WO2001064947A1 - Substrat utile pour detecter la protease du virus de l'herpes et procede de production de ce dernier - Google Patents

Substrat utile pour detecter la protease du virus de l'herpes et procede de production de ce dernier Download PDF

Info

Publication number
WO2001064947A1
WO2001064947A1 PCT/JP2001/001574 JP0101574W WO0164947A1 WO 2001064947 A1 WO2001064947 A1 WO 2001064947A1 JP 0101574 W JP0101574 W JP 0101574W WO 0164947 A1 WO0164947 A1 WO 0164947A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
protease
human
substrate
herpes virus
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/001574
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kiyoko Goto
Shinkichi Irie
Yoko Miura
Original Assignee
Nippi, Incorporated
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippi, Incorporated filed Critical Nippi, Incorporated
Priority to AU2001236027A priority Critical patent/AU2001236027A1/en
Publication of WO2001064947A1 publication Critical patent/WO2001064947A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus

Definitions

  • the present invention relates to a substrate for detection of a virus virus protease and a method for producing the same.
  • Alphaviruses include simple herpesviruses (HSV) types 1 and 2 and herpes zoster virus (VZV), and betaviruses include human cytomegalovirus (HCMV) and human herpes virus.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • HHV-6 and human herpesvirus 7 (HHV-7) and gammaviruses include EB virus (EBV) and human herpesvirus 8 (HHV-8).
  • HHV-6 simple herpesviruses
  • HHV-7 human herpesvirus 7
  • gammaviruses include EB virus (EBV) and human herpesvirus 8 (HHV-8).
  • Human herpes virus is the causative virus of various disease states. Many human herpes viruses are reactivated by various stimuli after occult infection, making them ubiquitous opportunistic pathogens that can cause serious illness. HCMV-induced pneumonia and retinitis frequently occur in immunocompromised humans, such as organ transplant patients and AIDS patients. HCMV can also cause serious infectious diseases in congenitally infected infants. VZV is known to cause a number of serious illnesses, varicella, shingles, and post-heral neuralgia. HSV-1 latently infects the trigeminal ganglia and is later reactivated, causing keratitis and cold sores. HSV-2 is usually obtained by sexual contact and causes genital herpes. HHV-8 is the causative virus of Kaposi's sarcoma that frequently occurs in AIDS.
  • Nucleic acid-based antiviral agents eg, ganciclovir and acyclovir
  • Nucleic acid-based antiviral agents that use a selective inhibitory effect on the viral gene replication process have been used as anti-herpesvirus agents.
  • Virus strains exhibiting drug resistance have emerged, and development of non-nucleic acid antiviral agents in place of these nucleic acid antiviral agents has been desired.
  • protease inhibitors are protease inhibitors.
  • the protease encoded by herpes virus is a virus-specific serine protease with an active center different from that of known host cell-derived serine proteases. It has been attracting attention as a target for antiviral drugs because it is very well preserved.
  • Herpesvirus protease is translated as a fusion polypeptide chain with the viral capsid protein.
  • the primary role of the herpes virus protease was thought to be in the cleavage of this precursor polypeptide chain.
  • an appropriate activity assay is essential for the development of a herpesvirus protease inhibitor as an anti-herpesvirus agent.
  • Several methods for producing proteases derived from herpes virus and methods for measuring their activity have already been reported (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-29979, Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-209396).
  • Japanese Translation of PCT International Application No. 10-530364 Japanese Translation of PCT International Application No. 10-530364
  • a substrate utilizing a specific cleavage sequence found in this precursor protein has been used.
  • their activity assays did not show sufficient reaction rates, making it difficult to evaluate protease activity inhibitors efficiently.o
  • proteins other than the precursor polypeptide chains could be provided as major substrates for the herpes virus protease, a new anti-herb based on a different mechanism could be provided. It suggests a method for developing antiviral agents, and is expected to contribute to the development of protease activity inhibitors that exhibit excellent anti-herpes virus activity in vivo.
  • the present invention provides an important novel endogenous substrate for a herpesvirus protease and a method for producing the same. , [Means for solving the problem]
  • a novel endogenous substrate for a herpesvirus protease is the minimum requirement that a protease-cleavable sequence be included in the molecule, but it alone contributes to the development of antiherpesvirus agents. It does not necessarily meet the requirements of a new endogenous substrate useful for Therefore, it is a molecule that contains a protease cleavable sequence in the molecule and can be specifically cleaved by herpes virus protease, and its substrate can be specifically cleaved in the course of virus infection. When it is a molecule, it is a useful new endogenous substrate.
  • important new endogenous substrates for herpesvirus protease include (1) in human herpesvirus-infected cells and (2) forced expression of herpesvirus protease.
  • This is a protein molecule that is cleaved in cultured cells and (3) is a protein molecule containing a protease-cleavable sequence in the molecule, and (4) is a molecule that is specifically cleaved in a virus virus protease digestion experiment in vitro.
  • the present inventors have intensively studied to identify a new endogenous substrate of herpesvirus protease in order to solve the above problems, and as a result, the p180 protein was infected by herpesvirus protease. It was specifically degraded in the late stage and was found to be an important new endogenous substrate for herpes virus protease, thereby completing the present invention.
  • the novel endogenous substrate of the herpesvirus protease of the present invention is characterized in that it is a host animal cell protein, and the precursor polypeptide encoded by the genomic DNA of herpesvirus itself known hitherto is known. It is a novel substrate of a completely different type from peptide chains. And further, a DNA encoding this identified novel endogenous substrate is assembled. We constructed a plasmid containing the protein, produced a recombinant protein, and completed a method for producing a recombinant substrate protein derived from this novel endogenous substrate.
  • a peptide chain substantially containing a human p180 protein refers to a peptide chain to which an amino acid sequence corresponding to the human p180 protein region has been added, or a herpesvirus protease. It refers to a peptide chain having amino acid residue conversion, deletion, or insertion in the natural human p180 protein region within a range that does not affect the activity as a novel endogenous substrate.
  • These amino acid sequences are modified by coding a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, specifically, an amino acid sequence to be modified by PCR or the like based on the DNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. By modifying the DNA base sequence, the corresponding modified peptide chain can be translated and prepared.
  • novel endogenous substrate of the virus virus protease of the present invention is a protein derived from host animal cells, it is compatible with the virus DNA which has been identified as a major substrate of the conventional virus virus protease. This suggests the possibility of developing a novel anti-herpesvirus agent based on a completely different mechanism from the loaded precursor polypeptide chain.
  • the human Pi80 protein which is a novel endogenous substrate of the herpesvirus protease provided by the present invention, is a protein containing a herpesvirus protease cleavable sequence represented by SEQ ID NOS: 1-3. is there.
  • the present invention also provides a recombinant human p180 protein expression vector obtained by inserting and linking a DNA fragment encoding a peptide chain substantially containing the human p180 protein region into an expression vector. provide.
  • the present invention also relates to a D-encoding peptide which substantially comprises a cleavable sequence of a herpesvirus protease of human P180 protein containing a cleavable sequence of a herpesvirus protease.
  • a recombinant human p180 protein expression substrate obtained by inserting and linking an NA fragment into an expression vector.
  • the present invention provides a recombinant human p180 protein comprising the steps of culturing and producing a microorganism transformed with the recombinant human p180 protein expression vector and collecting the recombinant human p180 protein.
  • a method of manufacturing is provided.
  • the present invention provides a method for culturing and producing a microorganism transformed with the recombinant human p180 fusion protein expression vector, and collecting a recombinant human p180 fusion protein produced as a soluble protein in the cells. And a method for producing a recombinant human p180 protein.
  • the DNA encoding the human P180 protein, a novel endogenous substrate for the virus virus protease provided by the present invention is a DNA encoding Langle et al. (Langley R et al., (1998) DNA Cell Biol., 17). 449-460) contain substantially the same nucleotide sequence as the concatenation of the corresponding gene fragments in HEMP37, HUSAX55, ESI870 reported by others.
  • the human p180 protein is known to have a plurality of different isoforms of the repetitive sequence, and the gene sequence shown in SEQ ID NO: 6 is a novel sequence having 24 repeats.
  • the gene used in the present invention is, in addition to the above-mentioned p180 gene, a gene modified to include a gene having a function equivalent to that of the p180 gene (including a gene naturally or artificially deleted or inserted with a base). Is also good.
  • the human p180 gene may be linked to an appropriate gene so as to be expressed as a fusion protein.
  • Other genes to be linked to the human p180 gene include the glutathione-S-transferase (molecular weight of about 26,000, hereinafter, referred to as GST) gene, the bead galactosidase gene, HIS-TAG gene and the like.
  • the DNA encoding the human P180 protein, a novel endogenous substrate of the virus virus protease provided by the present invention is, for example, cDNA of human fetal lung fibroblast (MRC-15 cells). Can be cloned by the PCR method using the ⁇ as a template. It is possible to obtain a plasmid into which a DNA encoding an amino acid sequence containing a full-length human p180 protein or a cleavable sequence of a herpesvirus protease has been incorporated.
  • the DNA fragment encoding the peptide chain substantially comprising the human p180 protein region has a repetitive sequence (represented by serine 159 to isoleucine 6100 in SEQ ID NO: 5). Because of inclusion and instability, it is more desirable to store a stable vector with a low copy number in a transformed bacterium such as pTrc99A or pKK-223-3 and store it.
  • the DNA encoding the pi80 protein is amplified by PCR using the single-stranded cDNA of MRC-5 cells as type I, and the full-length DNA encoding the p180 protein is simultaneously amplified. Since it is difficult to amplify, amplify by dividing into N-terminal region, repetitive sequence region and C-terminal region.
  • MRC-5 cells are general-purpose cultured cells that are widely used for experiments such as virus propagation.
  • the single-stranded cDNA can be prepared by any known method.
  • the 5 'and 3' ends of the repeat region should be overlapped with the 3 'end of the N-terminal region and the 5' end of the C-terminal region, respectively, and the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes. It can be subsequently linked.
  • a restriction enzyme BamHI cleavage site is located at the 5th untranslated region for the N-terminal region
  • a restriction enzyme BamHI cleavage site is located at the 3 'side for the repeat sequence region
  • a C-terminal region a restriction enzyme BamHI cleavage site is introduced on the 5 'side and a restriction enzyme EcoRI cleavage site is introduced into the 3' untranslated region.
  • the nucleotide sequence 471 in SEQ ID NO: 6 of the DNA encoding the p180 protein has a restriction enzyme Ec0RI cleavage site, and can be used for vector cloning of the N-terminal region and the repetitive sequence region. That is, the DNA fragment of the N-terminal region obtained by amplification by the PCR method can be digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI and cloned into an appropriate vector.
  • general-purpose vectors such as pUC118 and pUC19 can be used.
  • the TA closing method is also possible.
  • a vector for TA closing is used (for example, pGEM-Teasy vector (manufactured by Promega). ) Etc. Available.
  • the repetitive sequence region can be cut with restriction enzymes EcoRI and BamHI, and the C-terminal region can be digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI and cloned. These plasmids are once introduced into E. coli XL1-b1ue and transformed.
  • This recombinant bacterium is cultured, prepared in a large amount, disrupted, and the plasmids pUC-180Ni :, pUC-180Rp and pUC-180Ct are isolated and fractionated.
  • p UC- 18ON t is restricted by restriction enzymes EcoRI and Scal
  • pUC-180Rp is restricted by restriction enzymes E 0 and 1 ⁇ 1 "0 1,11 Plasmid pUC-1 containing DNA coding for the full length of human p180 protein, by ligating DNA fragments obtained by cutting 180-1 with restriction enzymes MroI and ScaI to each other.
  • a DNA fragment encoding a peptide chain substantially comprising the human P180 protein region contains a repetitive sequence and is unstable, so that pTr c 99A, It is more desirable to insert and store low-copy-number, more stable vectors in transformants such as KK-223_3, for which pUC-180f plasmid is replaced with the restriction enzymes BamHI and Sam. Digestion with pe I yields a DNA fragment of approximately 3.8 kbp that can be ligated between the low copy number, more stable vector restriction enzymes BamHI and SpeI.
  • An example of such an example is pTSX-180f described in Example 3.
  • This plasmid is introduced into a host cell (for example, Escherichia coli XL1-b1ue strain) and transformed.
  • a host cell for example, Escherichia coli XL1-b1ue strain
  • a transformant showing ampicillin resistance was selected, and further selected by the colony hybridization method using the p180 gene as a probe to obtain the full-length human p180 protein.
  • a transformed microorganism into which a plasmid containing cDNA has been introduced can be obtained.
  • Full length of human P180 protein or cleavage of herpesvirus protease DNA encoding the amino acid sequence containing the sequence can be subcloned into a plasmid for protein expression to construct an expression plasmid for expressing the recombinant human p180 protein.
  • a part of the human p180 protein gene is a full-length, or a fused recombinant P180 protein obtained by linking them to other genes.
  • Genes can be used.
  • Genes linked to the human p180 protein gene include GST gene, / 3-galactosidase gene, maltose-binding protein gene, (HIS) 6g gene, myc gene and other fusion proteins. Any gene can be used.
  • the production of a recombinant human p180 protein in a host cell can be induced by forming a translation region encoding the fused human p180 protein under the control of an inducible promoter. Desirable. Examples of such inducible promoter Isseki, tac, it may also be filed, but lac or tr p one promoter evening and the like in what promoters other similar les. Examples of expression promoters for eukaryotic cells include the CMV promoter, SR alpha promoter, and EF1 promoter.
  • the human P180 protein contains a Herpesvirus protease cleavable sequence, and in the case of HCMV, it contains three sites (SEQ ID NOs: 1, 2, and 3). It is possible to create a recombinant P180 protein mutant in which these cleavable sequences are artificially modified, and to specify the sequences necessary for cleavage by a herpesvirus protease.
  • Recombinant P180 protein variants can be generated, for example, using a plasmid encoding the full-length human p180 protein or a gene sequence containing a cleavable sequence of a herpesvirus protease, e.g., cleavable. It can be made by modifying palin in the sequence to alanine. Substitution of a specific base on a plasmid can be performed by a known technique.
  • a eukaryotic cell or a prokaryotic cell such as Escherichia coli in which a replication origin or a promoter incorporated in the vector works can be used.
