FR2849382A1

FR2849382A1 - Utilisation du gene htr2b pour le traitement du cancer de la prostate

Info

Publication number: FR2849382A1
Application number: FR0216699A
Authority: FR
Inventors: Alain Latil
Original assignee: Urogene SA
Current assignee: Urogene SA
Priority date: 2002-12-26
Filing date: 2002-12-26
Publication date: 2004-07-02
Also published as: WO2004060390A3; AU2003299399A1; WO2004060390A2; AU2003303568A8; AU2003303568A1; AU2003299399A8; WO2004061408A3; WO2004061408A2

Abstract

Utilisation d'un inhibiteur spécifique du récepteur 5HT2B pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des tumeurs solides du type épithélial dans lesquelles on observe une surexpression du gène HTR2B dans les cellules tumorales par rapport aux cellules saines.

Description

UTILISATION DU GENE HTR2B POUR LE TRAITEMENT DU CANCER DE
LA PROSTATE
L'invention concerne le traitement du cancer, plus particulièrement des tumeurs solides du type épithélial. Parmi ces tumeurs sont plus particulièrement concernés les cancers de la sphère urologique (prostate, vessie, rein), du poumon, du colon et du sein, cette liste n'étant pas limitative. Plus précisément, l'invention a pour objet l'utilisation du gène HTR2B ou de la voie de signalisation de ce récepteur pour le traitement des tumeurs solides du type épithélial et notamment du cancer de la prostate.

Dans la suite de la description, l'invention est plus particulièrement décrite en relation avec le cancer de la prostate.

Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquent chez les hommes non-fumeurs.

Sa prévalence, pour les hommes de plus de 50 ans est estimée à 15% et 3% de la population globale à partir de cette limite d'âge en mourra. Il est devenu un réel problème de santé publique en raison du vieillissement de la population. La mortalité du cancer de la prostate est directement liée au stade de la découverte de l'affection. Les modalités de traitement du cancer de la prostate dépendent principalement du stade au diagnostic et de l'âge du patient. A un stade précoce où la maladie est encore confinée à la glande prostatique, le cancer peut être curable par prostatectomie radicale ou irradiation prostatique. Cependant, outre les effets secondaires gênants découlant de ces deux solutions thérapeutiques, il a été montré que le bénéfice de ces traitements à visée curative n'est observé que chez des patients dont l'espérance de vie est supérieure à 10 ans, en raison de l'évolution souvent lente de ces tumeurs localisées.

La recherche de traitements efficaces et de moindre coût pour éradiquer cette pathologie est donc toujours d'actualité.

Le cancer de la prostate est un adénocarcinome que l'on peut caractériser par le passage d'une régulation paracrine à une régulation autocrine de la croissance de la composante épithéliale (Culig et al., 1996).

L'identification de gènes exprimés différemment dans les tumeurs malignes prostatiques et dans les tissus prostatiques sains pourrait ainsi permettre de découvrir des gènes-clés dans le processus de transformation maligne des cellules épithéliales prostatiques et plus généralement des cellules épithéliales.

Ces gènes pourraient alors être utilisés non seulement comme marqueurs diagnostiques mais aussi comme nouvelles cibles pour la thérapie du cancer de la prostate.

Le Demandeur s'est intéressé plus particulièrement à l'identification de gènes dont l'expression est dérégulée positivement dans les cancers de la prostate ;ce qui laisse supposer une fonction activatrice de la tumorigenèse pour les gènes ainsi identifiés.

Par cette approche, le Demandeur a mis en évidence que le gène HTR2B était surexprimé dans les tumeurs prostatiques à partir du stade clinique Tl selon la classification TNM 1997. Cette dernière s'appuie sur des critères anatomo-cliniques et distingue quatre stades, le stade Tl qui correspond à des cancers non palpables et non visibles par imagerie, le stade T2 qui correspond à des cancers limités à la prostate (apex et capsule compris), le stade T3 qui correspond à des cancers dont l'extension va au delà de la capsule et le stade T4 qui correspond à des cancers étendus aux organes adjacents (col vésical, sphincter urétral, rectum, paroi pelvienne). Lorsque la tumeur présente une extension loco-régionale et/ou des métastases à distance un traitement palliatif est décrété. Le cancer de la prostate étant androgéno-dépendant, le traitement le mieux adapté est le sevrage androgénique. L'efficacité du traitement honnonal est limitée dans le temps ; effet, après un délai variable selon les tumeurs, apparaît la phase d'échappement marquée par une reprise de l'évolution de la maladie. La tumeur est alors androgéno-indépendande et HTR2B est également surexprimé dans ces stades là.

