DE102005001889B4

DE102005001889B4 - A method of increasing the binding capacity and efficiency of a protein that specifically binds DNA containing non-methylated CPG motifs

Info

Publication number: DE102005001889B4
Application number: DE200510001889
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. med. Straube Eberhard; Dr. med. Rußwurm Stefan; Dr. rer. nat. Schmidt Karl-Hermann; Dr. Lehmann Marc; Svea Sachse
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2005-01-14
Publication date: 2012-03-29
Anticipated expiration: 2025-01-15
Also published as: DE102005001889A1

Abstract

Verfahren zur Steigerung der Bindungskapazität und -effizienz eines Proteins, das spezifisch nicht methylierte CPG-motive enthaltende DNA bindet und eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist und gegenüber diesem verkürzt ist, wobei die Bindungsstelle für nicht methylierte CPG-Motive erhalten bleibt, wobei die Bindung dieses Proteins über einen Spacer an eine Matrix erfolgt.Process for increasing the binding capacity and efficiency of a protein which specifically binds DNA which contains non-methylated CPG motifs and which has a 25% to 35% homology to the wild-type CGPB protein and is shortened compared to this, the binding site for unmethylated CPG motifs are retained, this protein being bound to a matrix via a spacer.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der Bindungskapazität- und effizienz eines Proteins, das nicht-methylierte Cytidin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotide (CpG-Motive) einer DNA bindet, die Verwendung des Verfahrens zur Trennung und/oder Anreicherung von DNA, die nicht-methylierte CpG-Motive enthält sowie einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.The invention relates to a method for increasing the binding capacity and efficiency of a protein which binds non-methylated cytidine-phosphate-guanosine dinucleotides (CpG motifs) to a DNA, the use of the method for the separation and / or enrichment of DNA which does not methylated CpG motifs and a kit for carrying out the method.

Durch Bakterien verursachte Infektionen sind eine der häufigsten Ursachen für Entzündungskrankheiten. Zur Prognose des Krankheitsverlaufes sowie insbesondere zur rechtzeitigen Auswahl geeigneter therapeutischer Maßnahmen ist der frühzeitige Nachweis der bakteriellen Erreger von entscheidender Bedeutung.Bacterial infections are one of the most common causes of inflammatory diseases. For the prognosis of the course of the disease and in particular for the timely selection of suitable therapeutic measures, the early detection of the bacterial pathogens is of crucial importance.

Zum Nachweis bakterieller Erreger werden auch heute noch hauptsächlich verschiedene kulturabhängige Methoden angewendet. Aktuelle Studien verdeutlichen jedoch die mangelnde Eignung von kulturabhängigen Methoden zum Erregemachweis (Hellebrand W., König-Bruhns C., Hass W., Studie zu Blutkulturdiagnostik im Jahr 2002, Poster Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, Göttingen 2004; Straube E (2003) Sepsis – microbiological diagnosis. Infection 31: 284). Demnach konnten nur bei ca. 15–16% aller untersuchten Blutkulturen die Erreger ermittelt werden. Die Nachteile dieser Methoden führten dazu, daß gerade in der letzten Dekade parallel zur stürmischen technologischen Entwicklung der Molekularbiologie verstärkt nach Alternativen gesucht wurde. Erste Berichte zum Einsatz kulturunabhängiger Nachweisverfahren bakterieller Erreger, welche auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR) beruhen, stammen vom Anfang der 90er Jahre. So konnten beispielsweise Miller und Kollegen (Miller N J Clin Microbiol. 1994 Feb; 32 (2): 393–7) zeigen, dass kulturunabhängige Verfahren den klassischen Kultivierungs- und Mikroskopietechniken beim Nachweis von Mycobacterium tuberculosis überlegen sind. In letzter Zeit haben aber weitere molekularbiologische Methoden, die auf dem Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren basieren, an Bedeutung gewonnen (z. B. M. Grijalva et al. Heart 89 (2003) 263–268; Uyttendaele M et al. Lett Appl Microbiol. 2003; 37 (5): 386–91; Saukkoriipi A et al. Mol Diagn. 2003 Mar; 7 (1): 9–15; Tzanakaki G et al. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003 Oct 24; 39 (1): 31–6;).To detect bacterial pathogens, still mainly different culture-dependent methods are used today. Recent studies illustrate, however, the inadequacy of culture-dependent methods for detection of the pathogen (Hellebrand W., König-Bruhns C., Hass W., Study on blood culture diagnostics in 2002, Poster Annual Meeting of the German Society for Hygiene and Microbiology, Göttingen 2004; 2003) Sepsis - microbiological diagnosis, Infection 31: 284). Accordingly, only in about 15-16% of all blood cultures examined the pathogens could be determined. The disadvantages of these methods led to the fact that in the last decade parallel to the stormy technological development of molecular biology was increasingly looking for alternatives. First reports on the use of culture-independent detection methods of bacterial pathogens, which are based on the principle of polymerase chain reaction (PCR), date from the beginning of the 90s. For example, Miller and colleagues (Miller N J Clin Microbiol. 1994 Feb; 32 (2): 393-7) have shown that culture-independent techniques are superior to classical culture and microscopy techniques in the detection of Mycobacterium tuberculosis. Recently, however, other methods of molecular biology based on the detection of pathogen-specific nucleic acids have gained in importance (for example, Grijalva, et al, Heart 89 (2003) 263-268, Uyttendaele M et al., Lett Appl Microbiol., 2003; 5): 386-91; Saukkoriipi A et al Mol., Mol. Mar, 7 (1): 9-15; Tzanakaki G et al., FEMS Immunol Med Microbiol., 2003 Oct 24; 39 (1): 31-6; ).

Neben der hohen Spezifität solcher molekularbiologischer Methoden ist der geringe Zeitbedarf als wesentlicher Vorteil gegenüber konventionellen kulturabhängigen Methoden zu nennen. Allerdings ist die Sensitivität des Nachweises prokaryonter DNA direkt aus Körperflüssigkeiten und nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial im Vergleich zur Kultur der Mikroorganismen bislang viel zu gering. Eine für den direkten Erregernachweis aus nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial ausreichende Menge an Nukleinsäuren von Bakterien wird auch im Bereich der 16S-rRNA-Analyse, mittels PCR der 16S Region auf dem bakteriellen Chromosom und der anschließenden Sequenzanalyse des PCR Fragmentes, nur eingeschränkt erreicht, da sich meist mehrere Kopien für den die 16S-rRNA kodierenden Abschnitt auf dem Chromosom befinden. Der direkte spezifische Erregemachweis mittels 16S-rRNA Analyse setzt voraus, dass sich nur eine Erreger-Spezies in der zu untersuchenden Probe befindet. Befinden sich verschiedene Erreger-Spezies in der Probe, ist ein spezifischer Nachweis über Sequenzzierung der 16S-rRNA Region nicht möglich, da die verwendeten Primer universell für die meisten Bakterien sind. Weiterhin ist für den Erregernachweis mittels 16S-rRNA-Analyse Voraussetzung, dass sich die nachzuweisenden Bakterien in der metabolischen Phase befinden und genügend 16S-rRNA exprimieren. Davon ist insbesondere bei Patienten, die unter einer kalkulierten antibiotischen Therapie stehen, in der Regel nicht auszugehen.In addition to the high specificity of such molecular biological methods, the short time requirement is a significant advantage over conventional culture-dependent methods. However, the sensitivity of detecting prokaryotic DNA directly from body fluids and non-pretreated specimens has been far too low in comparison to the culture of microorganisms. A sufficient amount of nucleic acids from bacteria for the direct detection of pathogens from non-pretreated examination material is only limitedly achieved in the area of 16S rRNA analysis, by means of PCR of the 16S region on the bacterial chromosome and the subsequent sequence analysis of the PCR fragment multiple copies for the 16S rRNA coding portion located on the chromosome. The direct detection of specific pathogens by means of 16S rRNA analysis requires that only one pathogen species is present in the sample to be examined. If different pathogen species are present in the sample, specific evidence of sequencing of the 16S rRNA region is not possible because the primers used are universal to most bacteria. Furthermore, it is a prerequisite for pathogen detection by means of 16S rRNA analysis that the bacteria to be detected are in the metabolic phase and express enough 16S rRNA. Of these, especially in patients who are under a calculated antibiotic therapy, usually can not be expected.