  • T antigen eg, 2993 T cells and COS cells
  • T antigen eg, 2993 T cells and COS cells
  • phosphate Any known method such as the Lucidium method, the DEAE-dextran method, the ribosome method, and the electroporation method is possible (for example, Experimental Medicine Supplement “Genetics Handbook”, Yodosha, 1991) , See).
  • transfection can be performed using the phage to introduce the gene into animal cells. (Yokoyama-Kobayashi and Kato, Biochem. Biophys. Res. Co. rec. Un. 192: 935-939 (1993)).
  • Expression in prokaryotic cells is performed by using a plasmid for fusion protein expression and transforming the transformed microorganism into a host cell (for example, Escherichia coli XL1-b1e strain can be used). After selection of transformants showing ampicillin resistance, the colony hybridization method using a gene coding for the C-terminal region of human p180 protein or human p180 was selected.
  • the protein can be selected by a western protecting method using an antibody against the C-terminal region of the protein.
  • the antibody to be used can be prepared by a conventional method using the recombinant human P180 protein as an immunogen.
  • the production of a fusion protein by a recombinant bacterium and the production of a recombinant substrate from the culture can be carried out, for example, by the following procedure.
  • a recombinant bacterium having an expression plasmid that expresses the recombinant human P180 protein as a fusion protein was transformed into a 5 L Erlenmeyer flask using a 1 L LB medium supplemented with ampicillin. C, Incubate with shaking for 6 hours. Next, when the turbidity of the culture broth at 600 nm exceeds 0.5, isopropyl-1-D was added to the medium to induce the expression of the GST-recombinant GST fusion p180 protein. —Add thiogalactopyranoside (IPTG) to a final concentration of 0.2 mM. Further, shake culture is performed at 28 for 4 hours, and the obtained culture is centrifuged to collect the cells.
  • IPTG thiogalactopyranoside
  • the collected cells are suspended in a buffer solution equilibrated with glucan thione sepharose 4B column (50 mM Tris-HC1, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, hereinafter referred to as buffer A). It becomes cloudy and disrupts the cells by ultrasonic waves. Thereafter, the insoluble fraction is separated by centrifugation to obtain a supernatant containing a soluble protein. Only the recombinant GST-fused p180 protein dissolved as a soluble protein in this supernatant can be purified by the following means.
  • the supernatant to be collected is loaded onto a glutathione Sepharose 4B column equilibrated with buffer A, and the GST-fused p180 protein dissolved in the supernatant is specifically adsorbed to the column. Let it. Wash the column with buffer solution A to remove unadsorbed components. Thereafter, the GST-fused p180 protein adsorbed on the column is eluted with the buffer solution A to which 2 OmM reduced glutathione is added. The eluted GST-fused p180 protein was dialyzed against buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCL 1 mM EDTA, pH 7.4), and a commercially available ultrafiltration membrane such as Centricon 30 was used. Amicon).
  • the substrate proteins used in the Herpesvirus protease digestion experiment in vitro include a natural substrate that is affinity-purified from human-derived cultured cells using specific antibodies, and a recombinant substrate that is expressed in human-derived cultured cells.
  • Recombinant substrate purified by affinity purification using a specific antibody, or a portion containing the herpes virus protease cleavage recognition sequence from the entire p180 protein sequence is expressed as a fusion protein
  • the used recombinant substrate protein can be used.
  • affinity purification of the natural substrate either immunoprecipitation or purification using an affinity column may be used, and the antibody used is a recombinant human P180 protein that is used as an immunogen. Can be created.
  • the purified (or partially purified) recombinant GST-fused p180 protein can be used in an in vitro vitro herpesvirus protease digestion experiment by the following procedure.
  • To the buffer for measuring protease activity add 0.3 ⁇ g of the recombinant substrate and 0.01 to 0.03 ⁇ g of the recombinant protease, respectively, and at 30 ° C. or 4 ° C. for 4 hours. After incubation, stop the reaction by adding 2X sample buffer for S.DS-PAGE.
  • the reaction mixture is subjected to SDS-PAGE analysis, Western blotting, and immunostaining using specific antibodies.
  • a novel endogenous substrate of the virus virus protease provided by the present invention Certain native human p180 proteins can be degraded in cultured cells that have expressed herpesvirus protease.
  • an embodiment will be described.
  • herpes virus protease in cultured cells are known (see Liu et al (1991) J. Virol. 65, 5149-5156, Welch et al (1991) ProNASUSA 88, 10792-10796, Sardana ( 1994) 269, 14337-14340), and in the following examples, the protease encoded by the UL80 gene of HCMV was subcloned into a plasmid PcDNA4 for expressing a protein for eukaryotic cells and used.
  • viral DNA was extracted from cells infected with cytomegalovirus (AD169 strain) according to the Hirt method (Robert, L., et al., J. gen. Virol., 64, 373-389 (1983). )).
  • the DNA encoding UL80 protease was obtained by performing PCR using the two oligonucleotides as primers and the extracted viral DNA as type III. This was cloned between the BamHI and XbaI sites of the vector pcDNA4 (Invitrogen), and the (HIS) 6- tagged UL80 protease protein expression plasmid pC— for eukaryotic cells was added.
  • UL 80 has been built.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding UL80 protease was determined by the deoxynucleotide method, and it was confirmed that the nucleotide sequence did not differ from the nucleotide sequence already reported in the literature (Chee et al (1990) Curr. Top Microbiol. Immunol. 154, 125-169).
  • the expression plasmid was transfected into 293 T cells to express UL 80 protease in 293 T cells. Thirty hours after the transfusion, the cells were washed and collected, and subjected to SDS-PAGE and ⁇ -estimated blotting analysis.
  • HIS HIS 6- tag antibody
  • Fig. 2 p-stamplot analysis of p180 protein was performed.
  • the native p180 protein was degraded, and a smaller molecular weight protein (arrow) was detected. Is not expressed, the native p180 protein is degraded. No (lane 2). From these results, degradation of the native p180 protein in 293T cells expressing HCMV protease was confirmed.
  • the P180 protein was amplified by PCR using single-stranded cDNA of MRC-5 cells (purchased from Dainippon Pharmaceutical) as type III.
  • MRC-5 cells purchased from Dainippon Pharmaceutical
  • 1st strand cDNA use 1st strand cDNA synthesis kit for RT-PC (manufactured by Behringa Co., Ltd.), and use this as a type II for amplification by PCR using LA Taq polymerase (manufactured by Takara Shuzo). went .
  • N-terminal region pl80Nt
  • repetitive sequence region pl80Rp
  • C-terminal region pl80Ct
  • the restriction enzyme BamHI cleavage site is located at the 5 'untranslated region for the N-terminal region
  • the restriction enzyme BamHI cleavage site is located at the 3' side for the repetitive sequence region
  • the restriction enzyme BamHI cleavage site is located at the 5 'side for the C-terminal region.
  • a primer to which a restriction enzyme BamHI cleavage site was added was synthesized and amplified by the PCR method. The primers used are as follows.
  • the nucleotide sequence 471 of the 180 protein has a restriction enzyme EcoRI cleavage site, it was used when cloning the N-terminal region and the repetitive sequence region into a vector. That is, the amplified DNA fragment of the N-terminal region was digested with restriction enzymes EcoR I and BamHI, followed by low melting point agarose gel electrophoresis to separate a fragment of about 550 bp and phenol. The fragments were recovered by extraction. The recovered DNA fragment was previously digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI and inserted and ligated between EcoRI and BamHI of the pUC118 vector, which was separated and recovered by low melting point agarose electrophoresis. , PUC—18 ⁇ .
  • the DNA fragment of the repetitive sequence region amplified in the same manner was digested with restriction enzymes Ec0RI and BamHI, and a low-melting point agarose gel electrophoresis was used to separate and collect about 1450 bp fragment.
  • the DNA fragment containing the recovered repetitive sequence region was inserted and ligated between EcoRI of pUC118 and BamHI to obtain pUC-180Rp.
  • About the C-terminal region a fragment of about 2200 bp was separated and recovered by low-melting point agarose electrophoresis, and inserted and ligated to the pGEM-Teasy vector (Promega) using the TA cloning method.
  • This plasmid was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI.
  • plasmids are once introduced into Escherichia coli XL I-b1ue strain and transformed, and the recombinant bacteria are cultured, prepared in a large amount, disrupted, and transformed into plasmid pUC—18 ONt, pUC-180 Rp and pUC-180 Ct were isolated and fractionated.
  • coli XL I-b1ue strain transformed using the marker gene Ampr to select a transformant strain exhibiting ampicillin resistance, and probed for the p180 gene.
  • This recombinant bacterium is cultured, prepared in large quantities, isolated and separated to obtain a plasmid pUC-180f containing cDNA encoding the full length of the human p180 protein (see Fig. 1).
  • the DNA fragment encoding the peptide chain substantially comprising the human P180 protein region contains the repetitive sequence represented by 590 to 1302 in SEQ ID NO: 6, so that it is more stable and has a higher copy number in transformed bacteria. Had to be inserted into the vector with the least number.
  • a vector having a site to be cleaved with the restriction enzyme SpeI in pTrc99A which is a derivative of the general-purpose PKK233-2 vector, was prepared as follows.
  • Trc99A (Pharmacia-Biotech) was digested with the restriction enzymes PstI and HindIII and separated and recovered by low-melting point agarose electrophoresis.
  • a synthetic oligo DNA having a site cleaved by the restriction enzyme SPeXh0NotI was prepared (5′-GACTAGTCTCGAGCGGCCGCA-3 ′ and 5′-AGCTTGCGGCCGCTCGAGACTAGTCTGCA-3 ′), and the closing site of Trc 99A was prepared.
  • a new cloning site having a site to be inserted and ligated between III and a site cut by the restriction enzyme SpeXhoNotI was additionally inserted and named pTSX.
  • the pUC-180f plasmid was digested with the restriction enzymes BamHI and SpeI to obtain a DNA fragment of about 3.8 kbp, and the restriction enzymes BamHI and Spe of pTSX-1 were obtained. Insertion and ligation were performed between I to construct pTSX-180f. This plus The transformant was introduced into the Enterobacter coli XL1-b1ue strain, transformed using the marker gene Ampr to select a transformant strain exhibiting ampicillin resistance, and further colony hybridized using the p180 gene as a probe. The selection was made by the sessionion method. One of these was named E. c 01 i XL 1—b 1 ue ⁇ p TSX — 180 f for identification.
  • the cDNA sequence of the cloned human p180 protein was determined using a dye terminator cycle sequencing ready reaction kit FS (manufactured by Applied Nano Systems) according to the dideoxy method. The assignment of bases was confirmed from the analysis results on both strands of the double-stranded DNA, and the results were further confirmed using a plurality of primers. Sequencing was performed on multiple clones. As a result of the analysis, it was confirmed that cDNA of human P180 protein represented by SEQ ID NO: 6 was obtained.
  • pTSX-1 contains a trc promoter and a transcription termination signal, and constitutes an expression vector in prokaryotic cells. Therefore, pTSX-180f, in which the cDNA of human 180 protein is inserted into p-c3 ⁇ _1, can induce the expression of recombinant human p180 protein in prokaryotic cells, The expression of the 180 protein was confirmed by the following method.
  • the recombinant bacterium containing pTSX-180 ⁇ was cultured with shaking at 37 ° C for 16 hours using 2 mL of LB medium supplemented with ampicillin. The culture was diluted 10-fold using LB medium and cultured at 28 ° C for 2 hours.
  • XL1-b1ue was transformed using p180 protein expression vector plasmid pcDNA-180f to obtain multiple single colonies, and 37 ° C using 2 mL of LB medium at 37 ° C. After shaking culture for 16 hours, plasmid was extracted from the cells. Approximately 500 ng of these plasmids are digested with the restriction enzyme HindIII, and subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis. A fragment derived from plasmid pTSX-180f, which generates a 2.3 kbp fragment, is inserted in the forward direction. Clones have been selected.
  • This recombinant bacterium was cultured to prepare a large amount, a plasmid was extracted by the alkaline method, and a plasmid for transfusion was isolated and fractionated using Qiagen tip (manufactured by Qiagen).
  • Recombinant human type 180 protein was produced in cultured cells by transfection into 293 T cells and CH cells.
  • 293 T cells and CHO cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle (DMEM) medium containing 10% fetal bovine serum at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . 0. 7 ⁇ 0. 8 X 1 0 5 cells to 6-well plates planted (Nunc, diameter 3 cm holes), 5% C0 2 presence and 20-22 hours at 3 7 ° C.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle
  • X 1 0 5 cells to 6-well plates planted (Nunc, diameter 3 cm holes), 5% C0 2 presence and 20-22 hours at 3 7 ° C.
  • To the cells replaced with fresh medium add 1 mL of DME MO containing 3 ⁇ L of the plasmid obtained in (1) and 3 ⁇ L of Fugene reagent (manufactured by Behringer), and in the presence of 5% CO 2.
  • the cells were cultured at 37 ° C for 30 hours. The cells were washed and recovered, and after SDS-PAGE, Western blotting was performed using rabbit anti-p180 antibody. The recombinant p180 of p180 protein in 293T cells and CHO cells was obtained. The expression of the protein was confirmed.
  • Example 6 Degradation of Recombinant P180 Protein in 293T Cells Expressing HCMV UL80 Protease:
  • the recombinant human P180 protein is cultured by transfecting the human p180 protein expression vector plasmid pcDNA-180f into 2293 T cells and CHO cells in the same manner as in Example 5. Produced in cells. At this time, by co-transfecting the expression plasmid pC—UL80 of the protease encoded by the HCMV UL80 gene, the UL80 protease and the recombinant human P1 were cotransfected. The 80 proteins were co-expressed and it was determined whether the recombinant human p180 protein was degraded by UL80 protease.
  • FIG. 4 shows an example of 293 T cells.
  • the human P180 protein contains a Herpesvirus protease cleavable sequence, and in the case of HCMV, three places in SEQ ID NO: 5 (699-702, 805-80) 9, 990-903) included. These cleavable sequences were artificially modified A recombinant p180 protein mutant was prepared, and its effect as a substrate on UL80 protease was examined as follows.
  • Plasmid pc DNA—180 f was mutated into a herpesvirus protease cleavable sequence using site—directed mu tagenesis kit (Stratagene) (L699P, V805A). , V990A) to which an expression vector pcDNA-18Om was prepared. That is, in SEQ ID NO: 5, the leucine (L) at position 699 is substituted with proline (P), the valine (V) with position 8.5 is substituted with alanine, and the valine (V) at position 990 is substituted with alanine (A) Was mutated.
