DE102009021681A1 - New Staphylococcus aureus-binding peptide, comprising amino acid sections, useful for the enrichment, immobilization, detection and/or marking of Staphylococcus aureus - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Peptide, die affin an die Oberfläche bzw. die extrazellulären Strukturen von Staphylococcus aureus binden, die Verwendung dieser Peptide zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus sowie Verfahren und Kits zur Anreicherung und zum Nachweis von Staphylococcus aureus. Die Erfindung betrifft weiterhin die Kopplung von therapeutisch wirksamen Substanzen an diese Peptide.The The invention relates to peptides affine to the surface or the extracellular Staphylococcus aureus structures bind to the use of these Peptides for enrichment, immobilization, detection and / or for labeling Staphylococcus aureus as well as methods and kits for the enrichment and detection of Staphylococcus aureus. The The invention further relates to the coupling of therapeutically effective Substances to these peptides.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind insbesondere die Medizin, Tiermedizin Krankenhäuser, andere Gesundheits- und Pflegeeinrichtungen sowie weitere Gebiete mit hohen Hygienestandards, so z. B. die Lebensmittel- und Pharmaindustrie.application areas The invention includes, in particular, medicine, veterinary hospitals, others Health and care facilities as well as other areas with high Hygiene standards, such. B. the food and pharmaceutical industries.
Staphylococcus aureus hat eine kugelförmige Morphologie, bei einem Durchmesser der Zellen von 0,8–1,2 μm. Es gehört zu den Gram-positiven Bakterien und ist nicht in der Lage, Endosporen zu bilden. Staphylococcus aureus ist ubiquitär verbreitet und besiedelt u. a. Schleimhäute. Unter Umständen kann Staphylococcus aureus pathogen sein und induziert Hautinfektionen, Lungenentzündungen, Endokarditis, Toxisches Schock-Syndrom und Sepsis.Staphylococcus aureus has a spherical shape Morphology, with a diameter of cells of 0.8-1.2 μm. It belongs to the Gram-positive bacteria and is unable to endospores too form. Staphylococcus aureus is ubiquitous and colonized u. a. Mucous membranes. In certain circumstances Staphylococcus aureus can be pathogenic and induces skin infections, Pneumonia, Endocarditis, toxic shock syndrome and sepsis.
Zum Nachweis von Staphylococcus aureus kommen derzeit verschiedene, z. T. in die amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG aufgenommene Untersuchungsmethoden zur Anwendung. Dabei handelt es sich um kulturelle, immunologische bzw. molekularbiologische Nachweisverfahren. Es ist möglich, diese Verfahren zu kombinieren.To the Detection of Staphylococcus aureus are currently different, z. T. in the official collection of examination procedures according to §35 LMBG the examination methods used. It acts it is cultural, immunological or molecular biological Detection methods. It is possible, to combine these procedures.
Die konventionelle Detektion von Staphylococcus aureus, auch in Lebensmitteln, wird in der Regel folgendermaßen durchgeführt:
- – Voranreicherung
- – Isolierung auf Selektivnährböden
- – Selektiv-Anreicherung in Flüssigkultur
- – Koagulase-Test
- – Biochemische Identifizierung
- - Pre-enrichment
- - Isolation on selective nutrient media
- - Selective enrichment in liquid culture
- - coagulase test
- - Biochemical identification
Auch die MPN ist eine etablierte Methode.Also the MPN is an established method.
Bis zum ersten Ergebnis nach Isolierung der Keime auf Selektivnährböden wird ein Untersuchungszeitraum von mindestens 4 bis 6 Tagen benötigt.To becomes the first result after isolation of the germs on selective nutrient media an examination period of at least 4 to 6 days.
Neben den klassischen Tests kommen auch immunologische Nachweisverfahren, wie Immunfluoreszenztests oder ELISA zum Einsatz.Next the classical tests also include immunological detection methods, such as immunofluorescence tests or ELISA used.
Für den molekularbiologischen Nachweis von Staphylococcus aureus stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Er kann beispielsweise mittels Gensonden im Zuge der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung oder mit der Polymerase-Kettenreaktion erfolgen.For the molecular biological Detection of Staphylococcus aureus are various methods Available. He can, for example, by means of gene probes in the course of fluorescence in situ hybridization or with the polymerase chain reaction.
Den genannten modernen Verfahren ist der Nachteil eigen, dass die Sensitivität nicht ausreichend hoch ist, d. h. die Keime müssen nach wie vor auf eine Zellzahl größer als das notwendige Detektionslimit angereichert werden.The The above-mentioned modern method has the disadvantage that the sensitivity is not is sufficiently high, d. H. the germs still need to be one Cell count greater than the necessary detection limit be enriched.
Mit Hilfe von superparamagnetischen, mit entsprechenden Liganden, z. B. Antikörpern, beschichteten Partikeln ist ein Aufkonzentrieren der Keime möglich.With Help of superparamagnetic, with appropriate ligands, eg. Antibodies, coated particles is a concentration of the germs possible.
Für den Nachweis und die Charakterisierung von Mikroorganismen und deren Dauerformen (Sporen) werden als nachzuweisende Zielmoleküle neben den von den Zellen ausgeschiedenen Stoffwechselprodukten und anderen Zellbestandteilen oder Molekülen auch die Zellen selbst verwendet. Hierzu werden die Zellen nach dem Stand der Technik mit speziellen Immunoglobulinen (Antikörpern), aber auch anderen bindenden Molekülen (z. B. Lektinen) markiert. Diesen Molekülen ist gemeinsam, dass sie spezielle Zellstrukturen erkennen und daran binden. Dabei ist die Selektivität des Nachweisverfahrens sehr stark von den zur Markierung eingesetzten Molekülen abhängig, weshalb z. B. der Einsatz von Lektinen bei Systemen mit einer hohen Diversität der stofflichen Zusammensetzung ungeeignet ist.For the proof and the characterization of microorganisms and their permanent forms (Spores) are to be detected as target molecules next to those of the cells excreted metabolites and other cell components or molecules also used the cells themselves. For this, the cells are after the prior art with specific immunoglobulins (antibodies), but also other binding molecules (eg lectins). These molecules What they all have in common is that they recognize and recognize special cell structures tie. Here is the selectivity of the detection method very much of those used for labeling molecules dependent, why z. B. the use of lectins in systems with a high diversity the material composition is unsuitable.
