FR2805824A1 - Cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, et leur utilisation pour l'obtention de marqueurs de la trisomie 21 - Google Patents

Abstract

L'invention est relative à des cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21.Des protéines sécrétées différentiellement par ces cultures et par des cultures de cytotrophoblastes normaux sont notamment utilisables comme marqueurs de la trisomie 21.

Description

L'invention est relative à des cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, et à leurs utilisations.

La trisomie 21, responsable du syndrome de Down plus communément appelé mongolisme, est la plus fréquente des trisomies autosomiques puisque l'on observe sur près de 1 pour 800 nouveau-nés lors de l'accouchement [FERGUSON-SMITH et al., Prenat. Diagn., 4, 5-44, 1984)]. C'est la cause génétique majeure de retard mental [CUNNINGHAM et al., Williams Obstetrics, ed. 19, 919-938, (1993)].

Le diagnostic prénatal de la trisomie 21 repose essentiellement sur l'établissement du caryotype f#tal, examen pratiqué 1e plus souvent sur les cellules f#tales du liquide amniotique recueilli par amniocentèse, plus rarement sur les cellules trophoblastiques prélevées par biopsie des villosités choriales.

Cependant, l'établissement du caryotype f#tal ne peut pas être pratiqué systématiquement, et a été longtemps réservé aux femmes âgées de 38 ans et plus et/ou celles présentant des signes d'appel échographiques. Certains signes d'appel échographiques, et notamment l'épaississement de la nuque du f#tus au premier trimestre de la grossesse, permettent en effet de déceler 80% des cas de trisomie 21 [NICOLAIDES et al., B. M. J., 304, 867-869, (1992) ; NICOLAIDES et al., Br. J. Obstet. Gynecol., 101, 782-786, (1994) ; SNIJDERS et al., Lancet, 352, 343-346, (1998)]. Cependant, l'efficacité de ce mode de dépistage dépend directement de l'expertise de l'opérateur. D'autre part, bien que le risque de trisomie 21 augmente avec l'âge, près de 70% des enfants trisomiques 21 naissent de mère ayant moins de 35 ans [WALD et al., Brit. Med. J., 297, 883-887, (1988)].

Dans ces conditions, il a été proposé de compléter ces examens par le dosage de marqueurs sériques maternels, dans le but notamment d'effectuer la détection préalable des cas dans lesquels l'établissement du caryotype f#tal serait préconisé.

En 1987, BOGART et al. [Prenat. Diagn., 7, 623 630] ont décrit dans deux tiers des grossesses avec un f#tus trisomique une diminution de 1'a-foetoprotéine associée à une élévation de l'hCG dans le sérum maternel aux deuxième trimestre. De nombreuses études ont depuis confirmé le lien entre le risque de trisomie 21 et des taux élevés d' hCG, et notamment d'hCG(3 chez la mère [BROCK et al., Prenat. Diagn., 10, 245-251, (1990) ; CHARD et al., The embryo. Springer Verlag, London, 209-226, (1991) ; HADDOW et al., N. Engl. J. Med., 338, 955-961, (1998)]. Par ailleurs, il existe aussi dans le sang maternel des taux bas d'oestriol non conjugué [HADDOW et al., N. Engl. J. Med., 327, 588-593, (1992) ; HADDOW et al., N. Engl. J. Med., 330, 1114-1118, (1994) ; VAN-LITH, Prenat. Diagn., 12, 495-504, (1992)]. Ces trois marqueurs n'étant pas interdépendants, il est possible de calculer le risque d'une trisomie 21 f#tale en associant leur détermination ; cette méthode de dépistage est dénommée triple test .

I1 faut cependant remarquer que l'emploi de 1'oestriol non conjugué comme marqueur supplémentaire dans le triple test est très controversé [cf. par exemple SPENCER, Screening <I>for</I> Down's <I>syndrome,</I> Cambridge University Press, 141-162, (1994)] et, pour des raisons d'économie de santé publique, sa détermination n'est pas systématiquement effectuée.

Ces tests permettent de dépister un peu plus de 60% des trisomies 21 ; on observe en outre environ 5% de faux positifs dont le caryotype f#tal se révélera, en fait, normal.

I1 apparaît donc souhaitable de disposer d'autres marqueurs sériques de la trisomie 21, qui permettraient d'améliorer la sensibilité et/ou la spécificité du dépistage.

Par ailleurs, l'origine du profil hormonal sérique maternel anormal, observé dans la trisomie 21, demeure totalement inconnue.

Par exemple, il a été supposé que l'augmentation des taux circulants d'hCG chez la mère en cas de trisomie 21, pourrait résulter d'une production augmentée par le trophoblaste à un âge gestationnel donné, ou d'une diminution de la clairance de la molécule en rapport avec une modification post-traductionnelle. Ainsi, ELDAR-GEVA et al. [J. Clin. Endocrinol. Metab., 80, 3528-353l, (1996)], rapportent une augmentation très importante de l'expression et de la sécrétion de l'hCG dans des cellules trophoblastiques de trisomie 21 prélevées au second trimestre de grossesse, et la proposent comme l'une des causes possible de l'augmentation d'hCG maternelle. D'autres auteurs [BRIZOT et al., Mol. Hum. Reprod., 10, 2506-2509, (l995)] n'observent pas de différence d'expression de l'hCG entre les placentas normaux et les placentas de trisomie 21, au premier trimestre de gestation. COLE et al. [Prenatal. Diagnosis, 18, 926-933, (1998)], ont mis en évidence la présence dans les urines maternelles de cas de trisomie 21, d'une forme hyperglycosylée de 1'hCG similaire à celle produite en cas de choriocarcinome ; ces auteurs proposent le dosage sérique ou urinaire de cette forme hyperglycosylée pour la détection de la trisomie 21.

