UTILISATION D'UN INHIBITEUR SPECIFIQUE DU RECEPTEUR HTR2B POUR LE TRAITEMENT DU CANCER
L'invention concerne le traitement du cancer, plus particulièrement des tumeurs solides du type épithélial. Parmi ces tumeurs sont plus particulièrement concernés les cancers de la sphère urologique (prostate, vessie, rein), du poumon, du colon et du sein, cette liste n'étant pas limitative. Plus précisément, l'invention a pour objet l'utilisation du gène HTR2B ou de la voie de signalisation de ce récepteur pour le traitement des tumeurs solides du type épithélial et notamment du cancer de la prostate.
Dans la suite de la description, l'invention est plus particulièrement décrite en relation avec le cancer de la prostate.
Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquent chez les hommes non-fumeurs. Sa prévalence, pour les hommes de plus de 50 ans est estimée à 15% et 3% de la population globale à partir de cette limite d'âge en mourra. Il est devenu un réel problème de santé publique en raison du vieillissement de la population. La mortalité du cancer de la prostate est directement liée au stade de la découverte de l'affection. Les modalités de traitement du cancer de la prostate dépendent principalement du stade au diagnostic et de l'âge du patient. A un stade précoce où la maladie est encore confinée à la glande prostatique, le cancer peut être curable par prostatectomie radicale ou irradiation prostatique. Cependant, outre les effets secondaires gênants découlant de ces deux solutions thérapeutiques, il a été montré que le bénéfice de ces traitements à visée curative n'est observé que chez des patients dont l'espérance de vie est supérieure à 10 ans, en raison de l'évolution souvent lente de ces tumeurs localisées.
La recherche de traitements efficaces et de moindre coût pour éradiquer cette pathologie est donc toujours d'actualité.
Le cancer de la prostate est un adénocarcinome que l'on peut caractériser par le passage d'une régulation paracrine à une régulation autocrine de la croissance de la composante épithéliale (Culig et al, 1996).
L'identification de gènes exprimés différemment dans les tumeurs malignes prostatiques et dans les tissus prostatiques sains pourrait ainsi permettre de découvrir des gènes-clés dans le processus de transformation maligne des cellules épithéliales prostatiques et plus généralement des cellules épithéliales.
Ces gènes pourraient alors être utilisés non seulement comme marqueurs diagnostiques mais aussi comme nouvelles cibles pour la thérapie du cancer de la prostate.
Le Demandeur s'est intéressé plus particulièrement à l'identification de gènes dont l'expression est dérégulée positivement dans les cancers de la prostate; ce qui laisse supposer une fonction activatrice de la tumorigénèse par les gènes ainsi identifiés.
Par cette approche, le Demandeur a mis en évidence que le gène HTR2B était surexprimé dans les tumeurs prostatiques à partir du stade clinique TI selon la classification TNM 1997. Cette dernière s'appuie sur des critères anatomo-cliniques et distingue quatre stades, le stade TI qui correspond à des cancers non palpables et non visibles par imagerie, le stade T2 qui correspond à des cancers limités à la prostate (apex et capsule compris), le stade T3 qui correspond à des cancers dont l'extension va au delà de la capsule et le stade T4 qui correspond à des cancers étendus aux organes adjacents (col vésical, sphincter urétral, rectum, paroi pelvienne). Lorsque la tumeur présente une extension loco-régionale et/ou des métastases à distance un traitement palliatif est décrété. Le cancer de la prostate étant androgéno-dépendant, le traitement le mieux adapté est le sevrage androgénique. L'efficacité du traitement hormonal est limitée dans le temps; en effet, après un délai variable selon les tumeurs, apparaît la phase d'échappement marquée par une reprise de l'évolution de la maladie. La tumeur est alors androgéno-indépendande et HTR2B est également surexprimé dans ces stades là.
Le gène HTR2B est un récepteur à la 5-hydroxytryptamine plus communément connue sous le nom de sérotonine. Cette famille de récepteurs à la sérotonine appartient à la grande famille des récepteurs rhodopsine comprenant entre autres les récepteurs à la brady inine, l'endothéline, neurotensine....Les 14 récepteurs HTR (également appelés
5-HTR) sont répertoriés dans 7 sous-types HTR1 à HTR7, et comportent notamment 3 formes F-.TR2 (HTR2A, HTR2B, et HTR2C).
L'utilisation du gène HTR2B comme cible thérapeutique a déjà été décrite dans d'autres pathologies (par exemple migraine ou syndrome d'irritation intestinale) mais jamais pour le traitement du cancer.
Néanmoins, un lien a déjà été établi entre certains récepteurs à la sérotonine et le traitement du cancer.
En effet, le document WO 02/43652 propose d'utiliser des agents psychotropes dans le traitement des tumeurs. En particulier, il est fait référence à la clozapine, décrit comme un antagoniste de HTRIA dans ce document mais qui semble être, en réalité, un antagoniste de HTR2A et un agoniste partiel de HTR1C. Ce document propose également d'utiliser des agents psychotropes tels que la fluoxétine ou la paroxétine. Ces agents sont connus pour agir sur la recapture de la sérotonine et donc, par leur action sur la disponibilité du ligand, affectent tous les récepteurs de cette famille.
Le document EP-A-0 0727 206 divulgue l'utilisation de la sertraline dans le traitement de certains cancers, par exemple celui de la prostate. La sertraline est cependant également connue pour agir sur la recapture de la sérotonine et donc, comme la fluoxétine et la paroxétine citées précédemment, affecte tous les récepteurs de cette famille.
En revanche, aucun inhibiteur spécifique du récepteur HTR2B n'a été proposé pour le traitement du cancer.