Auch der Einsatz von Antikörpern für Nachweisverfahren hat einige Nachteile. Zunächst müssen spezifische Antikörper hergestellt werden. Dies geschieht zunächst durch Immunisierung von Tieren mit dem Zielantigen oder einem Bestandteil daraus. Hierbei ist jedoch nicht sichergestellt, dass die gewünschte Immunantwort auch erzielt wird. Falls eine Immunantwort stattgefunden hat und das Serum nach einiger Zeit einen genügend hohen Titer an spezifischen Antikörpern gegen das Zielantigen aufweist, werden B-Lymphozyten und Antikörper aus dem Blut des Tieres isoliert und mittels bekannter Methoden aufgereinigt. Diese Antikörper werden unabhängig von ihrem Reinheitsgrad als polyklonale Antikörper bezeichnet. Sie reagieren auf alle Antigene, zu denen das Tier bis zum Zeitpunk der Isolation Kontakt hatte und auf die eine Immunantwort erfolgt ist. Unerwünschte Kreuzreaktionen mit fremden, den Zielantigenen nicht unbedingt verwandten Antigenen werden daher häufig beobachtet und stellen einen wesentlichen Nachteil dar. Die Antikörper können zwar in weiteren Arbeitsschritten für ein bestimmtes Antigen angereichert werden, dies ist jedoch extrem zeitaufwändig und mit hohen Kosten verbunden. Ein weiterer Nachteil polyklonaler Antikörper liegt in der begrenzten Lebensdauer der B-Lymphozyten. Diese können nicht kultiviert werden und sterben nach einer gewissen Zeit ab. Zwischen verschiedenen Chargen polyklonaler Antikörper gibt es daher immer unerwünschte Qualitätsschwankungen.The use of antibodies for detection methods also has some disadvantages. First, have to spe zifische antibodies are produced. This is done first by immunizing animals with the target antigen or a component thereof. However, this does not ensure that the desired immune response is achieved. If an immune response has taken place and the serum has a sufficiently high titre of specific antibodies to the target antigen after some time, B lymphocytes and antibodies are isolated from the blood of the animal and purified by known methods. These antibodies are called polyclonal antibodies regardless of their purity. They respond to all antigens to which the animal had contact until the time of isolation and to which an immune response has occurred. Unwanted cross-reactions with foreign antigens that are not necessarily related to the target antigens are therefore frequently observed and represent a significant disadvantage. Although the antibodies can be enriched in further working steps for a particular antigen, this is extremely time-consuming and involves high costs. Another disadvantage of polyclonal antibodies lies in the limited lifespan of B lymphocytes. These can not be cultured and die off after a period of time. Therefore, there are always undesirable quality fluctuations between different batches of polyclonal antibodies.
Des Weiteren ist es möglich, durch entsprechende Fusionstechniken einzelne Antikörper produzierende B-Lymphozyten mit einer Tumor-Zellinie zu Hybridoma-Zelllinien zu verschmelzen. Die entstehenden Hybridoma-Zellen können in vitro kultiviert werden. So lassen sich monoklonale Antikörper in Zellkulturen gewinnen. Die Hybridoma-Techniken sind jedoch langwierig und teuer. Die Entwicklung neuer monoklonaler Antikörper erfolgt in mehreren Teilschritten: Immunisierung, Fusion, Selektion, Screening und Charakterisierung. Eventuell folgen weitere Modifikationen, die die Eigenschaften der monoklonalen Antikörper verbessern. Zudem ist es nicht in allen Fällen ohne Probleme möglich, Antikörper gegen das Zielantigen zu gewinnen, besonders wenn es sich hierbei um ganze, intakte Zellen handelt. Teilweise kommt es auch zum Absterben der Hybridoma-Zelllinie. Dies stellt einen weiteren Nachteil dar, da entsprechende Kopplungsprotokolle für Nachweisverfahren zeitaufwändig neu etabliert werden müssen.Of Furthermore, it is possible using appropriate fusion techniques individual antibody producing B lymphocytes with a tumor cell line to hybridoma cell lines too merge. The resulting hybridoma cells can be transformed into be cultured in vitro. Thus, monoclonal antibodies can be in Win cell cultures. However, the hybridoma techniques are tedious and expensive. The development of new monoclonal antibodies takes place in several steps: immunization, fusion, selection, screening and characterization. There may be further modifications, which improve the properties of the monoclonal antibodies. In addition is not in all cases without problems, antibody to win against the target antigen, especially if it is is about whole, intact cells. Partly it also dies the hybridoma cell line. This represents another disadvantage since corresponding coupling protocols for detection procedures time consuming new must be established.
