorrichtung wünschenswert, die es ermöglicht, die Sensivität der kulturunabhängigen Nachweisverfahren zu steigern.in the Result will be clinically effective Doctor due to the lack of aptitude of culture-dependent methods as well as due the above-mentioned problems by nucleic acid test method for the pathogen detection falsely transmitted negative findings. As a result, a targeted antibiotic therapy either not at all or just too late be initiated. The doctor is in such cases on his empirical knowledge and general guidelines (such as the Paul Ehrlich Society) and will therefore treat far too much antibiotics. The non-targeted use of antibiotics involves a number of Risks not only for the individual patient (such as unnecessary side effects in the form of kidney damage etc.), but also for the whole society (for example the development of additional Antibiotic resistance such as MRSA (Methicillin-resistant staphylococcus aureus, etc.). Evidence of clinically significant pathogenicity factors and Resistance of bacteria at the chromosomal and plasmid level, ie ultimately at the DNA level, provides for the diagnosis of many infectious diseases, but also sepsis, significant benefits. This is even more so because at this level also a distinction between pathogenic and commensal bacteria can be hit. It would be accordingly a device desirable which makes it possible the sensitivity the culture independent To increase detection methods.

Prokaryonte DNA unterscheidet sich von eukaryonter DNA durch das Vorkommen nicht-methylierter CpG-Motive (Hartmann G et al., Deutsches Ärzteblatt, Jg. 98/15: A981–A985 (2001). In der prokaryonten DNA befinden sich CpG-Motive in einem 16-fachen Überschuß im Vergleich zu eukaryonter DNA, die solche Motive nur übergangsweise enthält, z.B. in Krebszellen oder Promotorregionen. In prokaryonter DNA sind diese Motive nicht-methyliert, wohingegen sie in eukaryonter DNA zum größten Teil methyliert sind, was die Unterschiedlichkeit nochmals erhöht.prokaryotic DNA differs from eukaryotic DNA by the presence of non-methylated CpG motifs (Hartmann G et al., Deutsches Ärzteblatt, Acts 98/15: A981-A985 (2001). The prokaryotic DNA contains CpG motifs in one 16 times over in comparison to eukaryotic DNA containing such motifs only transiently, e.g. in cancer cells or promoter regions. In prokaryotic DNA these are Motifs are unmethylated, whereas in eukaryotic DNA they are for the most part are methylated, which increases the difference again.

Nicht-methylierte CpG-Motive sind nicht-methylierte Deoxycytidylat-Deoxyguanylat-Dinucleotide innerhalb des prokaryonten Genoms oder innerhalb von Fragmenten desselben.Unmethylated CpG motifs are unmethylated deoxycytidylate deoxyguanylate dinucleotides within the prokaryotic genome or within fragments thereof.

Es ist weiterhin bekannt, dass sich aus unterschiedlichen Methylierungsmustern innerhalb der humanen DNA diagnostische Aussagen für Krebserkrankungen ableiten lassen (Epigenetics in Cancer Prevention: Early Detection and Risk Assessment (Annals of the New York Academy of Sciences, Vol 983) Editor: Mukesh Verma ISBN 1-57331-431-5). Anhand von methylierten und nicht-methylierten Cytosinen im Genom lassen sich gewebe-, aber auch krankheitsspezifische Muster identifizieren. Die spezifischen Methylierungsmuster für eine Krankheit ermöglichen zum einen eine Diagnose zu einem sehr frühen Zeitpunkt, zum anderen auch eine molekulare Klassifikation einer Krankheit und die wahrscheinliche Reaktion eines Patienten auf eine bestimmte Behandlung. Ausführliche Informationen hierzu können beispielsweise aus Beck S, Olek A, Walter J.: From genomics to epigenomics: a loftier view of life.", Nature Biotechnology 1999 Dec; 17(12): 1144, der Homepage der Epigenomics AG (http://www.epigenomics.de) oder aus WO 200467775 entnommen werden.It It is also known that from different methylation patterns within the human DNA diagnostic statements for cancers Epigenetics in Cancer Prevention: Early Detection and Risk Assessment (Annals of the New York Academy of Sciences, Vol 983) Editor: Mukesh Verma ISBN 1-57331-431-5). Based on methylated and unmethylated Cytosines in the genome can be tissue-specific, but also disease-specific Identify patterns. The specific methylation patterns for a disease enable on the one hand a diagnosis at a very early stage, on the other hand also a molecular classification of a disease and the probable one Reaction of a patient to a specific treatment. Full Information about this can for example from Beck S, Olek A, Walter J .: From genomics to epigenomics: a loftier view of life. ", Nature Biotechnology 1999 Dec; 17 (12): 1144, the homepage of Epigenomics AG (http://www.epigenomics.de) or from WO 200467775 are taken.

In Cross et al. wurde gezeigt, dass es möglich ist, unterschiedlich methylierte genomische humane DNA zu trennen, indem die methylierte CpG-Motive an ein Protein gebunden werden (Cross SH, Charlton JA, Nan X, Bird AP, Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column, Nat Genet. 1994 Mar; 6(3): 236–44). Dieses Verfahren dient zur Bindung methylierte CpG-Motive enthaltender DNA. Eine ausreichende Trennung von nicht-methylierter und methylierter DNA ist aus technischen Gründen nicht möglich, da dass verwendete Protein auch nicht-methylierte DNA schwach bindet. Auch eine Anreicherung von nicht-methylierter DNA ist mit diesem Verfahren nicht möglich, da die Kapazität des verwendeten Proteins nicht ausreicht, um bei einem hohen Überschuss an methylierter DNA in ausreichendem Maße von nicht-methylierter DNA zu trennen. Weiterhin bleibt durch die Bindung der methylierten DNA das Ausgangsvolumen in welchem sich die nicht-methylierte DNA befindet unverändert, so dass keine Anreicherung erreicht wird.In Cross et al. It has been demonstrated that it is possible to separate differently methylated human genomic DNA by binding the methylated CpG motifs to a protein (Cross SH, Charlton JA, Nan X, Bird AP, Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column , Nat Genet. 1994 Mar; 6 (3): 236-44). This method is used for binding methylated CpG motifs containing DNA. A sufficient separation of non-methylated and methylated DNA is not possible for technical reasons, since that protein used also weakly binds unmethylated DNA. An enrichment of non-methylated DNA is not possible with this method, since the capacity of the protein used is not sufficient to separate sufficiently from non-methylated DNA with a high excess of methylated DNA. Furthermore, due to the binding of the methylated DNA, the starting volume in which the non-methylated DNA is present remains unchanged, so that no enrichment is achieved.

