WO2001065264A1 - Cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, et leur utilisation pour l'obtention de marqueurs de la trisomie 21 - Google Patents

Cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, et leur utilisation pour l'obtention de marqueurs de la trisomie 21 Download PDF

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culture
trisomy
protein
cultures
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Danièle EVAIN-BRION
Jean-Louis Frendo
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • G01N2800/387—Down syndrome; Trisomy 18; Trisomy 13

Definitions

  • the invention relates to cultures of trisomy 21 cytotrophoblasts, and to their uses.
  • Trisomy 21, responsible for Down syndrome more commonly known as mongolism, is the most common autosomal trisomy since it is observed on nearly 1 in 800 newborns during childbirth [FERGUSON-SMITH et al., Prenat. Diagn. , 4, 5-44, 1984)]. It is the major genetic cause of mental retardation [CUNNINGHAM et al., Williams Obstetrics, ed. 19, 919-938, (1993)].
  • the prenatal diagnosis of trisomy 21 is essentially based on the establishment of the fetal karyotype, an examination practiced most often on fetal cells of the amniotic fluid collected by amniocentesis, more rarely on the trophoblastic cells taken by biopsy of the cho ⁇ al villi.
  • VAN-LITH Prenat. Diagn., 12, 495-504, (1992)].
  • this screening method is called "triple test”.
  • the present invention aims to provide new means of studying cellular and molecular dysfunctions occurring during placental development in trisomy 21, as well as new markers of trisomy 21.
  • the inventors have put in culture cytotrophoblastic cells from normal placentas and placentas with fetal trisomy 21.
  • the cytotrophoblastic cell is the key cell of the human placenta. It is differentiated m vi tro and m if you at the placental level as a syncytiotrophoblast.
  • the syncytiotrophoblast is the endocrine tissue of the human placenta. It produces steroid and polypeptide hormones at very high rates (several grams per day).
  • the cytotrophoblasts isolated and purified from the normal placenta aggregate then merge to form the syncytiotrophoblast.
  • This highly polarized cell secretes m vi tro into the culture medium the hormones which it normally pours into the maternal circulation.
  • the inventors have isolated, purified and cultured cytotrophoblasts from trisomy 21 placentas to all terms of pregnancy, and have compared their development, as well as their ability to express and secrete different peptide hormones, with that of normal cytotrophoblasts.
  • transformed cytotrophoblasts overexpressing copper and zinc-dependent superoxide dismutase (Cu / Zn SOD), exhibited the same abnormalities in syncytiotrophoblast formation, and decreased production of hCG ⁇ , the hCG ⁇ , hPL, and PGH.
  • Cu / Zn SOD gene is carried by the long arm of chromosome 21, and this enzyme is one of those that are overexpressed in subjects with Down's syndrome.
  • the subject of the present invention is a culture of cytotrophoblasts, characterized in that said cytotrophoblasts are trisomal for human chromosome 21, or for a region thereof comprising at least the gene coding for Cu / Zn superoxide dismutase, and in that '' they express after 3 days of culture at least one peptide hormone chosen from human placental lactogen (hPL), the human cho ⁇ onic gonadotroph
  • hCG human cho ⁇ onic gonadotrophm ⁇
  • PGH human placental growth hormone
  • normal cytotrophoblasts is understood here to mean cytotrophoblasts having a normal karyotype, and which are capable of forming a syncytiotrophoblast when cultivated in vitro.
  • Cytotrophoblast cultures according to the invention can be obtained from trisomy 21 placentas, by enzymatic digestion in several stages, followed by purification on a Ficoll gradient.
  • the cells thus isolated can then be cultured in a conventional manner, according to the techniques usually used for cultures of normal cytotrophoblasts.
  • Cytotrophoblast cultures according to the invention can be used as an in vitro model to study the anomalies of differentiation of the syncytiotrophoblast in trisomy 21, for example cell fusion anomalies.
  • the cultures of cytotrophoblasts in accordance with the invention can be used to identify and characterize biological molecules, in particular proteins, released into the blood maternal by placentas of fetuses with Down's syndrome, and quantitatively and / or qualitatively different from the biological molecules released into maternal blood by placentas of normal fetuses, and thus being able to constitute markers of Down's syndrome.
  • cultures of cytotrophoblasts in accordance with the invention can be used for obtaining differential expression libraries of nucleic acids between normal cytotrophoblasts and trisomal cytotrophoblasts for chromosome 21, and / or between trisomal cytotrophoblasts for chromosome 21 at different stages of culture.
  • the present invention thus encompasses differential expression libraries of nucleic acids obtained using at least one culture of cytotrophoblasts according to the invention.
  • Such libraries can consist, for example: of a population of total or partial cDNA sequences of genes expressing themselves in the cytotrophoblast cultures according to the invention, and not expressing themselves in the cytotrophoblast cultures normal to same stage of syncytiotrophoblast formation; a population of total or partial cDNA sequences of genes not expressing themselves in the cultures of cytotrophoblasts in accordance with the invention, and expressing themselves in cultures of normal cytotrophoblasts at the same stage of formation of the syncytiotrophoblast; of a population of total or partial sequences of cDNAs of genes whose expression is greater in the cultures of cytotrophoblasts according to the invention than in the cultures of normal cytotrophoblasts at the same stage of formation of the syncytiotrophoblast; a population of total or partial sequences of cDNAs of
  • Differential expression libraries of nucleic acids according to the invention can be obtained by methods known in themselves to those skilled in the art.
  • methods such as DDRT-PCR [LIANG and PARDEE, Science, 257, 967-971, (1992)], subtractive hybridization [JIANG and FISHER, Mol. Cell. Different., 1, 285-299, (1993)], RAP-PCR [MCCLELLAND and WELSH, PCR Methods & Applications, 4, S66-81, (1994)], SAGE analysis [VELCULESCU et al., Science , 270, 484-487, 1995], and their different variants. They can then be used in particular to identify, characterize and clone genes involved in abnormalities in the differentiation of the syncytiotrophoblast, and / or to study the regulatory mechanisms of these genes.
  • Cytotrophoblast cultures in accordance with the invention can also be used to study the expression and / or differential secretion of proteins during the various stages of syncytiotrophoblast formation, by comparing their expression and / or secretion profiles. proteins with those of normal cytotrophoblast cultures, or with those of other cytotrophoblast cultures according to the invention, at another stage of development or cultivated under different conditions.
  • the comparison can be carried out on total proteins, or on protein subpopulations, for example on intracellular proteins or on those secreted in the culture medium, on glycosylated proteins or on those which are not, etc. .
  • the glycosylation or the absence of glycosylation of a protein can for example be detected by isoelectric focusing; according to their glycosylation (in particular their sialic acid content), the different glycoforms will migrate until they arrive in a pH zone corresponding to their isoelectric point; this isoelectric focusing profile can be compared with that obtained after treatment with an enzyme (for example neurammidase or mannosidase) which hydrolyzes the glycans.
  • Glycosylated proteins can also be detected by affinity electrophoresis on a gel containing a lectme; the glycoforms are separated according to their affinity for lectme.
  • Proteins separated on gel can for example be detected by conventional staining or by immunodetection after transfer to nitrocellulose, and their quantity can be evaluated by densitometry. The proteins for which differential expression is observed can then be purified from the gels to complete their identification and characterization.
  • the proteins in the culture medium can also be analyzed by chromatography. For example, to detect and / or quantify glycosylated proteins, it is possible to perform affinity chromatography on lectme.
  • the comparison of the expression of mRNAs and of the secretion of proteins in cultures of cytotrophoblasts in accordance with the invention and in cultures of normal cytotrophoblasts enabled the inventors to identify proteins which may constitute serum markers for Down's syndrome.
  • the inventors have in fact found that the synthesis of certain peptide hormones, which is very important in the cultures of normal cytotrophoblasts, at the time of the formation of the syncytiotrophoblast, was very weak in the cultures of cytotrophoblasts in accordance with the invention. These serum hormones should therefore be present in smaller quantities in the serum of women with a Down's syndrome fetus than in that of women with a normal fetus.
  • hCG which is one of the peptide hormones whose expression is reduced in Cytotrophoblast cultures according to the invention is, on the contrary, known to be present in a greater quantity in the serum of women carrying a trisomic fetus 21 than in that of women carrying a normal fetus.
  • the proteins which are produced by the cytotrophoblasts in non-glycosylated form will, if they are produced in less quantity, also present in smaller quantity in the serum of women carrying a fetus with Down's syndrome than in that of women carrying a normal fetus, whereas on the contrary the proteins produced in glycosylated form, like hCG, will be glycosylated abnormally in the cytotrophoblasts trisomiques 21, and even if they are produced in smaller quantity, will be found in more quantity important in maternal blood.
  • the inventors carried out the assay, in sera of women carrying a trisomic fetus 21 and in sera of women carrying a normal fetus, 1 hCG and another glycosylated hormone, l growth hormone, as well as that of the following hormones: human placental lactogen (hPL) and leptm, which are not produced by cytotrophoblasts in glycosylated form.