Aufgabe der Erfindung ist es, einfache, sensitive, spezifische und möglichst schnell durchführbare Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, Markierung und/oder zum Nachweis von Staphylococcus aureus anzugeben, die nicht auf der Verwendung von Antikörpern basieren. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, die entsprechenden Nachweisreagenzien und Kits zur Durchführung dieser Verfahren anzugeben.task The invention is simple, sensitive, specific and possible fast feasible Method for enrichment, immobilization, labeling and / or to indicate the presence of Staphylococcus aureus not on the use of antibodies based. It is another object of the invention to provide the corresponding Specify detection reagents and kits to perform these procedures.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein oder mehrere Staphylococcus aureus bindende Peptide, das oder die einen mindestens zwölf Aminosäuren langen Abschnitt aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13 enthält.According to the invention Task solved by one or more Staphylococcus aureus binding peptides, the or the one at least twelve amino acids long section of an amino acid sequence according to a the sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 13 contains.
Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz des Peptids eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13.Preferably is the amino acid sequence of the peptide one of the sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 13th
Die erfindungsgemäßen Peptide binden überraschend affin und spezifisch an die Oberfläche bzw. an extrazelluläre Strukturen von Staphylococcus aureus und sind daher geeignet, in Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren zur Anreicherung und/oder zum Nachweis von Staphylococcus aureus eingesetzt zu werden.The peptides according to the invention bind surprisingly affinely and specifically to the surface or on Extracellular structures of Staphylococcus aureus and are therefore suitable to be used in enrichment or detection methods for the enrichment and / or detection of Staphylococcus aureus.
Die aufwändige Herstellung und Verwendung von Antikörpern in entsprechenden Nachweisverfahren kann so auf vorteilhafte Weise vermieden werden. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich zudem mit herkömmlichen Syntheseverfahren leicht und in sehr hoher Reinheit herstellen. Daher kann eine gleichbleibende, chargenunabhängige Produktqualität erzielt werden, insbesondere im Hinblick auf die Reinheit und Stabilität. Die Handhabung der in Immobilisierungs- und/oder Nachweisverfahren einzusetzenden Reagenzien wird ebenfalls vereinfacht, so dass insgesamt die Immobilisierung und/oder der Nachweis von Staphylococcus aureus schneller, mit höherer Reproduzierbarkeit und mit geringerem Gesamtaufwand ermöglicht wird. Zudem ist es einfacher, Nachweis- und/oder Immobilisierungsverfahren zu miniaturisieren und zu automatisieren, in denen statt Antikörpern Fängerpeptide verwendet werden.The complex Production and use of antibodies in appropriate detection methods can be avoided in an advantageous manner. The peptides of the invention can also be used with conventional Produce synthesis process easily and in very high purity. Therefore, a consistent, batch-independent product quality can be achieved especially with regard to purity and stability. The handling to be used in immobilization and / or detection methods Reagents are also simplified, allowing total immobilization and / or the detection of Staphylococcus aureus faster, with higher reproducibility and with less total effort. It's also easier Miniaturize detection and / or immobilization and to automate, in which instead of antibodies capture peptides are used.
Bevorzugt sind solche Peptide, die einen zumindest 10 Aminosäuren, bevorzugt 12 Aminosäuren, langen Ausschnitt einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 und/oder SEQ ID NO. 4 und/oder SEQ ID NO. 8 umfassen. Diese Peptide haben sich als besonders geeignet zum Binden an Staphylococcus aureus herausgestellt. Sie können auch in komplexen Proben spezifisch und mit hoher Ausbeute an Staphylococcus aureus binden.Prefers are those peptides which are at least 10 amino acids, preferred 12 amino acids, long section of an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 and / or SEQ ID NO. 4 and / or SEQ ID NO. 8 include. These Peptides have been found to be particularly suitable for binding to Staphylococcus aureus exposed. You can also in complex samples specific and with high yield of Staphylococcus tie aureus.
Besonders bevorzugt sind Peptide der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 und SEQ ID NO. 4 und SEQ ID NO. 8 Diese Peptide sind besonders spezifisch für Staphylococcus aureus und weisen eine hohe Affinität für diesen Mikroorganismus auf. Sie sind daher in besonderer Weise geeignet, an Staphylococcus aureus in Proben zu binden.Especially Peptides of the amino acid sequence SEQ ID NO. 2 and SEQ ID NO. 4 and SEQ ID NO. 8 These peptides are particularly specific for Staphylococcus aureus and have a high affinity for this microorganism. They are therefore particularly suitable for Staphylococcus aureus to bind in samples.
Die erfindungsgemäßen Peptide besitzen eine Affinität für Staphylococcus aureus. Sie sind daher gut zur Verwendung als Sonden für Staphylococcus aureus einsetzbar. Dazu werden sie vorteilhafterweise mit einem leicht nachweisbaren Marker versehen. Geeignete Marker (wie z. B. Biotin, Fluoreszenzfarbstoffe oder auch Radionukleotide) sind dem Fachmann aus zahlreichen Anwendungen, beispielsweise aus ELISA, bekannt.The peptides according to the invention have an affinity for Staphylococcus aureus. They are therefore good for use as probes for Staphylococcus aureus can be used. For this they are advantageously with a provided easily detectable markers. Suitable markers (such as eg Biotin, fluorescent dyes or radionucleotides) are the Skilled in numerous applications, for example from ELISA, known.
Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein erfindungsgemäßes Peptid, das einen detektierbaren Marker enthält.component The invention therefore also relates to a peptide according to the invention which is a detectable marker contains.
Durch die Kopplung an den detektierbaren Marker eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide vorteilhaft zur spezifischen Markierung und zum spezifischen Nachweis von Staphylococcus aureusBy the coupling to the detectable marker are the peptides of the invention advantageous for specific labeling and specific detection of Staphylococcus aureus
Bei dem detektierbaren Marker handelt es sich bspw. um partikuläre Marker (z. B. Goldpartikel), Fluorochrome, Isotope, Markerproteine, wie z. B. fluoreszierende Proteine (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP)), Amplifikatoren, z. B. Enzyme, die eine Reaktion katalysieren, welche ein Signal in Form eines sichtbaren Farbstoffpräzipitates, einer sichtbaren Farbstoffabspaltung oder Chemo- bzw. Biolumineszenz liefert.at the detectable marker is, for example, particulate marker (eg, gold particles), fluorochromes, isotopes, marker proteins, such as z. For example, fluorescent proteins (eg green fluorescent protein (GFP)), Amplifiers, e.g. B. enzymes that catalyze a reaction, which a signal in the form of a visible dye precipitate, a visible one Dye cleavage or chemo- or bioluminescence provides.
