WO2002000929A1

WO2002000929A1 - Procede de diagnostic in vitro du cancer de la prostate et kit de mise en oeuvre

Info

Publication number: WO2002000929A1
Application number: PCT/FR2001/001566
Authority: WO
Inventors: Olivier Cussenot; Alain Latil; Karine Chantrel-Groussard
Original assignee: Urogene
Priority date: 2000-06-27
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2002-01-03
Also published as: AU2001263992A1; EP1294941A1; FR2810677A1; FR2810677B1; EP1294941B1; DE60108245D1; ATE286541T1

Abstract

L'invention a trait à un nouveau procédé de diagnostic in vitro et/ou de pronostic du cancer de la prostate à partir d'un échantillon de cellules d'origine prostatique récoltées de manière non invasive dans les urines ou de manière peu invasive via une aiguille à biopsie. Le procédé comprend la recherche d'altérations chromosomiques détectées par des pertes d'allèles, à partir des ADN extraits de cellules d'origine prostatique, sur au moins une région chromosomique. Elle porte aussi sur un kit permettant une mise en oeuvre du procédé, et l'utilisation d'un tel kit pour nourrir une base de données rassemblant les données phénotypiques et génotypiques de patients, et guider un traitement anticancéreux.

Description

PROCEDE DE DIAGNOSTIC M VITRO DU CANCER DE LA PROSTATE ET KIT DE MISE EN ŒUVRE

La présente invention a trait à des procédés de diagnostic in vitro et/ou de pronostic du cancer de la prostate à partir d'un échantillon de cellules, contenues dans les sécrétions, d'origine prostatique récoltées de manière non invasive dans les urines après le massage de la prostate ou de manière peu invasive via une aiguille à biopsie, ou cytoponction. Elle porte aussi sur un kit de diagnostic permettant une mise en oeuvre simple du procédé.

Le cancer de la prostate est l'un des cancers les plus répandus chez l'homme dans les pays industrialisés et son incidence augmente de manière importante ces dernières années. L'étiologie du cancer de la prostate est complexe et englobe à la fois des facteurs génétiques (prédisposition familiale, origine ethnique) et exogènes (carcinogènes) variables avec l'environnement socio-économique, les habitudes alimentaires, la situation géographique et la pollution.

Le diagnostic précoce de cette maladie, qui est la première cause de mortalité par cancer chez l'homme de plus de 50 ans, est actuellement le seul moyen de pouvoir proposer un traitement capable d'obtenir une guérison.

Le pronostic dépend du stade de la maladie au moment du diagnostic : en effet, seul un cancer de la prostate localisé peut être traité de manière efficace par prostatectomie ou radiothérapie. Cependant, une grande proportion de patients est à un stade avancé de la maladie au moment du diagnostic : environ 28% des patients ont une extension extra prostatique et 25% ont des métastases (majoritairement ganglionnaires et osseuses).

Le cancer de la prostate à un stade précoce, donc curable ne donne pas de symptôme et ne peut être suspecté que par des méthodes de dépistage dont la plus utilisée actuellement est le dosage du PSA (prostate spécifie antigen) sanguin. La suspicion de cancer par une méthode de dépistage nécessite une confirmation anatomo-pathologique sur des prélèvements de tissu obtenus par biopsies de la prostate. Le PSA est une protéase de la famille des kallicréines, sécrété à l'état physiologique par les cellules épithéliales luminales (cellules épithéliales différentiée et androgenodépendantes) des glandes prostatiques. Le taux de PSA dans le sang peut s'élever au cours de différentes pathologies de la prostate (infections ou inflammations prostatiques (prostatites), traumatismes de la prostate, cancers de la prostates développées au dépend des cellules épithéliales (adénocarcinomes prostatiques) de la prostate, hyperplasie bénigne de la prostate) et servir de marqueurs pour ses pathologies. Le fait que le PSA ne soit pas un marqueur spécifique des adénocarcinomes prostatiques fait qu'il a une faible valeur prédictive de biopsies positives dans le diagnostique précoce des cancers de la prostate (moins de 20% de VPP pour des valeurs du taux de PSA < à 4ng/ml, ; moins de 40% pour PSA <10ng/ml). La valeur seuil habituellement reconnue pour indiquer des biopsies prostatiques (suspicion de cancer) est 4ng/ml ( l'utilisation de ce seuil revient à faire des biopsies de la prostate chez environ 10% des hommes de plus de 50 ans). Cependant, avec ce seuil, 40% des hommes supposés présenter une tumeur localisée auront déjà développé une tumeur extraprostatique (1) et 20% des cancers sont méconnus. L'abaissement du seuil à 2ng/ml permet de diagnostiquer plus de cancer et plus de cancers curables car encore limités à la prostate, cependant et en raison de la mauvaise spécificité du PSA cela revient à faire près des biopsies prostatiques à près de 30% des hommes de plus de 50 ans.

La méthode de confirmation diagnostique classiquement consiste en la réalisation de biopsies (entre 6 à 10) de la prostate réalisée par voie transrectale , parfois par voie périnéale), les biopsies sont dirigées sur la prostate sous le contrôle d'une échographique endorectale ou du toucher digital. Les biopsies sont pratiquée après un dosage sanguin de l'antigène prostatique spécifique (PSA : Prostate Spécifie Antigen) dans le sang. De plus, les biopsies prostatiques sont invasives et douloureuses (nécessitent parfois une anesthésie générale) pour le patient et susceptible d'engendrer des complications infections et saignements dans prés de 10% des cas. Le risque de méconnaître un cancer de la prostate par les biopsies n'est pas négligeable prés de entre 20 et 30%,. En effet dans la majorité des cas le cancer n'est pas palpable, ni visualisable par imagerie au sein de la glande prostatique, si bien que les biopsies sont faites au hasard dans la prostate. Le risque de méconnaître un cancer par biopsies sera d'autant plus grand que la prostate est volumineuse (petit volume de cancer dans un important volume prostatique). Ces limites à la sensibilité des biopsies prostatiques font souvent répéter les biopsies. Pour accroître la valeur prédictive du PSA et éviter de pratiquer beaucoup de biopsies inutiles, plusieurs modalités pour pondérer le taux de PSA ont été proposés (PSA rapporté à l'âge, PSA rapporté au volume de la prostate (Densité du PSA), Cinétique du PSA dans le temps). Ces méthodes de pondérations sont cependant inférieures en terme de valeurs prédictives de biopsie positive à l'utilisation du rapport des formes libres et complexées du PSA dans le sang. En effet le PSA dit total dosé dans le sang est sous un forme libre et sous une formes complexés à des protéines telles que l'alphachymotrypsine. Plusieurs méthodes diagnostiques basées sur la reconnaissances d'épitopes du PSA masqués ou non par les protéines qui le complexent, permettent de réalisée soit un dosage du PSAtotal, soit du PSA libre, soit du PSA complexé. Pour des raisons encore inconnues, il s'avère que dans le cancer de la prostate, par rapport aux autres pathologies prostatiques (comme l'hypertrophie bénigne), le rapport entre le PSA libre et le PSA total s'abaisse (d'autres ratio utilisant le taux de PSA total, ou complexé ou libre peuvent également être utilisé, il ont la même signification). L'utilisation du ratio PSA libre/total a permis d'apporter une légère amélioration de la spécificité dans le diagnostic précoce du cancer de la prostate (2). Cependant les seuils proposés pour indiquer les biopsies prostatiques ne sont pas formellement définis. Un taux <15% est très fortement évocateur de cancer, un taux entre 15 et 25% suspect et rassurant s'il est > à 25%.

A coté du PSA d'autres marqueurs circulants (comme les nuclear Matrix protein NMP) sont en cours d'évaluation pour le diagnostic du cancer de la prostate. Par ailleurs, il a été proposé une méthode non-invasive de détection moléculaire de marqueurs (télomérase, GSTP1) spécifiques des cellules cancéreuses et/ou saines de la prostate à partir de cellules récoltées dans des éjaculas ou après lavage des urètres chez des patients. Cependant, les résultats obtenus dans cette étude ne permettent pas de discriminer les cellules tumorales des cellules normales (3). Par conséquent, il existe toujours un réel besoin d'apporter de nouveaux procédés de détection précoce du cancer de la prostate qui améliorent la sensibiUté, la spécificité et la prédictibilité et qui utilisent de préférence des moyens non-invasifs.