Aus Voo et al. ist bekannt, dass das humane CpG-bindende Protein (hCGBP) in der Lage ist, nicht-methylierte CpG-Motive zu binden. Die Publikation beschreibt den transkriptionsaktivierenden Faktor hCGBP, von dem gezeigt wurde, dass er eine Rolle in der Regulation der Expression von Genen innerhalb von CpG-Motiven spielt.Out Voo et al. it is known that the human CpG-binding protein (hCGBP) is capable of non-methylated Bind CpG motives. The publication describes the transcriptional activating Factor hCGBP, which has been shown to play a role in regulation expression of genes within CpG motifs.

In der EP 02020904 wurde ein Verfahren beschrieben, das die Trennung und Anreicherung von prokaryonter DNA aus einem Gemisch aus prokaryonter und eukaryonter DNA durch Bindung der prokaryonten DNA an ein spezifisch nicht-methylierte DNA bindendes Protein ermöglicht.In the EP 02020904 A method has been described which allows the separation and accumulation of prokaryotic DNA from a mixture of prokaryotic and eukaryotic DNA by binding the prokaryotic DNA to a protein specific for non-methylated DNA.

In der DE 10 2004 010 928.1 wurde ein Protein näher beschrieben, das in der Lage ist, spezifisch CpG-Motive enthaltende DNA zu binden. Weiterhin wurde in der DE 10 2005 001 889.0 ein Verfahren beschrieben, das die Bindungsstärke und -effizienz des Proteins aus der DE 10 2004 010 928.1 steigert.In DE 10 2004 010 928.1 has described in more detail a protein which is described in US Pat It is able to bind specifically DNA containing CpG motifs. Farther has been described in DE 10 2005 001 889.0 a method which the bond strength and efficiency of the protein from DE 10 2004 010 928.1 increases.

Es wäre also wünschenswert, nicht-methylierte DNA von methylierter DNA abtrennen und nicht-methylierte DNA anreichern zu können, um so prokaryonte von eukaryonter DNA bzw. unterschiedlich methylierte humane DNA voneinander zu trennen. Es wäre zudem wünschenswert und von hohem gesundheitsökonomischen Interesse, dass die Trennung und Anreicherung von nicht-methylierter DNA auch aus einem Gemisch (beispielsweise Vollblut) erreicht werden könnte, das durch einen hohen Überschuß an methylierter DNA charakterisiert ist.It would be so desirable, Separate unmethylated DNA from methylated DNA and accumulate non-methylated DNA to be able to so prokaryonte of eukaryotic DNA or differently methylated human Separate DNA from each other. It would be also desirable and of high health economic Interest that the separation and enrichment of non-methylated DNA can also be obtained from a mixture (for example, whole blood) could, that by a high excess of methylated DNA is characterized.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung bereitzustellen, die die Abtrennung und/oder Anreicherung von nicht-mehtylierte CpG-Motive enthaltender DNA, insbesondere die Anreicherung/Abtrennung prokaryonter DNA, aus Untersuchungsproben mit hohem Anteil methylierte CpG-Motive enthaltender DNA, insbesondere eukaryonter DNA, beispielsweise von Patienten mit Infektionen, ermöglicht.Of the The present invention is therefore based on the object, a device to provide the separation and / or enrichment of non-methylated DNA containing CpG motifs, in particular the enrichment / separation prokaryotic DNA, from high assay sample methylated CpG motifs containing DNA, in particular eukaryotic DNA, for example from Patients with infections, possible.

Erfindungsgemäß wird dies durch eine Vorrichtung gemäß dem Schutzanspruch 1 erreicht, die ein Reaktionsgefäß mit mindestens einer Öffnung und ein Protein, das nicht-methylierte CpG-Motive über eine Bindungsstelle spezifisch erkennt, wobei das Protein eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist und gegenüber diesem verkürzt ist, wobei sich das Protein innerhalb des Rekationsgefäßes befindet, umfaßt.According to the invention this is by a device according to the protection claim 1 reaches a reaction vessel containing at least an opening and a protein containing non-methylated CpG motifs over a Specifically recognizes binding site, the protein being 25% to 35% homology to wild-type CGPB protein and to this shortened with the protein within the reaction vessel, includes.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Schutzansprüchen 2 bis 14 angegeben.preferred embodiments are in the protection claims 2 to 14 indicated.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt ein Protein, das nicht-methylierte CpG-Motive bindet, wobei es eine 25%ige bis 35%ige, insbesondere etwa 27,6%ige, Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist, wobei die Bindungsstelle für nicht-methylierte CpG-Motive in dem Protein der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthalten ist, und es gegenüber dem Wildtyp-Protein verkürzt ist, vorzugsweise bis maximal zur Länge der Bindungsstelle für nicht-methylierte CpG-Motive. Dies bedeutet, daß es nur maximal soweit verkürzt ist, daß die Bindungsstelle für nicht-methyliert CpG-Motive erhalten bleibt.The inventive device comprises a protein that binds non-methylated CpG motifs, where there is a 25% to 35%, especially about 27.6%, homology to the wild-type CGPB protein, wherein the binding site for containing non-methylated CpG motifs in the protein of the device of the invention is, and it is opposite shortened the wild-type protein is, preferably at most to the length of the binding site for unmethylated CpG motifs. This means that it only as far as possible shortened is that the binding site for unmethylated Received CpG motives remains.

Als Wildtyp-CGPB-Protein (oder CPGbP656) wird im folgenden das humane CGPB-Protein (vgl. Voo et al., Mol Cell Biol. 2000 Mar; 20(6): 2108–21.) bezeichnet. Proteine, die bevorzugt in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzt werden können, werden im folgenden als CPGbP187 und CPGbP181 bezeichnet.When Wild type CGPB protein (or CPGbP656) will be the human CGPB protein (see Voo et al., Mol Cell Biol. 2000 Mar; 20 (6): 2108-21.). Proteins which are preferably used in the device according to the invention can be are referred to below as CPGbP187 and CPGbP181.