Die verschiedenen detektierbaren Marker werden mittels bekannter Verfahren an das erfindungsgemäße Peptid gekoppelt. Werden beispielsweise GFP oder enzymatisch aktive Amplifikatoren als detektierbare Marker eingesetzt, erfolgt die Kopplung des Peptides an den Marker geeigneterweise durch Fusion der für das Peptid kodierenden DNA-Sequenz mit der DNA-Sequenz von GFP bzw. des enzymatisch aktiven Amplifikators mittels üblicher gentechnischer Verfahren.The Various detectable markers are determined by known methods to the peptide of the invention coupled. Be, for example, GFP or enzymatically active amplifiers used as detectable markers, the coupling of the peptide takes place to the marker, suitably by fusion of the DNA sequence coding for the peptide with the DNA sequence of GFP or the enzymatically active Amplifikators by conventional genetic engineering process.
Es ist auch möglich, den Marker erst nach der Bindung an Staphylococcus aureus am Peptid anzubringen. Dies kann beispielsweise durch Vermittlung eines Linkers wie Biotin-Streptavidin bzw. Biotin-Avidin geschehen, indem das Peptid z. B. biotinyliert ist. Nach der Bindung des Peptids an Staphylococcus aureus werden Streptavidin und die biotinylierte katalytisch wirkende Einheit zugegeben. Streptavidin vermittelt dann die Bindung der katalytisch wirkenden Einheit an das Peptid.It is possible, too, the marker only after binding to Staphylococcus aureus on the peptide to install. This can be done, for example, by the intermediary of a linker like biotin-streptavidin or biotin-avidin done by the peptide z. B. biotinylated is. After binding of the peptide to Staphylococcus aureus Streptavidin and the biotinylated catalytic moiety added. Streptavidin then mediates the binding of the catalytic acting entity to the peptide.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid an einen Träger gebunden.In a preferred embodiment According to the invention, at least one peptide according to the invention is bound to a carrier.
Bei dem Träger handelt es sich bevorzugt um eine feste Phase, insbesondere können die in bekannten Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren verwendeten festen Träger eingesetzt werden, z. B. Mikrotiterplatten, Biochips oder Dip-Sticks.at the carrier it is preferably a solid phase, in particular the solid used in known enrichment or detection methods carrier be used, for. B. microtiter plates, biochips or dip sticks.
Als feste Träger geeignet sind Metallkörper, beispielsweise Goldfolien und goldbeschichtete Träger wie z. B. in Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (Surface Plasmon Resonance, SPR)-Systemen. Ferner können Kunststoffkörper bzw. kunststoffbeschichtete Körper als feste Träger verwendet werden, bspw. Polystyrol- oder Polymethylmethacrylat-Träger. Daneben können auch Glasträger, Gele oder andere, zur Herstellung von Biochips geeignete Träger, verwendet werden.When solid carriers suitable are metal body, For example, gold foils and gold-coated supports such as z. In surface plasmon resonance spectroscopy (Surface Plasmon Resonance, SPR) systems. Furthermore, plastic body or plastic-coated body as solid carriers used, for example. Polystyrene or polymethyl methacrylate carrier. Besides can also glass carrier, Gels or other carriers suitable for the production of biochips become.
Indem das erfindungsgemäße Peptid an einen festen Träger gebunden ist, wird es auf vorteilhaft einfache Weise möglich, Staphylococcus aureus aus Proben zu immobilisieren, zu gewinnen und/oder z. B. für die nachfolgende Detektion anzureichern bzw. Staphylococcus aureus zu detektieren.By doing the peptide of the invention to a solid support is bound, it is possible in an advantageously simple manner, Staphylococcus aureus from samples to immobilize, gain and / or z. B. for the to enrich subsequent detection or Staphylococcus aureus too detect.
Das erfindungsgemäße Peptid wird durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren an den festen Träger gebunden, bspw. durch Adsorption an den festen Träger. Ein mit einer Beschichtung versehener Träger bewirkt ebenfalls die Bindung des Peptids, z. B. bindet ein mit Streptavidin beschichteter Träger das Peptid nach dessen Biotinylierung. Andere mögliche Beschichtungen zum Binden eines Peptids sind z. B. Serumalbumin oder Cystamindihydrochlorid ggf. in Kombination mit N-succinimidyl-3-maleimidopropionat. Das Peptid kann auch mit einem Nukleinsäure-Linker verbunden sein und in dieser Form an den Träger gebunden werden. Das Peptid kann weiterhin mit einem Oligonukleotid verbunden sein, das über ein an dem festen Träger gebundenes komplementäres Oligonukleotid die Bindung des Peptids an den Träger vermittelt.The peptide of the invention is solidified by various methods known to those skilled in the art carrier bound, for example by adsorption to the solid support. One Coated carrier also causes the bond of the peptide, e.g. For example, a streptavidin-coated carrier binds the peptide after its biotinylation. Other possible coatings for bonding a peptide are z. B. serum albumin or cystamine dihydrochloride optionally in combination with N-succinimidyl-3-maleimidopropionate. The peptide can also work with a nucleic acid linker be connected and bound in this form to the carrier. The peptide may be further connected to an oligonucleotide having a on the solid support bound complementary Oligonucleotide mediates the binding of the peptide to the carrier.