  • the recombinant p180 protein mutant expressed by this vector pc DNA-180 m and the UL80 protein were expressed in CHO cells in the same manner as in Example 6, and the recombinant p180 was expressed.
  • the 180 protein mutant was detected with a rabbit anti-p180 antibody.
  • the recombinant p180 protein mutant When the UL80 protease is not expressed, the recombinant p180 protein mutant is overexpressed at the position indicated by the arrow (Fig. 5, lane 2), indicating that the UL80 protease is not expressed.
  • the wild-type recombinant p180 protein When expressed, the wild-type recombinant p180 protein is degraded, resulting in the detection of proteins of lower molecular weight (lane 1), but in the case of the recombinant p180 protein mutant (FIG. 5, lane 3), indicating that degradation by the UL80 protease was dependent on these cleavable sequences. That is, it is clear that the amino acid sequences 699-1702, 855-809, 990-903 in the human p180 protein are required for cleavage by UL80 protease. .
  • PCR using the plasmid pUC-180Ct containing the gene encoding the C-terminal region of the human p180 protein as a primer ('-agggcctgagggaggtgaataaggagctg-3' and 5'-GCTCAGACAGAGGTGCCCTCCTT-3 ')
  • a low-melting point agarose gel electrophoresis isolates a fragment of about 1.4 kbp and cleaves the sequence of the human p180 protein, a herpesvirus protease.
  • a DNA fragment containing the gene was obtained.
  • the plasmid p GEX-5X-3 is After digestion with BamHI and NotlI, the previously obtained 1.4 kbp DNA fragment was inserted and ligated to obtain a recombinant plasmid.
  • This plasmid was introduced into Escherichia coli XL1-blue strain for transformation, a transformant showing ampicillin resistance was selected using the marker gene Ampr, and a colony hybridizer using the pUC-180Ct gene as a probe was selected. The selection was made by the Isseyon method. E.coli XL 1 -blue-pGEX-180sub was named for one ⁇ 3 of them.
  • This transformant was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology Industrial Research Institute, 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan, January 7, 2000. Received the accession number PERM P-17693.
  • IPTG Galactopyranoside
  • the culture was shake-cultured at 28 ° (4 hours, and the obtained culture was centrifuged to collect the cells.
  • the collected cells were mixed with a glutathione Sepharose 4B column equilibrated buffer (5 OmM Tr is HC1, 15 OmM NaCl, ImM EDTA, pH 8.0, hereinafter referred to as buffer A) and disrupted the cells by ultrasonication.
  • the insoluble fraction was separated by centrifugation.
  • a supernatant containing soluble protein was obtained, and the supernatant was loaded onto a Glutinthione Sepharose 4B column equilibrated with buffer A, and the GST-fused p180 protein dissolved in the supernatant was applied to the column.
  • HCMV protease produced in cultured cells was purified and used.
  • affinity purification was carried out by a Ni-NTA column (manufactured by Quiagen) using the PenHis TAG sequence which is a known technique.
  • the medium of 293T cells that had become 80% confluent in a 15-cm culture dish was replaced with fresh medium, and cultured at 37 ° C. for 20 to 22 hours in the presence of 5% C02.
  • To the cells replaced with fresh medium add 1 mL of DMEM containing 30 ⁇ L of PC-UL 80 plasmids 151 51 and 1 ⁇ : 6116 reagents (manufactured by Hopkins), and add 37 mL of 5% C02.
  • the cells were cultured at 30 ° C for 30 hours.
  • the cells were washed with PBS, and the lysate (1 Triton x 100, 10 mM imidazole, 1 ⁇ g / mL of Peptidyltin, 5 ⁇ g / mL of Leptin), 0.3 M of NaCl, 50 mM Tris After adding HC1 pH 7.4), the mixture was allowed to stand on water for 30 minutes, and then centrifuged at 1,000 O xg for 30 minutes to obtain a supernatant containing soluble protein. The UL 80 protein dissolved in the supernatant was specifically adsorbed to the Ni-NTA column.
  • the column was washed with buffer solution A (2 OmM imidazole, NaC 10.3 M, 50 mM Tris HCl pH 7.4), and after the unadsorbed portion was washed out, the buffer solution containing 20 OmM imidazole was added.
  • A eluted the UL 80 protein adsorbed on the column.
  • the eluted UL80 protein was dialyzed against buffer B (5 OmM Tris-HC1, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4) and concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon). Then, glycerol was added to a final concentration of 50%, and the mixture was stored at ⁇ 20 ° C.
  • This UL80 protease was used in a digestion experiment of the GST-fused p180 protein in the in vivo mouth by the following procedure.
  • human P180 protein a novel endogenous substrate of the herpesvirus protease provided by the present invention, is used in human herpesvirus-infected cells at a late stage of infection.
  • Treatment with a drug that degraded and inhibited the herpes virus from progressing late in infection eg, using phosphonoacetic acid
  • Digestion experiments were performed in the mouth using HCMV protease produced in E. coli.
  • (HIS) UL80 plasmid with plasmid 6 pTSX—UL80 was constructed.
  • TAL ON column is purified using Penta His TAG sequence, which is a well-known technique.
  • Recombinant bacteria containing the expression plasmid pTSX—UL80, which expresses HCMV protease are shake-cultured in a 2 L Erlenmeyer flask at 38 ° C in 0.4 L LB medium supplemented with ampicillin. did. Then, when the absorbance at 600 nm of the turbidity of the culture broth exceeds 0.5, isopropyl-1-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was terminated in the medium to induce the expression of HCMV protease. An amount was added so that the concentration became 0.2 mM. Further, shaking culture was performed at 37 ° C for 3 hours, and the obtained culture solution was centrifuged to collect the cells.
  • IPTG isopropyl-1-D-thiogalactopyranoside
  • the collected cells were lysed in a buffer for solubilization A (2 OmM Tris—HC1, 300 mM NaCl, 1 OmM 2 -ME. Peptide 1 g / mL. PH 8 • 0, 1 OmM Suspended in imidazole) and disrupted cells by ultrasound . Thereafter, the insoluble fraction was separated by centrifugation to obtain a supernatant containing soluble proteins. The UL80 protein dissolved in the supernatant was specifically adsorbed to the TALON column equilibrated with the buffer A for solubilization. The column was washed with washing buffer B (2 OmM imidazole, NaCl 0.3 M, 50 mM TrisHC lp H 8.0, 1 OmM 2-ME).
  • washing buffer B (2 OmM imidazole, NaCl 0.3 M, 50 mM TrisHC lp H 8.0, 1 OmM 2-ME).
  • the UL 80 protein adsorbed on the column was eluted with the solubilization buffer A containing OmM imidazole.
  • the eluted UL80 protein was dialyzed against a buffer C for activity measurement (PBS, ImM DDT, 1 mM EDTA, 10% glycerol) and concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon).
  • This UL80 protease was used in a digestion experiment of the GST-fused p180 protein in the in vivo mouth by the following procedure.
  • the optimum pH for this reaction is around neutrality (pH 7.5), and various protease inhibitors (antipine, chymosin, leupeptin, aprotinin, epsin, vessin, 64-64) , And PMSF) were not inhibited.
  • the classical serine protease inhibitor aprotinin which is less likely to be inhibited by PMSF, is consistent with the previously reported properties of herpesvirus protease.
  • a quench experiment was performed by changing the amount of glycerol in the buffer for activity measurement. Degradation product of GST fusion p180 protein recombinant substrate is anti-p18
  • HCMV human herpesvirus-infected cells
  • MRC-5 human fetal lung fibroblast
  • MOI multiplicity of infection
  • FIG. 7 shows the results of immunostaining using various types of specific antibodies. Only in the cells inoculated with the virus, the p180 protein was degraded 4 to 6 days after inoculation (see FIG. 8).
  • virus-inoculated cells and non-virus-inoculated control cells were prepared, and a fluorescent antibody method was performed using an antibody against gH antigen (manufactured by ABI), which is an HCMV late antigen, and an antibody against p180 protein.
  • gH antigen manufactured by ABI
  • p180 protein was degraded in HCMV infected cells at a late stage of infection.
  • human p180 protein is cleaved in (1) cells infected with human herpes virus and (2) cultured cells in which herpes virus protease is forcibly expressed, and (3) molecules (4) It is clear that the molecule is cleaved in a herpesvirus protease digestion experiment in the in vitro mouth.
  • Herpesvirus protease acts on proteins other than the assembly protein (precursor protein), and it was not expected that any substance other than the assembly protein would be present.
  • the P180 protein which was revealed to be an endogenous substrate according to the present invention, differs from the assembly protein in localization in cells, etc., and thus has a new role in the infection of herpes virus proteases. The mechanism of action is assumed. This is very important in the development of inhibitors of the virus virus protease and suggests a new direction.
  • an appropriate activity assay is essential for the development of a herpesvirus protease inhibitor as an anti-herpesvirus agent.
  • the activity measurement using the substrate does not show a sufficient reaction rate, There is a current situation in which it has been difficult to efficiently evaluate an inhibitor of oral theatase activity.
  • By utilizing the cleavage sequence present in the human p180 protein it is possible to devise a more efficient method for measuring the activity, which may lead to a strong promotion of the development of anti-herpes virus agents. is there.
  • the recombinant human p180 protein can be easily recovered as a soluble protein in Escherichia coli, it can be used as a recombinant human 180 protein substrate.
  • FIG. 1 shows that the cDNA encoding the full-length human P180 protein is divided into an N-terminal region (pUC-pi80Nt), a repetitive sequence region (pUC-pl80Np) and a C-terminal region (pUC-pl80Ct).
  • Constructing plasmid pUC-180 ⁇ which consists of inserting it into the vector, and treating pUC-180f and pTSX-1 with restriction enzymes to convert pUC-180f into pTSX-1
  • FIG. 2 shows the results of degradation of the native p180 protein in 293T cells expressing the UL80 protease of human cytomegalovirus.
  • FIG. 3 shows the expression of the recombinant p180 protein in E. coli by CBB staining in SDS-PAGE analysis.
  • FIG. 4 shows the results of the degradation of the recombinant p180 protein in 2293 T cells in which the UL80 protease of human cytomegalovirus was expressed.
  • Figure 5 shows the degradation of the recombinant P180 protein in CHO cells expressing the human cytomegalovirus UL80 protease (lane 1) and the non-degradation of the recombinant p180 protein mutant (lane 1). The results of 3) are shown.
  • Figure 6 shows the results of purifying the GST-fused recombinant p180 protein expressed in Escherichia coli.
  • Figure 7 shows the GST fusion p18 with the addition of human cytomegalovirus protease. The results of in vitro degradation of the 0 protein recombination substrate are shown.