Das Wildtyp-CGPB-Protein CPGbP656 bindet nicht-methylierte CpG-Motive prokaryonter DNA, wobei ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird. Dieser kann z.B. auf einem Träger gebunden sein oder werden, wodurch eine Trennung und/oder Anreicherung der DNA erfolgen kann. Das Protein der erfindungsgemäßen Vorrichtung besitzt eine verbesserte Bindungseigenschaft gegenüber nicht-methylierten CpG-Motiven prokaryonter DNA als das Wildtyp-CGPB-Protein und Varianten davon mit 80% oder mehr Homologie, insbesondere das Protein CPGbP187 mit 187 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 1), und das CPGbP181 mit 181 Aminsäuren (SEQ ID Nr. 2), die eine 27,6%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweisen.The Wild-type CGPB protein CPGbP656 binds unmethylated CpG motifs prokaryotic DNA, whereby a protein-DNA complex is formed. This can e.g. on a carrier be bound or become, creating a separation and / or enrichment the DNA can be done. The protein of the device according to the invention has an improved binding property over non-methylated CpG motifs prokaryotic DNA as the wild type CGPB protein and variants thereof with 80% or more homology, in particular the protein CPGbP187 with 187 amino acids (SEQ ID NO: 1), and the CPGbP181 with 181 amino acids (SEQ ID NO: 2) containing a Have 27.6% homology to the wild-type CGPB protein.

Das in EP 02020904 beschriebene Protein (CPGbP241), das eine verkürzte Variante des Wildtyp-CGPB-Proteins (CPGbP656) ist und als Grundlage für das Protein CPGbP181 und das Protein CPGbP187 der erfindungsgemäßen Vorrichtung dienten, hat eine Länge von 241 Aminosäuren.This in EP 02020904 described protein (CPGbP241), which is a truncated variant of wild-type CG PB protein (CPGbP656) and served as a basis for the protein CPGbP181 and the protein CPGbP187 of the device according to the invention, has a length of 241 amino acids.

Das Wildtyp-CGBP-Protein hat eine Länge von 656 Aminosäuren, 135 positiv und 94 negativ geladene Reste.The Wild-type CGBP protein has a length of 656 amino acids, 135 positive and 94 negatively charged residues.

Das Protein der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird bevorzugt durch Klonierung der entsprechenden cDNA-Sequenz in ein Plasmid und Expression in Escherichia coli hergestellt. Ein das Protein exprimierender E. coli-Stamm wurde am 16. Februar 2004 unter der Nr. DSM 16229 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegt. Alternativ können andere, dem Fachmann vertraute Verfahren zur Herstellung angewendet werden. Die Nutzung des Plasmids pQE9 stellt dabei eine beispielhafte Möglichkeit dar, aber jedes andere geeignete Plasmid ist als Vektor einsetzbar. Die Expression in E. coli stellt ebenfalls nur ein Beispiel dar. Eine Expression in anderen prokaryonten System als auch in einem eukaryonten System als auch die chemische oder enzymatische Synthese oder die Aufreinigung aus einer genetisch veränderter Tabakpflanze sind weitere mögliche Ausführungsformen der Proteingewinnung. Das Protein kann sowohl im Labormaßstab (z.B. im Erlenmeyerkolben) als auch im industriellen Maßstab (z.B. Fermenter) hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Protein kann z.B. mittels Bindung von an den Anfang oder das Ende des Proteins eingebrachten Histidin-Reste (His-tag) an eine geeignete nickelhaltige Matrix gereinigt werden, eine Methode, die dem Fachmann bekannt ist.The Protein of the device according to the invention is preferred by cloning the corresponding cDNA sequence into a plasmid and expression in Escherichia coli. One the protein expressing E. coli strain was on February 16, 2004 under the number DSM 16229 at the German Collection of Microorganisms and cell cultures deposited. Alternatively, others familiar to those skilled in the art may Method of preparation can be applied. Use of the plasmid pQE9 is an example, but every other one suitable plasmid can be used as a vector. Expression in E. coli is also just one example. Expression in others prokaryotic system as well as in a eukaryotic system as well chemical or enzymatic synthesis or purification from a genetically modified Tobacco plant are other possible embodiments the protein recovery. The protein can be used both on a laboratory scale (e.g. in the Erlenmeyer flask) as well as on an industrial scale (e.g. Fermenter). The protein of the invention may e.g. by means of Binding of introduced at the beginning or the end of the protein Histidine residues (His-tag) to a suitable nickel-containing matrix be cleaned, a method which is known in the art.

Weitere Möglichkeiten der Reinigung können jegliche Art von Fusionsproteinen umfassen, die eine Aufreinigung über geeignete Matrices (Säulen, Gele, Beads etc.) erlauben. Andere Formen von tag's können Fusionspeptide/-proteine, z.B. Streptavidin-tag, Myc-tag und andere sein.Further options the cleaning can include any type of fusion protein that is suitable for purification Matrices (columns, Gels, beads, etc.). Other forms of tag's may include fusion peptides / proteins, e.g. Be streptavidin-tag, my-tag and others.

Eine bevorzugte Form des Proteins der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die native Form, aber auch eine denaturierte Form ist zur Bindung nicht-methylierter CpG-Motive geeignet. Unter „denaturierten Formen" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden andere Sekundärstrukturen als die in der Natur vorkommenden verstanden.A preferred form of the protein of the device according to the invention is the native Form, but also a denatured form is non-methylated to bond CpG motives suitable. Under denatured Shapes "in the sense In the present invention, secondary structures other than those described in U.S.P. Understood nature occurring.