Besonders vorteilhaft ist die Immobilisierung der erfindungsgemäßen Peptide an eine bewegliche feste Phase als Träger, wie z. B. bei der biomagnetischen Separation. Hierbei werden die Peptide mittels kovalenter Bindung beispielsweise über Amino- oder Carboxylgruppen an superparamagnetische Mikro- bzw. Nanopartikel (Beads) gekoppelt. Die Beads lassen sich durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes leicht mit den über die erfindungsgemäßen Peptide immobilisierten Staphylococcus aureus-Zellen aus Lösungen und Aerosolen abtrennen. Zudem besitzen die Beads eine hohe massenspezifische Oberfläche, so dass ein hoher Anteil des Probenvolumens in Kontakt mit dem Träger tritt. Die verwendeten Materialien sind preiswert und die Handhabung ist einfach In einer weiteren Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße Peptid an ein pharmazeutisch wirksames Agens gebunden. Dieses kann auch eingeschlossen sein, z. B. in Mikrokapseln oder Hydrogele.Especially the immobilization of the peptides according to the invention is advantageous to a mobile solid phase as a carrier, such. B. in the biomagnetic Separation. In this case, the peptides by means of covalent bonding for example about Amino or carboxyl groups on superparamagnetic micro- or Coupled nanoparticles (beads). The beads can be applied by applying an external magnetic field easily with the over the peptides of the invention immobilized Staphylococcus aureus cells from solutions and Separate aerosols. In addition, the beads have a high mass-specific surface, so that a high proportion of the sample volume comes into contact with the carrier. The materials used are inexpensive and handling is In a further embodiment, the peptide according to the invention is linked to a pharmaceutically active agent. This one can too be included, for. In microcapsules or hydrogels.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Nutzung dieser an pharmazeutisch wirksame Agenzien gekoppelten Peptide für therapeutische Zwecke.The The invention further relates to the use of these in pharmaceutical effective agents coupled peptides for therapeutic purposes.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus Die Durchführung dieser Verfahren erfolgt bevorzugt in festen und flüssigen Stoffsystemen zur Diagnostik und Analyse von Staphylococcus aureusThe Invention also includes methods for enrichment, immobilization, for the detection and / or labeling of Staphylococcus aureus The execution This process is preferably carried out in solid and liquid material systems for the diagnosis and analysis of Staphylococcus aureus
Ein bevorzugtes Verfahren zur Anreicherung bzw. Immobilisierung von Staphylococcus aureus aus einer Probe umfasst die folgenden Schritte:
- a) Bindung mindestens eines erfindungsgemäßen Peptides an einen Träger und
- b) Kontaktieren des trägergebundenen Peptides mit der zu untersuchenden Probe, um ein Binden des Peptides an Staphylococcus aureus zu ermöglichen.
- a) binding of at least one peptide of the invention to a carrier and
- b) contacting the supported peptide with the sample to be assayed to allow binding of the peptide to Staphylococcus aureus.
Das erfindungsgemäße Peptid bindet sowohl an den Träger als auch an die zu immobilisierenden bzw. nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen. Dadurch stellt es auf vorteilhaft einfache Weise eine stabile und spezifische Verbindung zwischen dem Träger und den zu immobilisierenden bzw. nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen her. Die immobilisierten Staphylococcus aureus-Zellen können anschließend einfach von der Probe abgetrennt werden, beispielsweise indem der Träger absedimentiert, abzentrifugiert oder durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes abgetrennt wird.The peptide of the invention binds both to the wearer as well as to be immobilized or detected Staphylococcus aureus cells. As a result, it provides an advantageously simple way a stable and specific connection between the carrier and the Staphylococcus aureus cells to be immobilized or detected ago. The immobilized Staphylococcus aureus cells can then easily be separated from the sample, for example by the carrier sedimented, centrifuged or separated by applying an external magnetic field becomes.
Wenn der Träger ein Gefäß zur Aufnahme der Probe selbst ist, bspw. in Form einer Mikrotiterplatten-Vertiefung, so können die gebundenen Staphylococcus aureus-Zellen durch Waschen des Gefäßes mit einer entsprechenden Waschlösung von der übrigen Probe abgetrennt und somit aufgereinigt und angereichert werden.If the carrier a receptacle the sample itself is, for example in the form of a microtiter plate well, so can the bound Staphylococcus aureus cells by washing the vessel with a corresponding washing solution from the rest Separate sample and thus purified and enriched.