Ainsi, la 2-amino-4-(4-fluoronaphthalen-l-yl)-6-isopropylpyrimidine ou RS127445, qui présente une affinité de l'ordre du nanomolaire (nM) vis à vis du récepteur 5-HT2B et une sélectivité d'un facteur 1000 par rapport aux autres récepteurs (Bonhaus et al., 1999), est préconisée pour la prise en charge de la migraine (Sigma Aldrich Handbook,
08/2002).
La séquence d'ARN messager de HTR2B, disponible dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès NM 000867 (Cette séquence correspond à la
séquence SEQ FD 1 en annexe) comporte une ORF (Open Reading Frame) de 1446 bases qui est localisée entre le 56e'™' et le 1501cme nucléotide de cette séquence. Cette ORF est encadrée par une région 5' non codante de 55 bases et une région 3' non codante de 290 bases. L'ORF code une protéine de 481 résidus (soit un poids d'environ 54 kDa), nommée protéine 5HT2B dont la séquence est disponible dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès NM 000868. La séquence de la protéine 5HT2B correspond à la séquence SEQ ID 2 de l'annexe.
La protéine 5HT2B est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) comportant 7 régions transmembranaires (7TM). Le signal se fait par la voie du Phosphatidylinositol (appelle second messager) et de la Phospholipase C.
Comme déjà dit, le Demandeur a démontré pour la première fois que le gène HTR2B était surexprimé dans les cellules tumorales prostatiques. En outre, le Demandeur a montré que la sérotonine et le BW723C86 (agoniste spécifique des récepteurs HTR2B et HTR2C) avait un effet sur la prolifération des cellules (Exemple 2 ci-après) et que l'inhibition du récepteur 5HT2B par un antagoniste spécifique (RS 127445) bloquait cette prolifération à la fois in vitro et in vivo (Exemples 3 et 4 ci-après).
En conséquence, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur spécifique du récepteur 5ITT2B pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des tumeurs solides du type épithélial, préférentiellement dans lesquelles on observe une surexpression du gène HTR2B dans les cellules tumorales par rapport aux cellules saines.
Les tumeurs solides plus spécifiquement concernées par le médicament de l'invention correspondent aux cancers de la sphère urologique (prostate, rein, vessie), le cancer du sein, le cancer du poumon et le cancer du colon ; cette liste n'étant pas limitative.
Dans la suite de la description et dans les revendications, par les expressions
"tumeurs solides du type épithélial", on désigne les tumeurs se développant à partir des cellules épithéliales,
- "surexpression", on désigne une quantité d'ARNm du gène HTR2B ou de protéine 5HT2B au moins 1,5 fois supérieure dans les cellules tumorales par rapport aux cellules saines du même organe,
"inhibiteur spécifique du récepteur 5HT2B", on désigne toute molécule possédant une forte affinité pour le récepteur 5HT2B, préférentiellement de l'ordre du nM. De plus, cette affinité est sélective, puisque l'affinité de cette molécule vis à vis des autres récepteurs, en particulier ceux de la même famille, est très signiiïcativement inférieure, au moins d'un facteur 100. Un inhibiteur spécifique avantageux selon l'invention est la 2-amino-4-(4-fluoronaphfhalen-l- yl)-6-isopropylpyrimidine ou RS 127445. Plus généralement, il peut s'agir de : toute molécule antagoniste de la partie extracellulaire ou intracellulaire du récepteur 5HT2B pouvant rétablir dans le tissu tumoral une activité biologique de la protéine 5HT2B similaire à celle rencontrée dans le tissu normal, toute molécule agoniste inverse de la partie extracellulaire ou intracellulaire du récepteur 5HT2B pouvant induire une absence totale d'activité biologique,
RNAi (double brin), ARN anti-sens susceptibles de bloquer la traduction de l'ARNm du gène HTR2B.
De même, par l'expression «l'activité biologique», on désigne l'activité induite par la protéine 5HT2B sur la prolifération cellulaire des cellules tumorales et sur la capacité invasive de ces mêmes cellules.
Dans le cas des molécules agissant sur la partie intracellulaire du récepteur 5HT2B, l'inhibiteur est synthétisé sous forme intracytoplasmique afin d'inhiber son signal.
Selon un premier mode de réalisation, l'inhibiteur peut être constitué d'une petite molécule. Dans ce cas, l'identification de telles molécules peut être réalisée par un criblage à haut débit ou ciblé de librairies de molécules telles que composés chimiques ou autres (phytothèque....) en présence de la protéine 5HT2B par des techniques bien connues de l'homme du métier, le principe étant d'identifier les molécules se fixant spécifiquement sur le récepteur 5HT2B.
Une technique de criblage avantageuse correspond au binding ou "cell-based assays". Ces tests donnent lieu à l'identification de "Hits" (Touches), c'est à dire de molécules pouvant s'accrocher à 5HT2B avec une bonne affinité. Cet ancrage à 5HT2B ne pouvant pas être déplacé par le ligand naturel. Ces familles de "hits" seront testées pour leur activité sur la prolifération cellulaire, et la capacité invasive des cellules tumorales et subiront par la suite une optimisation chimique afin de donner un "lead".
Les molécules inhibitrices peuvent également être obtenues par des méthodes in silico après détermination des coordonnées atomiques de la protéine 5HT2B, puis criblage d'une librairie de molécules chimiques.
Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention, peuvent être déterminés de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, etc.
De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 1 μg à environ 1 g par prise peut être administrée à des adultes humains.
Dans un second mode de réalisation, l'inhibiteur est un peptide.
Le peptide peut être introduit directement dans l'organisme ou indirectement, par le biais de sa séquence codante, par transfection de cellules.