  • hPL human placental lactogen
  • leptm which are not produced by cytotrophoblasts in glycosylated form.
  • the subject of the present invention is a method for detecting a risk of trisomy 21 in a fetus, characterized in that it comprises the measurement, in a sample of a biological fluid obtained from the mother, of at least one protein chosen from:
  • non-glycosylated proteins secreted by a culture of cytotrophoblasts according to the invention in a smaller amount than by a culture of normal cytotrophoblasts; - the non-glycosylated proteins secreted by a culture of cytotrophoblasts in accordance with the invention in greater quantity than by a culture of normal cytotrophoblasts; glycosylated proteins, secreted by a culture of cytotrophoblasts according to the invention, with the exception of hCG.
  • Proteins "secreted by a culture of cytotrophoblasts according to the invention in a smaller amount than by a culture of normal cytotrophoblasts” also include proteins which are not secreted by cytotrophoblasts according to the invention but are secreted by normal cytotrophoblasts .
  • proteins "secreted by a culture of cytotrophoblasts according to the invention in greater quantity than by a culture of normal cytotrophoblasts” also include proteins which are secreted by cytotrophoblasts according to the invention but are not by normal cytotrophoblasts.
  • biological liquid is meant in particular serum and urine.
  • the assay of said non-glycosylated protein will preferably be carried out from a serum sample. Proteins that can be used can be easily identified by those skilled in the art, by comparing the protein secretion profiles of the 2 cultures, and / or by detecting glycosylation or the absence of glycosylation, as indicated above.
  • a separate dose of one or more of said proteins different from the average dose encountered in women carrying a normal fetus indicates a risk of Down's syndrome in the fetus.
  • a dose of said protein greater than the average dose encountered in women with a normal fetus indicates a risk of Down's syndrome in the fetus.
  • cytotrophoblastic cell expressed secreted proteins such as: IGF 2 , Thymosme beta 10, Calgranulme B, "Macrophage colony stimulatmg factor”, “C. reactive protem precursor ", EGF,” FMLP-related receptor 1 ", small cytok e mductible A 5, IGF BPi,” Hepatocyte growth factor like protem “, PDGF, and some of the IL-1 mterleukmes IL-18. They also found that cytotrophoblastic cells expressed the precursor of the amyloid peptide (APP). They also observed that this expression was much greater in the cultures of cytotrophoblasts according to the invention than in the cultures of normal cytotrophoblasts.
  • APP amyloid peptide
  • the precursor of the amyloid peptide is a transmembrane protein (SWISS-PROT access number:
  • P05067) the extracellular domain of which is released in soluble form after proteolytic cleavage by an ⁇ -secretase activity (release of a soluble protein comprising the amino acids 18-699 of APP) or by a ⁇ -secretase activity (release of a soluble protein comprising amino acids 18-671 of APP), (for review, see OCTAVE et al., Medicine / Sciences, 11, 1251-1259, 1995).
  • the extracellular domain of the APP protein, or fragments thereof therefore appears usable, in accordance with the invention, as maternal serum markers of trisomy 21.
  • the inventors have also identified hPL and leptm, among the non-glycosylated proteins secreted by normal and non-secreted cytotrophoblast cultures, or secreted in less quantity, by the cytotrophoblast cultures in accordance with the invention. They also identified 1 mterleukme 13, among the glycosylated proteins secreted by the cultures of cytotrophoblasts in accordance with the invention. This protein is not secreted by normal cytotrophoblasts.
  • the method according to the invention comprises the assay, in a biological sample obtained from the mother, of at least one protein chosen from glycosylated proteins secreted by a culture of cytotrophoblasts in accordance with the invention, and at least one protein chosen from non-glycosylated proteins secreted by a culture of cytotrophoblasts according to the invention.
  • said glycosylated protein can be for example hCG, placental growth hormone, the extracellular domain of APP protein or any other glycosylated protein secreted by cultures of cytotrophoblasts in accordance with l 'invention.
  • Glycosylated proteins which can be used can be easily identified by a person skilled in the art, from the protein secretion profile of a cytotrophoblast culture according to the invention, by detecting glycosylation or the absence of glycosylation, as indicated above.
  • the dosage of the selected proteins is carried out according to the usual methods, known in themselves. same to those skilled in the art.
  • immunoassay methods can be used, using antibodies directed against the protein concerned.
  • suitable antibodies are available commercially, or can readily be obtained by conventional techniques, from purified preparations of these proteins.
  • suitable antibodies can be obtained, for example, from proteins eluted from two-dimensional gels. These antibodies can then be used to purify larger quantities of the protein concerned from cytotrophoblast cultures.
  • the detection method according to the invention can be implemented in addition to another method of detecting trisomy 21, for example in addition to an assay method using other serum markers, or a method of detection by ultrasound.
  • hPL which constitutes a very discriminating marker from the 19 th week of gestation.
  • EXAMPLE 1 OBTAINING TRISOMY CYTOTROPHOBLAST CULTURES 21 Collection of placental tissues:
  • Placental tissue samples were taken during abortion for abnormalities severe fetal, between 12 and 35 weeks of gestation, either in cases of trisomy 21 detected by karyotype, or as a control, in cases of fetal malformation without karyotype anomalies.
  • the samples were taken in accordance with the provisions of French law for the consent of the patients concerned.
  • HBSS balanced solution of HANK
  • Cytotrophoblast cells were isolated by trypsin-DNAse digestion, using the protocol described by KLIMAN et al. [Endocrmology, 118, 1567-1582, (1986)], modified as follows:
  • the digestion is carried out using an enzymatic preparation prepared extemporaneously, and comprising 0.5% (w / v) of trypsm powder (DIFCO), 5 IU / ml of DNAsel (SIGMA, 375000 U, 2600 Kunitz u / mg solid), 25 mM HEPES, 4.2 mM MgS0 4 and 1% (w / v) penicillin / streptomycin, in HBSS.
  • DIFCO trypsm powder
  • SIGMA 5 IU / ml of DNAsel
  • SIGMA DNAsel
  • 25 mM HEPES 4.2 mM MgS0 4
  • 1% (w / v) penicillin / streptomycin in HBSS.
  • the minced villi are covered with this preparation; after 30 mm. digestion at 37 ° C, the liquid is discarded and replaced by a fresh enzyme preparation. A further 25 min incubation is carried out, at the end of which the liquid is discarded and again replaced by a fresh enzymatic preparation. 5 digests are then carried out successively, each time using a fresh enzymatic preparation: 1 digestion of 20 min., 1 digestion of 15 mm. and 3 digests of 10 mm. The liquids from the last 5 digests are stored and collected, then fractionated on a discontinuous Percoll gradient of 10 to 70%.
  • a homogeneous population of mononuclear cells is thus obtained. After centrifugation, the cell pellet is taken up in 4 ml of DMEM medium. These 4 ml are deposited on the gradient comprising more than 90% of viable cytotrophoblastic cells [ALSAT et al. , J. Clin. Encodocrmol. Metab., 73, 288-294, (1991)].
  • the cells are cultured in dishes 60 mm in diameter (3 ⁇ 10 6 cells per dish, in 3 ml of DMEM medium, supplemented with 25 mM of HEPES, 2 mM of glutam, 20% of fetal calf serum inactivated by heat, and in the presence of antibiotics (100 IU per ml of penicillin and 100 ⁇ g per ml of streptomycin).
  • the cultures are maintained at 37 ° C. in a humid atmosphere: 95% air
  • Modified Eagle Medium in the presence of 25mM HEPES, 2mM glutam, 20% heat-inactivated fetal calf serum, and in an atmosphere consisting of 95% air and 5% C0 2 .
  • the cytotrophoblasts isolated from the control placentas aggregate, then after 24 to 48 hours, fuse and differentiate into syncytiotrophoblasts.
  • Cytotrophoblasts isolated from trisomy 21 placentas remain aggregated in culture dishes. After 3 to 4 days of culture, only very few syncytiotrophoblasts are observed.
  • An anti-desmoplaqum or anti-E-cadherm monoclonal antibody, diluted to l / 400 th (SIGMA) is then applied to the treated cells, and the antigen-antibody complex is revealed by anti-mouse goat immunoglobulins, fluorescently labeled. (SIGMA).
  • desmoplaqume and E-cadherme are absent from normal syncytiotrophoblasts, but present at mtercellular contacts in cultures of trisomy 21 cytotrophoblasts.
  • EXAMPLE 2 CHARACTERIZATION OF THE EXPRESSION AND SECRETION OF PROTEINS IN CULTURES OF TRISOMY CYTOTROPHOBLASTS Study of transcription
  • Total RNA is extracted from cytotrophoblast cultures after 24, 48 or 72 hours using _t QIAGEN, following the manufacturer's protocol.
  • Human placental lactogen (hPL), human choonic gonadotrophm ⁇ (hCG ⁇ ), human chorionic gonadotrophm ⁇ (hCG ⁇ ), human placental growth hormone (PGH), and leptm mRNAs are quantified as described below, from total RNA in solution, previously transcribed inversely into cDNA.