I1 apparaît donc que peu d'études ont été menées sur les anomalies moléculaires observées dans 1e placenta de trisomie 21, et que les résultats en sont contradictoires.

La présente invention a pour but de fournir de nouveaux moyens d'étude des dysfonctionnements cellulaires et moléculaires intervenant au cours du développement placentaire dans la trisomie 21, ainsi que de nouveaux marqueurs de la trisomie 21. Dans ce but, les Inventeurs ont mis en culture des cellules cytotrophoblastiques issues de placentas normaux et de placentas avec trisomie 21 fcetale.

La cellule cytotrophoblastique constitue la cellule clé du placenta humain. Elle se différencie<I>in</I> vitro et<I>in situ</I> au niveau placentaire en syncytiotrophoblaste. Le syncytiotrophoblaste est le tissu endocrine du placenta humain. I1 produit des hormones stéroïdiennes et polypeptidiques à des taux très élevés (plusieurs grammes par jour).

<I>In vitro,</I> les cytotrophoblastes isolés et purifiés à partir du placenta normal s'agrègent puis fusionnent pour former le syncytiotrophoblaste. Cette cellule, hautement polarisée, sécrète<I>in vitro</I> dans le milieu de culture les hormones qu'elle déverse normalement dans la circulation maternelle.

Les Inventeurs ont isolé, purifié et mis en culture des cytotrophoblastes de placentas de trisomie 21 à tous les termes de la grossesse, et ont comparé leur développement, ainsi que leur aptitude à exprimer et sécréter différentes hormones peptidiques, avec celui de cytotrophoblastes normaux. Ils ont ainsi observé que des cultures de cytotrophoblastes issus de placentas de trisomie 21, ne formaient pas de syncytiotrophoblaste, ou formaient un syncytiotrophoblaste défectueux, et que cette formation intervenait beaucoup plus tardivement que dans les cultures de cytotrophoblastes issus de placentas normaux prélevés au même stade de gestation. Ils ont en outre mesuré l'expression et la sécrétion dans le milieu de culture, de certaines (hCG(c, hCG(3, hPL, PGH, et leptine) des hormones peptidiques produites normalement par le trophoblaste, et ont constaté que dans les cultures de cytotrophoblastes issus de placentas de trisomie 21, les anomalies de la formation du syncytiotrophoblaste s'accompagnaient d'une diminution importante de ces hormones. Ces résultats étant en contradiction avec ceux précédemment rapportés par ELDAR-GEVA et al. (publication précitée), les Inventeurs ont afin de vérifier l'absence d'artefact, mesuré l'expression des hormones peptidiques mentionnées ci-dessus dans des prélèvements de tissus placentaires. Ils ont ainsi observé dans les tissus de placentas de trisomie 21, un niveau d'expression très inférieur au niveau moyen d'expression des mêmes hormones dans les tissus issus de placentas normaux.

En outre, ils ont constaté que des cytotrophoblastes transformés, surexprimant la superoxyde dismutase dépendante du cuivre et du zinc (Cu/Zn SOD), présentaient les mêmes anomalies de formation du syncytiotrophoblaste, et une diminution de la production de l' hCGa., l' hCG(3, l' hPL, et 1a PGH. 3. Chez l'homme le gène de la Cu/Zn SOD est porté par le bras long du chromosome 21, et cette enzyme fait partie de celles qui sont surexprimées chez les sujets atteints de trisomie 21. La présente invention a pour objet une culture de cytotrophoblastes caractérisée en ce que lesdits cytotrophoblastes sont trisomiques pour le chromosome 21 humain, ou pour une région de celui-ci comprenant au moins le gène codant pour la Cu/Zn superoxyde dismutase, et en ce qu'ils expriment après 3 jours de culture au moins une hormone peptidique choisie parmi le lactogène placentaire humain (hPL), la gonadotrophine chorionique humaine a (hCGa), la gonadotrophine chorionique humaine P (hCGP), l'hormone de croissance placentaire humaine (PGH), et la leptine, en quantité inférieure à celle exprimée en moyenne par des cytotrophoblastes normaux issus de placentas au même stade de gestation, et cultivés dans les mêmes conditions.

On entend ici par cytotrophoblastes normaux des cytotrophoblastes présentant un caryotype normal, et qui sont capables de former un syncytiotrophoblaste lorsqu'ils sont cultivés<I>in vitro.</I>

Des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention peuvent être obtenues à partir de placentas de trisomie 21, par une digestion enzymatique en plusieurs étapes, suivie de purification sur un gradient de Ficoll.

Les cellules ainsi isolées peuvent ensuite être cultivées de manière classique, selon les techniques habituellement utilisées pour des cultures de cytotrophoblastes normaux.

Des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention sont utilisables comme modèle<I>in vitro</I> pour étudier les anomalies de différenciation du syncytiotrophoblaste dans la trisomie 21, par exemple les anomalies de fusion cellulaire. En particulier, comme les cellules trophoblastiques sécrètent dans le milieu de culture les mêmes protéines solubles que celles qu'elle sécrètent<I>in</I> <I>vivo</I> dans le sang maternel ou dans le compartiment f#tal, les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention sont utilisables pour identifier et caractériser des molécules biologiques, notamment des protéines, relarguées dans le sang maternel par des placentas de f#tus trisomiques 21, et quantitativement et/ou qualitativement différentes des molécules biologiques relarguées dans le sang maternel par des placentas de fcetus normaux, et pouvant ainsi constituer des marqueurs de la trisomie 21.