  • FIG. 8 shows the results of the degradation of human p180 protein in cells infected with human herpes virus progressing only in virus-inoculated cells and at a later stage of infection.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明細書
ヘルぺスウィルスプロテアーゼの検出用基質及びその製法 〔発明の属する技術分野〕
本発明はへルぺスウィルスプロテアーゼの検出用基質及びその製造方法に関す る
〔発明の背景、 従来の技術〕 亜科からなる DN Aウィルスである。 アルファヘルぺスウィルスとしては単純へ ルぺスウィルス （HSV) 1型および 2型、 および帯状疱疹ウィルス （VZV) があり、 ベ一タヘルぺスウィルスとしてはヒトサイ トメガロウィルス （HCMV ) 、 ヒトヘルぺスウィルス 6 (HHV— 6) およびヒトヘルぺスウィルス 7 (H H V - 7 ) があり、 そしてガンマへルぺスウィルスとしては E Bウィルス （EB V) およびヒトヘルぺスウィルス 8 (HHV- 8) があり、 合計で 8種類のウイ ルスがヒトに感染するヒトヘルぺスウィルスとして報告されている。
ヒトヘルぺスウィルスは、 様々な病態の原因ウィルスである。 多くのヒトヘル ぺスウィルスは不顕性感染ののちに様々な刺激によつて再活性化されるために、 重篤な疾患を引き起こしうる遍在する日和見病原体となっている。 臓器移植患者 やエイズ患者のように免疫不全の状態にあるヒトには HCMVに起因する肺炎、 網膜炎が多発する。 また HCMVは先天的に感染した幼児において深刻な感染疾 病を引き起こしうる。 VZVは多くの深刻な疾病即ち水痘、 帯状疱疹、 およびへ ルぺス後神経痛を引き起こすことが知られている。 HSV— 1は三叉神経節に潜 伏感染し、 後に再活性化され角膜炎、 口唇ヘルぺスを引き起こす。 HSV— 2は 、 通常、 性的接触によって獲得され、 生殖器ヘルぺスを引き起こす。 HHV— 8 はエイズに頻発するカポジ肉腫の原因ウイルスである。
抗ヘルぺスウィルス剤としては、 ウィルス遺伝子複製過程の選択的な阻害作用 を利用する核酸系抗ウィルス剤 （例としてガンシクロビル、 ァシクロビル） が用 いられているが、 現状では次第にこれら核酸系抗ウィルス剤に対する耐性を示す ウィルス株が出現してきており、 これら核酸系抗ウィルス剤に代わる非核酸系抗 ウィルス剤の開発が望まれている。 そのような非核酸系抗ヘルぺスウィルス剤と して有力な候補はプロテア一ゼ阻害剤である。
ヘルぺスウィルス科の全てのウィルスは複製に必須であるセリンプロテア一ゼ をコードしており （Holwerda (1997) Ant iviral Res. 35, 1-21を参照） 。 ヘル ぺスウィルスがコードするプロテア一ゼのタンパク質分解活性がウィルスカプシ ドの成熟において必須の役割を演じているので、 プロテアーゼ阻害剤は感染性ゥ ィルス粒子の形成を阻害し、 それによつて抗ウィルス作用を発現するとされる。 ヘルぺスウィルスがコ一ドするプロテアーゼは、 これまで知られている宿主細胞 由来のセリンプロテア一ゼとは異なる活性中心を持つウィルス固有のセリンプロ テアーゼであり、 8種のヒトヘルぺスウィルスの全てで極めてよく保存されてい るため、 抗ウィルス剤の標的として注目されている。
ヘルぺスウィルスプロテア一ゼはウィルスカプシドのァッセンプリ一蛋白質と の融合ポリべプチド鎖として翻訳される。 これまでヘルぺスウィルスプロテア一 ゼの主要な役割はこの前駆体ポリべプチド鎖の切断にあると考えられてきた。 抗ヘルぺスウィルス剤としてのへルぺスウィルスプロテアーゼ阻害剤の開発の ためには適切な活性測定法の使用が必須である。 既に、 幾つかのヘルぺスウィル ス由来のプロテアーゼの製造方法および活性測定法が報告されており （特開平 9 - 2 9 9 0 7 9号明細書、 特開平 1 0— 2 0 3 9 6 7号明細書、 特表平 1 0— 5 0 3 6 4号明細書)、 この前駆体蛋白質中に見いだされた特異的切断配列を利用 した基質が用いられてきた。 しかしながら、 それらの活性測定法は十分な反応速 度を示しておらず、 プロテアーゼ活性阻害物質の効率的な評価を困難にしていた o
また、 これまでの技術は全て、 ヘルぺスウィルスがコードするプロテア一ゼの 主要な基質は前駆体ポリべプチド鎖それ自身であるという知見に基づき発展して きたものである。 既に試験管内において抗ヘルぺスウィルス作用を示すプロテア
—ゼ活性阻害物質が報告されている （特開平 1 0— 2 0 3 9 6 7号明細書、 特開 平 1 1一 7 1 2 8 3号明細書） 。 しかしながら、 生体内において優れた抗ヘルべ スウィルス作用を示すプロテアーゼ活性阻害物質は未だ報告がない。
前駆体ポリぺプチド鎖以外にヘルぺスウィルスプロテアーゼの主要な基質とな りうる蛋白質が提供されれば、 これまでと異なる機構に基づいた新たな抗ヘルべ スウィルス剤の開発方法が示唆され、 ひいては生体内において優れた抗ヘルぺス ウィルス作用を示すプロテアーゼ活性阻害物質の開発に役立つことが期待できる
〔発明が解決しょうとする課題〕
本発明はへルぺスウィルスプロテアーゼの重要な新規内因性基質及びその製造 方法を提供するものである。 ， 〔課題を解決するための手段〕
ヘルぺスウィルスプロテア一ゼの新規内因性基質とは、 分子内にプロテア一ゼ 切断可能配列を含むことが最低の必要条件ではあるが、 それだけでは抗ヘルぺス ウィルス剤の開発に寄与するために有用な新規内因性基質の条件を満たすとは限 らない。 従って、 分子内にプロテア一ゼ切断可能配列を含み、 実際にヘルぺスゥ ィルスプロテア一ゼにより特異的に切断され得る分子であり、 さらにそのウィル ス感染課程においてもその基質が特異的に切断され得る分子である場合に、 有用 な新規内因性基質といえる。
詳しくは、 ヘルぺスウィルスプロテア一ゼの重要な新規内因性基質とは、 （ 1 ) ヒトヘルぺスウィルス感染細胞中においておよび （2 ) ヘルぺスウィルスプロ テア一ゼを強制的に発現させた培養細胞中において切断され、 かつ （3 ) 分子内 にプロテアーゼ切断可能配列を含む蛋白質分子であり、 （4 ) インビトロにおけ るへルぺスウィルスプロテアーゼ消化実験において特異的切断を受ける分子であ 本発明者らは、 上記課題を解決すべく、 ヘルぺスウィルスプロテア一ゼの新 規内因性基質を同定するための研究を鋭意進めた結果、 p 1 8 0蛋白質がヘルべ スウィルスプロテアーゼによって感染後期において特異的に分解され、 ヘルぺス ウィルスプロテア一ゼの重要な新規内因性基質であることを見出し、 本発明を完 成するに至った。
本発明のへルぺスウィルスプロテアーゼの新規内因性基質は宿主動物細胞蛋白 質であることを特徴とし、 従来知られていたへルぺスウィルス自身のゲノム D N Aにコードされている前駆体ポリぺプチド鎖とは全く異なったタイプの新規な基 質である。 そしてさらにこの同定された新規内因性基質をコードする D NAを組 み込んだプラスミ ドを構築し、 組換え型蛋白質を生成させ、 この新規内因性基質 由来である組換え型基質蛋白質を製造する方法を完成させた。
本発明において、 ヒト p 1 8 0蛋白質を実質的に含んでなるペプチド鎖とは 、 ヒト p 1 8 0蛋白質領域に相当するアミノ酸配列を付加させたペプチド鎖、 又 はへルぺスウィルスプロテアーゼの新規内因性基質としての活性作用に影響を与 えない範囲で天然のヒト p 1 8 0蛋白質領域中にアミノ酸残基の変換、 欠損、 揷 入を有するペプチド鎖を意味する。 これらのアミノ酸配列の改変は、 配列番号 5 のァミノ酸配列をコードする塩基配列、 具体的には配列番号 6の D N A塩基配列 を基に P C R法等を利用して改変するアミノ酸配列をコ一ドする D N A塩基配列 への改変を行うことで、 対応する改変べプチド鎖に翻訳 ·調製を行うことができ る。
本発明のへルぺスウィルスプロテアーゼの新規内因性基質は宿主動物細胞由 来の蛋白質であるので、 従来のへルぺスウィルスプロテアーゼの主要な基質とし て同定されていたウィルス D NAにコ一ドされた前駆体ポリべプチド鎖とは全く 異なる機構に基づく新規な抗ヘルぺスウィルス剤の開発の可能性を示唆する。 〔発明の実施の態様〕
本発明で提供されるへルぺスウィルスプロテアーゼの新規内因性基質であるヒ ト P i 8 0蛋白質は、 配列番号 1— 3で示されるヘルぺスウィルスプロテア一ゼ 切断可能配列を含む蛋白質である。
また、 本発明はヒト p 1 8 0蛋白質領域を実質的に含んでなるペプチド鎖をコ ―ドする D N A断片を発現ベクターに挿入連結してなる組み換え型ヒト p 1 8 0 蛋白質発現べクタ一を提供する。
また、 本発明は、 ヘルぺスウィルスプロテア一ゼの切断可能配列を含んだヒト P 1 8 0蛋白質のヘルぺスウィルスプロテアーゼの切断可能配列を実質的に含ん でなるぺプチド鎖をコードする D NA断片を、 発現ベクターに揷入連結してなる 組み換え型ヒト p 1 8 0蛋白質発現基質を提供する。
さらに、 本発明は前記組み換え型ヒト p 1 8 0蛋白質発現ベクターで形質転換 した微生物を培養生産し、 組み換え型ヒト p 1 8 0蛋白質を採取することからな る組み換え型ヒト p 1 8 0蛋白質を製造する方法を提供する。 さらには、 本発明は前記組み換え型ヒト p 1 8 0融合蛋白質発現ベクターで形 質転換した微生物を培養生産し、 菌体内に可溶性蛋白質として産生する組み換え 型ヒ ト p 1 8 0融合蛋白質を採取することからなる組み換え型ヒト p 1 8 0蛋白 質を製造する方法を提供する。
本発明によって提供されるへルぺスウィルスプロテア一ゼの新規内因性基質で あるヒト P 1 8 0蛋白質をコードする DNAはラングレ一 （Langley R et al.， (1998) DNA Cell Biol., 17, 449-460) 他によって報告された HEMP 3 7、 H US AX 5 5, ES I 8 7 0中の相当する遺伝子断片を連結させたものと実質的 に同じ塩基配列を含んでいる。 ヒト p 1 8 0蛋白質には、 反復配列の反複数の異 なるイソフォームが知られており、 配列番号 6で示した遺伝子配列は 24回反復 の新規な配列である。 本発明で用いられる遺伝子は上記の p 1 8 0遺伝子のほか 、 それと同等の機能を有する程度に修飾 （自然あるいは人為的に塩基の脱落、 揷 入されたものを含む） されたものであってもよい。 また融合蛋白質として発現さ せるように、 ヒト p 1 8 0遺伝子を適当な遺伝子と連結させたものであってもよ い。 ヒト p 1 8 0遺伝子と連結させるその他の遺伝子としては、 グル夕チオン一 S— トランスフヱラ一ゼ （分子量約 2 6, 0 0 0、 以下、 GSTという） 遺伝子 、 ベ一夕ガラク トシダ一ゼ遺伝子、 H I S— TAG遺伝子などが挙げられる。 本発明で提供されるへルぺスウィルスプロテア一ゼの新規内因性基質であるヒ ト P 1 8 0蛋白質をコードする DNAは、 例えばヒト胎児肺繊維芽細胞 （MRC 一 5細胞） の c D N Aを铸型として P C R法によりクローニングすることが可能 である。 ヒト p 1 8 0蛋白質の全長あるいはヘルぺスウィルスプロテア一ゼの切 断可能配列を含んだァミノ酸配列をコードする DNAを組み込んだプラスミ ドを 得ることができる。 ここで、 ヒト p 1 8 0蛋白質領域を実質的に含んでなるぺプ チド鎖をコードする DNA断片は反復配列 （配列番号 5中のセリン 1 5 9からィ ソロイシン 6 1 0で示される） を包含し不安定なため、 pTr c 9 9 A、 pKK - 2 2 3— 3のような形質転換菌において低コピー数でより安定なベクタ一^ ^揷 入して保存することがより望ましい。
PCRによるヒ p 1 8 0蛋白質をコードする cDNAのクローニング方法を 以下に詳しく説明する。 組換え型 P 1 80をコ一ドする DNAを含んでなるプラスミ ドベクターの構築 及び該プラスミ ドベクタ一を導入した形質転換微生物の調製：
先ず、 MR C— 5細胞の一本鎖 c DN Aを鐯型として、 p i 80蛋白質をコ一 ドする DNAを P CR法により増幅するが、 p 1 80蛋白質をコードする DN A の全長を同時に増幅させるのは難しいため、 N末端領域、 反復配列領域、 C末端 領域に分けて増幅させる。 MRC— 5細胞はウィルスの増殖実験などに広く用い られる汎用培養細胞である。 一本鎖 c D N Aの調製は公知のどのような方法でも 可能である。 増幅の際、 反復領域の 5' 及び 3' 末端はそれぞれ N末端領域の 3 ' 末端、 C末端領域の 5' 末端と重複ざせるようにし、 得られた DN A断片を制 限酵素による切断ののち連結結合させることができる。 その際、 好ましくは N末 端領域については 5， 側の非翻訳領域に制限酵素 B amH I切断部位を、 反復配 列領域については 3' 側に制限酵素 B amH I切断部位を、 C末端領域について は 5 ' 側に制限酵素 B amH I切断部位及び 3 ' 側の非翻訳領域に制限酵素 E c oR I切断部位を導入する。 即ち、 既に解明されている p 1 80遺伝子の塩基配 列を参照して、 これらの人為的な塩基配列を付加したプライマーを合成し、 それ を用いて PCR法による増幅を行う。 p 1 80蛋白質をコードする DNAの配列 番号 6中の塩基配列 47 1には制限酵素 E c 0 R I切断部位が存在するので、 N 末端領域、 反復配列領域をべクタ ^クローニングする際利用できる。 即ち、 P CR法により増幅で得られた N末端領域の DNA断片を制限酵素 E c oR Iと B amH Iで消化して、 適当なベクタ一へクローニングできる。 例えば pUC 1 1 8、 pUC 1 9などの汎用べクタ一が利用できる。 Ta qDNAポリメラ一ゼを 使用した P CR法により得られた DN Aの場合は T Aクローユング法でも可能で 、 その場合は TAクロ一ユング用べクタ一が （例えば pGEM-Teasy vector (プロ メガ社製） など） 利用できる。 同様に反復配列領域については制限酵素 E c oR I、 B amH Iで切断し、 C末端領域については制限酵素 E c o R Iと B a mH Iで消化してクローニングできる。 これらのプラスミ ドを、 一旦大腸菌 XL 1— b 1 u e株に導入して形質転換する。 この組換え菌を培養して、 大量に調製し、 破菌して、 プラスミ ド pUC— 1 80Ni：、 pUC— 1 80Rp、 pUC- 1 8 0 C tを単離 ·分取する。 p 1 80蛋白質をコードする DNAの配列番号 6中の 塩基配列 1 829には制限酵素 Mr o I切断部位が存在するので、 反復配列領域 と C末端領域の連結結合に利用できる。 即ちこれらを連結結合させるために、 p UC- 1 8 ON tを制限酵素 E c oR Iと Sc a l、 pUC— 1 80Rp、 を制 限酵素 Eじ 0尺 1と1^1" 0 1、 11〇ー 1 80〇 1を制限酵素 M r o Iと S c a Iで切断して得られる DNA断片を相互に連結させ、 ヒト p 1 80蛋白質の全長 をコ一ドする DNAを含むプラスミ ド pUC— 1 80 f を得ることができる。 上記したようにヒト P 1 80蛋白質領域を実質的に含んでなるペプチド鎖をコ —ドする DN A断片は反復配列を包含し不安定なため、 pTr c 99A、 KK — 223 _ 3のような形質転換菌において低コピー数でより安定なベクターへ揷 入して保存することがより望ましい。 このために pUC— 1 80 f プラスミ ドを 制限酵素 B amH Iと S p e Iで消化し、 約 3. 8 k b pの DN A断片を得て、 低コピー数でより安定なベクターの制限酵素 B amH Iと S p e Iの間に挿入連 結することが可能である。 このような例として実施例 3で説明する p T S X— 1 80 f を例示できる。 このプラスミ ドを、 宿主細胞 （例えば大腸菌 XL 1 -b 1 u e株） に導入して形質転換し、 マ一カー遺伝子 Amp rを利用して、 アンピシ リン耐性を示す形質転換株を選別し、 さらに p 1 80遺伝子をプローブとしたコ ロニ一ハイブリダィゼ一シヨン法により選択し、 ヒト p 1 80蛋白質の全長をコ 一ドする c DNAを含むプラスミ ドを導入した形質転換微生物を得ることができ る。