Dans ce cas, l'acide nucléique codant le peptide peut être associé à un ou plusieurs agents qui améliorent l'efficacité transfectionnelle et/ou la stabilité dudit vecteur et/ou la protection dudit peptide in vivo à l'égard du système immunitaire de l'organisme hôte. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme du métier. A titre illustratif mais non limitatif, il peut s'agir d'un agent
chimique qui modifie la perméabilité cellulaire tel que la bupivacaïne, de liposomes, de lipides notamment catioπiques, de protéines nucléaires ou virales, ou des microparticules de silice, d'or ou de tungstène. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison.
La quantité à utiliser comme médicament dépend notamment de la construction d'acide nucléique elle-même, de l'individu auquel cet acide nucléique est administré, du mode d'administration et du type de formulation et de la pathologie. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 1 g à environ l g par prise peut être administrée à des adultes humains.
Les inhibiteurs peuvent être administrés par toute voie d'administration conventionnelle telle que notamment la voie parentérale ou ceux-ci peuvent être injectés par voie intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes.
Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie. Une administration ciblée au tissu prostatique peut être particulièrement avantageuse.
L'invention concerne également une méthode d'inhibition de la capacité proliférative et invasive de cellules tumorales épithéliales par inhibition des récepteurs 5HT2B, en particulier de cellules tumorales épithéliales prostatiques et plus largement une méthode de traitement du cancer de la prostate selon laquelle, on administre à un patient, une quantité efficace de la composition pharmaceutique précédemment décrite.
Le patient visé est généralement un être humain, mais l'application peut également être étendue à tout mammifère le cas échéant.
L'invention concerne également un procédé de détection in vitro du caractère tumoral de cellules contenues dans un échantillon biologique, selon lequel : - on quantifie les ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans les cellules de l'échantillon biologique, - on quantifie les ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans des cellules saines,
une augmentation de la quantité d'ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans les cellules de l'échantillon biologique par rapport aux cellules saines marquant le caractère tumoral de l'échantillon biologique.
En pratique, l'ARNm du gène HTR2B correspond, comme identifié précédemment, à la séquence SEQ ID 1 . De même, la protéine 5HT2B correspond à le séquence SEQ ID 2 identifiée précédemment.
En tant qu'échantillon biologique, on utilise un échantillon biologique contenant des cellules prostatiques ou autres, en fonction du cancer à traiter.
Le Demandeur a en effet constaté que le caractère tumoral des cellules prostatiques était avéré lorsque la quantité d'ARNm du gène HTR2B ou la protéine 5HT2B dans des cellules tumorales contenues dans un échantillon biologique était au moins 1,5 fois supérieure à celle trouvée dans des cellules saines.
L'expression "cellules prostatiques" recouvre au sens de l'invention non seulement les cellules prostatiques mais également les cellules métastasées, en particulier les cellules cancéreuses d'origine prostatique ayant envahi les ganglions lymphatiques, les os.
La quantification des ARNm du gène HTR2B ou de la protéine 5HT2B dans les cellules, par exemple d'origine prostatique, peut être effectuée par différentes techniques connues de l'homme du métier.
En particulier et dans un premier mode de réalisation, la quantification des ARNm du gène HTR2B dans les cellules de l'échantillon biologique, par exemple les cellules prostatiques, est effectuée par RT-PCR à partir d'ARN extraits des cellules prostatiques contenues dans l'échantillon biologique. Les amorces utilisées dans cette technique sont spécifiques du gène HTR2B, ce qui signifie qu'elles s'hybrident spécifiquement avec la séquence SEQ TD 1 ou son complémentaire dans des conditions d'hybridation appropriées usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans des conditions stringentes.
Les amorces utilisées sont des acides nucléiques qui comportent au minimum 17 nucleotides, de préférence au moins 20 nucleotides et moins de 27 nucleotides. Avantageusement, elles correspondent aux séquences SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6. L'homologie des amorces avec les sus-nommées séquences est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence tel que OLIGO4S ou PRIMER-EXPRESS et la spécificité de ces séquences est déterminée par des logiciels d'analyse de séquence tel que BLASTN (Altschul et a , 1990), FASTA (Pearson et al, 1988) ou encore DNASIS (Hitachi Software Engineering America Ltd.).
Les conditions de stringence d'une hybridation entre deux acides nucléiques sont définies par rapport à la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81 ,5 + 0,41 (%G+C) + 16,6 log(concentration en cations) - 0,63(%formamide) - (600/nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm peut être définie de façon approximative par la relation : Tm = 4(G+C) + 2(A+T).
Il est communément admis par l'homme du métier que dans des conditions d'hybridation stringentes, conditions dans lesquelles les séquences aspécifiques ne s'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation sont de préférence des solutions de force ionique élevée comme par exemple une solution 6xSSC.
Dans un second mode de réalisation, la quantification des ARNm du gène HTR2B dans les cellules de l'échantillon biologique, par exemple les cellules prostatiques est effectuée par Northern Blot. Les sondes utilisées sont des acides nucléiques comportant au minimum 10 nucleotides, préférentiellement au moins 20 nucleotides, préférentiellement encore au moins 100 nucleotides et qui hybrident spécifiquement avec la séquence SEQ ID 1 ou son complémentaire. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique
usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence elles correspondent à des conditions stringentes telles que définies précédemment.
La quantification de la protéine 5HT2B est effectuée par la mise en contact d'au moins un anticorps dirigé spécifiquement contre au moins 15 aa de SEQ ID2, avec l'échantillon biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre de la protéine 5HT2B et le ou lesdits anticorps et par la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés (Western Blot).