Darüber hinaus kommen bestimmte Pathogenitätsfaktoren von Bakterien nicht zu jeder Zeit zur Expression, obwohl die entsprechenden Gene im bakteriellen Genom vorhanden sind. Im Ergebnis werden dem klinisch tätigen Arzt falsch negative Befunde übermittelt. Dadurch kann eine gezielte antibiotische Therapie entweder gar nicht oder viel zu spät eingeleitet werden. Der Arzt ist in solchen Fällen auf sein Erfahrungswissen und allgemeine Richtlinien (wie z. B. der Paul-Ehrlich-Gesellschaft) angewiesen und wird daher viel zu allgemein antibiotisch behandeln. Der nicht zielgenaue Einsatz von Antibiotika birgt eine Reihe von Risiken nicht nur für den einzelnen Patienten (wie z. B. unnötige Nebenwirkungen in Form von Nierenschäden etc.), sondern auch für die gesamte Gesellschaft (z. B. die Entwicklung zusätzlicher Antibiotikaresistenzen wie MRSA (Methicillinresistente Staphylokokkus aureus, etc.). Deshalb bietet der Nachweis der klinisch bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren und Resistenzen von Bakterien auf chromosomaler und Plasmid-Ebene, also letztendlich auf DNA-Ebene, für die Diagnose vieler Infektionserkrankungen, aber auch der Sepsis, erhebliche Vorteile. Dies gilt um so mehr, da auf dieser Ebene auch eine Unterscheidung zwischen pathogenen und kommensalen Bakterien getroffen werden kann.In addition, certain pathogenicity factors of bacteria do not come for expression at any time, although the corresponding genes are present in the bacterial genome. As a result, the clinically active physician receives false negative results. As a result, targeted antibiotic therapy can either not be initiated at all or far too late. The doctor relies on his experience and general guidelines (such as the Paul Ehrlich Society) in such cases, and will therefore far too generally treat antibiotics. The non-targeted use of antibiotics poses a number of risks not only to the individual patient (such as unnecessary side effects in the form of kidney damage, etc.), but also to society as a whole (eg, the development of additional antibiotic resistance such as MRSA (Methicillin-resistant staphylococcus aureus, etc.) Therefore, the detection of clinically significant pathogenicity factors and resistance of bacteria at the chromosomal and plasmid level, ie ultimately at the DNA level, for the diagnosis of many infectious diseases, but also sepsis, considerable advantages This is all the more true, because at this level a distinction between pathogenic and commensal bacteria can be made.

Am häufigsten erfolgt der erregerspezifische Nukleinsäurenachweis durch Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT), wie beispielsweise die Vervielfältigung der prokaryonten DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bzw. der Ligase-Kettenreaktion (LCR). Der hohen Spezifität und schnellen Verfügbarkeit der Ergebnisse stehen die Störanfälligkeit durch Kontaminationen oder stark reaktionshemmende Faktoren in klinischen Proben gegenüber.Pathogen-specific nucleic acid detection is most frequently performed by nucleic acid amplification techniques (NAT), such as, for example, the amplification of the prokaryotic DNA by means of the polymerase reaction. Chain reaction (PCR) or the ligase chain reaction (LCR). The high specificity and rapid availability of the results are offset by the susceptibility to contamination by contaminants or highly reaction-inhibiting factors in clinical samples.

Bei einem herkömmlichen PCR-Nachweisverfahren muß für eine erfolgreiche Detektion von Erregern im Blut theoretisch mindestens 1 Target-DNA des Erregers in 10 μl Blut vorhanden sein. Das entspricht ca. 100 Targets in 1 ml Blut bzw. 1000 Targets in 10 ml Blut.In a conventional PCR detection method must be present for successful detection of agents in the blood theoretically at least 1 target DNA of the pathogen in 10 ul of blood. This corresponds to about 100 targets in 1 ml of blood or 1000 targets in 10 ml of blood.

Anders verhält es sich bei der Blutkultur zum Nachweis von Erregern einer Infektion. Hier liegt die untere Nachweisgrenze bei etwa 3–5 Bakterien pro 10 ml Blut.The situation is different with the blood culture for the detection of pathogens of an infection. Here, the lower limit of detection is about 3-5 bacteria per 10 ml of blood.

Diese Nachweisgrenze wird derzeit mit PCR-Verfahren noch nicht erreicht, auch nicht mit solchen, die ihre Zielsequenz im Bereich der 16S-rRNA Region auf dem Chromosom haben. Obwohl mehrere die 16S rRNA kodierende Regionen auf dem bakteriellen Chromosom lokalisiert sind, meist 3 bis 6, bleibt die Voraussetzung, daß sich mindestens ein Molekül der Template-DNA im PCR-Reaktionsgemisch befindet, unerfüllt.This detection limit is currently not achieved with PCR methods, even those with their target sequence in the region of the 16S rRNA region on the chromosome. Although several 16S rRNA coding regions are located on the bacterial chromosome, usually 3 to 6, the assumption that there is at least one molecule of template DNA in the PCR reaction remains unfulfilled.

Eine verbesserte diagnostische Sicherheit ist von PCR-Verfahren zu erwarten, deren spezifische Zielsequenzen für speziesspezifische Proteine kodieren, entweder im Chromosom oder auf Plasmiden der Mikroorganismen. Auch hier trifft das Obengesagte zur Nachweisgrenze zu. Gerade unter dem Einfluß einer laufenden Antibiotikatherapie kann das Wachstum der Erreger stark verlangsamt, eingeschränkt oder blockiert sein, auch wenn das eingesetzte Antibiotikum letztlich nicht optimal wirksam ist. Diese Situation ist gerade bei solchen Patienten häufig anzutreffen, die bereits unter Antibiotikatherapie stehen und bei denen aus diesem Grund keine krankheitsverursachenden Bakterien aus den Blutkulturen oder anderen Proben (wie z. B. Trachealabstrichen, bronchoalveolären Lavagen (BAL) etc.) angezüchtet werden können.Improved diagnostic certainty is expected from PCR methods whose specific target sequences encode species-specific proteins, either in the chromosome or on microorganism plasmids. Again, the above statement applies to the detection limit. Especially under the influence of ongoing antibiotic therapy, the growth of pathogens can be severely slowed down, restricted or blocked, even if the antibiotic used is ultimately not optimally effective. This situation is particularly common in those patients who are already on antibiotic therapy and for which reason no disease-causing bacteria can be cultured from blood cultures or other samples (such as tracheal swabs, bronchoalveolar lavages (BAL), etc.).