  • the cDNA is amplified by RT-PCR in real time using the TaqMan ⁇ method (PE Applied Biosystems). This method is based on the use of the 5 '3' exonuclear activity of the Taq polymerase in order to digest a labeled probe hybridized to a target sequence, during the extension phase of a PCR amplification.
  • the labeling of the probe is designed so that its digestion generates a fluorescent signal.
  • the parameter C ⁇ (cycle threshold) is defined as the number of cycles for which the fluorescence generated by the digestion of the probe exceeds a threshold fixed beforehand; this number is lower the higher the initial quantity of the target molecule.
  • the quantity of each target sequence in samples of unknown composition is thus determined by measuring C ⁇ and using a calibration curve to determine the initial quantity of the target sequence.
  • the primers used for reverse transcription, as well as the amplification primers and the detection probes are chosen from the nucleic sequences of hPL), of hCG ⁇ , of hCG ⁇ , of PGH and of leptum. available on the databases, using OLIGO 4.0 (NATURAL BIOSCIENCES) and Primer express (PERKIN-ELMER BIOSYSTEMS) software. Their specificity, and the absence of polymorphism was verified by research using BLASTN
  • the standard curve was established using series of 10 in 10 dilutions of cDNA obtained by reverse transcription from 1 ⁇ g of total RNA extracted from placenta collected during the 1 st trimester of pregnancy.
  • an internal control was carried out by quantification of transcripts of the PPIA gene (coding for human peptidyl prolyl isomerase A), and each sample was normalized on the basis of its PPIA content.
  • the quantity of target RNA to be quantified and that of the control PPIA RNA was determined from the standard curve. Then, the amount of target RNA was divided by the amount of PPIA RNA to obtain the normalized value.
  • the concentration of hCG in the culture media was determined by an ELISA test (VITAS system, BIOMERIEUX) following the protocol indicated by the manufacturer.
  • the detection sensitivity of this test is 2 mU / ml.
  • the concentration of secreted hPL was determined using the IRMA AMERLEX hPL kit, (AMERSHAM) in concentrated medium 4 times. The sensitivity of the test is 0.5 ⁇ g / ml). HPL has also been detected from cell lysates of cytotrophoblasts. The solubilized proteins (5 ⁇ g) were revealed after electrophoresis and transfer to nitrocellulose using a polyclonal rabbit antibody directed against 1 hPL and diluted to 250 erae (DACO, FRANCE). The band corresponding to 1 hPL is revealed by chemiolummescence (PIERCE SUPERSIGNAL, INTERKIM, FRANCE) after incubation with an anti-lapm antibody coupled to peroxidase.
  • chemiolummescence PIERCE SUPERSIGNAL, INTERKIM, FRANCE
  • the leptm was measured in concentrated medium 4 times using the RIA kit “Sensitive Human Leptm RIA Kit” (LINCO, ST LOUIS, USA).
  • the sensitivity of the assay is 0.5 ng / ml.
  • FIGS. 1A and 1B show the expression of the mRNAs of 1 hCG ⁇ and 1 hCG ⁇ during the differentiation of cytotrophoblasts isolated from control placentas (N) and trisomy 21 placentas (T21) and cultured for 24 h, 48 h or 72 h.
  • Figure 1C illustrates the secretion of hCG by control cells (N) or T21 cells after 24 h, 48 h or 72 h of culture. In normal placental cell cultures, the level of transcripts of the hCG ⁇ subunit increases by more than 10 3 times between cytotrophoblast and differentiated syncytiotrophoblast m vi tro. Likewise, the secretion of ⁇ hCG gradually increases in the culture medium. In cultures of T21 placenta cells, the level of transcripts and hCG secretion are decreased.
  • Figures 2A to 2C illustrate the expression of
  • FIG. 2A illustrates the level of transcription, expressed as a normalized amount of mRNA.
  • Figure 2B illustrates the secretion of hPL in the culture medium, expressed in ⁇ g / ml.
  • Figure 2C shows the detection of intracellular hPL after immunoelectrophoretic transfer. In T21 cells, we do not detect after
  • Figure 3 illustrates the expression of leptm (Figure 3A) and PGH (Figure 3C) mRNAs, as well as leptm secretion (Figure 3B) during differentiation of cytotrophoblasts isolated from control placentas (N) or of T21 placentas grown for 3 days.
  • hPL is not detectable in trisomy 21 cells, whereas it is present in normal cells.
  • the secretion of PGH in the culture medium has not been measured since it is known that this secretion is inhibited by glucose, which is present in this medium.
  • the transcription of the hCG ⁇ , hCG ⁇ , PGH, hPL, and leptm genes was measured during placental ontogenesis, using the protocol described above, in samples of normal placentas and T21. the results obtained indicate that throughout pregnancy, the transcription of these genes is much lower in the placentas of trisomy 21 than in normal placentas.
  • hPL The assay is carried out on serum.
  • the test portion is adapted according to the stage of pregnancy (at the start of pregnancy 200 ⁇ l, at the end of pregnancy 20 ⁇ l).
  • the Assay is carried out using the AMERLEX-hPL-IRMA IRMA Kit (Ortho Clmical Diagnostics, United Kingdom).
  • Each serum is dosed in duplicate with a precision on the mter-series measurement ranging from 5.9% to 10% coefficient of variation.
  • the concentration range is
  • the detection limit of the test is
  • the assay is carried out on serum.
  • the test portion is 100 ⁇ l.
  • the assay is performed using the RIA Human Leptm RIA KIT assay (Linco, USA).
  • Each serum is dosed in duplicate with a precision on the mter-series measurement ranging from 3.3% to 8.9% of coefficients of variation.
  • the concentration range is from 0.5 to 100 ng / ml.
  • the detection limit is 0.1 ng / ml
  • the assay is carried out on serum.
  • the test portion is 100 ⁇ l.
  • the assay is carried out using the hPGH IRMA kit (BC1017) BIOCODE.
  • Each serum is dosed in duplicate with a precision on the mter-series measurement ranging from 5.5% to 7.9% of coefficients of variation.
  • the concentration range is from 1 to 180 ng / ml.
  • the detection limit is 0.2 ng / ml.

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Abstract

L'invention est relative à des cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21. Des protéines sécrétées différentiellement par ces cultures et par des cultures de cytotrophoblastes normaux sont notamment utilisables comme marqueurs de la trisomie 21.

Description

CULTURES DE CYTOTROPHOBLASTES DE TRISOMIE 21, ET LEUR UTILISATION POUR L'OBTENTION DE MARQUEURS DE LA TRISOMIE 21
L'invention est relative à des cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, et à leurs utilisations. La trisomie 21, responsable du syndrome de Down plus communément appelé mongolisme, est la plus fréquente des trisomies autosomiques puisque l'on observe sur près de 1 pour 800 nouveau-nés lors de l'accouchement [FERGUSON-SMITH et al., Prenat . Diagn. , 4, 5-44, 1984)]. C'est la cause génétique majeure de retard mental [CUNNINGHAM et al., Williams Obstetrics, éd. 19, 919-938, (1993)].
Le diagnostic prénatal de la trisomie 21 repose essentiellement sur l'établissement du caryotype fœtal, examen pratiqué le plus souvent sur les cellules fœtales du liquide amniotique recueilli par amniocentèse, plus rarement sur les cellules trophoblastiques prélevées par biopsie des villosités choπales .
Cependant, l'établissement du caryotype fœtal ne peut pas être pratiqué systématiquement, et a été longtemps réservé aux femmes âgées de 38 ans et plus et/ou celles présentant des signes d'appel échographiques . Certains signes d'appel échographiques, et notamment 1 ' épaississement de la nuque du fœtus au premier trimestre de la grossesse, permettent en effet de déceler 80% des cas de trisomie 21 [NICOLAIDES et al., B. M. J., 304, 867-869, (1992) ;
NICOLAIDES et al., Br . J. Obstet . Gynecol . , 101, 782-786,
(1994) ; SNIJDERS et al., Lancet , 352, 343-346, (1998)] .
Cependant, l'efficacité de ce mode de dépistage dépend directement de l'expertise de l'opérateur. D'autre part, bien que le risque de trisomie 21 augmente avec l'âge, près de 70% des enfants trisomiques 21 naissent de mère ayant moins de 35 ans [WALD et al., Bπt . Med. J., 297, 883-887, (1988)] .
