DE102009021681B4

DE102009021681B4 - Use of Staphylococcus aureus-binding peptides, methods and kits for the enrichment, immobilization and detection of Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus binding peptide and nucleic acid encoding same

Info

Publication number: DE102009021681B4
Application number: DE102009021681A
Authority: DE
Inventors: Thidarat Juthong; Philipp Weber; Dr.rer.nat.Ing.habil Boschke Elke; Juliane Steingroewer
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2009-05-13
Filing date: 2009-05-13
Publication date: 2012-12-27
Anticipated expiration: 2029-05-14
Also published as: DE102009021681A1

Abstract

Verwendung mindestens eines Peptids, das einen mindestens acht Aminosäuren langen Abschnitt aus eineID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13 enthält zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus.Use of at least one peptide that is at least eight amino acids long from an ID NO. 1 to SEQ ID NO. 13 contains for the enrichment, immobilization, detection and / or marking of Staphylococcus aureus.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Staphylococcus aureus bindenden Peptiden, sowie Verfahren und Kits zur Anreicherung, Immobilisierung und zum Nachweis von Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus bindende Peptide und dafür kodierende Nukleinsäure gemäß den Patentansprüchen.The invention relates to the use of Staphylococcus aureus binding peptides, and methods and kits for enrichment, immobilization and for the detection of Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus binding peptides and nucleic acid encoding therefor according to the claims.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Peptiden, die affin an die Oberfläche bzw. die extrazellulären Strukturen von Staphylococcus aureus binden zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus sowie Verfahren und Kits zur Anreicherung und zum Nachweis von Staphylococcus aureus. Die Erfindung betrifft weiterhin die Kopplung von therapeutisch wirksamen Substanzen an diese erfindungsgemäß verwendeten Peptide.The invention thus relates to the use of peptides which bind affinity to the surface or the extracellular structures of Staphylococcus aureus for the enrichment, immobilization, detection and / or labeling of Staphylococcus aureus and methods and kits for enrichment and for the detection of Staphylococcus aureus , The invention further relates to the coupling of therapeutically active substances to these peptides used in the invention.

Anwendungsgebiete der Erfindung sind insbesondere die Medizin, Tiermedizin Krankenhäuser, andere Gesundheits- und Pflegeeinrichtungen sowie weitere Gebiete mit hohen Hygienestandards, so z. B. die Lebensmittel- und Pharmaindustrie.Areas of application of the invention are in particular the medicine, veterinary hospitals, other health and care facilities as well as other areas with high standards of hygiene, such. B. the food and pharmaceutical industries.

Staphylococcus aureus hat eine kugelförmige Morphologie, bei einem Durchmesser der Zellen von 0,8–1,2 μm. Es gehört zu den Gram-positiven Bakterien und ist nicht in der Lage, Endosporen zu bilden. Staphylococcus aureus ist ubiquitär verbreitet und besiedelt u. a. Schleimhäute. Unter Umständen kann Staphylococcus aureus pathogen sein und induziert Hautinfektionen, Lungenentzündungen, Endokarditis, Toxisches Schock-Syndrom und Sepsis.Staphylococcus aureus has a spherical morphology, with a cell diameter of 0.8-1.2 μm. It belongs to the Gram-positive bacteria and is unable to form endospores. Staphylococcus aureus is ubiquitous and inhabits u. a. Mucous membranes. Staphylococcus aureus may be pathogenic, inducing skin infections, pneumonia, endocarditis, toxic shock syndrome and sepsis.

Zum Nachweis von Staphylococcus aureus kommen derzeit verschiedene, z. T. in die amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG aufgenommene Untersuchungsmethoden zur Anwendung. Dabei handelt es sich um kulturelle, immunologische bzw. molekularbiologische Nachweisverfahren. Es ist möglich, diese Verfahren zu kombinieren.For the detection of Staphylococcus aureus are currently various, eg. T. used in the official collection of examination procedures under §35 LMBG investigation methods used. These are cultural, immunological or molecular biological detection methods. It is possible to combine these procedures.

Die konventionelle Detektion von Staphylococcus aureus, auch in Lebensmitteln, wird in der Regel folgendermaßen durchgeführt:

– Voranreicherung
– Isolierung auf Selektivnährböden
– Selektiv-Anreicherung in Flüssigkultur
– Koagulase-Test
– Biochemische Identifizierung

Auch die MPN ist eine etablierte Methode.The conventional detection of Staphylococcus aureus, even in food, is usually carried out as follows:

- Pre-enrichment
- Isolation on selective nutrient media
- Selective enrichment in liquid culture
- coagulase test
- Biochemical identification

The MPN is also an established method.

Bis zum ersten Ergebnis nach Isolierung der Keime auf Selektivnährböden wird ein Untersuchungszeitraum von mindestens 4 bis 6 Tagen benötigt.Until the first result after isolation of the germs on selective nutrient media, a test period of at least 4 to 6 days is required.

Neben den klassischen Tests kommen auch immunologische Nachweisverfahren, wie Immunfluoreszenztests oder ELISA zum Einsatz.In addition to the classical tests, immunological detection methods such as immunofluorescence tests or ELISA are also used.

Für den molekularbiologischen Nachweis von Staphylococcus aureus stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Er kann beispielsweise mittels Gensonden im Zuge der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung oder mit der Polymerase-Kettenreaktion erfolgen.Various methods are available for the molecular biological detection of Staphylococcus aureus. It can be done for example by means of gene probes in the course of fluorescence in situ hybridization or with the polymerase chain reaction.

Den genannten modernen Verfahren ist der Nachteil eigen, dass die Sensitivität nicht ausreichend hoch ist, d. h. die Keime müssen nach wie vor auf eine Zellzahl größer als das notwendige Detektionslimit angereichert werden.The above-mentioned modern methods have the disadvantage that the sensitivity is not sufficiently high, i. H. the germs must still be enriched to a cell count greater than the required detection limit.

Mit Hilfe von superparamagnetischen, mit entsprechenden Liganden, z. B. Antikörpern, beschichteten Partikeln ist ein Aufkonzentrieren der Keime möglich.With the help of superparamagnetic, with appropriate ligands, z. As antibodies, coated particles is a concentration of the germs possible.

Für den Nachweis und die Charakterisierung von Mikroorganismen und deren Dauerformen (Sporen) werden als nachzuweisende Zielmoleküle neben den von den Zellen ausgeschiedenen Stoffwechselprodukten und anderen Zellbestandteilen oder Molekülen auch die Zellen selbst verwendet. Hierzu werden die Zellen nach dem Stand der Technik mit speziellen Immunoglobulinen (Antikörpern), aber auch anderen bindenden Molekülen (z. B. Lektinen) markiert. Diesen Molekülen ist gemeinsam, dass sie spezielle Zellstrukturen erkennen und daran binden. Dabei ist die Selektivität des Nachweisverfahrens sehr stark von den zur Markierung eingesetzten Molekülen abhängig, weshalb z. B. der Einsatz von Lektinen bei Systemen mit einer hohen Diversität der stofflichen Zusammensetzung ungeeignet ist.For the detection and characterization of microorganisms and their permanent forms (spores), the target molecules to be detected are, in addition to the metabolites excreted by the cells and other cell components or molecules, also the cells themselves. For this purpose, the cells are labeled according to the prior art with specific immunoglobulins (antibodies), but also other binding molecules (eg lectins). These molecules have in common that they recognize and bind to specific cell structures. The selectivity of the detection method is very strong from those for labeling used molecules, which is why z. B. the use of lectins in systems with a high diversity of the material composition is unsuitable.