L'accumulation d'altérations génétiques caractérise la transformation d'une cellule normale vers la cellule cancéreuse chez l'homme. En particulier, une cellule deviendrait cancéreuse par l'activation d'oncogènes et l'inactivation fonctionnelle de gènes suppresseurs de tumeurs. Selon le type histopathologique de cancers, les régions chromosomiques affectées par des délétions et ce de façon récurrente sont plus ou moins caractéristique. Ceci a déjà été utihsé, a des fins diagnostic, pour détecter des cellules tumorales de cancers de la vessie, du colon ou du poumon dans des fluides biologiques. Ces altérations chromosomiques sont détectées par la mise en évidence soit d'un déséquilibre allélique ou perte d'hétérozygotie (Loss of heterozygosity, LOH) soit d'une délétion homozygote, ces deux phénomènes étant regroupés dans la suite de la description et dans les revendications sous l'expression générale "perte d'allèles". Des pertes d'allèles associées à des tumeurs du cancer de la prostate ont été détectées de façon récurrente sur les bras chromosomiques 6p, 6q, 7q, 8p, 9p, lOq, 12p, 13q, 16q, 17q,18q et Yq. L'essentiel des études sur les pertes d'allèles (hétérozygotes ou homozygotes) a porté sur la recherche de la localisation chromosomique précise de ces altérations en vue de l'éventuelle identification de gènes suppresseurs de tumeurs. Ces études ont aussi permis de caractériser la fréquence de détection de ces anomalies dans des tumeurs du cancer de la prostate.

L'invention résulte de la recherche d'altérations chromosomiques par la détection de LOH ou de délétion homozygote parmi plusieurs régions caractérisées (hot spot) à partir de cellules cancéreuses d'origine prostatique obtenues de manière non invasive ou peu invasive. Les résultats obtenus montrent que cette recherche peut être utilisée de façon avantageuse comme moyen de diagnostic du cancer de la prostate chez des patients à risque. En pratique, cette recherche est conduite postérieurement à la détection dans le sang d'un taux de PSA élevé et d'un ratio PSA libre/total anormal, le diagnostic ou pronostic obtenu par le procédé de l'invention étant ensuite, en cas de positivité, confirmé par le biais d'une biopsie. En particuher, il a pu être montré que la détection de pertes d'allèles parmi au moins une région chromosomique choisie dans le groupe comprenant les régions 6p21-31, 6q21, 6q25.3, 7q31, 8p22, 9p21, 10q23-25, 12pl3, 13ql4, 16q24.3, 16q23.2, 17q21.2, 18q21 et Yqll-12, sur un échantillon de cellules d'origine prostatique, en association avec la caractérisation desdites cellules par l'analyse de plusieurs marqueurs spécifiques de cellules de la prostate, permet d'augmenter simultanément la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives du diagnostic du cancer de la prostate. En conséquence, le procédé de diagnostic objet de la présente invention permet, en cas de résultat négatif, de ne pas effectuer de biopsie, laquelle était indispensable avec les diagnostics connus de l'état de la technique.

Ainsi, l'invention porte sur un procédé de diagnostic in vitro et/ou de pronostic du cancer de la prostate à partir d'un échantillon de cellules d'origine prostatique isolées d'un patient comprenant les étapes suivantes : a) extraction séparée ou simultanée des ADN et ARN totaux des cellules récoltées ; b) analyse de la qualité des cellules récoltées, soit par l'analyse de marqueurs spécifiques des cellules prostatiques à partir des ARN extraits en a), soit par dosage direct d'antigènes spécifiques des cellules prostatiques dans l'urine présente dans l'échantillon ; c) recherche d'altérations chromosomiques détectées par perte d'allèles à partir des ADN extraits en a). En d'autres termes, l'invention consiste à analyser dans une première étape la qualité du prélèvement, c'est à dire sa richesse en cellules d'origine prostatique de sorte à permettre d'effectuer, dans une seconde étape, une recherche d'altérations chromosomiques dont les résultats soient significatifs et spécifiques des cellules cancéreuses d'origine prostatique. Le procédé est conduit sur des cellules d'origine prostatiques, c'est-à-dire tant sur des cellules prostatiques que sur des cellules métastasées, en particulier sur des cellules cancéreuses d'origine prostatique ayant envahi les ganglions lymphatiques et les os et ce, de manière à permettre de vérifier une éventuelles proliférations des cellules cancéreuses d'origine prostatiques vers d'autres organes.

La récolte des cellules d'origine prostatique peut être réalisée de manière peu invasive à l'aide d'une aiguille à biopsie. Dans une forme préférée de mise en oeuvre du procédé, les cellules sont récoltées dans les urines après massage de la prostate par voie rectale, de sorte que l'échantillon de cellules prostatiques récupéré résulte, au sens de l'invention, d'un mélange de cellules prostatiques et d'urine. Le massage permet en outre d'augmenter le nombre de cellules d'origine prostatique présentes dans les urines. Cette méthode a l'avantage d'être non invasive et convient particulièrement à la répétition dans le temps du diagnostic. Il est donc possible, pour procéder à l'analyse ultérieure de la qualité du prélèvement, de travailler soit sur F ARN des cellules d'origine prostatiques soit directement sur l'urine. Ainsi et selon une première caractéristique du procédé, l'extraction des ADN et ARN des cellules prostatiques peut être effectué après centrifugation de l'échantillon et récupération du culot cellulaire ou un autre procédé de tri cellulaire permettant de récupérer spécifiquement les cellules d'origine prostatique. La collecte des cellules d'origine prostatique lorsqu'il s'agit de cellules métastasées est réalisée par prélèvement sanguin ou prélèvement des ganglions lymphatiques lors d'une prostatectomie radicale.

Une double-extraction ADN et ARN est ensuite réalisée de préférence simultanément à partir des échantillons cellulaires récoltés et triés le cas échéant. Des protocoles de double-extraction sont décrits dans l'état de la technique et sont par exemple décrits par Chomczynski & Sacchi (14). L'objectif est de permettre l'extraction simultanée des ARN et des ADN à partir d'un même échantillon cellulaire.

Un des avantages du procédé de l'invention est de fournir comme déjà dit, une étape d'analyse tant qualitative que quantitative des cellules présentes dans l'échantillon. En effet, selon une première forme de réalisation du procédé de l'invention, différents marqueurs spécifiques des cellules d'origine prostatique sont détectés à partir des ARN extraits. On entend par « marqueur spécifique des cellules d'origine prostatique», toute molécule ou macromolécule présente en quantité, structure ou conformation inhabituelle dans ou à la surface des cellules d'origine prostatique par rapport aux cellules non prostatiques. Dans le procédé de l'invention, une association de marqueurs est utilisée de manière à caractériser l'origine des cellules et certains types cellulaires et leur niveau de différenciation (cellules endothéliales, cellule épithéliales, cellules stromales et cellules basales épithéliales). La caractérisation des cellules par l'utilisation d'une association de marqueurs permet également d'augmenter la sensibilité du diagnostic compte tenu de la possibilité de perte de certains marqueurs prostatiques dans les tumeurs évoluées. Des marqueurs préférés sont les marqueurs PSA (prostate spécifie antigen), PSMA (prostate spécifie membrane antigen), PAP (prostate acid phosphatase), la cytokératine 5 (KRT5), la cytokératine 18, (KRT18), la vimentine et le marqueur CD34. Le type ou l'état cellulaire est ainsi déterminé par la détection et/ou la quantification des différents marqueurs utilisés. La détection comprend généralement une étape de transcription inverse des ARNm en ADNc puis une étape d'amplification quantitative permettant de quantifier les marqueurs spécifiques dans chaque échantillon d'ADNc amplifié.