Dans ces conditions, il a été proposé de compléter ces examens par le dosage de marqueurs séπques maternels, dans le but notamment d'effectuer la détection préalable des cas dans lesquels l'établissement du caryotype fœtal serait préconisé. En 1987, BOGART et al. [Prenat. Diagn., 7, 623- 630] ont décrit dans deux tiers des grossesses avec un fœtus trisomique une diminution de 1 ' α-foetoprotéme associée à une élévation de 1 ' hCG dans le sérum maternel aux deuxième trimestre. De nombreuses études ont depuis confirmé le lien entre le risque de trisomie 21 et des taux élevés d'hCG, et notamment d'hCGβ chez la mère [BROCK et al., Prenat. Diagn., 10, 245-251, (1990) ; CHARD et al., The embryo . Spπnger Verlag, London, 209-226, (1991) ; HADDOW et al., N. Engl . J. Med., 338, 955-961, (1998)]. Par ailleurs, il existe aussi dans le sang maternel des taux bas d' oestriol non conjugué
[HADDOW et al., N. Engl. J. Med., 327, 588-593, (1992) ;
HADDOW et al., N. Engl. J. Med., 330, 1114-1118, (1994) ;
VAN-LITH, Prenat. Diagn., 12, 495-504, (1992)]. Ces trois marqueurs n'étant pas interdépendants, il est possible de calculer le risque d'une trisomie 21 fœtale en associant leur détermination ; cette méthode de dépistage est dénommée : « triple test » .
Il faut cependant remarquer que l'emploi de 1 ' oestriol non conjugué comme marqueur supplémentaire dans le « triple test » est très controversé [cf . par exemple SPENCER, Screening for Down ' s syndrome , Cambridge University Press, 141-162, (1994)] et, pour des raisons d'économie de santé publique, sa détermination n'est pas systématiquement effectuée.
Ces tests permettent de dépister un peu plus de 60% des trisomies 21 ; on observe en outre environ 5% de faux positifs dont le caryotype fœtal se révélera, en fait, normal . II apparaît donc souhaitable de disposer d'autres marqueurs séπques de la trisomie 21, qui permettraient d'améliorer la sensibilité et/ou la spécificité du dépistage.
Par ailleurs, l'origine du profil hormonal séπque maternel anormal, observé dans la trisomie 21, demeure totalement inconnue.
Par exemple, il a été supposé que l'augmentation des taux circulants d'hCG chez la mère en cas de trisomie 21, pourrait résulter d'une production augmentée par le trophoblaste à un âge gestationnel donné, ou d'une diminution de la clairance de la molécule en rapport avec une modification post- traductionnelle . Ainsi, ELDAR-GEVA et al. [J. Clin. Endocπnol . Metab., 80, 3528-3531, (1996)], rapportent une augmentation très importante de l'expression et de la sécrétion de 1 ' hCG dans des cellules trophoblastiques de trisomie 21 prélevées au second trimestre de grossesse, et la proposent comme l'une des causes possible de l'augmentation d'hCG maternelle. D'autres auteurs [BRIZOT et al., Mol. Hum. Reprod., 10, 2506-2509, (1995)] n'observent pas de différence d'expression de 1 ' hCG entre les placentas normaux et les placentas de trisomie 21, au premier trimestre de gestation. COLE et al. [Prénatal. Diagnosis, 18, 926-933,
(1998)] , ont mis en évidence la présence dans les urines maternelles de cas de trisomie 21, d'une forme hyperglycosylée de 1 ' hCG similaire à celle produite en cas de choriocarcmome ; ces auteurs proposent le dosage séπque ou uπnaire de cette forme hyperglycosylée pour la détection de la trisomie 21. II apparaît donc que peu d'études ont été menées sur les anomalies moléculaires observées dans le placenta de trisomie 21, et que les résultats en sont contradictoires.
La présente invention a pour but de fournir de nouveaux moyens d'étude des dysfonctionnements cellulaires et moléculaires intervenant au cours du développement placentaire dans la trisomie 21, ainsi que de nouveaux marqueurs de la trisomie 21. Dans ce but, les Inventeurs ont mis en culture des cellules cytotrophoblastiques issues de placentas normaux et de placentas avec trisomie 21 fœtale. La cellule cytotrophoblastique constitue la cellule clé du placenta humain. Elle se différencie m vi tro et m si tu au niveau placentaire en syncytiotrophoblaste . Le syncytiotrophoblaste est le tissu endocrine du placenta humain. Il produit des hormones stéroidiennes et polypeptidiques à des taux très élevés (plusieurs grammes par jour) .
In vi tro, les cytotrophoblastes isolés et purifiés à partir du placenta normal s'agrègent puis fusionnent pour former le syncytiotrophoblaste. Cette cellule, hautement polarisée, sécrète m vi tro dans le milieu de culture les hormones qu'elle déverse normalement dans la circulation maternelle. Les Inventeurs ont isolé, purifié et mis en culture des cytotrophoblastes de placentas de trisomie 21 à tous les termes de la grossesse, et ont comparé leur développement, ainsi que leur aptitude à exprimer et sécréter différentes hormones peptidiques, avec celui de cytotrophoblastes normaux. Ils ont ainsi observé que des cultures de cytotrophoblastes issus de placentas de trisomie 21, ne formaient pas de syncytiotrophoblaste, ou formaient un syncytiotrophoblaste défectueux, et que cette formation intervenait beaucoup plus tardivement que dans les cultures de cytotrophoblastes issus de placentas normaux prélevés au même stade de gestation. Ils ont en outre mesuré l'expression et la sécrétion dans le milieu de culture, de certaines
(hCGα, hCGβ, hPL, PGH, et leptme) des hormones peptidiques produites normalement par le trophoblaste, et ont constaté que dans les cultures de cytotrophoblastes issus de placentas de trisomie 21, les anomalies de la formation du syncytiotrophoblaste s'accompagnaient d'une diminution importante de ces hormones. Ces résultats étant en contradiction avec ceux précédemment rapportés par ELDAR-GEVA et al. (publication précitée) , les Inventeurs ont, afin de vérifier l'absence d'artefact, mesuré l'expression des hormones peptidiques mentionnées ci -dessus dans des prélèvements de tissus placentaires. Ils ont ainsi observé dans les tissus de placentas de trisomie 21, un niveau d'expression très inférieur au niveau moyen d'expression des mêmes hormones dans les tissus issus de placentas normaux.
En outre, ils ont constaté que des cytotrophoblastes transformés, surexpπmant la superoxyde dismutase dépendante du cuivre et du zinc (Cu/Zn SOD) , présentaient les mêmes anomalies de formation du syncytiotrophoblaste, et une diminution de la production de l'hCGα, l'hCGβ, l'hPL, et la PGH. Chez l'homme le gène de la Cu/Zn SOD est porté par le bras long du chromosome 21, et cette enzyme fait partie de celles qui sont surexprimées chez les sujets atteints de trisomie 21.
La présente invention a pour objet une culture de cytotrophoblastes caractérisée en ce que lesdits cytotrophoblastes sont trisomiques pour le chromosome 21 humain, ou pour une région de celui-ci comprenant au moins le gène codant pour la Cu/Zn superoxyde dismutase, et en ce qu'ils expriment après 3 jours de culture au moins une hormone peptidique choisie parmi le lactogène placentaire humain (hPL) , la gonadotrophme choπonique humaine α
(hCG ) , la gonadotrophme choπonique humaine β (hCGβ) , l'hormone de croissance placentaire humaine (PGH), et la leptme, en quantité inférieure à celle exprimée en moyenne par des cytotrophoblastes normaux issus de placentas au même stade de gestation, et cultivés dans les mêmes conditions.
On entend ici par « cytotrophoblastes normaux » des cytotrophoblastes présentant un caryotype normal, et qui sont capables de former un syncytiotrophoblaste lorsqu'ils sont cultivés in vi tro . Des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention peuvent être obtenues à partir de placentas de trisomie 21, par une digestion enzymatique en plusieurs étapes, suivie de purification sur un gradient de Ficoll .
Les cellules ainsi isolées peuvent ensuite être cultivées de manière classique, selon les techniques habituellement utilisées pour des cultures de cytotrophoblastes normaux.
Des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention sont utilisables comme modèle in vi tro pour étudier les anomalies de différenciation du syncytiotrophoblaste dans la trisomie 21, par exemple les anomalies de fusion cellulaire. En particulier, comme les cellules trophoblastiques sécrètent dans le milieu de culture les mêmes protéines solubles que celles qu'elle sécrètent in vi vo dans le sang maternel ou dans le compartiment fœtal, les cultures de cytotrophoblastes conformes a l'invention sont utilisables pour identifier et caractériser des molécules biologiques, notamment des protéines, relarguées dans le sang maternel par des placentas de fœtus trisomiques 21, et quantitativement et/ou qualitativement différentes des molécules biologiques relarguées dans le sang maternel par des placentas de fœtus normaux, et pouvant ainsi constituer des marqueurs de la trisomie 21.
On peut notamment analyser l'expression différentielle des gènes et des protéines, entre des cultures de cellules trophoblastiques normales et des cultures de cellules conformes à l'invention, au cours des différents stades de formation du syncytiotrophoblaste, y compris le développement du syncytiotrophoblaste différencié.
Par exemple, des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention peuvent être utilisées pour l'obtention de banques d'expression différentielle d'acides nucléiques entre les cytotrophoblastes normaux et les cytotrophoblastes trisomiques pour le chromosome 21, et/ou entre les cytotrophoblastes trisomiques pour le chromosome 21 à différents stades de culture.