Le gène HTR2B est un récepteur à la 5-hydroxytryptamine plus communemment connue sous le nom de serotonine. Cette famille de récepteurs à la sérotonine appartient à la grande famille des récepteurs rhodopsine comprenant entre autres les récepteurs à la bradykinine, l'endothéline, neurotensine....Les 14 récepteurs HTR (également appellés

5-HTR) sont répertoriés dans 7 sous-types HTR1 à HTR7, et comportent notamment 3 formes HTR2 (HTR2A, HTR2B, et HTR2C).

L'utilisation du gène HTR2B pour indication thérapeutique a déjà été décrite dans d'autres pathologies mais jamais pour le traitement du cancer. En effet, la sérotonine est nommée comme molécule principale impliquée dans la migraine. A ce titre de nombreux agonistes (et quelques antagonistes) aux récepteurs de la famille, pas toujours spécifiques d'un seul sous-type de récepteur, ont été développés et ont montré leur efficacité dans le traitement de la douleur et aux symptômes associés.

La séquence d'ARN messager de HTR2B, disponible dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès NM 000867 (Cette séquence correspond à la séquence SEQ ID 1 en annexe) comporte une ORF (Open Reading Frame) de 1446

bases est localisée entre le 56eme et le 1501 èllle nucléotide de cette séquence. Cette ORF est encadrée par une région 5' non codante de 55 bases et une région 3' non codante de 290 bases. L'ORF code une protéine de 481 résidus (soit un poids d'environ 54 kDa), nommée protéine 5HT2B. La séquence de la protéine 5HT2B correspond à la séquence SEQ ID 2 de l'annexe.

La protéine 5HT2B est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) comportant 7 régions transmembranaires (7TM). Le signal se fait par la voie du Phosphatidylinositol (appellé second messager) et de la Phospholipase C.

Comme déjà dit, le Demandeur a démontré pour la première fois que le gène HTR2B était surexprimé dans les cellules tumorales prostatiques. En outre et comme indiqué dans l'exemple 2 ci-après, le Demandeur a également montré que la sérotonine et le BW723C86 (agoniste spécifique des récepteurs HTR2B et HTR2C) avait un effet sur la prolifération des cellules et que l'inhibition du récepteur 5HT2B bloquait cette prolifération.

En conséquence, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur spécifique du récepteur 5HT2B pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des

tumeurs solides du type épithélial dans lesquelles on observe une surexpression du gène
HTR2B dans les cellules tumorales par rapport aux cellules saines.

Les tumeurs solides plus spécifiquement concernées par le médicament de l'invention correspondent aux cancers de la sphère urologique (prostate, rein, vessie), le cancer du sein, le cancer du poumon et le cancer du colon ; cette liste n'étant pas limitative.

Dans la suite de la description et dans les revendications, par les expressions - "tumeurs solides du type épithélial", on désigne les tumeurs se développant à partir des cellules épithéliales, - "surexpression", on désigne une quantité d'ARNm du gène HTR2B ou de protéine 5HT2B au moins 1,5 fois supérieure dans les cellules tumorales par rapport aux cellules saines du même organe, - "inhibiteur spécifique du récepteur 5HT2B", on désigne : toute molécule antagoniste de la partie extracellulaire ou intracellulaire du récepteur 5HT2B pouvant rétablir dans le tissu tumoral une activité biologique de la protéine 5HT2B similaire à celle rencontrée dans le tissu normal, toute molécule agoniste inverse de la partie extracellulaire ou intracellulaire du récepteur 5HT2B pouvant induire une absence totale d'activité biologique,
RNAi (double brin), ARN anti-sens susceptibles de bloquer la traduction de l'ARNm du gène HTR2B.

De même, par l'expression l'activité biologique , on désigne l'activité induite par la protéine 5HT2B sur la prolifération cellulaire des cellules tumorales et sur la capacité invasive de ces même cellules.

Dans le cas des molécules agissant sur la partie intracellulaire du récepteur 5HT2B, l'inhibiteur est synthétisé sous forme intracytoplasmique afin d'inhiber son signal.

Selon un premier mode de réalisation, l'inhibiteur peut être constitué d'une petite molécule. Dans ce cas, l'identification de telles molécules peut être réalisée par un criblage à haut débit de librairies de molécules telles que composés chimiques ou autres (phytothèque....) en présence de la protéine 5HT2B par des techniques bien connues de l'homme du métier, le principe étant d'identifier les molécules se fixant spécifiquement sur le récepteur 5HT2B.

Une technique de criblage avantageuse correspond au binding ou "cell-based assays".

Ces tests donnent lieu à l'identification de "Hits" (Touches) c'est à dire de molécules pouvant s'accrocher à 5HT2B avec une bonne affinité. Cet ancrage à 5HT2B ne pouvant pas être déplacé par le ligand naturel. Ces familles de "hits" seront testées pour leur activité sur la prolifération cellulaire, et la capacité invasive des cellules tumorales et subiront par la suite une optimisation chimique afin de donner un "lead".