On peut notamment analyser l'expression différentielle des gènes et des protéines, entre des cultures de cellules trophoblastiques normales et des cultures de cellules conformes à l'invention, au cours des différents stades de formation du syncytiotrophoblaste, y compris le développement du syncytiotrophoblaste différencié.

Par exemple, des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention peuvent être utilisées pour l'obtention de banques d'expression différentielle d'acides nucléiques entre les cytotrophoblastes normaux et les cytotrophoblastes trisomiques pour le chromosome 21, et/ou entre les cytotrophoblastes trisomiques pour le chromosome 21 à différents stades de culture.

La présente invention englobe ainsi des banques d'expression différentielle d'acides nucléiques obtenues à l'aide d'au moins une culture de cytotrophoblastes conformes à l'invention. De telles banques peuvent être constituées par exemple - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes s'exprimant dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, et ne s'exprimant pas dans les cultures de cytotrophoblastes normaux au même stade de formation du syncytïotrophoblaste ; - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes ne s'exprimant pas dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, et s'exprimant dans les cultures de cytotrophoblastes normaux au même stade de formation du syncytiotrophoblaste ; - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes dont l'expression est plus importante dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention que dans les cultures de cytotrophoblastes normaux au même stade de formation du syncytiotrophoblaste ; - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes dont l'expression est moins importante dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention que dans les cultures de cytotrophoblastes normaux au même stade de formation du syncytiotrophoblaste ; - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes dont l'expression varie entre différents stades de formation du syncytiotrophoblaste dans des cultures de cellules conformes à l'invention ; - d'une population de séquences totales ou partielles d'ADNc de gènes dont l'expression dans des cultures de cellules conformes à l'invention varie selon les conditions environnementales, ou en réponse à l'application d'un agent physique ou chimique (par exemple à 2 températures différentes, en présence ou en absence d'oxygène, etc..).

Des banques d'expression différentielle d'acides nucléiques conformes à l'invention peuvent être obtenues par des méthodes connues en elles-mêmes de l'homme de l'art. A titre d'exemples non limitatifs, on citera par exemple des méthodes telles que la DDRT-PCR [LIANG et PARDEE, Science, 257, 967-971,(1992)], l'hybridation soustractive [JIANG et FISHER, Mol. Cell. Different., 1, 285-299, (1993)], la RAP- PCR [MCCLELLAND et WELSH, PCR Methods & Applications, 4, S66- 81, (1994)], l'analyse SAGE [VELCULESCU et al., Science, 270, 484-487, 1995], et leurs différentes variantes. Elles peuvent ensuite être utilisées notamment pour identifier, caractériser et cloner des gènes impliqués dans les anomalies de différenciation du syncytiotrophoblaste, et/ou pour étudier les mécanismes de régulation de ces gènes. On peut aussi, pour étudier les gènes impliqués dans la différenciation du syncytiotrophoblaste, et les facteurs de transcription régulant ces gènes, utiliser des extraits nucléaires préparés à partir de cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention ou de syncytiotrophoblastes formés par ces cultures.

Des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention peuvent également être utilisées pour étudier l'expression et/ou 1a sécrétion différentielle de protéines au cours des différents stades de formation du syncytiotrophoblaste, par comparaison de leurs profils d'expression et/ou de sécrétion de protéines avec ceux de cultures de cytotrophoblastes normaux,- ou avec ceux d'autres cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, à un autre stade de développement ou cultivées en conditions différentes.

On peut par exemple comparer la quantité de protéines produites et/ou sécrétées, ainsi que les différences qualitatives entre protéines, notamment les modifications post-traductionnelles. La comparaison peut être effectuée sur les protéines totales, ou sur des sous- populations de protéines, par exemple sur les protéines intracellulaires ou sur celles sécrétées dans le milieu de culture, sur les protéines glycosylées ou sur celles qui ne le sont pas, etc..

Les méthodes de séparation, de détection, et de quantification ou d'analyse qualitative qui permettent d'effectuer cette comparaison sont connues en elles-mêmes de l'homme de l'art.

On citera par exemple l'électrophorèse bi dimensionnelle, éventuellement couplée à une spectrométrie de masse, qui permet d'identifier rapidement, par comparaison des gels d'électrophorèse, les différences entre deux profils d'expression protéique. De même, la glycosylation ou l'absence de glycosylation d'une protéine peut par exemple être détectée par isoélectrofocalisation ; selon leur glycosylation (notamment leur teneur en acide sialique), les différentes glycoformes vont migrer jusqu'au moment où elles arrivent dans une zone de pH correspondant à leur point isoélectrique ; ce profil d'isoélectrofocalisation peut être comparé avec celui obtenu après traitement par une enzyme (par exemple neuraminidase ou mannosidase) qui hydrolyse les glycannes. On peut également détecter les protéines glycosylées par électrophorèse d'affinité sur un gel renfermant une lectine ; les glycoformes sont séparées selon leur affinité pour la lectine.

Les protéines séparées sur gel peuvent par exemple être détectées par coloration classique ou par immunodétection après transfert sur nitrocellulose, et leur quantité peut être évaluée par densitométrie. Les protéines pour lesquelles on observe une expression différentielle peuvent ensuite être purifiées à partir des gels pour compléter leur identification et leur caractérisation.