Auch der Einsatz von Antikörpern für Nachweisverfahren hat einige Nachteile. Zunächst müssen spezifische Antikörper hergestellt werden. Dies geschieht zunächst durch Immunisierung von Tieren mit dem Zielantigen oder einem Bestandteil daraus. Hierbei ist jedoch nicht sichergestellt, dass die gewünschte Immunantwort auch erzielt wird. Falls eine Immunantwort stattgefunden hat und das Serum nach einiger Zeit einen genügend hohen Titer an spezifischen Antikörpern gegen das Zielantigen aufweist, werden B-Lymphozyten und Antikörper aus dem Blut des Tieres isoliert und mittels bekannter Methoden aufgereinigt. Diese Antikörper werden unabhängig von ihrem Reinheitsgrad als polyklonale Antikörper bezeichnet. Sie reagieren auf alle Antigene, zu denen das Tier bis zum Zeitpunk der Isolation Kontakt hatte und auf die eine Immunantwort erfolgt ist. Unerwünschte Kreuzreaktionen mit fremden, den Zielantigenen nicht unbedingt verwandten Antigenen werden daher häufig beobachtet und stellen einen wesentlichen Nachteil dar. Die Antikörper können zwar in weiteren Arbeitsschritten für ein bestimmtes Antigen angereichert werden, dies ist jedoch extrem zeitaufwändig und mit hohen Kosten verbunden. Ein weiterer Nachteil polyklonaler Antikörper liegt in der begrenzten Lebensdauer der B-Lymphozyten. Diese können nicht kultiviert werden und sterben nach einer gewissen Zeit ab. Zwischen verschiedenen Chargen polyklonaler Antikörper gibt es daher immer unerwünschte Qualitätsschwankungen.The use of antibodies for detection methods also has some disadvantages. First, specific antibodies must be produced. This is done first by immunizing animals with the target antigen or a component thereof. However, this does not ensure that the desired immune response is achieved. If an immune response has taken place and the serum has a sufficiently high titre of specific antibodies to the target antigen after some time, B lymphocytes and antibodies are isolated from the blood of the animal and purified by known methods. These antibodies are called polyclonal antibodies regardless of their purity. They respond to all antigens to which the animal had contact until the time of isolation and to which an immune response has occurred. Unwanted cross-reactions with foreign antigens that are not necessarily related to the target antigens are therefore frequently observed and represent a significant disadvantage. Although the antibodies can be enriched in further working steps for a particular antigen, this is extremely time-consuming and involves high costs. Another disadvantage of polyclonal antibodies lies in the limited lifespan of B lymphocytes. These can not be cultured and die off after a period of time. Therefore, there are always undesirable quality fluctuations between different batches of polyclonal antibodies.

Des Weiteren ist es möglich, durch entsprechende Fusionstechniken einzelne Antikörper produzierende B-Lymphozyten mit einer Tumor-Zellinie zu Hybridoma-Zelllinien zu verschmelzen. Die entstehenden Hybridoma-Zellen können in vitro kultiviert werden. So lassen sich monoklonale Antikörper in Zellkulturen gewinnen. Die Hybridoma-Techniken sind jedoch langwierig und teuer. Die Entwicklung neuer monoklonaler Antikörper erfolgt in mehreren Teilschritten: Immunisierung, Fusion, Selektion, Screening und Charakterisierung. Eventuell folgen weitere Modifikationen, die die Eigenschaften der monoklonalen Antikörper verbessern. Zudem ist es nicht in allen Fällen ohne Probleme möglich, Antikörper gegen das Zielantigen zu gewinnen, besonders wenn es sich hierbei um ganze, intakte Zellen handelt. Teilweise kommt es auch zum Absterben der Hybridoma-Zelllinie. Dies stellt einen weiteren Nachteil dar, da entsprechende Kopplungsprotokolle für Nachweisverfahren zeitaufwändig neu etabliert werden müssen.Furthermore, it is possible to fuse individual antibody-producing B lymphocytes with a tumor cell line to hybridoma cell lines by appropriate fusion techniques. The resulting hybridoma cells can be cultured in vitro. Thus monoclonal antibodies can be obtained in cell cultures. However, the hybridoma techniques are tedious and expensive. The development of new monoclonal antibodies takes place in several steps: immunization, fusion, selection, screening and characterization. There may be further modifications that improve the properties of the monoclonal antibodies. In addition, it is not always possible without problems to obtain antibodies against the target antigen, especially if these are whole, intact cells. Partly it also comes to the death of the hybridoma cell line. This represents a further disadvantage, since corresponding coupling protocols for detection methods must be time-consuming newly established.

WO 2004/087760 A1 offenbart Hepatitis C Virus Antikörper und unter anderem die Peptide HSSWYIQHFPPL und WSPGQQRLHNST. US 2004/0102382 A1 offenbart Peptide (u. a. WSPGQQRLHNST und XHSLHVHKGLSELX, wobei X jeweils eine beliebige Aminosäure ist) zur Erkennung und Behandlung von Tumoren, insbesondere des Herzens. CN 1858253 offenbart Peptide (u. a. GMBP28 TPPPRDASLSRW) zur Behandlung von Chemotherapieresistenten Magenkarzinomen. T. Bratkovic et. al. (J Basic Mcirobio 48: 202–206) offenbart Peptidinhibitoren (u. a. MD-12 HSSWYIQHFPPL) von Enzymen der bakteriellen Zellwandbiosynthese. WO 2004/087760 A1 discloses hepatitis C virus antibodies and among others the peptides HSSWYIQHFPPL and WSPGQQRLHNST. US 2004/0102382 A1 discloses peptides (including WSPGQQRLHNST and XHSLHVHKGLSELX, where X is any amino acid) for the detection and treatment of tumors, particularly the heart. CN 1858253 discloses peptides (including GMBP28 TPPPRDASLSRW) for the treatment of chemotherapy-resistant gastric carcinomas. T. Bratkovic et. al. (J Basic Mcirobio 48: 202-206) discloses peptide inhibitors (including MD-12 HSSWYIQHFPPL) of bacterial cell wall biosynthesis enzymes.

Aufgabe der Erfindung ist es, einfache, sensitive, spezifische und möglichst schnell durchführbare Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, Markierung und/oder zum Nachweis von Staphylococcus aureus anzugeben, die nicht auf der Verwendung von Antikörpern basieren. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, die entsprechenden Nachweisreagenzien und Kits zur Durchführung dieser Verfahren anzugeben.The object of the invention is to provide simple, sensitive, specific and as quickly as possible feasible method for enrichment, immobilization, labeling and / or detection of Staphylococcus aureus, which are not based on the use of antibodies. A further object of the invention is to specify the corresponding detection reagents and kits for carrying out these methods.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines oder mehrerer Peptide, das oder die einen mindestens acht, bevorzugt zwölf Aminosäuren langen Abschnitt aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13 enthält, zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder Markierung von Staphylococcus aureus.According to the invention, the object is achieved by the use of one or more peptides, which or at least eight, preferably twelve amino-acids long section of an amino acid sequence according to one of the sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 13, for the enrichment, immobilization, for the detection and / or labeling of Staphylococcus aureus.

Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz des Peptids eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13. SEQ ID NO. 1: Gly Asn His Ser Thr Thr Asn Met His Pro Pro Leu SEQ ID NO. 2: His Ser Ser Trp Tyr Ile Gln His Phe Pro Pro Leu SEQ ID NO. 3: Trp Ser Pro Gly Gln Gln Arg Leu His Asn Ser Thr SEQ ID NO. 4: His Ser Leu His Val His Lys Gly Leu Ser Glu Leu SEQ ID NO. 5: Gly Pro Ser Ile Ile Pro Gly Tyr Leu Ser Ile Thr SEQ ID NO. 6: His Thr Asp Trp Arg Leu Gly Thr Trp His His Ser SEQ ID NO. 7: Gln Ser Tyr His Arg His Gln Gln Tyr His Gly Asn SEQ ID NO. 8: Ser Leu Thr His Ala Trp Gln Gln Thr His Phe Leu SEQ ID NO. 9: Phe Thr Thr Ser Asn His Thr Ser Arg His Gly Ser SEQ ID NO. 10: Thr Pro Pro Pro Arg Asp Ala Ser Leu Ser Arg Trp SEQ ID NO. 11: Asp Gly Leu Leu Thr Arg His Pro Leu His Pro Tyr SEQ ID NO. 12: Asn Glu Met Phe Glu Leu Ile Pro Leu Ser Pro Ala SEQ ID NO. 13: Asn Ile Leu Lys His Val Ser Val Asp Thr Ala Ala Preferably, the amino acid sequence of the peptide is one of the sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 13th SEQ ID NO. 1: Gly Asn His Ser Thr Thr Asn mead His Per Per Leu SEQ ID NO. 2: His Ser Ser Trp Tyr Ile Gln His Phe Per Per Leu SEQ ID NO. 3: Trp Ser Per Gly Gln Gln bad Leu His Asn Ser Thr SEQ ID NO. 4: His Ser Leu His Val His Lys Gly Leu Ser Glu Leu SEQ ID NO. 5: Gly Per Ser Ile Ile Per Gly Tyr Leu Ser Ile Thr SEQ ID NO. 6: His Thr Asp Trp bad Leu Gly Thr Trp His His Ser SEQ ID NO. 7: Gln Ser Tyr His bad His Gln Gln Tyr His Gly Asn SEQ ID NO. 8th: Ser Leu Thr His Ala Trp Gln Gln Thr His Phe Leu SEQ ID NO. 9: Phe Thr Thr Ser Asn His Thr Ser bad His Gly Ser SEQ ID NO. 10: Thr Per Per Per bad Asp Ala Ser Leu Ser bad Trp SEQ ID NO. 11: Asp Gly Leu Leu Thr bad His Per Leu His Per Tyr SEQ ID NO. 12: Asn Glu mead Phe Glu Leu Ile Per Leu Ser Per Ala SEQ ID NO. 13: Asn Ile Leu Lys His Val Ser Val Asp Thr Ala Ala

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Peptid, welches einen mindestens acht Aminosäuren, bevorzugt mindestens zwölf Aminosäuren, langen Abschnitt aus einer Amnisäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1, 5 bis 9 und 11 bis 13 enthält.The invention also provides a peptide which has at least eight amino acids, preferably at least twelve amino acids, a long section from an amani acid sequence selected from the sequences according to SEQ ID NO. Contains 1, 5 to 9 and 11 to 13.

Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide binden überraschend affin und spezifisch an die Oberfläche bzw. an extrazelluläre Strukturen von Staphylococcus aureus und sind daher geeignet, in Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren zur Anreicherung und/oder zum Nachweis von Staphylococcus aureus eingesetzt zu werden.The peptides used according to the invention bind surprisingly affinely and specifically to the surface or extracellular structures of Staphylococcus aureus and are therefore suitable for use in enrichment or detection methods for the enrichment and / or detection of Staphylococcus aureus.

Die aufwändige Herstellung und Verwendung von Antikörpern in entsprechenden Nachweisverfahren kann so auf vorteilhafte Weise vermieden werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide lassen sich zudem mit herkömmlichen Syntheseverfahren leicht und in sehr hoher Reinheit herstellen. Daher kann eine gleichbleibende, chargenunabhängige Produktqualität erzielt werden, insbesondere im Hinblick auf die Reinheit und Stabilität. Die Handhabung der in Immobilisierungs- und/oder Nachweisverfahren einzusetzenden Reagenzien wird ebenfalls vereinfacht, so dass insgesamt die Immobilisierung und/oder der Nachweis von Staphylococcus aureus schneller, mit höherer Reproduzierbarkeit und mit geringerem Gesamtaufwand ermöglicht wird. Zudem ist es einfacher, Nachweis- und/oder Immobilisierungsverfahren zu miniaturisieren und zu automatisieren, in denen statt Antikörpern Fängerpeptide verwendet werden.The complex preparation and use of antibodies in corresponding detection methods can thus be advantageously avoided. The peptides used according to the invention can also be prepared easily and in very high purity by conventional synthesis processes. Therefore, a consistent, batch-independent product quality can be achieved, especially with regard to purity and stability. The handling of the reagents to be used in immobilization and / or detection methods is likewise simplified, so that immobilization and / or the detection of Staphylococcus aureus overall is made possible faster, with higher reproducibility and with less total effort. In addition, it is easier to miniaturize and automate detection and / or immobilization methods in which capture peptides are used instead of antibodies.

Bevorzugt verwendet werden solche Peptide, die einen zumindest 10 Aminosäuren, bevorzugt 12 Aminosäuren, langen Ausschnitt einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 und/oder SEQ ID NO. 4 und/oder SEQ ID NO. 8 umfassen. Diese Peptide haben sich als besonders geeignet zum Binden an Staphylococcus aureus herausgestellt. Sie können auch in komplexen Proben spezifisch und mit hoher Ausbeute an Staphylococcus aureus binden.Preference is given to using those peptides which have at least 10 amino acids, preferably 12 amino acids, a long section of an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 and / or SEQ ID NO. 4 and / or SEQ ID NO. 8 include. These peptides have been found to be particularly suitable for binding to Staphylococcus aureus. They are also able to bind specifically and in high yield to Staphylococcus aureus in complex samples.

Besonders bevorzugt verwendet werden Peptide der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 und SEQ ID NO. 4 und SEQ ID NO. 8 Diese Peptide sind besonders spezifisch für Staphylococcus aureus und weisen eine hohe Affinität für diesen Mikroorganismus auf. Sie sind daher in besonderer Weise geeignet, an Staphylococcus aureus in Proben zu binden.Particular preference is given to using peptides of the amino acid sequence SEQ ID NO. 2 and SEQ ID NO. 4 and SEQ ID NO. 8 These peptides are particularly specific for Staphylococcus aureus and have a high affinity for this microorganism. They are therefore particularly suitable for binding to Staphylococcus aureus in samples.

Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide besitzen eine Affinität für Staphylococcus aureus. Sie sind daher gut zur Verwendung als Sonden für Staphylococcus aureus einsetzbar. Dazu werden sie vorteilhafterweise mit einem leicht nachweisbaren Marker versehen. Geeignete Marker (wie z. B. Biotin, Fluoreszenzfarbstoffe oder auch Radionukleotide) sind dem Fachmann aus zahlreichen Anwendungen, beispielsweise aus ELISA, bekannt.The peptides used according to the invention have an affinity for Staphylococcus aureus. They are therefore well-suited for use as probes for Staphylococcus aureus. For this they are advantageously provided with an easily detectable marker. Suitable markers (such as, for example, biotin, fluorescent dyes or radionucleotides) are known to the person skilled in the art from numerous applications, for example from ELISA.

Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein erfindungsgemäß verwendetes Peptid, das einen detektierbaren Marker enthält.A component of the invention is therefore also a peptide used according to the invention which contains a detectable marker.

Durch die Kopplung an den detektierbaren Marker eignen sich die erfindungsgemäß verwendeten Peptide vorteilhaft zur spezifischen Markierung und zum spezifischen Nachweis von Staphylococcus aureusBy coupling to the detectable marker, the peptides used in the invention are advantageously suitable for the specific labeling and specific detection of Staphylococcus aureus

Bei dem detektierbaren Marker handelt es sich bspw. um partikuläre Marker (z. B. Goldpartikel), Fluorochrome, Isotope, Markerproteine, wie z. B. fluoreszierende Proteine (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP)), Amplifikatoren, z. B. Enzyme, die eine Reaktion katalysieren, welche ein Signal in Form eines sichtbaren Farbstoffpräzipitates, einer sichtbaren Farbstoffabspaltung oder Chemo- bzw. Biolumineszenz liefert.The detectable marker is, for example, particulate markers (for example gold particles), fluorochromes, isotopes, marker proteins, such as eg. For example, fluorescent proteins (e.g., green fluorescent protein (GFP)), amplifiers, e.g. For example, enzymes that catalyze a reaction that provides a signal in the form of a visible dye precipitate, a visible dye cleavage or chemo- or bioluminescence.

Die verschiedenen detektierbaren Marker werden mittels bekannter Verfahren an das erfindungsgemäß verwendete Peptid gekoppelt. Werden beispielsweise GFP oder enzymatisch aktive Amplifikatoren als detektierbare Marker eingesetzt, erfolgt die Kopplung des Peptides an den Marker geeigneterweise durch Fusion der für das Peptid kodierenden DNA-Sequenz mit der DNA-Sequenz von GFP bzw. des enzymatisch aktiven Amplifikators mittels üblicher gentechnischer Verfahren.The various detectable markers are coupled by known methods to the peptide used according to the invention. If, for example, GFP or enzymatically active amplifiers are used as detectable markers, the coupling of the peptide to the marker is suitably carried out Fusion of the DNA sequence coding for the peptide with the DNA sequence of GFP or the enzymatically active amplifier by means of conventional genetic engineering methods.

Es ist auch möglich, den Marker erst nach der Bindung an Staphylococcus aureus am Peptid anzubringen. Dies kann beispielsweise durch Vermittlung eines Linkers wie Biotin-Streptavidin bzw. Biotin-Avidin geschehen, indem das Peptid z. B. biotinyliert ist. Nach der Bindung des Peptids an Staphylococcus aureus werden Streptavidin und die biotinylierte katalytisch wirkende Einheit zugegeben. Streptavidin vermittelt dann die Bindung der katalytisch wirkenden Einheit an das Peptid.It is also possible to attach the marker to the peptide only after binding to Staphylococcus aureus. This can be done for example by mediating a linker such as biotin-streptavidin or biotin-avidin by the peptide z. B. is biotinylated. After binding of the peptide to Staphylococcus aureus, streptavidin and the biotinylated catalytic moiety are added. Streptavidin then mediates binding of the catalytic moiety to the peptide.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein erfindungsgemäß verwendetes Peptid an einen Träger gebunden.In a preferred embodiment of the invention, at least one peptide used according to the invention is bound to a carrier.

Bei dem Träger handelt es sich bevorzugt um eine feste Phase, insbesondere können die in bekannten Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren verwendeten festen Träger eingesetzt werden, z. B. Mikrotiterplatten, Biochips oder Dip-Sticks.The carrier is preferably a solid phase, in particular the solid carriers used in known enrichment or detection methods can be used, for. B. microtiter plates, biochips or dip sticks.

Als feste Träger geeignet sind Metallkörper, beispielsweise Goldfolien und goldbeschichtete Träger wie z. B. in Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie(Surface Plasmon Resonance, SPR)-Systemen. Ferner können Kunststoffkörper bzw. kunststoffbeschichtete Körper als feste Träger verwendet werden, bspw. Polystyrol- oder Polymethylmethacrylat-Träger. Daneben können auch Glasträger, Gele oder andere, zur Herstellung von Biochips geeignete Träger, verwendet werden.Suitable solid supports are metal body, such as gold foils and gold-coated support such. In surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy systems. Furthermore, plastic bodies or plastic-coated bodies can be used as solid carriers, for example polystyrene or polymethyl methacrylate carriers. In addition, it is also possible to use glass carriers, gels or other carriers which are suitable for the production of biochips.

Indem das erfindungsgemäß verwendete Peptid an einen festen Träger gebunden ist, wird es auf vorteilhaft einfache Weise möglich, Staphylococcus aureus aus Proben zu immobilisieren, zu gewinnen und/oder z. B. für die nachfolgende Detektion anzureichern bzw. Staphylococcus aureus zu detektieren.By virtue of the fact that the peptide used according to the invention is bound to a solid carrier, it is advantageously possible to immobilize Staphylococcus aureus from samples, to recover it and / or to remove it, for example. B. for subsequent detection or to detect Staphylococcus aureus.

Das erfindungsgemäß verwendete Peptid wird durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren an den festen Träger gebunden, bspw. durch Adsorption an den festen Träger. Ein mit einer Beschichtung versehener Träger bewirkt ebenfalls die Bindung des Peptids, z. B. bindet ein mit Streptavidin beschichteter Träger das Peptid nach dessen Biotinylierung. Andere mögliche Beschichtungen zum Binden eines Peptids sind z. B. Serumalbumin oder Cystamindihydrochlorid ggf. in Kombination mit N-succinimidyl-3-maleimidopropionat. Das Peptid kann auch mit einem Nukleinsäure-Linker verbunden sein und in dieser Form an den Träger gebunden werden. Das Peptid kann weiterhin mit einem Oligonukleotid verbunden sein, das über ein an dem festen Träger gebundenes komplementäres Oligonukleotid die Bindung des Peptids an den Träger vermittelt.The peptide used according to the invention is bound to the solid support by various methods known to those skilled in the art, for example by adsorption on the solid support. A coated carrier also causes the binding of the peptide, e.g. For example, a streptavidin-coated carrier will bind the peptide after its biotinylation. Other possible coatings for binding a peptide include e.g. B. serum albumin or cystamine dihydrochloride optionally in combination with N-succinimidyl-3-maleimidopropionate. The peptide may also be linked to a nucleic acid linker and bound in this form to the carrier. The peptide may further be linked to an oligonucleotide which mediates binding of the peptide to the carrier via a complementary oligonucleotide bound to the solid support.