Wegen unzureichender Sensitivität hat der erregerspezfische Nukleinsäurennachweis ohne Amplifikationsschritt durch direkten Nachweis der prokaryonten DNA (Sondentechnik, FISH-Technik) nur bei ausreichend hoher Keimzahl im Untersuchungsmaterial diagnostische Bedeutung.Because of insufficient sensitivity of the pathogen-specific nucleic acid detection without amplification step by direct detection of prokaryotic DNA (probe technique, FISH technique) only with sufficiently high numbers of germs in the test material diagnostic significance.

Die wesentliche Problematik des Nachweises prokaryonter DNA zur Identifikation bakterieller Erreger in Körperflüssigkeiten bestehen neben PCR-hemmenden Bestandteilen im Untersuchungsmaterial vor allem in der geringen Konzentration prokaryonter DNA und den damit einhergehenden Überschuß eukaryonter gegenüber prokaryonter DNA. Hierbei sind insbesondere kompetitive Prozesse bei der DNA-Analyse sowie die geringe Menge an prokaryonter DNA als hinderlich für einen qualitativen und quantitativen Erregemachweis anzusehen.The main problem of the detection of prokaryotic DNA for the identification of bacterial pathogens in body fluids, in addition to PCR-inhibiting components in the test material mainly in the low concentration of prokaryotic DNA and the concomitant excess eukaryotic against prokaryotic DNA. In particular, competitive processes in the DNA analysis and the small amount of prokaryotic DNA are to be regarded as a hindrance to a qualitative and quantitative evidence of proof.

Die üblichen Methoden zur DNA-Isolierung reichem die Gesamt-DNA einer Körperflüssigkeit an, so daß das Verhältnis Wirts-DNA zu mikrobieller DNA zwischen 1:10^–6 und 1:10^–8 betragen kann. Aus diesem Unterschied ist die Schwierigkeit des Nachweises mikrobieller DNA in Körperflüssigkeiten gut nachzuvollziehen.The usual methods for DNA isolation enrich the total DNA of a body fluid so that the ratio of host DNA to microbial DNA can be between 1:10 ^-6 and 1:10 ^-8 . From this difference, the difficulty of detecting microbial DNA in body fluids is easy to understand.

Prokaryonte DNA unterscheidet sich von eukaryonter DNA beispielsweise durch das Vorkommen nicht-methylierter CpG-Motive (Hartmann G et al., Deutsches Ärzteblatt, Jg. 98/15: A981–A985 (2001). In der prokaryonten DNA befinden sich CpG-Motive in einem 16-fachen Überschuß im Vergleich zu eukaryonter DNA, die solche Motive nur übergangsweise enthält, z. B. in Krebszellen oder Promotorregionen. In prokaryonter DNA sind diese Motive nicht-methyliert, wohingegen sie in eukaryonter DNA zum größten Teil methyliert sind, was die Unterschiedlichkeit nochmals erhöht. Nicht-methylierte CpG-Motive sind nicht-methylierte Deoxycytidylat-Deoxyguanylat-Dinucleotide innerhalb des prokaryonten Genoms oder innerhalb von Fragmenten desselben.Prokaryote DNA differs from eukaryotic DNA, for example, by the presence of non-methylated CpG motifs (Hartmann G et al., Deutsches Ärzteblatt, Vol. 98/15: A981-A985 (2001).) The prokaryotic DNA contains CpG motifs in a 16-fold excess compared to eukaryotic DNA that only transiently contains such motifs, for example, in cancer cells or promoter regions. In prokaryotic DNA, these motifs are unmethylated whereas in eukaryotic DNA they are mostly methylated Unmethylated CpG motifs are unmethylated deoxycytidylate deoxyguanylate dinucleotides within the prokaryotic genome or within fragments thereof.

Es ist weiterhin bekannt, dass aus unterschiedlichen Methylierungsmustern innerhalb der humanen DNA diagnostische Aussagen für Krebserkrankungen ableiten lassen (Epigenetics in Cancer Prevention: Early Detection and Risk Assessment (Annals of the New York Academy of Sciences, Vol 983) Editor: Mukesh Verma ISBN 1-57331-431-5). Anhand von methylierten und nicht-methylierten Cytosinen im Genom lassen sich gewebe-, aber auch krankheitsspezifische Muster identifizieren. Die spezifischen Methylierungsmuster für eine Krankheit ermöglichen zum einen eine Diagnose zu einem sehr frühen Zeitpunkt, zum anderen auch molekulare Klassifikation einer Krankheit und die wahrscheinliche Reaktion eines Patienten auf eine bestimmte Behandlung. Ausführliche Informationen hierzu können beispielsweise aus Beck S, Olek A, Walter J.: From genomics to epigenomics: a loftier view of life”, Nature Biotechnology 1999 Dec; 17 (12): 1144, der Homepage der Epigenomics AG (http://www.epigenomics.de) oder aus der WO 2004/67775 A2 entnommen werden.It is also known that diagnostic data for cancer can be derived from different methylation patterns within human DNA (Epigenetics in Cancer Prevention: Early Detection and Risk Assessment Editor: Mukesh Verma ISBN 1- 57331-431-5). On the basis of methylated and unmethylated cytosines in the genome, tissue as well as disease-specific patterns can be identified. The specific patterns of methylation for a disease allow for a diagnosis at a very early stage, as well as molecular classification of a disease and the likely response of a patient to a particular treatment. For further details, see, for example, Beck S, Olek A, Walter J .: From genomics to epigenomics: a loftier view of life ", Nature Biotechnology 1999 Dec; 17 (12): 1144, the homepage of Epigenomics AG (http://www.epigenomics.de) or from the WO 2004/67775 A2 be removed.

In Cross et al. wurde gezeigt, dass es möglich ist, unterschiedlich methylierte genomische humane DNA zu trennen, indem die methylierte CpG-Motive an ein Protein gebunden werden (Cross SH, Charlton JA, Nan X, Bird AP, Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column, Nat Genet. 1994 Mar; 6 (3): 236–44). Dieses Verfahren dient also zur Bindung methylierte CpG-Motive enthaltende DNA. Eine ausreichende Trennung von nicht-methylierter und methylierter DNA ist aus technischen Gründen nicht möglich, da dass verwendete Protein auch nicht-methylierte DNA schwach bindet. Auch eine Anreicherung von nicht-methylierter DNA ist mit diesem Verfahren nicht möglich, da die Kapazität des verwendeten Proteins nicht ausreicht, um bei einem hohen Überschuss an methylierter DNA in ausreichendem Maße von nicht-methylierter DNA zu trennen. Weiterhin bleibt durch die Bindung der methylierten DNA das Ausgangsvolumen in welchem sich die nicht-methylierte DNA befindet unverändert, so dass keine Anreicherung erreicht wird. In Cross et al. It has been demonstrated that it is possible to separate differently methylated human genomic DNA by binding the methylated CpG motifs to a protein (Cross SH, Charlton JA, Nan X, Bird AP, Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column , Nat Genet. 1994 Mar; 6 (3): 236-44). This method thus serves to bind methylated CpG motifs containing DNA. A sufficient separation of non-methylated and methylated DNA is not possible for technical reasons, since the protein used weakly binds non-methylated DNA. An enrichment of non-methylated DNA is not possible with this method, since the capacity of the protein used is not sufficient to separate sufficiently from non-methylated DNA with a high excess of methylated DNA. Furthermore, due to the binding of the methylated DNA, the starting volume in which the non-methylated DNA is present remains unchanged, so that no enrichment is achieved.