Les molécules inhibitrices peuvent également être obtenues par des méthodes in silico après détermination des coordonnées atomiques de la protéine 5HT2B, puis criblage d'une librairie de molécules chimiques.

Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention, peuvent être déterminés de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, etc.

De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 g à environ 1 mg par prise peut être administrée à des adultes humains.

Dans un second mode de réalisation, l'inhibiteur est un polypeptide synthétisé sous forme sécrétée ou sous forme intracytoplasmique.

Le polypeptide peut être introduit directement dans l'organisme ou indirectement, par le biais de sa séquence codante, par transfection de cellules.

Dans ce cas, l'acide nucléique codant le polypeptide peut être associé à un ou plusieurs agents qui améliorent l'efficacité transfectionnelle et/ou la stabilité dudit vecteur et/ou la protection dudit polypeptide in vivo à l'égard du système immunitaire de l'organisme hôte. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme du métier. A titre illustratif mais non limitatif, il peut s'agir d'un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire tel que la bupivacaïne, de liposomes, de lipides notamment cationiques, de protéines nucléaires ou virales, ou des microparticules de silice, d'or ou de tungstène. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison.

La quantité à utiliser comme médicament dépend notamment de la construction d'acide nucléique elle-même, de l'individu auquel cet acide nucléique est administré, du mode d'administration et du type de formulation et de la pathologie. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 g à environ 1 mg, de préférence d'environ 1 g à environ 800 g et de manière préférentielle d'environ 25 g à environ 250 g par prise, peut être administrée à des adultes humains.

Les inhibiteurs peuvent être administrés par toute voie d'administration conventionnelle telle que notamment la voie parentérale ou ceux-ci peuvent être injectés par voie intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes.

Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie.

Une administration ciblée au tissu prostatique peut être particulièrement avantageuse.

L'invention concerne également une méthode d'inhibition de la capacité proliférative et invasive de cellules tumorales épithéliales par inhibition des récepteurs 5HT2B, en particulier de cellules tumorales épithéliales prostatiques et plus largement une méthode de traitement du cancer de la prostate selon laquelle, on administre à un patient, une quantité efficace de la composition pharmaceutique précédemment décrite.

Le patient visé est généralement un être humain, mais l'application peut également être étendue à tout mammifère le cas échéant.

L'invention concerne également un procédé de détection in vitro du caractère tumoral de cellules contenues dans un échantillon biologique, selon lequel : - on quantifie les ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans les cellules de l'échantillon biologique, - on quantifie les ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans des cellules saines, - une augmentation de la quantité d'ARNm du gène HTR2B ou la protéine
5HT2B dans les cellules de l'échantillon biologique par rapport aux cellules saines marquant le caractère tumoral de l'échantillon biologique.

En pratique, l'ARNm du gène HTR2B correspond, comme identifié précédemment, à la séquence SEQ ID 1. De même, la protéine 5HT2B correspond à le séquence SEQ ID 2 identifiée précédemment.

En tant qu'échantillon biologique, on utilise un échantillon biologique contenant des cellules prostatiques ou autres, en fonction du cancer à traiter.

Le Demandeur a en effet constaté que le caractère tumoral des cellules prostatiques était avéré lorsque la quantité d'ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans des cellules tumorales contenues dans un échantillon biologique était au moins 1,5 fois supérieure à celle trouvée dans des cellules saines.

L'expression "cellules prostatiques" recouvre au sens de l'invention non seulement les cellules prostatiques mais également les cellules métastasées, en particulier les cellules cancéreuses d'origine prostatique ayant envahi les ganglions lymphatiques, les os.

La quantification des ARNm du gène HTR2B ou de la protéine 5HT2B dans les cellules, par exemple d'origine prostatique, peut être effectuée par différentes techniques connues de l'homme du métier.

En particulier et dans un premier mode de réalisation, la quantification des ARNm du gène HTR2B dans les cellules de l'échantillon biologique, par exemple les cellules prostatiques, est effectuée par RT-PCR à partir d'ARN extraits des cellules prostatiques contenues dans l'échantillon biologique. Les amorces utilisées dans cette technique sont spécifiques du gène HTR2B, ce qui signifie qu'elles s'hybrident spécifiquement avec la séquence SEQ ID 1 ou son complémentaire dans des conditions d'hybridation appropriées usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans des conditions stringentes.

Les amorces utilisées sont des acides nucléiques qui comportent au minimum 17 nucléotides, de préférence au moins 20 nucléotides et moins de 27 nucléotides.