Les anticorps dirigés spécifiquement contre de la protéine 5HT2B utilisés sont des anticorps monoclonaux (BD Pharmingen ).
L'invention concerne également un kit pour la mise en œuvre du procédé précédemment décrit.
Dans le mode de réalisation selon lequel la quantification des ARNm du gène HTR2B est effectuée par RT-PCR ou Northern Blot, le kit comprend :
- les couples d'amorces ou sondes spécifiques du gène HTR2B, en particulier les séquences SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6,
- les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification et d'hybridation.
Dans le mode de réalisation selon lequel la quantification de la protéine 5HT2B est effectuée par test immunologique, le kit contient : - au moins un anticorps spécifique de la protéine 5HT2B, éventuellement fixé sur un support,
- des moyens de révélation de la foπnation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre la protéine 5HT2B et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.
L'invention va maintenant être décrite dans le détail à l'appui des figures annexées.
Figure
Expression de HTR2B au niveau de l'ARN messager dans 18 échantillons prostatiques normaux, 34 tumeurs de prostate cliniquement localisées ( 17 stades pathologiques pT2 et 17 stades pathologiques pT3) et 9 tumeurs prostatiques hormono-indépendantes. L'expression du gène HTR2B dans chaque tissu est exprimée par rapport à l'expression du gène PP1A qui est utilisé comme contrôle endogène (comme décrit dans le texte c l /méthode). L'expression du gène HTR2B a été également normalisée de telle façon que la moyenne d'expression des 18 échantillons prostatiques normaux soit égale à 1.
Figure 2 : Localisation de la protéine 5HT2B par immunohistochimie.
Les échantillons normaux et tumoraux sont coupés et étalés sur lames, puis fixés à l'acétone. Les lames sont incubées avec l'anticorps primaire (BD Pharmingen™), puis l'anticorps secondaire anti-souris couplé à la peroxydase (Novostain Uni versai Quick Kit). La révélation se fait avec le complexe streptavidine/AEC (ZYMED). Les cellules sont ensuite observées grâce à un microscope à fluorescence.
La figure 2 représente une coupe de prostate normale (N) et des coupes de prostate tumorale (T) sur lesquelles l'hybridation a été réalisée avec l'anticorps monoclonal 5HT2B (BD Pharmingen™).
Figure 3 : Activation de la prolifération des cellules par la sérotonine (ligand naturel des récepteurs HTRs) et le composé BW723C86 (agoniste HTR2B et HTR2C). La prolifération des cellules prostatiques CaHPVlO et PC3 est mesurée 24h après traitement par les composés. La sérotonine et le BW723C86 sont ajoutés aux doses indiquées sur le graphique. Les résultats sont exprimés en pourcentage de luminescence, reflétant le nombre de cellules par rapport à la moyenne des duplicats d'échantillons contrôles, ceci pour chaque lignée cellulaire. Les écarts types sont obtenus en tenant compte des valeurs de deux expériences indépendantes réalisées en duplicat.
Figure 4 : Effet in vitro du RS 127445 (antagoniste spécifique du récepteur HTR2B) sur la prolifération des cellules prostatiques CaHPVlO et PC3.
La prolifération cellulaire est mesurée sept jours après traitement par le composé RS 127445 aux doses indiquées sur le graphique. Les résultats sont exprimés en pourcentage de luminescence, reflétant le nombre de cellules par rapport à la moyenne
des duplicats d'échantillons contrôles, ceci pour chaque lignée cellulaire. Les écarts types sont obtenus en tenant compte des valeurs de deux expériences indépendantes réalisées en duplicat.
Figure 5 : Effet in vivo du RS 127445 (antagoniste spécifique du récepteur HTR2B) sur la prolifération des cellules tumorales prostatiques PC3.
L'expérience a été réalisée sur 24 souris immunodéprimées (Swiss nude), greffées avec une suspension cellulaire PC3 en sous-cutané. Le traitement commence au jour 22 après la greffe lorsque la taille de la tumeur atteint 200 mm . Les animaux sont répartis en 4 groupes (n=6 par groupe) homogènes avec des tailles de tumeurs comprises entre 200 et 250 mm3. Un des groupes est traité par le véhicule (Ethanol-propylene glycol-eau) alors que les 3 autres groupes sont traités par des doses croissantes de RS127445 (10 mg/kg, 25 mg/kg et 50 mg/kg). La moyenne du volume tumoral pour les souris d'un même groupe (n=6) est donnée en mm . Deux mesures hebdomadaires de la taille tumorale sont effectuées.
Figure 6 : Comparaison du poids des tumeurs
Après exérèse, le poids des tumeurs issues des greffes ectotopiques pratiquées chez les souris nude est analysé dans chaque groupe. Une inhibition du poids de la tumeur est observée dans les groupes traités avec les doses de RS 127445 à 25 et 50mg/kg.
Figure 7 : Etude par Immunohistochimie de l'état prolifératif des cellules PC3 greffées chez les souris nude
Les échantillons tumoraux issus des cellules PC3 greffées chez les souris nude (comme décrit dans l'exemple 4) sont coupés et étalés sur lames, puis fixés avec un mélange έfhanol (95%) / acide acétique (5%). Les lames sont incubées avec l'anticorps monoclonal primaire de lapin (Interchim), puis l'anticorps secondaire chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase (Santa Cruz). La révélation se fait avec le complexe streptavidine/AEC (ZYMED). Les cellules sont ensuite observées grâce à un microscope à fluorescence.
La Fig 7 représente des coupes de tumeurs après exérèse chez des souris nude non traitées (NT) ou traitées avec le RS 127445 à la dose de 25mg/kg, sur lesquelles
l'hybridation a été réalisée avec l'anticorps monoclonal Ki67 (Interchim), qui rend compte de l'état prolifératif des cellules.