Toute technique permettant l'amplification spécifique d'un acide nucléique donné peut être utilisée dans le procédé de l'invention. Citons à titre d'exemple la méthode d'amplification PCR (Polymerase Chain Reaction) ou les méthodes d'amplification isotherme telles que la TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid séquence based amplification), la 3SR (self sustained séquence réplication) ou l'amplification par déplacement de brin (strand displacement amplification). De manière préférée, des amorces choisies pour l'amphtication des marqueurs spécifiques PSA, PSMA, PAP, KRT5, KRT18, vimentine et CD34 sont définies par les séquences nucléotidiques présentées dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 Exemples de séquences nucléotidiques d'amorces pouvant être utiUsées pour l'amplification des marqueurs cellulaires

Différentes méthodes de quantification des acides nucléiques sont proposées dans l'état de la technique. Parmi les techniques possibles, on peut citer la quantification par électrophorèse en gel d'agarose, mesure de la densité optique (DO), slot blot, ou Northern blot. Des méthodes de quantification préférées pour la quantification des produits amplifiés sont celles utilisant des intercalants fluorescents tel que le système SYBrGreen commercialisé par Roche ou des couples de groupements fluorophores/quenchers telles que le système TaqMan™ commercialisé par ABI^®, le système AmpliSensor™ commerciaUsé par InGen ou encore le système Sunrise™ commercialisé par Oncore et Appligène^®. Afin de pouvoir estimer la quantité relative de chaque transcrit amplifié et de tenir compte de la variabilité de la quantité d'ARN total extrait, un contrôle interne est utilisé. Le contrôle interne est un transcrit choisi pour son absence de rétro-pseudogènes contrairement aux contrôles classiquement utiUsés tels que la GAPDH ou la β-actine. Un tel contrôle interne peut être par exemple le transcrit du gène RPLPO codant pour une protéine ribosomale. L'expression relative (normalisée par rapport au contrôle interne) d'un marqueur donné, dans un échantillon, est également normalisée par rapport à l'échantillon présentant le plus faible taux d'expression : le caUbrateur. Ceci permet ainsi de définir le niveau d'expression relatif de chaque marqueur par rapport au contrôle interne choisi et au caUbrateur. Le calcul de la valeur est résumé comme suit:

Marqueur ^échant»^lon/ Contrôle interne ^échantillon Marqueur ^{cali rateu}7contrôle interne ^calibrateur Plus généralement, toute calibration permettant une évaluation quantitative des transcrits, notamment celles qui éliminent les biais introduits lors des amplifications de transcrits de tailles différentes, peut être valablement utilisée dans cette étape du procédé de l'invention.

Dans une seconde forme de réalisation du procédé de l'invention, l'étape d'analyse de la qualité de l'échantillon est effectuée par dosage des antigènes spécifiques des cellules prostatiques directement dans l'urine contenue dans l'échantillon de cellules d'origine prostatiques. On peut ainsi doser directement au moins une protéine choisie dans le groupe comprenant PSA, PSMA, PAP, prostase, par toute technique connue de l'homme du métier en particulier, Western blot, immunofluorescence, technique ELISA, et micropuces à protéines.

Après la caractérisation de l'échantillon de cellules à partir des ARN totaux extraits conformément aux étapes a) et b) du procédé ou dosage d'antigènes dans l'urine, l'ADN de chaque échantillon présentant un taux suffisant de cellules d'origine prostatique est analysé pour la recherche d'altérations chromosomiques détectées par une perte d'allèles sur au moins une région chromosomique fréquemment associée au cancer de la prostate.

Tout type de marqueurs de polymorphisme peut être utiUsé dans le procédé de l'invention pour permettre une détection des pertes d'allèles. On peut citer en plus des marqueurs microsatelUtes, par exemple les marqueurs de polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP) ou encore les marqueurs SNP (Single Nucleotide Polymorphism).

De manière préférée, la détection d'altérations chromosomiques est réalisée par l'analyse de marqueurs microsatelUtes de polymorphisme localisés au niveau des régions altérées. Un mode de réalisation de l'invention consiste à ampUfier la région porteuse des marqueurs de polymorphisme et à quantifier les produits amplifiés issus des deux allèles.

Les marqueurs sont alors choisis de manière à être facilement ampUfiables pour leur quantification.

La méthode d'ampUfication est choisie et optimisée de sorte que les produits générés soient représentatifs en quantité et en qualité de la matrice d'ampUfication. Une ampUfication de l'ADN extrait des cellules d'origine prostatique est réaUsée en parallèle d'une amplification de l'ADN constitutionnel extrait de cellules normales prélevées sur le même patient et représentant les allèles non délétés. Une co-amplification avec des marqueurs situés dans des régions non altérées permet également de constituer un standard interne afin de valider les pertes d'allèles observées dans les régions d'intérêts. Seuls sont pris en compte pour le diagnostic les échantillons d'acides nucléiques dits « informatifs », c'est à dire, les échantillons pour lesquels les marqueurs présentent deux allèles différents pour une région donnée. De manière préférée, afin d'augmenter le nombre d'échantillons informatifs, au moins deux marqueurs par région analysée sont choisis.

Dans le procédé de l'invention, une perte d'hétérozygotie est détectée lorsque l'intensité relative des deux allèles est significativement différente de l'intensité relative des deux allèles issus de l'analyse d'un échantillon d'ADN contrôle extrait par exemple de lymphocytes prélevés du sang du patient et traités en parallèle.

De manière préférée, une perte d'hétérozygotie est détectée lorsque le rapport entre les intensités relatives des deux allèles de l'ADN de cellules prostatiques tumorales et l'intensité relative des deux allèles des lymphocytes est en dehors de la fourchette 0.76-1.3. Les intensités de détection des deux allèles peuvent être mesurées selon les techniques classiques ou automatisée de quantification des acides nucléiques de type slot blot, ou électrophorèse en gel de polyacrylamide de produits radiomarqués, technologies de quantification de type TaqMan^® ou avantageusement aujourd'hui par des biopuces à ADN ou des microarrays (1 5). Le principe de ces techniques repose sur l'hybridation d'un ou plusieurs acides nucléiques cibles avec un ou plusieurs acides nucléiques « sondes » spécifiques marqués, la quantité de « sondes » hybridées étant théoriquement proportionnelle à la quantité de «cibles» présentes sur le support d'hybridation. La quantification des allèles peut aussi être réalisée par les techniques d'ampUfication et de marquage à l'aide d'amorces portant un fluorophore puis séparation sur gel sur séquenceur tel que celui commerciaUsé par Perkin Elmer modèle 377, et quantification à l'aide par exemple du logiciel d'analyse Genescan© 672 Fragment Analysis (Applied Biosystem) qui calcule la taille et la surface des pics.

Les régions chromosomiques analysées pour la recherche d'altérations chromosomiques sont choisies parmi les régions où une perte d'allèles est fréquemment détectée sur des cellules tumorales prostatiques et pour lesquelles aucune interférence ou hybridation croisée ne peut être attendue ni observée lors des étapes d'amplification ou d'hybridation (étapes b) et c) du procédé. L'analyse d'au moins une région chromosomique choisie dans le groupe comprenant les régions 6p21-31, 6q21, 6q25.3, 7q31, 8p22, 9p21, 10q23-25, 12pl3, 13ql4, 16q23.2, 16q24.3, 17q21.2, 18q21, et Yqll-12 permet selon le procédé, un diagnostic dont la sensibiUté, la spécificité et la prédictibilité sont améliorées par rapport aux diagnostics actuellement en routine, qui présentent l'inconvénient d'être traumatiques.

Avantageusement, les pertes d'allèles sont recherchées sur les 3 régions chromosomiques suivantes : 7q31, 8p22, 13ql4 ; alternativement sur les 4 régions chromosomiques suivantes : 7q31, 8p22, 13ql4, 16q23.2 , de préférence sur les 6 régions chromosomiques suivantes : 7q31, 8p22, 12pl3, 13ql4, 16q23.2, et 18q21 ; plus le nombre de régions étant important et plus les résultats étant significatifs.

Dans le procédé de l'invention, une délétion homozygote est détectée par la quantification du nombre d'allèles présents par des techmques de mesure telles que le système TaqMan en utilisant comme marqueur, en particulier le marqueur D12S89 localisé entre D12S77 et D12S358.