ヒト P 1 80蛋白質の cDNA配列の分析から、 反復配列領域内での反復数が 54回、 26回、 1 4回の少なくとも 3種類の分子種が存在することが分かって いる （Langley R et al (1998) DNA Cell Biol. を参照） 。 配列番号 6で示した ものは、 反復数が 24回の分子種であり、 新規な配列である。 反復数が 1 4回の 分子種についても同様に上記の方法でクローニング可能である。 反復数が 54回 の分子種も上記の方法でクローニング可能であるが、 その際は铸型として MR C 一 5細胞のゲノム DNAを用いた方がより望ましい。 細胞のゲノム DNAの調製 は公知のどのような方法でも可能である。
組換え P 1 80蛋白質遺伝子を有する組換えプラスミ ドの調製：
ヒト P 1 80蛋白質の全長あるいはヘルぺスウィルスプロテア一ゼの切断可能 配列を含んだァミノ酸配列をコードする D N Aを蛋白質発現用プラスミ ドにサブ クロ一ニングして組換え型ヒト p 1 8 0蛋白質を発現する発現用プラスミ ドを構 築できる。 組換え型ヒト p 1 8 0蛋白質遺伝子としては、 ヒト p 1 8 0蛋白質遺 伝子の一部分あるレ、は全長、 またはそれらを他の遺伝子と連結させた融合型組換 え P 1 8 0蛋白質遺伝子を使用できる。 ヒト p 1 8 0蛋白質遺伝子と連結させる 遺伝子としては、 G S T遺伝子、 /3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子、 マルトース結合 蛋白質遺伝子、 （H I S ) 6 夕グ遺伝子、 m y c夕グ遺伝子など融合蛋白質発現 に汎用されるどのような遺伝子であっても使用できる。 その際、 誘導可能なプロ モータの制御下に融合ヒト p 1 8 0蛋白質をコードする翻訳域を形成させること により、 宿主細胞中で組換え型ヒト p 1 8 0蛋白質の生産を誘導させることが望 ましい。 そのような誘導可能なプロモ一夕の例として、 t a c、 l a c又は t r p一プロモー夕が挙げられるが他の類似のどのようなプロモーターであつてもよ レ、。 真核細胞用発現プロモーターの例としては C MVプロモータ一， S Rアルフ ァ一プロモーター、 E F 1プロモータ一などが挙げられる。
組換え P 1 8 0蛋白質変異体の作成：
ヒト P 1 8 0蛋白質はへルぺスウィルスプロテアーゼ切断可能配列を含んでお り、 H C MVの場合には 3力所 （配列番号 1、 2、 3 ) 含まれている。 これらの 切断可能配列を人口的に改変した組換え P 1 8 0蛋白質変異体を作成し、 ヘルべ スウィルスプロテアーゼによる切断に必要な配列を特定することが可能である。 組換え P 1 8 0蛋白質変異体の作成はヒト p 1 8 0蛋白質の全長あるいはヘルべ スウィルスプロテア一ゼの切断可能配列を含んだ遺伝子配列をコードするプラス ミ ドを用いて、 例えば切断可能配列中のパリンをァラニンに改変して作成できる 。 プラスミ ド上の特定塩基の置換は公知の技術で可能である。
組換え P 1 8 0蛋白質の宿主細胞における発現：
宿主細胞としては、 ベクタ一に組み込まれた複製オリジンやプロモーターが働 く真核細胞あるいは大腸菌などの原核細胞を使用することができる。
真核細胞における発現の場合、 S V 4 0の複製オリジンやプロモーターを使用 する場合には、 T抗原を発現している細胞 （例えば 2 9 3 T細胞、 C O S細胞が 例示できる） が適している。 発現ベクターを真核細胞に導入するには、 リン酸力 ルシゥ厶法、 D E A E—デキストラン法、 リボソーム法、 エレクトロボレ一ショ ン法等の公知のどのような方法でも可能である （例えば実験医学別冊 「遺伝子ェ 学ハンドブック」 、 羊土社、 1 9 9 1、 参照） 。 あるいは、 一本鎖ファージを調 製した後、 これを用いてトランスフエクシヨンを行い遺伝子を動物細胞に導入す ることも可能である。 (Yokoyama-Kobayashi and Kato, Biochem. Biophys. Res. Co誦 un. 192 : 935-939 (1993)) 。
原核細胞における発現は融合蛋白質発現用プラスミ ドを用いて、 宿主細胞を形 質転換した形質転換微生物を （例えば大腸菌 X L 1 - b 1 υ e株が使用できる） マーカ一遺伝子 Am p rを利用して、 アンピシリ ン耐性を示す形質転換株を選別 したのち、 さらにヒト p 1 8 0蛋白質の C末端領域をコ一ドする遺伝子をプロ一 ブとしたコロニーハイプリダイゼ一ジョン法あるいはヒト p 1 8 0蛋白質の C末 端領域に対する抗体を用いたウェスタンプロテツング法により選択可能である。 使用する抗体は組換え型ヒト P 1 8 0蛋白質を免疫原として常法により作成可能 こ"ある。
組換え菌による融合蛋白質の培養生産と培養物からの組換え型基質は、 例えば 、 以下の手順で行うことができる。
組換え型 G S T融合 p 1 8 0蛋白質の調製：
組換え型ヒト P 1 8 0蛋白質を融合蛋白質として発現する発現用プラスミ ドを 保有する組換え菌を、 アンピシリンを添加した 1 Lの L B培地を用いて、 5 L容 三角フラスコ中で 2 8 °C、 6時間振とう培養する。 次いで、 培養菌液の濁度 6 0 0 n mにおける吸光度が 0 . 5を越えた時点で、 G S T—組換え型 G S T融合 p 1 8 0蛋白質の発現を誘導するため、 培地にイソプロピル一 ^一 D—チォガラク トピラノシド （IPTG) を終濃度 0 . 2 mMとなる量添加する。 さらに 2 8で、 4 時間振とう培養を行い、 得られる培養液を遠心分離して集菌する。 集菌した菌体 はグル夕チオンセファロース 4 Bカラム平衡化緩液 （50 mM Tri s- HC1， 150 mM N aCl, 1 mM EDTA, pH 8. 0、 以降、 緩衝液 Aと称する） 中に懸濁し、 超音波によつ て菌体を破砕する。 その後、 遠心分離によって、 不溶性画分を分離し、 可溶性蛋 白質を含有する上清を得る。 この上清中に可溶性蛋白質として溶解している組換 え型 G S T融合 p 1 8 0蛋白質のみを以下の手段で精製できる。 先ず、 分取される上清を、 緩衝液 Aで平衡化されたグル夕チオンセファロース 4 Bカラムに負荷し、 上清に溶解している GST融合 p 1 8 0蛋白質をカラムに 特異的に吸着させる。 カラムをバッファ一液 Aにより洗浄し、 未吸着分を洗い出 す。 その後、 2 OmM還元型グル夕チオンを添加したバッファー液 Aによって、 カラムに吸着していた GST融合 p 1 8 0蛋白質を溶出させる。 溶出させた GS T融合 p 1 8 0蛋白質は緩衝液 B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCL 1 mM EDTA, pH 7.4) に対して透析し、 セントリコン 3 0などの市販の限外濾過膜 （Amicon社 製） により濃縮できる。
インビトロにおけるヘルぺスウィルスプロテアーゼ消化実験：
( 1 ) 基質蛋白質の調製
ィンビトロにおけるヘルぺスウィルスプロテアーゼ消化実験に用いる基質蛋白 質としては、 ヒト由来培養細胞から特異抗体を利用してァフィ二ティ一精製した 天然型基質、 ヒト由来培養細胞において発現させた組換え型基質を特異抗体を利 用してァフィ二ティ一精製した組換え型基質、 または p 1 8 0蛋白質全配列のう ちからへルぺスウィルスプロテアーゼの切断認識配列を含む部分を融合蛋白質と して発現させた組換え型基質蛋白質を用いることができる。 天然型基質をァフィ 二ティ一精製するさいには、 免疫沈降法およびァフィ二ティ一カラムを用いた精 製法のいずれでも良く、 使用する抗体は組換え型ヒト P 1 8 0蛋白質を免疫原と して作成可能である。
(2) 精製した （あるいは部分精製した） 組換え型 GST融合 p 1 8 0蛋白質 を以下に示す手順でィンビトロにおけるヘルぺスウィルスプロテア一ゼ消化実験 に用いることができる。 プロテアーゼ活性測定用バッファーに、 該組換え基質を 0. 3〃 g及び該組換え型プロテアーゼをそれぞれ 0. 0 1— 0. 0 3〃 g添加 し、 3 0° Cまたは 4° Cで 4時間インキュベーションした後、 S.DS— PAG E用 2 Xサンプルバッファーを添加することで反応を停止させる。 その反応液を SDS— PAGE分析、 ウェスタンブロッ小後に、 特異的抗体を用いて免疫染色 を行う。
〔実施例〕
本発明によって提供されるへルぺスウィルスプロテア一ゼの新規内因性基質で ある天然型ヒト p 1 80蛋白質は、 ヘルぺスウィルスプロテア一ゼを発現させた 培養細胞中において分解され得る。 以下、 実施例で説明する。
実施例 1
ヘルぺスウィルスプロテアーゼを発現させた 293 T細胞中における天然型 p 1 80蛋白質の分解：
ヘルぺスウィルスプロテア一ゼの培養細胞における発現方法は公知であるが （ Liu et al (1991) J.Virol. 65, 5149 - 5156， Welch et al (1991) ProNASUSA 88 , 10792-10796, Sardana (1994) 269， 14337-14340) 、 以下の例では HCMVの UL 80遺伝子にコードされるプロテア一ゼを、 真核細胞用蛋白発現用プラスミ ド P c DNA 4にサブクローニングして用いた。
具体的にはサイトメガロウィルス （AD 1 69株） の感染した細胞から Hi r t法に従ってウィルス DNAを抽出した（Robert, L , et al. , J. gen. Virol., 64, 373-389 (1983))。 二つのオリゴヌクレオ夕イドをプライマ一とし、 抽出し たウィルス DNAを铸型として PCRをおこなうことで、 UL 80プロテアーゼ をコードする DNAを得た。 これをベクター p c DNA 4 (Invitrogen社製） の B amH Iと Xb a I部位間にクローニングして、 （H I S) 6 タグ付加された UL 80プロテア一ゼの真核細胞用蛋白質発現プラスミ ド pC— UL 80を構築 した。 UL 80プロテアーゼをコードする DNAの塩基配列についてはデォキシ ヌクレオチド法により塩基配列を決定し、 既に報告されている文献記載の塩基配 列と相違ないことを確認した (Chee et al (1990) Curr. Top. Microbiol. Immunol .154, 125-169) 。 この発現プラスミ ドを 293 T細胞にトランスフエクシヨン することにより、 293 T細胞内に UL 80プロテア一ゼを発現させた。 トラン スフヱクシヨン後 30時間後に各々細胞を洗浄、 回収し、 SDS— PAGE, ゥ エスタンプロッティング分析に供した。 （H I S) 6 タグ抗体 （Qu i a g e n 社より購入） を用いて免疫染色し UL 80プロテア一ゼの発現を確認し （図 2) 、 同時に p 1 8 0蛋白質のゥヱスタンプロッティング分析を行った。 図 2に示し たように、 UL 80プロテアーゼが発現された場合には （レーン 1 ) 天然型 p 1 8 0蛋白質が分解され、 より分子量の小さい蛋白質 （矢印） が検出されるが、 U L 80プロテアーゼが発現されていない場合には天然型 p 1 80蛋白質は分解さ れなかった （レーン 2) 。 この結果より、 HCMVプロテアーゼを発現させた 2 93 T細胞中での天然型 p 1 80蛋白質の分解が確認された。
実施例 2
ヒト P 1 80蛋白質をコードする DNAを含んでなるプラスミ ドベクターの構 築：
ヒト P 1 80蛋白質をコ一ドする DNAを含んでなるプラスミ ドベクタ一の構 築について以下に例示して詳細に説明する。
(1) PCR法による増幅及びべクタ一への挿入：
先ず、 MRC— 5細胞 （大日本製薬より購入） の一本鎖 cDN Aを錶型として 、 P 1 80蛋白質を PCR法により増幅した。 1st strand cDNAの調製は 1st st rand cDNA synthesis kit for RT-PC (ベ一リンガ一社製） を用い、 これを鐯型 として LA Taqポリメラ一ゼ （宝酒造社製） を用いて PCR法による増幅を行った 。 ヒト p 1 80蛋白質の全長を同時に増幅させるのは難しいため、 N末端領域 （ pl80Nt) 、 反復配列領域 (pl80Rp) 、 C末端領域 (pl80Ct) に分けて増幅させた (図 1参照） 。 即ち、 メチォニン 1〜ァスパラギン 1 58の N末端領域、 セリン 1 59〜イソロイシン 6 1 0の反復配列領域、 アルギニン 6 1 1〜終止コドン T G Aまでの C末端領域べプチド鎖をコードする D N Aを含む領域を P C R法によ りそれぞれ増幅した。 その際、 N末端領域については 5' 側の非翻訳領域に制限 酵素 BamH I切断部位を、 反復配列領域については 3 ' 側に制限酵素 BamH I切断部位を、 C末端領域については 5' 側に制限酵素 B a mH I切断部位を付 加したプライマ一を合成して PC R法による増幅を行った。 用いたプライマ一は 以下のとおりである。
p l 80Nt用プライマ一 5' -TGGATCCGAAAGCAAGCC AGGATG- 3' 及び 5' -ATCGGCACCTCCTTGGGAGCAG T- 3，
p l 80Rp用プライマ一 5' -CAGGATCCAGCCCCCAAT GTGAC - 3 ' 及び 5' -CTGGATCCCTCGTGGCCTGGTTC AAGGCATC- 3'