Dabei ist die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, nicht festgelegt. Es hat sich gezeigt, dass die Bindung von Peptiden an einen zu immobilisierenden Mikroorganismus behindert sein kann, wenn das Peptid vor der Bindung an den Mikroorganismus bereits an den festen Träger gebunden ist. In einem solchen Fall ist es vorteilhaft, den Schritt b) vor oder gleichzeitig mit dem Schritt a) durchzuführen, indem beispielsweise das Peptid und die zu untersuchende Probe durch Mischen miteinander in Kontakt gebracht werden, und gleichzeitig oder anschließend der Träger mit der Mischung in Kontakt gebracht wird. Wenn jedoch der Schritt a) vor dem Schritt b) durchgeführt wird, beispielsweise indem ein erfindungsgemäßes an einen Träger gebundenes Peptid wie zuvor beschrieben verwendet wird, so kann derselbe Träger mehrfach zum Immobilisieren von Mikroorganismen aus mehreren Proben oder zum Immobilisieren von Mikroorganismen aus einem Probenstrom verwendet werden. Ein solches Vorgehen kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn die zu untersuchenden Proben nur geringe Konzentrationen des nachzuweisenden Mikroorganismus besitzen, oder wenn die Proben zahlreiche Begleitsubstanzen enthalten, die unspezifisch an den festen Träger binden oder auf andere Weise die Bindung der Peptide an den nachzuweisenden Mikroorganismus stören.The order in which steps a) and b) are performed is not fixed. It has been found that the binding of peptides to a microorganism to be immobilized may be hindered if the peptide is already bound to the solid support before binding to the microorganism. In such a case, it is advantageous to carry out step b) before or simultaneously with step a), for example by contacting the peptide and the sample to be examined by mixing with one another be brought and at the same time or subsequently the carrier is brought into contact with the mixture. However, if step a) is performed prior to step b), for example by using a supported peptide of the invention as described above, the same support can be used multiple times to immobilize microorganisms from multiple samples or to immobilize microorganisms from a sample stream become. Such a procedure may be advantageous in particular if the samples to be examined have only low concentrations of the microorganism to be detected, or if the samples contain numerous accompanying substances which non-specifically bind to the solid support or otherwise interfere with the binding of the peptides to the microorganism to be detected ,
Das erfindungsgemäße Anreicherungsverfahren erlaubt es, auch aus stark verdünnten Proben genügend hohe Zellzahlen von Staphylococcus aureus zu isolieren, um einen sicheren und spezifischen Nachweis von Staphylococcus aureus zu ermöglichen.The enrichment process according to the invention allows it, even from heavily diluted Samples enough to isolate high cell numbers of Staphylococcus aureus to one safe and specific detection of Staphylococcus aureus enable.
Die Peptide werden mittels dem Fachmann bekannter Verfahren bevorzugt an eine feste Phase als Träger gebunden. Als feste Phase werden vorzugsweise superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel (Beads) verwendet. Nach Kontakt mit einer Probe immobilisieren die Peptide durch ihre spezifische Bindungsfähigkeit die in der Probe enthaltenen Staphylococcus aureus-Zellen an die Trägerphase.The Peptides are preferred by methods known to those skilled in the art to a solid phase as a carrier bound. As a solid phase are preferably superparamagnetic Micro or nanoparticles (beads) used. After contact with a Probe immobilize the peptides by their specific binding ability the Staphylococcus aureus cells contained in the sample to the Carrier phase.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von Staphylococcus aureus in einer Probe mit den Schritten
- a) Kontaktierung der Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen Peptid, das einen detektierbaren Marker enthält, um ein Binden des Peptids an die nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen zu ermöglichen
- b) Nachweis des detektierbaren Markers des Peptides.
- a) contacting the sample with at least one peptide of the invention containing a detectable marker to allow binding of the peptide to the Staphylococcus aureus cells to be detected
- b) detection of the detectable marker of the peptide.
Das Nachweisverfahren ermöglicht einen spezifischen und sensitiven Nachweis von Staphylococcus aureus auch in komplexen Proben.The Detection method allows a specific and sensitive detection of Staphylococcus aureus even in complex samples.
Das Verfahren zum Nachweis des detektierbaren Markers richtet sich nach dem eingesetzten Marker.The Method for detecting the detectable marker depends the marker used.
Wie schon bei den zuvor beschriebenen Immobilisierungs- und Anreicherungsverfahren steht die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, im Belieben des Fachmanns. Dieser kann anhand der Umstände des Einzelfalles leicht selbst entscheiden, welche Reihenfolge die besten Nachweisergebnisse liefert.As already in the immobilization and enrichment processes described above is the order in which steps a) and b) are performed, at the discretion of the skilled person. This can be based on the circumstances of the Individual cases can easily decide for yourself which order the best Provides detection results.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform des Nachweisverfahrens werden die in der Probe vorhandenen Staphylococcus aureus-Zellen vor dem Nachweisen des detektierbaren Markers mittels des erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreichungsverfahrens aus der Probe angereichert bzw. an einem Träger immobilisiert.In a preferred embodiment of the detection method the Staphylococcus aureus cells present in the sample before the Detection of the detectable marker by means of the immobilization or enrichment process enriched from the sample or on a Carrier immobilized.
Dazu erfolgt zunächst die Immobilisierung von Staphylococcus aureus-Zellen an erfindungsgemäßen trägergebundenen und nicht markierten Peptiden. Nach einem Waschschritt zur Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile (Antigene, andere Zellen) wird ein weiteres erfindungsgemäßes nicht an einen Träger gebundenes Peptid mit einem detektierbaren Marker zugegeben, das an die Targets auf den nun ebenfalls an die feste Phase immobilisierten Zielzellen bindet und diese auf die oben beschriebene Art und Weise nachweist.To takes place first the immobilization of Staphylococcus aureus cells on carrier-bound and unlabeled peptides. After a washing step for removal unbound sample components (antigens, other cells) another invention not bound to a carrier Peptide with a detectable marker added to the targets on the now also immobilized on the solid phase target cells binds and proves them in the manner described above.
Auf diese Weise kann der nachzuweisende Mikroorganismus ohne großen Aufwand auch in stark verdünnten Proben oder in Proben mit den Nachweis stark störenden Begleitsubstanzen zuverlässig und mit hoher Sensitivität nachgewiesen werden.On This way, the microorganism to be detected without much effort also in heavily diluted Samples or in samples with the detection strongly interfering accompanying substances reliably and with high sensitivity be detected.