EXEMPLE 1 : analyse de l'expression du gène HTR2B dans les tumeurs prostatiques et lignées prostatiques tumorales
1/ Patients et échantillons
Quarante-trois tumeurs primaires de la prostate ont été analysées. Les échantillons de tumeur proviennent de patients ayant subi une intervention chirurgicale. Trente quatre patients présentaient des tumeurs de la prostate qui ont été localisées cliniquement [limitées à la prostate dans 17 cas (pT2), et présentant une extension extracapsulaire dans 17 cas (pT3)], et 9 présentaient des carcinomes hormono-réfractaires récurrents de la prostate.
2/ Tissus sélectionnés
Les échantillons de tumeur maligne localisée à la glande prostatique (stades pT2 et pT3), ont été obtenus par prostatectomie radicale, alors que ceux des tumeurs hormono- réfractaires ont été obtenus par résection transuréthrale.
Une partie des tissus sélectionnés a été immédiatement placée dans l'azote liquide pour une potentielle extraction des acides nucléiques, alors que les sections adjacentes ont été colorées avec H/E (Hematoxyline et Eosine) et examinées histologiquement dans le service d'anatomopathologie des centres investigateurs. La contre-partie pré-selectionnée (placée dans l'azote liquide) est assujettie à un nouvel examen histologique dans le laboratoire par un anatomopathologiste pour confirmer la malignité de l'échantillon.
Les zones malignes sont par la suite soigneusement disséquées de manière à obtenir une population cellulaire homogène et ainsi éviter toute "dilution" des modifications génétiques spécifiques aux tumeurs avec les acides nucléiques de cellules normales et réactives présentes dans le même échantillon.
Pour ces raisons, un échantillon est considéré comme convenable pour des études moléculaires si toutes les cellules épithéliales sont tumorales. Le diagnostic histologique, le classement clinique basé sur le système TMM et les scores de Gleason (Mellinger et a , 1967; Schroder et al, 1992) ont été déterminés dans chaque cas au cours d'une manipulation après une opération chirurgicale. Neuf étaient des tumeurs hormono-réfractaires alors qu'après un examen pathologique 17 des 34 tumeurs cliniquement localisées étaient des pT2 et 17 étaient des pT3. Les scores de Gleason des aires tumorales sélectionnées ont été établis avant l'extraction : Gleason 4-6 (7 cas), 7 (21 cas) et 8-10 (15 cas).
En supplément d'un pool commercial de tissus prostatiques humains sains (pool commercial ; BD Biosciences Clontech : Human Prostate total RNA, Ref : 64108-1), la contrepartie non tumorale de 18 fragments de tissus prostatiques obtenus après prostatectomie radicale a été utilisée pour déterminer la quantité de référence d'ARNm du gène HTR2B dans un tissu prostatique sain. Ces 18 échantillons de tissu ont été vérifiés et sélectionnés pour leur absence de foyers tumoraux mais également en fonction de leur composition cellulaire (rapport épithélium/stroma) ; en effet, les échantillons à composante stromale majoritaire ont été exclus du fait d'une probable hyperplasie bénigne (HBP) de ces échantillons.
3/ Extraction des ARN et synthèse des ADNc a/ Extraction des ARN Les ARN totaux ont été extraits à partir d'échantillons de tissu en utilisant de l'isothiocyanate de guanidium, du phénol et du chloroforme (Chomczynski & Sacchi, 1987). La qualité des ARN a été contrôlée par electrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium sur la base d'une non-dégradation des ARN 18S et 28S. Les bandes d'ARN 18S et 28S ont été visualisées sous lumière ultra-violette.
h/ Synthèse des ADNc Les ARN ont subi une transcription inverse dans un volume final de 20 μl contenant un tampon RT IX (500 mM de chaque dNTP, 3 mM de MgCl2, 75 mM de KC1, 50 raM de
Tris-HCl à pH 8,3), 10 unités d'inhibiteur de la ribonucléase Rnasin® (Promega,
Madison, Wf), 10 mM de dithiothréitol, 50 unités de transcriptase reverse Superscript II
Rnase H" (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1 ,5 mM d'hexamères aléatoires (Pharmacia, Uppsala, Suède) et 1 μg d'ARN totaux. Les échantillons ont été incubés à 20°C pendant 10 minutes et à 42°C pendant 30 minutes, et la transcriptase reverse a été inactivée par chauffage à 99°C pendant 5 minutes et refroidissement à 5°C pendant 5 minutes.
c/ Real-Time RT-PCR cl/ Méthode Les valeurs quantitatives ont été obtenues à partir du nombre de cycles seuil (Ct) à partir duquel l'augmentation du signal correspondant à une amplification exponentielle du produit PCR commence à être détectée (en utilisant un programme d'analyse Biosystems PE).
La quantité précise d'ARN totaux ajoutée à chaque réaction (basée sur la densité optique) et sa qualité (c'est-à-dire l'absence de dégradation extensive) sont toutes deux difficiles à maîtriser. Par conséquent, les transcrits du gène PPIA codant la peptidylprolyl isomérase A (cyclophiline A) ont été quantifiés comme contrôle d'ARN endogène, puis chaque échantillon a été normalisé sur la base de son contenu en transcrits du gène PPIA.
De nombreux gènes ont été testés en tant que contrôles d'ARN endogène (par exemple le gène codant pour la phosphoprotéine acide ribosomale humaine (RPLP0) ou le gène codant pour la sous-unité ribosomale 18S), le gène PPIA a été retenu du fait de son taux d'expression constant à la fois dans les tissus prostatiques normaux, tumoraux, et les lignées cellulaires prostatiques.