On peut également analyser les protéines du milieu de culture par chromatographie. Par exemple, pour détecter et/ou quantifier des protéines glycosylées, on peut effectuer une chromatographie d'affinité sur lectine.

A titre d'exemple, 1a comparaison de l'expression des ARNm, et de la sécrétion des protéines dans des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention et dans des cultures de cytotrophoblastes normaux a permis aux Inventeurs d'identifier des protéines pouvant constituer des marqueurs sériques de la trisomie 21.

Les Inventeurs ont en effet constaté que la synthèse de certaines hormones peptidiques, qui est très importante dans les cultures de cytotrophoblastes normaux, au moment de la formation du syncytiotrophoblaste, était très faible dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention. ces hormones sériques devraient donc être présentes en quantité plus faible dans le sérum des femmes porteuses d'un f#tus trisomique 21 que dans celui des femmes porteuses d'un f#tus normal. Or, l'hCG, qui est l'une des hormones peptidiques dont l'expression est diminuée dans les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, est au contraire connue comme étant présente en quantité plus importante dans le sérum des femmes porteuses d'un f#tus trisomique 21 que dans celui des femmes porteuses d'un f#tus normal.

Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que cette contradiction apparente s'expliquait par une demi-vie plus importante de l'hCG dans le sérum, résultant d'une anomalie de glycosylation dans les cytotrophoblastes trisomiques pour le chromosome 21, telle que celle décrite par COLE et al. (1998, publication précitée).

Dans ce cas, les protéines qui sont produites par les cytotrophoblastes sous forme non-glycosylée seront, si elles sont produites en quantité moins importante, présentes également en quantité plus faible dans 1e sérum des femmes porteuses d'un fcetus trisomique 21 que dans celui des femmes porteuses d'un f#tus normal, alors qu'au contraire les protéines produites sous forme glycosylée, comme l'hCG, seront glycosylées anormalement dans les cytotrophoblastes trisomiques 21, et même si elles sont, produites en quantité plus faible, seront retrouvées en quantité plus importante dans le sang maternel.

Pour vérifier cette hypothèse, les Inventeurs ont effectué le dosage, dans des sérums de femmes porteuses d'un fcetus trisomique 21 et dans des sérums de femmes porteuses d'un f#tus normal, de l'hCG et d'une autre hormone glycosylée, l'hormone de croissance placentaire, ainsi que celui des hormones suivantes : lactogène placentaire humain (hPL) et leptine, qui ne sont pas produites par les cytotrophoblastes sous forme glycosylée.

Ils ont ainsi constaté que dans les sérums des femmes porteuses de f#tus trisomiques 21, l'hPL et la leptine étaient présentes en quantité significativement plus faible, alors qu'au contraire, l'hCG et l'hormone de croissance placentaire étaient présentes en quantité plus importante.

Ces résultats permettent de proposer de nouvelles méthodes de détection et de nouveaux marqueurs de la trisomie 21.

La présente invention a pour objet un procédé de détection d'un risque de trisomie 21 chez un faetus caractérisé en ce qu'il comprend le dosage, dans un échantillon d'un liquide biologique obtenu à partir de la mère, d'au moins une protéine choisie parmi - les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention en quantité plus faible que par une culture de cytotrophoblastes normaux ; - les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention en quantité plus importante que par une culture de cytotrophoblastes normaux ; - les protéines glycosylées, sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention, à l'exception de l'hCG.

Ces protéines apparaissent donc utilisables, comme marqueurs de la trisomie 21, conformément à l'invention.

Des protéines sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention en quantité plus faible que par une culture de cytotrophoblastes normaux comprennent également les protéines qui ne sont pas sécrétées par des cytotrophoblastes conformes à l'invention mais sont sécrétées par des cytotrophoblastes normaux.

De même, des protéines sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention en quantité plus importante que par une culture de cytotrophoblastes normaux comprennent également les protéines qui sont sécrétées par des cytotrophoblastes conformes à l'invention mais ne le sont pas par des cytotrophoblastes normaux.

Par liquide biologique on entend notamment le sérum et l'urine. Pour la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention le dosage de ladite protéine non-glycosylée sera effectué de préférence à partir d'un échantillon de sérum.

Des protéines utilisables peuvent être identifiées sans difficulté par l'homme de l'art, en comparant les profils de sécrétion protéique des 2 cultures, et/ou en détectant la glycosylation ou l'absence de glycosylation, comme indiqué ci-dessus. Une dose sérique d'une ou plusieurs desdites protéines différente de la dose moyenne rencontrée chez les femmes porteuses d'un f#tus normal indique un risque de trisomie 21 chez le f#tus. S'il s'agit d'une protéine glycosylée, du fait de la demi-vie plus importante résultant d'une glycosylation anormale dans les cytotrophoblastes trisomiques 21, une dose sérique de ladite protéine supérieure à la dose moyenne rencontrée chez les femmes porteuses d'un f#tus normal indique un risque de trisomie 21 chez le f#tus.

Les Inventeurs ont ainsi identifié à l'aide du dispositif Microarray de CLONTECH Atlas Human 1.2 parmi les protéines sécrétées par la cellule cytotrophoblastique l'IGF2, la Thymosine beta 10, la Calgranuline B, le Macrophage colony stimulating factor , le C. reactive protein precursor , l'EGF, le FMLP-related receptor 1 , la petite cytokine inductible A 5, l'IGF BP1, 1' Hépatocyte growth factor like protein , le PDGF, et certaines des interleukines IL-1 à IL-18.