La présente invention englobe ainsi des banques d'expression différentielle d'acides nucléiques obtenues à l'aide d'au moins une culture de cytotrophoblastes conformes à l'invention. De telles banques peuvent être constituées par exemple : d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes s' exprimant dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, et ne s ' exprimant pas dans les cultures de cytotrophoblastes normaux au même stade de formation du syncytiotrophoblaste ; - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes ne s 'exprimant pas dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, et s 'exprimant dans les cultures de cytotrophoblastes normaux au même stade de formation du syncytiotrophoblaste ; d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes dont l'expression est plus importante dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à 1 ' invention que dans les cultures de cytotrophoblastes normaux au même stade de formation du syncytiotrophoblaste ; d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes dont l'expression est moins importante dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention que dans les cultures de cytotrophoblastes normaux au même stade de formation du syncytiotrophoblaste ; - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes dont l'expression varie entre différents stades de formation du syncytiotrophoblaste dans des cultures de cellules conformes à 1 ' invention ; - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes dont l'expression dans des cultures de cellules conformes à l'invention varie selon les conditions environnementales, ou en réponse à l'application d'un agent physique ou chimique
(par exemple à 2 températures différentes, en présence ou en absence d'oxygène, etc..) . Des banques d'expression différentielle d'acides nucléiques conformes à l'invention peuvent être obtenues par des méthodes connues en elles-mêmes de l'homme de l'art. A titre d'exemples non limitatifs, on citera par exemple des méthodes telles que la DDRT-PCR [LIANG et PARDEE, Science, 257, 967-971,(1992)], l'hybridation soustractive [JIANG et FISHER, Mol. Cell . Différent., 1, 285-299, (1993)], la RAP- PCR [MCCLELLAND et WELSH, PCR Methods & Applications, 4, S66- 81, (1994)], l'analyse SAGE [VELCULESCU et al., Science, 270, 484-487, 1995], et leurs différentes variantes. Elles peuvent ensuite être utilisées notamment pour identifier, caractériser et cloner des gènes impliqués dans les anomalies de différenciation du syncytiotrophoblaste, et/ou pour étudier les mécanismes de régulation de ces gènes.
On peut aussi, pour étudier les gènes impliqués dans la différenciation du syncytiotrophoblaste, et les facteurs de transcription régulant ces gènes, utiliser des extraits nucléaires préparés à partir de cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention ou de syncytiotrophoblastes formés par ces cultures. Des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention peuvent également être utilisées pour étudier l'expression et/ou la sécrétion différentielle de protéines au cours des différents stades de formation du syncytiotrophoblaste, par comparaison de leurs profils d'expression et/ou de sécrétion de protéines avec ceux de cultures de cytotrophoblastes normaux, ou avec ceux d'autres cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, à un autre stade de développement ou cultivées en conditions différentes . On peut par exemple comparer la quantité de protéines produites et/ou sécrétées, ainsi que les différences qualitatives entre protéines, notamment les modifications post-traductionnelles . La comparaison peut être effectuée sur les protéines totales, ou sur des sous- populations de protéines, par exemple sur les protéines intracellulaires ou sur celles sécrétées dans le milieu de culture, sur les protéines glycosylées ou sur celles qui ne le sont pas , etc ..
Les méthodes de séparation, de détection, et de quantification ou d'analyse qualitative qui permettent d'effectuer cette comparaison sont connues en elles-mêmes de 1 ' homme de 1 ' art .
On citera par exemple 1 ' électrophorèse bi- dimensionnelle, éventuellement couplée à une spectrométπe de masse, qui permet d'identifier rapidement, par comparaison des gels d' électrophorèse , les différences entre deux profils d'expression protéique. De même, la glycosylation ou l'absence de glycosylation d'une protéine peut par exemple être détectée par isoélectrofocalisation ; selon leur glycosylation (notamment leur teneur en acide sialique) , les différentes glycoformes vont migrer jusqu'au moment où elles arrivent dans une zone de pH correspondant à leur point isoélectrique ; ce profil d' isoélectrofocalisation peut être comparé avec celui obtenu après traitement par une enzyme (par exemple neurammidase ou mannosidase) qui hydrolyse les glycannes . On peut également détecter les protéines glycosylées par électrophorèse d'affinité sur un gel renfermant une lectme ; les glycoformes sont séparées selon leur affinité pour la lectme.
Les protéines séparées sur gel peuvent par exemple être détectées par coloration classique ou par immunodétection après transfert sur nitrocellulose, et leur quantité peut être évaluée par densitométne . Les protéines pour lesquelles on observe une expression différentielle peuvent ensuite être purifiées à partir des gels pour compléter leur identification et leur caractérisation.
On peut également analyser les protéines du milieu de culture par chromatographie . Par exemple, pour détecter et/ou quantifier des protéines glycosylées, on peut effectuer une chromatographie d'affinité sur lectme.
A titre d'exemple, la comparaison de l'expression des ARNm, et de la sécrétion des protéines dans des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention et dans des cultures de cytotrophoblastes normaux a permis aux Inventeurs d'identifier des protéines pouvant constituer des marqueurs sériques de la trisomie 21.
Les Inventeurs ont en effet constaté que la synthèse de certaines hormones peptidiques, qui est très importante dans les cultures de cytotrophoblastes normaux, au moment de la formation du syncytiotrophoblaste, était très faible dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à 1' invention. Ces hormones sériques devraient donc être présentes en quantité plus faible dans le sérum des femmes porteuses d'un fœtus trisomique 21 que dans celui des femmes porteuses d'un fœtus normal. Or, l'hCG, qui est l'une des hormones peptidiques dont l'expression est diminuée dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, est au contraire connue comme étant présente en quantité plus importante dans le sérum des femmes porteuses d'un fœtus trisomique 21 que dans celui des femmes porteuses d'un fœtus normal .
Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que cette contradiction apparente s'expliquait par une demi-vie plus importante de 1 ' hCG dans le sérum, résultant d'une anomalie de glycosylation dans les cytotrophoblastes trisomiques pour le chromosome 21, telle que celle décrite par COLE et al. (1998, publication précitée) .
Dans ce cas, les protéines qui sont produites par les cytotrophoblastes sous forme non-glycosylée seront, si elles sont produites en quantité moins importante, présentes également en quantité plus faible dans le sérum des femmes porteuses d'un fœtus trisomique 21 que dans celui des femmes porteuses d'un fœtus normal, alors qu'au contraire les protéines produites sous forme glycosylée, comme l'hCG, seront glycosylées anormalement dans les cytotrophoblastes trisomiques 21, et même si elles sont produites en quantité plus faible, seront retrouvées en quantité plus importante dans le sang maternel .
Pour vérifier cette hypothèse, les Inventeurs ont effectué le dosage, dans des sérums de femmes porteuses d'un fœtus trisomique 21 et dans des sérums de femmes porteuses d'un fœtus normal, de 1 ' hCG et d'une autre hormone glycosylée, l'hormone de croissance placentaire, ainsi que celui des hormones suivantes : lactogène placentaire humain (hPL) et leptme, qui ne sont pas produites par les cytotrophoblastes sous forme glycosylée.
Ils ont ainsi constaté que dans les sérums des femmes porteuses de fœtus trisomiques 21, 1 ' hPL et la leptme étaient présentes en quantité significativement plus faible, alors qu'au contraire, 1 ' hCG et l'hormone de croissance placentaire étaient présentes en quantité plus importante.
Ces résultats permettent de proposer de nouvelles méthodes de détection et de nouveaux marqueurs de la trisomie 21. La présente invention a pour objet un procédé de détection d'un risque de trisomie 21 chez un fœtus caractérisé en ce qu'il comprend le dosage, dans un échantillon d'un liquide biologique obtenu à partir de la mère, d'au moins une protéine choisie parmi :
- les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l' invention en quantité plus faible que par une culture de cytotrophoblastes normaux ; - les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention en quantité plus importante que par une culture de cytotrophoblastes normaux ; les protéines glycosylées, sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention, à l'exception de l'hCG.
Ces protéines apparaissent donc utilisables, comme marqueurs de la trisomie 21, conformément à 1 ' invention. Leur dosage peut s'effectuer, selon la protéine concernée, soit par détection et quantification de la protéine entière, soit, s'il s'agit d'une protéine qui est dégradée dans l'organisme, par détection de ses produits de dégradation (notamment fragments peptidiques) . Des protéines « sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention en quantité plus faible que par une culture de cytotrophoblastes normaux » comprennent également les protéines qui ne sont pas sécrétées par des cytotrophoblastes conformes à l'invention mais sont sécrétées par des cytotrophoblastes normaux.