Les résultats d'expression du gène HTR2B appelles N-nτκ2B sont exprimés en différence de N-fois entre l'expression relative du gène HTR2B par rapport au gène PPIA ont été
, , , . _ . -. τ ,-ΔCt échantillon calcules par la formule N-HTR2B = 2 où la valeur Ct de l'échantillon a été déterminée par soustraction de la valeur moyenne (chaque échantillon a été testé deux fois) du Ct du gène HTR2B de la valeur moyenne du Ct du gène PPIA.
Les valeurs de N-HTR2B ont été normalisées de telle sorte que la valeur moyenne N-HTR2B des 18 échantillons de prostate saine corresponde à une valeur de 1.
c2/ Amorces et produits pour la PCR Les amorces ont été choisies avec l'assistance des programmes informatiques Oligo 4 (National Biosciences, Plymouth, MN) et Primer express (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster city, CA). Des recherches BLASTN (Altschul et al, 1990) ont été effectuées contre dbEST et nr (le jeu non-redondant de GenBank, bases de données de séquences EMBL et DDBJ) pour confirmer la spécificité totale des séquences nucléotidiques choisies comme amorces vis à vis des gènes d'intérêt à quantifier. Pour éviter l'amplification d'ADN génomique contaminant, les amorces ont été choisies de telle façon qu'une des amorces soit à cheval entre deux exons.
Les séquences nucléotidiques des amorces sont les suivantes :
HTR2B
1 e' couple
Upper 5'GTGCCATTTCAGTGGATCGTTACATA 3' (SEQ ID 3)
Lower 5'GCCAGTGAGCCAAAGAGCATGA 3 '(SEQ ID 4)
2ύmc couple
Upper 5'GTGGTGTGGTTAATTTCAATAGGCATT 3 '(SEQ ID 5)
Lower 5'CAGCCAGTGAGCCAAAGAGCAT 3 '(SEQ ID 6)
PPIA
Upper 5'- GTC AAC CCC ACC GTG TTC TT-3' Lower 5'-CTG CTG TCT TTG GGA CCT TGT -3'
c3/ Amplification PCR Toutes les réactions PCR ont été effectuées en utilisant un système de détection de séquence Prism ABI 7900 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). La PCR a été effectuée en utilisant le kit de réactifs SYBR® Green PCR Core (Perkin-Elmer Applied
Biosystems). Les conditions au cours des cycles thermiques comprennent une étape
initiale de dénaturation à 95°C pendant 10 minutes et 45 cycles comprenant 15 secondes à 95°C suivies de 1 minute à 65°C. Les expériences ont été effectuées en double pour chaque point de données (échantillons et contrôles).
4/ Résultats
Les niveaux d'expression relative du gène HTR2B ont été quantifiés dans 43 tumeurs prostatiques malignes, 18 tissus de prostate saine, et dans 47 tissus de prostate humaine saine provenant d'un pool de tissus commercialisé (Clontech). Les niveaux d'expression sont déterminés sous la forme de rapports entre le gène HTR2B et le gène de référence PPIA, afin de corriger les variations de quantité d'ARN.
Une augmentation significative de l'expression de HTR2B est observée dans les tumeurs prostatiques par rapport aux tissus normaux ; 26 (60 %) des 43 tumeurs montraient une augmentation d'expression d'au moins un facteur 1,5 (cf. figure 1).
Les résultats obtenus sur les tissus prostatiques sont regroupés dans le tableau 1.
Tableau 1
HTR2B est exprimé dans les lignées prostatiques tumorales LNCaP, DU145, PC3 (American Tissue Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) et dans la lignée prostatique épithéliale, immortalisée par HPV (CaHPVl O). La lignée épithéliale prostatique pNT2 (Berthon et al., 1995) établie à partir d'un échantillon normal prostatique n'exprime pas HTR2B.
EXEMPLE 2 : Essais de prolifération avec la sérotonine et avec le BW723C86
1/ Test de prolifération
Ce test vise à démontrer l'effet prolifératif de la sérotonine sur les cellules tumorales. Les cellules sont ensemencées en plaques 96 puits. Les cellules PC3 (expression endogène de la sérotonine (= 204,1 fmol/cellule) sont ensemencées à raison de 2 000 cellules par puits dans 100 μl de milieu RMPI contenant 5% de SFV et glutamine ( 1 mM). Les cellules CaHPVlO (expression endogène de la sérotonine 15,6 fmol/cellule) sont ensemencées à raison de 5 000 cellules par puits dans 100 μl de milieu RPMI contenant 10%) de SVF, glutamine (ImM) et EGF (lOng/μl). Le lendemain, le milieu des cellules est changé, elles sont mises en présence de leurs milieux respectifs mais sans sérum. La sérotonine (Sigma) et le BW723C86 (Sigma) sont ajoutés à la concentration indiquée. Chaque condition expérimentale est réalisée en duplicat. La prolifération cellulaire est mesurée par le kit Cell Titer Glo (Promega). Le protocole est celui recommandé par le fabricant. Brièvement, 100 μl de tampon reconstitué est ajouté à chaque puits. Les plaques sont placées 2 min en agitation douce, puis incubées 10 min à température ambiante. Le signal luminescent mesuré est proportionnel au nombre de cellules vivantes. Afin d'obtenir un indice de la prolifération des cellules, la fluorescence émise dans les puits ayant subi le traitement, par la sérotonine ou le BW723C86, est rapportée à la fluorescence émise dans les puits contrôles. Les résultats indiqués sont calculés en pourcentage de luminescence par rapport au puits contrôle pour chaque expérience.