Besonders vorteilhaft ist die Immobilisierung der erfindungsgemäß verwendeten Peptide an eine bewegliche feste Phase als Träger, wie z. B. bei der biomagnetischen Separation. Hierbei werden die Peptide mittels kovalenter Bindung beispielsweise über Amino- oder Carboxylgruppen an superparamagnetische Mikro- bzw. Nanopartikel (Beads) gekoppelt. Die Beads lassen sich durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes leicht mit den über die erfindungsgemäß verwendeten Peptide immobilisierten Staphylococcus aureus-Zellen aus Lösungen und Aerosolen abtrennen. Zudem besitzen die Beads eine hohe massenspezifische Oberfläche, so dass ein hoher Anteil des Probenvolumens in Kontakt mit dem Träger tritt. Die verwendeten Materialien sind preiswert und die Handhabung ist einfach.Particularly advantageous is the immobilization of the peptides used in the invention to a mobile solid phase as a carrier, such as. B. in the biomagnetic separation. Here, the peptides are coupled by covalent bonding, for example via amino or carboxyl groups to superparamagnetic micro- or nanoparticles (beads). The beads can be easily separated by applying an external magnetic field with the Staphylococcus aureus cells immobilized on the peptides used according to the invention from solutions and aerosols. In addition, the beads have a high mass-specific surface, so that a high proportion of the sample volume comes into contact with the carrier. The materials used are inexpensive and handling is easy.

In einer weiteren Ausgestaltung ist das erfindungsgemäß verwendete Peptid an ein pharmazeutisch wirksames Agens gebunden. Dieses kann auch eingeschlossen sein, z. B. in Mikrokapseln oder Hydrogele.In a further embodiment, the peptide used according to the invention is bound to a pharmaceutically active agent. This may also be included, for. In microcapsules or hydrogels.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Nutzung dieser an pharmazeutisch wirksame Agenzien gekoppelten Peptide für therapeutische Zwecke.The invention further relates to the use of these peptides coupled to pharmaceutically active agents for therapeutic purposes.

Die Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus Die Durchführung dieser Verfahren erfolgt bevorzugt in festen und flüssigen Stoffsystemen zur Diagnostik und Analyse von Staphylococcus aureusThe invention also encompasses methods for enrichment, immobilization, detection and / or labeling of Staphylococcus aureus. These methods are preferably carried out in solid and liquid material systems for the diagnosis and analysis of Staphylococcus aureus

Ein bevorzugtes Verfahren zur Anreicherung bzw. Immobilisierung von Staphylococcus aureus aus einer Probe umfasst die folgenden Schritte:

a) Bindung mindestens eines erfindungsgemäß verwendeten Peptides an einen Träger und
b) Kontaktieren des trägergebundenen Peptides mit der zu untersuchenden Probe, um ein Binden des Peptides an Staphylococcus aureus zu ermöglichen.

A preferred method for the enrichment or immobilization of Staphylococcus aureus from a sample comprises the following steps:

a) binding of at least one peptide used according to the invention to a carrier and
b) contacting the supported peptide with the sample to be assayed to allow binding of the peptide to Staphylococcus aureus.

Das erfindungsgemäße Peptid bindet sowohl an den Träger als auch an die zu immobilisierenden bzw. nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen. Dadurch stellt es auf vorteilhaft einfache Weise eine stabile und spezifische Verbindung zwischen dem Träger und den zu immobilisierenden bzw. nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen her. Die immobilisierten Staphylococcus aureus-Zellen können anschließend einfach von der Probe abgetrennt werden, beispielsweise indem der Träger absedimentiert, abzentrifugiert oder durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes abgetrennt wird. The peptide according to the invention binds both to the carrier and to the Staphylococcus aureus cells to be immobilized or detected. As a result, it produces a stable and specific connection between the carrier and the Staphylococcus aureus cells to be immobilized or detected in an advantageously simple manner. The immobilized Staphylococcus aureus cells can then be easily separated from the sample, for example, by the carrier sedimented, centrifuged or separated by applying an external magnetic field.

Wenn der Träger ein Gefäß zur Aufnahme der Probe selbst ist, bspw. in Form einer Mikrotiterplatten-Vertiefung, so können die gebundenen Staphylococcus aureus-Zellen durch Waschen des Gefäßes mit einer entsprechenden Waschlösung von der übrigen Probe abgetrennt und somit aufgereinigt und angereichert werden.If the carrier is a vessel for receiving the sample itself, for example in the form of a microtiter plate well, the bound Staphylococcus aureus cells can be separated from the remaining sample by washing the vessel with a corresponding washing solution and thus purified and enriched.

Dabei ist die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, nicht festgelegt. Es hat sich gezeigt, dass die Bindung von Peptiden an einen zu immobilisierenden Mikroorganismus behindert sein kann, wenn das Peptid vor der Bindung an den Mikroorganismus bereits an den festen Träger gebunden ist. In einem solchen Fall ist es vorteilhaft, den Schritt b) vor oder gleichzeitig mit dem Schritt a) durchzuführen, indem beispielsweise das Peptid und die zu untersuchende Probe durch Mischen miteinander in Kontakt gebracht werden, und gleichzeitig oder anschließend der Träger mit der Mischung in Kontakt gebracht wird. Wenn jedoch der Schritt a) vor dem Schritt b) durchgeführt wird, beispielsweise indem ein erfindungsgemäß verwendetes an einen Träger gebundenes Peptid wie zuvor beschrieben verwendet wird, so kann derselbe Träger mehrfach zum Immobilisieren von Mikroorganismen aus mehreren Proben oder zum Immobilisieren von Mikroorganismen aus einem Probenstrom verwendet werden. Ein solches Vorgehen kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn die zu untersuchenden Proben nur geringe Konzentrationen des nachzuweisenden Mikroorganismus besitzen, oder wenn die Proben zahlreiche Begleitsubstanzen enthalten, die unspezifisch an den festen Träger binden oder auf andere Weise die Bindung der Peptide an den nachzuweisenden Mikroorganismus stören.The order in which steps a) and b) are performed is not fixed. It has been found that the binding of peptides to a microorganism to be immobilized may be hindered if the peptide is already bound to the solid support before binding to the microorganism. In such a case, it is advantageous to carry out step b) before or simultaneously with step a), for example by bringing the peptide and the sample to be investigated into contact with each other by mixing, and simultaneously or subsequently contacting the support with the mixture is brought. However, if step a) is performed prior to step b), for example by using a supported peptide used in accordance with the present invention as previously described, the same support can be used multiple times to immobilize microorganisms from multiple samples or to immobilize microorganisms from a sample stream be used. Such a procedure may be advantageous in particular if the samples to be examined have only low concentrations of the microorganism to be detected, or if the samples contain numerous accompanying substances which non-specifically bind to the solid support or otherwise interfere with the binding of the peptides to the microorganism to be detected ,

Das erfindungsgemäße Anreicherungsverfahren erlaubt es, auch aus stark verdünnten Proben genügend hohe Zellzahlen von Staphylococcus aureus zu isolieren, um einen sicheren und spezifischen Nachweis von Staphylococcus aureus zu ermöglichen.The enrichment method according to the invention makes it possible to isolate sufficiently high numbers of cells of Staphylococcus aureus even from strongly diluted samples, in order to enable safe and specific detection of Staphylococcus aureus.