Les régions chromosomiques analysées pour la recherche d'altérations chromosomiques au niveau des cellules tumorales d'origine prostatique sont choisies parmi les régions où des délétions d'allèles sont fréquemment détectées.

Dans un mode de réalisation du procédé, des amorces sont choisies de manière à réaliser des amplifications PCR multiplex. On entend par PCR multiplex, l'amptification de plusieurs séquences cibles (deux au moins) dans un même tube d'ampUfication. Des amorces spécialement adaptées pour l'amplification des marqueurs microsatellites situés aux régions 6p21-31, 6q21, 6q25.3, 7q31, 8p22, 9p21, 10q23-25, 12pl3, 13ql4, 16q23.2, 16q24.3, 17q21.2 et 18q21 sont celles dont la séquence nucléotidique est définie dans Dib et al (17) et Tomforhrde et al (19). Les marqueurs utilisés pour les régions Yql l-12 sont donnés par des gènes référencés par Perinchery et al. (18). Les marqueurs utilisés pour chaque région chromosomique sont reproduits dans le tableau ci-après :

Dans une forme de réalisation avantageuse du procédé de l'invention, on fait suivre l'étape de recherche d'altération chromosomique, d'une étape de détection puis de quantification du marqueur de la neuropiline (NRPl) dans l'échantillon, dont on sait qu'il est fréquemment surexprimé dans les cellules cancéreuses d'origine prostatiques.

Les techniques de détection et d'amplification quantitatives sont identiques à celles mises en œuvre pour les marqueurs PSA, PSMA, PAP, prostase lors de l'étude qualitative du prélèvement de cellules d'origine prostatique.

En Ueu et place de la neuropiline, on peut également détecter toute protéine impliquée dans la voie de l'angiogénèse ou de l'apoptose dans l'échantillon.

De manière préférée, des amorces choisies pour l'amplification des marqueurs spécifiques de la neuropiline sont choisies parmi les séquences de nucléotides suivantes : 5' -AGT GTC TTG CAG AGC AGT GTC TCA- 3' et 5'-TGG TGC TAT ACT GGG AAG AAG CTG T- 3'.

Le procédé de l'invention permet ainsi d'obtenir en particulier une caractérisation des cellules analysées, la quantité relative de PSA (normaUsée avec un contrôle interne), le rapport PSA libre/total, l'analyse de la présence d'altérations chromosomiques sur au moins une région chromosomique et enfin, éventuellement la quantité de neuropiline dans l'échantillon. Les résultats obtenus dans la partie expérimentale présentant des exemples de mise en oeuvre du procédé montrent de manière surprenante que la détection d'au moins une perte d'allèle sur trois, quatre et six régions chromosomiques analysées permet d'améUorer la qualité du diagnostic du cancer de la prostate de manière significative en comparaison avec le diagnostic classiquement utilisé, consistant en l'analyse du ratio PSA libre/total considéré comme significatif d'un mauvais pronostic lorsque celui-ci est inférieur à 25%. Plus particulièrement, il est montré qu'un test de diagnostic consistant en la détection d'au moins une perte d'allèles parmi les quatre régions analysées suivantes : 7q31, 8p22, 13ql4 et 16q23.2 permet d'augmenter les valeurs de sensibiUté, de spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives de respectivement 8, 15, 20 et 17 points par rapport aux valeurs obtenues avec la détection du ratio PSA libre/total. Par conséquent, la mise en oeuvre du procédé selon l'invention fournit un nouveau test in vitro et non ou peu invasif qui contribue avec l'analyse du ratio PSA Ubre/total à améliorer le diagnostic du cancer de la prostate et fournit un pronostic en vue de la décision d'une intervention ultérieure, telle que la réalisation d'une biopsie de la prostate.

De plus, la mise en oeuvre du procédé chez un nombre élevé de patients ainsi que le suivi clinique de la réponse aux traitements thérapeutiques ultérieurs réalisés pour les patients atteints d'un cancer permet la constitution d'une base de données associant les caractéristiques phénotypiques des cellules tumorales (obtenues à l'étape b) du procédé, les caractéristiques génotypiques des cellules tumorales (obtenues à l'étape c) du procédé et les données cliniques portant sur la réponse aux traitements thérapeutiques ultérieurs.

Un médecin peut alors par consultation d'une base de données, affiner le diagnostic et le pronostic réalisés sur l'un de ses patients. Cela lui permet ainsi de proposer un traitement thérapeutique en fonction des caractéristiques phénotypiques et génotypiques des cellules tumorales de son patient, et du tableau clinique de ce dernier. L'itération du procédé et l'enregistrement des données acquises sur chacun des patients permet d'enrichir au cours du temps la base de données et ainsi augmenter la fiabiUté du diagnostic et/ou du pronostic étabU par le médecin, et par là même, la pertinence du traitement proposé.

Par conséquent, l'invention fournit un procédé pour identifier le traitement thérapeutique optimal d'un patient atteint d'un cancer de la prostate comprenant les opérations suivantes :

1) RéaUsation d'une base de données constituée des données acquises par la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon l'invention chez un nombre élevé de patients et les données acquises par le suivi cUnique des mêmes patients 2) La mise en oeuvre du procédé de diagnostic et/ou de pronostic selon l'invention sur le patient à traiter, comprenant les étapes suivantes a) extraction séparée ou simultanée des ADN et ARN totaux des cellules récoltées ; b) analyse de la qualité des cellules récoltées, soit par l'analyse de marqueurs spécifiques des cellules d'origine prostatiques à partir des ARN extraits en a), soit par dosage direct d'antigènes spécifiques des cellules prostatiques dans l'urine présente dans F échantillon ; c) recherche d'altérations chromosomiques détectées par des perte d'allèles à partir des ADN extraits en a) ; d) éventuellement détection puis quantification du marqueur de la neuropiline (NRPl)

3) La comparaison des données acquises sur le patient à l'étape 2) avec les données présentes dans la base de données réalisée à l'étape 1), et le choix du traitement thérapeutique optimal pour le patient à traiter.

Dans un mode de réalisation préféré, les cellules sont récoltées dans les urines des patients. Dans un autre mode de réalisation préféré, les ADN et ARN sont extraits simultanément à partir des cellules récoltées.

L'invention porte également sur l'utiUsation d'une base de données constituée des données phénotypiques et génotypiques de patients atteints de cancer de la prostate ainsi que de leurs tableaux cliniques et de leur évolution en fonction des traitements. Cette utiUsation permet d'inclure un patient donné dans une catégorie clinique, l'identifier dans cette base de données et proposer un traitement thérapeutique optimal déterminé en fonction de la catégorie clinique de laquelle ledit patient se rapproche le plus.

Un autre objet de l'invention est un kit pour le diagnostic ou/et le pronostic in vitro du cancer de la prostate mettant en oeuvre les procédés décrits précédemment. Un tel kit comprend au moins un de chacun des éléments suivants :

- des amorces spécifiques permettant l'ampUScation des ARN correspondant aux marqueurs spécifiques des cellules d'origine prostatiques et/ou un réactif de dosage des antigènes spécifiques des cellules prostatiques;

- des amorces spécifiques permettant l'ampUfication spécifique de séquences porteuses des marqueurs de polymorphisme , - les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification, de marquage et d'hybridation

- le cas échéant, les cibles pour l'hybridation spécifique des produits amplifiés et leur quantification, lesdites cibles pouvant être fixées sur un support-

Selon une forme préférée de réalisation de l'invention, le kit contient des amorces choisies pour l'amplification spécifique des séquences porteuses des marqueurs de polymorphismes situées au niveau des régions 6p21-31, 6q21, 6q25.3, 7q31, 8p22, 9p21, 10q23-25, 12pl3, 13ql4, 16q24.3, 16q23.2, 17q21.2, 18q21 et Yqll-12 lesquelles présentent des LOH ou des délétions homozygotes. Des marqueurs de polymorphismes peuvent être par exemple des marqueurs microsatellites, des marqueurs SNP ou RFLP. Des exemples d'amorces spécialement adaptées pour l'ampUfication de marqueurs microsatellites situés au niveau de l'ensemble de ces régions sont celles dont la séquence nucléotidique est définie dans Dib et al (17), Tomforhrde et al (19), et Perinchery et al. (18).