De même, des protéines « sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention en quantité plus importante que par une culture de cytotrophoblastes normaux » comprennent également les protéines qui sont sécrétées par des cytotrophoblastes conformes à l'invention mais ne le sont pas par des cytotrophoblastes normaux. Par « liquide biologique » on entend notamment le sérum et l'urine. Pour la mise en œuvre du procédé conforme à 1 ' invention le dosage de ladite protéine non-glycosylée sera effectué de préférence à partir d'un échantillon de sérum. Des protéines utilisables peuvent être identifiées sans difficulté par l'homme de l'art, en comparant les profils de sécrétion protéique des 2 cultures, et/ou en détectant la glycosylation ou l'absence de glycosylation, comme indiqué ci-dessus. Une dose séπque d'une ou plusieurs desdites protéines différente de la dose moyenne rencontrée chez les femmes porteuses d'un fœtus normal indique un risque de trisomie 21 chez le fœtus. S'il s'agit d'une protéine glycosylée, du fait de la demi-vie plus importante résultant d'une glycosylation anormale dans les cytotrophoblastes trisomiques 21, une dose séπque de ladite protéine supérieure à la dose moyenne rencontrée chez les femmes porteuses d'un fœtus normal indique un risque de trisomie 21 chez le fœtus. A l'aide du dispositif Microarray de CLONTECH
« Atlas Human 1.2 », les Inventeurs ont ainsi constaté que la cellule cytotrophoblastique exprimait des protéines sécrétées telles que : l'IGF2, la Thymosme beta 10, la Calgranulme B, le « Macrophage colony stimulatmg factor », le « C. reactive protem precursor », l'EGF, le « FMLP-related receptor 1 », la petite cytok e mductible A 5, l'IGF BPi, l'« Hépatocyte growth factor like protem », le PDGF, et certaines des mterleukmes IL-1 à IL-18. Ils ont en outre constaté que les cellules cytotrophoblastiques exprimaient le précurseur du peptide amyloïde (APP) . Ils ont également observé que cette expression était beaucoup plus importante dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention que dans les cultures de cytotrophoblastes normaux.
Le précurseur du peptide amyloïde (APP) est une protéine transmembranaire (numéro d'accès SWISS-PROT :
P05067) , dont le domaine extracellulaire est relargué sous forme soluble après clivage protéolytique par une activité α-sécrétase (relargage d'une protéine soluble comprenant les acides aminés 18-699 de l'APP) ou par une activité β- sécrétase (relargage d'une protéine soluble comprenant les acides aminés 18-671 de l'APP), (pour revue, cf. OCTAVE et al., Médecine/Sciences, 11, 1251-1259, 1995). Le domaine extracellulaire de la protéine APP, ou des fragments de celui-ci, apparaissent donc utilisables, conformément à l'invention, comme marqueurs sériques maternels de la trisomie 21.
Les Inventeurs ont d'autre part identifié 1 ' hPL et la leptme, parmi les protéines non-glycosylées sécrétées par des cultures de cytotrophoblastes normaux et non- sécrétées, ou sécrétées en quantité moindre, par les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention. Ils ont aussi identifié 1 ' mterleukme 13, parmi les protéines glycosylées sécrétées par les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention. Cette protéine n'est pas sécrétée par les cytotrophoblastes normaux.
Selon un mode de mise en œuvre préféré, le procédé conforme à l'invention comprend le dosage, dans un échantillon biologique obtenu à partir de la mère, d'au moins une protéine choisie parmi les protéines glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention, et d'au moins une protéine choisie parmi les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention.
Dans le cadre de ce mode de mise en œuvre, ladite protéine glycosylée peut être par exemple l'hCG, l'hormone de croissance placentaire, le domaine extracellulaire de la protéine APP ou toute autre protéine glycosylée sécrétée par des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention. Des protéines glycosylées utilisables peuvent être identifiées sans problème par l'homme de l'art, à partir du profil de sécrétion protéique d'une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention, en détectant la glycosylation ou l'absence de glycosylation, comme indiqué ci-dessus .
Le dosage séπque des protéines choisies s'effectue selon les méthodes habituelles, connues en elles- mêmes de l'homme du métier. En particulier, on peut utiliser des méthodes de dosage immunologique , à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine concernée. Dans le cas de protéines qui sont connues en elles-mêmes comme l'hPL, l'hormone de croissance placentaire, la leptme, l'hCG, ou l'APP, des anticorps appropriés sont disponibles dans le -commerce, ou peuvent aisément être obtenus par des techniques classiques, à partir de préparations purifiées de ces protéines. Dans le cas de protéines identifiées uniquement à partir de profils de sécrétion protéique de cultures de cytotrophoblastes, qui n'étaient pas précédemment connues et pour lesquelles aucun anticorps spécifique n'est disponible, des anticorps appropriés peuvent être obtenus, par exemple, à partir des protéines éluées des gels bi-dimensionnels . Ces anticorps peuvent ensuite être utilisés pour purifier, à partir de cultures de cytotrophoblastes, des quantités plus importantes de la protéine concernée.
Le procédé de détection conforme à l'invention peut être mis en œuvre en complément d'une autre méthode de détection de la trisomie 21, par exemple en complément d'une méthode de dosage faisant appel à d'autres marqueurs sériques, ou d'une méthode de détection par échographie .
Par exemple, pour confirmer ou infirmer un diagnostic échographique, on peut effectuer le dosage de l'hPL, qui constitue un marqueur très discriminant à partir de la I9eme semaine de gestation.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'obtention et de caracterisation de cultures de cytotrophoblastes conformes à 1' invention, et d'utilisation d'hormones peptidiques produites par ces cultures comme marqueurs de la trisomie 21.
EXEMPLE 1 : OBTENTION DE CULTURES DE CYTOTROPHOBLASTES DE TRISOMIE 21 Prélèvement des tissus placentaires :
Des échantillons de tissus placentaires ont été prélevés lors d' interruption de grossesses pour anomalie fœtale grave, entre 12 et 35 semâmes de gestation, soit dans des cas de trisomie 21 détectée par caryotype, soit à titre de contrôle, dans des cas de malformation fœtales sans anomalies du caryotype. Les prélèvements ont été effectués conformément aux dispositions du droit Français visant le consentement des patientes concernées.
Les prélèvements des deux groupes ont été appariés de manière à correspondre à des durées de gestation identiques. Il a été vérifié, pour les prélèvements effectués dans les cas de trisomie 21, que le tissu placentaire était également trisomique pour le chromosome 21, et pour les prélèvements contrôles, que le caryotype était normal. Isolement et culture des cytotrophoblastes
Les villosités placentaires ont été débarrassées des membranes et des vaisseaux, rincées et émincées dans une solution équilibrée de HANK (HBSS) dépourvue de calcium et de magnésium.
Les cellules du cytotrophoblaste ont été isolées par digestion à la trypsine-DNAse, en utilisant le protocole décrit par KLIMAN et al . [Endocrmology, 118, 1567-1582, (1986)], modifié comme suit :
La digestion est effectuée à l'aide d'une préparation enzymatique préparée extemporanément , et comprenant 0,5% (p/v) de trypsme en poudre (DIFCO) , 5 Ul/ml de DNAsel (SIGMA, 375000 U, 2600 Kunitz u/mg solide) , 25 mM HEPES, 4,2 mM de MgS04 et 1% (p/v) de pénicilline/streptomycine, dans l'HBSS.
Les villosités émincées sont recouvertes avec cette préparation ; après 30 mm. de digestion à 37°C, le liquide est jeté et remplacé par une préparation enzymatique fraîche. On effectue une nouvelle incubation de 25 min., à l'issue de laquelle le liquide est jeté et à nouveau remplacé par une préparation enzymatique fraîche. On effectue ensuite 5 digestions successives en utilisant chaque fois une préparation enzymatique fraîche : 1 digestion de 20 min., 1 digestion de 15 mm. et 3 digestions de 10 mm. Les liquides des 5 dernières digestions sont conservés et rassemblés, puis fractionnés sur gradient discontinu de Percoll de 10 à 70%.
On obtient ainsi une population homogène de cellules mononucléaires. Après centrifugation, le culot cellulaire est repris dans 4 ml de milieu DMEM. Ces 4 ml sont déposés sur le gradient comprenant plus de 90% de cellules cytotrophoblastiques viables [ALSAT et al . , J. Clin. Encodocrmol . Metab., 73, 288-294, (1991)]. Les cellules sont mises en culture dans des boîtes de 60 mm de diamètre (3xl06 cellules par boîte, dans 3 ml de milieu DMEM, supplémenté avec 25 mM d' HEPES, 2 mM de glutamme, 20% de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et en présence d'antibiotiques (100 UI par ml de pénicilline et 100 μg par ml de streptomycine) . Les cultures sont maintenues à 37°C sous atmosphère humide : 95% d'air
(19% 02, et 76% NH2) ; 5%C02. sur milieu DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle Médium) , en présence de 25mM HEPES, 2mM glutamme, 20% sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et sous une atmosphère constituée de 95% d'air et 5% de C02.
Comparaison des propriétés des cytotrophoblastes obtenus à partir de placentas de trisomie 21 et des cytotrophoblastes obtenus à partir de placentas contrôles
Les cytotrophoblastes isolés à partir des placentas de contrôle s'agrègent, puis au bout de 24 à 48 heures, fusionnent et se différencient en syncytiotrophoblastes .