Die native oder auch denaturierte Form des Proteins stellt eine beispielhafte Ausführungsform dar. Die Erfindung schließt die in vitro-Synthese sowie alle weiteren chemischen oder enzymatischen Modifikation des Proteins ein, wie z.B. Einbau von Disulfidbrücken, Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acylierungen, Aminosäureaustausche sowie Fusion mit Proteinen oder anderen Molekülen ein. Solche Modifikationen können z.B. durch Rekombination und/oder Expression und/oder chemische und/oder enzymatische Modifikation einzelner oder mehrerer Aminosäuren erzielt werden.The native or denatured form of the protein provides an exemplary embodiment The invention concludes the in vitro synthesis as well as all other chemical or enzymatic Modification of the protein, e.g. Incorporation of disulfide bridges, glycosylations, Phosphorylations, acylations, amino acid substitutions, and fusion with proteins or other molecules one. Such modifications may e.g. by recombination and / or expression and / or chemical and / or achieved enzymatic modification of single or multiple amino acids become.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Vielzahl von Vorteilen auf. So kann über das darin enthaltene Protein besser als das Wildtyp-CGPB-Protein oder Varianten davon mit 80% oder mehr Homologie nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA beispielsweise prokaryonte DNA über nicht-methylierte CpG-Motive binden. Dadurch ist es beispielsweise möglich, aus einem Gemisch von prokaryonter und eukaryonter DNA die prokaryonte DNA spezifisch abzutrennen und/oder anzureichern. Dies ermöglicht letztendlich einen schnellen und einfachen Erregernachweis sowie eine frühzeitige Diagnose von Infektionen, die durch bakterielle Erreger verursacht sein können. Vice versa kann die Erfindung auch zur Abreicherung mikrobieller DNA im Sinne einer Reinigung bei klinischen Zuständen angewandt werden, die mit einem unphysiologischen Vorkommen von Bakterien oder deren Spaltprodukten Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, von Patienten einhergehen. Dies gilt um so mehr, da gut belegt ist, daß Bakterien aber auch deren Spaltprodukte, wie beispielsweise bakterielle DNA, für eine Vielzahl den Patienten schädigenden biologischen Effekte verantwortlich sind.The inventive device has a variety of advantages. So can about the protein contained therein better than the wild-type CGPB protein or 80% variants thereof or more homology containing DNA containing non-methylated CpG motifs for example, prokaryotic DNA via bind unmethylated CpG motifs. This is what it is for example possible, from a mixture of prokaryotic and eukaryotic DNA the prokaryonte Separate and / or enrich DNA specifically. This ultimately allows one quick and easy pathogen detection as well as early detection Diagnosis of infections caused by bacterial pathogens could be. Vice versa, the invention can also for the depletion of microbial DNA in the sense of purification in clinical conditions which with a nonphysiological occurrence of bacteria or their cleavage products Body fluids especially blood, associated with patients. This is even more so since it is well documented that bacteria but also their cleavage products, such as bacterial DNA, for one Variety damaging the patient biological effects are responsible.

Antikörper, die gegen die Proteine der erfindungsgemäßen Vorrichtung gerichtet sind, können mono- oder polyklonale Antikörper sein. Sie können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wozu der Fachmann die notwendigen Materialien und Methoden kennt. Die Antikörper können zur Isolierung und Quantifizierung der Proteine verwendet werden. Auch hierbei handelt es sich um an sich bekannte Einsatzmöglichkeiten, für die der Fachmann die notwendigen Materialien und Methoden kennt.Antibodies that are directed against the proteins of the device according to the invention, can mono- or polyclonal antibody be. You can be prepared in a conventional manner, including the expert knows the necessary materials and methods. The antibodies can be used for Isolation and quantification of the proteins are used. Also These are known application possibilities, for which the Professional knows the necessary materials and methods.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben, wobeiThe Invention will be described below with reference to the figures, in which

1 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wiedergibt; 1 an embodiment of the device according to the invention reproduces;

2 eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung zeigt; und 2 shows a further embodiment of the device; and

3 eine hochparallele Ausführungsform der Vorrichtung wiedergibt. 3 a highly parallel embodiment of the device reproduces.

Der Begriff "Homologie" im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet den Grad der Übereinstimmung von zwei Protein-Sequenzen. Dabei bedeutet 60%ige Homologie, daß 60 von 100 Aminosäure-Positionen in den Sequenzen übereinstimmen. Der Ausdruck "verkürzt" wie er zur Charakterisierung des erfindungsgemäßen Proteins verwendet wird, bedeutet, daß die Länge der Aminosäuresequenz des Proteins gemäß SEQ-ID Nr. 1 kürzer als die Länge der Aminosäuresequenz des Wildtyp-CPGB-Proteins (CPGbP656) ist. Die Verkürzung erfolgt am N-terminalen und am C-terminalen Ende der Wildtyp-Proteinsequenz. Die größte Verkürzung stellt dabei die Reduktion der Sequenz bis zur DNA-Bindestelle des Proteins dar.Of the Term "homology" within the meaning of the present Invention refers to the degree of agreement of two protein sequences. 60% homology means that 60 out of 100 amino acid positions in the sequences match. The term "shortens" as he characterizes the protein of the invention is used means that the Length of amino acid sequence of the protein according to SEQ ID No. 1 shorter as the length the amino acid sequence of the wild-type CPGB protein (CPGbP656). The shortening takes place at the N-terminal and C-terminal ends of the wild-type protein sequence. The biggest reduction is while reducing the sequence to the DNA binding site of the protein represents.

Das Reaktionsgefäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann jede beliebige Form besitzen, welche in der Lage ist, das nicht-methylierte DNA bindende Protein aufzunehmen. Als vorteilhafte Ausführungsform hat sich ein Reaktionsgefäß erwiesen, das eine zylindrische Form besitzt.The Reaction vessel of the device according to the invention may have any form which is capable of being unmethylated To include DNA binding protein. As an advantageous embodiment proved to be a reaction vessel, which has a cylindrical shape.

Das Reaktionsgefäß besitzt mindestens eine Öffnung, die zum Befüllen des Reaktionsgefäßes dient. Diese Öffnung kann derart gestaltet sein, dass sie mittels eines Schraubverschlusses oder einer Passung kraftschlüssig und lösbar verschlossen werden kann (1).The reaction vessel has at least one opening which serves to fill the reaction vessel. This opening can be designed such that it can be closed by means of a screw cap or a fit non-positively and releasably ( 1 ).

In einer weiteren Ausführungsform besitzt das Reaktionsgefäß sich gegenüberstehende Öffnungen.In a further embodiment the reaction vessel has opposing openings.

In einer weiteren Ausführungsform ist das sich in dem Reaktionsgefäß befindende Protein an eine Matrix gekoppelt. Das Protein kann hierbei direkt oder indirekt an die Matrix gekoppelt sein. Als Matrix kommen hierbei Filtermembranen, Harze, Perlzellulose, Sepharose, Silica, Mikropartikel oder andere dem Fachmann bekannte Trägermaterialien zum Einsatz. In einer weiteren Ausführungsform ist das Protein an einen gegen das Protein gerichteten Antikörper gekoppelt.In a further embodiment is that located in the reaction vessel Protein coupled to a matrix. The protein can be directly or indirectly coupled to the matrix. As matrix come here Filter membranes, resins, perlcellulose, sepharose, silica, microparticles or other carrier materials known to those skilled in the art. In a further embodiment the protein is coupled to an antibody directed against the protein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Reaktionsgefäß mit einem Auffanggefäß verbunden, so dass eine Öffnung des Reaktionsgefäßes durch das Auffanggefäß umschlossen wird. Mit dieser Ausführungsform wird ein im wesentlichen abgeschlossener Hohlraum zwischen Reaktionsgefäß und Auffanggefäß geschaffen, der zur Aufnahme der Wasch- und Elutionsflüssigkeiten dient (2).In a further preferred embodiment, the reaction vessel is connected to a collecting vessel, so that an opening of the reaction vessel is enclosed by the collecting vessel. With this embodiment, a substantially closed cavity between the reaction vessel and collecting vessel is provided, which serves to receive the washing and elution liquids ( 2 ).