Dans une forme de réalisation avantageuse, le kit contient des amorces permettant l'amplification spécifique des séquences porteuses des marqueurs de polymorphismes situées au niveau des trois régions 7q31, 8p22 et 13ql4.

Selon une autre forme de réalisation, le kit contient des amorces permettant l'amplification spécifique des séquences porteuses des marqueurs de polymorphismes situées au niveau des quatre régions 7q31, 8p22, 13ql4 et 16q23.2.

De préférence, le kit contient des amorces permettant l'amplification spécifique des séquences porteuses des marqueurs de polymorphismes situées au niveau des six régions 7q31, 8p22, 12pl3, 13ql4, 16q23.2, et 18q21.

Des amorces préférées pour l'amplification des ARN correspondant aux marqueurs spécifiques des cellules prostatiques et cancéreuses sont celles permettant l'ampUfication des gènes PSA, PSMA, PAP, KRT 18, la vimentine, KRT 5 et CD34. Par exemple, de telles amorces sont celles dont la séquence nucléotidique est définie dans le tableau 1 ci-dessus.

Le kit contient en outre un réactif permettant de doser au moins un antigène spécifique présent dans l'urine contenue dans l'échantillon choisi parmi PSA, PSMA, PAP ou prostase. La technique utilisée est en pratique la technique ELIS A ou toute technique équivalente comme le western blot, rimmunofluorescence, ou les puces à protéines.

De manière optionnelle, les cibles pour l'hybridation spécifique des produits amplifiés sont comprises dans le kit, lesdites cibles pouvant être fixées sur un support. L'hybridation entre les produits d'amplification et les cibles spécifiques des régions chromosomiques étudiées peut être réalisée dans des conditions classiques, telles que celles décrites par Sambrook et al. (20).

La fixation stable des acides nucléiques cibles sur un support permet de réaliser une analyse quantitative et quaUtative simple et rapide des produits amplifiés par hybridation spécifique des échantillons d'ADN amplifiés et préalablement marqués, avec les ADN cibles présents sur le support, puis par quantification du signal d'intensité d'hybridation. De tels supports sont des membranes de nylon ou de nitrocellulose classiquement utilisées en biologie moléculaire pour la quantification des acides nucléiques sur lesquelles ont été transférés ou déposés les ADN cibles. Ces supports peuvent aussi être des supports solides de types puces à ADN ou micro- arrays (16).

Dans une forme de réalisation préférée, le kit contient en outre des amorces pour l'ampUfication du marqueur de la neuropiline (NRPl), dont les séquences nucléotidiques sont choisies parmi les séquence suivantes : : 5'-AGT GTC TTG CAG AGC AGT GTC TCA- 3' et 5'-TGG TGC TAT ACT GGG AAG AAG CTG T- 3'.

L'invention porte aussi sur l'utilisation d'un kit tel que décrit précédemment pour inclure les résultats obtenus dans une base de données constituée des données phénotypiques et génotypiques de patients atteints de cancer de la prostate ainsi que de leurs tableaux cliniques et de leur évolution en fonction des traitements et identifier le traitement thérapeutique optimal à proposer au patient.

Les exemples qui suivent illustrent des modes de réalisation de l'invention sans en limiter la portée des revendications. Ils présentent par ailleurs une étude comparative du diagnostic par le procédé de l'invention avec le diagnostic par la mesure du ratio PSA libre/total. Exemple 1 : détection de la perte d'hétérozygotie sur quatre régions chromosomiques indépendantes chez 32 patients

Afin de déterminer l'efficacité d'un diagnostic du cancer de la prostate par la détection d'au moins une perte d'hétérozygotie sur 4 régions indépendantes, une étude a été menée sur 32 patients âgés de 55 à 81 ans.

A : Matériels et méthodes

Al : Prélèvement des cellules

Les patients qui ont été choisis pour le prélèvement des cellules ont un niveau de PSA resté supérieur à 4 ng/ml pendant 3 à 6 mois après une première analyse négative de la prostate par biopsie.

Après massage par voie rectale de la prostate, les urines des 32 patients ont été collectées puis centrifugées pour récolter les cellules présentes. En parallèle, un prélèvement sanguin a été réalisé.

A2 Extraction des ADN et ARN des cellules

L'ADN des lymphocytes sanguins prélevés a été extrait. L'ADN et l'ARN ont été extraits de manière simultanée à partir des cellules récoltées dans les urines selon le protocole suivant.

Traitement des culots urinaires Le culot est ensuite mis à décongeler dans la glace. Deux fois 250 μl de solution D sont ajoutés au culot, puis le culot est transféré dans un tube Eppendorf. Cinquante microlitres d'acétate de sodium 2M pH4 (concentration finale de 0.2 M) sont ajoutés à l'échantillon, puis l'échantillon est agité. On ajoute alors 550 μl (volume à volume) de phénol acide pH 4,3 et 200 μl (1/5 du volume), de chloroforme/alcool isoamylique (c.i.a. 49/1). L'échantillon est agité vigoureusement pendant 10 secondes, puis mis à reposer dans la glace pendant 15 minutes. L'échantillon est ensuite centrifugé 15 minutes à 13 000 g à 4°C. La phase aqueuse (supérieure) contient les acides nucléiques. La moitié supérieure du surnageant est réservée à l'extraction des ARN alors que l'ADN est récupéré à partir de la moitié inférieure du surnageant, interface comprise.

Extraction des ARN: Un volume d'isopropanol à -20°C est ajouté à la partie récupérée pour l'ARN et l'échantillon est placé à -20°C de 1 à 16 heures. L'échantillon est ensuite centrifugé pendant 30 minutes à 12 500 g à 4°C. Le surnageant est éliminé, puis le culot est repris dans 300 μl de solution D et mélangé. Un volume d'isopropanol à -20°C est ajouté et l'échantillon est placé à -20°C de 1 à 16 heures. L'échantillon est centrifugé 30 minutes à 13 000 g à 4°C. Le surnageant est ensuite éliminé puis le culot est lavé à l'éthanol 70% à froid. L'échantillon est ensuite centrifugé 10 minutes à 13 000 g. Le surnageant est éUminé et le culot est séché. L'ARN est repris dans 20 μl d'eau DEPC (distillée).

Extraction de l'ADN: Sur la partie basse de la phase supérieure (interphase comprise), on ajoute un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (p.c.L 25 :24 :1). Après agitation, l'échantillon est centrifugé 5 minutes à 13 000g à 4°C. La phase aqueuse est récupérée et l'extraction au p.c.i. est renouvelée une fois. La phase aqueuse est ensuite récupérée. Un volume de chloroforme/alcool isoamylique (c.i.a. 24 :1) est ajouté, puis l'échantillon est centrifugé pendant 5 minutes à 13 000g à 4°C. La phase aqueuse est récupérée et l'extraction au c.i.a. est renouvelée une fois. Après récupération de la phase aqueuse, un volume d'acétate d'ammonium 8 M (concentration finale de 2 M) est ajouté, et 2,2 volumes d'éfhanol absolu à -20°C. L'échantillon est agité doucement et placé à -20°C de 1 à 16 heures. Il est ensuite centrifugé pendant 30 minutes à 13 000g à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est rincé avec 500 μl d'éthanol 70% à froid. Après centrifugation et éUmination du surnageant, le culot est séché. Le culot est ensuite resuspendu dans 20 μl de Tris lOmM-EDTA 1 mM pH 8.

A.3 Amplification, des ARN par RT-PCR L'ARN total (1 μg) est reverse-transcrit dans un volume total de 20 μl contenant une solution tampon (500 μM DNTP, 3 mM MgCl₂, 75 mM KC1, 50 mM Tris-HCl pH 8.3), 10 unités de Rnasin Tm Ribonuclease inhibitor (Promega, Madison, WI), 10 mM de dithiothreitol, 50 unités de transcriptase inverse Superscript II Rnase H- (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) et 1.5 μM d'hexamères aléatoires (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Les échantillons sont incubés à 20°C pendant 10 minutes et à 42°C pendant 30 minutes, et la transcriptase inverse est inactivée par chauffage à 99°C. Les produits sont ensuite refroidis et conservés à 4°C.