Es wäre also wünschenswert, die nicht-methylierte DNA von methylierter DNA zu trennen und nicht-methylierte DNA anreichern zu können, um somit prokaryonte von eukaryonter DNA bzw. unterschiedlich methylierte humane DNA voneinander zu trennen. Es wäre zudem wünschenswert und von hohen gesundheitsökonomischen Interesse, dass die Trennung und Anreicherung von nicht-methylierter DNA auch aus einem Gemisch (beispielsweise Vollblut) erreicht werden könnte, dass durch einen hohen Überschuß an methylierter DNA charakterisiert ist.It would therefore be desirable to be able to separate the unmethylated DNA from methylated DNA and to be able to accumulate unmethylated DNA in order to separate prokaryotes from eukaryotic DNA or differently methylated human DNA from one another. It would also be desirable and of high health economic interest that separation and enrichment of unmethylated DNA could also be achieved from a mixture (e.g., whole blood) characterized by a high excess of methylated DNA.

Aus Voo et al. ist bekannt, dass das humane CpG-bindende Protein (hCGBP) in der Lage ist, nichtmethylierte CpG-Motive zu binden. Die Publikation beschreibt den transkriptionsaktivierenden Faktor hCGBP, von dem gezeigt wurde, dass er eine Rolle in der Regulation der Expression von Genen innerhalb von CpG-Motiven spielt.From Voo et al. It is known that the human CpG-binding protein (hCGBP) is capable of binding non-methylated CpG motifs. The publication describes the transcriptional activating factor hCGBP, which has been shown to play a role in the regulation of the expression of genes within CpG motifs.

In der EP 1 400 589 A1 wurde ein Verfahren gezeigt, das die Trennung und Anreicherung von prokaryonter DNA aus einem Gemisch aus prokaryonter und eukaryonter DNA durch Bindung der prokaryonten DNA an ein spezifisch nicht-methylierte DNA bindendes Protein ermöglicht. Aus der DE 10 2004 010 928 A1 ) und aus Sachse S. et al. (Using a DNA-binding protein to enrich prokaryontic DNA from a mixture of both, eukarotic and prokayrotic DNA, Poster Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, Göttingen 2004) ist bekannt, dass die Bindung nicht-methylierter CpG-Motive durch das rekombinant herstellte Protein CpGbP-181 mit der SEQ-ID. Nr. 1 erreicht werden kann.In the EP 1 400 589 A1 For example, a method has been demonstrated which allows the separation and accumulation of prokaryotic DNA from a mixture of prokaryotic and eukaryotic DNA by binding the prokaryotic DNA to a specific non-methylated DNA binding protein. From the DE 10 2004 010 928 A1 ) and from Sachse S. et al. (Using a DNA-binding protein to enrich prokaryotic DNA from a mixture of both, eukaryotic and prokayrotic DNA, Poster Annual Meeting of the German Society for Hygiene and Microbiology, Göttingen 2004) is known that the binding of non-methylated CpG motifs by the recombinant produced protein CpGbP-181 with the SEQ ID. No. 1 can be achieved.

Es wurde gezeigt, dass das CpGbp-181-Protein direkt an eine Matrix gekoppelt wurde. In Sachse et al. wurde das CpGbP-181-Protein direkt an bromcyanaktivierte Sepharose gekoppelt.It was shown that the CpGbp-181 protein was coupled directly to a matrix. In Sachse et al. For example, the CpGbP-181 protein was coupled directly to cyanogen bromide activated Sepharose.

Die direkte Bindung des CpGbP-181-Proteins führt jedoch zu einer ungerichteten Bindung dieses Proteins über die gesamte Oberfläche der Matrix. Daraus resultiert eingeschränkte Beweglichkeit des Proteins auf der Oberfläche der Matrix. Weiterhin kann die direkte Bindung des Proteins an die Matrix eine optimale Faltung dieses Proteins verhindern und die Zahl der freien Bindungsstellen reduzieren.However, the direct binding of the CpGbP-181 protein results in an undirected binding of this protein over the entire surface of the matrix. This results in limited mobility of the protein on the surface of the matrix. Furthermore, direct binding of the protein to the matrix can prevent optimal folding of this protein and reduce the number of free binding sites.

Die mit der direkten Kopplung des CpGbP-181-Proteins an eine Matrix einhergehenden Nachteile führen schließlich zu einer reduzierten Bindungskapazität und- effizienz für die nicht-mehtylierten CpG-Motive einer DNA.The disadvantages associated with the direct coupling of the CpGbP-181 protein to a matrix ultimately lead to a reduced binding capacity and efficiency for the non-methylated CpG motifs of a DNA.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, dass die Bindungskapazität – und effizienz eines Proteins, dass spezifisch nicht-methylierte CpG-motive enthaltende DNA bindet und eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtypprotein-CGPB-Protein aufweist und gegenüber diesem verkürzt ist wobei die Bindungsstelle für nicht-methylierte CpG-Motive erhalten bleibt, erhöht und somit eine verbesserte Trennung und/oder Anreicherung nicht-methylierter DNA aus einem Gemisch von methylierter DNA und nicht-methylierter DNA ermöglicht.It is an object of the present invention to provide a method that binds the binding capacity and efficiency of a protein that specifically binds non-methylated CpG motifs and has 25% to 35% homology to the wild-type protein CGPB protein and shortened with respect to this, while retaining the binding site for unmethylated CpG motifs, thus increasing and thus enabling improved separation and / or enrichment of unmethylated DNA from a mixture of methylated DNA and unmethylated DNA.

Im folgenden wird die Erfindung am Beispiel des rekombinant herstellten CpGbP-181-Proteins gemäß SEQ-ID Nr. 1 beschrieben. Die auf das Protein CpGbP-181 mit der SEQ-ID Nr. 1 bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.The invention is described below using the example of the recombinantly produced CpGbP-181 protein according to SEQ ID No. 1. The description of the invention related to the protein CpGbP-181 with SEQ ID No. 1 is not a limitation but only an exemplary application.

Erfindungsgemäß wird dies durch die indirekte Kopplung des Proteins an die Matrix erreicht. Die Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass durch eine indirekte Bindung des CpGbP-181-Proteins die Bindungskapazität und -effizienz erhöht wird.According to the invention this is achieved by the indirect coupling of the protein to the matrix. The invention is based on the surprising finding that binding capacity and efficiency is increased by indirect binding of the CpGbP-181 protein.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die 1 und 2 beschrieben, wobeiThe invention will be described below with reference to FIGS 1 and 2 described, wherein

1 Ergebnisse der PCR nach Anreicherung prokaryontischer DNA aus DNA-Gemisch von Staphylococcus aureus und human DNA unter Verwendung von gekoppeltem CpGbP-181-Protein an CNBr-Sepharose und 1 Results of PCR after enrichment of prokaryotic DNA from DNA mixture of Staphylococcus aureus and human DNA using coupled CpGbP-181 protein on CNBr-Sepharose and

2 Ergebnisse der PCR nach Anreicherung prokaryontischer DNA aus einem DNA-Gemisch von Staphylococcus aureus und humaner DNA unter Verwendung von gekoppeltem CpGbP-181-Protein an AH-Sepharose darstellen. 2 Results of PCR after enrichment of prokaryotic DNA from a DNA mixture of Staphylococcus aureus and human DNA using coupled CpGbP-181 protein to AH-Sepharose.