P 1 80 C t用プライマー 5' -CTGGATCCTGTCCGAGAA IS
GGCTGGTGTCATTC-3' 及び 5' -GCTCAGACAGAGGT GC C CTC CTT- 3'
1 80蛋白質の塩基配列 471には制限酵素 E c oR I切断部位が存在する ので、 N末端領域、 反復配列領域をベクターへクローニングする際に利用した。 即ち、 増幅された N末端領域の DN A断片を制限酵素 E c oR Iと B amH I で消化後、 低融点ァガ口一ス電気泳動で、 約 550 bpの断片を分離し、 フエノ ール抽出によりその断片を回収した。 回収した DNA断片を、 あらかじめ制限酵 素 E c oR Iと BamH Iで消化し低融点ァガロース電気泳動で分離回収した p UC 1 1 8ベクタ一の E c oR Iと BamH Iの間に挿入連結し、 pUC— 1 8 ΟΝΐを得た。 同様に増幅した反復配列領域の DNA断片を制限酵素 E c 0 R Iと B amH Iで消化後、 低融点ァガロース電気泳動で、 約 1 450 b pの断片 を分離し、 回収した。 回収した反復配列領域を含む DN A断片を、 pUC 1 1 8 の E c oR Iと BamH Iの間に揷入連結し、 pUC— 1 80 R pを得た。 C末 端領域については低融点ァガロース電気泳動で、 約 2200 bpの断片を分離回 収し、 TAクローニング法を利用して pGEM— Te a s yベクター （プロメガ 社製） へ挿入連結した。 このプラスミ ドを、 制限酵素 E c oR Iと B amH Iで 消化した。 これを pUC 1 9の E c oR Iと B amH Iの間に揷入連結し、 pU C- 1 80 C tを作成した。 pUC— 1 80 C tの Ec oR I切断部位の 5 ' 側 には PGEM— Te a s yベクタ一由来の Sp e I切断部位が含まれている （図 1参照） 。
(2) 全長 c DNAをコードするプラスミ ドベクタ一の構築：
これらのプラスミ ドを、 一旦大腸菌 XL I -b 1 u e株に導入して形質転換し 、 この組換え菌を培養して、 大量に調製し、 破菌して、 プラスミ ド pUC— 1 8 ONt, pUC- 1 80 Rp, pUC- 1 80 C tを単離 ·分取した。 これらを 連結結合させるために、 pUC— 1 8 ON tを制限酵素 E c oR Iと S e a lで 切断して得られる約 1 950 b pの DNA断片約 200 n g, pUC- 1 80 R Pを制限酵素 E c o R Iと Mr o Iで切断して得られる約 1 350 b pの DNA 断片約 3 O O ngおよび pUC— 1 80 C tを制限酵素 Mr o Iと S c a Iで切 断して得られる約 3. 7 kb pの DNA断片約 200 n gの 3種を相互に連結さ せた。 ラィゲ一ションには r ap i d l i ga t i on キッド （ベ一リンガ —社製） を用いた。 このプラスミ ドを、 大腸菌 XL I -b 1 u e株に導入して形 質転換し、 マーカー遺伝子 Amp rを利用して、 アンピシリン耐性を示す形質転 換株を選別し、 さらに p 1 80遺伝子をプローブとしたコロニーハイブリダィゼ ーシヨン法により選択した。 この組換え菌を培養して、 大量に調製し、 単離 .分 ¾し、 ヒト p 1 80蛋白質の全長をコ一ドする c DNAを含むプラスミ ド pUC - 1 8 0 f を得た （図 1参照） 。
ヒト 1 80蛋白質の cDN A配列の分析から、 反復配列領域内での反復数が 5 4回、 26回、 1 4回の少なくとも 3種類の分子種が存在することが分かってい る (Langley R et al 1998 DNA Cell Biol.を参照) 。 配列番号 5で示した配列 は反復数が 24回のものである。
(3) pTSX- 1の作成：
ヒト P 1 80蛋白質領域を実質的に含んでなるペプチド鎖をコードする DNA 断片は配列番号 6中の 590 - 1 302で示される反復配列を包含するため、 形 質転換菌でより安定でコピー数の少ないベクタ一へ挿入する必要があった。 この ために、 汎用 PKK 233— 2ベクタ一の誘導体である pTr c 99 Aに制限酵 素 S p e Iで切断される部位を有するベクターを以下のように作成した。
Tr c 9 9 A (Pharmacia-Biotech社製） を制限酵素 P s t Iと制限酵素 H i nd I I Iで消化し、 低融点ァガロース電気泳動で分離回収した。 制限酵素 S P e X h 0 No t Iで切断される部位を有する合成オリゴ DNAを作成 し （5' -GACTAGTCTCGAGCGGCCGCA-3' 及び 5' -AGCTTGCGGCCGCTCGAGACTAGTCTGCA-3' ) 、 Tr c 99 Aのクロ一ニングサイト制限酵素 P s t Iと制限酵素 H i nd
I I Iの間に挿入連結し、 制限酵素 S p e Xho No t Iで切断される 部位を有するクロ一ニングサイトを新たに追加挿入し、 p T S Xと命名した。
(4) pTSX- 1 80 f の構築および該プラスミ ドベクターを導入した形質 転換微生物の調製：
先の pUC— 1 80 f プラスミ ドを制限酵素 B amH Iと S p e Iで消化し、 約 3. 8 kb pの DNA断片を得て、 p T S X— 1の制限酵素 B a mH Iと S p e Iの間に挿入連結し、 pTSX— 1 80 f を構築した。 このプラスミ ドを、 大 腸菌 XL 1 -b 1 u e株に導入して形質転換し、 マーカー遺伝子 Amp rを利用 して、 アンピシリン耐性を示す形質転換株を選別し、 さらに p 1 80遺伝子をプ ローブとしたコロニーハイブリダイゼ一ション法により選択した。 このうちの一 つについて E. c 01 i XL 1— b 1 u e · p TSX_ 1 80 f と識別のため の呼称を付した。 この形質転換株を日本国〒 305 - 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号所在の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に 寄託して平成 12年 1月 7日に受領した受託番号 FERM P— 17694を得た。
実施例 3 DNA配列決定：
クローニングしたヒト p 1 80蛋白質の cDN A配列決定はジデォキシ法に準 じ、 dye terminator cycle sequencing ready reaction kit FS (アプライドノ ィォシステム社製） を用いて行った。 塩基の帰属は、 2本鎮 DNAの両鎖におけ る分析結果から確認し、 複数のプライマーを用いてさらに結果を確認した。 配列 決定は複数のクローンについて行った。 分析の結果、 配列番号 6で示されるヒト P 1 80蛋白質の c DN Aが得られたことが確認された。
実施例 4 組換え型 p 1 80蛋白質の大腸菌における発現：
pTSX- 1は pTr c 99 Aと同様に t r cプロモータ一および転写終了シ グナルを含み、 原核細胞における発現ベクターを構成している。 したがって、 p 丁3∑_ 1にヒト 1 80蛋白質の cDNAを挿入した pTSX— 1 80 f は原 核細胞において組換え型ヒト p 1 80蛋白質を発現誘導可能であるので、 この組 換え型ヒト p 1 80蛋白質の発現を以下の方法で確認した。 pTSX— 1 80 ί を保有する組換え菌を、 アンピシリンを添加した 2 mLの LB培地を用いて 37 °C、 1 6時間振とう培養した。 この培養菌液を LB培地を用いて 1 0倍に希釈し 、 28 °Cで 2時間培養したところで、 組換え型 p 1 80蛋白質の発現を誘導する ため、 培地にイソプロピル一^一 D—チォガラクトビラノシド （IPTG) を終濃度 0. 5mMとなる量添加した。 さらに 28°C、 4時間振とう培養を行い、 得られ る培養液を遠心分離して集菌し、 SDS— PAGE用のサンプル溶解液に溶かし 、 SDS— PAGE分析に供した。 図 3に示される様に分子量 1 35 kDa付近 に I PTG誘導依存的に蛋白質が検出さた。 ウェスタンブロット、 家兎抗 p 1 8 0抗体による免疫染色の結果から組換え型 pl800蛋白質の発現が確認された。 実施例 5 組換え p 1 80蛋白質の真核細胞における発現：
(1) 組換え p 1 80蛋白質の真核細胞発現べクタ一の構築
プラスミ ド pTSX— 1 80 f を制限酵素 B amH Iおよび制限酵素 Xh o I で消化して得られる 3. 8 kbpのDNA断片を、 市販の真核細胞発現べクタ一 P cDNA4のクロ一ニングサイト BamH I - X h o I部位の間に揷入連結し て、 真核細胞における p 1 80蛋白質発現ベクタープラスミ ド p c DNA- 1 8 0 f を作成した。 p 1 80蛋白質をコードする遺伝子が正方向に挿入されていれ ば p c DNA4の CMVプロモーターの制御下で 6 xH I Sタグの付加されたヒ p 1 80蛋白質をコードする翻訳域が形成されている。 p 1 80蛋白質発現べ クタ一プラスミ ド p cDNA— 1 80 f を用いて XL 1—b 1 u eを形質転換し 、 単一コロニーを複数個得て、 2mLの LB培地を用いて 37° C、 1 6時間振 とう培養後、 菌体からプラスミ ドを抽出した。 これらのプラスミ ド約 500 n g を制限酵素 H i n d I I Iで消化し， 0. 7 %ァガロース電気泳動にかけ、 2. 3 kbpの断片を生じるプラスミ ド pTSX— 1 80 f 由来の断片が正方向に揷 入されているクローンを選択した。 この組換え菌を培養して、 大量に調製し、 ァ ルカリ法によりプラスミ ドを抽出し、 Qiagen tip (キアゲン社製） を用いてトラ ンスフエクシヨン用のプラスミ ドを単離 '分取した。
(2) 組換え p 1 80蛋白質の真核細胞における発現：
29 3 T細胞および CH〇細胞へトランスフヱクシヨンすることにより組換 ぇ型ヒト 1 80蛋白質を培養細胞において産生させた。 293 T細胞および CHO細胞は 1 0 %ゥシ胎児血清を含むダルべッコ改変イーグル（DMEM)培地中 、 5%C02 存在下、 37° Cで培養した。 0. 7〜0. 8 X 1 05 個の細胞 を 6穴プレート （ヌンク社、 穴の直径 3 cm) に植え、 5%C02 存在下、 3 7° Cで 20〜22時間培養した。 新鮮培地に交換した細胞に （1) で得たプ ラスミ ド l ugと Fug en e試薬 （ベ一リンガ一社製） 3 u Lを含む DME MO. lmLを添加し、 5%C02 存在下、 37° Cで 30時間培養した。 細 胞を洗净、 回収し、 SDS— P AGE後に家兎抗 p 1 80抗体を用いてウェス タンプロッティングを行い、 p 1 80蛋白質の 293 T細胞中および CHO細胞 での組み換え型 p 1 80蛋白質の発現を確認した。 実施例 6 HCMVの UL 8 0プロテア一ゼを発現させた 2 9 3 T細胞中にお ける組み換え型 P 1 8 0蛋白質の分解：
実施例 5と同様にヒト p 1 8 0蛋白質発現ベクタープラスミ ド p cDNA— 1 8 0 f を 2 9 3 T細胞および CHO細胞へトランスフヱクションすることにより 組換え型ヒト P 1 8 0蛋白質を培養細胞において産生させた。 その際、 HCMV の UL 8 0遺伝子にコ一ドされるプロテア一ゼの発現プラスミ ド p C— U.L 8 0 を同時トランスフヱクションすることにより、 UL 8 0プロテア一ゼと組換え型 ヒト P 1 8 0蛋白質を共発現させ、 組換え型ヒト p 1 8 0蛋白質が UL 8 0プロ テア一ゼにより分解されるかどうかを調べた。 6穴プレート中で 8 0 %集密的に なるまで培養させた 29 3 T細胞および CHO細胞を新鮮培地に交換した後、 p c DNA - 1 8 0 f 0. 8 u g、 p C— UL 8 0 1 u g、 F u g e n e試薬 3 u Lを含む DMEMO. 1 m lを添加し、 5 %C〇2存在下、 3 7° Cで 3 0時間 培養した。 トランスフ クシヨンの 3 0時間後各々細胞を洗浄、 回収し、 SDS -PAGE, ウェスタンブロッテイング分析に供した。 UL 8 0プロテアーゼの 発現は （H I S) 6 タグ抗体により、 組み換え型 p 1 8 0蛋白質は家兎抗 p 1 8 0抗体により検出した。 図 4に 2 9 3 T細胞の例を示した。 組換え型 p 1 8 0蛋 白質のみを発現させた場合、 組換え型 P 1 8 0蛋白質は矢印に示した位置に過剰 に発現されているが （レーン 2) 、 組換え型 p 1 8 0蛋白質と UL 8 0プロテア —ゼ共発現させるとレーン 1のように組換え型 P 1 80蛋白質が分解され、 より 分子量の小さい蛋白質が検出されるようになった。 図 5 (レーン 1、 レーン 2) には CHO細胞の例を示したが、 2 9 3 T細胞の場合と同様に UL 8 0プロテア ーゼ共発現させとレーン 1のように組換え型 P 1 8 0蛋白質が分解された。 これ らにより組換え型 P 1 8 0蛋白質も UL 8 0プロテア一ゼにより分解されること があきらかとなった。
実施例 7 組換え p 1 8 0蛋白質変異体の真核細胞における発現および UL 8 0プロテア一ゼ基質としての効果：
ヒト P 1 8 0蛋白質はへルぺスウィルスプロテアーゼ切断可能配列を含んでお り、 HCMVの場合には配列番号 5中に 3力所 （6 9 9— 7 0 2、 8 0 5 - 8 0 9、 9 9 0 - 9 0 3 ) 含まれている。 これらの切断可能配列を人工的に改変した 組換え p 1 8 0蛋白質変異体を作成し、 UL 8 0プロテアーゼにたいする基質と しての効果を以下のように調べた。
プラスミ ド p c DNA— 1 8 0 f を s i t e— d i r e c t e d mu t a g e n e s i s キット （stratagene社製） を用いて、 ヘルぺスウィルスプロテア ーゼの切断可能配列に変異 （L 6 9 9 P、 V 8 0 5 A、 V 9 9 0 A) を加えた発 現ベクター p c DNA- 1 8 Omを作成した。 即ち、 配列番号 5中の 6 9 9番の ロイシン （L) をプロリン （P) に、 8 0 5番のバリン （V) をァラニンに、 9 9 0番のバリン （V) をァラニン （A) に変異させた。 このべクタ一 p c DNA ― 1 8 0 mによって発現される組換え p 1 8 0蛋白質変異体と、 UL 8 0プロテ ァーゼを実施例 6と同様の方法で CHO細胞中に発現させ、 組換え p 1 8 0蛋白 質変異体を家兎抗 p 1 8 0抗体により検出した。