2/ Résultats Les cellules CaHPV l O et PC3 sont traitées par des concentrations croissantes de sérotonine et de BW723C86 (Figure 3). La prolifération cellulaire est mesurée 24 heures après traitement. Les résultats indiqués sont la moyenne de deux expériences indépendantes. On observe une augmentation de la prolifération de 10 à 20 % pour les cellules CaHPVl O à des doses allant de 10"5 à 10"9 M de sérotonine. Lorsque les cellules sont traitées par le composé BW723C86, l'augmentation de la prolifération est plus importante. L'effet dose apparaît et atteint son maximum avec 25% d'augmentation de la prolifération, à la concentration de 10"7M de BW723C86. Pour les cellules PC3, on observe un effet dose de la sérotonine sur la stimulation de la prolifération qui est à son
maximum (entre 35 et 45 % d'augmentation), aux concentrations de 10"7M et 10"6M de sérotonine. L'effet du BW723C86 est le plus important à partir d'une dose d'au moins 10 7M, entraînant une augmentation de la prolifération des cellules de 20%. Les tests de prolifération ont été également effectués sur la lignée pNT2, qui ne montrait aucune expression du récepteur en RT-PCR quantitative. Aucun effet de la sérotonine et du BW723C86 sur la prolifération des cellules pNT2 n'a été observé.
EXEM PLE 3 : Inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques par le RS127445
1/ Test d'inhibition de la prolifération
Ce test vise à démontrer l'effet anti-prolifératif de l'antagoniste spécifique du récepteur 5HT2B, RS 127445, sur les cellules tumorales. Comme dans l'exemple 2, les cellules sont ensemencées dans des plaques de culture 96 puits dans lOOμl de RPMI 1640 SLipplémentés avec 5% SVF et ImM glutamine par puits. Vingt quatre heures après l'ensemencement, les cellules sont traitées par le RS127445. La prolifération est mesurée après 1 , 3, 5 et 7 jours de traitement par le RS 127445. Pour les expériences de prolifération avec lecture à 5 et 7 jours, les cellules sont ensemencées à des densités cellulaires inférieures à celles utilisées pour lecture à 1 , 2, et 3 jours afin d'éviter que les cellules arrivent à confluence. Le jour du traitement, le milieu est remplacé par du milieu de culture frais dans lequel a été dilué le composé à la concentration à tester. Les cellules prostatiques LNCaP, DU145, et PC3 sont traitées par des concentrations croissantes de RS 127445 (1 , 10, 50 et lOOμM). Les cellules prostatiques pNT2 qui n'expriment pas le récepteur HTR2B sont également traitées par des concentrations croissantes de RS127445 (5, 25 et 50μM) et utilisées comme contrôle négatif. Dans certains puits (contrôles), seul le solvant du RS127445 est ajouté. Pour les traitements à 5 et 7 jours, le milieu est renouvelé également à 4 jours par du milieu frais contenant le composé à la concentration testée. La révélation se fait par ajout de l Oμl d'Uptiblue (Interchim) dans chaque puits. Après une incubation de 3 heures à 37°C, la fluorescence est mesurée (Ex560/Em590). La fluorescence est proportionnelle au nombre de cellules vivantes dans les puits. Afin d'obtenir un indice de la prolifération des cellules, la fluorescence émise dans les puits ayant subi le traitement par le RS 127445 est rapportée à la fluorescence émise dans les
puits contrôles. Les résultats sont donnés en pourcentage de prolifération par rapport au contrôle.
2/ Résultats L'effet du RS 127445, composé antagoniste spécifique du récepteur 5HT2B, est testé sur la prolifération des cellules LNCaP, DU145, PC3 et pNT2. La spécificité du RS127445 pour le récepteur 5HT2B est donnée par la constante d'inhibition (Ki) qui est de lnM pour ce récepteur alors qu'elle est de 4000, 500, 400, >300 pour respectivement 5HT1A, 5HT2A, 5HT2C et 5HT7. La prolifération des cellules est mesurée au jour 1, 3, 5, 7 après traitement. Dans les conditions expérimentales précédemment décrites, au jour 7 une dose de 25μM de RS127445 entraîne une diminution de la prolifération des cellules LNCaP, DU145 et PC3 de 50% (1C50). Un effet dose du RS127445 sur l'inhibition de la prolifération est observé : l'inliibition de la prolifération est d'autant plus importante que la dose de RS127445 est grande. L'effet le plus important est observé au jour 7 avec une dose de lOOμM. Dans ces conditions l'inliibition varie entre 90 à presque 100% suivant les lignées (LNCaP et PC3, respectivement). Les tests d'inhibition de la prolifération par le RS127445 ont été également effectués sur la lignée PNT2, qui ne montrait aucune expression du récepteur en RT-PCR quantitative. Aucun effet du RS127445 sur l'inhibition de la prolifération des cellules PNT2 n'a été observé. Les résultats obtenus sont représentés Figure 4. Les valeurs du graphique sont la moyenne de duplicats réalisés dans les mêmes conditions expérimentales.
EXEMPLE 4: Inhibition par le RS127445 de la croissance de la tumeur PC3 implantée chez la souris immunodéprimée nude
1) Matériel et méthodes
L'expérience a été réalisée sur des souris immunodéprimées (Swiss nude) adultes d'environ 30g (5 semaines d'âge à leur arrivée). Pendant toute la durée expérimentale, ces animaux ont été maintenus dans les conditions standards d'animalerie (Cycle lumière 12h/12h, granulés et eau ad libitum et niveau de confinement P2). Vingt quatre souris nude ont été greffées avec une suspension cellulaire PC3 (2.106 cellules+ Matrigel), en sous-cutané sur le flanc droit. La mesure de la taille tumorale et le poids corporel sont contrôlés périodiquement. Le traitement commence au jour 22 après la
greffe lorsque la taille de la tumeur atteint 200 mm . Les animaux sont répartis en 4 groupes (n=6 par groupe) homogènes avec des tailles de tumeurs comprises entre 200 et 250 mm' .