Die Peptide werden mittels dem Fachmann bekannter Verfahren bevorzugt an eine feste Phase als Träger gebunden. Als feste Phase werden vorzugsweise superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel (Beads) verwendet. Nach Kontakt mit einer Probe immobilisieren die Peptide durch ihre spezifische Bindungsfähigkeit die in der Probe enthaltenen Staphylococcus aureus-Zellen an die Trägerphase.The peptides are preferably bound to a solid phase as a carrier by methods known to those skilled in the art. The solid phase used is preferably superparamagnetic micro- or nanoparticles (beads). After contact with a sample, the peptides immobilize by their specific binding ability the Staphylococcus aureus cells contained in the sample to the carrier phase.

Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von Staphylococcus aureus in einer Probe mit den Schritten

a) Kontaktierung der Probe mit mindestens einem erfindungsgemäß verwendeten Peptid, das einen detektierbaren Marker enthält, um ein Binden des Peptids an die nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen zu ermöglichen
b) Nachweis des detektierbaren Markers des Peptides.

Also part of the invention is a method for detecting Staphylococcus aureus in a sample comprising the steps

a) contacting the sample with at least one peptide according to the invention which contains a detectable marker in order to allow binding of the peptide to the Staphylococcus aureus cells to be detected
b) detection of the detectable marker of the peptide.

Das Nachweisverfahren ermöglicht einen spezifischen und sensitiven Nachweis von Staphylococcus aureus auch in komplexen Proben.The detection method allows a specific and sensitive detection of Staphylococcus aureus even in complex samples.

Das Verfahren zum Nachweis des detektierbaren Markers richtet sich nach dem eingesetzten Marker.The method for detecting the detectable marker depends on the marker used.

Wie schon bei den zuvor beschriebenen Immobilisierungs- und Anreicherungsverfahren steht die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, im Belieben des Fachmanns. Dieser kann anhand der Umstände des Einzelfalles leicht selbst entscheiden, welche Reihenfolge die besten Nachweisergebnisse liefert.As in the previously described immobilization and enrichment processes, the order in which steps a) and b) are carried out is at the discretion of the person skilled in the art. This can easily decide on the basis of the circumstances of the individual case, which order provides the best detection results.

In einer bevorzugten Ausgestaltungsform des Nachweisverfahrens werden die in der Probe vorhandenen Staphylococcus aureus-Zellen vor dem Nachweisen des detektierbaren Markers mittels des erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreichungsverfahrens aus der Probe angereichert bzw. an einem Träger immobilisiert.In a preferred embodiment of the detection method, the Staphylococcus aureus cells present in the sample are enriched from the sample or immobilized on a support before detection of the detectable marker by means of the immobilization or enrichment method according to the invention.

Dazu erfolgt zunächst die Immobilisierung von Staphylococcus aureus-Zellen an erfindungsgemäß verwendeten trägergebundenen und nicht markierten Peptiden. Nach einem Waschschritt zur Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile (Antigene, andere Zellen) wird ein weiteres erfindungsgemäß verwendetes nicht an einen Träger gebundenes Peptid mit einem detektierbaren Marker zugegeben, das an die Targets auf den nun ebenfalls an die feste Phase immobilisierten Zielzellen bindet und diese auf die oben beschriebene Art und Weise nachweist.For this purpose, the immobilization of Staphylococcus aureus cells first takes place on carrier-bound and unlabelled peptides used according to the invention. After a washing step to remove the unbound sample components (antigens, other cells), a further used according to the invention not bound to a carrier peptide with a detectable marker is added, which binds to the targets on the now also immobilized on the solid phase target cells and detects them in the manner described above ,

Auf diese Weise kann der nachzuweisende Mikroorganismus ohne großen Aufwand auch in stark verdünnten Proben oder in Proben mit den Nachweis stark störenden Begleitsubstanzen zuverlässig und mit hoher Sensitivität nachgewiesen werden.In this way, the microorganism to be detected can be detected reliably and with high sensitivity even in highly diluted samples or in samples with the detection of strongly interfering accompanying substances.

Zweckmäßigerweise wird das Nachweisverfahren und/oder das Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahren in Form eines miniaturisierten Assays durchgeführt. Beispielsweise können verschiedene zu untersuchende Proben jeweils in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben und dort einem für die jeweilige Vertiefung spezifisch ausgestalteten Nachweisverfahren unterzogen werden. Auf diese Weise können große Probenmengen parallel verarbeitet werden.The detection method and / or the immobilization or enrichment method is expediently carried out in the form of a miniaturized assay. For example, different samples to be examined can each be placed in a well of a microtiter plate and subjected there to a detection method specifically designed for the respective well. In this way, large quantities of samples can be processed in parallel.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Testkits zur spezifischen Markierung, zum Nachweis, zur Immobilisierung und zur Anreicherung von Zellen, die neben den üblichen Bestandteilen mindestens eines oder mehrere der erfindungsgemäß verwendeten Peptide enthalten.The invention finally also test kits for specific labeling, detection, immobilization and enrichment of cells containing at least one or more of the peptides used in the invention in addition to the usual ingredients.

Ein bevorzugtes Kit zum Anreichern von Staphylococcus aureus enthält mindestens ein erfindungsgemäß verwendetes Peptid und einen Träger, wobei das Peptid bevorzugt an den Träger gebunden ist.A preferred kit for accumulating Staphylococcus aureus contains at least one peptide used according to the invention and a carrier, wherein the peptide is preferably bound to the carrier.

Mit einem solchen Kit wird dem Fachmann auf einfache Weise eine Reagenzienzusammenstellung an die Hand gegeben, um die Bindung eines erfindungsgemäß verwendeten Peptids an einen festen Träger ohne großen Aufwand zu ermöglichen. Damit vereinfacht ein solcher Kit die Durchführung eines erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahrens. Partikelförmige feste Träger wie z. B. magnetische Beads (bevorzugt superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel) sind wegen der genannten Vorteile besonders bevorzugt.With such a kit, the expert is given a reagent composition in a simple manner to allow the binding of a peptide used in the invention to a solid support without much effort. Thus, such a kit simplifies the implementation of an immobilization or enrichment process according to the invention. Particulate solid supports such. As magnetic beads (preferably superparamagnetic micro or nanoparticles) are particularly preferred because of the advantages mentioned.

Ein bevorzugtes Kit zum Nachweis von Staphylococcus aureus enthält mindestens ein mit einem detektierbaren Marker gekoppeltes erfindungsgemäß verwendetes Peptid.A preferred kit for detecting Staphylococcus aureus contains at least one peptide used according to the invention coupled to a detectable marker.

Bestandteil der Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die mindestens einen für eines der erfindungsgemäßen Peptide kodierenden Abschnitt enthalten. Vorteilhaft ermöglichen es die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die erfindungsgemäßen Peptide auf einfache Weise herzustellen, beispielsweise indem die für die Peptide kodierenden Nukleinsäuren in geeignete Organismen (z. B. Escherichia coli) eingebracht und die Peptide so rekombinant gewonnen werden.Part of the invention are also nucleic acids containing at least one coding for one of the peptides of the invention section. The nucleic acids according to the invention advantageously make it possible to prepare the peptides according to the invention in a simple manner, for example by introducing the nucleic acids coding for the peptides into suitable organisms (eg Escherichia coli) and thus recovering the peptides recombinantly.