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können für eine parallele Reaktionsführung so angeordnet werden, dass die Anordnung eine Mehrzahl der erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfaßt, bevorzugt in Form einer Matrix, besonders bevorzugt im Mikrotiterplattenformat. Mit dieser Anordnung wird ein Einsatz in automatisierter Form mittels Pipetierrobotern ermöglicht.The Devices according to the invention can for one parallel reaction be arranged so that the arrangement a plurality of the devices according to the invention comprises preferably in the form of a matrix, particularly preferably in microtiter plate format. With this arrangement, an insert in automated form by means of Pipetting robots enabled.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert, ohne sie aber darauf einzuschränken.The Invention will be explained below by way of examples, without but limit it to it.

Beispiel 1: Herstellung eines Proteins der erfindungsgemäßen VorrichtungExample 1: Preparation a protein of the device according to the invention

Aus der DNA Sequenz für das komplette CPGbP Protein wurden die Primer 1 (GGATCCGGTGGAGGGCGCAAGAGGCCTG-fw, SEQ ID Nr. 3) und 2 (AAGCTTAGAGGTAGGTCCTCAT-CTGAG-rv, SEQ ID Nr. 4) konstruiert, die ein verkürztes DNA-Fragment amplifizieren, das für ein verkürztes CPG-bindendes Protein, CPGbP181 (SEQ ID Nr. 2), kodiert. Das DNA-Fragment wurde nach Spaltung mit den Restriktionsenzymen BamHI und Hind III in den Vektor pQE9 (Qiagen) ligiert. In pQE9 entsteht ein offener Leserahmen, in dem an das 5' Ende ein für 6 × His-Tag kodierendes DNA Fragment fusioniert wird (pQE9[6HisCPGbP181]).Out the DNA sequence for the complete CPGbP protein were primers 1 (GGATCCGGTGGAGGGCGCAAGAGGCCTG-fw, SEQ ID Nos. 3) and 2 (AAGCTTAGAGGTAGGTCCTCAT-CTGAG-rv, SEQ ID NO. 4) constructed, which is a shortened Amplify DNA fragment, that for a shortened one CPG-binding protein, CPGbP181 (SEQ ID NO: 2). The DNA fragment was cleaved with the restriction enzymes BamHI and Hind III ligated into the vector pQE9 (Qiagen). PQE9 creates an open one Reading frame in which at the 5 'end one for 6 × His-tag encoding DNA fragment is fused (pQE9 [6HisCPGbP181]).

Das Plasmid pQE9[6HisCPGbP181] wurde in den E. coli Expressionsstamm M15[pREP4] (Qiagen) transformiert. Der Klon wird im weiteren M15[pCPGbP181] bezeichnet und das exprimierte Protein rCPGbP181. Die Expression des Proteins rCPGbP181 erfolgte nach folgendem Protokoll: Eine Kolonie des Expressionsstammes M15[pCPGbP181] wird in 2 ml Luria Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Kanamycin bei 37°C unter Schütteln über Nacht angezüchtet. Anschließend wird die Vorkultur in 200 ml vorgewärmtes Nährmedium, das die gleichen Antibiotikakonzentrationen enthält, überführt. Nach 3 Stunden Wachstum bei 37°C unter Schütteln wird IPTG zur Induktion der Expression zugegeben und weitere 5 Stunden inkubiert. Danach werden die Bakterien abzentrifugiert und das Sediment in 5 ml 0.2 M Trispuffer, pH 7.5 resuspendiert. Die Bakterien werden im Eisbad 5 × 1 min mit Ultraschall behandelt. Nach der Zentrifugation wird das Sediment in 10 ml 0.2 M Tris, 2 M Harnstoff, pH 7.5 resuspendiert und 15 min geschüttelt. Nach erfolgter Zentrifugation wird das verbliebene Sediment in 0.2 M Tris, 6 M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol aufgenommen und suspendiert. Die Inclusionbodies werden unter Agitation für 1 Stunde bei Raumtemperatur gelöst. Nach Zentrifugation befindet sich das Rohprotein im Überstand und kann direkt auf eine 3 ml Ni-Agarosesäule aufgetragen werden. Die nächsten Schritte sollten im Kühlraum bei +4 bis +6°C erfolgen. Zunächst wird die Säule mit 0.2 M Tris, 6 M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol Puffer, pH 7.5 gewaschen bis die Extinktion die Nulllinie erreicht hat. Von hier aus kann rCPGbP181 auf verschiedenen Wegen gewonnen werden: 1. Als denaturiertes Protein gelöst in 6 M Guanidinhydrochlorid oder 6 M Harnstoff und 2. als natives Protein löslich in Puffern physiologischer Konzentration. Im 2. Fall ist die Ausbeute aber geringer.The plasmid pQE9 [6HisCPGbP181] was transformed into the E. coli expression strain M15 [pREP4] (Qiagen). The clone is further referred to as M15 [pCPGbP181] and the expressed protein rCPGbP181. The expression of the protein rCPGbP181 was carried out according to the following protocol: A colony of the expression strain M15 [pCPGbP181] is grown in 2 ml Luria medium with 100 ug / ml ampicillin and 25 ug / ml kanamycin at 37 ° C with shaking overnight. Subsequently, the preculture is transferred to 200 ml of prewarmed nutrient medium containing the same antibiotic concentrations. After 3 hours growth at 37 ° C with shaking, IPTG is added to induce expression and incubated for a further 5 hours. The bacteria are then centrifuged off and the sediment is resuspended in 5 ml of 0.2 M Tris buffer, pH 7.5. The bacteria are treated in the ice bath 5 × 1 min with ultrasound. After centrifugation, the sediment is resuspended in 10 ml of 0.2 M Tris, 2 M urea, pH 7.5 and shaken for 15 min. After centrifugation, the remaining sediment is taken up in 0.2 M Tris, 6 M guanidine hydrochloride, 0.001 M dithioeritrit (DTE), 0.02 M imidazole and suspended. The inclusion bodies become agitated for 1 hour Room temperature dissolved. After centrifugation, the crude protein is in the supernatant and can be applied directly to a 3 ml Ni agarose column. The next steps should be in the cold room at +4 to + 6 ° C. First the column is washed with 0.2 M Tris, 6 M guanidine hydrochloride, 0.001 M dithioeritrit (DTE), 0.02 M imidazole buffer, pH 7.5 until the extinction reaches the zero line. From here rCPGbP181 can be obtained in several ways: 1. As a denatured protein dissolved in 6 M guanidine hydrochloride or 6 M urea and 2. as a native protein soluble in buffers of physiological concentration. In the second case, the yield is lower.