Zur Steigerung der Bindungskapazität und -effizienz des CpGbP-181-Proteins für nicht-methylierte CpG-Motive ist Gegenstand dieser Erfindung ein Verfahren zur indirekten Bindung des Proteins an die Matrix über einen Spacer. Durch die Kopplung des Proteins über einen Spacer an die Matrix wird der Grad der Beweglichkeit sowie die Anzahl der freien Bindungsstellen des CpGbP-181-Proteins erhöht. Dadurch wird eine Steigerung der Bindungskapazität- und effizienz erreicht. Weiterhin kann dadurch die Menge des eingesetzten Proteins reduziert werden.To increase the binding capacity and efficiency of the CpGbP-181 protein for non-methylated CpG motifs, the subject of this invention is a method of indirectly binding the protein to the matrix via a spacer. Coupling the protein to the matrix via a spacer increases the degree of mobility and the number of free binding sites of the CpGbP-181 protein. This achieves an increase in binding capacity and efficiency. Furthermore, this can reduce the amount of protein used.

Als Spacer im Sinne dieser Erfindung werden Moleküle verstanden, welche einen räumlichen Abstand zwischen Matrix und dem CpGbP-181-Protein ermöglicht. Als Spacer kommen Moleküle wie Diaminhexan (NH-CH₂)₆-NH₂) oder andere dem Fachmann bekannte anorganische oder organische Verbindungen zum Einsatz. Antikörper sind im Sinne dieser Erfindung nicht als Spacer zu betrachten.For the purposes of this invention, spacers are understood to mean molecules which enable a spatial distance between the matrix and the CpGbP-181 protein. Suitable spacers are molecules such as diamine hexane (NH-CH ₂ ) ₆ -NH ₂ ) or other inorganic or organic compounds known to the person skilled in the art. For the purposes of this invention, antibodies are not considered as spacers.

Als Matrix im Sinne dieser Erfindung werden Substanzen bezeichnet, die als Träger für Spacer und Protein fungieren. Trägermaterialien können beispielsweise Sepharose, Perlzellulose, Silica o. ä. dem Fachmann bekannte Substanzen sein.For the purposes of this invention, the term "matrix" refers to substances which act as a carrier for spacer and protein. Support materials may be, for example, sepharose, perl cellulose, silica or the like known to those skilled substances.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Matrix an einen festen Träger gekoppelt sein. Diese Ausführungsform stellt eine besonders einfache Möglichkeit der Anreicherung nicht-methylierte CpG-motive enthaltender DNA dar, da die Separation aus der Lösung besonders einfach, beispielsweise durch physikalische Entfernung (z. B. Abzentrifugation) der nicht-gebundenen Bestandteile des Gemisches aus der Lösung, erfolgen kann. Als Träger kommen dabei insbesondere Membranen, Mikropartikel und Harze oder ähnliche Materialien für Affinitätsmatrices in Frage. Geeignete Materialien zur Anbindung des erfindungsgemäßen Proteins, sowie – abhängig von der Art des Materials – die Durchführung der Anbindung, sind dem Fachmann hinlänglich bekannt.According to another embodiment, the matrix may be coupled to a solid support. This embodiment represents a particularly simple possibility of enrichment of DNA containing non-methylated CpG motifs, since the separation from the solution is particularly simple, for example by physical removal (eg centrifugation) of the unbound constituents of the mixture from the solution, can be done. Suitable carriers are, in particular, membranes, microparticles and resins or similar materials for affinity matrices. Suitable materials for binding the protein according to the invention, as well as - depending on the type of material - the implementation of the connection, are well known to the skilled person.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird Sepharose als Matrix verwendet.According to another embodiment Sepharose is used as a matrix.

In einer weiteren Ausführungsform wird Diaminohexan-Rest (-NH-(CH₂)₆-NH-; auch als AH bezeichnet) als Spacer verwendet.In another embodiment, diaminohexane radical (-NH- (CH ₂ ) ₆ -NH-, also referred to as AH) is used as a spacer.

Aufgrund der gesteigerten Bindungskapazität und -effizienz ist weiterhin Gegenstand dieser Erfindung ein Verfahren zur Trennung und/oder Anreicherung von nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA mit den Schritten

a) Kopplung des CpGbP-181-Proteins über einen Spacer an eine Matrix
b) Kontaktieren mindestens einer in Lösung befindlichen nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA mit dem CpGbP-181-Protein, wodurch ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird, und
c) Separation des Komplexes.

Further, because of the increased binding capacity and efficiency, the subject of this invention is a method of separating and / or enriching DNA containing non-methylated CpG motifs with the steps

a) Coupling of the CpGbP-181 protein via a spacer to a matrix
b) contacting at least one DNA containing non-methylated CpG motifs in solution with the CpGbP-181 protein to form a protein-DNA complex, and
c) Separation of the complex.

Die Bezeichnung „nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA” bezieht sich dabei sowohl auf eukaryonte als auch prokaryonte DNA. Diese kann aufgereinigt und wieder in Lösung gebracht sein (z. B. aus Geweben isolierte nicht-methylierte DNA) oder direkt in der Ursprungsquelle (z. B. Körperflüssigkeit, wie Blut, Serum, Trachealaspirat, Urin, bronchalveoläre Lavage, Nasenabstrich, Hautabstrich, Punktionsflüssigkeit) vorliegen.The term "non-methylated CpG motifs containing DNA" refers to both eukaryotic and prokaryotic DNA. This may be purified and redissolved (eg, non-methylated DNA isolated from tissues) or directly in the source of origin (eg, body fluid such as blood, serum, tracheal aspirate, urine, bronchoalveolar lavage, nasal swab, skin swab, Puncture fluid).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA prokaryonte, insbesondere bakterielle DNA.According to a preferred embodiment, the DNA containing non-methylated CpG motifs is prokaryote, in particular bacterial DNA.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA humane, genomische DNA.In another preferred embodiment, DNA containing non-methylated CpG motifs is human genomic DNA.

Die Separation kann mittels verschiedener Verfahren zur Trennung, Isolierung oder Anreicherung von DNA-Protein-Komplexen oder DNA-Polypeptid-Komplexe erfolgen, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Dabei werden bevorzugt Methoden angewendet, bei denen das DNA-bindende Protein an einen Träger immobilisiert ist oder wird, um die DNA aus der Probelösung zu trennen und/oder anzureichern.The separation may be accomplished by various methods for the separation, isolation or enrichment of DNA-protein complexes or DNA-polypeptide complexes well known to those skilled in the art are. In this case, methods are preferably used in which the DNA-binding protein is immobilized on a carrier or is to separate the DNA from the sample solution and / or enriched.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform schließt sich an die Separation ein Schritt zur Abtrennung der DNA vom CpGbP-181-Protein aus dem Komplex an. Dies kann beispielsweise durch herkömmliche Verfahren zur DNA-Aufreinigung erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Im einfachsten Falle beruht die Abtrennung auf der Änderung des pH-Wertes oder der Salzkonzentration (z. B. auf 1 M NaCl) des Mediums/Puffers oder der Zufügung chaotroper Reagenzien, etc; also geeignete Parameter, die zur Auflösung des Protein-DNA-Komplexes führen. Solche Methoden sind dem Fachmann bekannt.In a preferred embodiment, the separation is followed by a step of separating the DNA from the CpGbP-181 protein from the complex. This can be done, for example, by conventional methods for DNA purification, which are known in the art. In the simplest case, the separation is based on the change of the pH or the salt concentration (eg to 1 M NaCl) of the medium / buffer or the addition of chaotropic reagents, etc .; that is, suitable parameters that lead to the dissolution of the protein-DNA complex. Such methods are known to the person skilled in the art.