Les cytotrophoblastes isolés à partir des placentas de trisomie 21 restent agrégés dans les boîtes de culture. Après 3 a 4 jours de culture, n'on observe que très peu de syncytiotrophoblastes.
La desmoplaqume, et la cadhérme-E qui disparaissent normalement lors de la formation du syncytium, ont été recherchées dans les cultures de cytotrophoblastes contrôles, et dans les cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, à l'aide d'anticorps monoclonaux anti- desmoplaqume ou anti-E-cadhérme . Pour la détection de la desmoplaqume ou de la E- cadhérme, les cellules en culture ont été rincées avec du PBS , fixées, et perméabilisées par immersion dans le méthanol à -20°C pendant 20 mm. Un anticorps monoclonal anti- desmoplaqume ou anti-E-cadhérme, dilué au l/400eme (SIGMA) est ensuite appliqué aux cellules traitées, et le complexe antigène-anticorps est révélé par des îmmunoglobulmes de chèvre anti-souris, marquées à la fluorescéme (SIGMA) .
Au bout de 3 jours de culture, la desmoplaqume et la E-cadhérme sont absentes des syncytiotrophoblastes normaux, mais présentes aux contacts mtercellulaires dans les cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21.
Ces résultats montrent clairement qu'il existe, dans les cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, un retard et/ou un défaut de différenciation du cytotrophoblaste en syncytiotrophoblaste.
EXEMPLE 2 : CARACTERISATION DE L'EXPRESSION ET DE LA SECRETION DES PROTEINES DANS DES CULTURES DE CYTOTROPHOBLASTES DE TRISOMIE 21 Etude de la transcription
L'ARN total est extrait des cultures de cytotrophoblastes, après 24, 48, ou 72 heures en utilisant le _t QIAGEN, suivanc le protocole maique par le fabricant.
Les ARNm du lactogène placentaire humain (hPL) , de la gonadotrophme choπonique humaine α (hCGα) , de la gonadotrophme chorionique humaine β (hCGβ) , de l'hormone de croissance placentaire humaine (PGH) , et de la leptme sont quantifiés comme décrit ci-après, à partir de l'ARN total en solution, préalablement transcrit de façon inverse en ADNc . L'ADNc est amplifié par RT-PCR en temps réel en utilisant la méthode TaqMan^ (PE Applied Biosystems) . Cette méthode est basée sur l'utilisation de l'activité exo- nucléasique 5' 3' de la polymérase Taq afin de digérer une sonde marquée hybπdée à une séquence cible, pendant la phase d'extension d'une amplification PCR. Le marquage de la sonde est conçu de manière à ce que sa digestion génère un signal fluorescent. Pour chaque réaction, le paramètre Cτ (cycle seuil) est défini comme le nombre de cycles pour lequel la fluorescence générée par la digestion de la sonde excède un seuil fixé au préalable ; ce nombre est d'autant plus faible que la quantité initiale de la molécule cible est plus importante. La quantité de chaque séquence cible dans des échantillons de composition inconnue est ainsi déterminée en mesurant Cτ et en utilisant une courbe d'étalonnage pour déterminer la quantité initiale de la séquence-cible.
Les amorces utilisées pour la transcription inverse, ainsi que les amorces d'amplification et les sondes de détection sont choisies à partir des séquences nucléiques de l'hPL), de l'hCGα, de l'hCGβ, de la PGH et de la leptme disponibles sur les bases de données, à l'aide des logiciels OLIGO 4.0 (NATURAL BIOSCIENCES) et Primer express (PERKIN- ELMER BIOSYSTEMS). Leur spécificité, et l'absence de polymorphisme a été vérifiée par recherche à l'aide de BLASTN
[ALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res . 25:3389-3402, (1997)]. sur les bases dbEST et nr . Les amplifications PCR ont été effectuées dans un appareillage ABI PRISM 7700 (PERKIN-ELMER BIOSYSTEMS) .
La courbe-étalon a été établie à l'aide de séries de dilutions de 10 en 10 d'ADNc obtenu par transcription inverse à partir de 1 μg d'ARN total extrait de placenta prélevé pendant le 1er trimestre de grossesse. Pour corriger des biais éventuels provoqués par une évaluation imprécise de la quantité d'ARN total utilisée dans chaque réaction, ainsi que de sa qualité (c'est-à-dire l'absence de dégradation importante) , un contrôle interne a été effectué par quantification de transcrits du gène PPIA (codant pour la peptidyl prolyl isomérase A humaine), et chaque échantillon a été normalisé sur la base de son contenu en PPIA . Pour chaque échantillon, la quantité des ARN-cibles à quantifier et celle de l'ARN PPIA de contrôle a été déterminée à partir de la courbe standard. Ensuite, la quantité d'ARN-cible a été divisée par la quantité d'ARN PPIA pour obtenir la valeur normalisée . Etude de la sécrétion
Mesure des hormones produites par les cytotrophoblastes
La concentration en hCG dans les milieux de culture a été déterminée par un essai ELISA (VITAS système, BIOMERIEUX) en suivant le protocole indiqué par le fabricant. La sensibilité de détection de ce test est de 2 mU/ml .
La concentration en hPL sécrétée a été déterminée à l'aide du kit hPL IRMA AMERLEX, (AMERSHAM) dans du milieu concentré 4 fois. La sensibilité du test est de 0,5 μg/ml) . L'hPL a également été détectée à partir de lysats cellulaires de cytotrophoblastes. Les protéines solubilisées (5 μg) ont été révélées après électrophorèse et transfert sur nitrocellulose en utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre 1 ' hPL et dilué au 250erae (DACO, FRANCE) . La bande correspondant à 1 ' hPL est révélée par chemiolummescence (PIERCE SUPERSIGNAL, INTERKIM, FRANCE) après incubation avec un anticorps anti-lapm couplé à la peroxydase .
La leptme a été mesurée dans du milieu concentré 4 fois en utilisant le kit RIA « Sensitive Human Leptm RIA Kit » (LINCO, ST LOUIS, USA). La sensibilité du dosage est de 0 , 5 ng/ml .
Pour chaque dosage, trois mesures indépendantes ont été effectuées. Immunoblotinσ
Les résultats de ces expériences sont illustrés par les Figures 1 à 3 :
Les Figures 1A et 1B montrent l'expression des ARNm de 1 ' hCGα et de 1 ' hCGβ pendant la différenciation de cytotrophoblastes isolés de placentas contrôles (N) et de placentas de trisomie 21 (T21) et cultivés pendant 24 h, 48 h ou 72 h. La Figure 1C illustre la sécrétion d'hCG par des cellules contrôle (N) ou des cellules T21 au bout de 24 h, 48 h ou 72 h de culture. Dans les cultures de cellules placentaires normales, le niveau des transcrits de la sous-unité β de 1 ' hCG augmente de plus de 103 fois entre cytotrophoblaste et syncytiotrophoblaste différencié m vi tro . De même, la sécrétion de βhCG augmente progressivement dans le milieu de culture. Dans les cultures de cellules de placenta de T21, le niveau des transcrits et la sécrétion d'hCG sont diminués. Les Figures 2A à 2C illustrent l'expression des
ARNm, la sécrétion dans le milieu de culture, et la production intracellulaire d'hPL au cours de la différenciation de cytotrophoblastes isolés à partir de placentas contrôle (N) ou trisomiques (T21) . La Figure 2A illustre le niveau de transcription, exprimé en quantité normalisée d'ARNm. La Figure 2B illustre la sécrétion d'hPL dans le milieu de culture, exprimé en μg/ml . La Figure 2C montre la détection d'hPL intracellulaire après transfert immunoélectrophorétique . Dans les cellules T21, on ne détecte au bout de
3 jours qu'une très faible quantité de transcrits d'hPL, et 1 ' hPL n'est pas détectable dans les cellules.
La Figure 3 illustre l'expression des ARNm de la leptme (Figure 3A) et de la PGH (Figure 3C) , ainsi que la sécrétion de leptme (Figure 3B) pendant la différenciation de cytotrophoblastes isolés à partir de placentas contrôle (N) ou de placentas T21 cultivés pendant 3 jours.
Dans les cultures de placenta normal, le niveau d'ARNm est augmenté de plus de 20 fois (leptme) et de 140 fois (GH placentaire) entre cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes. En cas de trisomie 21, on observe un défaut de transcription, et de la sécrétion de ces deux hormones dans les milieux de culture.
Ces résultats montrent que, dans les cellules obtenues à partir de placentas contrôles, on observe au bout de 72 h, ce qui correspond à la formation du syncytiotrophoblaste, une augmentation importante des ARNm de hCGα, hCGβ, hPL, leptme, et PGH. Simultanément, on observe une augmentation de l'hCG, de 1 ' hPL et de la sécrétion de leptme dans les milieux de culture.
Au contraire, dans les cellules obtenues à partir de placentas de trisomie 21, la formation défectueuse du syncytiotrophoblaste est associée avec une diminution importante des ARNm de l'hCGα, de l'hCGβ, de l'hPL, de la leptme et de la PGH.