Reinigung nach Methode 1 (denaturiert):
Das Protein rCPGbP181 wird von der Ni-NTA Agarose mit einem Imidazolgradienten von 0–0.5 M eluiert M in dem Puffer 0.2 M Tris, 6 M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol, pH 7.5 als Grundlage. Dabei wird rCPGbP181 bei 0.2–0.3 M Imidazol von der Säule abgelöst. Das so gewonnene Protein wird gegen 0.2 M Tris, 6 M Harnstoff, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), pH 7.5 dialysiert und eingefroren. Bei Dialyse gegen physiologische Puffer fällt so gereinigtes rCPGbP181 aus.Purification according to method 1 (denatured):
The protein rCPGbP181 is eluted from the Ni-NTA agarose with an imidazole gradient of 0-0.5 M in the buffer 0.2 M Tris, 6 M guanidine hydrochloride, 0.001 M dithioeritrit (DTE), 0.02 M imidazole, pH 7.5 as a basis. In this case, rCPGbP181 is detached from the column at 0.2-0.3 M imidazole. The protein thus obtained is dialyzed against 0.2 M Tris, 6 M urea, 0.001 M dithioeritrit (DTE), pH 7.5 and frozen. In dialysis against physiological buffer so purified rCPGbP181 precipitates.

Reinigung nach Methode 2 (nativ):
Nach dieser Methode wird die Guanidinhydrochlorid Konzentration von 6 molar auf der Ni-NTA Agarose mit dem gebundenem rCPGbP181 über einen Gradienten auf 0 molar Guanidinhydrochlorid gebracht. Grundlage ist der Puffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol, pH 7.5. Die Flussgeschwindigkeit betrug 0.5 ml/min. Danach wurde zur Elution ein Imidazolgradient von 0 bis 0.5 molar angelegt in Puffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), pH 7.5 als Grundlage. Auch hier wurde ein wesentlicher Anteil des gebundenen Proteins (20%) bei 0.2 bis 0.3 molar Imidazol eluiert. Dieses native rCPGbP181-Eluat blieb in diesem Puffer gelöst, auch nach Dialyse in PBS. Von Nachteil ist aber, dass ca. 80% des an Ni-NTA Agarose gebundenen rCPGbP181 unter diesen Bedingungen auf der Säule verblieben und nachträglich nur unter den denaturierenden Bedingungen von Methode 1 noch gewonnen werden konnten. Das heißt, die Ausbeute der verwendeten Methode 2 ergab nur 20% natives, in physiologischen Puffern lösliches rCPGbP181.Purification according to method 2 (native):
According to this method, the guanidine hydrochloride concentration of 6 molar on the Ni-NTA agarose with the bound rCPGbP181 is brought over a gradient to 0 molar guanidine hydrochloride. The basis is the buffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.001 M dithioeritrit (DTE), 0.02 M imidazole, pH 7.5. The flow rate was 0.5 ml / min. Thereafter, an imidazole gradient of 0 to 0.5 molar was applied for elution in buffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.001 M dithioeritrite (DTE), pH 7.5 as a basis. Again, a substantial portion of the bound protein (20%) was eluted at 0.2 to 0.3 molar imidazole. This native rCPGbP181 eluate remained dissolved in this buffer even after dialysis in PBS. However, it is disadvantageous that about 80% of the rCPGbP181 bound to Ni-NTA agarose remained on the column under these conditions and could subsequently only be recovered under the denaturing conditions of method 1. That is, the yield of Method 2 used gave only 20% native, physiologically buffer-soluble rCPGbP181.

Beispiel 2:Example 2:

Abtrennung/Anreicherung von bakterieller DNA aus einem Gemisch von humaner und bakterieller DNA mittels einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Dieses Beispiel wird anhand derSeparation / enrichment of bacterial DNA from a mixture of human and bacterial DNA by means of an embodiment the device according to the invention. This example is based on the

4, die eine schematische Beschreibung des Protokolls für den Nachweis bakterieller DNA wiedergibt und der 4 , which gives a schematic description of the protocol for the detection of bacterial DNA and the

5, die einen Vergleich der Ergebnisse der 16S rRNA Gen-PCR zum Nachweis von bakterieller DNA, welche ohne bzw. mit der Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus dem buffy coat klinischer Proben gewonnen wurde, zeigt,
beschrieben. 5 which shows a comparison of the results of the 16S rRNA gene PCR for the detection of bacterial DNA, which was obtained without or with the use of the device according to the invention from the buffy coat of clinical samples,
described.

Als beispielhafte Anwendung diente der Nachweis von bakterieller DNA in Vollblutproben von Patienten. Die zu untersuchende DNA wurde mittels dem Fachmann bekannten Verfahren aus dem Buffy Coat des Vollbluts klinischer Proben gewonnen. Somit stand ein Gemisch von humaner und bakterieller DNA für den Nachweis zur Verfügung. Die Beschreibung des Beispiels mit bakterieller DNA dient zur Beschreibung des Ausführungsbeispiels mit einer nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA und stellt keine Einschränkung der Erfindung dar.When Exemplary application was the detection of bacterial DNA in whole blood samples from patients. The DNA to be examined was by methods known in the art from the buffy coat of whole blood obtained clinical samples. Thus, a mixture of human and bacterial DNA for the proof available. The description of the example with bacterial DNA is for description of the embodiment containing DNA containing non-methylated CpG motifs no limitation of Invention.