Für die Lösung für nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA kommt grundsätzlich jedes geeignete Lösungsmittel in Frage. Besonders zweckmäßig ist das Verfahren jedoch zur Anreicherung nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA aus Lösungen, die verschiedene biomolekulare Spezies, insbesondere verschieden Arten von DNA, enthalten.In principle, any suitable solvent is suitable for the solution for DNA containing unmethylated CpG motifs. However, the method is particularly useful for enriching non-methylated CpG motifs-containing DNA from solutions containing various biomolecular species, especially different types of DNA.

Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein Verfahren zur Trennung und Anreicherung prokaryonter DNA aus einem Gemisch von prokaryonter und eukaryonter DNA. Dabei wird beispielsweise die in Körperflüssigkeiten befindliche prokaryonte DNA durch spezifische Bindung an das erfindungsgemäße Protein von der eukaryonten DNA getrennt und angereichert. Die so angereicherte prokaryonte DNA erleichtert den Nachweis prokaryonter Erreger mit Hilfe molekularbiologischer Methoden und kann zur Diagnose von Krankheiten, die durch pathogene Erreger verursacht werden, beitragen.The invention preferably relates to a method for separating and accumulating prokaryotic DNA from a mixture of prokaryotic and eukaryotic DNA. In this case, for example, the prokaryotic DNA present in body fluids is separated from the eukaryotic DNA by specific binding to the protein according to the invention and enriched. The enriched prokaryotic DNA facilitates the detection of prokaryotic pathogens with the help of molecular biological methods and can contribute to the diagnosis of diseases caused by pathogenic agents.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Trennung und Anreicherung von nichtmethylierte genomischer DNA aus einem Gemisch von nicht-methylierter genomischer und methylierter genomischer DNA. Durch die Bindung der nicht-methylierten genomischen DNA an das über einen Spacer an eine Matrix gekoppelte CpGbP-181-Protein wird die methylierte genomische DNA abgetrennt. Diese Verfahrensweise trägt wesentlich zur vereinfachten Untersuchung der Methylierungsmuster von methylierter genomischer DNA bei und ermöglicht die Diagnose von Krankheiten, die ein spezifisches Methylierungsmuster aufweisen.The invention also relates to a method for separating and accumulating non-methylated genomic DNA from a mixture of unmethylated genomic and methylated genomic DNA. By binding the non-methylated genomic DNA to the CpGbP-181 protein coupled to a matrix via a spacer, the methylated genomic DNA is separated. This procedure contributes significantly to the simplified study of the methylation patterns of methylated genomic DNA and allows the diagnosis of diseases having a specific methylation pattern.

Als Körperflüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle vom Körper eines Säugers, einschließlich Mensch, stammenden Flüssigkeiten verstanden, insbesondere solche in denen Krankheitserreger vorkommen können, wie z. B. Blut, Urin, Liquor, Pleural-, Perikardial-, Peritoneal- sowie Synovialflüssigkeit. Die auf humanes Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.For the purposes of the invention, bodily fluids are understood as meaning all fluids originating from the body of a mammal, including humans, in particular those in which pathogens may occur, such as, for example, As blood, urine, cerebrospinal fluid, pleural, pericardial, peritoneal and synovial fluid. The human blood related description of the invention is not a limitation but only an exemplary application.

Unter bakteriellen Erregern werden vorzugsweise Erreger einer Sepsis, aber auch alle anderen bakteriellen Erreger von Infektionen verstanden. Sie können sich dabei von kommensalen Erregern unterscheiden, die zur normalen Besiedlung des Organismus gerechnet werden und gelegentlich auch in Untersuchungsproben von Patienten gefunden werden, aber keine klinische Bedeutung haben.Bacterial pathogens are preferably pathogens of sepsis, but also all other bacterial pathogens of infections. They may be different from commensal pathogens, which are considered normal colonization of the organism and occasionally found in specimens from patients, but have no clinical significance.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Trennung und Anreicherung nicht-methylierte CpG-motive enthaltende DNA von methylierter DNA durch Bindung der nicht-methylierten CpG-motive enthaltenden DNA an das CpGbP-181-Protein welches an Mikropartikeln immobilisiert wurde. Hierbei kommen alle Mikropartikel in Frage, die eine Immobilisierung des DNA-bindenden erfindungsgemäßen Proteins ermöglichen. Solche Mikropartikel können aus Latex, Kunststoff (z. B. Styropor, Polymer), Metall oder ferromagnetischen Stoffen bestehen. Weiterhin können auch fluoreszierende Mikropartikel, wie sie beispielsweise von der Firma Luminex angeboten werden, verwendet werden. Nachdem die nicht-methylierte CpG-motive enthaltende DNA an die an Mikropartikel immobilisierten erfindungsgemäßen Proteine gebunden wurde, werden die Mikropartikel mit geeigneten Methoden, wie beispielsweise Filtration, Zentrifugation, Fällung, Sortierung über Messung der Fluoreszensintensität oder magnetische Verfahren, von dem Stoffgemisch getrennt. Die nicht-methylierte CpG-motive enthaltende DNA steht nach Trennung von den Mikropartikeln zur weiteren Verarbeitung zur Verfügung.A further application of the method according to the invention consists in the separation and enrichment of DNA containing methylated DNA containing non-methylated CpG motifs by binding of the DNA containing non-methylated CpG motifs to the CpGbP-181 protein which has been immobilized on microparticles. In this case, all microparticles come into question, which allow immobilization of the DNA-binding protein of the invention. Such microparticles may consist of latex, plastic (eg polystyrene, polymer), metal or ferromagnetic substances. Furthermore, fluorescent microparticles, such as those offered by Luminex, can also be used. After the DNA containing unmethylated CpG motifs has been bound to the proteins immobilized on microparticles according to the invention, the microparticles are separated from the mixture of substances by suitable methods such as, for example, filtration, centrifugation, precipitation, sorting by measuring the fluorescence intensity or magnetic methods. The DNA containing non-methylated CpG motifs is available for further processing after separation from the microparticles.

Eine andere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Trennung und Anreicherung von nicht-methylierte CpG-motive enthaltender DNA durch Bindung der nichtmethylierte CpG-motive enthaltende DNA an das CpGbP-181-Protein, welches anschließend durch Elektrophorese von übrigen Bestandteilen des Gemisches getrennt wird.Another application of the method according to the invention consists in the separation and enrichment of non-methylated CpG motif-containing DNA by binding the DNA containing unmethylated CpG motifs to the CpGbP-181 protein, which is subsequently separated by electrophoresis from other components of the mixture.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Trennung und Anreicherung nicht-methylierte CpG-motive enthaltender DNA von methylierter DNA durch Bindung der nicht-methylierte CpG-motive enthaltende DNA an das CpGbP-181-Protein, wobei das CpGbP-181-Protein anschließend an entsprechende Antikörper gebunden wird. Die Antikörper können an feste oder flexible Substrate, z. B. Glas, Kunststoffe, Silizium, Mikropartikel, Membranen gebunden sein, oder sich in Lösung befinden. Nach Bindung der nicht-methylierte CpG-motive enthaltenden DNA an das CpGbP-181-Protein und dessen Bindung an den spezifischen Antikörper erfolgt die Trennung aus dem Stoffgemisch mit dem Fachmann bekannten Methoden.Another application of the method according to the invention consists in the separation and enrichment of DNA containing methylated DNA containing non-methylated CpG motifs by binding of the DNA containing non-methylated CpG motifs to the CpGbP-181 protein, the CpGbP-181 protein subsequently is bound to corresponding antibodies. The antibodies may be attached to solid or flexible substrates, e.g. As glass, plastics, silicon, microparticles, membranes, or are in solution. After binding of the non-methylated CpG motif-containing DNA to the CpGbP-181 protein and its binding to the specific antibody, the separation from the mixture is carried out by methods known to those skilled in the art.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Detektion nichtmethylierte CpG-Motive enthaltender DNA. Hierbei schließt sich nach der Anreicherung der nicht-methylierte CpG-Motive enthaltenden DNA ein Schritt zur Amplifikation dieser DNA an, wozu sich alle gängigen Amplifikationsmethoden eignen (PCR, LCR, LM-PCR etc.).Another application of the method according to the invention consists in the detection of DNA containing non-methylated CpG motifs. This is followed by the enrichment of DNA containing non-methylated CpG motifs a step to amplify this DNA, including all common amplification methods are suitable (PCR, LCR, LM-PCR, etc.).