Avantageusement, elles correspondent aux séquences SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6. L'homologie des amorces avec les sus-nommées séquences est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence tel que OLIG04S ou PRIMER-EXPRESS et la spécificité de ces séquences est déterminée par des logiciels d'analyse de séquence tel que BLASTN (Altschul et al, 1990), FASTA (Pearson et al., 1988) ou encore DNASIS (Hitachi Software Engineering America Ltd.).

Les conditions de stringence d'une hybridation entre deux acides nucléiques sont définies par rapport à la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81,5 + 0,41 (%G+C) 16,6 log(concentration en cations) - 0,63(%formamide) - (600/nombre de bases).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4(G+C) + 2(A+T).

Il est communément admis par l'homme du métier que dans des conditions d'hybridation stringentes, conditions dans lesquelles les séquences aspécifiques ne s'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation sont de préférence des solutions de force ionique élévée comme par exemple une solution 6xSSC.

Dans un second mode de réalisation, la quantification des ARNm du gène HTR2B dans les cellules de l'échantillon biologique, par exemple les cellules prostatiques est effectuée par Northern Blot. Les sondes utilisées sont des acides nucléiques comportant au minimum 10 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 100 nucléotides et qui hybrident spécifiquement avec la séquence SEQ ID 1 ou son complémentaire. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence elles correspondent à des conditions stringentes telles que définies précédemment.

La quantification de la protéine 5HT2B est effectuée par la mise en contact d'au moins un anticorps dirigé spécifiquement contre au moins 15 AA de SEQ ID2, avec l'échantillon biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre de la protéine 5HT2B et le ou lesdits anticorps et par la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés (Western Blot).

Les anticorps dirigés spécifiquement contre de la protéine 5HT2B utilisés sont des anticorps monoclonaux (BD PharmingenTM).

L'invention concerne également un kit pour la mise en #uvre du procédé précédemment décrit.

Dans le mode de réalisation selon lequel la quantification des ARNm du gène HTR2B est effectuée par RT-PCR ou Northem Blot, le kit comprend : - les couples d'amorces ou sondes spécifiques du gène HTR2B, en particulier les séquences SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6, - les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification et d'hybridation.

Dans le mode de réalisation selon lequel la quantification de la protéine 5HT2B est effectuée par test immunologique, le kit contient : - au moins un anticorps spécifique de la protéine 5HT2B, éventuellement fixé sur un support, - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre la protéine 5HT2B et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.

L'invention va maintenant être décrite dans le détail à l'appui des figures annexées.

Figure 1 :
Expression de HTR2B au niveau de l'ARN messager dans 18 échantillons prostatiques normaux, 34 tumeurs de prostate cliniquement localisées (17 stades pathologiques pT2 et 17 stades pathologiques pT3) et 9 tumeurs prostatiques hormono-indépendantes.

L'expression du gène HTR2B dans chaque tissu est exprimée par rapport à l'expression du gène PPIA qui est utilisé comme contrôle endogène (comme décrit dans le texte cl/méthode). L'expression du gène HTR2B a été également normalisée de telle façon que la moyenne d'expression des 18 échantillons prostatiques normaux soit égale à 1.

' Figure 2 : Localisation de la protéine 5HT2B par immunohistochimie.

Les échantillons normaux et tumoraux sont coupés et étalés sur lames, puis fixés à l'acétone. Les lames sont incubées avec l'anticorps primaire (BD PharmingenTM), puis l'anticorps secondaire anti-souris couplé à la peroxydase (Novostain Universal Quick
Kit). La révélation se fait avec le complexe streptavidine/AEC (ZYMED).

Les cellules sont ensuite observées grâce à un microscope à fluorescence.

La figure 2 représente une coupe de prostate normale (N) et des coupes de prostate tumorale (T) sur lesquelles l'hybridation a été réalisée avec l'anticorps monoclonal 5HT2B (BD PharmingenTM).

Figure 3 : Activation de la prolifération des cellules par la sérotonine et le composé BW723C86.

La prolifération cellulaire est mesurée 24h après traitement par les composés. La sérotonine et le BW723C86 sont ajoutés aux doses indiquées sur le graphique. Les résultats sont exprimés en pourcentage de chimioluminescence, reflétant le nombre de cellules par rapport à la moyenne des duplicats d'échantillons contrôles, ceci pour chaque lignée cellulaire. Les écarts types sont obtenus en tenant compte des valeurs de deux expériences indépendantes réalisées en duplicats.

Figure 4 : Effet de la ritansérine (antagoniste des récépteurs HTR-2 et HTR-7) sur la prolifération cellulaire.