Kopplung des Proteins gemäß Seq-ID Nr. 1 an die mit Aminohexyl-(AH)-Spacern präparierte Matrix (Sepharose).Coupling of the protein according to Seq-ID No. 1 to the aminohexyl (AH) spacer prepared matrix (Sepharose).

Zunächst wurde 1 ml AH-Sepharose nach Zugabe der bivalenten Substanz Glutaraldehyd 15 Minuten bei Raumtemperatur aktiviert. Anschließend wurde die Glutaraldehyd-aktivierte AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na₂HPO₄ gewaschen.First, 1 ml of AH-Sepharose was activated for 15 minutes at room temperature after addition of the bivalent substance glutaraldehyde. Subsequently, the glutaraldehyde-activated AH Sepharose was washed with 0.1 molar Na ₂ HPO ₄ .

Abschließend wurde das Protein (CPGbP187 gemäß SEQ ID Nr. 1) zur Kopplung auf die Matrix gegeben. Die Bindung des Proteins wurde über dessen freie Aminogruppen an die Glutaraldehyd-aktivierte AH-Sepharose nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur erreicht. Das überschüssige Protein wurde durch Waschen entfernt.In conclusion was the protein (CPGbP187 according to SEQ ID No. 1) for coupling to the matrix. The binding of the protein was over its free amino groups to the glutaraldehyde-activated AH-Sepharose after a two-hour Incubation at room temperature. The excess protein was washed off away.

Nach anschließendem Waschen der Protein-AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na₂HPO₄ und Zugabe von 0,1 molarem Glycin wurde die Protein-AH-Sepharose zur Absättigung freier Bindungsstellen 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Protein-AH-Sepharose erneut mit 0,1 molarem Na₂HPO₄ gewaschen.After subsequent washing of the protein AH Sepharose with 0.1 molar Na ₂ HPO ₄ and addition of 0.1 molar glycine, the protein AH Sepharose was incubated for 2 hours at room temperature to saturate free binding sites. Thereafter, the protein AH Sepharose was again washed with 0.1 molar Na ₂ HPO ₄ .

Zur Reduktion der Schiff'schen Base und Stabilisierung der Bindung wurde die Protein-AH-Sepharose mit Natriumborhydrid versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Protein-AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na₂HPO₄ gewaschen. Die Lagerfähigkeit der Protein-AH-Sepharose bei 4°C wird durch Zugabe von 20% Ethanol erreicht.To reduce the Schiff's base and stabilize the binding, the protein AH-Sepharose was mixed with sodium borohydride and incubated for 1 hour at room temperature. Thereafter, the protein AH Sepharose was washed with 0.1 molar Na ₂ HPO ₄ . The shelf life of the protein AH Sepharose at 4 ° C is achieved by adding 20% ethanol.

Konfektionierung der Vorrichtung zur Trennung/Anreicherung von bakterieller DNAAssembly of the device for separation / enrichment of bacterial DNA

Die Vorrichtung besteht aus einem kommerziell erhältlichen Minizentrifugenröhrchen. Dieses zylindrische Minizentrifugenröhrchen besitzt eine Öffnung zum Befüllen sowie einen im Durchmesser kleineren Auslass auf der gegenüberliegenden Seite. Zur Verhinderung des Auslaufens der Protein-AH-Sepharose befindet sich im unteren Drittel des Reaktionsgefäßes eine Fritte, die für Flüssigkeiten jedoch nicht für die Protein-AH-Sepharose durchlässig ist. Nach Befüllen des Reaktionsgefäßes mit Protein-AH-Sepharose wurde das Reaktionsgefäß anschließend mit TRIS-Puffer gewaschen und stand für die Trennung/Anreicherung von prokaryonter DNA zur Verfügung.The Device consists of a commercially available mini-centrifuge tube. This cylindrical mini-centrifuge tube has an opening for fill and a smaller diameter outlet on the opposite Page. To prevent the leakage of protein AH-Sepharose is located in the lower third of the reaction vessel one Fritters for liquids but not for the protein AH sepharose permeable is. After filling of the reaction vessel with Protein AH Sepharose, the reaction vessel was then washed with TRIS buffer and stood for the separation / enrichment of prokaryotic DNA available.

Zugabe des DNA-GemischesAddition of the DNA mixture

Zunächst wurde das DNA-Gemisch in das präparierte Reaktionsgefäß gegeben. Das DNA-Gemisch wurde mittels eines Vortex gleichmäßig in dem Reaktionsgefäß verteilt und ca. 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde das Reaktionsgefäß bei 15000 × g 30 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wurden ca. 100 μl Waschpuffer (W) (10 mM Tris, 10 mM EDTA; pH 7,5) in das Reaktionsgefäß pipettiert und bei 15000 × g 30 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Wiederholung dieses Waschvorgangs wurden 1000 μl Elutionspuffer (E1) (10 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,5 M NaCl; pH 7,5) in das Reaktionsgefäß pipettiert und wiederum bei 15000 × g 30 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Wiederholung dieses Elutionsschrittes wurde mit einem weiteren Elutionspuffer (E2) (10 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl; pH 7,5) in gleicher Weise verfahren.At first was the DNA mixture in the prepared Reaction vessel given. The DNA mixture was uniformed by vortexing in the Reaction vessel distributed and incubated for about 1 minute at room temperature. After that it became Reaction vessel at 15,000 × g for 30 seconds centrifuged at room temperature. Subsequently, about 100 .mu.l wash buffer (W) (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.5) is pipetted into the reaction vessel and at 15000 × g Centrifuged for 30 seconds at room temperature. After repetition this washing was 1000 ul Elution buffer (E1) (10 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.5 M NaCl, pH 7.5) pipetted into the reaction vessel and again at 15,000 x g Centrifuged for 30 seconds at room temperature. After repetition this elution step was treated with another elution buffer (E2) (10 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7.5) in the same way method.