In besonders bevorzugten Nukleinsäuren ist der für das erfindungsgemäße Peptid kodierende Abschnitt mit einer für ein Markerprotein kodierenden Nukleinsäure verbunden, so dass ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Peptid und dem Markerprotein, z. B. GFP und/oder einem enzymatisch aktiven Amplifikator gebildet wird.In particularly preferred nucleic acids, the section coding for the peptide according to the invention is linked to a nucleic acid coding for a marker protein, so that a fusion protein of the peptide according to the invention and the marker protein, eg. As GFP and / or an enzymatically active amplifier is formed.

Vorzugsweise enthalten die Nukleinsäuren mindestens eine der Sequenzen ausgewählt aus SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 18 bis SEQ ID NO. 22 und EQ ID NO. 24 bis SEQ ID NO. 26: SEQ ID NO. 14: ggg aat cat agt act act aat atg cat cct ccg ttg SEQ ID NO. 18: ggg cct tot att att cct ggt tat ctg tct ata act SEQ ID NO. 19: cat act gat tgg agg ctt ggt act tgg cat cat agt SEQ ID NO. 20: cag agt tat cat agg cat cag cag tat cat ggt aat SEQ ID NO. 21: tcg ctt acg cat gcg tgg cag cag acg cat ttt ctg SEQ ID NO. 22: ttt act act tcg aat cat act tcg agg cat ggt tct SEQ ID NO. 24: gat ggg ctt ctg acg agg cat cct ctg cat cct tat SEQ ID NO. 25: aat gag atg ttt gag ctt att ccg ttg agt ccg gcg SEQ ID NO. 26: aat att ctt aag cat gtg tot gtg gat act gcg gct Preferably, the nucleic acids contain at least one of the sequences selected from SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 18 to SEQ ID NO. 22 and EQ ID NO. 24 to SEQ ID NO. 26: SEQ ID NO. 14: ggg aat cat agt act act aat atg cat cct ccg ttg SEQ ID NO. 18: ggg cct dead att att cct gcd did ctg tct ata act SEQ ID NO. 19: cat act gat tgq agg ctt gcd act tgq cat cat agt SEQ ID NO. 20: cag agt did cat agg cat cag cag did cat gcd aat SEQ ID NO. 21: tcg ctt acg cat gcg tgq cag cag acg cat ttt ctg SEQ ID NO. 22: ttt act act tcg aat cat act tcg agg cat gcd tct SEQ ID NO. 24: gat ggg ctt ctg acg agg cat cct ctg cat cct did SEQ ID NO. 25: aat gag atg ttt gag ctt att ccg ttg agt ccg gcg SEQ ID NO. 26: aat att ctt aag cat gtg dead gtg gat act gcg gct

Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 14 kodiert dabei für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1, die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 15 für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 usw. The nucleic acid sequence according to SEQ ID NO. 14 encodes a peptide with the amino acid sequence SEQ ID NO. 1, the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO. 15 for a peptide having the amino acid sequence SEQ ID NO. 2 etc.

Ausführungsbeispieleembodiments

Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken.Based on the following figures and embodiments, the invention will be explained in more detail, without limiting it.

Darin werden folgende Abkürzungen verwendet:

CFU: Kolonie bildende Einheiten (clony forming units)
M: mol/l
RT: Raumtemperatur

It uses the following abbreviations:

CFU: Colony forming units
M: minor
RT: room temperature

Ausführungsbeispiel 1:Embodiment 1

Erfindungsgemäß konnte ein Pool von Peptiden zur bioaffinen, spezifischen Bindung an Staphylococcus aureus mittels der Phagendisplay-Technik ermittelt werden. Dazu wurde eine kommerziell erhältliche M13 Phagenbibliothek (Ph.D.-12, New England Biolabs) eingesetzt, die an der Oberfläche der Phagen zufällige Peptide mit einer Länge von 12 Aminosäuren präsentiert. Die Peptide werden zusammen mit einem kurzen Spacer (Gly-Gly-Gly-Ser) am N-terminalen Ende des Hüllproteins gpIII expressiert (Typ 3 Bibliothek). Die Bibliothek hat laut Herstellerangaben eine Diversität von 2,7·10⁹ verschiedenen Peptidsequenzen. In mehreren Panningrunden wurden die an Staphylococcus aureus bindenden Phagen isoliert. Zur Erhöhung der Spezifität wurden außerdem entsprechende Subtraktionsrunden durchgeführt.According to the invention, a pool of peptides for bioaffinity specific binding to Staphylococcus aureus could be determined by means of the phage display technique. For this purpose, a commercially available M13 phage library (Ph.D.-12, New England Biolabs) was used which presents random peptides with a length of 12 amino acids on the surface of the phages. The peptides are expressed together with a short spacer (Gly-Gly-Gly-Ser) at the N-terminal end of the envelope protein gpIII (type 3 library). According to the manufacturer, the library has a diversity of 2.7 × 10 ⁹ different peptide sequences. In several rounds of panning, the phages binding to Staphylococcus aureus were isolated. In order to increase the specificity also appropriate subtraction rounds were carried out.

Die DNA der spezifisch bindenden Phagen wurde isoliert, mittels PCR vervielfältigt, aufgereinigt und anschließend von der Firma Seqlab GmbH sequenziert.The DNA of the specific binding phage was isolated, amplified by PCR, purified and then sequenced by Seqlab GmbH.

Ausführungsbeispiel 2:Embodiment 2:

Die ausgewählten Peptide wurden synthetisiert (Seqlab GmbH) und an paramagnetischen Aminobeads (Dynal) immobilisiert.The selected peptides were synthesized (Seqlab GmbH) and immobilized on paramagnetic aminobeads (Dynal).

Ausführungsbeispiel 3:Embodiment 3

Für die biomagnetische Separation der Staphylococcus aureus-Zellen wurde zunächst eine Übernachtkultur von Staphylococcus aureus DSM 1104 angelegt.For the biomagnetic separation of the Staphylococcus aureus cells, an overnight culture of Staphylococcus aureus DSM 1104 was first applied.

Die Zellkonzentration der Kultur wurde mittels Zählkammer ermittelt, die Zellkonzentration im Test durch Verdünnung mit Phosphate-buffered saline (0,01 M; pH 7,4) auf einen Wert von 10³ CFU ml^–1 eingestellt.The cell concentration of the culture was determined by means of a counting chamber, the cell concentration in the test was adjusted to a value of 10 ³ CFU ml ^-1 by dilution with phosphate-buffered saline (0.01 M, pH 7.4).

Aliquots von 100 μl der verdünnten Zellsuspension wurden in einem 2 ml Reaktionsgefäß mit je 100 μl der mit Peptid SA02 (SEQ ID NO. 2) beladenen Magnetbeads 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Bead-Zellverbände im magnetischen Feld (MPC^®-S, Dynal) aus der flüssigen Phase abgeschieden. Der Überstand wurde entfernt. Das Bead-Zell-Pellet wurde 4-mal mit 500 μl PBS-Tween (0,01 M; pH 7,4; 0,05% Tween 20) gewaschen und in 100 μl PBS resuspendiert.Aliquots of 100 μl of the diluted cell suspension were incubated in a 2 ml reaction vessel with 100 μl each of the magnetic beads loaded with peptide SA02 (SEQ ID NO: 2) for 60 min at room temperature. Subsequently, the bead cell assemblies in the magnetic field (MPC ^® -S, Dynal) were separated from the liquid phase. The supernatant was removed. The bead cell pellet was washed 4 times with 500 μl PBS-Tween (0.01 M, pH 7.4, 0.05% Tween 20) and resuspended in 100 μl PBS.