La prolifération cellulaire est mesurée cinq jours après traitement par les composés. La ritansérine (1 M) est ajoutée 2 heures avant la sérotonine ou le BW723C86 (ajoutés aux doses indiquées sur le graphique). Les résultats sont exprimés en pourcentage de luminescence, reflétant le nombre de cellules par rapport à la moyenne des duplicats d'échantillons contrôles, ceci pour chaque lignée cellulaire. Les écarts types sont obtenus en tenant compte des valeurs de deux expériences indépendantes réalisées en duplicates.

EXEMPLE 1 : analyse de l'expression du gène HTR2B dans les tumeurs prostatiques et lignées prostatiques tumorales 1/ Patients et échantillons Quarante-trois tumeurs primaires de la prostate ont été analysées. Les échantillons de tumeur ont été obtenus auprès de patients subissant une opération chirurgicale à l'hôpital St-Louis à Paris, l'hôpital La Cavale Blanche à Brest, le CHU de Nancy et l'Institut Mutualiste Monsouris de Paris (France). Trente quatre patients présentaient des tumeurs de la prostate qui ont été localisées cliniquement [limitées à la prostate dans 17 cas

(pT2), et présentant une extension extracapsulaire dans 17 cas (pT3)], et 9 présentaient

des carcinomes h0l1110110-réfractaires récurrents de la prostate.

2/ Tissus sélectionnés
Les échantillons de tumeur maligne localisée à la glande prostatique (stades pT2 et pT3), ont été obtenus par prostatectomie radicale, alors que ceux des tumeurs hormono- réfractaires ont été obtenus par résection transuréthrale.

Une partie des tissus sélectionnés a été immédiatement placée dans l'azote liquide pour une potentielle extraction des acides nucléiques, alors que les sections adjacentes ont été colorées avec H/E (Hematoxyline et Eosine) et examinées histologiquement dans le service d'anatomopathologie des centres investigateurs.

La contre-partie pré-selectionnée (placée dans l'azote liquide) est assujettie à un nouvel examen histologique dans le laboratoire par un anatomopathologiste pour confirmer la malignité de l'échantillon.

Les zones malignes sont par la suite soigneusement disséquées de manière à obtenir une population cellulaire homogène et ainsi éviter toute "dilution" des modifications génétiques spécifiques aux tumeurs avec les acides nucléiques de cellules normales et réactives présentes dans le même échantillon.

Pour ces raisons, un échantillon est considéré comme convenable pour des études moléculaires si toutes les cellules épithéliales sont tumorales. Le diagnostic histologique, le classement clinique basé sur le système TMM et les scores de Gleason (Mellinger et al., 1967; Schroder et al., 1992) ont été déterminés dans chaque cas au cours d'une manipulation après une opération chirurgicale. Neuf étaient des tumeurs

h0l1110no-réfractaires alors qu'après un examen pathologique 17 des 34 tumeurs cliniquement localisées étaient des pT2 et 17 étaient des pT3. Les scores de Gleason des aires tumorales sélectionnées ont été établis avant l'extraction : Gleason 4-6 (7 cas), 7 (21 cas) et 8-10 (15 cas).

En supplément d'un pool commercial de tissus prostatiques humains sains (pool commercial ; BD Biosciences Clontech : Prostate total RNA, Ref : 64108-1), la

contrepartie non tumorale de 18 fragments de tissus prostatiques obtenus après prostatectomie radicale a été utilisée pour déterminer la quantité de référence d'ARNm du gène HTR2B dans un tissu prostatique sain. Ces 18 échantillons de tissu ont été vérifiés et sélectionnés pour leur absence de foyers tumoraux mais également en fonction de leur composition cellulaire (rapport épithélium/stroma) ; en effet, les échantillons à composante stromale majoritaire ont été exclus du fait d'une probable hyperplasie bénigne (HBP) de ces échantillons.

3/ Extraction des ARN et synthèse des ADNc a/ Extraction des ARN Les ARN totaux ont été extraits à partir d'échantillons de tissu en utilisant de l'isothiocyanate de guanidium, du phénol et du chloroforme (Chomczynski & Sacchi, 1987). La qualité des ARN a été contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium sur la base d'une non-dégradation des ARN 18S et 28S. Les bandes d'ARN 18S et 28S ont été visualisées sous lumière ultra-violette. bl Synthèse des ADNc Les ARN ont subi une transcription inverse dans un volume final de 20 l contenant un tampon RT IX (500 mM de chaque dNTP, 3 mM de MgCl2, 75 mM de KCI, 50 mM de Tris-HCl à pH 8,3), 10 unités d'inhibiteur de la ribonucléase Rnasin# (Promega, Madison, WI), 10 mM de dithiothréitol, 50 unités de transcriptase reverse Superscript II Rnase H- (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1,5 mM d'hexamères aléatoires (Pharmacia, Uppsala, Suède) et 1 g d'ARN totaux. Les échantillons ont été incubés à 20 C pendant 10 minutes et à 42 C pendant 30 minutes, et la transcriptase reverse a été inactivée par chauffage à 99 C pendant 5 minutes et refroidissement à 5 C pendant 5 minutes. c/ Real-Time RT-PCR cl/ Méthode Les valeurs quantitatives ont été obtenues à partir du nombre de cycles seuil (Ct) à partir duquel l'augmentation du signal correspondant à une amplification exponentielle du produit PCR, commence à être détectée (en utilisant un programme d'analyse Biosystems PE), selon le manuel du fabricant.