UL 8 0プロテア—ゼが発現されない場合、 組換え型 p 1 8 0蛋白質変異体は 矢印に示した位置に過剰に発現されている （図 5、 レーン 2) 、 UL 8 0プロテ ァ一ゼが発現されると野生型組換え型 p 1 8 0蛋白質は分解され、 より分子量の 小さい蛋白質が検出されるようになるが （レーン 1 ) 、 組換え型 p 1 8 0蛋白質 変異体の場合は分解がおこらず （図 5、 レーン 3) 、 UL 8 0プロテアーゼによ る分解はこれらの切断可能配列依存的であることが示された。 即ち、 ヒト p 1 8 0蛋白質中のアミノ酸配列 6 9 9— 7 0 2、 8 0 5— 8 0 9、 9 9 0— 9 0 3が UL 8 0プロテアーゼによる切断に必要であることが明らかでる。
実施例 8 組換え型 GST融合 p 1 8 0蛋白質の作成：
( 1 ) GSTをコ一ドする遺伝子とヒト p 1 8 0蛋白質のヘルぺスウィルスプ 口テアーゼの切断可能配列を含んだ遺伝子を有する組み換えプラスミ ド pGEX - 1 8 0 s u bの作製およびそれを保有する組換え菌の作成：
上記ヒト p 1 8 0蛋白質の C末端領域をコードする遺伝子を含むプラスミ ド p U C - 1 8 0 C tをプライマ— '- aggatcctgagggaggtgaataaggagctg - 3'及び 5 ' -GCTCAGACAGAGGTGCCCTCCTT-3' ) を用いて P C R法により増幅し、 B amH I と No t I Iで消化後、 低融点ァガロース電気泳動で、 約 1. 4 kb pの断片を分 離し、 ヒト p 1 8 0蛋白質のヘルぺスウィルスプロテアーゼの切断可能配列を含 んだ遺伝子 DNA断片を得た。 次いでプラスミ ド p GEX— 5 X— 3を制限酵素 BamH Iと Notl Iで消化し、 先に得た 1.4kbpの DNA断片を揷入、 連結し、 組み 換えプラスミ ドを得た。 このプラスミ ドを、 大腸菌 XL 1— blue株に導入して形質 転換し、 マーカー遺伝子 Amprを利用して、 アンピシリン耐性を示す形質転換株を 選別し、 さらに pUC -180Ct 遺伝子をプローブとしたコロニーハイブリダィゼー シヨン法により選択した。 このうちの一^ 3について E.coli XL 1 -blue - pGEX- 180subと識別のための呼称を付した。 この形質転換株を日本国〒 305-8566茨城県 つくぱ市東 1丁目 1番 3号所在の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技 術研究所に寄託して平成 12年 1月 7日に受領した受託番号 PERM P-17693を得た。
(2) 組換え型 GST融合 p 1 80蛋白質の調製：
上記組換え型ヒト P 1 80蛋白質を融合蛋白質として発現する発現用プラスミ ド PGEX— 1 80 subを保有する組換え菌を、 アンピシリンを添加した 1 Lの LB培地を用いて、 5 L容三角フラスコ中で 28°C、 6時間振とう培養した。 次 いで、 培養菌液の濁度 600 milにおける吸光度が 0. 5を越えた時点で、 GST 一組換え型 GST融合 p 1 80蛋白質の発現を誘導するため、 培地にイソプロピ ルー^ー D—チォガラクトピラノシド （IPTG) を終濃度 0. 3 mMとなる量添加 した。 さらに 28° (、 4時間振とう培養を行い、 得られる培養液を遠心分離して 集菌した。 集菌した菌体は、 グルタチオンセファロ一ス 4 Bカラム平衡化緩液 （ 5 OmM Tr i s - HC 1、 1 5 OmM NaC l、 ImM EDTA、 pH 8. 0、 以降、 緩衝液 Aと称する） 中に懸濁し、 超音波によって菌体を破砕した 。 その後、 遠心分離によって、 不溶性画分を分離し、 可溶性蛋白質を含有する上 清を得て、 緩衝液 Aで平衡化されたグル夕チオンセファロ一ス 4 Bカラムに負荷 し、 上清に溶解している GST融合 p 1 80蛋白質をカラムに特異的に吸着させ た。 カラムを、 ノ ッファー液 Aにより洗浄し、 未吸着分を洗い出す。 その後、 2 0 mM還元型グル夕チオンを添加したバッファ一液 Aによって、 カラムに吸着し ていた GST融合 p 1 80蛋白質を溶出させた。 溶出させた GST融合 p 1 80 蛋白質は緩衝液 B (5 OmM Tr i s— HC 1、 1 5 OmM NaC l、 lm M EDTA、 pH7. 4) に対して透析し、 限外濾過膜 （Amicon社製） により 濃縮した。 図 6に培養 I PTG誘導後の大腸菌の菌体 （レーン 1)、 可溶性蛋白 質を含有する上清 （レーン 2) 及び溶出させた GST融合 p 1 80蛋白質 （レー ン 3) の SDS— PAGE分析における CBB染色の結果を示した。 この条件で GST融合 p 1 80蛋白質は他の菌体成分から効率良く分離できることが確認で きた。
実施例 9 ィンビトロにおける GST融合 p 1 80蛋白質の消化実験：
( 1 ) UL 8 0プロテアーゼの精製：
インビトロにおけるヘルスウィルスプロテア一ゼ消化実験に用いるプロテア一 ゼは、 培養細胞内で生産された HCMVプロテアーゼを精製して使用した。 また その精製には公知の技術であるペン夕 H i s TAG配列を利用して N i—NT A カラム （quiagen社製） によるァフィ二ティ一精製を行った。
1 5 cm培養シャーレに 80%集密的になった 293 T細胞の培地を新鮮培地 に交換し、 5%C02存在下、 37° Cで 20〜22時間培養した。 新鮮培地に 交換した細胞に P C— UL 80プラスミ ド 1 51^ と 1{ §： 6 11 6試薬 （ベ一リ ンガ一社製） 30 uLを含む DMEMlmLを添加し、 5%C02存在下、 37 ° Cで 30時間培養した。 細胞を PBSにより洗浄し、 溶解液 （1 トリ トン X 1 00、 1 0 mMイミダゾ一ル、 ぺプス夕チン 1 u g/mL、 ロイぺプチン 5 u gZmL、 NaC l 0. 3 M、 50 mMトリス H C 1 p H 7. 4 ) を加え水 上に 30分静置後、 1 000 O xgで 30分遠心し、 可溶性蛋白質を含有する上 清を得た。 上清に溶解している UL 80蛋白質を N i—NTAカラムに特異的に 吸着させた。 カラムを、 バッファー液 A (2 OmMィミダゾ一ル、 Na C 1 0. 3M、 50mMトリスHC l pH 7. 4 ) により洗浄し、 未吸着分を洗い 出した後、 20 OmMイミダゾールを添加したバッファー液 Aによって、 カラム に吸着していた UL 80蛋白質を溶出させた。 溶出させた UL 80蛋白質は緩衝 液 B (5 OmMトリス—HC 1、 1 50 mM NaC l、 1 mM EDTA, p H7. 4) に対して透析し、 限外濾過膜 （アミコン社製） により濃縮し、 終濃度 50 %となるようにグリセロールを加えて— 20° Cで保存した。 この UL 80 プロテア一ゼを以下に示す手順でインビト口における GST融合 p 1 80蛋白質 の消化実験に用いた。
(2) インビト口における GST融合 p 1 80蛋白質の消化実験：
プロテア—ゼ活性測定用バッファ一に、 該組換え基質を 0. 3 zgZ40 uL 及び該組換え型プロテアーゼを 1 O uL添加し、 4° Cで 1 6時間インキュべ一 ションした後、 2 Xサンプルバッファーを添加することで反応を停止させた。 そ の反応液を SDS— PAGE分析、 ウエスタンプロツ ト後に、 家兎抗 p 1 80抗 体を用いて免疫染色を行った。 図 7に示す通り、 HCMVプロテア一ゼを加える ことにより GST融合 p 1 80蛋白質組換え基質の分解が確認された。
本発明で提供されるへルぺスウィルスプロテア一ゼの新規内因性基質であるヒ ト P 1 80蛋白質は、 実施例 1 0で説明するようにヒトヘルぺスウィルス感染細 胞中で感染後期において分解され、 ヘルぺスウィルスを感染後期に進まないよう に阻害する薬剤 （例えばホスホノ酢酸を用いる） で処理することによってその分 解が抑制された。
実施例 1 0 インビト口における GST融合 p 1 80蛋白質の消化実験 I I
(1) 大腸菌内で生産した UL 80プロテアーゼの精製
大腸菌内で生産した HCMVプロテアーゼを用いてインビト口における消化 実験を行った。 実施例 1で用いた （H I S) 6 タグ付加された UL 80プロテ ァ一ゼをコードする DNA断片を実施例 2— 3で作成した大腸菌用蛋白発現プ ラスミ ド pTSX= lにサブクロ一ユングして （H I S) 6 夕グ付 U L 80プ 口テア一ゼ発現プラスミ ド pTSX— UL 80を構築した。 またその精製には 公知の技術である P e n t a H i s TAG配列を利用して TAL ONカラム
(clontech社製） によるァフィニィティ精製を以下のように行った。
HCMVプロテア一ゼを発現する発現用プラスミ ド pTSX— UL 80を保有 する組換え菌を、 アンピシリンを添加した 0. 4Lの LB培地を用いて、 2L 容三角フラスコ中で 38°Cで振とう培養した。 次いで、 培養菌液の濁度 600 nmにおける吸光度が 0. 5を越えた時点で、 HCMVプロテアーゼの発現を 誘導するため、 培地にイソプロピル一^一 D—チォガラクトピラノシド （ I P TG) を終濃度 0. 2mMとなる量添加した。 さらに 37°C、 3時間振とう培 養を行い、 得られる培養液を遠心分離して集菌した。
集菌した菌体は、 可溶化用緩衝液 A (2 OmM Tr i s— HC 1、 300 mM NaC l、 1 OmM 2 -ME. ぺプス夕チン 1 g/mL. p H 8 • 0、 1 OmM イミダゾ一ル） 中に懸濁し、 超音波によって菌体を破砕した 。 その後、 遠心分離によって、 不溶性画分を分離し、 可溶性蛋白質を含有する 上清を得た。 上清に溶解している UL 80蛋白質を可溶化用緩衝液 Aに平衡化 した TALONカラムに特異的に吸着させた。 カラムを、 洗浄用緩衝液 B (2 OmM イミダゾ一ル、 NaC l 0. 3M、 50mM Tr i sHC l p H 8. 0、 1 OmM 2—ME) により洗浄し、 未吸着分を洗い出した後、 2 0 OmMィミダゾールを添加した可溶化用緩衝液 Aによって、 カラムに吸着し ていた UL 80蛋白質を溶出させた。 溶出させた UL 80蛋白質は活性測定用 緩衝液 C (PBS、 ImM DDT、 1 mM EDTA、 1 0%グリセ口一ル ) に対して透析し、 限外濾過膜 （Amicon社製） により濃縮した。 この UL 80 プロテア一ゼを以下に示す手順でインビト口における GST融合 p 1 80蛋白 質の消化実験に用い 。
(2) インビト口における GST融合 p 1 80蛋白質の消化実験
プロテアーゼ活性測定用緩衝液じに、 該組換え基質を 1. 0 / g/30 L 及び該組換え型プロテア一ゼを 3. 5〃L添加し、 30 °Cでインキュべ一ショ ンした後、 サンプルバッファーを添加することで反応を停止させた。 その反応 液を SDS— PAGEした後、 抗 p 1 80抗体を用いてウエスタンブロッ 卜を 行った。 実施例 9と同様に、 HCMVプロテアーゼを加えることにより GST 融合 P 1 80蛋白質組換え基質の分解が確認された。 この反応の至適 pHは中 性付近 （PH7. 5) で、 各種プロテア一ゼ阻害剤 （アンチパイン、 キモス夕 チン、 ロイぺプチン、 ァプロチニン、 ぺプス夕チン、 べス夕チン、 Έ— 64、 PMSFを含む） の添加によって阻害は観察されなかった。 古典的セリンプロ テア一ゼ阻害剤であるァプロチニン、 P MS Fによって阻害されにくいという 特徴は、 ヘルぺスウィルスプロテアーゼのこれまで報告されてきた特性と一致 するものである。 更に、 活性測定用緩衝液中のグリセロール量を変化させて消 化実験を行った。 GST融合 p 1 80蛋白質組換え基質の分解産物は抗 p 1 8
0抗体により染色されたバンドをデンシトメ一ターにより定量した。 反応液中 のグリセロール量を 40 %まで増加させると分解産物量は 1 0%グリセロール の場合に比べて約 2. 7倍に増加した （表 1) 。 この結果から、 ヘルぺスウイ ルスプ πテア一ゼを用いてアッセンブリープロティン前駆体中の認識配列を利 用したペプチド性基質の消化を行ったこれまでの報告 （参考文献、 Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 2000, 11:1-22, Waxman L and Darke PL ) と同 様に、 p 1 8 0蛋白質組換え基質の UL 8 0プロテア一ゼによる試験管内の分 解も抗カオトロピック効果のある薬剤により昂進することが明らかとなつた。 〔表 1〕
P 1 8 0蛋白組換え基質の UL 8 0プロテアーゼによる分解 産物とグリセ口一ル濃度の関係
分解産物
グリセロール （％) 反応産物量 （面積） ：比
0 5 6 2 3 0 7 6
1 0 73 79 1 0 0
2 0 1 44 7 0 1 9 6
3 0 1 8 2 7 0 2 2 8
4 0 2 0 64 0 2 8 0
実施例 1 1
( 1 ) ヒトヘルぺスウィルス感染細胞中におけるヒト p 1 8 0蛋白質の分解： ヒトヘルぺスウィルスとして HCMV (AD169株） を使用した場合の実施例を 示す。 宿主細胞としては HCMVの許容細胞であるヒト胎児肺繊維芽細胞 （MRC - 5)を用いた。 6ゥエルの培養ディッシュに培養された培養後 3か目の 8 0 %集密 的になったヒト胎児肺繊維芽細胞の培養液を除いたあと、 HCMV (AD169株） を MO I (感染多重度） 1一 3プラーク形成能 Z細胞 （p ί u/c e 1 1 ) の範 囲で 3 7 °C 1時間の条件で接種した。 ウィルスを含まない液で全く同様の処理を 施した対照細胞を同時に作成した。 5 %FCSを含んだ培養培地を加えて 3 7°C 、 5 %C02 インキュベーターで培養した。 培養後 2、 4、 6日目に各々細胞を 洗浄、 回収し、 SDS— PAGE、 ウエスタンブロッテッング分析に供した。 各 種の特異抗体を用いて免疫染色した結果を図 7に示した。 ウィルス接種細胞にお いてのみ p 1 8 0蛋白質が接種後 4日から 6日に分解が認められた （図 8参照） 。 接種後 4日から 6日という時期から判断して p 1 8 0蛋白質の発現低下は感染 後期におこったことが推察されたので、 H C M V感染を感染後期まで進まないよ うに阻害する薬剤ホスホノ酢酸 0 . I mMで処理すると、 p 1 8 0蛋白質の分解 は抑制された。
( 2 ) 蛍光抗体法による観察：
さらに同様にウィルス接種細胞、 ウィルス非接種対照細胞を作成し、 H C MV 後期抗原である g H抗原に対する抗体 （A B I社製） と、 p 1 8 0蛋白質に対す る抗体を使用して蛍光抗体法を用いて共焦点蛍光顕微鏡によって観察した。 感染 後期のマーカーである g H抗原が陽性になった細胞では、 p 1 8 0蛋白質抗原が 消失していた。 これらよりヒト p 1 8 0蛋白質は H C MV感染細胞中で感染後期 において分解されることが明らかとなった。 .