Zur Bestimmung des Anteils der separierten Zellen wurden je 100 μl des resuspendierten Bead-Zell-Pellets auf PCA-(Merck)-Platten ausgestrichen. Gleichzeitig wurden 100 μl der verdünnten Übernachtkultur als Referenz zur Ermittlung des Anteils separierter Zellen ausgestrichen.To determine the proportion of separated cells, 100 μl of the resuspended bead cell pellet were streaked onto PCA (Merck) plates. At the same time, 100 μl of the diluted overnight culture was streaked out as a reference to determine the proportion of separated cells.

Die Ergebnisse der Biomagnetischen Separation für eine Versuchsserie mit dem Peptid SA02 (SEQ ID NO. 2) sind in dargestellt.The results of the biomagnetic separation for a series of experiments with the peptide SA02 (SEQ ID NO. 2) are in shown.

zeigt die Abscheideraten in Abhängigkeit von der Beadkonzentration (5 × 10⁵ to 1 × 10⁷) im Test. (n = 3) shows the deposition rates as a function of the bead concentration (5 × 10 ⁵ to 1 × 10 ⁷ ) in the test. (n = 3)

In den Versuchen hat sich gezeigt, dass es mit Hilfe der isolierten Ligandenpeptide möglich ist, Staphylococcus aureus erfolgreich aus flüssiger Phase zu isolieren.The experiments have shown that it is possible with the help of isolated ligand peptides to successfully isolate Staphylococcus aureus from the liquid phase.

Ausführungsbeispiel 4: Embodiment 4

Zur Anwendung kam das SPR-Analysesystem des Fraunhofer-Instituts für Angewandte Optik und Feinmechanik, Jena (IOF-SPR).The SPR analysis system of the Fraunhofer Institute for Applied Optics and Precision Engineering, Jena (IOF-SPR) was used.

Die Chips wurden wie folgt vorbereitet:

• Reinigung der Goldoberfläche mit 65% HNO₃,
• Funktionalisierung mit DTSSP bei 4°C über Nacht,
• Immobilisierung von je 50 μl Protein A (2 μg/μl) bzw. Casein (0,5 μg/μl) für 1 h bei RT,
• Blocken mit 50 μl Casein (0,5 μg/μl) für 1 h bei RT,
• Blocken mit 50 μl 0,1 M Tris-HCl für 1 h bei RT.

The chips were prepared as follows:

• cleaning the gold surface with 65% HNO ₃ ,
Functionalization with DTSSP at 4 ° C overnight,
Immobilization of 50 μl protein A (2 μg / μl) or casein (0.5 μg / μl) for 1 h at RT,
Block with 50 μl of casein (0.5 μg / μl) for 1 h at RT,
Block with 50 μl of 0.1 M Tris-HCl for 1 h at RT.

Messung Parameter Gewählte Versuchsbedingungen Vorwäsche mit PBS 1 ml Probenvolumen (Peptid SA01 (SEQ ID NO. 1) 4 mg/ml) 90 μl Zwischenwäsche mit PBS 105 μl Anzahl der Durchläufe 50 Volumen eines Durchlaufs 65 μl Flussgeschwindigkeit 300 μl/min Temperatur 30°C Measurement parameter Selected experimental conditions Prewash with PBS 1 ml Sample volume (peptide SA01 (SEQ ID NO. 1) 4 mg / ml) 90 μl Intermediate wash with PBS 105 μl Number of passes 50 Volume of a pass 65 μl flow rate 300 μl / min temperature 30 ° C

zeigt SPR-Signale in Abhängigkeit von dem gewählten Liganden (Protein A und Casein) und Peptid SA01 (SEQ ID NO. 1) (4 mg/ml) als Analyt. shows SPR signals depending on the ligand selected (protein A and casein) and peptide SA01 (SEQ ID NO. 1) (4 mg / ml) as analyte.

Es konnte nachgewiesen werden, dass Peptid SA01 (SEQ ID NO. 1) in der Lage ist, im Gegensatz zu Casein an das Staphylococcus aureus Protein A zu binden ( ). SEQUENCE LISTING

It has been demonstrated that peptide SA01 (SEQ ID NO: 1) is able to bind to Staphylococcus aureus protein A in contrast to casein ( ). SEQUENCE LISTING

Claims

Use of at least one peptide which has a length of at least eight amino acids from an amino acid sequence according to one of the sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 13 contains for accumulation, immobilization, detection and / or labeling of Staphylococcus aureus.

Use according to claim 1, characterized in that the amino acid sequence of the peptide has one of the sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 13 is.

Use according to claim 1 or 2, characterized in that the peptide contains a detectable marker.

Use according to claim 1 or 2, characterized in that the peptide is bound to a carrier.

Use according to claim 3, characterized in that superparamagnetic micro- or nanoparticles (beads) are used as carriers.

Use according to claim 1 or 2, characterized in that the peptide is bound to a pharmaceutically active agent.

Use of a peptide as defined in claim 6 for therapeutic purposes.

Method for immobilizing and / or enriching Staphylococcus aureus from a sample comprising the following steps: a. Binding of at least one peptide as defined in claim 1 or 2 to a carrier b. Contacting the supported peptide with the sample.

A method of detecting Staphylococcus aureus in a sample comprising the steps of: a. Contacting at least one labeled peptide as defined in claim 3 with the sample b. Detecting the detectable marker of the peptide.

Kit for accumulating Staphylococcus aureus, containing at least: a. A peptide as defined in any one of claims 1 to 5 and b. a carrier.

Kit for the detection of Staphylococcus aureus, at least containing a peptide as defined in claim 3.

Staphylococcus aureus binding peptide which has a length of at least eight amino acids from an amino acid sequence according to any one of the sequences selected from SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 5 to SEQ ID NO. 9 and SEQ ID NO. 11 to SEQ ID NO. 13 contains.

Peptide according to claim 12, characterized in that the amino acid sequence of the peptide is one of the sequences selected from SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 5 to SEQ ID NO. 9 and SEQ ID NO. 11 to SEQ ID NO. 13 is.

Peptide according to one of claims 12 or 13, characterized in that it contains a detectable marker.

Peptide according to one of claims 12 or 13, characterized in that the peptide is bound to a carrier.

Peptide according to claim 14, characterized in that superparamagnetic micro- or nanoparticles (beads) are used as carriers.

Peptide according to one of claims 12 or 13, characterized in that the peptide is bound to a pharmaceutically active agent.

A nucleic acid having a portion coding for a peptide according to any one of claims 12 to 13.

Nucleic acid according to claim 18, characterized in that the nucleic acid has a section with a sequence according to one of the sequences selected from SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 18 to SEQ ID NO. 22 and SEQ ID NO. 24 to SEQ ID NO. 26 includes.