La quantité précise d'ARN totaux ajoutée à chaque réaction (basée sur la densité optique) et sa qualité (c'est-à-dire l'absence de dégradation extensive) sont toutes deux difficiles à maîtriser. Par conséquent, les transcrits du gène PPIA (Gène peptidylprolyl isomerase A dont le produit est la cyclophilin A) codant la peptidylprolyl isomerase A ont été quantifiés comme contrôle d'ARN endogène, puis chaque échantillon a été normalisé sur la base de son contenu en transcrits du gène PPIA.

De nombreux gènes ont été testés en tant que contrôles d'ARN endogène (par exemple le gène codant pour la phosphoprotéine acide ribosomale humaine (RPLPO) ou le gène codant pour la sous-unité ribosomale 18S), le gène PPIA a été retenu du fait de son taux d'expression constant à la fois dans les tissus prostatiques normaux, tumoraux, et les lignées cellulaires prostatiques.

Les résultats d'expression du gène HTR2B appellés N-HTR2B sont exprimés en différence de N-fois entre l'expression relative du gène HTR2B par rapport au gène PPIA ont été

calculés par la formule ., . N-HTR2B= #, 2 DCt échcntilloc où la valeur ACt de l'échantillon a été déterminée par soustraction de la valeur moyenne (chaque échantillon a été testé deux fois) du Ct du gène HTR2B de la valeur moyenne du Ct du gène PPIA.

Les valeurs de N-HTR2B ont été normalisées de telle sorte que la valeur moyenne N-HTR2B des 18échantillons de prostate saine corresponde à une valeur de 1. c2/ Amorces et produits pour la PCR Les amorces ont été choisies avec l'assistance des programmes informatiques Oligo 4 (National Biosciences, Plymouth, MN) et Primer express (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster city, CA). Des recherches BLASTN (Altschul et al., 1990) ont été effectuées contre dbEST et nr (le jeu non-redondant de GenBank, bases de données de séquences EMBL et DDBJ) pour confinner la spécificité totale des séquences nucléotidiques choisies comme amorces vis à vis des gènes d'intérêt à quantifier. Pour éviter l'amplification d'ADN génomique contaminant, les amorces ont été choisies de telle façon qu'une des amorces soit à cheval entre deux exons.

Les séquences nucléotidiques des amorces sont les suivantes :

HTR2B
ICI' couple
Upper 5'GTGCCATTTCAGTGGATCGTTACATA 3' (SEQ ID 3)
Lower 5'GCCAGTGAGCCAAAGAGCATGA 3'(SEQ ID 4)
2ème couple
Upper 5'GTGGTGTGGTTAATTTCAATAGGCATT 3'(SEQ ID 5)
Lower 5'CAGCCAGTGAGCCAAAGAGCAT 3'(SEQ ID 6) PPIA Upper 5'- GTC AAC CCC ACC GTG TTC TT-3' Lower 5'-CTG CTG TCT TTG GGA CCT TGT -3' c3/ Amplification PCR Toutes les réactions PCR ont été effectuées en utilisant un système de détection de séquence Prism ABI 7900 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). La PCR a été effectuée en utilisant le kit de réactifs SYBR Green PCR Core (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Les conditions au cours des cycles thermiques comprennent une étape initiale de dénaturation à 95 C pendant 10 minutes et 45 cycles comprenant 15 secondes à 95 C suivies de 1 minute à 65 C. Les expériences ont été effectuées en double pour chaque point de données (échantillons et contrôles).

4/ Résultats Les niveaux d'expression relative du gène HTR2B ont été quantifiés dans 43 tumeurs 'prostatiques malignes, 18 tissus de prostate saine, et dans 47 tissus de prostate humaine saine provenant d'un pool de tissus commercialisé (Clontech). Les niveaux d'expression sont déterminés sous la forme de rapports entre le gène HTR2B et le gène de référence PPIA, afin de corriger les variations de quantité d'ARN.