Zweckmäßigerweise wird das Nachweisverfahren und/oder das Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahren in Form eines miniaturisierten Assays durchgeführt. Beispielsweise können verschiedene zu untersuchende Proben jeweils in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben und dort einem für die jeweilige Vertiefung spezifisch ausgestalteten Nachweisverfahren unterzogen werden. Auf diese Weise können große Probenmengen parallel verarbeitet werden.Conveniently, is the detection method and / or the immobilization or enrichment process in the form of a miniaturized assay. For example, different ones each sample to be examined in a well of a microtiter plate given and there one for the respective well specifically designed detection method be subjected. In this way, large quantities of samples can be processed in parallel become.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Peptids zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus.component The invention likewise relates to the use of at least one peptide according to the invention Enrichment, immobilization, detection and / or labeling of Staphylococcus aureus.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Testkits zur spezifischen Markierung, zum Nachweis, zur Immobilisierung und zur Anreicherung von Zellen, die neben den üblichen Bestandteilen mindestens eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide enthalten.object Finally, the invention is also test kits for specific labeling, detection, immobilization and for the enrichment of cells, in addition to the usual ingredients at least contain one or more of the peptides of the invention.
Ein bevorzugtes Kit zum Anreichern von Staphylococcus aureus enthält mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid und einen Träger, wobei das Peptid bevorzugt an den Träger gebunden ist.One preferred kit for accumulating Staphylococcus aureus contains at least a peptide of the invention and a carrier, wherein the peptide is preferably bound to the carrier.
Mit einem solchen Kit wird dem Fachmann auf einfache Weise eine Reagenzienzusammenstellung an die Hand gegeben, um die Bindung eines erfindungsgemäßen Peptids an einen festen Träger ohne großen Aufwand zu ermöglichen. Damit vereinfacht ein solcher Kit die Durchführung eines erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahrens. Partikelförmige feste Träger wie z. B. magnetische Beads (bevorzugt superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel) sind wegen der genannten Vorteile besonders bevorzugt.With Such a kit will be readily available to a person skilled in the art for a reagent composition given to the binding of a peptide according to the invention to a solid support without much effort to enable. Thus, such a kit simplifies the implementation of an immobilization or enrichment process. Particulate solid carriers like z. As magnetic beads (preferably superparamagnetic micro or Nanoparticles) are particularly preferred because of the advantages mentioned.
Ein bevorzugtes Kit zum Nachweis von Staphylococcus aureus enthält mindestens ein mit einem detektierbaren Marker gekoppeltes erfindungsgemäßes Peptid.One preferred kit for the detection of Staphylococcus aureus contains at least a peptide coupled to a detectable marker according to the invention.
Bestandteil der Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die mindestens einen für eines der erfindungsgemäßen Peptide kodierenden Abschnitt enthalten. Vorteilhaft ermöglichen es die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die erfindungsgemäßen Peptide auf einfache Weise herzustellen, beispielsweise indem die für die Peptide kodierenden Nukleinsäuren in geeignete Organismen (z. B. Escherichia coli) eingebracht und die Peptide so rekombinant gewonnen werden.component The invention also includes nucleic acids, the at least one for one of the peptides of the invention coding section included. Advantageously, the nucleic acids according to the invention, which enable peptides according to the invention in a simple way, for example by adding the peptides encoding nucleic acids introduced into suitable organisms (eg Escherichia coli) and the peptides are recovered recombinantly.
In besonders bevorzugten Nukleinsäuren ist der für das erfindungsgemäße Peptid kodierende Abschnitt mit einer für ein Markerprotein kodierenden Nukleinsäure verbunden, so dass ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Peptid und dem Markerprotein, z. B. GFP und/oder einem enzymatisch aktiven Amplifikator gebildet wird.In particularly preferred nucleic acids is the for the peptide of the invention coding section with a for linked to a marker protein nucleic acid, so that a Fusion protein from the peptide according to the invention and the marker protein, z. As GFP and / or an enzymatically active amplifier becomes.
Vorzugsweise enthalten die Nukleinsäuren mindestens eine der Sequenzen SEQ ID NO. 14 bis SEQ ID NO. 26: Preferably, the nucleic acids contain at least one of the sequences SEQ ID NO. 14 to SEQ ID NO. 26:
Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 14 kodiert dabei für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1, die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 15 für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 usw.The nucleic acid sequence according to SEQ ID NO. 14 encodes for a peptide with the amino acid sequence SEQ ID NO. 1, the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO. 15 for a peptide with the amino acid sequence SEQ ID NO. 2 etc.
Ausführungsbeispieleembodiments
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken.Reference to the following figures and embodiments, the invention will be explained in more detail, without this limit.
Darin werden folgende Abkürzungen verwendet:
- CFU
- Kolonie bildende Einheiten (clony forming units)
- M
- mol/l
- RT
- Raumtemperatur
- CFU
- Colony forming units
- M
- minor
- RT
- room temperature
Ausführungsbeispiel 1:embodiment 1:
Erfindungsgemäß konnte ein Pool von Peptiden zur bioaffinen, spezifischen Bindung an Staphylococcus aureus mittels der Phagendisplay-Technik ermittelt werden. Dazu wurde eine kommerziell erhältliche M13 Phagenbibliothek (Ph.D.-12, New England Biolabs) eingesetzt, die an der Oberfläche der Phagen zufällige Peptide mit einer Länge von 12 Aminosäuren präsentiert. Die Peptide werden zusammen mit einem kurzen Spacer (Gly-Gly-Gly-Ser) am N-terminalen Ende des Hüllproteins gpIII expressiert (Typ 3 Bibliothek). Die Bibliothek hat laut Herstellerangaben eine Diversität von 2,7·109 verschiedenen Peptidsequenzen. In mehreren Panningrunden wurden die an Staphylococcus aureus bindenden Phagen isoliert. Zur Erhöhung der Spezifität wurden außerdem entsprechende Subtraktionsrunden durchgeführt.According to the invention, a pool of peptides for bioaffinity specific binding to Staphylococcus aureus could be determined by means of the phage display technique. For this purpose, a commercially available M13 phage library (Ph.D.-12, New England Biolabs) was used which presents random peptides with a length of 12 amino acids on the surface of the phages. The peptides are expressed together with a short spacer (Gly-Gly-Gly-Ser) at the N-terminal end of the envelope protein gpIII (type 3 library). According to the manufacturer, the library has a diversity of 2.7 × 10 9 different peptide sequences. In several rounds of panning, the phages binding to Staphylococcus aureus were isolated. In order to increase the specificity also appropriate subtraction rounds were carried out.