以上よりヒト p 1 8 0蛋白質は （ 1 ) ヒトヘルぺスウィルス感染細胞中、 およ び （2 ) ヘルぺスウィルスプロテアーゼを強制的に発現させた培養細胞中におい て切断され、 （3 ) 分子内にプロテアーゼ切断可能配列を含み、 （4 ) インビト 口におけるヘルぺスウィルスプロテア一ゼ消化実験において切断を受ける分子で あることがあきらかである。
〔発明の効果〕
ヘルぺスウィルスプロテア一ゼがアッセンブリー蛋白質 （前駆体蛋白質） 以外 の蛋白質に作用することは全く知られておらず、 アツセンブリ一蛋白質以外の基 質が存在するとは予想されていなかった。 本発明により内因性基質であることが 明らかになった P 1 8 0蛋白質とアッセンプリ一蛋白質とは細胞内における局在 などの違いがあるので、 ヘルぺスゥィルスプロテアーゼの感染における役割とし て新たな作用機序が想定される。 このことはへルぺスウィルスプロテア一ゼの阻 害剤の開発において非常に重要であり、 新たな方向性を示唆する。 つまり、 この ような従来予想もされていなかったヘルぺスウィルスプロテアーゼの新規な重要 な内因性基質が同定されたことにより、 予想されていたものとは異なる機構にも とずく新たな抗ヘルぺスウィルス剤の開発を導くものである。
抗ヘルぺスウィルス剤としてのへルぺスウィルスプロテア一ゼ阻害剤の開発の ためには適切な活性測定法の使用が必須であるが、 これまでの前駆体蛋白質中の 切断配列を利用した基質を使用した活性測定法では十分な反応速度を示さず、 プ 口テア一ゼ活性阻害物質の効率的な評価を困難にしてきた現状がある。 ヒト p 1 8 0蛋白質に存在する切断配列を利用することにより、 より効率的な活性測定法 を考案することが可能であり、 ひいては抗ヘルぺスゥィルス剤の開発を強力に推 進する可能性がある。 また、 組み換えヒト p 1 8 0蛋白質は大腸菌において容易 に可溶性蛋白質として回収できるので組み換えヒト 1 8 0蛋白質基質として使用 することも可能となる。
またヒト p 1 8 0蛋白質がヒトヘルぺスウィルス感染細胞中で、 感染後期に特 異的に分解されることを利用して新しいヒトヘルぺスウィルスの検出方法を考案 することが可能である。
〔図面の簡単な説明〕
図 1はヒト P 1 8 0蛋白質の全長をコードする c DNAを N末端領域 （pUC- pi 80Nt) 反復配列領域（pUC- pl80Np)及び C末端領域 (pUC-pl80Ct) に分けて増幅し てべクタ—へ挿入することからなるプラスミ ド pUC— 1 8 0 ίの構築工程、 及 び pUC— 1 8 0 f と pTSX— 1 とを制限酵素で処理し pUC— 1 8 0 f を p TSX- 1に連結挿入することからなる pTSX— 1 8 0 f の構築工程を示す。 図 2はヒトサイトメガロウィルスの UL 8 0プロテア一ゼを発現ざせた 2 9 3 T細胞中における天然型 p 1 8 0蛋白質の分解結果を示す。
図 3は組換え型 p 1 8 0蛋白質の大腸菌における発現を SDS— PAGE分析 においる C B B染色によって示す。
図 4はヒトサイトメガロウィルスの UL 8 0プロテアーゼを発現ざせた 2 9 3 T細胞中における組換え型 p 1 8 0蛋白質の分解結果を示す。
図 5はヒトサイトメガロウィルスの UL 8 0プロテアーゼを発現ざせた CHO 細胞中における組換え型 P 1 8 0蛋白質の分解 （レーン 1 ) 及び組換え型 p 1 8 0蛋白質変異体の非分解 （レーン 3) の各結果を示す。
図 6は大腸菌で発現した GST融合組換え p 1 8 0蛋白質の精製結果を、 培養 I PTG誘導後の大腸菌の菌体 （レーン 1 ) 、 可溶性蛋白質を含有する上澄み （ レーン 2) 及び溶出させた GST融合 p 1 8 0蛋白質 （レーン 3) の SDS— P A G E分析における C B B染色によつて示す。
図 7はヒトサイトメガロウィルスプロテアーゼの添加による GST融合 p 1 8 0蛋白質組換え基質のィンビトロにおける分解結果を示す。
図 8はヒトヘルぺスウィルス感染細胞中におけるヒト p 1 8 0蛋白質の分解が ウィルス接種細胞においてのみ且つ感染後期において進行する結果を示す。

Claims

請求の範囲
1 . ヒ ト p 1 8 0蛋白質から由来するへルぺスウィルスプロテア一ゼ切断可能配 列を含むぺプチド鎖からなるヘルぺスウィルスプロテアーゼの検出用基質。
2 . 配列番号 1〜3のアミノ酸配列で示されるヘルぺスウィルスプロテアーゼ切 断可能配列を少なくとも 1つ含むぺプチド鎖からなるヘルぺスウィルスプロテア ーゼの検出用基質。
3 . 配列番号 4のアミノ酸配列で示され、 ヘルぺスウィルスプロテアーゼ切断可 能配列を含むヒト p 1 8 0蛋白質から由来するペプチド鎖からなるヘルぺスウイ ルスプロテア一ゼの検出用基質。
4 . 配列番号 1〜 3で示されるヘルぺスウィルスプロテア一ゼ切断可能配列を少 なくとも 1つ含むペプチド鎖またはヒト p 1 8 0蛋白質から由来するヘルぺスゥ ィルスプロテアーゼ切断可能配列を含むペプチド鎖およびヒト p 1 8 0蛋白質か ら由来する反復配列を含むペプチド鎖からなるヘルぺスウィルスプロテアーゼの 検出用基質。
5 . ヒト p 1 8 0蛋白質から由来するへルぺスウィルスプロテアーゼ切断可能配 列を含むぺプチド鎖をグル夕チオン—S —トランスフヱラ一ゼ （G S T ) に連結 してなる組換え型 G S T融合 p 1 8 0蛋白質からなるヘルぺスウィルスプロテア ーゼの検出用基質。
6 . 反復配列の反復数が 2 4であるか、 または 0〜5 4の間のいずれかである請 求項 4記載の検出用基質。
7 . ヘルぺスウィルスがヒトサイトメガロウィルスである請求項 1〜6のいづれ か 1項記載の検出用基質。
8 . ヘルぺスウィルスが単純へルぺスウィルス 1型又は 2型、 帯状疱疹ウィルス 、 ヒ トヘルぺスウィルス 6、 ヒ トヘルぺスウィルス 7、 E Bウィルス （E B V )
、 又はヒトヘルぺスウィルス 8である請求項 1〜6のいづれか 1項記載の検出用
9 . 配列番号 5のアミノ酸配列をコードする D N A断片を、 宿主細胞中で発現し 得る複製可能な発現べクタ一に挿入連結してなるヘルぺスウィルスプロテア一ゼ の検出用基質発現ベクター。
1 0. 配列番号 5のアミノ酸配列をコードする DNA断片を他の遺伝子配列と連 結させた融合型 DNA配列を、 宿主細胞中で発現し得る複製可能な発現べクタ一 に挿入連結してなるヘルぺスウィルスプロテアーゼの検出用基質発現べクタ一。
1 1. 他の遺伝子が GST遺伝子である請求項 1 0記載の検出用基質発現べクタ
1 2. 配列番号 5のアミノ酸配列をコードする DNA断片を、 宿主細胞中で発現 し得る複製可能な発現べクタ一に挿入連結して、 該発現べク夕一で宿主細胞を形 質転換又はトランスフ クシヨンし、 該宿主細胞を培養し、 培養細胞から配列番 号 5のァミノ酸配列を含む組換え蛋白質を採取することを特徴とするヘルぺスゥ ィルスプロテア一ゼの検出用基質の製造方法。
1 3. 形質転換細胞が受託番号 FERM 1 7694として工業技術院生命工学 工業技術研究所に寄託された E. c 01 i XL 1— b l ue · pTSX- 1 8 0 f である請求項 1 2記載の検出用基質の製造方法。
1 4. 配列番号 5のアミノ酸配列をコードする DNA断片を他の遺伝子配列と連 結させた融合型 DNA配列を、 宿主細胞中で発現し得る複製可能な発現べクタ一 に揷入連結して、 該発現べクターで宿主細胞を形質転換又はトランスフエクショ ンし、 該宿主細胞を培養し、 培養細胞から組換え型融合蛋白質を採取することを 特徴とするヘルぺスウィルスプロテアーゼの検出用基質の製造方法。
1 5. 発現べクタ一が GST発現ベクターである請求項 1 4記載の検出用基質の 製造方法。
1 6. 形質転換細胞が受託番号 FERM— 1 7693として工業技術院生命工学 工業技術研究所に寄託された E. c 01 i XL 1— b l ue - pGEX- 1 8 0 s ubである請求項 1 4記載の検出用基質の製造方法。
PCT/JP2001/001574 2000-03-01 2001-03-01 Substrat utile pour detecter la protease du virus de l'herpes et procede de production de ce dernier WO2001064947A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2001236027A AU2001236027A1 (en) 2000-03-01 2001-03-01 Substrate for detecting herpes virus protease and process for producing the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000-60380 2000-03-01
JP2000060380 2000-03-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001064947A1 true WO2001064947A1 (fr) 2001-09-07

Family

ID=18580711

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/001574 WO2001064947A1 (fr) 2000-03-01 2001-03-01 Substrat utile pour detecter la protease du virus de l'herpes et procede de production de ce dernier

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU2001236027A1 (ja)
WO (1) WO2001064947A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993001291A1 (en) * 1991-07-05 1993-01-21 The Johns Hopkins University Herpes virus proteinase and method of assaying
WO1999001565A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 The Regents Of The University Of California Method for increasing secretion of proteins in eukaryotic host cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993001291A1 (en) * 1991-07-05 1993-01-21 The Johns Hopkins University Herpes virus proteinase and method of assaying
WO1999001565A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 The Regents Of The University Of California Method for increasing secretion of proteins in eukaryotic host cells

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LANGLEY R. ET AL.: "Identification of multiple forms of 180-kDa ribosome receptor in human cells", DNA CELL. BIOL., vol. 17, no. 5, 1998, pages 449 - 460, XP002941633 *
O'BOYLE D.R. ET AL.: "Identification of a novel peptide substrate of HSV-1 protease using substrate phage display", VIROLOGY, vol. 236, 1997, pages 338 - 347, XP002941631 *
WANKER E.E. ET AL.: "Functional characterization of the 180-kD ribosome receptor in vivo", J. CELL. BIOL., vol. 130, no. 1, 1995, pages 29 - 39, XP002941632 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001236027A1 (en) 2001-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3212660B1 (en) Mammalian cells expressing cytomegalovirus antigens
JP3592326B2 (ja) ユビキチン特異的プロテアーゼ
JP4139867B2 (ja) 殺菌性／浸透性が向上した安定なタンパク質生成物およびそれを含む薬剤組成物
CN112424362A (zh) 使用来自青鳉属的转座酶将核酸构建体整合入真核细胞
US20080081353A1 (en) Production of recombinant human collagen
US20180100006A1 (en) Method for the expression of polypeptides using modified nucleic acids
WO2001064947A1 (fr) Substrat utile pour detecter la protease du virus de l'herpes et procede de production de ce dernier
JP3549210B2 (ja) プラスミド
KR20220097504A (ko) 투구게 유래 재조합 FactorG 및 이것을 이용한 β-글루칸의 측정 방법
CA2560161A1 (en) Production of recombinant human collagen
KR20160076416A (ko) 바실러스 세레우스 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 바실러스 세레우스 검출용 매개체
LATCHINIAN‐SADEK et al. Secretion, purification and characterization of a soluble form of the yeast KEX1‐encoded protein from insect‐cell cultures
Liu et al. Cloning and expression of a cDNA encoding the Epstein-Barr virus thymidine kinase gene
US8568978B1 (en) Use of mammalian expression vector including T7 promoter and N-terminal HA tag for overexpression of human genes in E. coli
JPH09299079A (ja) 組換え単純ヘルペスウイルス１型プロテアーゼおよびその製造方法
US20210230608A1 (en) Gycomodule motifs and uses thereof
US6582691B1 (en) Expression vector for the production of dead proteins
RU2089612C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк purvgf, определяющая синтез фактора роста вируса осповакцины штамма л-ивп совместно с бета - галактозидазой escherichia coli, и штамм бактерий escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную днк purvgf - продуцент фактора роста вируса осповакцины штамма л-ивп
CN110627913A (zh) 一种带赖氨酸标签的adamts13底物及其制备方法和应用
EP0676412A1 (en) Purified human chondrocalcin, process for producing the same, and utilization thereof
Kang et al. High-level expression of T4 endonuclease V in insect cells as biologically active form
WO2000049044A1 (en) Expression of helicobacter polypeptides in pichia pastoris
JP2004357635A (ja) 糖転移酵素及びそれをコードする核酸
JP2001128680A (ja) ヒト脱ユビキチン化酵素
JP2001069980A (ja) セリンプロテアーゼおよび抗インフルエンザウィルス剤のスクリーニング方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 563634

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

122 Ep: pct application non-entry in european phase