Une augmentation significative de l'expression de HTR2B est observée dans les tumeurs prostatiques par rapport aux tissus normaux ; 26 (60 %) des 43 tumeurs montraient une augmentation d'expression d'au moins un facteur 1,5 (cf. figure 1).

Les résultats obtenus sur les tissus prostatiques sont regroupés dans le tableau 1.

Tableau 1

<tb>
<tb> HTR2B/ <SEP> PPIA
<tb> moyenne <SEP> écart <SEP> type
<tb> Tissu <SEP> sain <SEP> 1,00 <SEP> 0,21
<tb> Tumeur <SEP> maligne <SEP> localisée
<tb> PT2 <SEP> 1,47 <SEP> 1,41
<tb> PT3 <SEP> 3,19 <SEP> 3,31
<tb> Tumeur <SEP> hormono-indépendante <SEP> 3,32 <SEP> 3,02
<tb>

HTR2B est exprimé dans la lignée prostatique tumorale PC3 (American Tissue Type
Culture Collection (Rockville, MD, USA) et dans la lignée prostatique épithéliale, immortalisée par HPV (CaHPV10)(Figure 2) .

EXEMPLE 2 : de prolifération avec la sérotonine et avec le BW723C86, et inhibition par la Ritansérine
1/ Test de prolifération
Ce test vise à démontrer l'effet prolifératif de la sérotonine sur les cellules tumorales puis l'effet contraire lorsque 5HT2B est bloqué. Les cellules sont ensemencées en plaques 96 puits. Les cellules PC3 (expression endogène de la sérotonine (= 204,1 fmol/cellule) sont ensemencées à raison de 2 000 cellules par puits dans 100 l 'de milieu RMPI contenant 5% de SFV et glutamine (1mM). Les cellules CaHPVIO (expression endogène de la sérotonine 15,6 fmol/cellule) sont ensemencées à raison de
5 000 cellules par puits dans 100 l de milieu RPMI contenant 10% de SVF, glutamine (ImM) et EGF (10ng/ l). Le lendemain, le milieu des cellules est changé, elles sont mises en présence de leurs milieux respectifs mais sans sérum. La sérotonine (Sigma) et le BW723C86 (Sigma) sont ajoutés à la concentration indiquée. Lorsque les cellules sont traitées par la ritanserine (Sigma) ce composé est ajouté 2 heures avant la sérotonine et le BW723C86. La ritanserine étant resuspendue dans du DMSO, les

cellules sont au final en contact de 1% DMSO, pour le puits contrôle les cellules sont mises en présence de milieu contenant également 1% de DMSO. Chaque condition expérimentale est réalisée en duplicate. La prolifération cellulaire est mesurée par le kit
Cell Titer Glo (Promega). Le protocole est celui recommandé par le fabricant.

Brièvement 100 l de tampon reconstitué est ajouté à chaque puits. Les plaques sont placées 2 min en agitation douce, puis incubées 10 min à température ambiante. Le signal chimioluminescent mesuré est proportionnel au nombre de cellules vivantes. Les résultats indiqués sont calculés en pourcentage de luminescence par rapport au puits contrôle pour chaque expérience.

2/ Résultats a/ Effet sur la prolifération de la sérotonine et du BW723C86 Les cellules PC3 et CaHPV10 sont traitées par des concentrations croissantes de sérotonine et de BW723C86 (Figure 3). La prolifération cellulaire est mesurée 24 heures après traitement. Les résultats indiqués sont la moyenne de deux expériences indépendantes. On observe une augmentation de la prolifération de 10 à 30 % pour les cellules CaHPVlO à des doses allant de 10-5 à 10-9 M de sérotonine. Lorsque les cellules sont traitées par le composé BW723C86 l'augmentation de la prolifération est plus importante. L'effet dose apparaît et atteint son maximum entre 20 et 60 % d'augmentation de la prolifération à la concentration de 10-7M de BW723C86. Pour les cellules PC3on observe un effet dose de la sérotonine sur la stimulation de la prolifération qui est à son maximum (entre 30 et 70 % d'augmentation), aux concentrations de 10-7M et 10-6M de sérotonine. L'effet du BW723C86 est le plus important egalement aux doses de 10-7m et 10-6m, entrainant une augmentation de la proliferation des cellules de 20 a 50%.