Die DNA der spezifisch bindenden Phagen wurde isoliert, mittels PCR vervielfältigt, aufgereinigt und anschließend von der Firma Seglab GmbH sequenziert.The DNA of the specific binding phage was isolated by PCR reproduced, cleaned up and then sequenced by the company Seglab GmbH.
Ausführungsbeispiel 2:embodiment 2:
Die ausgewählten Peptide wurden synthetisiert (Seglab GmbH) und an paramagnetischen Aminobeads (Dynal) immobilisiert.The chosen Peptides were synthesized (Seglab GmbH) and paramagnetic Aminobeads (Dynal) immobilized.
Ausführungsbeispiel 3:embodiment 3:
Für die biomagnetische Separation der Staphylococcus aureus-Zellen wurde zunächst eine Übernachtkultur von Staphylococcus aureus DSM 1104 angelegt.For the biomagnetic Separation of Staphylococcus aureus cells was initially an overnight culture of Staphylococcus aureus DSM 1104.
Die Zellkonzentration der Kultur wurde mittels Zählkammer ermittelt, die Zellkonzentration im Test durch Verdünnung mit Phosphate-buffered saline (0,01 M; pH 7,4) auf einen Wert von 103 CFU ml–1 eingestellt.The cell concentration of the culture was determined by means of a counting chamber, the cell concentration in the test was adjusted to a value of 10 3 CFU ml -1 by dilution with phosphate-buffered saline (0.01 M, pH 7.4).
Aliquots von 100 μl der verdünnten Zellsuspension wurden in einem 2 ml Reaktionsgefäß mit je 100 μl der mit Peptid SA02 (SEQ ID NO. 2) beladenen Magnetbeads 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Bead-Zellverbände im magnetischen Feld (MPC®-S, Dynal) aus der flüssigen Phase abgeschieden. Der Überstand wurde entfernt. Das Bead-Zell-Pellet wurde 4-mal mit 500 μl PBS-Tween (0,01 M; pH 7,4; 0,05% Tween 20) gewaschen und in 100 μl PBS resuspendiert.Aliquots of 100 μl of the diluted cell suspension were incubated in a 2 ml reaction vessel with 100 μl each of the magnetic beads loaded with peptide SA02 (SEQ ID NO: 2) for 60 min at room temperature. Subsequently, the bead cell assemblies in the magnetic field (MPC ® -S, Dynal) were separated from the liquid phase. The supernatant was removed. The bead cell pellet was washed 4 times with 500 μl PBS-Tween (0.01 M, pH 7.4, 0.05% Tween 20) and resuspended in 100 μl PBS.
Zur Bestimmung des Anteils der separierten Zellen wurden je 100 μl des resuspendierten Bead-Zell-Pellets auf PCA-(Merck)-Platten ausgestrichen. Gleichzeitig wurden 100 μl der verdünnten Übernachtkultur als Referenz zur Ermittlung des Anteils separierter Zellen ausgestrichen.to Determination of the proportion of separated cells were resuspended for each 100 μl of the Bead cell pellets streaked on PCA (Merck) plates. simultaneously 100 μl the diluted overnight culture as a reference for determining the proportion of separated cells struck.
Die
Ergebnisse der Biomagnetischen Separation für eine Versuchsserie mit dem
Peptid SA02 (SEQ ID NO. 2) sind in
In den Versuchen hat sich gezeigt, dass es mit Hilfe der isolierten Ligandenpeptide möglich ist, Staphylococcus aureus erfolgreich aus flüssiger Phase zu isolieren.In The experiments have shown that it is isolated Ligand peptides possible is to successfully isolate Staphylococcus aureus from the liquid phase.
Ausführungsbeispiel 4:embodiment 4:
Zur Anwendung kam das SPR-Analysesystem des Fraunhofer-Instituts für Angewandte Optik und Feinmechanik, Jena (IOF-SPR).to Application was the SPR analysis system of the Fraunhofer Institute for Applied Optics and Precision Engineering, Jena (IOF-SPR).
Die Chips wurden wie folgt vorbereitet:
- • Reinigung der Goldoberfläche mit 65% HNO3,
- • Funktionalisierung mit DTSSP bei 4°C über Nacht,
- • Immobilisierung von je 50 μl Protein A (2 μg/μl) bzw. Casein (0,5 μg/μl) für 1 h bei RT,
- • Blocken mit 50 μl Casein (0,5 μg/μl) für 1 h bei RT,
- • Blocken mit 50 μl 0,1 M Tris-HCl für 1 h bei RT.
- • cleaning the gold surface with 65% HNO 3 ,
- Functionalization with DTSSP at 4 ° C overnight,
- Immobilization of 50 μl protein A (2 μg / μl) or casein (0.5 μg / μl) for 1 h at RT,
- Block with 50 μl of casein (0.5 μg / μl) for 1 h at RT,
- Block with 50 μl of 0.1 M Tris-HCl for 1 h at RT.
Es
konnte nachgewiesen werden, dass Peptid SA01 (SEQ ID NO. 1) in der
Lage ist, im Gegensatz zu Casein an das Staphylococcus aureus Protein
A zu binden (
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows Sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can of the official publication platform downloaded from the DPMA.
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