La PCR est réalisée de manière quantitative selon la technologie TaqMan. La fluorescence générée par le clivage des sondes marquées est délectable à l'aide d'un détecteur de séquence (ABI Prism 7700 ou 7900 Séquence Détection System ; PE Applied Biosystems). Une courbe standard est réalisée à l'aide d'une série de dilution d'ADNc obtenus de tissus de prostate sains. Afin de tester le rendement de la PCR la courbe standard est composée de 5 points de dilutions (1 mg, 62.5 ng, 15.6 ng et 3.9 ng d'ADNc). Les transcrits RPLPO ont été quantifiés comme contrôle interne de chaque échantillon. Le transcrit PSA a par ailleurs été quantifié. Les amorces utilisées pour la PCR des transcrits RPLPO et PSA sont décrites dans le tableau 1 présenté plus haut.

A.4 Détection sur l'APN des marqueurs microsatellites Deux marqueurs microsatellites ont été utilisés par région analysée, les marqueurs D7S480, D7S522 pour la région 7q31, les marqueurs D8S133, D8S261 pour la région 8p22, les marqueurs Dl 3S153, Dl 3S284 pour la région 13ql4 et les marqueurs D16S507 et D16S518 pour la région 16q23.2. Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification de ces marqueurs microsatellites sont définies dans Dib et al. (17) et Tomforhrde et al. (19).

Les réactions de PCR sont réalisées sur un volume total de 15 μl contenant 50 ng d'ADN génomique, 3 pmole de chaque amorce (une marquée par flurorescence), 1 mM de chaque DNTP, 1.5 mM de MgCI2, 1 0 mM de Tris-HCI pH 8.3, 50 mM de KCI et 0.6 unités de Taq polymérase. Les conditions pour l'amplification sont : 94°C pendant 5 minutes, 12 cycles de 94°C pendant 15 secondes, 55°C pendant 15 secondes, 72°C pendant 30 secondes, suivie de 22 cycles de 89°C pendant 15 secondes, 55°C pendant 15 secondes et 72°C pendant 3 secondes. L'étape d'élongation finale à 72°C est prolongée à 10 minutes.

Un des deux oUgonucléotides est marquée à la fluorescéine à son extrémité 5' et le sequenceur AppUed Biosystems modèle 377 (PE) est utilisé pour détecter et quantifier les différents signaux. Un microtitre de produit de PCR est ajouté à 3,5 μl de formamide désionisé contenant 0,5 μl d'un marqueur de taille moléculaire (Genescan 500 ROX, Perkin Elmer). Le mélange est dénaturé à la chaleur et 2,5 μl sont déposés sur un gel de polyacrylamide 6% urée 8 M et mis à migrer pendant 2 à 3 heures dans le sequenceur. Les différents fragments sont quantifiés à l'aide du logiciel d'analyse Genescan& 672 Fragment Analysis (Perkin Elmer) qui calcule la taille et la surface des pics. Une perte d'hétérozygotie est considérée comme présente quand l'intensité relative des deux allèles de l'ADN analysé diffère de l'intensité relative des deux allèles de l'ADN des lymphocytes d'un facteur inférieur ou égal à 0,66 ou au moins égal à 1,5. Chaque analyse est réaUsée au moins deux fois pour vérifier la reproductibilité de la détection de LOH (l'amplification PCR, la séparation par gel et la quantification sont répétées).

B. Résultats

Le tableau 2 ci-dessous présente l'ensemble des données obtenues dans cette étude sur chacun des 32 patients. Plus précisément, il présente l'âge de chaque patient (Age), le numéro d'identification anonyme de chaque patient (DKPRO), les valeurs quantifiées et normalisées de PSA (PSA/RPLPO), le taux de PSA exprimé dans le sang (PSA), le ratio PSA Hbre/total (PSA LIT), l'évaluation des seuils (eut off) de 25% et 15% des ratio PSA libre/total (L/T<25% et L/T <15%) (test à valeur diagnostic), la détection d'au moins une perte d'hétérozygotie parmi les quatre régions analysées (test à valeur diagnostic selon l'invention), les résultats de l'analyse de la biopsie réalisée après le diagnostic (cancer de la prostate ou non) et enfin le niveau de différenciation de la tumeur suite à l'analyse histologique des biopsies positives.

Le nombre de perte d'hétérozygotie détectée pour chacune des quatre régions analysées est détaillé dans le tableau 3 ci-dessous ainsi que le nombre de cas par région chromosomique pour lesquels les résultats sont non informatifs compte tenu du fait que les cellules saines sont homozygotes pour le marqueur considéré.

Tableau 3 Présentation des données obtenues sur la détection de perte d'hétérozygotie sur chacune des 4 régions indépendantes

Dans ce tableau, la colonne « non informatif » indique le nombre de patients testés dont la réponse est non informative. Les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre de réponses non informatives obtenues pour les marqueurs pris individuellement. De la même façon, les résultats indiqués dans la colonne « LOH » indiquent l'existence d'une LOH pour les deux marqueurs simultanément, et entre parenthèses pour chacun des marqueurs pris individuellement.

Une biopsie positive a été considérée comme la référence standard pour le diagnostic d'un cancer de la prostate. Afin d'évaluer la valeur diagnostique du procédé selon l'invention, les paramètres de diagnostic fondés sur un test de détection de perte d'hétérozygotie (positif lorsqu'au moins une perte d'hétérozygotie est détectée) ont été comparés aux paramètres de diagnostic fondés sur un test de mesure du ratio PSA libre/total (positif lorsqu'il est inférieur à 25%), test classiquement utilisé aujourd'hui pour le diagnostic. Ces paramètres de sensibiUté, de spécificité et de valeurs prédictives positives et négatives sont présentés dans le tableau 4.

Tableau 4: Comparaisons des paramètres de sensibilité, de spécificité et de valeurs prédictives selon le test réalisé pour le diagnostic

Les résultats montrent que l'ensemble des paramètres est amélioré de manière significative. La sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives sont supérieures de respectivement 8, 15, 20 et 17 points avec le nouveau test diagnostic proposé et réalisable par la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Par conséquent, ce nouveau test contribue avec l'analyse du ratio PSA libre/total à améliorer le diagnostic du cancer de la prostate et permet un pronostic, par exemple, pour la sélection des candidats à une biopsie de la prostate et un suivi de l'effet d'un traitement.

Exemple 2 : détection de la perte d'hétérozygotie sur trois régions chromosomiques indépendantes chez 52 patients

La détection d'au moins une perte d'hétérozygotie a été recherchée sur trois et six régions chromosomiques prostate sur 52 patients âgés de 53 à 86 ans. Les résultats obtenus lors de l'analyse de trois et six régions chromosomiques sont présentés respectivement par l'exemple 2 et l'exemple 3.

A : Matériels et méthodes

Al : Prélèvement des cellules

Les conditions de prélèvement des cellules sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1 consacré à l'étude de 32 patients.

A2 Extraction des ADN et ARN des cellules

Les ADNs et ARNs des cellules d'origines prostatique ainsi que les ADNs des lymphocytes sanguins prélevés ont été extraits selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 1. Les réactions de PCR réalisées pour la quantification des ARN messagers du PSA et la détection des LOH sont identiques à celles citées dans l'exemple 1.

B. Résultats

Le tableau 4 ci-dessous présente l'ensemble des données obtenues dans cette étude sur chacun des 52 patients. Plus précisément, il présente le numéro d'identification, anonyme de chaque patient (DKPRO), la détection d'au moins une perte d'hétérozygotie parmi les trois régions analysées (test à valeur diagnostic selon l'invention), les résultats de l'analyse de la biopsie réaUsée après le diagnostic (cancer de la prostate ou non).

Tableau 4 : présentation des résultats de LOH sur trois régions chromosomiques en analysant l'ADN de 52 patients

L'annotation NI (non informatif) indique que le patient est homozygote pour la région analysée, ND (non déterminé) indique qu'aucun résultat de génotypage interprétable n'a été obtenu après au moins trois PCR successives, LOH et + indiquent respectivement la perte d'allèle et la présence de l'hétérozygotie

Le nombre de perte d'hétérozygotie détectée sur l'ensemble des trois régions chromosomiques analysées et pour chacun des deux groupes cliniques (cancer de la prostate ou non) de patients étudiés est détaiUé dans le tableau 5 ci-dessous.