Les tests de prolifération ont été également effectués sur la lignée PNT2, qui ne montrait aucune expression du récepteur en RT-PCR quantitative. Aucun effet de la sérotonine et du BW23C86 sur la prolifération des cellules PNT2 n'a été observé. b/ Inhibition de 5HT2B L'effet de la ritanserine, composé antagoniste des récepteurs 5HT2B et 5HT2C, est testé sur la prolifération des cellules CaHPVlO et PC3 (figure 4). La prolifération des cellules est mesurée cinq jours après traitement. Les résultats montrés sont issus d'une

expérience représentative de trois expériences indépendantes. Les valeurs du graphique sont la moyenne de duplicats réalisés dans les mêmes conditions expérimentales. La ritanserine, en absence de toute stimulation, entraine une diminution de la prolifération de 20 % sur les cellules CaHPVIO et PC3. Les cellules CaHPVIO voient leur prolifération diminuée de 10 à 20 % après traitement par la ritanserine suivi d'une stimulation par la sérotonine ou le BW723C86. Cette diminution de 10 à 20 % est également observée pour des cellules PC3 stimulées par la sérotonine. L'effet le plus important est observé dans le cas de cellules PC3 stimulées par le BW723C86, la ritanserine inhibant la prolifération de 30 %.

REFERENCES
1. Culig Z., Hobisch A., Cronauer M., Radmayr C., Hittmair A., Zhang J., Thurnher M., Bartsch G., Klocker H. Régulation of prostatic growth and fonction by peptide growth factors. The Prostate (1996), 28 (6) : 392-405.

2. Altschul S.F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and D.J, Lipman Basic local alignment search tool. J Mol. Biol. (1990) : 215, 403-410.

3. Mellinger GT., Gleason D. & Bailar JIII. J. Urol.(1967), 97 : 331-337
4. Schroder FH., Hermanek P., Denis L., Fair WR., Gospodarowicz MK., Pavone-
Macaluso M., The Prostate (1992), Suppl. 4 : 129-138.

5. Chomczynski & Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid

guanidium thiocyanate-phenol-chlorofom extraction. Anal. Biochem. (1987),
162 (1) : 156-159.

6. Pearson W. R., Lipman D.J.; Improved tools for biological séquence comparison.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85:2444-2448.

7. Sambrook J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. Second Edition. Ed. Chris Nolan. Cold Spring Harbor Laboratory Press (USA).

Claims

REVENDICATIONS

1/ Utilisation d'un inhibiteur spécifique du récepteur 5HT2B pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des tumeurs solides du type épithélial dans lesquelles on observe une surexpression du gène HTR2B dans les cellules tumorales par rapport aux cellules saines.

2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la tumeur solide est caractéristique d'un cancer de la sphère urologique (prostate, vessie, rein), d'un cancer du sein, d'un cancer du poumon et d'un cancer du colon.

3/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un antagoniste de la partie extracellulaire ou intracellulaire du récepteur 5HT2B.

4/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un agoniste inverse de la partie extracellulaire ou intracellulaire du récepteur 5HT2B.

5/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un ARNi ou un ARN anti-sens susceptible de bloquer la traduction de l'ARNm du gène HTR2B.

6/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibiteur est obtenu par criblage à haut débit de librairies de molécules chimiques ou phytothèque en présence de la protéine 5HT2B.

'Il Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un polypeptide synthétisé sous forme sécrétée ou sous forme intracytoplasmique.

8/ Procédé de détection in vitro du caractère tumoral de cellules contenues dans un échantillon biologique, selon lequel : - on quantifie les ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans les cellules de l'échantillon biologique,

on quantifie les ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans des cellules saines, une augmentation de la quantité d'ARNm du gène HTR2B ou de la protéine

5HT2B dans les cellules de l'échantillon biologique par rapport aux cellules saines, associée au caractère tumoral de l'échantillon biologique.

9/ Procédé de détection selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'échantillon biologique contient des cellules prostatiques.

10/ Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que lorsque l'échantillon biologique contient des cellules prostatiques, le caractère tumoral desdites cellules prostatiques est avéré lorsque la quantité d'ARNm du gène HTR2B ou de la protéine 5HT2B de l'échantillon est au moins 1,5 fois supérieure à celle des cellules prostatiques saines.

11/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la quantification des ARNm du gène HTR2B dans les cellules de l'échantillon biologique est effectuée par RT-PCR.

12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les amorces utilisées correspondent aux séquences SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6.

13/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la quantification des ARNm du gène HTR2B dans les cellules de l'échantillon biologique est effectuée par Northern Blot.

14/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la quantification de la protéine 5HT2B est effectuée par la mise en contact d'au moins un anticorps dirigé spécifiquement contre au moins 15 acides aminés de la séquence SEQ ID 2.

15/ Kit pour la mise en #uvre du procédé objet de l'une des revendications 8 à 14.

16/ Kit selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend : - les couples d'amorces correspondant aux séquences SEQ ID 3, SEQ ID 4,

SEQ ID 5, - les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification et d'hybridation.

17/ Kit selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un anticorps spécifique de la protéine 5HT2B, éventuellement fixé sur un support, - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre la protéine 5HT2B et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.