L'homogénéité est vérifiée en tenant compte de la moyenne et de l'écart-type des groupes. Un des groupes est traité par le véhicule (Ethanol-propylene glycol-eau) alors que les 3 autres groupes sont traités par des doses croissantes de RS 127445 (10 mg/kg, 25 mg/kg et 50 mg/kg). Le traitement consiste en 5 applications par semaine dans la cavité intra-péritonéale (i.p.) et ce pendant 5 semaines avec un volume d'injection de 200 μl/souris. Deux mesures hebdomadaires de la taille tumorale, du poids corporel et de la consommation alimentaire des animaux sont effectuées.
Il Résultats a-Santé animale: Le poids des souris et la prise alimentaire Une perte de poids corporel de 2 grammes a été observée lors de la première semaine de traitement avec le RS 127445 et ce pour toutes les doses utilisées. Toutefois, cette perte de poids s'est stabilisée par la suite lors du traitement et n'a plus varié jusqu'à 5 semaines de traitement. Une perte de poids équivalente a été également observée dans le groupe de souris non traitées reflétant le développement de la maladie. De plus, cette perte de poids n'a pas affecté la santé des animaux en expérimentation; ceci est confirmé par l'aspect des animaux et leur prise alimentaire.
b-Evolution de la croissance tumorale:
Une inhibition significative de la croissance tumorale est observée à partir du 9 jour de traitement dans les groupes traités par le RS127445. Cette inhibition de la croissance tumorale en fin de traitement est de 22%, 38%, et 55%o pour les doses respectives de 10 mg/kg, 25 mg/kg et 50 mg/kg. L'évolution de la croissance tumorale dans les différents groupes est illustrée à la Figure 5. Cette étude statistique utilise ANOVA et le test Tukey pour des comparaisons multiples fait sur la moyenne, n=6 (±SEM) de la croissance tumorale de chaque groupe expérimental. La comparaison de la croissance tumorale entre les groupes correspond à 13 mesures du volume tumoral (2 par semaine) et à 35 jours de traitement.
c-Comparaison du poids des tumeurs: Une inhibition du poids de la tumeur est observée dans les groupes traités, en accord avec les observations sur l'évolution de la croissance tumorale (Figure 6).
d-Etat prolifératif des cellules PC3 greffées chez les souris nude par
Immunohistochimie:
Les échantillons tumoraux issus des cellules PC3 greffées chez les souris nude sont coupés et étalés sur lames, puis fixés avec un mélange éthanol (95%> )/acide acétique
(5%). Les lames sont incubées avec l'anticorps monoclonal primaire de lapin (Interchim), puis l'anticorps secondaire chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase (Santa Cruz). La révélation se fait avec le complexe streptavidine/AEC (ZYMED). Les cellules sont ensuite observées grâce à un microscope à fluorescence. Les souris nude non traitées par le RS 127445 présentent des tumeurs dont le pourcentage de noyaux marqués par le ki67, corrélé au nombre de cellules en prolifération, est de l'ordre de 10% ce qui est en accord avec la littérature. L'état prolifératif des cellules PC3 greffées chez les souris nude traitées avec le RS127445 présentent des tumeurs dont le pourcentage de noyaux marqués par le ki67 varie entre 0 et 5 %ι. Le pourcentage de noyaux marqués est d'autant plus faible que la dose de RS 127445 utilisée est forte. Ces résultats confirment l'inhibition de la prolifération des cellules prostatiques par l'inhibiteur spécifique HTR2B, résultats observées in vivo par une diminution de la taille de la tumeur chez la souris nude. Un exemple des résultats obtenus est donné Figure 7.
REFERENCES
AltschuI S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, and D.J. Lipman Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. (1990) : 215, 403-410.
Berthon P, Cussenot, O., Hopwood, L, Le Duc A, and Maitland, NJ Functional expression of SV40 in normal human prostatic épithélial and fibroblastic cells: differentiation pattern of non-tumorigenic cell lines. lnt J Oncol 1995;6:333-343.
Bonhaus D.W., Flippin L.A., Greenhouse R.J., Jaime S., Rocha C, Dawson M., Chang L.K., Pulido-Rios T., Webber A. Leung E., Eglen R.M., Martin G.R. RS- 122445: a sélective, high affinity, orally bioavailable 5-HT2B receptor antagonist. Br. J. Pharmacol. (1999) : 127(5), 1075-82.
Chomczynski & Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. (1987), 162(1) : 156-159. Pearson W.R., Lipman D.J.; Improved tools for biological séquence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85:2444-2448.
Culig Z., Hobisch A., Cronauer M., Radmayr C, Hittmair A., Zhang J., Thurnher M., Bartsch G, Klocker H. Régulation of prostatic growth and function by peptide growth factors. The Prostate (1996), 28 (6) : 392-405. Mellinger GT., Gleason D. & Bailar JIII. J. Urol(\961), 97 : 331 -337
Pearson W.R., Lipman D.J.; Improved tools for biological séquence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85:2444-2448. Sambrook J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.
Second Edition. Ed. Chris Nolan. Cold Spring Harbor Laboratory Press (USA).
Schroder FH., Hermanek P., Denis L., Fair WR., Gospodarowicz MK., Pavone- Macaluso M., The Prostate (1992), Suppl. 4 : 129-138.