Fällung der bakteriellen DNAPrecipitation of the bacterial DNA

Die in den Elutionspuffern (E1 und E2) gewonnene bakterielle DNA wurde anschließend mit 0,7 Volumenanteil Isopropanol (700 μl) gefällt. Das Präzipitat wurde 30 Minuten mit 15000 × g in der Tischzentrifuge sedimentiert, der Überstand vorsichtig abgekippt und verworfen. Das Sediment wurde mit 1 ml 70%-igen eiskaltem Ethanol gewaschen und 5 Minuten bei 15000 × g und Raumtemperatur zentrifugiert. Der verbleibende Überstand wurde vorsichtig dekantiert. Das Pellet wurde in der Vakuumzentrifuge getrocknet und anschließend in 30–50 μl TE-Puffer aufgenommen.The in the elution buffers (E1 and E2) was recovered bacterial DNA subsequently with 0.7 volume of isopropanol (700 ul) like. The precipitate was allowed to stand for 30 minutes 15000 × g sedimented in the bench top centrifuge, the supernatant was gently tipped off and discarded. The sediment was mixed with 1 ml of 70% ice-cold ethanol and centrifuged for 5 minutes at 15,000 x g and room temperature. The remaining supernatant was carefully decanted. The pellet was placed in the vacuum centrifuge dried and then in 30-50 μl of TE buffer added.

Nachweis der Abtrennung/Anreicherung der bakteriellen DNA aus dem DNA-GemischDetection of separation / enrichment the bacterial DNA from the DNA mixture

Zum Nachweis der Funktionsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurden sowohl die aus dem Buffy Coat ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung gewonnene DNA als auch die verschiedenen Fraktionen, welche unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung gewonnen wurden, mittels einer 16S rRNA Gen-PCR auf das Vorhandensein von bakterieller DNA untersucht (4).To demonstrate the mode of operation of the device according to the invention, both the DNA obtained from the buffy coat without using the device according to the invention and the various fractions obtained using the device according to the invention were examined for the presence of bacterial DNA by means of a 16S rRNA gene PCR ( 4 ).

Die Qualität der durchgeführten PCR wurde durch Zufügen von Positiv-(Staphylocuccus aureus-DNA als Template) und Negativkontrollen (Mastermix ohne DNA-Zugabe) abgesichert. Des weiteren wurde parallel zu der ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten DNA eine definierte Menge an bakterieller DNA (S. aureus-DNA) als Inhibitionskontrolle mitgeführt.The quality the carried out PCR was done by adding positive (Staphylococcus aureus DNA as template) and negative controls (Mastermix without DNA addition) secured. Furthermore, it became parallel to used without the use of the device according to the invention DNA a defined amount of bacterial DNA (S. aureus DNA) as Inhibition control included.

Die Ergebnisse wurden anschließend mittels einer Agarosegelelektrophorese analysiert (5). Die in 5 gezeigten Banden des Agarosegels haben folgende Bedeutung (von links nach rechts):

F: Durchlauf-Fraktion (unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)
W: Wasch-Fraktion (unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)
E1: Elutionspuffer 1 (unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)
E2: Elutionspuffer 2 (unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)
DNA: aus Buffy coat isolierte DNA (ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)
I: Inhibitionskontrolle (ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)
P: Positivkontrolle
N: Negativkontrolle
S: Standard

The results were then analyzed by agarose gel electrophoresis ( 5 ). In the 5 The bands of the agarose gel shown have the following meaning (from left to right):

F: Passage fraction (using the device according to the invention)
W: Washing fraction (using the device according to the invention)
E1: Elution buffer 1 (using the device according to the invention)
E2: Elution buffer 2 (using the device according to the invention)
DNA: DNA isolated from buffy coat (without use of the device according to the invention)
I: Inhibition control (without use of the device according to the invention)
P: positive control
N: negative control
S: default

Das Beispiel verdeutlicht, dass in der Durchlauf- und Waschfraktion, in der Negativkontrolle sowie in der DNA, welche ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung untersucht wurde, keine bakterielle DNA nachgewiesen werden konnte. Demgegenüber konnte in den Elutionspuffern 1 und 2, der Positiv- und Inhibitionskontrolle eindeutig das Vorhandensein von bakterieller DNA durch Nachweis des 16S rRNA Gens mittels PCR gezeigt werden. Das positive Ergebnis der Inhibitionskontrolle schließt eine mögliche Hemmung der DNA-Probe, welche ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung analysiert wurde, aus.The Example illustrates that in the flow and wash fraction, in the negative control as well as in the DNA, which without use of the Device according to the invention was examined, no bacterial DNA could be detected. In contrast, could in the elution buffers 1 and 2, the positive and inhibition control clearly the presence of bacterial DNA by detection of the 16S rRNA gene by PCR. The positive result the inhibition control closes a possible Inhibition of the DNA sample, which without use of the device according to the invention analyzed.

Somit zeigen die Ergebnisse, dass die beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung in der Lage ist, bakterielle DNA aus Patientenproben mit einem hohen Anteil humaner DNA abzutrennen/anzureichern und für eine anschließende Analyse verfügbar zu machen.Consequently show the results that the device according to the invention described is able to detect bacterial DNA from patient samples with a high Separate / enrich human DNA fraction for subsequent analysis available close.

SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENCE LISTING

Claims

Device for enrichment and / or separation comprising DNA containing non-methylated CpG motifs a) a reaction vessel with at least an opening and b) a protein containing non-methylated CpG motifs over a Specifically recognizes binding site, the protein being 25% to 35% homology to wild-type CGPB protein and to this is shortened, in which the protein is inside the reaction vessel.

The device of claim 1, wherein the protein is the amino acid sequence according to the Seq-ID No. 1 or Seq-ID No. 2.

Apparatus according to claim 1 or claim 2, wherein the protein is coupled to a matrix.

Apparatus according to claim 3, wherein the matrix is a Filter membrane, a resin, pearl cellulose, sepharose or silica.

Apparatus according to claim 3 or claim 4, wherein the protein over an antibody is coupled.

Device according to one or more of the preceding Claims, wherein the reaction vessel is a cylindrical Form has.

Device according to one of the preceding claims, wherein the reaction vessel on im essentially opposite Each with an opening is provided.

Apparatus according to claim 7, wherein at least one the openings of the reaction vessel with a lid can be closed.

Apparatus according to claim 8, wherein the closing of the opening by a non-positive Fit the lid or a screw connection between the lid and reaction vessel realized becomes.

Device according to one of the preceding claims, wherein the reaction vessel made of plastic consists.

Device according to one of the preceding claims, wherein the reaction vessel at least partly taken from a collecting vessel is created and a substantially closed cavity between the reaction vessel and collecting vessel becomes.

Arrangement for enrichment and / or separation of DNA containing non-methylated CpG motifs comprising a plurality of devices according to one the claims 1 to 11.

Arrangement according to claim 12, wherein the devices are arranged in the form of a matrix.

Arrangement according to claim 13, with the devices arranged in microtiter plate format are.