Les Inventeurs ont d'autre part identifié l'hPL et la leptine, parmi les protéines non-glycosylées sécrétées par des cultures de cytotrophoblastes normaux et non- sécrétées, ou sécrétées en quantité moindre, par les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention. Ils ont aussi identifié l'interleukine 13, parmi les protéines glycosylées sécrétées par les cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention. Cette protéine n'est pas sécrétée par les cytotrophoblastes normaux.

Selon un mode de mise en #uvre préféré, le procédé conforme à l'invention comprend le dosage, dans un échantillon biologique obtenu à partir de la mère, d'au moins une protéine choisie parmi les protéines glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention, et d'au moins une protéine choisie parmi les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention.

Dans le cadre de ce mode de mise en #uvre, ladite protéine glycosylée peut être par exemple l'hCG, l'hormone de croissance placentaire, ou toute autre protéine glycosylée, notamment sécrétée par des cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention. Des protéines glycosylées utilisables peuvent être identifiées sans problème par l'homme de l'art, à partir du profil de sécrétion protéique d'une culture de cytotrophoblastes conforme à l'invention, en détectant la glycosylation ou l'absence de glycosylation, comme indiqué ci-dessus.

Le dosage sérique des protéines choisies s'effectue selon les méthodes habituelles, connues en elles- mêmes de l'homme du métier. En particulier, on peut utiliser des méthodes de dosage immunologique, à l'aide d'anticorps dirigés contre 1a protéine concernée. Dans le cas de protéines qui sont connues en elles-mêmes comme 1'hPL, l'hormone de croissance placentaire, la leptine, ou l'hCG, des anticorps appropriés sont disponibles dans le commerce, ou peuvent aisément être obtenus par des techniques classiques, à partir de préparations purifiées de ces protéines. Dans le cas de protéines identifiées uniquement à partir de profils de sécrétion protéique de cultures de cytotrophoblastes, qui n'étaient pas précédemment connues et pour lesquelles aucun anticorps spécifique n'est disponible, des anticorps appropriés peuvent être obtenus, par exemple, à partir des protéines éluées des gels bi-dimensionnels. Ces anticorps peuvent ensuite être utilisés pour purifier, à partir de cultures de cytotrophoblastes, des quantités plus importantes de la protéine concernée.

Le procédé de détection conforme à l'invention peut être mis en ceuvre en complément d'une autre méthode de détection de la trisomie 21, par exemple en complément d'une méthode de dosage faisant appel à d'autres marqueurs sériques, ou d'une méthode de détection par échographie.

Par exemple, pour confirmer ou infirmer un diagnostic échographique, on peut effectuer 1e dosage de 1'hPL, qui constitue un marqueur très discriminant à partir de la 19e" semaine de gestation.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'obtention et de caractérisation de cultures de cytotrophoblastes conformes à l'invention, et d'utilisation d'hormones peptidiques produites par ces cultures comme marqueurs de la trisomie 21. EXEMPLE 1 : OBTENTION DE CULTURES DE CYTOTROPHOBLASTES DE TRISOMIE 21 <U>Prélèvement des tissus placentaires</U> Des échantillons de tissus placentaires ont été prélevés lors d'interruption de grossesses pour anomalie f#tale grave, entre 12 et 35 semaines de gestation, soit dans des cas de trisomie 21 détectée par caryotype, soit à titre de contrôle, dans des cas de malformation f#tales sans anomalies du caryotype. Les prélèvements ont été effectués conformément aux dispositions du droit Français visant le consentement des patientes concernées.

Les prélèvements des deux groupes ont été appariés de manière à correspondre à des durées de gestation identiques. Il a été vérifié, pour les prélèvements effectués dans les cas de trisomie 21, que le tissu placentaire était également trisomique pour le chromosome 21, et pour les prélèvements contrôles, que le caryotype était normal.

<U>Isolement et culture des</U> cytotrophoblastes Les villosités placentaires ont été débarrassées des membranes et des vaisseaux, rincées et émincées dans une solution équilibrée de HANK (HBSS) dépourvue de calcium et de magnésium.

Les cellules du cytotrophoblaste ont été isolées par digestion à 1a trypsine-DNAse, en utilisant le protocole décrit par KLIMAN <I>et a1.</I> [Endocrinology, 118, 1567-1582, (1986)], modifié-comme suit La digestion est effectuée à l'aide d'une préparation enzymatique préparée extemporanément, et comprenant 0,5% (p/v) de trypsine en poudre (DIFCO), 5 UI/ml de DNAseI (SIGMA, 375000 U, 2600 Kunitz u/mg solide), 25 mM HEPES, 4,2 mM de MgS04 et 1% (p/v) de pénicilline/streptomycine, dans l'HBSS. Les villosités émincées sont recouvertes avec cette préparation ; après 30 min. de digestion à 37 C, 1e liquide est jeté et remplacé par une préparation enzymatique fraîche. On effectue une nouvelle incubation de 25 min., à l'issue de laquelle le liquide est jeté et à nouveau remplacé par une préparation enzymatique fraîche. On effectue ensuite 5 digestions successives en utilisant chaque fois une préparation enzymatique fraîche : 1 digestion de 20 min., 1 digestion de 15 min. et 3 digestions de 10 min.

Les liquides des 5 dernières digestions sont conservés et rassemblés, puis fractionnés sur gradient discontinu de Percoll de 10 à 70%.

On obtient ainsi une population homogène de cellules mononucléaires. Après centrifugation, le culot cellulaire est repris dans 4 ml de milieu DMEM. Ces 4 ml sont déposés sur le gradient comprenant plus de 90% de cellules cytotrophoblastiques viables [ALSAT et a1., J. Clin. Encodocrinol. Metab., 73, 288-294, (199l)].