Tableau 5 : Présentation des données obtenues sur la détection de perte d'hétérozygotie sur chacune des trois régions indépendantes

Les paramètres de sensibiUté, de spécificité et de valeurs prédictives positives et négatives du test LOH pour cette étude réaUsée sur 52 patients sont présentés dans le tableau 6. Tableau 6: Présentation des paramètres de sensibilité, de spécificité et de valeurs prédictives selon le test réalisé pour le diagnostic par le test LOH

Les résultats montrent que, bien que l'on observe une légère diminution de la valeur prédictive positive pour cette dernière étude, l'ensemble des paramètres est globalement conservé entre les séries d'analyses de l'exemple 1 et de l'exemple 2.

Exemple 3 : détection de la perte d'hétérozygotie sur six régions chromosomiques indépendantes chez 52 patients

La perte d'allèle a été recherchée chez les 52 patients présentés dans l'exemple 2 sur un nombre de régions chromosomiques porté à six et qui comprennent les trois régions de l'exemple 2 et les régions 12pl3, 16q23.2 et 18q21.

A : Matériels et méthodes

Al : Prélèvement des cellules

A2 Extraction des ADN et ARN des cellules

Les ADNs et ARNs des cellules d'origines prostatique ainsi que les ADNs des lymphocytes sanguins prélevés ont été extraits selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 1. Les réactions de PCR réalisées pour la quantification des ARN messagers du PSA et la détection des LOH sont identiques à celles citées dans l'exemple 1. B. Résultats

Le tableau 7 ci-dessous présente l'ensemble des données obtenues dans cette étude sur chacun des 52 patients. Plus précisément, il présente le numéro d'identification anonyme de chaque patient (DKPRO), la détection d'au moins une perte d'hétérozygotie parmi les six régions analysées (test à valeur diagnostic selon l'invention), les résultats de l'analyse de la biopsie réalisée après le diagnostic (cancer de la prostate ou non).

Tableau 7 : présentation des résultats de LOH sur six régions chromosomiques en analysant l'ADN de 52 patients

L'annotation NI (non informatif) indique que le patient est homozygote pour la région analysée, ND (non déterminé) indique qu'aucun résultat de génotypage interprétable n'a été obtenu après au moins trois PCR successives, LOH et + indiquent respectivement la perte d'allèle et la présence de l'hétérozygotie.

Le nombre de perte d'hétérozygotie détectée sur l'ensemble des six régions chromosomiques analysées et pour chacun des deux groupes cliniques (cancer de la prostate ou non) de patients étudiés est détaillé dans le tableau 8 ci-dessous.

Tableau S : Présentation des données obtenues sur la détection de perte d'hétérozygotie sur chacune des six régions indépendantes

Les paramètres de sensibiUté, de spécificité et de valeurs prédictives positives et négatives du test LOH pour cette étude réaUsée sur 52 patients sont présentés dans le tableau 9. Tableau 9: Présentation des paramètres de sensibilité, de spécificité et de valeurs prédictives selon le test réalisé pour le diagnostic par le test LOH

Les résultats montrent que l'augmentation du nombre de régions chromosomiques étudiées portée aux six régions régions 7q31, 8p22, 12pl3, 13ql4, 16q23.2 et 18q21 permet d'augmenter la sensibilité et la valeur prédictive négative du test LOH. La diminution de la spécificité assortie de la valeur prédictive positive peut s'expliquer par le fait que 20 à 50% des biopsies sont prélevées dans du tissu sain à coté de la tumeur.

Le procédé de l'invention et sa mise en oeuvre offre au clinicien et au patient un moyen de diagnostic, pronostic et suivi d'un traitement des cancers de la prostate qui présente de nombreux avantages parmi lesquels il faut citer :

- la fiabiUté, améliorée par rapport aux dosages PSA, peut être augmentée avec le nombre de régions chromosomiques analysées ;

- la méthode non invasive - comparée aux biopsies - permet un suivi régulier tant en pronostic qu'en suivi thérapeutique, contribuant ainsi à l'augmentation de la fiabiUté des résultats ,

- le procédé est mis en oeuvre sur des cellules similaires caractérisées par leurs marqueurs spécifiques ; ainsi, la comparaison dans le temps des résultats obtenus est significative de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet d'un traitement.

- la possibiUté de réaUser une base de données accumulant l'ensemble des données relatives aux patients suivis et traités, et d'affiner ainsi les traitements à prodiguer à un patient par comparaison de son tableau clinique, des caractéristiques phénotypiques et génotypiques de ses cellules prostatiques avec les données constitutives de la base. BIBLIOGRAPHIE

1. Partin, P. R. et Oesterling, J. E. (1 994). The clinical usefulness of prostate spécifie antigen: update 1994. J Uroi. 152: 1358.

2. Christensson. A., Bjo6p21, 6q2 7q31, 8p22, 10q23-25, 13ql4, 16q22, 16q23, 16q24, 17q21 et 18q21rk, T., Nilsson, O., Dahlen, U., Matikainen, T., Cockett, A. T. K., Abrahamsson, P.A. et Lilja, H. (1993). Sérum prostate spécifie antigen complexed to al-antiçhymotrypsin as an indicator of prostate cancer. J. UroL 150: 1 00.

3. Cléments, LA. et al. (1999). Molecular détection of prostate cells in ejculate and urethral ashings in men with suspected prostate cancer. J. Uroi. 161 : 1337- 1343.

4. Latil, A., Cussenot, O., Fournier, G., Baron, J.-C. et Lidereau, R. (1995). Loss of heterozygosity at 7q31 is a fréquent and early event in prostate cancer. Clin. Cancer. Res. 1: 1385-1389.

5. Latil, A., Cussenot, O., Fournier, G., Keltouma, D. et Lidereau, R. (1997). Loss of heterozygosity at chromosome 16q in prostate adenocarcinoma : Identification of three indépendant régions. Cancer Res. 57: 1058-1062.

6. Latil, A., Fournier, G., Cussenot, 0. et Lidereau, R. (1996). Differential chromosome allelic imbalance in the progression of human prostate cancer. J. Uroi. 156: 2079-2083.

7. Ueda, T. et al. (1999). Identification of a 1 cM région of common deletion on 13ql4 associated with human prostate cancer. Gènes, chromosomes and cancer 24: 183-190.

8. . Yin, Z., Spitz, M.R., Babaiab, R.J., Strom, S.S., Troncoso, P. et Kagan, J. (1999). Limiting the location of a putative human prostate cancer tumor suppressor gène at chromosome 13ql4.3. Oncogene 18.- 75767583.

9. Jenkins, R.B. et al. (1998). A molecular cytogenetic analysis of 7q31 in prostate cancer. Cancer Res 58: 759-766.

10. Prasad, M.A., Trybus, T.M., Wojno, K.J. and Macoska, J.A. (1998). Homozygous and fréquent deletion of proximal 8p séquences in human prostate cancers : Identification of a potentiel tumor suppressor gène site. Gènes, chromosome and cancer 23: 255-262.

11. MacGrogan, D., Levy, A., Bostwick, D., Wagner, M., Wells, D. et Bookstein R. (1994). Loss of chromosome arm 8p loci in prostate cancer: Mapping by quantitative alleUc imbalance. Gènes, chromosome and cancer 10: 151-159.

12. Trapman, J. et al. (1994). Loss of. heterozygosity of chromosome 8 microsatellite loci implicates a candidate tumor suppressor gène between the loci D8S87 and D8S133 in human prostate cancer. Cancer Res 54: 6061-6064. 13. Latil, A. et al. (1999). Loss of heterozygosity at chromosome arm 13q and RBI status in human prostate cancer. Human pathology 30: 809-815.