Parallèlement, on observe une diminution importante de la sécrétion d'hCG dans le milieu de culture, et on ne peut détecter au bout de 3 jours aucune sécrétion d'hPL ou de leptme dans le milieu de culture. De même, 1 ' hPL n'est pas détectable dans les cellules de trisomie 21, alors qu'elle est présente dans les cellules normales.
La sécrétion de PGH dans le milieu de culture n'a pas été mesurée car il est connu que cette sécrétion est inhibée par le glucose, qui est présent dans ce milieu.
Ces résultats indiquent que les défauts et/ou le retard dans la différenciation morphologique en syncytiotrophoblaste des cytotrophoblastes isolés de placentas de trisomie 21 sont associés avec une diminution simultanée de l'expression et la sécrétion des hormones spécifiquement synthétisées par le syncytiotrophoblaste.
Parallèlement, la transcription des gènes de l'hCGα, de l'hCGβ, de la PGH, de l'hPL, et de la leptme a été mesurée au cours de l'ontogenèse placentaire, en utilisant le protocole décrit ci-dessus, dans des échantillons de placentas normaux et de T21. les résultats obtenus indiquent que tout au long de la grossesse, la transcription de ces gènes est beaucoup plus faible dans les placentas de trisomie 21 que dans les placentas normaux.
EXEMPLE 3 : UTILISATION DE PROTEINES SECRETEES PAR DES CULTURES DE CYTOTROPHOBLASTES DE TRISOMIE 21 COMME MARQUEURS DE LA TRISOMIE 21.
Les protéines suivantes ont été dosées sur un échantillon de 86 sérums prélevés à partir de femmes porteuses de fœtus trisomiques 21, et 247 sérums prélevés à partir de femmes porteuses de fœtus normaux.
Protéines non glycosylées
1. hPL : Le dosage est effectué sur sérum. La prise d'essai est adaptée en fonction du stade de la grossesse (en début de grossesse 200 μl, en fin de grossesse 20 μl) . Le dosage est effectué à l'aide du Kit IRMA (immunoradiothérapie) AMERLEX-hPL-IRMA (Ortho Clmical Diagnostics, Royaume-Uni) .
Chaque sérum est dosé en duplicata avec une précision sur la mesure mter-série allant de 5,9% à 10% de coefficient de variation. La gamme de concentrations est de
0,5 à 16,5 μg/ml . La limite de détection du test est de
0,06 μg/ml.
Les résultats sont illustrés par la Figure 4, qui montre que en cas de T21, les taux d'hPL sont anormalement bas et qu'à partir de 19-20 semâmes, ils deviennent un marqueur très discriminant. Les taux d'hPL sériques maternels sont donc le reflet direct de l'anomalie de la formation du syncytiotrophoblaste dans la T21. 2. Leptme :
Le dosage est effectué sur sérum. La prise d'essai est de 100 μl . Le dosage est effectué à l'aide du dosage RIA Human Leptm RIA KIT (Linco, USA) .
Chaque sérum est dosé en duplicate avec une précision sur la mesure mter-série allant de 3,3% à 8,9% de coefficients de variation. La gamme de concentrations va de 0,5 à 100 ng/ml . La limite de détection est de 0,1 ng/ml
On observe une diminution des taux sériques maternels de leptme en cas de trisomie 21 fœtale. Protéine glycosylée
GH placentaire
Le dosage est effectué sur sérum. La prise d'essai est de 100 μl . Le dosage est effectué à l'aide du kit hPGH IRMA (BC1017) BIOCODE. Chaque sérum est dosé en duplicate avec une précision sur la mesure mter-série allant de 5,5% à 7,9% de coefficients de variation. La gamme de concentrations va de 1 à 180 ng/ml. La limite de détection est de 0,2 ng/ml.
Les résultats sont illustrés par la Figure 5, qui confirme que la GH placentaire est plus élevée dans le sang maternel en cas de trisomie 21 fœtale à partir de 16 à 17 semâmes .

Claims

REVENDICATIONS 1) Culture de cytotrophoblastes caractérisée en ce que lesdits cytotrophoblastes sont trisomiques pour le chromosome 21 humain, ou pour une région de celui-ci comprenant au moins le gène codant pour la Cu/Zn superoxyde dismutase, et en ce qu'ils expriment après 3 jours de culture au moins une hormone peptidique choisie parmi le lactogène placentaire humain (hPL) , la gonadotrophme choπonique humaine α (hCGα) , la gonadotrophme choπonique humaine β (hCGβ) , l'hormone de croissance placentaire humaine (PGH), et la leptme, en quantité inférieure à celle exprimée en moyenne par des cytotrophoblastes normaux issus de placentas au même stade de gestation, et cultivés dans les mêmes conditions . 2) Utilisation d'un culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1 pour identifier et caractériser des marqueurs de la trisomie 21.
3) Banque d'expression différentielle d'acides nucléiques obtenues à l'aide d'au moins une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1.
4) Procédé de détection d'un risque de trisomie 21 chez un fœtus caractérisé en ce qu'il comprend le dosage, dans un échantillon biologique obtenu à partir de la mère, d'au moins une protéine choisie parmi : - les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1 en quantité plus faible que par une culture de cytotrophoblastes normaux ;
- les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1 en quantité plus importante que par une culture de cytotrophoblastes normaux ; les protéines glycosylées, sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1, à l'exception de l'hCG.
5) Procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'on effectue le dosage d'au moins une protéine non-glycosylée choisie parmi 1 ' hPL et la leptme. 6) Procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'on effectue le dosage d'au moins une protéine glycosylée parmi l'hormone de croissance placentaire, 1 ' mterleukme 13, et le domaine extracellulaire du précurseur de la protéine amyloïde.
7) Procédé selon une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre le dosage d'au moins une protéine choisie parmi les protéines glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1, et d'au moins une protéine choisie parmi les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1.
8) Procédé selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine glycosylée est choisie parmi l'hCG, l'hormone de croissance placentaire, 1 ' mterleukme 13, et le domaine extracellulaire du précurseur de la protéine amyloïde .
9) Utilisation d'au moins une protéine telle que définie dans la revendication 4 en tant que marqueur pour le diagnostic in vi tro de la trisomie 21.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRENDO J L ET AL: "Defect of villous cytotrophoblast differentiation into syncytiotrophoblast in Down's syndrome.", JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY & METABOLISM, vol. 85, no. 10, October 2000 (2000-10-01), pages 3700 - 3707, XP001002129, ISSN: 0021-972X *
KLIMAN H J ET AL: "PURIFICATION CHARACTERIZATION AND IN-VITRO DIFFERENTIATION OF CYTOTROPHOBLASTS FROM HUMAN TERM PLACENTAE", ENDOCRINOLOGY, vol. 118, no. 4, 1986, pages 1567 - 1582, XP000960541, ISSN: 0013-7227 *
KNIGHT G J ET AL: "MATERNAL SERUM LEVELS OF THE PLACENTAL PRODUCTS HCG HPL SP1 AND PROGESTERONE ARE ALL ELEVATED IN CASES OF FETAL DOWN SYNDROME", AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 45, no. 4 SUPPL., 1989, pages A263, XP000953459, ISSN: 0002-9297 *
LEE J E S ET AL: "Leptin utility for prenatal Down syndrome detection: A pilot study.", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 45, no. 6 PART 2, June 1999 (1999-06-01), 51st Annual Meeting of the American Association of Clinical Chemistry;New Orleans, Louisiana, USA; July 25-29, 1999, pages A77, XP001002136, ISSN: 0009-9147 *
MOGHADAM S ET AL: "Maternal serum placental growth hormone and insulin like growth factor binding proteins 1 and 3 in pregnancies affected by fetal aneuploidy and other abnormalites: Implications for prenatal diagnosis of trisomy 21.", FETAL DIAGNOSIS AND THERAPY, vol. 13, no. 5, 1998, pages 291 - 297, XP000953472, ISSN: 1015-3837 *
NOBLE P L ET AL: "Maternal serum inhibin-A and free beta-hCG concentrations in trisomy 21 pregnancies at 10 to 14 weeks of gestation.", BRITISH JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNAECOLOGY, vol. 104, no. 3, 1997, pages 367 - 371, XP000960387, ISSN: 0306-5456 *
RICHARDS RANDALL G ET AL: "Human cytotrophoblast cell cultured in maternal serum progress to a differentiated syncytial phenotype expressing both human chorionic gonadotropin and human placental lactogen.", ENDOCRINOLOGY, vol. 135, no. 1, 1994, pages 321 - 329, XP000960543, ISSN: 0013-7227 *
TOKUDA TAKAHIKO ET AL: "Plasma levels of amyloid beta proteins a-beta-1-40 and A-beta-1-42(43) are elevated in Down's syndrome.", ANNALS OF NEUROLOGY, vol. 41, no. 2, 1997, pages 271 - 273, XP001002135, ISSN: 0364-5134 *

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