Les cellules sont mises en culture dans des boîtes de 60 mm -de diamètre (3x10 cellules par boîte, dans 3 ml de milieu DMEM, supplémenté avec 25 mM d' HEPES, 2 mM de glutamine, 20% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur, et en présence d'antibiotiques (100 UI par ml de pénicilline et 100 ug par ml de streptomycine). Les cultures sont maintenues à 37 C sous atmosphère humide : 95% d'air (19% 02, et 76% NH2) ; 5%C02. sur milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), en présence de 25mM HEPES, 2mM glutamine, 20% sérum de veau f#tal inactivé par la chaleur, et sous une atmosphère constituée de 95% d'air et 5% de C02. <U>Comparaison des propriétés des</U> cytotrophoblastes <U>obtenus à</U> <U>partir de placentas de trisomie 21 et des</U> cytotrophoblastes <U>obtenus à partir de placentas contrôles</U> Les cytotrophoblastes isolés à partir des placentas de contrôle s'agrègent, puis au bout de 24 à 48 heures, fusionnent et se différencient en syncytiotrophoblastes.

Les cytotrophoblastes isolés à partir des placentas de trisomie 21 restent agrégés dans les boîtes de culture. Après 3 à 4 jours de culture, n'on observe que très peu de syncytiotrophoblastes.

La desmoplaquine, et la cadhérine-E qui disparaissent normalement lors de la formation du syncytium, ont été recherchées dans les cultures de cytotrophoblastes contrôles, et dans les cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, à l'aide d'anticorps monoclonaux anti- desmoplaquine ou anti-E-cadhérine.

Pour la détection de la desmoplaquine ou de la E- cadhérine, les cellules en culture ont été rincées avec du PBS, fixées, et perméabilisées par immersion dans le méthanol à -20 C pendant 20 min. Un anticorps monoclonal anti- desmoplaquine ou anti-E-cadhérine, dilué au 1/400ème (SIGMA) est ensuite appliqué aux cellules traitées, et le complexe antigène-anticorps est révélé par des immunoglobulines de chèvre anti-souris, marquées à la fluorescéine (SIGMA).

Au bout de 3 jours de culture, la desmoplaquine et la E-cadhérine sont absentes des syncytiotrophoblastes normaux, mais présentes aux contacts intercellulaires dans les cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21.

Ces résultats montrent clairement qu'il existe, dans les cultures de cytotrophoblastes de trisomie 21, un retard et/ou un défaut de différenciation du cytotrophoblaste en syncytiotrophoblaste.

EXEMPLE <B>2</B> : CARACTERISATION <B>DE L'EXPRESSION ET DE LA</B> SECRETION <B>DES</B> PROTEINES <B>DANS DES</B> CULTURES <B>DE</B> CYTOTROPHOBLASTES <B>DE TRISOMIE 21</B> Etude <U>de la transcription</U> L'ARN total est extrait des cultures de cytotrophoblastes, après 24, 48, ou 72 heures en utilisant le kit QIAGEN, suivant le protocole indiqué par le fabricant.

Les ARNm du lactogène placentaire humain (hPL), de la gonadotrophine chorionique humaine a (hCG(x), de la gonadotrophine chorionique humaine P (hCG(3), de l'hormone de croissance placentaire humaine (PGH), et de la leptine sont quantifiés comme décrit ci-après, à partir de l'ARN total en solution, préalablement transcrit de façon inverse en ADNc. L'ADNc est amplifié par RT-PCR en temps réel en utilisant la méthode TaqMan (PE Applied Biosystems). Cette méthode est basée sur l'utilisation de l'activité exo- nucléasique 5'3' de la polymérase Taq afin de digérer une sonde marquée hybridée à une séquence cible, pendant la phase d'extension d'une amplification PCR. Le marquage de la sonde est conçu de manière à ce que sa digestion génère un signal fluorescent. Pour chaque réaction, 1e paramètre CT (cycle seuil) est défini comme le nombre de cycles pour lequel la fluorescence générée par la digestion de la sonde excède un seuil fixé au préalable ; ce nombre est d'autant plus faible que la quantité initiale de la molécule cible est plus importante. La quantité de chaque séquence cible dans des échantillons de composition inconnue est ainsi déterminée en mesurant CT et en utilisant une courbe d'étalonnage pour déterminer la quantité initiale de la séquence-cible.

Les amorces utilisées pour la transcription inverse, ainsi que les amorces d'amplification et les sondes de détection sont choisies à partir des séquences nucléiques de l' hPL) , de l' hCGcc, de l' hCG(3, de la PGH et de la leptine disponibles sur les bases de données, à l'aide des logiciels OLIGO 4.0 (NATURAL BIOSCIENCES) et Primer express (PERKIN- ELMER BIOSYSTEMS). Leur spécificité, et l'absence de polymorphisme a été vérifiée par recherche à l'aide de BLASTN [ALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, (l997)]. sur les bases dbEST et nr. Les amplifications PCR ont été effectuées dans un appareillage ABI PRISM 7700 (PERKIN-ELMER BIOSYSTEMS).