14. Chomczynski, Y. et Sacchi, N. (1 987). Anal. Biochem. 162 : 156-159.

15. Pollack JR, Pérou CM, Alizadeh AA, Eisen MB, Pergamenschikov A, Williams CF, Jeffrey SS, Botstein D, Brown PO (1999). Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA'microarrays. Nat Genêt 23: 41-6.

16. Shalon D, Smith SJ, Brown PO (1996). A DNA microarray System for analyzing co plex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. Génome Res 6: 639-45.

17. Dib, C, Faure, S., Fizames, C, Samson, D., Drouot, N., Vignal, A., Missasseau, P., Marc,

S., Hazan, J., Seboun, E., Lathrop, M., Gyapay, G., Morissette, J., and Weissenbach, J. (1 996). ' A compréhensive genetic map of the human génome based on 5.264 microsatelites. Nature, 380: 152-154.

18. Périnchery,G., Sasaki, M., Angan,A., Kumar.V., Carroll, P. and Dahiya,R. (2000). 'Deletion of Y-chromosome spécifie gènes in human prostae cancer'. J. Uroi., 163:1339- 42.

19. Tomfohrde, J., Wood, S., Schertzer, M., Wagner, M.J., Wells, D.E., Parrish, J., Sadler, L.A., Blanton, S.H., Daiger, S.P., Wang, Z., Wilkie, P.J. and Weber, J.L. ( 1992). Human chromosome 8 linkage map based on short tandem repeat polymorphisme: Effect of genotyping errors. Genomics, 14:144.

20. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1 989). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2 edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de diagnostic in vitro et/ou de pronostic du cancer de la prostate à partir d'un échantillon de cellules d'origine prostatique isolées d'un patient comprenant les étapes suivantes : a) extraction séparée ou simultanée des ADN et ARN totaux des cellules récoltées ; b) analyse de la qualité des cellules récoltées, soit par l'analyse de marqueurs spécifiques des cellules d'origine prostatiques à partir des ARN extraits en a), soit par dosage directe d'antigènes spécifiques des cellules prostatiques dans l'urine présente dans l'échantillon ; c) recherche d'altérations chromosomiques détectées par perte d'allèles à partir des ADN extraits en a).

2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'extraction des ADN et ARN des cellules d'origine prostatiques est effectuée après centrifugation de l'échantillon et récupération du culot cellulaire ou autre tri cellulaire permettant d'isoler les cellules d'origine prostatique.

3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'analyse des marqueurs spécifiques est réalisée par une méthode d'amplification quantitative des ARN correspondants.

4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel les marqueurs spécifiques des cellules d'origine prostatiques sont choisis parmi les marqueurs suivants: PSA, PSMA, PAP, KRT 18, la vimentine, KRT 5 et CD34.

5. Procédé selon la revendication 4 dans lequel les amorces utilisées pour l'amplification des marqueurs ont une séquence nucléotidique définie dans le tableau suivant :

6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel au moins une protéine choisie dans le groupe comprenant PSA, PSMA, PAP, prostase est dosée directement dans l'urine contenue dans l' échantillon de cellules d'origine prostatiques.

7. Procédé selon la revendication 1 dans lequel la recherche d'altération chromosomique est réalisée par amplification quantitative de matrices porteuses de marqueurs de polymorphismes.

8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel des marqueurs de polymorphisme utiUsés sont des marqueurs microsatelUtes.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans lequel la perte d'allèle est recherchée sur au moins une région chromosomique choisie dans le groupe comprenant les régions 6p21-31, 6q21, 6q25.3, 7q31, 8p22, 9p21, 10q23-25, 12pl3, 13ql4, 16q24.3, 16q23.2, 17q21.2, 18q21 et Yqll-12,

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la perte d'allèle est recherchée sur les 3 régions chromosomiques suivantes : 7q31, 8p22, 13ql4.

11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la perte d'allèle est recherchée sur les 4 régions chromosomiques suivantes : 7q31, 8p22, 13ql4, 16q23.2

12. Procédé selon la revendication 9, caratérisé en ce que la perte d'allèle est recherchée sur les 6 régions chromosomiques suivantes : 7q31, 8p22, 12pl3, 13ql4, 16q23.2, et 18q21.

13. Procédé selon la revendication 8 dans lequel les marqueurs utilisés sont :.

14. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on fait suivre l'étape de recherche d'altération chromosomique, d'une étape de détection puis de quantification du marqueur de la neuropiline (NRPl).

15. Procédé selon la revendication 14 dans lequel les amorces utilisées pour l'amplification du marqueur de la neuropiline sont choisies parmi les séquences de nucléotides suivantes :. 5'- AGT GTC TTG CAG AGC AGT GTC TCA- 3' et 5'-TGG TGC TAT ACT GGG AAG AAG CTG T- 3'.

16. Procédé pour identifier le traitement thérapeutique optimal d'un patient atteint d'un cancer de la prostate et comprenant les étapes suivantes : a) Réalisation d'une base de données constituée des données acquises par la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 15 chez un nombre élevé de patients et les données acquises par le suivi cUnique des mêmes patients ; b) La mise en oeuvre du procédé de diagnostic et/ou de pronostic selon l'une des revendications 1 à 15 sur le patient à traiter; c) La comparaison des données acquises sur le patient à l'étape b) avec les données présentes dans la base de données réalisée à l'étape a) et choix d'un traitement thérapeutique optimal pour le patient à traiter.

17. Kit pour le diagnostic ou/et le pronostic in vitro du cancer de la prostate selon le procédé objet de l'une des revendications 1 à 15 comprenant au moins un de chacun des éléments suivants : a) des amorces spécifiques permettant l'amplification des ARN correspondant des marqueurs spécifiques des cellules d'origine prostatique et/ou un réactif de dosage des antigènes spécifiques des cellules prostatiques; b) des amorces spécifiques permettant l'amplification des séquences porteuses des marqueurs de polymorphisme; c) les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'ampUfication, de marquage et d'hybridation ; d) Le cas échéant, les cibles pour l'hybridation spécifique des produits amplifiés et leur quantification ; lesdites cibles pouvant être fixées sur un support.

18. Kit selon la revendication 17 contenant des amorces permettant l'amplification spécifique des séquences porteuses des marqueurs de polymorphismes situées au niveau des régions 6p21-31, 6q21, 6q25.3, 7q31, 8p22, 9p21, 10q23-25, 12pl3, 13ql4, 16q24.3, 16q23.2, 17q21.2, 18q21 et Yqll-12,

19. Kit selon la revendication 17 contenant des amorces permettant l'ampUfication spécifique des séquences porteuses des marqueurs de polymorphismes situées au niveau des trois régions 7q31, 8p22 et 13ql4

20. Kit selon la revendication 17 contenant des amorces permettant l'amplification spécifique des séquences porteuses des marqueurs de polymorphismes situées au niveau des quatre régions 7q31, 8p22, 13ql4 et 16q23.2.

21. Kit selon la revendication 17 contenant des amorces permettant l'amplification spécifique des séquences porteuses des marqueurs de polymorphismes situées au niveau des six régions 7q31, 8p22, 12pl3, 13ql4, 16q23.2 et 18q21.

22.. Kit selon l'une des revendications 17 à 21 contenant en outre un réactif de dosage dans l'urine d'au moins un antigène spécifique choisi parmi PSA, PSMA, PAP ou prostase.

23. Kit selon la revendication 17 à 22 contenant en outre des amorces pour l'amptification du marqueur de la neuropiline (NRPl), dont la séquence nucléotidique est choisie dans le tableau suivant : 5'-AGT GTC TTG CAG AGC AGT GTC TCA- 3' et 5'-TGG TGC TAT ACT GGG AAG AAG CTG T- 3'.

24. Kit selon la revendication 17 dans lequel les amorces permettant l'amptification spécifique des ARN correspondant aux marqueurs spécifiques des cellules prostatiques et cancéreuses ont une séquence nucléotidique définie dans le tableau suivant :

25.. Utilisation d'un kit selon l'une des revendications 17 à 24 pour inclure les résultats obtenus dans une base de données constituée des données phénotypiques et génotypiques de patients atteints de cancer de la prostate ainsi que de leurs tableaux cliniques et de leur évolution en fonction des traitements et identifier le traitement thérapeutique optimal à proposer au patient.