Die Erfindung betrifft darüber hinaus einen Kit zur Trennung und/oder Anreicherung nichtmethylierte CpG-Motive enthaltender DNA mittels eines der vorstehend beschriebenen Verfahren, in dem zumindest das CpGbP-181-Protein gegebenenfalls zusammen mit weiteren geeigneten Reagenzien zur Verfahrensdurchführung enthalten sind.The invention further relates to a kit for the separation and / or enrichment of DNA containing non-methylated CpG motifs by means of one of the methods described above, in which at least the CpGbP-181 protein is optionally present together with other suitable reagents for carrying out the method.

Der Kit kann neben dem CpGbP-181-Protein mindestens ein Set von Primern, welche zur Amplifikation genomischer DNA bestimmter Prokaryonten unter Standardbedingungen geeignet sind, enthalten.The kit may contain, in addition to the CpGbP-181 protein, at least one set of primers suitable for amplifying genomic DNA of certain prokaryotes under standard conditions.

Das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere mit den vorstehend beschriebener Ausführungsformen hat den Vorteil, daß durch die Verwendung eines Spacers für die Kopplung des CpGbP-181-Proteins DNA an eine Matrix die Bindungskapazität wesentlich gesteigert wird. Dadurch gelingt eine erhöhte Konzentrierung von nicht-methylierte CpG-motive enthaltende DNA, wodurch wiederum die Nachweisempfindlichkeit für Verfahren zum Nachweis von nicht-methylierter DNA stark erhöht wird.The inventive method, in particular with the embodiments described above has the advantage that the binding capacity is substantially increased by the use of a spacer for coupling the CpGbP-181 protein DNA to a matrix. This results in an increased concentration of DNA containing unmethylated CpG motifs, which in turn greatly increases the detection sensitivity of non-methylated DNA detection methods.

Beispielexample

Das Beispiel zeigt die verbesserten Bindungseigenschaften des CpG-bP-181-Proteins, die aus der indirekten Bindung dieses Proteins über einen Spacer an eine Matrix resultieren.The example demonstrates the improved binding properties of the CpG-bP-181 protein resulting from the indirect binding of this protein via a spacer to a matrix.

Zur Untersuchung der Bindungseigenschaften wurde prokaryonter DNA aus DNA-Gemisch von Staphylococcus aureus und humaner DNA unter Verwendung des direkt gekoppeltem CpGbP-181-Proteins an CNBr-Sepharose bzw. unter Verwendung des indirekt über einen Diaminohexyl-Spacer (AH) gekoppeltem CpGbP-181-Proteins an Sepharose (im folgenden AH-Sepharose) angereichert.In order to investigate the binding properties, DNA from Staphylococcus aureus DNA and human DNA was mixed directly with CNBr-Sepharose using the directly coupled CpGbP-181 protein or CpGbP-181- indirectly coupled via a diaminohexyl spacer (AH). Protein on Sepharose (hereinafter AH-Sepharose) enriched.

Zunächst wurde die AH-Sepharose nach Zugabe von Glutaraldehyd 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na₂HPO₄ gewaschen.First, the AH-Sepharose was incubated for 15 minutes at room temperature after addition of glutaraldehyde. Subsequently, the AH Sepharose was washed with 0.1 molar Na ₂ HPO ₄ .

Jetzt wurden 0,24 mg des CpGbP-181-Proteins auf die Matrix gegeben. Die Bindung des CpGbP-181-Proteins an die AH-Sepharose wurde durch eine Inkubation einer 2 Stunden bei Raumtemperatur erreicht. Das überschüssige CpGbP-181-Protein wurde entfernt.Now, 0.24 mg of the CpGbP-181 protein was added to the matrix. The binding of the CpGbP-181 protein to the AH Sepharose was achieved by incubation for 2 hours at room temperature. The excess CpGbP-181 protein was removed.

Nach anschließendem Waschen der CpGbP-181–AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na₂HPO₄ und Zugabe von 0,1 molarem Glycin, wurde die CpGbP-181–AH-Sepharose zur Absättigung freier Bindungsstellen 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde wiederum die CpGbP-181-AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na₂HPO₄ gewaschen.After then washing the CpGbP-181-AH Sepharose with 0.1 M Na ₂ HPO ₄ and adding 0.1 M glycine, the CpGbP-181 AH Sepharose was incubated for 2 hours at room temperature to saturate free binding sites. Thereafter, again, the CpGbP-181-AH Sepharose was washed with 0.1 molar Na ₂ HPO ₄ .

Zur Reduktion der Schiff'schen Base und Stabilisierung der Bindung wurde die CpGbP-181-AH-Sepharose mit Natriumborhydrid versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die CpGbP-181–AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na₂HPO₄ gewaschen.To reduce the Schiff's base and stabilize the binding, the CpGbP-181-AH-Sepharose was mixed with sodium borohydride and incubated for 1 hour at room temperature. Thereafter, the CpGbP-181-AH Sepharose was washed with 0.1 molar Na ₂ HPO ₄ .

Die Lagerfähigkeit der CpGbP-181–AH-Sepharose bei 4°C wird durch Zugabe von 20% Ethanol erreicht. Danach wurde die CpGbP-181-AH-Sepharose in Säulen portioniert. Die mit der CpGbP-181-AH-Sepharose präparierten Säulen wurden anschließend mit TRIS-Puffer gewaschen und standen für die Trennung/Anreicherung von nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA zur Verfügung.

2) Anreicherung des DNA-Gemisches, anschließende Elution der prokaryonten DNA und Konzentrationsbestimmung der prokaryonten DNA durch PCR

The shelf life of CpGbP-181-AH Sepharose at 4 ° C is achieved by adding 20% ethanol. Thereafter, the CpGbP-181-AH Sepharose was portioned into columns. The columns prepared with CpGbP-181-AH Sepharose were then washed with TRIS buffer and were available for separation / enrichment of DNA containing unmethylated CpG motifs.

2) Enrichment of the DNA mixture, subsequent elution of the prokaryotic DNA and determination of the concentration of the prokaryotic DNA by PCR

Als DNA-Gemisch bestand jeweils aus 330 ng humaner DNA bzw. 150 ng prokaryonter DNA (Staphylococcus aureus DNA).The DNA mixture consisted of 330 ng of human DNA or 150 ng of prokaryotic DNA (Staphylococcus aureus DNA).