La courbe-étalon a été établie à l'aide de séries de dilutions de 10 en 10 d'ADNc obtenu par transcription inverse à partir de 1 pg d'ARN total extrait de placenta prélevé pendant le ler trimestre de grossesse. Pour corriger des biais éventuels provoqués par une évaluation imprécise de la quantité précise d'ARN total utilisée dans chaque réaction, ainsi que sa qualité (c'est-à-dire l'absence de dégradation importante), un contrôle interne a été effectué par quantification de transcrits du gène PPIA (codant pour la peptidyl prolyl isomérase A humaine), et chaque échantillon a été normalisé sur la base de son contenu en PPIA. Pour chaque échantillon, la quantité des ARN-cibles à quantifier et celle de l'ARN PPIA de contrôle a été déterminée à partir de la courbe standard. Ensuite, la quantité d'ARN-cible a été divisée par 1a quantité d'ARN PPIA pour obtenir la valeur normalisée.

Etude <U>de la sécrétion</U> <U>Mesure des</U> hormones <U>produites par les</U> cytotrophoblastes La concentration en hCG dans les milieux de culture a été déterminée par un essai ELISA (VITAS système, BIOMERIEUX) en suivant le protocole indiqué par 1e fabricant. La sensibilité de détection de ce test est de 2 mU/ml.

La concentration en hPL secrétée a été déterminée à l'aide du kit hPL IRMA AMERLEX, (AMERSHAM) dans du milieu concentré 4 fois. La sensibilité du test est de 0,5 ug/ml).

L'hPL a également été détectée à partir de lysats cellulaires de cytotrophoblastes. Les protéines solubilisées (5 pg) ont été révélées après électrophorèse et transfert sur nitrocellulose en utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre l'hPL et dilué au 250eme (DACO, FRANCE). La bande correspondant à l'hPL est révélée par chemioluminescence (PIERCE SUPERSIGNAL, INTERKIM, FRANCE) après incubation avec un anticorps anti-lapin couplé à la peroxydase.

La leptine a été mesurée dans du milieu concentré 4 fois en utilisant le kit RIA Sensitive Human Leptin RIA Kit (LINCO, ST LOUIS, USA). La sensibilité du dosage est de 0,5 ng/ml.

Pour chaque dosage, trois mesures indépendantes ont été effectuées.

Immunobloting Les résultats de ces expériences sont illustrés par les Figures 1 à 3 Les Figures 1A et 1B montrent l'expression des ARNm de l'hCGa et de l'hCG(3 pendant la différenciation de cytotrophoblastes isolés de placentas contrôles (N) et de placentas de trisomie 21 (T21) et cultivés pendant 24 h, 48 h ou 72 h. La Figure 1C illustre la sécrétion d'hCG par des cellules contrôle (N) ou des cellules T21 au bout de 24 h, 48 h ou 72 h de culture.

Dans les cultures de cellules placentaires normales, le niveau des transcrits de la sous-unité P de l'hCG augmente de plus de 103 fois entre cytotrophoblaste et syncytiotrophoblaste différencié<I>in vitro.</I> De même, la sécrétion de PhCG augmente progressivement dans le milieu de culture. Dans les cultures de cellules de placenta de T21, le niveau des transcrits et 1a sécrétion d'hCG sont diminués.

Les Figures 2A à 2C illustrent l'expression des ARNm, la sécrétion dans le milieu de culture, et la production intracellulaire d'hPL au cours de la différenciation de cytotrophoblastes isolés à partir de placentas contrôle (N) ou trisomiques (T21). La Figure 2A illustre le niveau de transcription, exprimé en quantité normalisée d'ARNm. La Figure 2B illustre la sécrétion d'hPL dans le milieu de culture, exprimé en ug/ml. La Figure 2C montre la détection d'hPL intracellulaire après transfert immunoélectrophorétique.

Dans les cellules T21, on ne détecte au bout de 3 jours qu'une très faible quantité de transcrits d'hPL, et l'hPL n'est pas détectable dans les cellules.

La Figure 3 illustre l'expression des ARNm de la leptine (Figure 3A) et de la PGH (Figure 3C), ainsi que la sécrétion de leptine (Figure 3B) pendant la différenciation de cytotrophoblastes isolés à partir de placentas contrôle (N) ou de placentas T21 cultivés pendant 3 jours.

Dans les cultures de placenta normal, le niveau d'ARNm est augmenté de plus de 20 fois (leptine) et de 140 fois (GH placentaire) entre cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes. En cas de trisomie 21, on observe un défaut de transcription, et de la sécrétion de ces deux hormones dans les milieux de culture.

Ces résultats montrent que, dans les cellules obtenues à partir de placentas contrôles, on observe au bout de 72 h, ce qui correspond à la formation du syncytiotrophoblaste, une augmentation importante des ARNm de hCGcc, hCG(3, hPL, leptine, et PGH. Simultanément, on observe une augmentation de l'hCG, de l'hPL et de la sécrétion de leptine dans les milieux de culture.

Au contraire, dans les cellules obtenues à partir de placentas de trisomie 21, 1a formation défectueuse du syncytiotrophoblaste est associée avec une diminution importante des ARNm de l' hCGcc, de l' hCGP, de l' hPL, de la leptine et de la PGH.

Parallèlement, on observe une diminution importante de la sécrétion d'hCG dans le milieu de culture, et on ne peut détecter au bout de 3 jours aucune sécrétion d'hPL ou de leptine dans le milieu de culture. De même, l'hPL n'est pas détectable dans les cellules de trisomie 21, alors qu'elle est présente dans les cellules normales.

La sécrétion de PGH dans le milieu de culture n'a pas été mesurée car il est connu que cette sécrétion est inhibée par le glucose, qui est présent dans ce milieu.

Ces résultats indiquent que les défauts et/ou le retard dans la différenciation morphologique en syncytiotrophoblaste des cytotrophoblastes isolés de placentas de trisomie 21 sont associés avec une diminution simultanée de l'expression et la sécrétion des hormones spécifiquement synthétisées par le syncytiotrophoblaste.