Die DNA-Gemische wurde auf die mit CNBr-Sepharose bzw. mit AH-Sepharose präparierten Säulen gegeben und 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Säulen zentrifugiert und mit 100 μl TRIS-Puffer (10 μM, pH 7) gewaschen. Der Wasch- und Zentrifugationsschritt wurde 5 mal wiederholt. The DNA mixtures were added to the columns prepared with CNBr-Sepharose or with AH-Sepharose and incubated for 1 minute at room temperature. Thereafter, the columns were centrifuged and washed with 100 μl TRIS buffer (10 μM, pH 7). The washing and centrifuging step was repeated 5 times.

Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und anschließend jeweils 100 μl Elutionspuffer (10 μM TRIS-Puffer, 0,5 M NaCl, pH 7) auf die Säulen gegeben und zentrifugiert. Der Elutionsschritt wurde 5 mal wiederholt.The supernatant was carefully removed and then each 100 .mu.l elution buffer (10 .mu.M TRIS buffer, 0.5 M NaCl, pH 7) was added to the columns and centrifuged. The elution step was repeated 5 times.

Jetzt wurden die einzelnen Fraktionen jeder Probe durch Zugabe von 10 μl 3 M Natriumacetat und 250 μl Ethanol mit anschließendem Mischen und Zentrifugieren (15 min bei 15000 g) gefällt. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und das Pellet mit 1 μl Ethanol (70%) gewaschen und 5 Minuten bei 15000 g zentrifugiert. Anschleißend wurde wieder der Überstand entfernt, das Pellet in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in 30 μl DEPC-Wasser aufgenommen.Now the individual fractions of each sample were precipitated by adding 10 μl of 3 M sodium acetate and 250 μl of ethanol followed by mixing and centrifuging (15 min at 15,000 g). The supernatant was poured off gently and the pellet washed with 1 μl of ethanol (70%) and centrifuged for 5 minutes at 15,000 g. The supernatant was again removed by wiping, the pellet was dried in a vacuum centrifuge and taken up in 30 μl of DEPC water.

Hiervon wurden jeweils 5 μl für den PCR-Nachweis verwendet. Für die PCR wurden Universalprimer für das 16s RNA Gen verwendet. Nach Durchführung der PCR wurden jeweils 15 μl der einzelnen Fraktionen auf ein 2%-iges Agarosegel gegeben.Of these, 5 μl each were used for PCR detection. Universal primers for the 16s RNA gene were used for the PCR. After carrying out the PCR, in each case 15 μl of the individual fractions were placed on a 2% agarose gel.

1 (direkte Bindung des CpG-181 Proteins an CNBr-Sepharose) und 2 (indirekte Bindung des CpG-181 Proteins über eine Spacer (AH) an Sepahrose) zeigen die Ergebnisse der PCR für die einzelnen Fraktionen. Es zeigt sich deutlich, dass durch die Verwendung des AH-Spacer mehr prokayronte DNA angereichert werden konnte (Fraktion 1, Elutionsfraktion). Diese charakteristische Verbesserung der Bindungseigenschaften ist für die erfindungsgemäßen Verfahren ausnutzbar. SEQUENZPROTOKOLL

1 (direct binding of CpG-181 protein to CNBr-Sepharose) and 2 (Indirect binding of the CpG-181 protein via a spacer (AH) to Sepahrose) show the results of the PCR for the individual fractions. It is clear that more prokayronte DNA could be enriched by using the AH spacer (fraction 1, elution fraction). This characteristic improvement in the binding properties can be exploited for the processes according to the invention. SEQUENCE LISTING

Claims

A method of increasing the binding capacity and efficiency of a protein that specifically binds non-methylated CPG-containing DNA and has a 25% to 35% homology to the wild-type CGPB gene. Having protein and is shortened compared to this, wherein the binding site for non-methylated CPG motifs is retained, wherein the binding of this protein is via a spacer to a matrix.

The method of claim 1, wherein the protein has the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 has.

Method according to one of claims 1 or 2, wherein a diaminohexane radical is used as a spacer.

A method according to any one of claims 1 to 3, wherein Sepharose is used as a matrix.

A process for the separation and / or enrichment of DNA containing non-methylated CPG motifs with a protein according to any one of claims 1 or 2, comprising the steps a) Coupling of the protein via a spacer to a matrix b) contacting at least one DNA containing non-methylated CPG motifs with the protein, thereby forming a protein-DNA complex, and c) Separation of the complex.

A method according to claim 5, wherein the separation is followed by a step of separating DNA containing non-methylated CPG motifs from protein from the complex.

Method according to one of the preceding claims, wherein the DNA containing non-methylated CPG motifs is prokaryotic DNA.

The method of claim 7, wherein the prokaryotic DNA is bacterial DNA.

A method according to any one of the preceding claims 1-6, wherein the DNA containing non-methylated CPG motifs is human genomic DNA.

Method according to one of the preceding claims, wherein a solid support is used as the matrix.

The method of claim 10, wherein the carrier is formed as a matrix, microparticles or membrane.

A method according to any one of claims 5 to 11, wherein the separation is by means of an antibody or antiserum directed against the protein.

The method of claim 12, wherein the separation is by electrophoresis.

A method according to any one of claims 5 to 13, wherein the solution contains a mixture of eukaryotic and prokaryotic DNA.

A method according to claim 14, wherein the solution is a body fluid or derived therefrom, in particular whole blood, serum, plasma, whole blood cell preparations, urine, cerebrospinal fluid, pleural, pericardial, peritoneal, synovial and bronchoalveolar lavage.

A method according to any one of claims 5 to 13, wherein the solution contains a mixture of unmethylated human genomic DNA and methylated human genomic DNA.

A method according to any one of claims 12-18, wherein the separation is achieved by means of a filter which filters out corresponding DNA-protein complexes.

The method of claim 17, wherein the protein is immobilized on a filter matrix.

Method according to one of claims 5 to 18, wherein further after step c) as step d) the DNA containing non-methylated CPG motifs is amplified.

A method according to claim 19, comprising the steps of: a) isolation of the DNA from the protein-DNA complex containing non-methylated CPG motifs, b) denaturation of the double-stranded DNA, c) hybridization of the single strands of the DNA with complementary primers, d) generation of Double-stranded fragments via reaction with polymerases and e) repetition of these steps up to the desired degree of amplification.

The method of claim 19, comprising the steps of: a) cloning of the isolated non-methylated CPG motifs containing DNA sequences in vectors, b) transformation of suitable host cells with these vectors, c) cultivating these transformed cells, d) isolation of the vectors from these cells and e) isolation of the DNA.

Kit for separating and / or enriching non-methylated CPG-containing DNA by means of a method according to one of claims 5 to 21.

Test kit for the detection of non-methylated CPG motif-containing DNA by a method according to any one of claims 5 to 21 with one or more sets of specific primers.

Kit according to one of claims 22 and 23, wherein the protein according to SEQ ID no. 1 is included.

The kit according to claim 24, wherein the protein coupled via a spacer to a matrix according to SEQ ID no. 1 is included.

Method for separating and enriching non-methylated genomic DNA from a mixture of unmethylated genomic and methylated genomic DNA, comprising the steps of: a. Contacting a non-methylated genomic DNA in solution with a specific prokaryotic DNA binding protein having 25% to 35% homology to the wild-type CGPB protein, thereby forming a protein-DNA complex, and b. Separation of the complex.

Method according to claim 26 for the diagnosis of diseases which have a specific methylation pattern, especially cancers.