Parallèlement, la transcription des gènes de l' hCGa, de l' hCGP, de la PGH, de l' hPL, et de la leptine a été mesurée au cours de l'ontogénèse placentaire, en utilisant le protocole décrit ci-dessus, dans des échantillons de placentas normaux et de T21. les résultats obtenus indiquent que tout au long de la grossesse, la transcription de ces gènes est beaucoup plus faible dans les placentas de trisomie 21 que dans les placentas normaux.

EXEMPLE 3 :<B>UTILISATION DE</B> PROTEINES SECRETEES <B>PAR DES</B> <B>CULTURES DE</B> CYTOTROPHOBLASTES <B>DE TRISOMIE 21 COMME</B> MARQUEURS <B>DE LA TRISOMIE 21.</B>

Les protéines suivantes ont été dosées sur un échantillon de 86 sérums prélevés à partir de femmes porteuses de fcetus trisomiques 21, et 247 sérums prélevés à partir de femmes porteuses de fcetus normaux. <U>Protéines non</U> glycosylées 1. hPL Le dosage est effectué sur sérum. La prise d'essai est adaptée en fonction du stade de la grossesse (en début de grossesse 200 pl, en fin de grossesse 20 p1). Le dosage est effectué à l'aide du Kit IRMA (immunoradiothérapie) AMERLEX-hPL-IRMA (Ortho Clinical Diagnostics, Royaume-Uni).

Chaque sérum est dosé en duplicata avec une précision sur la mesure inter-série allant de 5,9% à 10% de coefficient de variation. La gamme de concentrations est de 0,5 à 16,5 pg/ml. La limite de détection du test est de 0,06 pg/ml.

Les résultats sont illustrés par 1a Figure 4, qui montre que en cas de T21, les taux d'hPL sont anormalement bas et qu'à partir de 19-20 semaines, ils deviennent un marqueur très discriminant. Les taux d'hPL sériques maternels sont donc le reflet direct de l'anomalie de la formation du syncytiotrophoblaste dans la T21.

2. Leptine Le dosage est effectué sur sérum. La prise d'essai est de 100 pl. Le dosage est effectué à l'aide du dosage RIA Human Leptin RIA KIT (Linco, USA).

Chaque sérum est dosé en duplicate avec une précision sur la mesure inter-série allant de 3,3% à 8,9% de coefficients de variation. La gamme de concentrations va de 0,5 à 100 ng/ml. La limite de détection est de 0,1 ng/ml On observe une diminution des taux sériques maternels de leptine en cas de trisomie 21 fcetale.

<U>Protéine</U> glycosylée GH placentaire Le dosage est effectué sur sérum. La prise d'essai est de 100 pl. Le dosage est effectué à l'aide du kit hPGH IRMA (BC1017) BIOCODE.

Chaque sérum est dosé en duplicate avec une précision sur la mesure inter-série allant de 5,5% à 7,9% de coefficients de variation. La gamme de concentrations va de 1 à 180 ng/ml. La limite de détection est de 0,2 ng/ml. Les résultats sont illustrés par la Figure S, qui confirme que la GH placentaire est plus élevée dans le sang maternel en cas de trisomie 21 fcetale à partir de 16 à 17 semaines.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1) Culture de cytotrophoblastes caractérisée en ce que lesdits cytotrophoblastes sont trisomiques pour le chromosome 21 humain, ou pour une région de celui-ci comprenant au moins 1e gène codant pour 1a Cu/Zn superoxyde dismutase, et en ce qu'ils expriment après 3 jours de culture au moins une hormone peptidique choisie parmi le lactogène placentaire humain (hPL), la gonadotrophine chorionique humaine a (hCGu), la gonadotrophine chorionique humaine (hCGP), l'hormone de croissance placentaire humaine (PGH), et la leptine, en quantité inférieure à celle exprimée en moyenne par des cytotrophoblastes normaux issus de placentas au même stade de gestation, et cultivés dans les mêmes conditions.

2) Utilisation d'un culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1 pour identifier et caractériser des marqueurs de la trisomie 21.

3) Banque d'expression différentielle d'acides nucléiques obtenues à l'aide d'au moins une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1.

4) Procédé de détection d'un risque de trisomie 21 chez un f#tus caractérisé en ce qu'il comprend le dosage, dans un échantillon biologique obtenu à partir de la mère, d'au moins une protéine choisie parmi - les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1 en quantité plus faible que par une culture de cytotrophoblastes normaux ; - les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1 en quantité plus importante que par une culture de cytotrophoblastes normaux ; - les protéines glycosylées, sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1, à l'exception de l'hCG.

5) Procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'on effectue le dosage d'au moins une protéine non-glycosylée choisie parmi l'hPL et la leptine.

6) Procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'on effectue le dosage d'au moins une protéine glycosylée parmi l'hormone de croissance placentaire et l'interleukine 13.

7) Procédé selon une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre le dosage d'au moins une protéine choisie parmi les protéines glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1, et d'au moins une protéine choisie parmi les protéines non-glycosylées sécrétées par une culture de cytotrophoblastes selon la revendication 1.

8) Procédé selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine glycosylée est choisie parmi l'hCG, l'hormone de croissance placentaire, et l'interleukine 13.

9) Utilisation d'au moins une protéine telle que définie dans la revendication 4 en tant que marqueur pour le diagnostic<I>in vitro</I> de la trisomie 21.